CN101130060B - 含有达巴霉素的医药组合物 - Google Patents

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CN101130060B CN2007101404712A CN200710140471A CN101130060B CN 101130060 B CN101130060 B CN 101130060B CN 2007101404712 A CN2007101404712 A CN 2007101404712A CN 200710140471 A CN200710140471 A CN 200710140471A CN 101130060 B CN101130060 B CN 101130060B
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Abstract

本发明提供一种医药组合物，其包含达巴霉素(dalbavancin)及至少一种有效的稳定剂，所述达巴霉素约含有小于3摩尔百分比的MAG，其中所述组合物的pH值约为3至5，且其中所述组合物是冻干的。

Description

含有达巴霉素的医药组合物
本申请案主张2002年11月18日申请的第60/427,654号、2003年7月8日申请的第60/485,694号、2003年8月13日申请的第60/495,048号和2003年8月19日申请的第60/496,483号美国临时专利申请案的权利，其揭示内容全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本申请案涉及达巴霉素(dalbavancin)组合物及在治疗细菌感染的方法中使用所述组合物的方法。
背景技术
根据美国疾病控制及预防中心(U.S.Center for Disease Control and Prevention)，医院血流感染为导致美国死亡发生的主要原因。在美国每年所插入的7百万个中心静脉导管(CVC)中约有5％与至少一个血流感染事件有关(每年约350,000件)。当细菌通过静脉导管进入血流时则发生导管相关的血流感染且可能危及生命。
皮肤及软组织感染(SSTI)为常见的医学病症且常在创伤及手术程序后发生。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)为最常见的自深层软组织感染患者分离出的病原体，虽然包括彼等在正常皮肤上发现的任何病原生物体均可造成感染。许多SSTI之严重度为轻度或中度，允许以口服杀菌剂及局部清洗进行成功的治疗。相反，常发生在有潜在危险因素患者中的更加严重或复杂的感染(例如，血管损害、糖尿病)和/或由难治性或多重抗药菌造成的感染可能需要有效的静脉内杀菌治疗及积极的外科清创。
葡萄球菌为临床及治疗问题且自20世纪60年代早期开始逐渐与医院感染有关。凝固酶阳性物种抗二甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为社区获得性及医院感染长期以来的问题，且已将若干凝固酶阴性葡萄球菌认定为机会性人病原体，尤其是在重症监护室危重患者的治疗中。临床关注的另一个主要原因为在世界许多地方抗青霉素肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)株的分离增加。
糖肽抗生素万古霉素(Vancomycin)及替考拉宁(teicoplanin)已用于对抗由下列物质所造成的严重医院感染：抗多种药物的革兰氏阳性病原体尤其是MRSA、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)及肠球菌。万古霉素及替考拉宁可用于MRSA引起的感染，且直至最近，所有分离菌均受到影响。然而，目前据报导具有中等敏感性或抗替考拉宁及万古霉素的金黄色葡萄球菌的分离菌株出现频率逐渐增加。已报导了基于抗药性机制而被分为“VanA”、“VanB”或“VanC”的许多抗万古霉素株。因此，需要替代的治疗选择。
在对抗多数革兰氏阳性菌中替考拉宁至少与万古霉素活性相当且似乎造成更少不良事件。两种治疗形式均需要至少每日一个剂量以实现完全康复。目前，由所述病原体中的某些所造成的严重感染的治疗选择相当受限。革兰氏阳性病原体对万古霉素的新兴抗药性使得可能使用具有增加高度需要功效之潜力的新抗生素。
此外，需要与当前可用的治疗相比投药次数较少的投药方案以增加患者的舒适度，尤其是用于非经肠(例如，静脉内或肌肉内)投与抗生素。有时对于需要以非经肠方式投与多日(multi-daily)抗生素的情况住院为必要的，且投药次数较少的投药将有利于允许待实施于门诊病人的所述治疗。
虽然，投药次数较少的投药为抗生素投药方案所要的特征，但是所投与抗生素的“医药窗”(即毒性曲线)必须被充分接受以允许待投与的较大的单个剂量而无在被治疗患者中造成严重不良反应的危害性治疗。另外，即使当抗生素呈现适合的医药窗时，仅在抗生素呈现适当的血清半衰期时可能进行投药次数较少的投药以维持经过投药间隔期所需的治疗功效。抗生素的血清半衰期规定活体内药物的寿命及投药后血清水平将达到最小最低水平的时间长度，而所述水平仍可有效杀菌。投与抗生素的第一剂量后随着时间产生的血清最低水平规定何时必须投与另一剂量以保持活体内抗生素的最小杀菌水平。
基于上述观点，具有对抗抗一种或多种抗生素的菌株(尤其是MRSA)活性的抗生素将具有商业价值且将满足长期以来此项技术中的需要，此抗生素可以每5-7日或更长时间一次的投药间隔来投与。
发明内容
本发明提供用于以达巴霉素治疗或预防细菌感染的组合物、方法及套件。令人惊讶的是，已发现稳定的达巴霉素调配物呈现医药窗及延长的血浆半衰期以允许约每5-7日或更长时间一次的治疗方案，同时保持活体内的抗菌特性。
因此，一方面，提供包括单位剂量达巴霉素、稳定剂及医药上可接受的载剂的医药组合物，所述达巴霉素的量足以为个体提供治疗或预防上有效的达巴霉素血浆水平至少5日。
本发明的医药组合物通常以用于投与个体的医药上可接受的形式来调配，例如，医药上可接受的含水调配物。所述医药组合物较佳为非经肠路径投与，例如，经静脉内或经肌肉内。因此，在此较佳实施例中，所述医药组合物通常为无菌的。
在某些实施例中，在投与个体之前，单位剂量的达巴霉素是以干粉(例如冻干)形式提供并且于医药上可接受的载剂中复水，诸如无菌含水调配物。在一实施例中，医药上可接受的载剂包括水中的5％右旋糖。本发明的医药组合物可投与需要治疗或预防细菌感染的哺乳动物，诸如人。在某些实施例中，医药组合物可包括至少一种非达巴霉素抗生素，诸如对革兰氏阴性菌具有有效(例如杀菌)抗性的抗生素和/或对达巴霉素所不能有效抗的革兰氏阳性物种(诸如抗VanA万古霉素的菌株)具有有效抗性的抗生素。
在投与个体之前，使用一种或多种稳定化物质抑制一种或多种达巴霉素组份在作为干粉(例如冻干)调配物和/或含水调配物储存期间降解。降解可随着时间导致不合需要地形成活性较低和/或非活性组份，其可以在活体内潜在地引起不良效果。优选的稳定剂包括非离子性组份，诸如糖或糖醇，例如单、二或多糖或其衍生物，例如甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘油、纤维素、海藻糖、麦芽糖或右旋糖或其混合物。
另一方面，提供在有需要的个体中治疗细菌感染的方法，包括以足以在个体中提供治疗上有效的达巴霉素血浆水平持续至少5天的量投与至少一个单位剂量的达巴霉素与医药上可接受的载剂。治疗上有效的达巴霉素血浆水平通常是每升血浆中至少约4mg达巴霉素。在一实施例中，所投与的达巴霉素的剂量的量是在临床上有效并且对比以诸如替考拉宁与万古霉素的药物进行护理的标准、也具有减少的不良副作用的量。
达巴霉素可作为单剂量或多剂量投与。在某些实施例中，投与约100mg到约4000mg(例如3000mg)的单剂量的达巴霉素。在各种实施例中，单个达巴霉素剂量可包括0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5或3克中的至少一个。
在其它实施例中，间隔约5到约10天投与两个剂量，例如间隔约1周。第一剂量可以是约500到约5000mg达巴霉素并且第二剂量可以是约250mg到约2500mg达巴霉素。第一剂量通常包括第二剂量中所含的达巴霉素量的约1.5到约3倍，通常至少是约2倍。举例而言，第一剂量可以是约1000mg并且第二剂量可以是约500mg达巴霉素。在其中投与两个剂量的方法中，在投与第二剂量之前个体中的达巴霉素的血浆最低水平通常是每升血浆中至少约4mg，通常至少约10mg，通常至少约20mg，更通常至少约30mg达巴霉素，并且更通常是每升血浆中至少约40mg达巴霉素。
本发明的方法通常包括非经肠投药，例如静脉内投药。在某些实施例中，投药是以受控投药速率在静脉内进行，以便投药发生经至少约30分钟或更长时间。
本发明的方法可用于治疗革兰氏阳性细菌感染，例如金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌皮肤及软组织感染。在某些实施例中，所述感染是抗青霉素及/抗多种药物的。
另一方面，提供用于预防细菌感染的方法，包括以足以在个体中提供预防上有效的达巴霉素血浆水平持续至少约1天、3天、5天、1周或10天或更长时间的量投与至少一个单位剂量的达巴霉素与医药上可接受的载剂。例如，达巴霉素的剂量可以是约100mg到约1000mg。在某些实施例中，在治疗程序或住院之前、期间或之后投与达巴霉素。
本发明的治疗或预防方法可包括投与至少一种非达巴霉素抗生素，优选的是对革兰氏阴性菌具有有效抗性的抗生素和/或对达巴霉素所不能有效抗的革兰氏阳性菌株(诸如VanA菌株)具有有效抗性的抗生素。
一方面，提供套件，其包括至少一个单位剂量的达巴霉素和用于细菌感染的治疗或预防方法中的说明书，所述达巴霉素的量足以在个体中提供治疗上有效的达巴霉素血浆水平持续至少约5天或预防上有效的达巴霉素血浆水平持续至少约1天。套件可含有两个单位剂量，其中第一剂量包括1.5到3倍、经常是至少约两倍于第二剂量中所包括的达巴霉素量。套件也包括非达巴霉素的抗生素，优选地对革兰氏阴性菌具有有效抗性。
在一实施例中，提供套件，其包括含有干粉(例如冻干)达巴霉素组合物的第一容器与含有用于与达巴霉素组合物混合的预定量的生理上可接受的水溶液的第二容器。所述溶液优选地是无菌水溶液。在一实施例中，套件包括用于将达巴霉素组合物投与个体的传递装置，例如注射器或静脉内投药装置。
附图说明
图1描述接受静脉内输注单个1000mg达巴霉素后达巴霉素血浆浓度对比时间的曲线。
图2描述达巴霉素与人血清白蛋白结合(最高)的等温滴定量热法数据及与测定自达巴霉素:蛋白的2:1结合模式的曲线相拟合的数据(最低)的图形表示。
图3描述达巴霉素的电喷射电离质谱。
图4是达巴霉素浓度对比达巴霉素多聚体与单体的群体比率的图表，并描述达巴霉素多聚体与单体的群体比随着达巴霉素浓度增加而增加。
图5是pH对比达巴霉素多聚体与单体的群体比率的图表，并描述达巴霉素多聚体与单体的群体比随着pH增加而增加。
图6描述甲酸铵5mM pH5溶液中的达巴霉素的电喷射电离质谱。
图7描述甲酸铵50mM pH5溶液中的达巴霉素的电喷射电离质谱。
图8描述甲酸铵100mM pH5溶液中的达巴霉素的电喷射电离质谱。
图9描述水中的替考拉宁(50μg/mL)的电喷射电离质谱。
图10描述水中的替考拉宁(100μg/mL)的电喷射电离质谱。
图11描述HSA对26℃(pH7.4)下的达巴霉素/三肽结合作用的表观离解常数的影响。
图12描述使用相同三肽溶液在相同条件下，三肽与万古霉素及达巴霉素结合的等温量热(ITC)数据的对比。
图13A与13B描述达巴霉素单体及多聚体(包括二聚体)与三肽配位基及HSA的可能的相互作用。
图13A描述在溶液中的单体-二聚体平衡下作为单体与HSA上的两个独立位点结合的达巴霉素。
图13B描述与溶液中的达巴霉素二聚体结合并更弱地与连接到HSA上的达巴霉素单体结合的配位基。
具体实施方式
本发明提供改良的剂量方案及新颖达巴霉素组合物及治疗耐抗生素细菌感染的改良方法。特定言之，本发明提供具有抗一种或多种抗生素抗性菌株(诸如MRSA)的活性的达巴霉素组合物，其可以每隔5-7天或更长时间投与1次的定量方案投药。
在科学文献中也称作BI397或VER001的达巴霉素是半合成糖肽混合物，其特性已报导于美国专利第5,606,036号、第5,750,509号、第5,843,679号及第5,935,238号中。
如本文中所用，术语“达巴霉素”指的是包含如下的组合物：一种或多种(优选为两种或两种以上)如下所述紧密相关的被称作“A0”、“A1”、“B0”、“B1”、“C0”及“C1”的同系物、或其单体、多聚体(即二聚体或更高阶的多聚体)、互变异构体、酯、溶剂化物或医药上可接受的盐。如本文中所用，“二聚体”或“多聚体”指的是同型二聚体或同型多聚体，即由相同达巴霉素同系物单体构成的二聚体或多聚体；或异型二聚体或异型多聚体，即由至少两种不同的达巴霉素同系物单体构成的二聚体或多聚体。达巴霉素通常包括如下所述的非同系物变体“MAG”。达巴霉素同系物与MAG有时候被单独称作“达巴霉素组份”。
如Malabarba与Donadio的(1999)Drugs of the Future24(8)：839-846中所述，通过化学修饰天然糖肽复合物A-40，926制备达巴霉素。达巴霉素的主要组份是B0，其占整个复合物>75％。
达巴霉素组合物中所存在的各组份的量是由各种因素规定，包括(例如)天然糖肽复合物A-40926(达巴霉素的前驱物(例如参见美国专利第5,843,679号))的制备中所用的发酵条件、用于自发酵肉汤回收A-40926的条件、用于选择性酯化A-40926的糖部分的羧基的化学反应、用于酰胺化肽酰羧基的条件、用于皂化N-酰胺基葡糖醛酸官能基的羧基的酯的条件、用于自合成混合物回收达巴霉素的条件及类似条件。
在优选实施例中，达巴霉素组合物包含至少约80到至少98重量％的B0组份。在特别优选的实施例中，达巴霉素包含如下量的B0：
表1.达巴霉素组合物中B0组份的优选量
 
优选的1 更优选的1 最优选的1
80-98 80-97 80-96
81-98 81-97 81-96
82-98 82-97 82-96
83-98 83-97 83-96
84-98 84-97 84-96
85-98 85-97 85-96
86-98 86-97 86-96
87-98 87-97 87-96
88-98 88-97 88-96
89-98 89-97 89-96
90-98 90-97 90-96
1各范围代表相对于包括MAG的达巴霉素组合物中所存在的全部达巴霉素组份的B0的摩尔％
若干达巴霉素组份的化学结构如下式I所述：
Figure S071E0471220070822D000071
 
达巴霉素组份 R 分子量
A0 -CH(CH3)2 1802.7
A1 -CH2CH2CH3 1802.7
B0 -CH2CH(CH3)2 1816.7
B1 -CH2CH2CH2CH3 1816.7
C0 -CH2CH2CH(CH3)2 1830.7
C1 -CH2CH2CH2CH2CH3 1830.7
所有上述达巴霉素组份对多种革兰氏阳性菌具有杀菌活性。然而，称作“MAG”的一种非同系达巴霉素组份(其缺少其它组份中所存在的葡糖胺)与其它达巴霉素组份相比在活体内与活体外的杀菌效力均较低。认为MAG为一种或多种其它达巴霉素组份的分解产物。因此在一优选实施例中，达巴霉素中MAG的量低于约4、3.5、3、2.5、2、1.5、1或0.5摩尔百分比的所存在的包括MAG的所有达巴霉素组份。
认为达巴霉素通过结合肽聚糖的D-丙氨酰-D-丙胺酸-终止型前驱物来抑制细菌细胞壁的生物合成。达巴霉素的二聚体或更高阶的多聚体通过亲脂侧链与细菌的细胞质膜相互作用可具有其它杀菌特性。例如参见Malabarba与Ciabatti等人(2001)CurrentMedicinal Chemistry 8：1759-1773。对达巴霉素多聚体的另一份详细研究可见于题为″DALBAVANCIN COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF BACTERIAL INFECTIONS″的美国第10/____号，，其与代理人案号第34231-20052.00号同时申请，其揭示内容全文以引用方式并入本文中。
在活体外，非临床与临床数据表明达巴霉素有益于治疗由MRSA与CoNS及所有链球菌及非VanA肠球菌物种(包括对万古霉素不太敏感或具有抗性的VanB与VanC表现型)所引起的严重革兰氏阳性感染。
达巴霉素在活体外对于抗葡萄球菌(包括某些抗替考拉宁的菌株)比替考拉宁与万古霉素更具活性。达巴霉素对于抗链球菌(包括抗青霉素的菌株)比替考拉宁或万古霉素具有更好的活性。达巴霉素在活体外与活体内对于抗多种革兰氏阳性菌(包括抗大部分药物的菌株)均具有活性。
达巴霉素通常作为达巴霉素组合物投与个体。如本文中所用，术语“达巴霉素组合物”或“达巴霉素调配物”指的是组合物，通常是包含上述达巴霉素与一种或多种其它非达巴霉素组份的医药组合物，所述非达巴霉素组份例如是医药上可接受的载剂、稳定剂、缓冲剂或其它类似组份。
如实例1中所示，达巴霉素在剂量间隔为一周时有效。因此，达巴霉素对比其它治疗选择的优点在于基于每周一次投与此抗生素的能力，从而使患者依从性达到最大并且潜在地最小化非经肠抗生素投药的住院需求或将非经肠抗生素投药的住院期降至最低。频率更低的投药通常允许基于门诊患者的治疗，因此降低治疗费用。如实例1中进一步所示，在投与第一剂量约一周后，达巴霉素的第二剂量意外地提供治疗功效上的显著改良，其中第二剂量约为第一剂量的一半。
使用方法
提供将达巴霉素投与需要细菌感染治疗的个体的方法。治疗可包括预防、治疗或治愈。方法包括以治疗上或预防上有效的量投与一个或多个单位剂量的达巴霉素。
如本文中所用，“治疗上有效量”指的是将提供所要治疗结果(例如减少或消除细菌感染)的达巴霉素的量。治疗上有效量可以一个或多个剂量投与。“预防上有效量”指的是当投与易患和/或(例如)由于治疗程序或住院或暴露于患有细菌感染的个体而可能染上细菌感染的个体时，足以防止或减轻未来细菌感染的严重程度的达巴霉素的量。达巴霉素通常在医药上可接受的载剂中投与。
达巴霉素通常作为可易于溶于水中的盐酸盐提供。
达巴霉素通常作为达巴霉素调配物中的“单位剂量”投与，其包括当投与个体时量足以提供治疗上或预防上有效的达巴霉素血浆水平并持续若干天(通常至少约5天、1周或10天)的达巴霉素。
如本文中所用，“个体”指的是脊椎动物，通常指哺乳动物，常常指人。
尽管认为MAG比其它同系物具有更短的半衰期，但上述达巴霉素的所有同系物于血浆中均呈现延长的半衰期，通常是9天或更长。长半衰期允许比万古霉素或替考拉宁更长的剂量间隔。如实例1中所述，与经常用于万古霉素的每天两次投药计划或通常用于替考拉宁的每天一次计划相比，达巴霉素仅需每周投药一次即可有效控制细菌感染。尤其就改良的便利性和患者对治疗方案的依从性而言，以较低频率投与达巴霉素可提供优于万古霉素和替考拉宁的显著治疗优点。可以比其它可用治疗选择要低的投药频率投与异常高的剂量(即导致异常高的及持久的血清水平)。因为在实施低频率投药所需的浓度下达巴霉素在活体内呈现最小的不良效果(表明大医药窗)，并且进一步因为达巴霉素血液水平维持在整个治疗方案的最低杀菌水平以上(表明延长的达巴霉素血清半衰期)，因此可用于达巴霉素的新颖剂量方案可提高功效。延长的血清半衰期与大医药窗的组合允许以较低频率投与达巴霉素。
另外，优选地将达巴霉素与可抑制一种或多种达巴霉素组份降解的稳定剂一起调配。在一优选实施例中，达巴霉素与1:2重量比的甘露醇:达巴霉素一起调配。在另一优选实施例中，达巴霉素以1:1:4重量比的甘露醇:乳糖:达巴霉素调配。
在某些实施例中，以可使治疗上有效(即杀菌)的药物血浆水平持续若干天(经常是至少约5到约10天，经常是至少约一周)的剂量投与达巴霉素调配物。达巴霉素通常在血浆中维持在约4mg/l的最低杀菌浓度或以上持续至少5天。达巴霉素经常维持在至少约5mg/l、经常至少约10mg/l、经常至少约20mg/l、经常至少约30mg/l、经常至少约40mg/l的血浆水平，持续至少5天、常持续至少约一周或更长。达巴霉素血浆水平可以此项技术中所熟知的方法测量，诸如液相色谱法、质谱法或微生物生物检定。在实例5中提供一种用于定量血浆中达巴霉素的方法的一实例。
达巴霉素血浆浓度水平的上限通常是由抑制所治疗患者人群中不可接受的不良效果的剂量来规定。
达巴霉素组合物可以单剂量或多剂量投与。当作为单剂量投与时，优选地将达巴霉素组合物调配成含有足量达巴霉素以实现活体内的杀菌活性持续至少5天，优选为至少7天并且更优选为至少10天。
当采用多剂量时，可每周一次投与达巴霉素持续两周或两周以上。在一实施例中，达巴霉素以至少两个剂量投与，经常间隔约5到约10天以两个剂量，更经常地每周一次持续两周投与。如实例1中所示，所述投药方案提供优于常规抗生素治疗计划的显著优点。
达巴霉素组合物也可间隔两天或两天以上或间隔至少一周以多剂量投与或以一个或多个两周一次的剂量投与。在某些实施例中，达巴霉素组合物可每周投与一次，随后两周投与一次或每月投与一次。在某些实施例中，达巴霉素每隔一周投与一次持续2、3、4、5、6或更多周。
最有利地，不需要每天投药，因为使用更大的低频率剂量。例如，单个或多次剂量可在约0.1到约5克范围内。可投与约0.1到约4克(例如约3克)的单剂量以用于各种感染治疗。当投与多剂量时(例如每周一次)，各剂量例如可在约0.25到约5.0克范围内。
就其中投与单剂量治疗感染的实施例而言，剂量的量(例如)可以是约0.1到约5克、或约0.5到约4克、或约1到约3.5克、或约2到约3克，例如约3克。在某些实施例中，投与约1、1.5、2、2.5或3克的单剂量治疗细菌感染。就其中投与单剂量进行预防的实施例而言，剂量的量(例如)可以是约0.1到约3克、或约0.1到约1克，例如约0.5到约0.25克。
在包括多剂量的投药方案中，单个剂量可相同或不同。在某些实施例中，投与比一个或多个随后剂量更高的第一剂量，即例如高出约1.5到3倍。例如，第一剂量可以是约0.5克到约5克并且第二剂量可以是约0.25克到约2.5克，第一剂量可以是约0.8克到约2克并且第二剂量可以是约0.4克到约1克，或者第一剂量可以是约0.4克到约3克并且第二剂量可以是约0.2克到1.5克。
在某些实施例中，投与至少两个剂量，其中第一剂量包括约两倍于随后剂量的达巴霉素。在一实施例中，第一剂量包括约1克达巴霉素并且随后剂量包括约0.5克。在另一实施例中，第一剂量包括约0.5克达巴霉素并且随后剂量包括约0.25克。
在某些实施例中，间隔两天或两天以上或间隔至少约一周以量相同或不同的两个剂量投与达巴霉素组合物。经常间隔约5到约10天、更经常地间隔约1周投与两个约0.2到约1.5克达巴霉素的剂量。在一实施例中，间隔约1周投与约1克达巴霉素的第一剂量与约0.5克达巴霉素的第二剂量。
在多剂量方案中，剂量之间的时间例如可在约5到约10天范围内，经常是约一周。剂量频率例如可以是每周两个剂量或每周多个剂量。投药间隔或剂量之间的时间例如可以是约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多天中的任一个。所给的剂量数目例如可以是1、2、3、4、5、6或更多剂量，首次剂量之后的各剂量是在所选剂量间隔后给出。
在多次投药方案中，“最低水平”或在达巴霉素的第一剂量之后和投与第二剂量之前血浆中的达巴霉素水平为至少约4mg/l。在诸如约一周的投药间隔的末期，最低水平优选地为至少约20mg/l，更优选地为至少约30mg/l，并且最优选地为至少约40mg/l。
达巴霉素可非经肠投与，例如经肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)或鞘内(i.t.)。投药计划与所投与的实际剂量可视诸如感染性质与严重程度、年龄、体重、患者的整体健康及特定患者对达巴霉素的耐受性而有所变化，但对于健康专家而言是可确定的。在一实施例中，在达巴霉素的1克静脉内剂量一周后之后，随后以0.5克静脉内剂量。
将药物投与及传递到患者(例如静脉内)可以受控速率进行，以便血液中的浓度不会增加太快或者发生沉淀。在某些实施例中，以适当速率投与达巴霉素以便药物与血流中的内源蛋白形成复合物。不受限于特定理论，据信诸如人血清白蛋白的内源蛋白可在活体内与一或两个达巴霉素同系物单体分子形成复合物。当存在足量达巴霉素时，据信高达两个达巴霉素同系物分子将结合到内源蛋白上，并且进一步据信通过在两个不同的结合位点上结合独立的达巴霉素同系物分子来形成此复合物。或者，二聚体达巴霉素结合到内源蛋白的单个结合位点上也是可能的。对以上讨论的达巴霉素-内源蛋白复合物的另一份详细研究可见于题为″COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATINGBACTERIAL INFECTIONS WITH PROTEIN DALBAVANCIN COMPLEXES″的美国第10/___号，，其与代理人案号第34231-20053.00号同时申请，其揭示内容全文以引用方式并入本文中。
输注持续时间例如可以是约1分钟到约2小时。举例而言，可使用约30分钟的输注持续时间，其中剂量是约0.5到约1克。在受控速率条件下进行静脉内投药可产生比在活体外的生理pH下于溶液相中可达成的浓度远远过量的体内达巴霉素浓度。尽管不希望受限于理论，但此可归因于达巴霉素与诸如血清白蛋白的内源蛋白形成复合物，其可增加血浆吸收达巴霉素的容量。
在活体外(in vitro或ex vivo)形成达巴霉素复合物可允许更快的投药，诸如至少约1分钟、至少约10分钟或至少约20分钟。通过混合人血清白蛋白和/或另一内源蛋白与达巴霉素可达成所述复合物，从而在活体外形成复合物，并且接着将此复合物投与所治疗患者。或者，人血清白蛋白或其它内源蛋白可从自体来源获得或自经修饰以含有用于所述蛋白的基因的微生物通过表达来获得。
所投与的达巴霉素的量可以是任何本文中所揭示的剂量。通常选择达巴霉素剂量以便药物将以治疗上或预防上有效(即杀菌)的血浆水平保持延长时期，经常是至少5天，更经常地是约一周或更长。优选投与可产生并维持杀菌浓度至少约一周(或约5到约10天)的达巴霉素剂量。杀菌浓度定义为经24小时杀死至少99％活体外实验最初所存在的细菌所需要的达巴霉素浓度。血浆中达巴霉素的最小杀菌浓度通常是约4mg/l。
可治疗的适应症的实例包括并发性与非并发性皮肤及软组织感染(SSTI)、血流感染(BSI)、与导管相关的血流感染(CRBSI)、骨髓炎、假体接头感染、外科预防、心内膜炎、医院或社区获得性肺炎、肺炎球菌肺炎、发烧性白细胞过低症的经验治疗、关节间隙感染及装置感染(例如起博器与内部心脏除颤器)。可治疗革兰氏阳性或耐抗生素的细菌感染，诸如葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、奈瑟氏菌(Neisseria)或芽孢梭菌(Clostridium)属感染，特定言之是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、A与C群链球菌、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)或芽孢杆菌(Clostridium difficile)。
本发明提供治疗皮肤及软组织感染(SSTI)的方法。受益于此治疗的患者可具有深度或浅度感染。SSTI可包括更深度的软组织感染和/或需要显著外科干预的感染，诸如严重脓肿、感染性溃疡、严重灼伤或深度与大面积蜂窝组织炎。也可治疗受感染的外科伤口。
皮肤与皮肤结构感染的临床表现可自轻度毛囊炎至严重坏死性肌膜炎而有所不同。获得模式也可随社区获得性皮肤与皮肤结构感染而有所变化，所述感染之前是由偶然暴露或娱乐活动引起的损伤并通常与病原体较大的多样性相关。医院获得性皮肤与皮肤组织感染通常与外科程序、褥疮及导管插入相关。后外科感染是第三常见的医院感染并占全国院内感染监测系统(NNIS)报导的所有医院感染的17％。最常见的感染源是患者的内源菌群。金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及肠球菌属是最经常自SSTI分离的病原体。
SSTI感染的症状可包括红斑、触痛或疼痛、发热或局部温暖、排液或淌液、肿胀或硬化、发红或波动。受益于以本发明的方法进行治疗的患者包括具有深度或并发感染或需要外科干预的感染的患者或具有潜伏性糖尿病或外周血管疾病的患者。所述感染经常是由革兰氏阳性菌引起，诸如葡萄球菌或链球菌种，诸如金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌。治疗皮肤或软组织细菌感染的方法包括以一定量并根据如上所述的投药方案将治疗上有效量的达巴霉素投与需要治疗的个体。在某些实施例中，分两个剂量经静脉内投与达巴霉素组合物，经常是间隔约5到约10天，更经常地是间隔约1周。在某些实施例中，第一剂量包括至少两倍于第二剂量的达巴霉素。在一实施例中，第一剂量是约1000mg并且第二剂量是约500mg。
本发明还提供用于预防性防止细菌感染发作的方法，所述感染例如是由金黄色葡萄球菌或奈瑟氏菌属或芽孢梭菌属细菌引起的感染。在本发明的预防方法中，将预防上有效量的达巴霉素投与(例如)通过治疗程序可能易染上细菌感染的个体。达巴霉素经常是以足以提供预防上有效的血浆水平持续至少约1天、至少约3天、至少约5天或至少约1周或更长时间的量来投与。达巴霉素组合物可在外科手术之前或之后作为抗感染的预防步骤(例如)非经肠投与，例如经肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、皮下(s.c.)或鞘内(i.t.)注射。可在诸如外科手术的侵袭性治疗程序或在诸如医院的医疗护理机构中住院之前、之后(之前或之后一或多天或约一周)或期间投与达巴霉素组合物以预防感染。预防方法可用于其中个体可能或很可能染上细菌感染的任何情形中，包括其中个体已暴露于或很可能暴露于细菌感染个体的情形。就预防方法而言，达巴霉素组合物可作为单剂量投与，或作为两个或两个以上相等或不同量的剂量间隔若干天到约一周投与。在一实施例中，达巴霉素组合物可在插入静脉内导管之前或同时投与以预防血流的相关感染。
就预防方法而言，达巴霉素组合物可根据如上所述的任何投药方案以单剂量或多剂量投与。达巴霉素组合物经常是作为包含约0.1到约3克或约0.1到约1克(例如约0.25克或约0.5克)的单剂量投与。在一实施例中，经约2分钟到约1小时(例如约30分钟)的时限经静脉内投与约0.25克的单剂量。在另一实施例中，与另一医药(例如抗生素)治疗的投与同时经静脉内投与达巴霉素组合物。
在任何上述治疗或预防方法中，达巴霉素组合物可与至少一种其它抗生素同时或相继投与。在某些实施例中，除达巴霉素之外还投与至少一种其它抗生素，其有效对抗(例如杀菌)一种或多种革兰氏阴性菌类和/或达巴霉素不能有效对抗的革兰氏阳性菌株。在某些实施例中，达巴霉素与有效对抗(例如杀菌)至少一种革兰氏阴性菌类的至少一种抗生素是作为达巴霉素组合物中的混合物投与。
医药组合物
本发明提供为根据上述方法投与达巴霉素而调配的医药组合物。本发明的医药组合物可呈达巴霉素的单位剂量形式，其包括当组合物投与个体时量足以提供治疗上或预防上有效的达巴霉素血浆水平持续若干天(经常是至少约3天、至少约5天、或至少约1周或更长时间)的达巴霉素及医药上可接受的载剂。治疗上或预防上有效的达巴霉素血浆水平通常是每升血浆中至少约4mg。达巴霉素血浆水平可以诸如上述方法的此项技术中熟知的方法测量。
达巴霉素可视情况呈医药上可接受的用于投与个体的形式，视情况作为医药上可接受的无毒性盐。
达巴霉素的合适盐的实例包括通过与有机及无机酸发生标准反应所形成的盐，所述酸例如是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、谷胺酸、樟脑酸、戊二酸、乙醇酸、邻苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸及类似酸。可与达巴霉素形成盐的盐的代表性实例包括碱金属或碱土金属氢氧化物，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁及氢氧化钡；氨与脂族、脂环族或芳族有机胺，诸如甲胺、二甲胺、二乙胺、乙醇胺及甲基吡啶。(例如参见美国专利第5,606,036号)
在某些实施例中，提供适于非经肠(例如静脉内注射)投与的医药上可接受的达巴霉素的含水调配物。为制备所述含水调配物，可使用此项技术中熟知的方法并且可使用此项技术中通常所用的任何医药上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或其它添加剂。在一实施例中，用于静脉内注射的医药上可接受的含水调配物包括5％右旋糖。
用于非经肠投与的医药组合物包括达巴霉素与生理上可接受的稀释剂，诸如去离子水、生理盐水、5％右旋糖、水混溶性溶剂(例如乙醇、聚乙二醇、丙二醇等)、非水性媒剂(例如油，诸如玉米油、棉籽油、花生油及芝麻油)或其它常用稀释剂。调配物可另外包括诸如聚乙二醇、聚丙二醇或其它已知增溶剂的增溶剂、用于稳定溶剂的缓冲剂(例如柠檬酸盐、乙酸盐及磷酸盐)和/或抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)。(例如参见美国专利第6,143,739号)其它合适的医药载剂及其调配物描述于E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中。如此项技术中所已知，还可将本发明的医药制剂制备成含有可接受水平的颗粒(例如无粒子)及制备成非热解性(例如符合美国药典中的可注射要求)。
在一实施例中，通过将经干燥(例如冻干)的达巴霉素剂量溶解于一定量的水中并优选地溶解于体积足以进行溶解的去离子水中来提供医药组合物，其经常含有稳定剂或稳定剂混合物。足以进行溶解的水的量通常是大约10mL并且达巴霉素溶液的所得pH值高于3.0并且是约3.5到4.5。通过将此溶液添加到经常含有5％右旋糖的第二种量的含水稀释剂(诸如用于静脉内投药的滴液袋中所含的量)中来稀释此溶液，从而将达巴霉素溶液的pH值升高到约5到约5.5。在另一实施例中，滴液袋中达巴霉素溶液的pH值是约4.5。第二种量的含水溶液可以是去离子的或无菌的、或是既去离子又无菌的。在一实施例中，含水稀释剂是5％右旋糖。
可在其中可保持达巴霉素的杀菌有效性的条件下在无菌小瓶中构成用于非经肠投与的医药组合物，其含有上述治疗上或预防上有效量的一个或多个单位剂量的达巴霉素，视情况包括赋形剂。组合物可呈(例如)干粉形式。在使用前可添加生理上可接受的稀释剂并通过注射器取出溶液以投与患者。上述医药调配物可通过任何可接受的方式消毒，所述方式例如包括电子束或伽马消毒方法或通过无菌过滤。
用于非经肠投与的典型调配物可包括达巴霉素，其浓度例如是每毫升最终制剂中约0.1到约100mg、约0.5到约50mg、约1到约100mg、或约2到约4mg达巴霉素。
在某些实施例中，根据本发明的医药组合物包括达巴霉素与一种或多种额外抗生素的混合物。优选地，混合物中的至少一种非达巴霉素抗生素为有效对抗(例如杀菌)一种或多种革兰氏阴性菌类(诸如阿兹罗南(aztheronam))和/或有效对抗(例如杀菌)达巴霉素所不能有效对抗的一种或多种革兰氏阳性菌株(诸如依佐立德(ilnezolide)或达托霉素(daptomycin))。混合物也可包括上述医药上可接受的载剂。
在某些实施例中，本发明的医药组合物包括一种或多种抑制一种或多种达巴霉素组份降解为活性较低或非活性材料(例如MAG)的稳定化物质。如本文中所用，“稳定化物质”或“稳定剂”指的是稳定组合物中一种或多种达巴霉素组成组份(例如B0)的水平的稳定剂。“稳定上有效量”指的是足以提高达巴霉素组合物的一种或多种组份的长期稳定性的稳定剂的量。在某些实施例中，可通过两种或两种以上稳定化物质的混合物提供稳定上有效量，其中各物质不是以足以提供稳定化效果的量单独存在。
稳定剂的实例例如包括非离子物质，诸如糖，例如单、二或多糖或其衍生物；糖醇；或多元醇。所述稳定化物质例如包括甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘油、纤维素、海藻糖、麦芽糖、棉子糖或其混合物。
在一实施例中，医药组合物包括重量比是1:2的甘露醇:达巴霉素。在另一实施例中，医药组合物包括重量比是1:1:4的甘露醇:乳糖:达巴霉素。令人吃惊地，已发现甘露醇与乳糖的组合比单独物质提供更好的稳定化效果。本发明的医药组合物的pH值例如经常是约3到约5，例如约3.5或约4.5。
在某些实施例中，可使用一个或多个程序减少MAG形成。例如，在诸如甘露醇的稳定化物质存在下冷冻干燥达巴霉素可用于减少所形成的MAG的量。
达巴霉素组合物的储存经常是在低于周围温度的温度下(诸如在约5℃下)以提高稳定性。
改良的功效与减少的副作用
如本文实例所证明，每周一次以高剂量水平(即导致异常高及持久的血清水平)投药达巴霉素显示异常好的安全性曲线，其类似于或优于每天一次甚或每天2-4次投与较低剂量的常规抗生素的标准治疗所观察到的安全性曲线。可以比其它抗生素更低的频率投与异常高的剂量(即导致异常高及持久的血清水平)的达巴霉素并不具有不良副作用，从而能够改良功效和患者依从性。
如实例1中所讨论，以达巴霉素进行治疗致使低的不良事件发生频率。严重不良事件包括在任何剂量下发生的导致死亡、危及生命、导致住院或住院延长或持久的或显著的能力丧失或无力的任何不良药物经历。在实例1中所述的阶段II试验中，90％的诸如腹泻、恶心、高血糖、肢体疼痛、呕吐及便秘的不良反应在严重程度上是轻度到中度。在实例1的试验中使用达巴霉素未导致与研究药物治疗相关的严重不良事件。
套件
本发明也提供用于细菌感染的治疗或预防方法中的套件。套件包括本发明的医药组合物(例如包括至少一个单位剂量的达巴霉素)与向健康护理提供者提供治疗或预防细菌感染的用法的相关信息的说明书。说明书可以印刷形式、或以诸如软盘、CD或DVD的电子介质形式、或以其中可获得所述说明书的网址形式提供。单位剂量的达巴霉素经常包括当投与个体时使得治疗上或预防上有效的达巴霉素血浆水平在个体内维持至少5天的剂量。在某些实施例中，套件包括间隔至少5天、经常间隔约1周有待投与的两个单位剂量，经常包括比第二剂量高出约1.5到约3倍的第一剂量的达巴霉素。经常包括作为无菌含水医药组合物或干粉(例如冻干)组合物的达巴霉素。
提供合适的封装。如本文中所用，“封装”指的是通常用于系统的并且能够将适于投与个体的达巴霉素组合物保持在固定范围内的固体基质或材料。所述材料包括玻璃与塑料(例如聚乙烯、聚丙烯及聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料及塑料箔层压的封套及其类似物。如果使用电子束消毒技术，那么封装应具有足够低的密度以允许对内容物消毒。
套件还可视情况包括用于投与达巴霉素的设备，例如用于静脉内投与的注射器或设备；和/或用于制备供投与用的组合物的干粉(例如冻干)的无菌溶液，例如，诸如5％右旋糖的稀释剂。
本发明的套件除达巴霉素之外还可包括非达巴霉素抗生素或非达巴霉素抗生素的混合物以如以上方法中所述与达巴霉素一起使用。
在以下实例中，下列缩写具有下列含义。如果未对缩写进行定义，那么其具有通常所被接受的含义。
AcOH           ＝乙酸
AcONa          ＝乙酸钠
aq.            ＝含水
AST            ＝天冬胺酸胺基转移酶
ALT            ＝丙胺酸胺基转移酶
BV             ＝柱床体积
CV             ＝变异系数
d              ＝直径
D              ＝道尔顿
DCC            ＝二环己基碳二酰胺
DMEPA          ＝3-(二甲基胺基)-丙胺
DMSO           ＝二甲基磺酰胺
eq             ＝当量
EU             ＝内毒素单位
g              ＝克
GC             ＝气相层析法
HCl            ＝盐酸
H2O            ＝水
HOBT           ＝水合1-羟基苯并噻唑
HPLC           ＝高效液相层析法
H2SO4          ＝硫酸
IPA            ＝异丙胺
IU             ＝国际单位
KF             ＝氟化钾
Kg             ＝千克
L              ＝升
LC/MS/MS       ＝液相层析/质谱/质谱
LDH            ＝乳酸脱氢酶
LSC            ＝液体闪烁计数
m3             ＝立方米
MeOH           ＝甲醇
mg             ＝毫克
mL             ＝毫升
mol            ＝摩尔
MW             ＝分子量
N              ＝正常
NaOH           ＝氢氧化钠
NMP            ＝N-甲基-2-毗咯烷酮
QTD            ＝定量组织分布
Rt             ＝滞留时间
sd             ＝标准偏差
TEA            ＝三乙胺
下列实例旨在说明本发明，但不欲限制其。
实例
实例1.每周一次的达巴霉素在深度皮肤及软组织感染中的功效及安全性
此随机化的受控研究评估两个达巴霉素剂量方案的安全性及功效。将包括深度皮肤结构或需要外科干预的皮肤及软组织感染(SSTI)成年患者随机分成三组：研究分组1在第1天通过静脉内注射(IV)接受1100mg达巴霉素；研究分组2在第1天通过IV接受1g达巴霉素并在第8天通过IV接受500mg达巴霉素；研究分组3接受“标准护理”(standard of care)。评定临床与微生物反应及不良事件。
用于分析的群体
有62名患者随机分入研究中；所有患者均接受至少一个剂量的研究药物。评估4组研究群体的安全性及功效并定义如下：意向治疗型(ITT)群体包括所有接受至少一个剂量的研究药物的患者(所有随机化的受试者)。微生物意向治疗型(MITT)群体是具有经培养证实的基准革兰氏阳性病原体的ITT患者。将临床上可评估的群体定义为如下群体：1)满足所有研究进入标准，2)除了口服递减治疗(仅用于标准护理组)，在第4天后的革兰氏阳性感染的抗菌治疗中无变化，3)继续进行后续(FU)评定回访(除非治疗失败)，及4)不接受非协议认可的伴随抗菌剂(除非治疗失败)。微生物学上可评估的群体是具有经培养证实的基准革兰氏阳性病原体的临床上可评估的患者亚组。
研究群体示于表2中。
表2.用于达巴霉素SSTI治疗的研究群体
 
群体 研究分组1达巴霉素1100mg第1天          研究分组2达巴霉素1000mg第1天500mg第8天          研究分组3“标准护理”
随机化的ITT 20 21 21
治疗 20(100％) 21(100％) 21(100％)
完成的研究 18/20(90％) 20/21(95.2％) 21/21(100％)
EOT时的临床评估 16/20(80％) 17/21(81％) 21/21(100％)
FU时的临床评估 13/20(65％) 17/21(81％) 21/21(100％)
MITT 14/20(70％) 13/21(61.9％) 14/21(66.7％)
EOT时的微生物评估 13/20(65％) 11/21(52.4％) 14/21(66.7％)
FU时的微生物评估 11/20(55％) 11/21(52.4％) 14/2(66.7％)
ITT-意向治疗型
MITT-具有经培养证实的革兰氏阳性感染的ITT群体亚组
EOT-治疗结束
FU-后续
受试者的中位数年龄是50-55岁(18-86岁的范围)。治疗分组之间的年龄无明显差异。治疗分组之间的性别存在差异，但整个研究登记了相等数目的男性与女性。患者群体主要是高加索人。对于ITT与临床上可评估的群体而言所述结果是一致的。
登记了62名患者，研究分组1中有20名并且研究分组2与3中各有21名。标准护理的最常见的对比物是克林霉素(clindamycin)、头孢曲松(ceftriaxone)、万古霉素及头孢唑啉(cefazolin)。研究分组3中的治疗平均持续时间是15天。
基准病原体与敏感性
在62名ITT患者中，66％(14名单剂量达巴霉素，13名两剂量达巴霉素，14名标准护理)具有经分离的预先治疗革兰氏阳性病原体(MITT群体)。最常见的病原体是金黄色葡萄球菌。基准病原体的分布示于表3中。
表3.MITT群体的基准革兰氏阳性病原体及达巴霉素MIC范围
 
病原体数目(MIC)      单剂量达巴霉素(1100mg)(N＝14)        两剂量达巴霉素(1000/500mg)(N＝13)        标准护理方案(N＝14)     
所有金黄色葡萄球菌 13(0.12) 11(0.12) 10(0.016-0.25)
Methicillin敏感性 7 6 8
抗Methicillin性 6 5 2
B群链球菌 0 2(0.016) 2(0.016)
化脓性链球菌 0 1(0.016) 1(0.016)
 
混杂的链球菌与非可分型菌株 3(0.016) 2(0.016) 4(0.016)
临床与微生物反应
通过评定患者的临床反应与经证明或假定的微生物反应来判定三个治疗方案的有效性。主要的功效终点是临床上可评估的群体于后续回访时的临床反应。EOT与FU回访的临床反应均分类为成功(治愈或改善)或失败(包括不确定结果)。归类为成功的患者必须未接受用于其感染的额外的全身性抗菌治疗。失败是定义为一个或多个SSTI的局部或全身指征与症状存留，使得需要新型或额外的全身性抗菌剂以用于SSTI。
在具有微生物学经证明的SSTI(即至少一个经确定的基准病原体)的患者亚组中评定次要的功效变数微生物结果。在基准处评定经确定的各革兰氏阳性病原体的微生物反应(即根除、推测根除、存留、推测存留)。对于未进行后续培养的患者而言，以临床反应为基础推测基准病原体的微生物反应。EOT与FU回访时患者的微生物反应分级为成功(即所有革兰氏阳性有机体根除或推测根除)或失败(即至少一种革兰氏阳性有机体存留或推测存留，多种病原体部分根除)。在EOT与FU回访时均评定拓殖与重复感染。在FU回访时患者的细菌学反应也可包括复发。
临床功效
临床成功率示于表4中。在临床上可评估的群体中，单剂量达巴霉素组中的61.5％患者、两剂量达巴霉素组中的94.1％患者及标准护理组中的76.2％患者在FU评定时被归类为成功。在分类为于基准处具有深度或并发SSTI的那些患者的试探性子分析中，相比于各自是58.3％与73.7％的单剂量达巴霉素治疗与标准护理治疗，两剂量达巴霉素治疗也提供较高的临床成功率(93.8％)。
在接受两剂量达巴霉素治疗后始终倾向于具有更有利的反应的支援性ITT与微生物学上可评估的群体中，在EOT与FU评定中发现类似的成功率(表3)。就MITT群体而言，具有抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)的患者在FU评定时单剂量达巴霉素的临床成功率是50％(3/6)，两剂量达巴霉素是80％(4/5)，并且以标准护理方案治疗的患者是50％(1/2)。
表4.通过分析群体与治疗组所得的临床成功率
 
群体 单剂量(1100mg)达巴霉素       两剂量(1000/500mg)达巴霉素     治疗标准方案
EOT时的ITT 15/20(75.0) 19/21(90.5) 17/21(81.0)
 
FU时的ITT 12/20(60.0) 19/21(90.5) 16/21(76.2)
EOT时的MITT 10/14(71.4) 12/13(92.3) 10/14(71.4)
FU时的MITT 7/14(50.0) 12/13(92.3) 9/14(64.3)
EOT时的临床上可评估 13/16(61.5) 16/17(94.1) 17/21(81.0)
FU时的临床上可评估 8/13(61.5) 16/17(94.1) 16/21(76.2)
EOT时的微生物学可评估                 10/13(76.9) 10/11(90.9) 10/14(71.4)
FU时的微生物学可评估 6/11(54.5) 10/11(90.9) 9/14(64.3)
微生物功效
关于不同病原体的不同治疗方案的成功率示于表5中。就微生物学可评估的群体而言，在FU评定时所有有机体的根除/推测根除率是58.3％(7/12)，就两剂量达巴霉素而言是92.3％(12/13)，并且就标准护理组中的患者而言是70.6％(12/17)。就存留的分离菌而言，在达巴霉素MIC中无变化。在FU中，两剂量达巴霉素组的金黄色葡萄球菌的根除率(90％)与单剂量达巴霉素(50％)及标准护理(60％)治疗相比较高。观察到MITT群体的类似发现；两剂量达巴霉素根除80％的MRSA分离菌(表5)。
表5.在FU评定时微生物ITT群体的病原体成功率
Figure S071E0471220070822D000221
就微生物学上可评估的MITT群体而言，EOT与FU时的微生物成功率总结于表6中。在以两剂量达巴霉素及标准护理方案治疗的患者的回访中均报导了相当的微生物成功率(大约64％到77％)，而那些提供单剂量达巴霉素的具有较低的成功率(<40％)。微生物学上可评估的群体中的EOT/FU微生物成功率平行于临床反应发现：就单剂量达巴霉素而言是38.5％/27.3％，就两剂量达巴霉素而言是72.7％/72.7％，并且就标准护理治疗而言是71.4％/64.3％。观察到MITT群体的类似发现(数据未显示)。
表6.微生物成功率
Figure S071E0471220070822D000231
药物动力学分析
就随机分入达巴霉素治疗组的患者而言，在第8天获得5ml血液以测定达巴霉素血浆浓度。对于在第8天随机接受500mg达巴霉素剂量的患者而言，在即将投与第二剂量前获得血液。就随机分入单剂量达巴霉素组的患者而言在第10天与第24天获得额外的5ml血液样本，并且就接受两剂量达巴霉素的患者而言在第20天与第34天获得额外的5ml血液样本。
使用经验证的液相层析法与质谱分光光度计方法测定达巴霉素血浆浓度。对血浆而言定量的下限是500μg/ml。
在单剂量方案中于第8、10及24天收集的平均达巴霉素浓度分别是31.1±7.1、25.2±4.8及10.2±3.5mg/l(平均值±SD)。接受两剂量方案的达巴霉素浓度在第8(第二剂量之前)、20及34天分别是30.4±8.2、21.2±10.0及9.0±4.4mg/l。如所期望的，所有患者接受第一剂量第一周内均具有高于20mg/l的达巴霉素浓度，在第8天以静脉内的额外500mg剂量使高于20mg/l的水平维持额外一周。最大杀菌浓度通常是约4到10mg/l。
安全性评估
通过监测不良事件(AE)来评估接受至少一个剂量的研究药物的各患者(ITT群体)的药物安全性，所述不良事件包括异常的临床实验室测试结果与生命指征。由研究者根据AE的严重程度将AE分级(轻度、中度、严重、危及生命)，并以与研究药物的关系分级(不相关、不太可能相关、可能相关或很可能相关)。
AE数据的总结呈现于表7中。认为大部分不良反应(90％)在严重程度上是轻度到中度。所有严重的不良反应(5名患者中有8起事件)均与研究药物治疗无关。报导有至少一个治疗紧急AE的所有患者中大约59％(19单剂量达巴霉素，16两剂量达巴霉素，21治疗标准)经历由研究者分类为与研究药物可能或很可能相关的事件。在11(55％)单剂量达巴霉素、10(48％)两剂量达巴霉素及12(57％)标准护理患者中明确报导了与药物相关的AE。在达巴霉素与标准护理无治疗组中最常见的经报导的药物相关AE是腹泻与恶心。不同治疗组的所观察的AE类型的总结呈现于表8中。
没有一个经达巴霉素治疗的患者由于AE过早地中断治疗。标准护理方案的21名患者中有3名(14％)由于AE过早地中断治疗，包括1名患者在第1天出现很可能与药物相关的荨麻疹，及2名患者具有与研究药物无关的AE(重复感染铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)与提高的万古霉素最低水平)。
表7.不良事件(AE)数据的总结
 
单剂量达巴霉素(N＝20) 两剂量达巴霉素(N＝21) 标准护理(N＝21)
≥1AE 95％ 76.2％ 100％
％AE严重 15％ 9.5％ 4.8％
≥1AE可能/很可能与治疗相关的 55％ 48％ 57％
导致研究药物中断的AE 0 0 14.3％
≥1严重AE 2(10％) 2(9.5％) 1(4.8％)
表8.最常见的不良事件
 
单剂量达巴霉素(N＝20)    两剂量达巴霉素(N＝21)        标准护理(N＝21) 
腹泻 20％ 9.5％ 28.6％
恶心 10％ 28.6％ 9.5％
高血糖 5％ 14.3％ 19％
四肢疼痛 10％ 9.5％ 9.5％
呕吐 10％ 14.3％ 4.8％
便秘 5％ 4.8％ 14.3％
讨论
此开放标记的随机化的阶段II试验显示达巴霉素可有效治疗具有SSTI的成人。大部分经登记患者具有深度或并发感染(>90％)与需要外科干预的感染(～70％)，而大约45％具有潜伏性糖尿病。
每周两次的达巴霉素剂量具有数字上比单剂量达巴霉素或标准护理方案更高的临床反应率。来自ITT与临床上可评估的群体的数据表明每周两次相继的注射式达巴霉素剂量(每周1000mg，500mg)在SSTI治疗上很有效。以13天的中位数持续时间治疗标准护理组。在后继回访中，相比于提供标准护理方案的患者中的76％与接受单剂量达巴霉素的患者中的61.5％，认为以两剂量达巴霉素治疗的临床上可评估的患者中的94％是临床成功。
金黄色葡萄球菌是基准处最常见的分离有机体。在此试验中，大约83％的患者感染金黄色葡萄球菌并且所有金黄色葡萄球菌中38％是MRSA。大多数感染(80％)是由单个病原体引起。达巴霉素抗革兰氏阳性分离菌(包括MRSA)的MIC在0.016到0.25mg/L范围内。
微生物成功率平行于临床上可评估的群体的临床反应的成功率。就经组合的所有有机体而言，相比于单剂量达巴霉素治疗(58％)与标准护理治疗(71％)，以每周两个剂量达巴霉素的方案进行治疗在治疗2周后的评定时可提供较高的根除率(92％)。总而言之，在90％、50％及60％的患者中分别观察到金黄色葡萄球菌根除率。就MITT群体而言，对比于单剂量达巴霉素治疗与标准护理治疗的50％，两剂量达巴霉素方案的MRSA根除率是80％。
在每周单剂量与两剂量的治疗期结束时(分别是第10天或第20天)获得的达巴霉素浓度相类似，表明接受第二个每周剂量后药物积累很少。观察到的两剂量方案的较高临床成功率表明时间依赖性杀灭效应，其中以间隔1周的两个达巴霉素剂量提供持续的药物水平或药物暴露。在每周投药间隔末期测量的达巴霉素血浆水平大体上高于所报导的对大部分SSTI负责的病原体的MIC90(<0.03到0.5mg/L)，包括此试验中所发现的MIC90。所述水平也高于4到10mg/l的最低杀菌浓度。
达巴霉素方案与标准护理组的总体不良反应率类似。与胃肠道药物相关的不良事件(即腹泻与恶心)在三个治疗组中最经常地有所报导。大部分所述事件是轻度与自我限制的。没有一个以达巴霉素治疗的患者由于不良反应自研究早期撤离，也未见任何可归因于所报导糖肽的严重不良事件，但标准护理组中有14％由于不良效应撤离。新颖剂量方案与标准护理相比因此具有减少的不良副作用。来自此试验的数据未发现达巴霉素诱导任何程度的临床上显著的肝中毒或肾脏中毒的任何证据。
两剂量达巴霉素方案显得对治疗具有并发SSTI的患者很有效。在两个剂量下达巴霉素在此临床试验中均被很好地耐受，同时具有与标准护理组类似的不良事件曲线。
实例2.健康受试者中的达巴霉素药代动力学及肾排泄
此项研究的主要目的是为了将达巴霉素的药代动力学特征化及计算接受治疗剂量药物的健康受试者的肾排泄程度。此为开放标记、非对照性研究。
研究药物治疗
将单个1000mg IV剂量的达巴霉素经30分钟注入18到65岁之间的健康男性及女性受试者。
记录6个受试者(1名女性及5名男性)接受研究药物及所完成的研究的所有方面。3名受试者为高加索人且3名受试者为美籍非洲人。平均年龄为29.8岁(从22到63)。平均高度为68.6英寸(从63到75)且平均体重为179.61bs(从140到244)。
药代动力学
在研究的第1、2、3、4、5、6、7、14、21、28及42日收集血液及尿(24小时收集)。将血液样本抽吸入肝素化的管子中且进行离心。分离血浆且于-20℃下冷冻储存直到检定时间。使用有效的LC/MS/MS方法来检定血浆及尿样本中的达巴霉素。尿及血浆定量检定的下限为500ng/mL。
使用WinNonlinTM软件(Pharsight Corporation)通过非间隔方法估计达巴霉素药代动力学参数。浓度峰值(Cmax)直接由观察的数据获得。使用线性梯形法则计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。以剂量/AUC来计算清除率(CL)。通过log浓度对时间曲线的log-线性部分的线性回归来估计消除半衰期(t1/2)。使用回归参数计算估计的体积分布(Vz)，同时由第一时刻曲线下面积(AUMC)乘以剂量且除以AUC来计算稳态下的体积分布(Vss)。以尿排泄率(AURC)的被积函数来确定排泄于尿中的达巴霉素累积量。以AURC/AUC的比率来计算CLr或肾脏清除率：CLR＝AURC/AUC。
所有受试者的达巴霉素血浆浓度对时间的关系皆显示于图1中。药代动力学参数呈现于表9中。所有受试者中的浓度是相似的。血浆峰值浓度约为300mg/L且在注入结束时立即达到。达巴霉素显示大于10L的表观体积分布且因而认为其可在细胞外液中极好的分布。
达巴霉素以9-12日的t1/2缓慢地消除。总药物清除率为0.0431±0.0074L/hr。排泄于尿中的未变化药物部分估计为投与剂量的42％，且估计肾脏清除率为0.018L/h。在受试者中所观察到的可变性很低且在所有药代动力学参数中的变化系数小于22％。
表9.药代动力学参数
Figure S071E0471220070822D000271
安全性评估
记录不良事件且评估严重性及其与研究药物的关系。收集实验室数据(化学盘，具有差异的CBC，尿分析)且评估来自基线与超出范围值的变化。获得ECG、身体检查及生命征象，且评估来自基线的变化。
达巴霉素在此项研究中耐受性良好。在研究期间无受试者死亡或严重不良事件的报导且没有由于AE而过早地自研究中退出的受试者。
据报导所有志愿者均出现至少一起不良事件，所有的不良事件均为轻度。据报导3名志愿者出现可能与研究药物有关的不良事件：一受试者出现升高的ALT(值46IU/L，正常上限40IU/L)；一受试者出现以下所有的不良事件：嗜酸粒细胞增多(值0.5×103/μL，正常上限0.4×103/μL)，升高的LDH(值303IU/L，正常上限90IU/L)，升高的ALT(值54IU/L，正常上限40IU/L)，升高的AST(值42IU/L，正常上限40IU/L)；及一受试者出现耳鸣。
没有发现后基准(post-baseline)血液学、化学、生命征象及ECG结果的倾向。
讨论
1000mg IV单个剂量的达巴霉素耐受良好。在经静脉内注入单个1000mg之后，大于45mg/l的达巴霉素血浆浓度维持至少7日。此值高于已知的杀菌浓度(4-32mg/l)。此结果支持达巴霉素每周一次的使用方案。尿消除曲线表明肾脏排泄为重要的消除路径，大约40％在尿中排泄。此项发现与动物中的观察结果一致。由于肾脏并非唯一消除路线，对达巴霉素的剂量调节可为肾脏受损患者所必需的。
实例3.使用等温滴定微量热法测量达巴霉素的蛋白结合
使用Microcal VP-ITC仪器在20mM磷酸盐，150mM NaCl，25及37℃下pH7.4中通过等温滴定微量热法(ITC)测量达巴霉素与蛋白的结合。在标准实验中，将25×10μl蛋白(～150μM)注入含有达巴霉素溶液(～5μM)的热量计单元(calorimeter cell)中。通过测量280nm的吸收率来测定蛋白及达巴霉素的实际浓度。对照实验包括将蛋白注入缓冲剂中(在达巴霉素不存在时)以解决在相同条件下蛋白稀释所产生的热。为了进行对照，使用替考拉宁执行类似的具有某些必要修改的实验。
用以下各蛋白来进行达巴霉素的实验：人白蛋白、狗白蛋白、大鼠白蛋白、牛白蛋白及人a-糖蛋白。用人白蛋白及a-糖蛋白来研究替考拉宁。在两种不同温度下结合亲和性的对照显示于表10中。
表10.表观结合亲和性的对照(Ka，X105M-1)
所引用的±误差为由适当的例行程序所获得的标准偏差。
在对稀释的热进行校正之后，通过使用以标准Microcal ORIGIN软件包的简单的单个位点结合模型的非线性回归分析综合热效应。综合各次注射的原始数据(μcal/sec)经过加法得到总热效应，接着除以注射量以得到注射剂的平均热量kcal/mole。相同的综合应用于对照稀释效应，且以实际滴定数据减去此。此举提供结合曲线的微分，其中结合程度与总热量释放(或吸收)成比例。接着通过各种标准结合模型的非线性回归方法来分析此。最简单的模型假设简单的非竞争性结合平衡，且给出三个参数：
Ka(＝l/Kdiss)为结合关联(解离常数)
ΔH＝结合的焓(与结合有关信号的大小)
N＝结合位点的数目(假设结合模型为正确的)
假设为非竞争性结合，N为使样本中所有可利用的结合位点饱和而需要的注射剂的摩尔(相对)数目。就达巴霉素实验而言，达巴霉素为“样本”且蛋白(HSA等)为“注射剂”。所述的初步结果表明结合为相对弱的且由于达巴霉素较差的溶解性，要清楚的测定结合化学计量(N)十分困难。然而，如图2所示，在所有状况下，数据与N<1极好的匹配(意即蛋白与达巴霉素的结合小于1比1)。因此，N＝0.5的值意谓仅需要一半摩尔数的预期蛋白去结合达巴霉素。换言之，每个蛋白显然结合两个达巴霉素分子。达巴霉素可能形成与蛋白1:1结合的二聚体。结合化学计量模型结果表明的是两个达巴霉素分子结合到一个蛋白分子，而替考拉宁与达巴霉素不同，其呈现1:1的结合。
假设人血清白蛋白(6×10-4M)及a-糖肽(1.5×10-5M)的生理浓度，表11表示抗生素浓度在1-500μM范围内所计算出的结合百分数。为了使其与临床情况有关，人的达巴霉素峰值浓度大约为300mg/L或165μM。
表11.替考拉宁及达巴霉素结合到血浆蛋白所计算出的百分数
 
抗生素浓度(μM) 达巴霉素 替考拉宁
人白蛋白
1 98.8 98.3
10 98.8 98.3
100 98.7 98.0
165 98.6 ND
250 98.5 ND
500 98.0 ND
人α-糖蛋白
1 73.0 9.6
10 68.2 9.1
100 26.2 6.0
165 16.9 ND
250 11.4 ND
500 5.9 ND
ND＝未进行
在所述实验中，达巴霉素结合到人血清白蛋白的量超过98％。结合分数在选定的达巴霉素浓度范围内保持恒定，即1-500μM。此范围涵盖人的治疗浓度。达巴霉素结合至α-糖蛋白的百分数远高于替考拉宁。达巴霉素证实了大容量及与其不同来源血浆蛋白的低亲和性，同时在来自被测试的所有种类的蛋白中有相似的Ka值。所述结果有助于解释达巴霉素的某些独特的药代动力学特征。2:1达巴霉素:蛋白复合物的结合与形成也解释了延长的半衰期及表观分布体积，其接近细胞外液的水体积。低亲和性有助于解释活体内所观察到的活性，其大大超过具有游离分数接近1％的化合物所预期的活性。对血浆蛋白的大容量有助于解释虽然在生理pH值下化合物溶解性较差但却达到相对高的血浆浓度。
实例4.大鼠中达巴霉素的药代动力学特征及组织分布
在投与单个IV注入20mg/kg[3H]-达巴霉素的大鼠中执行两项研究。在投药后的70日内收集排泄物及大于40个的不同组织，且测定源自药物放射性的组织分布及药代动力学。
将HPLC-纯化的[3H]-达巴霉素用于所述研究中。经由氚交换产生放射性同位素标记的药物且通过HPLC将其纯化。
大鼠质量平衡研究
在向雄性大鼠单个经静脉内(IV)注入达巴霉素之后进行质量平衡研究以确定达巴霉素的排泄类型。
15只雄性Sprague-Dawley大鼠接受单个IV剂量的3H-达巴霉素(20mg/kg，100μCi/大鼠)。在投药之后，于投药后间隔的14、36及70日(3只大鼠/最终收集时间)收集24小时的尿及粪便。也收集水及甲醇笼清洗物。在收集期结束分析畜体。通过液体闪烁计数(LSC)分析所有样本的总放射性含量。
在向大鼠经静脉内投与3H-达巴霉素之后，源自药物的放射性在尿(～2/3排泄的放射性)及粪便(～1/3排泄的放射性)中消除。第一周之内在尿及粪便中消除所投与的大约一半的放射性，其与大约一周的血浆t1/2一致。在投药后的第70日，仅4.5％的剂量保留于畜体中。在笼冲洗物中回收可忽略的放射性。实际上对研究期间所有投与的放射性都有说明(尿、粪便、畜体、笼冲洗物及氚交换)。
大鼠定量组织分布(QTD)研究
在达巴霉素单个IV注入雄性大鼠之后进行定量组织分布研究以评估达巴霉素的组织分布。
41只雄性Sprague-Dawley大鼠接受3H-达巴霉素的单个IV注入(20mg/kg，50μCi/rat)。在投药后第12、24、48、72、96、120、144、168、336、840、1176及1680小时对大鼠(每个时间点3只)施行安乐死以收集血液、血浆及组织(包括畜体)。通过LSC分析所有样本。
确定包括肾、肝、脾、血液、血浆、肺及皮肤的多于40个组织的浓度-时间曲线。包括皮肤的组织中源自药物放射性的浓度及t1/2值与在血浆中所观察到的相当。发现在注入后12小时内达巴霉素快速及广泛地分布于所有组织中且同时组织中具有源自药物放射性的可计量的浓度。在投药后24h内大多数组织达到最大浓度(Cmax)。5日后在任何单个组织中回收的放射性<剂量的5％。在投药后的第70日，仅畜体保持>投与的放射性的1％(2.34％)。因此，达巴霉素不在任何单个组织、器官和血液细胞组份中积聚。在此健康动物模型中CNS中的放射性浓度较低但可检测。发现达巴霉素透过皮肤且伴随等于或高于血浆中浓度的源自药物的放射性浓度。随着时间源自药物放射性的血液与血浆比率维持相对恒定且<1。
作为QTD研究的一部分，在投药后的384h(16日)中收集来自插入大鼠(4只动物)的胆管的胆汁样本。投药后经过384h几乎11％的剂量在胆汁中回收。此结果说明大多数源自药物的放射性发现于粪便中。
实例5.通过HPLC-MS/MS来定量确定血浆中的达巴霉素
如下所述，开发HPLC-MS/MS方法来定量测量血浆中的达巴霉素。
达巴霉素校准及质量控制标准的制备
在通过将达巴霉素溶解于去离子水中以制备1000ug/ml溶液来制备达巴霉素储备溶液之后，在去离子水中进行连续稀释以制备500、50及10μg/ml溶液。
通过以如上所述制备的1000μg/ml达巴霉素储备溶液使人血浆形成峰值来制备100、60及40μg/ml达巴霉素浓度的校准标准。通过以适当体积500μg/ml达巴霉素的储备溶液使人血浆形成峰值来制备20及10μg/ml浓度的校准标准，及通过以适当体积10μg/ml储备溶液使人血浆形成峰值来制备0.5μg/ml的校准标准。
通过以适当体积如上所述制备的1000μg/ml达巴霉素的储备溶液使人血浆形成峰值制备90及30μg/ml达巴霉素的质量控制标准。通过以适当体积50μg/ml溶液使人血浆形成峰值来制备1.5μg/ml的质量控制标准。
内部标准工作溶液的制备
30μg/ml内部标准的工作溶液BI-K0098为A-40926的二乙基-氨基-丙基-氨基衍生物，其是由如下操作来制备。将大约10mg BI-K0098溶解于大约10ml流动相A(80％的10mM甲酸铵/甲酸，pH3(v/v)，10％乙腈(v/v)及10％2-丙醇(v/v))中以得到1000μg/ml内部标准储备溶液。接着以流动相A将储备溶液(300μl)稀释到体积10ml以得到30μg/ml内部标准溶液。
分析样本的制备
如下所述制备用于定量测定血浆中达巴霉素浓度的样本。将100μl的内部标准工作标准溶液添加到50μl如上所制备的校准或质量控制标准液中并混和。允许混合物在室温下平衡5分钟，随后添加250μl乙腈。接着将混合物涡流10秒，随后在ALCmicro-centrifugette4214上以约10,000rpm的转速离心1分钟。将上清液转移到清洁的试管中且在Savant Speed-Vac系统中于约40℃下蒸发至干燥。接着将样本悬浮于150μl的流动相A中。
分析方法
将如上所述出于分析而制备的50μl样本注入Phenomenex Jupiter C18柱(50×2mm，C18 5μm300A)中，且以流动速率0.3ml/min在梯度HPLC条件下进行分析。梯度条件为：最初，80％流动相A/20％流动相B(20％10mM甲酸铵/甲酸，pH3(v/v)，40％乙腈(v/v)，40％2-丙醇(v/v))；1分钟，20％流动相A/80％流动相B；2分钟，20％流动相A/80％流动相B；2.5分钟，回到最初条件。
将HPLC系统耦合到PE SCIEX API-2000三倍四极质谱仪中，以阳性离子化模式操作涡轮离子喷雾。使用空气以产生离子源的喷雾。将探针温度设于500℃且以氮作为气帘气体。使用氮作为碰撞气体来利用多反应监测(MRM)。通过以下离子迁移来检测分析物：达巴霉素为909.3Da→1429.3Da，且内部标准为923.3Da→1457.3Da(BI-K0098)。为了避免质谱仪收到污染，在层析操作开始的第1分钟及2.5分钟执行柱后分流。
将软件样本控制(Software Sample Control)1.4用于数据分析的获取且将软件MacQuan1.6用于层析峰值的综合及统计数据评价。
校准曲线
通过检定校准标准来评估线性及检定方法以产生校准曲线。通过计算达巴霉素与内部标准之间的峰面积比率确定血浆样本中达巴霉素的浓度。
使用等式y＝A+Bx(1/x加权)构建在0.5-100μg达巴霉素/ml人血浆的分析范围内达巴霉素浓度的校准曲线，其中A表示曲线截距，B表示曲线斜率，x表示校准标准的达巴霉素浓度(μg/ml)，且y表示达巴霉素与内部标准的峰面积比。构建三个分离的校准曲线。结果显示达巴霉素/内部标准面积比及达巴霉素浓度在分析范围内呈线性变化。定量的下限(LLOQ)为0.5μg达巴霉素/ml人血浆。校准曲线的斜率为可复现的且其相关系数大于0.9995。
血浆中达巴霉素的稳定性
通过分析如上所制备的人血浆样本的三个复制质量控制标准来测定血浆样本中达巴霉素的稳定性，所述人血浆样本为两种不同浓度，分别为1.5及90ug/ml。在三个周期的冻融治疗之后可检测的达巴霉素浓度为稳定的。室温下24小时后在处理样本中的达巴霉素浓度为稳定的。未观察到关于时间零点样本的达巴霉素浓度的降低。
实例6.达巴霉素质谱分析
调查溶液中达巴霉素多聚体的性质且通过电喷雾离子质谱法(ESI-MS)确定对达巴霉素多聚体至达巴霉素单体的群体比率有影响的条件。
使用配备有TurboIonSpray来源、Triple Quadrupole分析器且在阳离子模式中操作的Applied Biosystem API III+质谱仪执行实验。优选条件列于如下表12中。
表12：用于应用生物系统API111+质谱仪上达巴霉素分析的仪器条件。
Figure S071E0471220070822D000331
溶液中的达巴霉素
在含有0.1mg/ml溶于8:2水:异丙醇溶液的达巴霉素的达巴霉素溶液下调整仪器参数。在溶液直接注射之后获得的溶液中光谱范围为500-2000amu的达巴霉素。如图3中所示所得光谱表明达巴霉素多聚体的存在。作为非限制性实例，光谱的一个迹线可归因于Bo的同源多聚体，将其表示为(2nM+y(+3))离子种类，其中n为正整数，表示同源多聚体的多样性，举例而言，当多聚体为同源二聚体时，n＝1；且当多聚体为同源四聚体时，n＝2，M表示单体的质量，y＝n且+3表示加上的三个离子电荷。例如，当n＝1，y＝1且M＝Bo的质量时，提供Bo的同源二聚体。将此二聚体种类归属于质谱中(2M+3)离子迹线。
达巴霉素浓度对达巴霉素多聚体到单体的群体比率的影响
使用上述条件通过质谱学评价达巴霉素浓度对多聚体到单体的群体比率的影响。通过直接注入浓度为20、40、60及80μg/mL的达巴霉素溶液来获得光谱。据报导将主峰强度作为达巴霉素浓度的函数且如图4所示测定达巴霉素多聚体到单体的群体比率。
数据表明达巴霉素多聚体至达巴霉素单体的群体比率随着浓度增加而增加。此可有助于解释可投与个体的药物的大容量容量。多聚体作为单体库房的作用可减少高浓度样本形成沉淀物的趋势且提高可投与个体的浓度。多聚体的存在也可允许达巴霉素的剂量快速地投与个体。
例如，如图3所示，通过测定离子A与B峰强度之间的比率提供测定达巴霉素多聚体到单体的群体比率的方法中的非限制性实例。以峰A强度除以峰B强度提供达巴霉素多聚体到单体的群体比率的测量值。
pH对达巴霉素多聚体到单体的群体比率的影响
在上述仪器条件及在以下溶液pH值：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0及5.5下评价溶液pH值对达巴霉素多聚体到单体的群体比率的影响。如图5所示在每个pH值下测定达巴霉素多聚体到单体的群体比率且将pH值绘成线。确信达巴霉素多聚体到单体的群体比率随着pH值的增加而增加。
不受理论限制，据信离子基团(例如，在第一达巴霉素单体上的羧基)通过在第二达巴霉素单体上以相反电荷的离子(例如，第三氮族)形成离子相互作用而有助于达巴霉素多聚体的稳定。所述离子相互作用可受到pH值的影响。据信在较高pH值下达巴霉素作为多聚体存在的增加的趋势表明离子间相互作用在多聚体稳定性中很重要。特定地，据信达巴霉素多聚体在较低pH值下不稳定，估计可能是由于离子相互作用的干扰形成了多聚体的稳定性，由于特定的官能基(例如，羧基)可在较低pH值下质子化。
溶液离子强度对达巴霉素多聚体到单体的群体比率的影响
通过质谱学确定溶液离子强度对达巴霉素多聚体到单体的群体比率的影响。使用Ultramark1621、咖啡碱及MRFA(L-蛋氨酰基-精氨酰基-苯基丙氨酰-精氨酸)在先前以电喷雾模式调整及校准的Finnigan LCQDeca离子阱仪器上获得电喷雾阳极模式的质谱。使用表13所列条件记录所有质谱。所要调查的样本参数列于表14中。
表13.MS条件
 
样本引入条件：毛细管温度(℃)：               200Sheat Gas(N2任意单位)：        40  
样本电压设置：极性：                         阳极源电压(kV)：                   4.70毛细管电压(V)：                34管子透镜偏移(V)：              -60 
全扫描条件：扫描范围(amu)：                500-2000微扫描数目：                   3最长离子时间(ms)：             200     
高分辨扫描条件：扫描范围(amu)：                1218-1228微扫描数目：                   5最长离子时间(ms)：             50       
表14.样本参数
Figure S071E0471220070822D000351
经由Harward注射泵以10μL/min的速度注入样本水溶液且获得如图6-8所示的质谱。
所获得的光谱表明达巴霉素多聚体到单体的群体比率受到离子强度的影响。发现缓冲剂浓度的增加对应于多聚体质量迹线的降低及由此达巴霉素多聚体到单体群体比率的降低。
如文中所述，据信离子相互作用在达巴霉素多聚体稳定性中十分重要。增加的离子强度与多聚体质量迹线强度降低有关这一实事证实了离子相互作用在多聚体稳定性中的作用。然而，由于在较高离子强度下仍存在多聚体质量迹线，多聚体稳定可涉及另一个第二相互作用。
在不受任何理论限制的情况下，据信疏水相互作用在稳定达巴霉素多聚体种类中十分重要。若所述非共价达巴霉素多聚体的稳定性仅是由于离子相互作用，则希望离子强度的增加将导致多聚体质量种类的全部损失。换言之，希望随着溶液离子强度的增加，稳定多聚体的离子相互作用将由于溶液中增加的离子总数受到破坏，其单体将更易于缔合。因此，溶液离子强度将使多聚体分解为单体组份且所得质谱将与任何的多聚体质量迹线无关。然而，甚至在高溶液离子强度(例如，100mM甲酸铵)下，也可在质谱中侦测到达巴霉素多聚体的存在。因此，认为达巴霉素多聚体是由于疏水性相互作用而稳定，至少一部分稳定。
结构上类似的化合物
据信达巴霉素改良的功效至少部分是由于其形成多聚体的能力。认为结构非常类似的化合物并不具有所述的独特特征，通过质谱分析调查具有化学结果类似于达巴霉素的化合物其形成多聚体的能力。使用Ultramark1621、咖啡碱及MRFA(L-蛋氨酰基-精氨酰基-苯基丙氨酰-精氨酸)在先前以电喷雾模式调整及校准的Finnigan LCQDeca离子阱仪器上获得电喷雾阳极模式的质谱。使用表15所列条件记录所有质谱。所调查的样本参数列于表16中。经由Harward注射泵以10μL/min的速度注入样本水溶液且获得如图9及10所示的质谱。
表15质谱条件
 
样本入口条件：毛细管温度(℃)：         200Sheat Gas(N2任意单位)：  40  
样本入口电压设置：极性                     正源电压(kV)：             4.70毛细管电压(V)：          34管子透镜偏移(V)：        -60 
全扫描条件：扫描范围(amu)：          500-2000微扫描的数目：           3最长离子时间(ms)：       200     
高分辨扫描条件：扫描范围(amu)：          1218-1228微扫描数目：             5最长离子时间(ms)：       50       
表16.样本参数
n.a.＝未调节
类似的糖肽抗生素(替考拉宁)在各种浓度溶液中不显示多聚体复合物。此结果支持结构类似化合物不能在溶液中形成多聚体物质的说法，且此现象可在达巴霉素活性中发挥重要作用。
实例7.蛋白-达巴霉素复合物的基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱学
将10μl HSA，0.150mM与10μl达巴霉素溶液(从0.075mM、0.15mM、0.3mM到1.5mM)混合且于37℃下培育60分钟。使用干燥小滴技术制备分析用的样本。使用标准牛血清白蛋白、获取及200个激光发射产生的平均光谱在先前调整及校准的BRUKER FLEX III、飞行时间质谱仪上获得光谱。基质：9份DHB-9(2，5-二羟基-苯甲酸)饱和于乙腈/H2O(50:50)中，1份芥子酸饱和于乙腈/H2O(50:50)中。将0.5μl样本溶液与0.5μl基质溶液混合且置于激光靶上。
达巴霉素结合到作为单体的蛋白(1HSA+1达巴霉素)。，可观察到以极高的达巴霉素蛋白结合率(1:2，1:10)的含有2分子达巴霉素/分子蛋白的复合物的存在。
实例8.在人血清白蛋白存在下达巴霉素结合到N，N′-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala的等温滴定热量测定法
25℃下在一定浓度范围的HSA(高达600μM)存在下通过等温滴定热量测定法(ITC)调查达巴霉素到N，N′-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala的结合，所述物质为达巴霉素细胞壁靶上的肽类似物，在37℃下进行某些另外的测量。HSA增加达巴霉素的溶解性且降低其与三肽配位体的结合亲和性。将结果与万古霉素的结果进行比较。所观察的效应在相对低的HSA浓度下保持平稳，其与非竞争性结合模型一致，此模型允许配位体结合到达巴霉素(两者在溶液中呈游离态)及(更弱)结合到达巴霉素-HSA复合物。
初步实验证实在血清蛋白存在时，达巴霉素与万古霉素显示类似的结合曲线：两者均在结合到N，N’-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala上后放热，但没有证据表明结合到二肽(D-Ala-D-Ala)或Lys-D-Ala-D-乳酸盐。就达巴霉素/三肽相互作用而言，数据与以Kdiss＝1-10μM进行的结合一致，类似于在相同条件下的万古霉素，所述结合将取决于温度。在HSA存在下，达巴霉素的溶解性显著增加且与三肽的结合亲和性以与抗生素与HSA竞争性或非竞争性结合一致的方式降低。设计此实例中所述实验是为了：(a)比较不同温度下(25及37℃)及不同HSA浓度时达巴霉素/三肽的测量值；(b)使用所述数据来构建结合模型以与观察到的数字相比较。
由Biosearch Italia供应达巴霉素。其它试剂来自Sigma：盐酸万古霉素(SigmaV-2002，fw1485.7)、N，N′-二乙酰基-Lys-D-Ala-D-Ala(Sigma D-9904，fw372.4)、人白蛋白(HSA；Sigma A-3782；mw69,366)。
在即将进行实验前将抗生素及肽溶于含有HSA的含水缓冲剂(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4)中伴随轻微搅拌。通过重量来测定肽浓度。使用摩尔消光系数ε＝12430(达巴霉素，A280 1％＝68.42)，ε280＝6690(万古霉素)通过重量或通过UV吸收率来测定达巴霉素浓度。通过UV吸收率(HSA，ε280＝37,700；A280 1％＝5.44)测定HSA浓度。室温下使用Shimadzu UV-160A或UV-1601分光光度计在1cm通路长度石英比色杯中记录光谱，若需要给出0.1-1范围的吸收率，则以缓冲剂定量稀释样本。
使用Microcal VP-ITC仪器于25℃及37℃下使用标准操作程序执行等温滴定热量测定法。参阅，例如，Wiseman等人.，anal.Biochem.(1989)179,131-137；Cooper，等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.Ser.A-Math Phys.Eng Sci.(1993)345，23-35；Cooper，A，IsothermalTitration Microcalorimetry in C.Jones，B.Mulloy and A.H.Thomas(Eds.)，Microscopy，Optical Spectroscopy，and Macroscopic Techniques.Human a Press，Totowa，NJ，(1994)第137-150页；Cooper，A.，Microcalorimetry of Protein-protein Interactions in J.E.Ladburyand B.Z.Chowdhry(Eds.)；Biocalorimetry：The Applications of Calorimetry in theBiological Sciences.Wiley，(1998)第103-111页；及Cooper，A.，Curr.Opin.Chem.Biol.(1999)3,557-563。在装载前将样本小心脱气以避免在热量计单元中形成气泡。每个实验通常包含将25×10μl肽溶液(≈1mM)注射到热量计单元中(体积≈1.4ml)含有抗生素溶液(≈20-100μM)。对照实验涉及在相同条件下将配位体注入缓冲剂中以测定肽稀释的热量，且将所述值用于分析前原始结合数据的较正。在各温度下重复达巴霉素/三肽结合实验若干次。使用标准Microcal ORIGINTM软件分析ITC结合数据以测定结合位点(N)的表观数目、结合亲和性(Kass＝1/Kdiss)及结合焓(ΔH)。
表17
通过ITC假定简单的非共同结合模型来测定三肽结合到达巴霉素及万古霉素的热力学数据：温度及HSA效应。
Figure S071E0471220070822D000391
在不存在HSA的情况下三肽与达巴霉素的结合ITC实验给出就结合亲和力而言相一致的数据，其中在37℃下平均Kdiss分别处于1.4、3.1及8.4μM的区间内(表17)。结合是放热的。此处的浓度计算表明N在所述条件下更接近0.5。此与所述条件下每个达巴霉素二聚体对应一个三肽分子的结合相一致。所述结合亲和力及结合焓与在相同条件下对万古霉素所观察到的相当(表17与D.McPhail，A.Cooper，J.Chem.Soc-Faraday Trans.(1997)93，2283-2289)。也提到万古霉素在较高浓度下经历配位体诱导的二聚作用。
尽管结合显然地放热更多，但向达巴霉素混合物中添加HSA可降低三肽与达巴霉素的表观结合亲和力(表17)。在25℃下HSA浓度对此的依赖性示于图11中。表观Kdiss最初升到(渐弱)35μM HSA之后，接近生理水平(600μM)的较高HSA浓度仍保持相对稳定。在高HSA浓度(Kdiss≈35μM)下的平稳水平对应于比不存在HSA时要弱约10-12倍的结合亲和力。在37℃下观察类似降低。
HSA效应并不归因于与三肽的相互作用。在HSA存在下万古霉素与三肽的结合对照ITC实验给出与不存在HSA时所观察的结果相当的结果(参见表17)。此表明肽或紧密相关的抗生素万古霉素均不与溶液中的HSA相互作用。其遵循HSA对达巴霉素/三肽相互作用的任何效应均必须归因于HSA与达巴霉素的相互作用。
尽管不希望受缚于理论，但以上数据与非竞争性结合模式相一致。此模式假设三肽配位体(L)可与游离状态的达巴霉素(D)及达巴霉素-HSA复合物中的达巴霉素(D)相结合。
Figure S071E0471220070822D000401
 KL＝[D][L]/[DL]
D.Hsa＝[D][HSA]/[D.HSA]
KLDHsa＝[D.HSA][L]/[LD.HSA]
表观(所观察到的)配位体结合离解常数(非竞争性)
Kapp，L＝[总D][L]/[总DL复合物]
      ＝([D]+[D.HSA])[L]/([DL]+[LD.HSA])
      ＝KL{1+[HSA]/KHSA}/{1+[HSA].KL/KHSA·KLDHSA}
此显示Kapp，L对游离HSA浓度的双曲线依赖性，其与所观察的数据很好地一致(图11)。在高[HSA]下此达到渐近(平稳)值。
Kapp，L＝KLDHSA(大[HSA])
此表明相比于游离达巴霉素的3μM(25℃图)，当达巴霉素结合于HSA上时其对三肽的结合亲和力是约35μM。
可依据达巴霉素在与肽或蛋白的相互作用中是否充当单体或二聚体来表明其它机制。直接比较达巴霉素与万古霉素(其显示在所述低浓度下明确的1:1结合)显示在较低摩尔比(较低N)下达巴霉素的结合完成(图12)。此与2:1达巴霉素:肽复合物相一致。
然而，在HSA存在下表观N值增加(表17)并且可与1:1复合作用更加一致。尽管不希望受缚于理论，图13中所示的模式与所述观察相一致，所述模式显示达巴霉素单体及二聚体与三肽配位体及HSA的可能相互作用。图13A描绘呈溶液中单体-二聚体均衡态(主要作为二聚体)的达巴霉素，但作为单体结合于HSA的两个独立位点上。此与由ITC对血清蛋白结合于达巴霉素上所观察到的N＝0.5值相一致(实例3)。图13B描绘配位体于溶液中结合于达巴霉素二聚体上，并且(更弱地)结合于与HSA相连接的达巴霉素单体上。此与达巴霉素以变化的表观化学计量与三肽及HSA的非竞争性结合相一致。
总而言之，此实例显示HSA以与非竞争性机制相一致的方式降低达巴霉素对三肽配位体的结合亲和力，并且与HSA结合的达巴霉素保留其结合三肽配位体的能力，虽然亲和力降低。所述结果也与其中达巴霉素呈溶液中单体-多聚体均衡态(主要是多聚体)的模式相一致，其中多聚体对肽配位体具有很强的亲和力。游离的及与血清白蛋白结合的达巴霉素单体也可以降低亲和力与肽结合。
实例9.A-40926与达巴霉素制备
制备A-40926
通过发酵所产生的天然糖肽A-40926是产生达巴霉素的起始材料。其是作为A-40926与其乙酰基衍生物的混合物由Nonomuria sp ATCC39727产生(参见美国专利第4,935,238与B.Golstain等人.Antimicrobial Agent and Chemotherapy，Dec.1987，第1961-1966页)。首先将乙酰基衍生物脱乙酰化成A-40926。脱乙酰化作用之后通过如下所述的聚酰胺管柱层析将A-40926纯化。下列描述代表当前产生方法。此处所报导的量是工业制备中通常所运作的量的约1/4。
脱乙酰化A-40926
在搅拌同时以NaOH30％调节10m3含有总共约1g/L A-40926及其乙酰基衍生物的发酵肉汤(23℃)处于pH11.4。持续搅拌6小时，接着将温度降至15℃并微过滤肉汤(具有0.12m2陶瓷膜0.1μ的Koch Protosep IV微过滤器)。在微过滤期间将水连续添加至滞留物中以在过程结束时获得20-25m3的渗出液与4.5-5m3的滞留物(起始值的一半)。
通过HPLC分析含有A-40926的渗出液。当脱乙酰化作用完成时，以30％硫酸调节渗出液溶液的pH处于pH7(储存于20℃下)。在此实例中，获得25m3含有6.62kgA-40926(268mg/L)的经过滤肉汤。脱乙酰化产率是66.2％。如果微过滤过程进行更长时间并且此过程中所用的萃取体积更高，则产率可增加至90％。
在聚酰胺管柱上纯化A-40926
萃取后将经过滤肉汤中所含的A-40926于如下所述的聚酰胺管柱上纯化。此描述中所报导的量是工业制备中通常所运作的量的约1/10并且代表当前产生方法。
将500L聚酰胺树脂SC6(得自Macherey Nagel)悬浮于软化水中并装载至管柱中。接着通过以至少2BV(柱床体积)的缓冲溶液洗提管柱来调节树脂处于pH6-6.5，所述缓冲溶液是通过将4kg碳酸钠溶解于800L水中并以乙酸调节所得溶液的pH来制备。
将A-40926经过滤肉汤(9000L；检定率0.275mg/L；A-409262475g；pH6±0.2；温度10±3℃)以每升树脂约5g活性的比率(通常使用5-8g/L的活性/树脂比率)装载至管柱中。以下列溶液洗涤管柱：3BV(1500L)处于pH6的溶液，其是通过将7.5kg碳酸钠溶解于1500L软化水中并以乙酸调节pH来制备；4BV(2000L)处于pH8的溶液，其是通过将10kg碳酸钠溶解于2000L软化水中并以乙酸调节pH来制备；1.5BV(750L)处于pH9的溶液，其是通过将4kg碳酸钠溶解于750L软化水中并以乙酸调节pH来制备。
通过以4BV(2000L)处于pH10的缓冲溶液洗提自管柱回收A-40926，所述缓冲溶液是通过将10kg碳酸钠溶解于2000L软化水中并以乙酸调节pH来制备。收集含有经纯化A-40926的部分(A-40926浓度大于0.5g/L并且主要组份(B0+B1)的HPLC面积％大于80％)，以1N HCl中和并通过HPLC进行分析。获得约2000L的最终透明溶液。
以1.5BV的异丙醇/5％NaOH的1:1混合物将用于纯化的树脂再生，随后以5BV软化水洗涤。
A-40926浓度
使来自柱的溶液经受若干轮稀释/浓度步骤以消除溶液大多数的无机盐。使用切割为250D的薄膜通过纳米过滤将溶液浓缩至80L，以80L的软化水来稀释，且于起始柱(80L)处通过纳米过滤重新浓缩。将此项操作重复至少5次。以23％HCl调节最终溶液的pH值(80L，pH7.5)至6.3。接着以80L的丙酮稀释溶液，且以23％HCl再次调节其pH值至pH2.6。
脱色
搅拌中将680g木炭PA200C(～0.3g/g A-40926)添加至以上步骤所获得的溶液(160L)中。室温下继续搅拌至少30分钟，接着添加约0.5-0.6Kg助滤剂(DIF-BO)。经过滤筒过滤混合物。将所获得的澄清溶液于真空中(45℃)浓缩以使丙酮低于10％。最终体积为约100L。接着以含水NaOH调节pH值为6.7且使用常用的纳米过滤继续浓缩步骤直至A-40926浓度约为100g/L。获得20L浓溶液(A-409261884g，94.2g/L)。
沉淀及干燥
在搅拌的同时以20L丙酮稀释先前溶液，并且以10％HCl调节其pH值维持5.1。向此溶液添加额外的5倍体积丙酮(100L)以完成A-40926沉淀作用。如果此时水含量<15％，则添加额外的丙酮。2小时后将悬浮液离心并以3×10L新鲜丙酮洗涤固体。分析母液并在确定不存在产物后将母液排出。
在静态干燥器中于30-35℃及减压下干燥固体A-40926直至残余丙酮低于2％并且水少于10％。接着经50目筛网将产物筛滤，获得2.08kg经纯化A-40926(HPLC检定率81.4％；水6.2％；硫酸化灰份4.8％)。起始自装载于管柱上的活性的产率是68.4％。
合成达巴霉素
通过Malabarba与Donadio(1999)，Drugs of the Future，24(8)：839-846中所述的三步骤合成自天然糖肽A-40926制备达巴霉素(BI-397)。特定言之，A-40926首先经受酯化步骤以制造MA，其接着经受酰胺化步骤以制造MA-A-1。最终的水解步骤接着将MA-A-1转化成达巴霉素。
酯化步骤(步骤1)
下列描述代表使用中的当前方法。
制备H 2 SO 4 96％/MeOH(溶液A)
在配备有机械搅拌器与温度计的15L圆底烧瓶中，将2.28LH2SO496％(每千克A-40926粉末对应～300mLH2SO496％)逐滴添加至7.9L MeOH中。使用外置冰浴维持温度介于0与5℃之间。
反应程序
在140L搪玻璃反应器中将起始材料A-40926(7.6kg；批号019，检定率85.09％；活性6.46kg；3.73mol)悬浮于MeOH(46L)中，并在0℃±2℃下冷却所得悬浮液。在此温度下以先前所制备的溶液A(H2SO4/MeOH)处理悬浮液。将所得溶液在0℃下搅拌22-26小时，同时每隔两小时通过HPLC分析来监测反应(以1:1乙腈/水混合物将反应等分试样稀释100倍)。当以HPLC面积％计算、残余A-40926少于5％并且二酯不超过10％时认为酯化作用完成。
酯(MA)分离
当反应完成时，在-5℃(+/-2℃)下冷却混合物并在保持温度低于5℃的情况下以相同体积的冷水(54L)稀释。通过缓慢添加10.2L三乙胺(TEA)调节溶液pH在5.5(+/-0.2)，藉此沉淀产物(MA)。在0-2℃下持续搅拌额外1小时，接着离心所获得的固体，以水(每千克A-40926对应10L)洗涤并最终以先前在10-15℃下冷却的MeOH(每千克起始A-40926对应3L MeOH)洗涤。在自MA中移除硫酸盐之前以水洗涤。
各自分析母液与洗液并且如果含有少于1-2％的活性则将其排出。在真空(50mmHg)中于35-40℃(外部温度)下干燥产物直至残余水少于10％。获得7.6kg呈浅褐色粉末的MA(5.63kg活性，3.23mol)。
分析显示下列HPLC面积％的值：MA89.8、A-409263.2、二酯衍生物5.9。HPLC检定率是74.2％，活性5.637Kg；3.23mol；产率＝86.5％。此材料不经进一步纯化即用于下一步骤中。
酰胺化步骤(步骤2)
下列描述代表当前产生方法。
制备DMSO/HCl混合物(溶液B)
将DMSO(1.6L)置于配备有机械搅拌器与温度计的10L圆底烧瓶中，并以低于10℃的冰浴冷却。接着在保持混合物温度低于25℃的情况下于搅拌同时缓慢添加HCl37％(1L)。
酰胺化程序(产生MA-A-1)
在室温下于搅拌同时将起始材料MA5.95kg(检定率76.3％，KF8.9％；2.68mol)缓慢溶解于19.2L的1:1DMSO/MeOH混合物(每千克MA粉末对应～1.6L DMSO与1.6L MeOH)中。搅拌1小时后将709mL的3-(二甲基胺基)-丙胺(DMEPA，MW102.1；密度＝0.812g/mL；5.63mol；每摩尔起始MA对应1.96mol)与325g的1-羟基苯并三唑水合物(HOBTH2O；MW153.1；2.04mol；每摩尔起始MA对应0.71mol)添加至反应混合物中。持续搅拌直至获得完全溶液，接着通过缓慢添加约2.0L溶液B(DMSO/HCl)调节混合物处于pH3-3.1(以水将反应等分试样稀释10倍后进行测量)。
在10分钟内将二环己基碳二酰胺(DCC)溶液(通过将1.03kgDCC(4.99mol；MW206.3；每摩尔MA对应1.74mol)溶解于4.1L的1:1DMSO/MeOH混合物中来制备)添加至经搅拌反应混合物中。持续搅拌5小时，接着将额外的51.5g固体DCC(0.25mol)添加至反应混合物中直至残余MA降低至低于5％，同时维持异脲水平低于4-5％。异脲是由达巴霉素与过量DCC进一步反应所产生的一组副产物。
通常在额外2小时后(总共7小时)反应完成。在结束时以水(60L)稀释混合物以降低DMSO浓度至15％(v/v)并以HCl1N(0.85L)调节处于pH2.3以消灭任何残余DCC。
将MA-A-1水解成达巴霉素(步骤3)
30分钟后以15％NaOH(8L)调节混合物处于pH12.0-12.1。持续搅拌4小时，同时通过少量添加NaOH15％维持混合物处于此pH下。此后以HPLC面积％计算的残余MA-A-1少于0.2％。
接着在pH3.0时以1N HCl(19L)酸化混合物，并过滤悬浮液以移除所形成的二环己基脲。在过滤器上以软化水(2×20L)洗涤固体滤饼。将洗液与滤液收集在一起从而获得透明溶液，通过HPLC对其进行分析。获得152.8L含有21.74g/L达巴霉素的溶液(总活性3322g；1.828mol，产率＝68.2％)。
纯化达巴霉素
下列描述代表当前产生方法。
将获得自水解步骤并含有3322g达巴霉素活性的152.8L溶液分成两份，并在含有400L聚酰胺的相同层析柱上分别纯化各份。在所述两个纯化运作中活性/树脂比率分别是4.3与4.0g/L。
聚酰胺管柱制备
根据树脂再生程序(见下)清洁含有400L聚酰胺树脂的搪玻璃管柱(内径＝40cm，h＝320cm)并以2BV(800L)经4LAcOH(pH＝3.2)酸化的软化水调节。
纯化第一份
以H2O(56L)稀释第一份76.4L起始溶液以降低DMSO含量低于5％(v/v)并以1N HCl(3.4L)酸化至pH2.78。接着将此溶液以150L/h的流动速率装载至管柱上。装载后以下列溶液洗涤树脂：4BV(1600L)经AcOH(8L)酸化的H2O，pH＝3.2；5BV(2000L)AcONa0.1M，pH＝8.2；1BV(400L)经AcOH(1L)酸化的H2O，pH＝3.2。以4BV(2400L)经AcOH(6L)酸化并且pH＝3.4的H2O/MeOH(8:2)洗提达巴霉素。
在洗提步骤中收集各自是50-60L的22份并通过HPLC分析。将9至25份(达巴霉素浓度高于0.5g/L并且(B0+B1)的HPLC面积％≧80％)收集在一起，从而获得969L具有1.56kg达巴霉素的溶液(产率＝93.9％)。接着通过毫微过滤使此溶液浓缩，从而获得125.7L具有1.38kg达巴霉素的溶液。将850L含有145g不纯达巴霉素(8.7％)的渗出液中和并排出。
树脂再生
在再使用之前以下列溶液洗涤树脂：2.5BV(1000L)经乙酸(2.5mL/L)酸化的1:1MeOH/水；2.5BV(1000L)1:10.5％NaOH/异丙醇；10BV(4000L)软化水。接着以2BV(800L)经乙酸(2.5mL/L)酸化的水使树脂再均衡。
纯化第二份
以H2O(56L)稀释来自水解步骤的第二份起始溶液(76.5L)以降低DMSO含量低于5％(v/v)并以3.0L1N HCl酸化至pH2.87。接着如先前第一份的纯化作用中所述将第二份纯化。通过毫微过滤使经收集的部分(体积＝972L，达巴霉素1.54kg，产率＝92.7％)浓缩，从而获得133L具有1.46kg活性的溶液。排出850L含有73g达巴霉素(4.3％)的渗出液。
将来自两个纯化步骤的浓溶液再分析并收集在一起，从而得到258L含有2840g经纯化达巴霉素的溶液。纯化产率是86％。起始自MA的总产率是58.3％。
最终聚酰胺再生
在第二个纯化运作之后，以经pH＝3.4的AcOH(2.5L)酸化的2.5BV的1:1MeOH-水、2.5BV的1:10.5％NaOH-异丙醇、10BV软化水使聚酰胺再生。
达巴霉素的脱色与沉淀
将每摩尔达巴霉素中1.5mol1N HCl与每克达巴霉素中0.3g炭CG1(0.85kg，得自NORIT)添加至以上获得的258L溶液中。在室温下搅拌混合物至少45分钟。pH值是3.1。接着在SUPRA DISC筒模上过滤悬浮液。以50LH2O/MeOH8:2洗涤得自SEITZ-SCHENK的SDP-EK1与滤饼。分析滤液并使用临界值是250D的MPS44膜通过毫微过滤再次浓缩。获得21.3L含有119g/L达巴霉素的浓溶液(pH4.1；MeOH1.9％，GC)。最终添加909mL1N HCl以调节pH处于2.63，其对应于1.65molHCl/mol达巴霉素的成盐比率。
在搅拌同时将溶液(22.2L)倾倒入200L丙酮中。将倾析后所获得的固体离心并以14L新鲜丙酮洗涤。接着在减压(50mmHg)下于35℃下干燥产物，同时维持内部温度低于30℃保持17小时。在干燥过程中，于3与5小时后将1L不含发热原的水(<250EU/mL)(分成各0.5L的两部分)喷洒至固体上以移除以其它方式难以消除的残余丙酮。接着筛滤(50目)产物，从而获得2592g达巴霉素(HPLC检定率82.4％；水(KF)14％；Cl-3.0％)。
实例10.用于A-40926与达巴霉素制备的替代方法
下述方法是可用于A-40926与达巴霉素制备过程中的替代方法。
XAD-7HP上的A-40926制备
脱乙酰化与菌丝体微过滤
在室温下(24℃)下将150L含有A-40926的发酵肉汤(pH7)于合适反应器中搅拌，并以2.5N NaOH溶液(2.5L)调节处于pH11.5。搅拌4小时后，以15％HCl调节肉汤处于pH10.6，并经0.2微米膜进行微过滤。收集439L透明渗出液并接着使用临界值是250D的MPS44膜通过毫微过滤进行浓缩。调节所获得的A-40926浓溶液(58.6L；3.89g/L)处于pH6.4并储存于4℃下直至使用。
管柱制备与纯化
将XAD-7HP树脂(8L)悬浮于1:1水/甲醇溶液中，过滤并以蠕动泵装载至适当玻璃管柱(内径12cm)中。
接着以水洗涤树脂并以经缓冲处于pH6的6BV碳酸钠水溶液使其均衡，所述碳酸钠水溶液是通过每升水中溶解5g碳酸钠并以乙酸调节pH来制备。
将一部分含有194g A-40926的浓肉汤装载至XAD-7HP管柱中。接着以1/2BV/小时的流动速率用下列两种经缓冲溶液洗涤树脂以消除所存在的一部分亲水性及有色物质：3BV(24L)0.5％乙酸水溶液，其经30％氢氧化钠调节处于pH5；5BV(40L)8:2水/丙酮混合物，其经5mL乙酸/L水酸化。
最终以8BV(64L)经5mL乙酸/L水酸化的1:1水/丙酮混合物洗提A-40926。收集16份各自是4L的部分。将其中A-40926浓度大于0.5g/L的浓部分(5至15)聚集在一起从而获得含有163.4g A-40926的溶液(43L，3.8g/L)。管柱产率是81.3％。排出含有0.23g/L(45.3g；22.2％)纯度较差的A-40926的其它部分(200L)。
在洗提后以6BV(55L)NaOH0.5％/异丙醇(1:1)混合物使树脂再生，并最终以10BV水洗涤至中性。
炭处理
以HCl37％(70mL)调节所收集的部分处于pH2.5并接着以50g炭PA200型(0.3g/gA-40926)脱色。将所获得的悬浮液于室温下搅拌2小时并接着经KS50过滤器(d＝25cm，时间＝2.5小时)过滤，从而获得45.6L微黄色A-40926溶液(3.5g/L；产率＝96.4％)。
以NaOH30％(230mL)调节经脱色溶液处于pH7并通过毫微过滤及超滤来浓缩。使用所述技术对于消除在Rt＝2-4分钟时于HPLC层析上所侦测到的亲水性物质而言很重要。当将滞留物浓缩成起始体积的1/10(4L)时，添加相同体积的水并将所获得的溶液再次浓缩。重复此浓缩/稀释步骤三次以减少残余丙酮至0.25％。通过HPLC分析最终溶液(2.2L，146.3gA-40926，66.5g/L，产率＝91.5％)。纯化产率是75.4％。
A-40926结晶
通过使用实验室规模的超滤器将300mL份的A-40926溶液(19.9g A-40926)进一步浓缩成100mL并接着在60-65℃下加热。调节(30％NaOH)此溶液的pH处于7，并在此温度下向每毫升浓溶液中逐滴添加1.2mL5:1丙酮/异丙醇混合物。使所得混合物在20℃下冷却。1.5小时后，将所获得的固体过滤，于过滤器上以丙酮洗涤并在40℃下干燥15小时。获得20.6g产物(HPLC检定率82.0％；A-4092616.9g)。沉淀产率是84.9％。起始自经过滤肉汤的总产率是约64％。
于CG-71上的A-40926制备
管柱制备
将CG-71树脂(350mL)倾倒入玻璃管柱(内径＝4cm)中并以水洗涤。以3BV碳酸钠溶液使树脂均衡，所述碳酸钠溶液是通过将5g碳酸钠溶解于以乙酸使pH处于6的水中来制备。将250mL含有14.7g A-40926的发酵肉汤(pH7)装载至管柱(42g/L树脂)中。以下列三种溶液洗涤树脂：1050mL(3BV)经乙酸调节处于pH6的碳酸钠水溶液(5g/L)；1750mL(5BV)经乙酸调节处于pH8的碳酸钠水溶液(5g/L)；3150mL(9BV)经乙酸调节处于pH9的碳酸钠水溶液(5g/L)。
接着以10BV软化水洗提活性。收集各自是500mL的20份。将12至15份收集在一起，从而获得2.2L含有11.7gA-40926的经纯化溶液(产率＝79.6％)。接着通过超滤浓缩此溶液并以软化水进一步稀释浓溶液并再次超滤。在减压下将所获得的溶液进一步浓缩至50mL。
A-40926结晶
在60℃下加热浓溶液并在搅拌同时以5:1丙酮/IPA混合物(60mL)处理。接着在室温下缓慢冷却混合物。将所获得的固体过滤，在过滤器上以丙酮洗涤并在真空中于35℃下干燥80小时。获得8.9g经纯化A-40926(HPLC检定率84.2％)。总产率是51％。
达巴霉素合成中使用N-甲基-2-吡咯烷(NMP)作为溶剂的替代酰胺化步骤
在搅拌同时将MA混合物逐份添加至1:1NMP/MeOH混合物(64mL)中。在20-25℃下持续搅拌直至完全溶液，接着添加DMEPA(2.42mL；1.96mol/eqMA)与HOBT(1.06g；0.71mol/eqMA)。以NMP中的9.37mL15％HCl(先前自溶解于57.7mL NMP中的34.0mL HCl37％制备)调节反应混合物(检查以水稀释成1:10的样本)的pH值至3.0。接着在搅拌同时添加DCC(3.17g；1.57mol/eqMA)于NMP/MeOH1:1(12.7mL)中的溶液。通过HPLC监测反应。在约6小时后反应完成(MA-A-188.9％，MA7.3％，ISO3.7％)。此实验表明NMP可以是用于酰胺化反应的DMSO的便利替代物。整个过程不受此溶剂改变影响并且所获得的最终达巴霉素在化学上等同于其它批次。
达巴霉素制备的替代方法：一锅型程序
在室温下于100mL玻璃反应器中将10g A-40926复合物(HPLC滴定度80.66％，4.6mmole)在搅拌同时悬浮于24mL MeOH中。在0℃下冷却混合物，并添加4g HCl(g)于16.4mL MeOH中的溶液以完成产物溶解作用。接着使温度升至20℃，同时持续搅拌额外24小时。
此后将40mL DMSO与0.4g HOBT添加至反应混合物中。
接着添加1，1-二甲胺丙胺，藉此调节所得反应混合物的pH值介于3-3.1之间(在以水稀释样本至9:1后进行测量)。接着添加1.8g固体DCC并持续搅拌额外15小时。此时将反应混合物转移入1L玻璃反应器中并以80mL水稀释。接着通过添加240mL15％NaOH使pH值达到12。持续搅拌额外60分钟，并以260mL15％HCl水溶液酸化混合物处于pH2.8。获得约800mL含有6.4g达巴霉素的最终透明溶液(产率＝76％)。
HPLC分析显示所获得的产物的概况与以其它制造方法获得的产物的概况相当。
　　　　　　　　　　　　　　　　*****
尽管已经为清晰理解的目的通过说明和实例详细地描述了前述发明，但所述领域技术人员应明白在不偏离本发明的精神和范畴下可实施某些改变与修正。因此，所述描述不应理解为限制由附加权利要求所描绘的本发明范畴。
本文所引用的所有公开案、专利及专利申请案均以全文引用方式并入本文中以用于各种目的，并且特定及个别地揭示的各个公开案、专利或专利申请案在某种程度上并入本文中。

Claims (7)

1.一种用于治疗细菌感染的医药组合物，其包含
达巴霉素，所述达巴霉素约含有小于3摩尔百分比的MAG；
至少一种有效的稳定剂；
其中所述组合物的pH值约为3至5；
且其中所述组合物是冻干的。
2.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述达巴霉素约含有小于2.5摩尔百分比的MAG。
3.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述达巴霉素约含有小于2摩尔百分比的MAG。
4.根据权利要求3所述的医药组合物，其中所述组合物的pH值约为3.5至4.5。
5.根据权利要求4所述的医药组合物，其中所述稳定剂包含至少一种糖。
6.根据权利要求5所述的医药组合物，其中所述达巴霉素包含约85至96摩尔百分比的B0。
7.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述达巴霉素约含有小于1.5摩尔百分比的MAG。
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