ES2657930T3

ES2657930T3 - Nuevos derivados de péptidos como antibióticos

Info

Publication number: ES2657930T3
Application number: ES12778971.7T
Authority: ES
Inventors: Maxime Gualtieri; Philippe Villain-Guillot; Alain Givaudan; Sylvie Pages
Original assignee: NOSOPHARM; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: NOSOPHARM; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2011-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2018-03-07
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: JP2014534173A; CA2845735A1; JP6158188B2; US20150175659A1; US9260481B2; CN103827138A; WO2013045600A1; EP2760881A1; RU2014114996A; EP2760881B1; CN103827138B; IL231664A0; IN2014DN03010A

Abstract

Compuesto de fórmula (I): Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-NH-(CH2)n-R (I) en el que Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa8 y Xaa10 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en lisina, 3-hidroxilisina, 4-hidroxilisina, 5-hidroxilisina, 3,4-dihidroxilisina, 3,5-dihidroxilisina, 4,5-dihidroxilisina, ornitina, 3-hidroxiornitina, 4-hidroxiornitina, 3,4-dihidroxiornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 3-hidroxi-2,4- diaminobutanoico, arginina, histidina, serina y treonina; Xaa4 es glicina; Xaa5 es ornitina Xaa6 es prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, ácido aziridin-2-carboxílico, ácido azetidin-2-carboxílico, ácido pipecólico, 4-oxaprolina, 3-tiaprolina, 4-tiaprolina, 3,4-deshidroprolina, 4-aminoprolina, 4-fluoroprolina, α-metilprolina o α-alilprolina; Xaa7 es histidina Xaa9 es arginina, 2,3-deshidroarginina, citrulina, 2,3-deshidrocitrulina, canavanina o 2,3-deshidrocanavanina; n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y R es -OH, -NH2 o -COOH.

Description

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En algunas formas de realización, las odilomicinas están aisladas.

En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 50%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 60%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 70%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 80%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 85%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 90%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 95%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 98%. En algunas formas de realización, las odilomicinas tienen una pureza superior a aproximadamente el 99%. En algunas formas de realización, cualesquiera valores de pureza establecidos pueden constituir un valor extremo inferior y/o superior de un intervalo de pureza cuando proceda o en las mismas cualquiera de los límites inferiores puede combinarse con cualquiera de los límites superiores.

En algunas formas de realización, las odilomicinas y/o las composiciones que comprenden las mismas son útiles como medicamento, como antibiótico, como antimicrobiano o en el tratamiento de enfermedades microbianas, en particular de una infección bacteriana provocada, por ejemplo, por bacterias patógenas.

En algunas formas de realización, las odilomicinas y/o las composiciones que comprenden las mismas son útiles en el tratamiento de infecciones bacterianas, por ejemplo en el tratamiento de una infección intrahospitalaria o una infección bacteriana nosocomial.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece una infección bacteriana intrahospitalaria que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I).

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece una infección bacteriana nosocomial que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I).

En un aspecto, la invención se refiere también a la utilización de compuestos de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para tratar una infección microbiana o una enfermedad microbiana.

En otro aspecto, la invención se refiere también a la utilización de compuestos de fórmula (I) para la fabricación de una composición antibiótica.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere también a procedimientos de tratamiento que comprenden la administración de un compuesto de fórmula (I), o composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I), a un sujeto con necesidad de ello. Las odilomicinas y/o las composiciones que comprenden las mismas pueden ser útiles, por ejemplo, en el tratamiento, la supresión y/o la prevención de una infección y/o enfermedad bacteriana.

En algunas formas de realización, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento, prevención y/o supresión de una infección bacteriana que comprende la administración a un sujeto con necesidad de ello de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una composición que comprende un compuesto de fórmula (I).

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece una infección bacteriana que comprende administrar a dicho sujeto un compuesto de fórmula (I).

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para suprimir una infección bacteriana en un sujeto que comprende administrar al sujeto un compuesto de fórmula (I).

En algunas formas de realización más, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que padece una infección bacteriana resistente a múltiples fármacos que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I).

En algunas formas de realización, los procedimientos de la presente invención proporcionan la inhibición de bacterias que son resistentes a otros fármacos o antibióticos, o la infección relacionada con las mismas. En algunas formas de realización, los procedimientos proporcionan el tratamiento, la supresión y/o la prevención de la infección por bacterias resistentes a múltiples fármacos.

En algunas formas de realización, la infección bacteriana es resistente a múltiples fármacos. En algunas formas de realización, la cepa bacteriana es intrahospitalaria. En algunas formas de realización, la cepa bacteriana es

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nosocomial.

En algunas formas de realización, la infección bacteriana comprende la infección por bacterias Gram-negativas. En algunas formas de realización, la infección bacteriana comprende la infección por bacterias Gram-positivas. En algunas formas de realización, la infección bacteriana comprende la infección por más de una cepa bacteriana.

En algunas formas de realización, la infección bacteriana o microbiana es una infección provocada en su totalidad o en parte por bacterias de las familias Achromobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Acinetobacter, Aeromonas, Anaplasma, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Bdellovibrio, Bifidobacterium, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Coxiella, Ehrlichia, Enterobacter, Enterococcus, Erysipelothrix, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Hemobartonella, Klebsiella, Lactobacillus, Legionella, Leptospira, Listeria, Mannheimia, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Neorickettsia, Nocardia, Pasteurella, Peptostreptococcus, Photorhabdus, Porphyromonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Shigella, Sphaerophorus, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Streptococcus, Treponema, Tropheryma, Ureaplasma, Vibrio o Yersinia.

En algunas formas de realización, la infección bacteriana o microbiana es una infección provocada en su totalidad o en parte por Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Enterobacter clocae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, Serratia marescens o Pseudomonas aeruginosa. Preferentemente, la cepa de Xenorhabdus nematophila CNCM 1-4530, el sobrenadante de cultivo de esta cepa y los extractos celulares de esta cepa muestran actividad antibiótica contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginos y Stenotrophomonas maltophilia.

En algunas formas de realización, la divulgación proporciona la utilización de composiciones farmacéuticas y/o medicamentos comprendidos por los compuestos de fórmula (I) en un procedimiento de tratamiento de una infección bacteriana y/o estado patológico y/o trastorno provocado por dicha infección bacteriana o relacionado con la misma.

En algunas formas de realización, los procedimientos comprenden la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I) solo o en combinación con un segundo compuesto antibiótico, o una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) solo o en combinación con un segundo compuesto antibiótico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, coadyuvantes, diluyentes, excipientes, materiales de carga y lubricantes. A menudo, el vehículo farmacéuticamente aceptable es químicamente inerte frente a compuestos activos y no es tóxico en las condiciones de utilización. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, agua o solución salina, polímeros tales como polietilenglicol, carbohidratos y derivados de los mismos, aceites, ácidos grasos o alcoholes.

En algunas formas de realización, el procedimiento de tratamiento, prevención y/o supresión de un trastorno relacionado con una infección bacteriana comprende las etapas de: (i) identificar un sujeto con necesidad de dicho tratamiento; (ii) proporcionar un compuesto de fórmula (I) solo o en combinación con un segundo compuesto antibiótico, o una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) solo o en combinación con un segundo compuesto antibiótico y un vehículo farmacéuticamente aceptable y (iii) administrar dicho compuesto o dichos compuestos o dicha composición en una cantidad terapéuticamente aceptable para tratar, prevenir y/o suprimir una infección bacteriana en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento.

En algunas formas de realización, los procedimientos comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I); o una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas formas de realización, el procedimiento de tratamiento, prevención y/o supresión de un trastorno relacionado con una infección bacteriana comprende las etapas de: (i) identificar un sujeto con necesidad de dicho tratamiento; (ii) proporcionar un compuesto de fórmula (I) o una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) y un vehículo farmacéuticamente aceptable y (iii) administrar dicho compuesto o dicha composición en una cantidad terapéuticamente eficaz para tratar, prevenir y/o suprimir el estado patológico o trastorno relacionado con una infección bacteriana en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento.

En algunas formas de realización, tratamiento se refiere, en general, a tratamiento y terapia, tanto de un ser humano como de un animal (por ejemplo, en aplicaciones veterinarias), con el que se logra algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo, la inhibición del progreso del trastorno. El tratamiento también puede incluir, pero de manera no limitativa, una reducción en la velocidad de la progresión, una detención en la velocidad de la

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progresión, una mejora del trastorno, la cura del trastorno, un estado estabilizado (es decir, no empeorado) de la enfermedad o afección, prevenir la expansión de la enfermedad o afección, el retardo o la ralentización de la progresión de la enfermedad o afección, una mejora o la paliación del estado patológico o de la afección y la remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como indetectable. En algunas formas de realización, tratamiento también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En algunas formas de realización, también está incluido un tratamiento como una medida profiláctica (es decir, la prevención). Por ejemplo, la utilización con sujetos que no han desarrollado aún el trastorno, pero que están en riesgo de desarrollar el trastorno, está comprendida por el término "tratamiento".

En algunas formas de realización, el tratamiento comprende los tratamientos de combinación y politerapias, en los que dos o más tratamientos o terapias se combinan, por ejemplo secuencialmente o simultáneamente. Por ejemplo, los agentes activos de la presente invención también pueden utilizarse en otras politerapias, por ejemplo junto con otros agentes, por ejemplo, otros antimicrobianos u otros antibióticos, etc.

Los sujetos se encuentran en sistemas in vitro e in vivo, incluidos, por ejemplo, células o tejidos aislados o cultivados, sistemas de ensayo in vitro no celulares y animales (por ejemplo, un anfibio, un ave, un pez, un mamífero, un marsupial, un ser humano, un animal doméstico tal como, por ejemplo, un gato, un perro, un mono, un ratón o una rata; o un animal útil tal como, por ejemplo, un caballo, un bovino (tal como una vaca), un pavo, un pollo o un cerdo).

En algunas formas de realización, el sujeto es un mamífero. En algunas formas de realización, el sujeto es un ave, un porcino, un bovino o un ser humano. En algunas formas de realización, el sujeto es un ser humano. En algunas formas de realización, el sujeto es un ave. En algunas formas de realización, el sujeto es un porcino o un cerdo. En algunas formas de realización, el sujeto es un pavo o un pollo.

Además, las composiciones o los procedimientos pueden comprender adicionalmente uno o más compuestos antibacterianos o antibióticos adicionales en combinación con un compuesto de fórmula (I) solo. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen, pero sin limitación, daptomicina, oxacilina, piperacilina/tazobactam, ticaricilina/ácido clavulánico, amoxicilina/ácido clavulánico, eritromicina, cefepim, clindamicina, imipenem, gentamicina, ciprofloxacina, aztreonam, vancomicina, linezolid, rifampicina, kanamicina, ampicilina, tetraciclina y similares.

En algunas formas de realización, el antibiótico adicional (o segundo antibiótico) es un antibiótico aminoglucósido. Los antibióticos aminoglucósidos son compuestos antibióticos en los que una porción de una molécula contiene un azúcar modificado con amino. Los ejemplos de antibióticos aminoglucósidos incluyen, pero sin liminación, amikacina, apramicina, arbekacina, astromicina, bekanamicina, capreomicina, dibekacina, dihidrostreptomicina, elsamitrucina, G418, gentamicina, higromicina B, isepamicina, kanamicina, kasugamicina, micronomicina, neomicina, netilmicina, sulfato de paromomicina, ribostamicina, sisomicina, estreptoduocina, estreptomicina, tobramicina y verdamicina.

Así, en algunas formas de realización los procedimientos y/o las composiciones comprenden además uno o más compuestos antibacterianos adicionales en combinación con un compuesto de fórmula (I). En algunas formas de realización, el compuesto antibacteriano adicional se selecciona del grupo que consiste en daptomicina, oxacilina, piperacilina/tazobactam, ticaricilina/ácido clavulánico, amoxicilina/ácido clavulánico, eritromicina, cefepim, clindamicina, imipenem, gentamicina, ciprofloxacina, aztreonam, vancomicina, linezolid, rifampicina, kanamicina, ampicilina y tetraciclina. En algunas formas de realización, el antibacteriano adicional es kanamicina. En algunas formas de realización, el antibiótico adicional es un antibiótico aminoglucósido.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar, suprimir y/o prevenir una infección bacteriana mediante la utilización combinada del compuesto de fórmula (I) y un segundo compuesto antibiótico en sujetos en los que la utilización del compuesto de fórmula (I) o del segundo compuesto antibiótico solos no proporciona el efecto terapéutico deseado. Sorprendentemente, se ha descubierto que cuando se utilizan otros compuestos antibióticos junto con un compuesto de fórmula (I), se observan aumentos estadísticamente significativos en los efectos antibióticos. En algunas formas de realización, existe un efecto sinérgico entre un segundo compuesto antibiótico, tal como la kanamicina, y el compuesto de fórmula (I). Así, en algunas formas de realización, la kanamicina y el compuesto de fórmula (I) se administran en cantidades que muestran una reducción sinérgica de niveles bacterianos. En algunas formas de realización, la kanamicina y el compuesto de fórmula (I) se administran en cantidades que muestran tratamiento sinérgico, supresión sinérgica y/o prevención sinérgica de una infección bacteriana.

En otro aspecto, la presente invención es una formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I). En algunas formas de realización, Xaa1 es lisina.

En algunas formas de realización, Xaa2 es ácido 3-hidroxi-2,4-diaminobutanoico.

En algunas formas de realización, Xaa3 es ácido 3-hidroxi-2,4-diaminobutanoico.

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memoria.

Se reconocerá también que pueden combinarse cualesquiera o todas las combinaciones, formas de realización y aspectos de la invención de cualquier forma para proporcionar otras combinaciones, formas de realización y aspectos dentro del ámbito de la invención a menos que, de otro modo, no sea posible.

La invención se describirá con más detalle mediante los ejemplos no limitantes siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Producción y fermentación

Organismo productor

La Xenorhabdus nematophila CNCM 1-4530 (colección "Diversité, genomes et interactions microorganismsinsectes") se cultivó en medio de Luria-Bertani (LB, compuesto por bactotriptona, 10 g/l, extracto de levadura, 5 g/l, y NaCl, 10 g/l) para un cultivo líquido y en LB-agar para cultivos sólidos. El estado de fase (I o II) de esta cepa se determinó cultivando en NBTA (agar nutriente (Difco), 31 g/l, azul de bromotimol, 25 mg/l, y cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 1%, 40 mg/l) y midiendo la actividad antibacteriana frente a Micrococcus luteus. La Xenorhabdus muestra dos formas o variantes de colonias cuando se cultiva in vitro. Las modificaciones de la membrana exterior inducen adsorción diferencial de colorantes por variantes. Las variantes de fase I absorben colorantes y son azules en placas de NBTA, mientras que las colonias de fase II son rojas. Las fases I y II de las cepas se indican con sufijos (/1 y /2, respectivamente) adjuntos a las denominaciones de las cepas. Esta cepa se mantuvo a 15ºC en medio NBTA.

Fermentación

La Xenorhabdus nematophila CNCM 1-4530 se cultivó durante 72 h, a 28ºC con agitación en un matraz Erlenmeyer de 2 l que contenía 500 ml de medio de cultivo compuesto por bactopeptona, 15 g/l, MgSO4·7H2O, 2 g/l, y glucosa, 2 g/l. Se inoculó al cultivo el 0,1% (v/v) de un precultivo de 24 h en el mismo medio. La producción de antibiótico se supervisó mediante HPLC analítica.

Ejemplo 2: Aislamiento

Se retiraron las células bacterianas mediante centrifugación a baja velocidad (6000 × g, 10 min a 4ºC) y el sobrenadante se esterilizó sobre un filtro de 0,22 µm de tamaño de poro. El sobrenadante se añadió (1:1; v/v) a un tampón de NaCl 0,1 M-Tris 0,02 M (pH 7) y se sometió a una cromatografía de intercambio iónico en un cartucho Sep Pack CarboxyMethyl (Accell Plus CM, Waters). El material sin unir se eliminó por lavado con tampón de NaCl 0,1 M-Tris 0,02 M (pH 7) y los productos con actividad antibiótica se eluyeron con tampón de NaCl 0,1 M-Tris 0,02 M (pH 7). Este eluato se acidificó con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (v/v) y después se sometió a cromatografía en fase inversa en un cartucho Sep Pack C18 (Sep-Pak Plus C18, Waters). El material sin unir se eliminó mediante lavado con H2O-TFA al 0,1% y los antibióticos reunidos se eluyeron con acetonitrilo. El eluato se liofilizó y, a continuación, se resuspendió en agua (1:5; v/v). Los compuestos puros se aislaron del extracto crudo mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 (Waters; Symmetry Symmetry C18; 5 µm; 4,6X150 mm), un gradiente lineal de H2O/0,1% de TFA-acetonitrilo partiendo del 0% al 30% en 30 min, un caudal de 1 ml/min y una detección UV de 200 a 400 nm, proporcionando odilomicinas con los tiempos de retención de HPLC siguientes: Odilomicina A: 14,16 min (pureza: 98% UV), Odilomicina B: 14,44 min (pureza: 95% UV) y Odilomicina C: 14,6 min (pureza: 94% UV).

Ejemplo 3: Caracterización y propiedades fisicoquímicas

Análisis por RMN y EM

El compuesto purificado se analizó mediante espectroscopia de masas y RMN para determinar su estructura química.

El estudio por RMN se llevó a cabo en un espectrómetro Bruker Avance que operaba a 700 MHz equipado con una criosonda. La muestra (10 mM) se disolvió en agua (95/5 H2O/D2O v/v) y el pH se ajustó a 3,5 con ácido clorhídrico. Todos los datos se registraron a 280 °K. Los desplazamientos químicos de protones se expresaron con respecto a 4,4-dimetil-silapentano-1-sulfonato de sodio, según las recomendaciones de la IUPAC. Los espectros de espectroscopia de correlación con filtro de doble cuanto (DQF-COSY), espectroscopia de correlación total con filtro-z (z-TOCSY) y espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) se registraron en un modo sensible a la fase, utilizando el procedimiento States-TPPI (Marion D. Et al, J. Magn. Reson. 85, 393-399 (1989)). Los espectros z-TOCSY se obtuvieron con un tiempo de mezclado de 80 ms y los espectros NOESY con tiempos de mezclado de 220 ms. Los experimentos de HSQC de 1H-13C y HSQC-TOCSY de 1H-13C se llevaron a cabo con la misma muestra. La resonancia de agua establecida en la frecuencia del vehículo se

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Sistema de espín: Grupo 1H (ppm) 13C (ppm)

CβH2 CγH2 CδH2 CεH2: 1,66/1,62 1,2 1,45 2,78 30,4 21,1 26,3 39,0

Ácido hidroxi-diamino-butírico2 Dab(βOH)2: HN CαH CpH-OH CγH2 NH2 8,83 4,28 3,89 2,99/2,79 -56,3 67,4 41,9

Ácido hidroxi-diamino-butírico3 Dab(βOH)3: HN CαH CβH-OH CγH2 NH2 8,63 4,33 3,93 2,98/2,80 - -56,3 67,7 41,5 -

Gly4: HN CαH 8,37 3,8 -42,1

Ornitina5 Orn5: HN CαH CβH2 CγH2 CδH2 NH2 8,15 4,46 1,58/1,42 1,49/1,4 2,74 - -51,2 27,5 23,2 39 -

Pro6: CαH CβH2 CγH2 CδH2 4,10 1,98/1,60 1,72 3,48/3,38 60,4 29,5 24,3 47,7

His7: HN CαH CβH2 Cδ2H Cε1H 8,49 4,46 2,98-2,91 7,03 8,33 -52,0 26,3 118 134

δ Hidroxilisina8 Dhl8: HN CαH CβH2 CγH2 CδH-OH CεH2 NH2 8,41 4,12 1,70 1,36/1,26 3,62 2,86/2,63 - -53,8 27,0 30,0 67,0 44,5 -

deshidroarginina9 Dha9: HN Cα CβHCγH2 CδH2 HNε C(NH2)=NH 9,6 -6,17 2,20 3,10 7,0 - --132 26,5 39,5 --

δ-Hidroxilisina10 Dhl10: HN CαH CβH2 CγH2 CδH-OH CεH2 NH2 8,05 4,06 1,65 1,27 3,60 2,86/2,63 - 54,0 27,0 30,0 67,0 44,5 -

Diaminobutano11 Dbt11: HN CαH2 8,05 2,95 39,5

CβH2: 1,30 25,3

CγH2: 1,40 24,0

CδH2: 2,78 39,0

NH2: - -

Tabla 2. Desplazamientos químicos de odilomicina B (agua, 280 K)

Sistema de espín: Grupo 1H (ppm) 13C (ppm)

Lys1: HN CαH CβH2 CγH2 CδH2 CεH2 -3,8 1,66/1,62 1,2 1,45 2,78 -53,0 30,4 21,1 26,3 39,0

Ácido hidroxi-diamino-butírico2 Dab(βOH)2: HN CαH CβH-OH CγH2 NH2 8,83 4,28 3,89 2,99/2,79 -56,3 67,4 41,9

Gly4: HN CαH 8,37 3,8 -42,1

HN: 8,49 -

CαH: 4,46 52,0

His7: CβH2 2,98-2,91 26,3

Cδ2H: 7,03 118

Cε1H: 8,33 134

Lys8: HN CαH CβH2 CγH2 Cδ H2 CεH2 NH2 8,41 4,12 1,70 1,36/1,26 1,53 2,86/2,63 - -53,8 27,0 30,0 26,4 44,5 -

δ-Hidroxilisina10: HN 8,05

Sistema de espín: Grupo 1H (ppm) 13C (ppm)

Dhl10: CαH 4,06 54,0

CβH2 CγH2: 1,65 1,27 27,0 30,0

CδH-OH: 3,60 67,0

CεH2 NH2: 2,86/2,63 - 44,5 -

HN: 8,05

CαH2: 2,95 39,5

Diaminobutano11 Dbt11: CβH2 CγH2 1,30 1,40 25,3 24,0

CδH2: 2,78 39,0

NH2: - -

Tabla 3. Desplazamientos químicos de odilomicina C (agua, 280 K)

Sistema de espín: Grupo 1H (ppm) 13C (ppm)

HN: 8,83 -

Ácido hidroxi-diamino-butírico2 Dab(βOH)2: CαH CβH-OH 4,28 3,89 56,3 67,4

CγH2: 2,99/2,79 41,9

NH2

Gly4: HN CαH 8,37 3,8 -42,1

HN: 8,49 -

CαH: 4,46 52,0

His7: CβH2 2,98-2,91 26,3

Cδ2H: 7,03 118

Cε1H: 8,33 134

HN: 8,41 -

CαH: 4,12 53,8

Lys8: CβH2 CγH2 1,70 1,36/1,26 27,0 30,0

CδH2: 1,53 26,4

CεH2: 2,86/2,63 44,5

Sistema de espín: Grupo 1H (ppm) 13C (ppm)

NH2: - -

deshidroarginina 9 Dha9: HN Cα CβHCγH2 CδH2 HNε C(NH2)=NH 9,6 -6,17 2,20 3,10 7,0 --132 26,5 39,5 -

Lys10: HN CαH CβH2 CγH2 CδH-OH CεH2 NH2 8,05 4,06 1,65 1,27 1,58 2,86/2,63 - 54,0 27,0 30,0 26,3 44,5 -

Diaminobutano11 Dbt11: HN CαH2 CβH2 CγH2 CδH2 NH2 8,05 2,95 1,30 1,40 2,78 - 39,5 25,3 24,0 39,0 -

Tabla 4. Fragmentaciones clave de los 1297 iones [M+H]+ de odilomicina A

172: [Gly4/Orn5]+

233: [Dab(βOH)2/Dab(βOH)3]+

235: [Pro6/His7]+

245: [Lys1/Dab(βOH)2]+

282: [His7/Dhl8]+

299: [Dhl8/Dha9]+ or [Dha9/Dhl10]+

361: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3]+

370: [Dha9/Dhl10/Dbt11]+ -NH3+

379: [Pro6/His7/Dhl8]+

396: [Pro6/His7/Dhl8]+ + NH3+

406: [Gly4/Orn5//Pro6/His7]+

436: [HiS7/Dhl8/Dha9]+

530: [Dhl8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

533: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5]+ o [Pro6/His7/Dhl8/Dha9]+

550: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8]+

567: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8]+ + NH3+

683: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8]+ + NH3+

704: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8/Dha9]+

765: [Pro6/His7/Dhl8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

820: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8/Dha9]+

936: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl9/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

964: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8/Dha9/Dhl10]+

1052: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

1064: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8/Dha9]+

1297: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Dhl8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

Tabla 5. Fragmentaciones clave de los 1281 iones [M+H]+ de odilomicina B

172: [Gly4/Orn5]+

233: [Dab(βOH)2/Dab(βOH)3]+

235: [Pro6/His7]+

245: [Lys1/Dab(βOH)2]+

266: [His7/Lys8]+

361: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3]+

370: [Dha9/Dhl10/Dbt11]+ -NH3+

363: [Pro6/His7/Lys8]+

380: [Pro6/His7/Lys8]+ + NH3+

406: [Gly4/Orn5/Pro6/His7]+

514: [Lys8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

517: [Pro6/His7/Lys8/Dha9]+

533: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5]+

534: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys]+

551: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8]+ + NH3+

667: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8]+ + NH3+

688: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9]+

749: [Pro6/His7/Lys8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

804: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9]+

920: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

948: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9/Dhl10]+

1036: [Dab(β0H)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

1048: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/lys8/Dha9]+

1281: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/lys8/Dha9/Dhl10/Dbt11]+

Tabla 6. Fragmentaciones clave de los 1264 iones [M+H]+ de odilomicina C

172: [Gly4/Orn5]+

233: [Dab(βOH)2/Dab(βOH)3]+

235: [Pro6/His7]+

245: [Lys1/Dab(βOH)2]+

266: [His7/Lys8]+

361: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3]+

354: [Dha9/Lys10/Dbt11]+ -NH3+

363: [Pro6/His7/Lys8]+

380: [Pro6/His7/Lys8]+ + NH3+

406: [Gly4/Orn5/Pro6/His7]+

498: [Lys8/Dha9/Lys10/Dbt11]+

517: [Pro6/His7/Lys8/Dha9]+

533: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5]+

534: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8]+

551: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8]+ + NH3+

688: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9]+

733: [Pro6/His7/Lys8/Dha9/Lys10/Dbt11]+

804: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9]+

904: [Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys9/Dha9/Lys10/Dbt11]+

932: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9/Lys10]+

1020: [Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/Lys8/Dha9/Lys10/Dbt11]+

1048: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/lys8/Dha9]+

1265: [Lys1/Dab(βOH)2/Dab(βOH)3/Gly4/Orn5/Pro6/His7/lys8/Dha9/Lys10/Dbt11]+

5 Ejemplo 4: Estudios in vitro Procedimientos de ensayo de susceptibilidad antibacteriana Las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) se determinaron según las directrices de condiciones del Clinical

10 and Laboratory Standards Institute (CLSI) detalladas en la tabla 7. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Tabla 7. Parámetros de determinación de la MIC

Cepa(s): Directrices del CLSI relevantes Medios de cultivo y condiciones de incubación

Acinetobacter baumannii Bacillus subtilis Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Escherichia coli Klebsiella pneumonia Klebsiella oxytoca Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia: M07-A8. Procedimientos para la dilución antimicrobiana Ensayos de susceptibilidad para bacterias que crecen aeróbicamente; norma aprobada – octava edición Caldo de Mueller-Hinton (MH) 37ºC aeróbicas 18 -24 h

Streptococcus pneumonia Streptococcus pyogenes: M07-A8 MH suplementado con el 5% de sangre de caballo lisada (MHB) 37ºC aeróbicas 18-24 h

Haemophilus influenzae: M07-A8 Medio de ensayo hemófilo (HTM) 37ºC aeróbicas 18-24 h.

Moraxella catarrhalis: M45-A2. Procedimientos para la dilución antimicrobiana y ensayo de susceptibilidad de disco de bacterias aisladas no frecuentemente o exigentes; directriz aprobada – segunda edición MH 37ºC aeróbicas 24 h.

Pasteurella multocida: M45-A2 MHB 37ºC aeróbicas 24 h.

5

10

15

20

25

30

35

40

Mannheimia haemolytica: No disponible, seguido por M07-A8 MHB 37ºC aeróbicas 24 h.

Proprionibacterium acnes Bacteroides fragilis: M11-A7. Procedimientos para el ensayo de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias anaerobias; norma aprobada – séptima edición Caldo de Schaedler suplementado con 1 µg/ml de vitamina K1 y el 5% de sangre de caballo lisada (SB) 37ºC aeróbicas 48 h.

Preparación de los inóculos. Se tomaron de cinco a diez colonias aisladas en pocillos y se resuspendieron en 3 ml de solución salina estéril. El inóculo se resuspendió mediante agitación vigorosa en un mezclador de vórtice durante 15 s. Se ajustó la turbidez a un patrón de McFarland 0,5 (1-5 x 106 UFC/ml). El inóculo se diluyó posteriormente en el medio apropiado (tabla 7) dando un inóculo final en cada pocillo de 2-8 x 105 UFC/ml.

Adición del artículo de ensayo. Se diluyeron soluciones madre de odilomicina A o comparador en el medio apropiado dando una concentración de partida máxima de 50 µg/ml en el ensayo. Se dispensaron 50 µl de medio en cada pocillo en las columnas dos a 12 de una placa de 96 pocillos. Se dispensaron 100 µl de la solución de compuesto de ensayo apropiada (100 µg/ml) en cada pocillo de la columna uno. En el caso de M. catarrhalis,

M. haemolytica y P. multocida estos valores se doblaron (se utilizó un volumen de ensayo final de 200 µl). Se realizaron diluciones a la mitad seriadas desde la columna uno a la columna 10 para dar un intervalo de concentración de 50 a 0,1 µg/ml de cada compuesto en el ensayo. Las columnas 11 y 12 sirvieron como controles de cultivo positivo (sin fármaco ni artículo de ensayo, inóculo añadido) y negativo (sin fármaco, artículo de ensayo o inóculo añadido), respectivamente.

Adición de cepas bacterianas. Se añadieron 50 µl de cada inóculo a los pocillos apropiados, dando como resultado un volumen final de 100 µl que consistía en 50 µl de compuesto diluido o diluyentes y 50 µl de inóculo o caldo solo.

Se establecieron las concentraciones bactericidas mínimas (MBC) ampliando el procedimiento de MIC a la evaluación de la actividad bactericida. Después de 24 horas, se retiraron 10 µl de los pocillos, se diluyeron de forma seriada y después se dispusieron en placas de agar adecuadas. Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche. La MBC se leyó 18 h después como la concentración más baja de antibiótico que dio como resultado una supervivencia del 0,1% en el subcultivo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Las MBC también se determinaron en presencia del 50% y el 95% (v/v) de suero humano para evaluar la unión de las proteínas.

Efectos bactericidas de odilomicina sobre el crecimiento de S. aureus y P. aeruginosa

Se llevaron a cabo curvas de destrucción bacteriana inoculando S. aureus ATCC 13709 y P. aeruginosa ATCC 27853 con una concentración de Odilomicina A igual a cuatro veces la MIC. Se utilizaron vancomicina o polimixina a una concentración cuatro veces su MIC. Los inóculos de S.aureus y P.aeruginosa se prepararon a partir de colonias cultivadas durante toda la noche en MHB. Las concentraciones de antibióticos en el matraz se ajustaron en MHB según la concentración deseada. A los tubos de cultivo que contenían 10 ml se inoculó S. aureus o P. aeruginosa a un inóculo aproximado de 105 UFC/ml. Las muestras se retiraron y se realizaron recuentos de las bacterias a 0, 1, 2, 3, 4, 6 y 24 h de incubación a 37ºC. Así, después de agitar en vórtice los tubos de cultivo, se retiraron dos muestras de 50 µl y se diluyeron de forma seriada con MHB. Después de cada etapa de dilución, se plaquearon 20 µl en placas de agar LB, que se incubaron durante 24 h a 37ºC. Después de ello, se realizó un recuento de las colonias y se retro-extrapolaron al volumen original para determinar la concentración inicial (UFC/ml).

Propiedades biológicas in vitro

Se analizó odilomicina A para determinar su actividad antimicrobiana frente a un intervalo amplio de bacterias

5 implicadas en infección nosocomial y animal. Esta posee un amplio espectro de actividad antibacteriana contra patógenos gram-positivos y gram-negativos (tabla 8). Con respecto a bacterias gram-positivas, las actividades antibacterianas de la odilomicina A son potentes, con unas MIC inferiores a 1 µg/ml frente a cepas de S. aureus,

S. epidermidis y B. subtilis, incluyendo frente a algunos aislados clínicos multirresistentes (tabla 9). Se observó una actividad antibacteriana débil o la carencia de la misma frente a E. faecalis, E. faecium, S. pneumoniae y S.

10 pyogenes. Con respecto a las bacterias gram-negativas, las actividades antibacterianas de odilomicina A son potentes frente a K. pneumoniae y K. oxytoca, y son buenas, con unas MIC inferiores a 10 µg/ml, frente a cepas de A. baumannii, E. cloacae, E. coli, M. catarrhalis, P. aerwginosa y S. maltophilia, incluidos algunos aislados clínicos multirresistentes (tabla 8, tabla 9).

15 Tabla 8. Actividad antibacteriana de Odilomicinas A, B, C

Bacterias: Cepa MIC (µg/ml)

Odilomicina A: Odilomicina B Odilomicina C Control

Gram(-)

A. baumannii: ATCC BAA747 6,25 - - < 0,1a

B. fragilis: ATCC 25238 1,56 - - 0,39b

E. cloacae*: 11370 1,56 - - 0,78c

E. coli: ATCC 25922 3,13 - - 0,39c

E. coli CTX-M14*: AEC7 3,13 - - 0,39c

E. coli CTX-M15*: MEC23 3,13 - - 0,39c

E. coli TEM*: MEC12 1,56 - - 0,39c

K. pneumoniae: ATCC 43816 0,78 - - 0,39c

K. pneumoniae KPC*: 2475 1,56 - - 0,78c

K. oxytoca *: NEB9 0,39 - - 0,39c

M. haemolytica: ATCC 33396 50,0 - - < 0,1a

M. catarrhalis: ATCC 25238 1,56 - - < 0,1a

P. multocida: ATCC 12945 25,0 - - < 0,1a

P. aeruginosa: ATCC 27853 3,13 3,13 6,25 0,39c

S. maltophilia: ATCC 13637 6,25 - - < 0,1a

H. influenzae: ATCC 49766 12,5 - - < 0,1a

Gram(+)

B. subtilis: DSM 347 <0,20 - - 0,20d

E. faecalis: ATCC 29212 > 50,0 - - 0,78a

E. faecium: ATCC 700221 25,0 - - > 50,0a

S. pneumoniae: ATCC 49619 > 50,0 - - 0,39a

S. pyogenes: ATCC 12384 50,0 - - 0,20a

S. aureus: ATCC 13709 0,39 0,39 0,78 0,78d

S. aureus: ATCC 25923 0,39 0,39 0,78 0,78d

S. aureus USA300: ATCC BAA1556 0,78 0,78 1,56 0,78d

S. epidermidis: ATCC 12228 < 0,20 - - 0,20d

P. acnes: ATCC 6919 3,13 - - 0,39a

*aislados clínicos del Hospital Universitario de Nimes ; aciprofloxacina; bmetronidazol; cpolimixina;dvancomicina

Tabla 9. Actividad antibacteriana de Odilomicina A frente a aislados clínicos multirresistentes

P. aeruginosa: S. aureus

Antibacteriano 1: 561 8 40168 1 3517 0 4216 2 51223 2 2330 5 1666 6 2068 1 2184 0 2036 4

Pip./Taz.a: S S S S R - - - - -

Ticar./CAb: S R R R R - - - - -

Eritromicina n: R R R R R R R S S R

Cefepim: S S S S S - - - - -

Cefoxitina: - - - - - I R R S R

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Claims

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