ES2655909T3 - Reactivos y métodos para el tratamiento y prevención del cáncer - Google Patents

Abstract

Un método de preparación de un agente antineoplásico que comprende: (a) exponer ex vivo una porción de células obtenidas de una línea de células de cáncer o una porción de células tumorales obtenidas de un paciente a un agente seleccionado de: (i) un análogo de tapsigargina seleccionado de desacetiltapsigargina, 8-O-(12-[L-leucinoilamino]dodecanoil)-8-O-desbutanoiltapsigargina (>=L12ADT), 8-O-desbutanoiltapsigargina, 8-O-(4-aminocinamoil)-8-O-desbutanoiltapsigargina (>=ACTA) y 8-(4-Azidobenzoil)tapsigargina (>=ZTG); o (ii) una guaianolida encontrada en Thapsia, seleccionada de tapsitranstagina, tapsivillosina A, tapsivillosina B, tapsivillosina C, tapsivillosina D, tapsivillosina E, tapsivillosina F, tapsivillosina G, tapsivillosina H, tapsivillosina I, tapsivillosina J, tapsivillosina K, trilobolida y nortrilobolida, con el fin de crear células tumorales tratadas; (b) lisar dichas células tumorales tratadas para crear fragmentos celulares, en los que dichos fragmentos son adecuados para generar un efecto terapéutico antineoplásico.

Description

Reactivos y métodos para el tratamiento y prevención del cáncer

5 Campo de la invención

La invención se refiere en general al tratamiento del cáncer y de forma más concreta al tratamiento de tumores, incluyendo tumores sólidos y sus metástasis, sin radiación o agentes quimioterapéuticos convencionales. En una realización preferente, la invención se refiere a la prevención y el tratamiento del cáncer a través del uso de una vacuna para el cáncer.

Antecedentes

La terapia para el cáncer moderna implica en gran medida el uso de radiación, cirugía y agentes quimioterapéuticos.

15 Sin embargo, aunque son beneficiosas en algunos tumores los resultados con estas medidas han tenido solo un efecto mínimo o no han tenido efecto en muchos otros. Además, estas estrategias a menudo tienen una toxicidad inaceptable.

Tanto la radiación como la cirugía tienen el mismo inconveniente teórico. Se ha reconocido que, dado que una única célula maligna clonogénica puede dar lugar a una progenie suficiente para matar al hospedador, debe erradicarse la población completa de células neoplásicas. Véase, en general, Goodman y Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8ª Edición) (pág. 1202-1204). Este concepto de “destrucción total de las células” implica que para una estrategia quirúrgica es necesaria la extirpación total de un tumor y que en una estrategia de radiación es necesaria la destrucción completa de todas las células cancerosas si se quiere conseguir una cura. En

25 la práctica esto rara vez es posible; de hecho, cuando hay metástasis, es imposible.

Además, los tratamientos para el cáncer quimioterapéuticos tradicionales rara vez dan también como resultado una remisión completa del tumor y los significativos niveles de dosificación necesarios, aun para generar una respuesta moderada, a menudo están acompañados de una toxicidad inaceptable. Los antineoplásicos normalmente tienen efectos hematológicos negativos (por ejemplo, el cese de la mitosis y la desintegración de elementos formados en la médula ósea y tejidos linfoides) y acción inmunosupresora (por ejemplo, recuentos celulares reducidos), así como un grave impacto sobre los tejidos epiteliales (por ejemplo, la mucosa intestinal)), los tejidos reproductivos (por ejemplo, incapacidad para la espermatogénesis) y el sistema nervioso. P. Calabresi y B. A. Chabner, En: Goodman y Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8ª Edición) (pág. 1209-1216). Los altos niveles de

35 dosificación y la toxicidad resultante son en gran parte necesarios por la falta de una especificidad de diana de los propios agentes antineoplásicos. El fármaco necesita distinguir entre las células hospedadoras que son cancerosas y las células hospedadoras que no son cancerosas. La gran mayoría de los fármacos antineoplásicos son indiscriminados a este nivel y tienen una toxicidad inherente significativa.

El éxito de los quimioterapéuticos tradicionales como agentes antineoplásicos también se ha visto obstaculizado por el fenómeno de la resistencia a múltiples fármacos, la resistencia a una amplia diversidad de compuestos antineoplásicos citotóxicos estructuralmente no relacionados. J. H. Gerlach et al., Cancer Surveys, 5: 25-46 (1986). La causa subyacente de la progresiva resistencia a fármacos puede deberse a una pequeña población de células resistentes a fármacos dentro del tumor (por ejemplo, células mutantes) en el momento del diagnóstico. J. H. Goldie

45 y Andrew J. Coldman, Cancer Research, 44: 3643-3653 (1984). Tratar tal tumor con un único fármaco al principio da como resultado una remisión, en donde el tumor se contrae en tamaño como resultado de la destrucción de las células sensibles al fármaco predominantes. Cuando las células sensibles al fármaco han desaparecido, las restantes células resistentes a fármaco continúan multiplicándose y eventualmente dominan la población celular del tumor.

Como una solución se propuso el tratamiento desde el principio con una combinación de fármacos, dada la pequeña probabilidad de que dos o más resistencias a fármaco distintas aparezcan de forma espontánea en la misma célula.

V.T. DeVita, Jr., Cancer, 51: 1209-1220 (1983). Sin embargo, se sabe que la resistencia a los fármacos se debe a una proteína de transporte de membrana, “P-glucoproteína”, que puede conferir resistencia a fármacos general. M.

55 M. Gottesman y I. Pastan, Trends in Pharmacological Science, 9: 54-58 (1988). Desde el punto de vista fenotípico, las células tumorales muestran a lo largo del tiempo una reducida acumulación celular de todos los fármacos. En resumen, una terapia de combinación parece no ser la respuesta.

La inmunoterapia celular adoptiva se ha propuesto como una metodología de tratamiento alternativa, que utiliza el propio sistema inmunitario del cuerpo en un intento de mejorar la especificidad por la célula diana mientras se reduce la toxicidad. Se ha investigado tanto in vivo como in vitro la activación y proliferación de diversas poblaciones de linfocitos con linfocinas, con diversos grados de éxito. Por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad metastásica se han utilizado las células citolíticas activadas por linfocinas (LAK) y los linfocitos infiltrantes de tumor (los TIL) en combinación con interleucina-2 (IL-2). Véase Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316: 889-97 (1987);

65 Belldegrun et al, Cancer Res. 48: 206-14 (1988).

Desafortunadamente, la inclusión de altos niveles de IL-2 para activar y expandir las poblaciones de células se asocia ella misma con una toxicidad significativa para el paciente. Además, las poblaciones celulares específicas de célula diana han sido difíciles de expandir in vitro, dado que los linfocitos cultivados en altos niveles de IL-2 a la larga desarrollan una falta de respuesta a IL-2 y posteriormente presentan un declive serio de la proliferación y 5 citotoxicidad. Véase Schoof et al., Cancer Res. 50: 1138-43 (1990). El último problema también ha impedido los esfuerzos para utilizar de forma satisfactoria linfocitos como vehículos celulares para la terapia génica en el hombre.

Lo que se necesita es una estrategia contra el cáncer específica que sea tumoricida de forma fiable frente a una amplia diversidad de tipos tumorales. Es importante destacar que el tratamiento debe ser eficaz con una mínima toxicidad para el hospedador.

El documento WO2004/037321 describe un aparato y método para la inmunoterapia para el cáncer, que comprenden tomar de un paciente una muestra de tumor, lisar la muestra y devolver el tejido lisado al paciente.

15 El documento US2002/137799 describe un método de sensibilización de células tumorales a la radioterapia, la quimioterapia e inmunoterapia, que comprende exponer las células tumorales a un monoterpeno o sesquiterpeno y tratar la célula.

Takei et al, European Journal of Pharmacology, 2006, Vol. 537, n.º 1-3, pág. 190-199 describe sesquiterpenos que pueden utilizarse en la inmunoterapia para el cáncer basada en células dendríticas.

Sumario de la invención

La divulgación se refiere en general a la prevención y/o el tratamiento del cáncer y de forma más concreta al

25 tratamiento de tumores, incluyendo tumores sólidos y sus metástasis, sin radiación o agentes quimioterapéuticos convencionales. En una realización, la invención proporciona un método de preparación de un antineoplásico que comprende:

(a) exponer ex vivo una porción de células obtenidas de una línea de células de cáncer o una porción de células obtenidas de un paciente a un agente seleccionado de:

(i)

un análogo de tapsigargina seleccionado de desacetiltapsigargina, L12ADT, 8-O-desbutanoiltapsigargina, ACTA y ZTG; o

(ii)

una guaianolida encontrada en Thapsia, seleccionada de tapsitranstagina, tapsivillosina A, tapsivillosina B,

35 tapsivillosina C, tapsivillosina D, tapsivillosina E, tapsivillosina F, tapsivillosina G, tapsivillosina H, tapsivillosina I, tapsivillosina J, tapsivillosina K, trilobolida y nortrilobolida, con el fin de crear células tumorales tratadas;

(b) lisar dichas células tumorales tratadas para crear fragmentos celulares, en los que dichos fragmentos son adecuados para generar un efecto terapéutico antineoplásico.

Las células tratadas pueden lavarse para minimizar la cantidad de agente arrastrado a la siguiente etapa. No se pretende que la presente invención esté limitada por ningún tiempo de exposición/tratamiento particular. Se contempla una diversidad de tiempos de exposición, incluyendo tiempos de exposición de entre 1 segundo y 72 45 horas, más preferentemente entre 30 segundos y 1 hora, aún más preferentemente 1 minuto y 30 minutos. No se pretende que la presente invención esté limitada por la naturaleza del lisado en la etapa (b). En una realización, las células tumorales tratadas se lisan por congelación/descongelación de las células. En otra realización se utiliza un agente de lisis; los agentes de lisis pueden ser detergentes (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio), enzimas (por ejemplo, un tampón de digestión enzimática compuesto de 1 ml de Tampón B1 de Qiagen, 20 μl de lisozima, 45 μl de proteasa y 0,35 ml de Tampón B2 de Qiagen), o soluciones simples (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) o soluciones más complejas para lisar células de forma osmótica, por ejemplo en tampón de lisis hipotónico (fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4, cóctel inhibidor de proteasas, DTT 5 mM). En otra realización, las células se someten a ultrasonidos. En otra realización se prepara un extracto celular (por ejemplo, un extracto de membranas, un extracto citoplasmático, etc.). En aún otras realizaciones, se utilizan combinaciones de estos métodos (por 55 ejemplo, lisis hipotónica seguida de tratamiento con un homogeneizador, por ejemplo Polytron PT 3000, Kinematica, Lucerna, Suiza). La presente invención proporciona el agente antineoplásico para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un paciente. No se pretende que la presente divulgación se limite a cómo se introducen los fragmentos celulares o componentes celulares; estos pueden administrarse por vía intravenosa (i.v.), vía intramuscular (i.m.), vía intraperitoneal (i.p.), vía subcutánea (s.c.), vía intradérmica (i.d.), etc. Puede ser preferente administrar los fragmentos/extractos de determinados modos para determinados cánceres. Por ejemplo, en el caso del cáncer de piel puede se preferente administrar los fragmentos/extractos a través de la piel (por ejemplo, por vía subcutánea, vía transdérmica, etc.) para tratar cánceres tales como el melanoma. En el caso del cáncer de próstata, puede ser preferente administrar los fragmentos/extractos por vía intraperitoneal. Por otro lado, los fragmentos/extractos pueden administrarse en un sitio que esté alejado del tumor y en un tejido (por ejemplo,

65 músculo, piel, etc.) que no está relacionado con el tipo de tejido del tumor (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, etc.).

Tampoco se pretende que la presente divulgación se limite a la introducción solo de fragmentos/extractos in vivo;

otros compuestos (incluyendo, pero sin limitación, adyuvantes, mitógenos y similares) o componentes (incluyendo,

pero sin limitación, construcciones de expresión que proporcionan la expresión continua o transitoria de péptidos,

polipéptidos o proteínas, o construcciones que proporcionan la generación continua o transitoria de moléculas de

5 ácido nucleico). Con respecto a otros compuestos, la presente divulgación contempla la administración de una o

más citocinas antes, después o junto con los fragmentos/extractos. La Tabla 1 proporciona ejemplos ilustrativos de

citocinas que pueden administrarse con fragmentos/extractos in vivo o, como alternativa, pueden simplemente

administrarse junto con tapsigargina y/o agentes similares a tapsigargina (es decir, la administración de los agentes

de forma directa sin células o lisados) para potenciar la respuesta inmunitaria. En un ejemplo particularmente 10 preferente, la citocina que se administra junto con la tapsigargina (o con células, fragmentos o lisados tratados con

tapsigargina) es interferón gamma.

TABLA 1

Nombre

Abrev. Tipo Nombre específico

Interferones

IFN alfa Interferón de leucocitos

beta

Interferón de fibroblastos

gamma

Factor de activación de macrófagos

Interleucinas

IL-1 1 alfa Pirógeno endógeno

1 beta

Factor activador de linfocitos

1 ra

Antagonistas del receptor de IL-1

IL-2

Factor de crecimiento de linfocitos T

IL-3

Factor de crecimiento de mastocitos

IL-4

Factor de crecimiento de linfocitos B

IL-5

Factor de diferenciación de eosinófilos

IL-6

Factor de crecimiento de hibridomas

IL-7

Linfopoyetina

IL-8

Proteína quimiotáctica de granulocitos

IL-9

Factor de crecimiento de megacarioblastos

IL-10

Factor inhibidor de la síntesis de citocinas

IL-11

Citocina derivada de células estromales

IL-12

Factor estimulante de linfocitos citolíticos naturales

Factores de necrosis tumoral

TNF alfa Caquectina

beta

Linfotoxina

Factores estimulantes de colonias

CSF GM-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos

Mp-CSF

Factor de crecimiento de macrófagos

G-CSF

Factor estimulante de colonias de granulocitos

EPO

Eritropoyetina

Factor de crecimiento transformante

TGF beta 1 Factor inductor de cartílago

beta 2

Factor inductor del virus de Epstein-Barr

beta 3

Factor de crecimiento derivado de tejidos

Otros factores de crecimiento

LIF Factor inhibidor de la leucemia

Nombre

Abrev. Tipo Nombre específico

MIF

Factor inhibidor de la migración de macrófagos

MCP

Proteína quimioatrayente de monocitos

EGF

Factor de crecimiento epidérmico

PDGF

Factor de crecimiento derivado de plaquetas

FGF

alfa Factor de crecimiento de fibroblastos ácido

beta

Factor de crecimiento de fibroblastos básico

ILGF

Factor de crecimiento similar a insulina

NGF

Factor de crecimiento nervioso

BCGF

Factor de crecimiento de linfocitos B

En aún otros ejemplos, el paciente puede tratarse antes, después de o al mismo tiempo con uno o más fármacos que estimulan la producción de glóbulos blancos en la médula ósea, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim de nombre genérico, Leukine de nombre comercial) y el factor

5 estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF, filgrastim de nombre genérico, Neupogen de nombre comercial). Con respecto a las construcciones de expresión preferentes, la presente divulgación contempla la introducción de un plásmido de expresión de CD40L antes, después de o junto con los fragmento/extractos para crear un efecto duradero.

10 En una realización es preferente que los fragmentos/extractos carezcan de células, para evitar la reintroducción de células cancerosas vivas en el paciente (sin embargo, en algunos casos puede ser posible reintroducir células en lugar de extractos, o extractos que contienen células, debido a que mueren rápidamente o que el paciente las destruye rápidamente). Dichas células tumorales pueden obtenerse de una biopsia y los extractos se administran al mismo paciente. En otro ejemplo, los fragmentos/extractos se introducen en un paciente distinto (de hecho, los

15 fragmentos/extractos pueden utilizarse de forma generalizada en una pluralidad de pacientes). En aún un tercer ejemplo, las células se establecen como una línea celular para el uso antineoplásico continuo; en otras palabras, en este tercer ejemplo, las células tumorales no se toman de un paciente cada vez que se necesitan sino que se proporcionan a partir de una línea celular (habitualmente el mismo tipo de cáncer que el paciente del tumor). La línea celular puede almacenarse en recipientes apropiados en nitrógeno líquido, utilizando técnicas convencionales (por

20 ejemplo, DMSO, medio de cultivo, suero fetal de ternera, etc.). Por otro lado, pueden pasarse de forma continua en cultivo hasta su uso. No se pretende que la presente invención se limite a un tipo de cáncer particular. Se contempla una diversidad de tipos de cáncer incluyendo, pero sin limitación, células de cáncer de piel, células de cáncer de próstata, células de cáncer de mama, células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer uterino, células de cáncer pancreático, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de hueso y linfomas

25 (para un listado de líneas celulares ilustrativas véase la Tabla 2). No se pretende que la presente divulgación se limite a un único tratamiento, es decir, los fragmentos/extractos (con o sin otros compuestos o componentes) pueden administrarse a intervalos (por ejemplo, una vez por semana, dos veces por mes, una vez por mes, una vez cada seis meses, una vez por año, etc.)

30 En algunos ejemplos en que las células tumorales se extirpan de un paciente, se contempla que a) se utilice una cirugía convencional para la extirpación de un tumor primario (o porción del mismo). Después b) de tratar las células tumorales ex vivo, de utilizar agentes estimulantes, incluyendo tapsigargina y/o compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células tumorales tratadas; c) de preparar fragmentos/extractos de células tumorales a partir de dichas células tumorales tratadas y d) de introducir dichos fragmentos/extractos in vivo en el mismo

35 paciente, se contempla que se genere un efecto antimetástasis. De esta manera, la presente divulgación puede combinarse con procedimientos quirúrgicos convencionales. Por ejemplo, puede extirparse un tumor primario en la mama mediante cirugía convencional (es decir, mastectomía parcial o completa) y pueden proporcionarse fragmentos/extractos

40 TABLA 2

Designación y origen de las líneas celulares y cepas humanas1

ORIGEN

LÍNEAS CELULARES O CEPAS

Carcinoma de colon

SW1116, HCT116, SKCO-1, HT-29, KM12C, KM12SM, KM12L4, SW480

Carcinoma de páncreas

BxPC-3, AsPC-1, Capan-2, MIA PaCa-2, Hs766T

Adenoma de colon

VaCo 235

Designación y origen de las líneas celulares y cepas humanas1

ORIGEN

LÍNEAS CELULARES O CEPAS

Carcinoma de pulmón

A549

Carcinoma de próstata

PC-3, DU-145

Carcinoma de mama

009P, 013T

Linfoma

Daudi, Raji

Epitelio de mama

006FA

Fibroblastos diploides

HCS (forma ciglada de human corneal stroma, estroma corneal humano), MRC-5

1Las células linfoblastoides SW1116, HT-29, SW480, Raji y las líneas pancreáticas se obtienen de la Colección americana de cultivos tipo.

al paciente después de la cirugía para tratar las metástasis. En algunos ejemplos, el tratamiento se realiza independientemente de que se sepa o no que el paciente tiene metástasis (o cuando la metástasis se ha detectado pero no se conoce el alcance total de la enfermedad metastásica). En otras palabras, la terapia protectora puede

5 aplicarse a los pacientes tras la cirugía convencional, así como la terapia aguda para la enfermedad metastásica conocida.

Por otro lado, no siempre es posible extirpar el tumor primario. Se contempla en la presente divulgación, en algunos ejemplos en donde las células tumorales se extirpan del paciente, que a) se utilice cirugía convencional para la 10 extirpación de una metástasis (o porción de la misma). Después b) de tratar las células tumorales ex vivo, de utilizar agentes estimulantes, incluyendo tapsigargina y/o compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células tumorales tratadas; c) de preparar fragmentos/extractos de células tumorales a partir de dichas células tumorales tratadas y d) de introducir dichos fragmentos/extractos in vivo en el mismo paciente, se contempla que se genere un efecto antineoplásico frente al tumor primario (así como la enfermedad metastásica residual). De esta

15 manera, la presente divulgación puede combinarse con procedimientos quirúrgicos convencionales.

En aún otro ejemplo, los sujetos se tratan para prevenir el cáncer. En un ejemplo preferente, se tratan sujetos con riesgo de cánceres particulares (ya sea debido a la edad, predisposición genética, exposición a la radiación, exposición al humo, inhalación de partículas, consumo de mutágenos, infección por VIH, etc.). En un ejemplo, la 20 presente divulgación completa un método que comprende: a) proporcionar un paciente con riesgo de desarrollar un cáncer y la línea de células de cáncer, b) tratar células de dicha línea de células de cáncer ex vivo con un agente seleccionado del grupo que consiste en tapsigargina y compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células cancerosas tratadas y c) introducir dichas células in vivo en dicho paciente para generar un efecto antineoplásico preventivo. Por supuesto, introducir células cancerosas vivas puede no ser atractivo (aún cuando 25 morirán o se destruirán). Por lo tanto, en un ejemplo, la presente divulgación contempla un método que comprende: a) proporcionar un paciente con riesgo de desarrollar cáncer y una línea de células de cáncer, b) tratar células de dicha línea de células de cáncer ex vivo con un agente seleccionado del grupo que consiste en tapsigargina y compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células cancerosas tratadas; c) preparar fragmentos/extractos celulares de dichas células cancerosas tratadas) y d) introducir dichos fragmentos/extractos in 30 vivo en dicho paciente para generar un efecto antineoplásico preventivo. En este ejemplo particular, las células cancerosas pueden ser de una línea celular establecida y los fragmentos/extractos pueden verse como una vacuna. No se pretende que la presente divulgación se limite a un único tratamiento, es decir, los fragmentos/extractos (con

o sin otros compuestos o componentes) pueden administrarse a intervalos (por ejemplo, una vez por semana, dos veces por mes, una vez por mes, una vez cada seis meses, una vez por año, una vez cada cinco años, una vez 35 cada diez años, etc.). No se pretende que la presente divulgación se limite a un tipo particular de cáncer. Se contempla una diversidad de tipos de cáncer incluyendo, pero sin limitación, células de cáncer de piel, células de cáncer de próstata, células de cáncer de mama, células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer uterino, células de cáncer pancreático, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de hueso y linfomas (para un listado de líneas celulares ilustrativas véase la Tabla 2). En un ejemplo preferente, los sujetos

40 con riesgo de cáncer no tienen cáncer en el momento de tratamiento.

La vacuna descrita anteriormente puede fabricarse en un volumen como para tratar a una población. Por ejemplo, en un ejemplo, puede administrarse la vacuna a seres humanos de más de cincuenta años (o de más de cincuenta y cinco años) sin enfermedad como un profiláctico, por ejemplo como una vacuna de una sola vez o de forma repetida 45 a intervalos a lo largo del tiempo (por ejemplo, cada 2-5 años o 5-10 años). De hecho, la población puede tratarse con una vacuna “cóctel” que comprenda fragmentos/extractos de al menos dos tipos de cáncer distintos (es decir, después del tratamiento de las células cancerosas ex vivo, utilizando agentes estimulantes incluyendo tapsigargina y/o compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células cancerosas tratadas) con el fin de proporcionar un amplio alcance de protección frente al cáncer. Los distintos tipos de cáncer para el “cóctel” pueden

50 seleccionarse a base de la incidencia aumentada en una población particular después de determinada edad (por ejemplo, aumento del cáncer de colon y el cáncer de próstata después de los cincuenta y cinco años en los hombres; aumento del cáncer de mama y del cáncer de cuello uterino después de los cincuenta y cinco años en las mujeres).

El método de tratamiento ex vivo descrito anteriormente puede tener ventajas en algunos casos con respecto a la administración in vivo (por ejemplo, inyección intravenosa). En el caso de tratamiento ex vivo: 1) la tapsigargina se pone en contacto con la célula diana apropiada, es decir, células cancerosas; 2) la exposición en cultivo permite la eliminación de agentes antes de la reintroducción de los fragmentos/extractos en el paciente, es decir, el paciente se

5 expone solo a muy pequeñas cantidades de tapsigargina in vivo (lo que da como resultado una toxicidad mínima) y 3) la falta de exposición sistémica a los agentes estimulantes reduce la probabilidad de inducir anticuerpos frente a tapsigargina.

Aunque no se limita a ningún mecanismo, se cree que exponer células a tapsigargina y/o compuestos relacionados con tapsigargina provoca que las células cancerosas sean inmunoestimuladoras. Cuando se administran a sujetos que tienen tumores, los extractos inducen preferentemente una reacción tumoricida que da como resultado la regresión tumoral. Debe entenderse que la expresión “reacción tumoricida” como se usa en el presente documento significa que las células tumorales se destruyen y no se pretende que se limite a ningún método particular mediante el que se destruyen las células tumorales. Por ejemplo, puede ser que las células tumorales se destruyan de forma

15 directa (por ejemplo, interacción célula-célula) o indirecta (por ejemplo, liberación de citocinas como interferón). Con respecto a las citocinas, se muestra en el presente documento que los fragmentos/extractos descritos anteriormente inducen la secreción de citocinas en células inmunitarias.

La presente divulgación contempla un ensayo in vitro de exploración de compuestos para los efectos inmunitarios similares a tapsigargina. Por ejemplo, en un ejemplo, la presente divulgación contempla un método que comprende a) proporcionar células cancerosas y una línea celular premonocítica, estando transfectada dicha línea celular premonocítica con una construcción de ADN que codifica un promotor NF-κB que dirige la expresión de una proteína marcadora; b) tratar dichas células cancerosas in vitro con un agente seleccionado del grupo que consiste en tapsigargina y compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células cancerosas tratadas; c) 25 introducir dichas células cancerosas tratadas en dicha línea celular premonocítica in vitro y e) medir la cantidad de dicha proteína marcadora. En otro ejemplo, la presente divulgación contempla un método, que comprende a) proporcionar células cancerosas y una línea celular premonocítica, estando transfectada dicha línea celular premonocítica con una construcción de ADN que codifica un promotor NF-κB que dirige la expresión de una proteína marcadora; b) tratar dichas células cancerosas in vitro con un agente seleccionado del grupo que consiste en tapsigargina y compuestos relacionados con tapsigargina, con el fin de crear células cancerosas tratadas; c) preparar extractos celulares de dichas células cancerosas tratadas, d) introducir dichos extractos en dicha línea celular premonocítica in vitro y e) medir la cantidad de dicha proteína marcadora. No se pretende que el ensayo de exploración se limite al uso de líneas celulares premonocíticas. También pueden utilizarse líneas celulares similares a monocito, tales como la línea celular RAW. Además, cuando se utilizan líneas celulares premonocíticas, no se

35 pretende que la presente divulgación esté limitada por la línea celular particular; se conoce una diversidad de líneas celulares premonocíticas incluyendo ML1, HL60 y U-937. Las líneas celulares premonocíticas preferentes son las líneas celulares premonocíticas humanas THP-1 y MonoMac-6.

En una realización, el método ex vivo se modifica adicionalmente de forma que el paciente no se expone a dichos fragmentos/extractos. En cambio, las células inmunitarias se exponen a células cancerosas intactas o los fragmentos/extractos ex vivo. Por ejemplo, se retiran del paciente linfocitos del paciente y se exponen a las células tumorales tratadas (es decir, tratadas con tapsigargina y/o compuestos relacionados con tapsigargina) o fragmentos/extractos ex vivo con el fin de generar linfocitos estimulados; después de eso, dichos linfocitos estimulados se reintroducen en el paciente con un efecto terapéutico antineoplásico. No se pretende que la

45 invención esté limitada por el origen o la naturaleza de las células inmunitarias. Preferentemente, son células hematopoyéticas, tales como linfocitos (por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumor), macrófagos, células dendríticas (y similares) o células que tengan la capacidad de progresar a células inmunitarias. Aunque pueden aislarse de una diversidad de fuentes, tales como la médula ósea (por ejemplo, de fémures mediante aspiración), el bazo o sangre periférica (por ejemplo, recogida con heparina y separada por gradiente de Ficoll/hypaque), así como del tumor (por ejemplo, linfocitos infiltrantes del tumor). Es preferente que se obtengan de ganglios linfáticos. Aunque pueden obtenerse de donantes normales sin enfermedad, también es preferente que se obtengan de hospedadores que porten un tumor.

Definiciones

55 Como se usa en el presente documento, un “sujeto” puede ser un ser humano o un animal. Un paciente es un ser humano bajo cuidado médico, ya sea en el hospital, como paciente ambulatorio, en el ambulatorio o en la consulta del médico. Un “sujeto con riesgo de cáncer” y un “paciente con riesgo de cáncer” puede estar en riesgo por una diversidad de razones (ya sea debido a la edad, predisposición genética, exposición a radiación, exposición al humo, inhalación de partículas, consumo de mutágenos, infección por VIH, etc.). Por ejemplo, una persona puede estar en riesgo debido a que él/ella sea de una familia con antecedentes de cáncer. Por otro lado, se puede estar en riesgo debido a los resultados de un ensayo de exploración genética. Con respecto a lo último, la detección de mutaciones es un área de diagnóstico clínico de importancia creciente incluyendo, pero sin limitación, el diagnóstico del cáncer y/o individuos predispuestos al cáncer (es decir, con riesgo). La prueba de truncamiento de proteínas (PTP) es una

65 técnica para la detección de mutaciones interruptoras y de cambio de fase que conducen a la generación de productos de proteína truncados. Ahora pueden explorarse de esta manera mutaciones en genes asociados con el

cáncer tales como el homólogo humano de mutL y el homólogo humano de nutS (ambos implicados en el cáncer de colon), y BRAC1 (implicado en el cáncer de mama familiar), junto con otros. Aquellos en los que se ha encontrado que tienen mutaciones de truncamiento (así como otros tipos de mutaciones) se reconocen como en riesgo de cáncer.

5 La tapsigargicina y la tapsigargina son compuestos naturales (estrechamente relacionados con las guaianolidas) que pueden sintetizarse o (de forma más común) extraerse de las raíces de Thapsia garganica L. De hecho, existen al menos 15 guaianolidas estrechamente relacionadas encontradas en Thapsia (véase la Tabla 3 a continuación). Estos 16 compuestos naturales se dividen en dos series de moléculas diferenciadas por la presencia de un

10 sustituyente del oxígeno en la posición C-2. En la serie de compuestos de trilobolidas, este sustituyente esté ausente. La tapsigargina está disponible en el mercado de varias fuentes: MP Biomedicals (Irvine CA), Sigma, Calbiochem y Alomone Labs. La tapsigargicina también está disponible en el mercado (Calbiochem).

Tabla 3 15 La variedad conocida de tapsigarginas encontradas en Thapsia

R1 R2

Compuesto 1 Tapsigargina O-Oct But 2 Tapsigargicina O-Hex But 3 Tapsitranstagina O-iVal 2-MeBut 4 Tapsivillosina A O-Ang Sen 5 Tapsivillosina B O-Ang 2-MeBut 6 Tapsivillosina C O-Oct 2-MeBut 7 Tapsivillosina D O-6-MeOct Sen 8 Tapsivillosina E O-6-MeOct 2-MeBut 9 Tapsivillosina G O-6-MeHep 2-MeBut

10 Tapsivillosina H O-Ang o Sen O-Ang o Sen 11 Tapsivillosina I O-Ang But 12 Tapsivillosina J O-IVal But 13 Tapsivillosina K O-Sen 2-MeBut 14 Trilobolida H (S)-2-MeBut 15 Nortrilobolida H But 16 Tapsivillosina F H Sen Ang, angeloilo; Sen, senecioilo; iVal, iso-valeroilo

20 A menudo se denomina a la tapsigargina como una lactona sesquiterpénica (véase a continuación la estructura 1) o tetraéster de lactona sesquiterpénica. Los derivados de tapsigargina se han preparado mediante una diversidad de estrategias. Por ejemplo, se ha realizado hidrólisis del grupo acetilo en O-10 para proporcionar desacetiltapsigargina (véase a continuación la estructura 2).

También se ha hecho la acetilación de uno de los grupos hidroxilo y la reducción del carbonilo de la lactona en un

grupo metileno. Como se usa en el presente documento, “compuestos relacionados con tapsigargina” incluye

derivados, análogos y compuestos de tapsigargina con actividad similar. Por lo tanto, se pretende que estén dentro

del ámbito de la presente invención los análogos naturales (véase la Tabla 2 anterior) así como los análogos

5 sintéticos (véanse las reivindicaciones). Se han sintetizado varios análogos de tapsigargina mediante alquilación o

acilación de O-11 y O-12 en el lactol obtenido por reducción de la tapsigargicina. La introducción de sustituyentes

dispuestos en alfa disminuye la potencia inhibidora de la Ca(2+)-ATPasa del análogo, mientras que la enzima fue

más tolerante con los sustituyentes dispuestos en beta, lo que indica que la cara alfa del anillo de lactona está en

contacto estrecho con el sitio de unión cuando el inhibidor se une a la enzima. Se ha demostrado que algunos 10 análogos fabricados de forma sintética tienen actividad potente (tal como el siguiente compuesto 77). Otros análogos

incluyen a L12ADT.

15 Esquema: Síntesis de análogos. a, 1: cloruro de 2,4,6-triclorobenzoílo, ácido angélico, Et3N, tolueno, 75 ºC (85 %); 2: acetato de isoprenilo, T5OH sustentado por polímero,tamiz de 4 Å; DCM, TA (95 %); 3: MeOH,

20 HCl 3M; 4: (S)-2-metil butírico anhídrido, DCM, DAMP, TA (90 %, dos etapas). b, 1: Ac2O, DMAP, DCM (99 %); 2: NaBH4, MeOH, TA; 3: cloruro de 2,4,6triclorobenzoílo, ácido angélico, Et3N,

25 tolueno, 75 ºC, 4: MeOH, HCl 3 M, 40 ºC; 5: (S)-2-metil butírico anhídrido, DCM, DAMP, TA (60 % durante cuatro etapas).

Con respecto a los derivados, la presente invención contempla una diversidad, incluyendo, pero sin limitación, 8-O

30 desbutanoiltapsigargina, 8-O-(4-aminocinamoil)-8-O-desbutanoiltapsigargina (denominado ACTA). Se sintetizó un derivado C8 de tapsigargina (ZTG) mediante acilación de desbutanoil-tapsigargina con ácido 4-azido[carboxil14C]benzoico.

Como se usa en el presente documento, un “efecto terapéutico antineoplásico” incluye uno o más de lo siguiente:

35 inhibición del crecimiento de células cancerosas, aumento de la muerte de células cancerosas (una reacción tumoricida), reducción de la invasividad tumoral, reducción de la masa tumoral global, reducción de la masa tumoral local, reducción del tamaño del tumor primario, prevención de la metástasis, reducción de la cantidad de metástasis, reducción del tamaño de las metástasis, inhibición de la progresión de la enfermedad (ya sea de forma temporal o permanente) y vida prolongada. Aunque se desea que el tratamiento haga que el sujeto esté libre de la enfermedad,

40 no se pretende que la presente invención se limite a curar el cáncer. Existe un beneficio terapéutico incluso si el cáncer simplemente se enlentece. No se pretende que la presente invención se limite a la magnitud del efecto. Por ejemplo, la reducción del tamaño del tumor primario (o de una metástasis) puede ser tan pequeña como una reducción del 10 % de reducción o tan grande como una reducción del 90 % (o más). Tampoco se pretende que la presente invención se limite a la duración del efecto terapéutico antineoplásico. El tratamiento (que utiliza las

45 diversas realizaciones descritas en el presente documento) puede dar como resultado solo una inhibición temporal del crecimiento de células cancerosas, una muerte de células cancerosas aumentada de forma temporal, la reducción temporal de la invasividad tumoral, la reducción temporal de la masa tumoral global, la reducción temporal de la masa tumoral local, la reducción temporal del tamaño del tumor primario, la prevención temporal de la metástasis, la reducción temporal de la cantidad de metástasis o la reducción temporal del tamaño de la metástasis.

50 Los efectos temporales pueden durar de semanas a meses o de meses a años. Estos parámetros son relativamente fáciles de medir (por ejemplo, una reducción del tamaño del tumor primario). Con respecto a la prevención de la metástasis y a la prolongación de la vida, estos parámetros pueden medirse frente a los datos de población de pacientes para el tipo de tumor y la fase particulares, y similar. Como se usa en el presente documento, un “efecto antineoplásico preventivo” o “efecto protector” comprende un efecto que reduce la incidencia de nuevos cánceres.

Este parámetro puede probarse en animales y medirse en seres humanos en función de la población.

Como se usa en el presente documento, “marcadores” y “etiquetas” son compuestos o fracciones que se pueden detectar. Pueden ser enzimas, moléculas fluorescentes y similares. Las enzimas ejemplares incluyen fosfatasa

5 alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, una luciferasa bacteriana, una luciferasa de insecto y luciferasa de pensamiento de mar (Renilla koellikeri), todas las cuales pueden crear una señal que se puede detectar en presencia de sustratos y de condiciones de ensayo adecuados.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta datos ejemplares que muestran los efectos de diversos compuestos sobre la actividad proinflamatoria de las células HeLa de cáncer de cuello uterino. Eje X: control (--); tapsigargina (TG); taxol, tunicamicina (Tunic), brefeldina (BrefA), cicloheximida (CHX) y calcimicina (A23187). Eje Y: TNF-α (pg/ml). La Figura 2A presenta datos ejemplares que muestran una comparación de las células HeLa con tapsigargina

15 frente a tratadas con taspigargicina en la estimulación de la liberación de IL-8 humana a partir de la línea celular monocitaria THP-1. Eje X: concentración de tapsigargina o tapsigargicina (μM); Eje Y: concentración de interleucina 8 (IL-8) (pg/ml). La Figura 2B muestra los resultados en los que se emplearon perlas de butil sefarosa tratadas con tapsigargina para generar la liberación de IL-8 a partir de células presentadoras de antígeno. En otra realización, la presente invención contempla liposomas, que también son hidrófobos, como vehículo de suministro (véase la Figura 2C). La Figura 3 presenta un listado ilustrativo que muestra la preponderancia de líneas celulares de cáncer de diversos tejidos conocidas por secretar citocinas después de la exposición a un compuesto relacionado con tapsigargina. La Figura 4 presenta datos ejemplares que muestran que las inmunizaciones basadas en tapsigargina reducen el

25 crecimiento tumoral y mejoran la supervivencia en ratones C57B1/6. Panel A: crecimiento tumoral a lo largo del tiempo. Líneas cortas: controles de solución salina. Círculos en blanco: extractos de células B16 no tratadas. Círculos negros: extractos de células BI6+TG 2,5 μM. Panel B: supervivencia celular a lo largo del tiempo. Líneas cortas: controles de solución salina. Círculos blancos: extractos de células B16 no tratadas. Círculos negros: extractos de células B16+TG 2,5 μM. La Figura 5 presenta datos ejemplares que muestran que las inmunizaciones basadas en tapsigargina no tienen efecto sobre el crecimiento tumoral en ratones desnudos (Nu/Nu). Panel A (las flechas indican el sitio de inyección): ratón 1 y ratón 2; inflamación inducida por BI6-TG. Ratón 3 y Ratón 4; controles de B16. Panel B: supervivencia celular a lo largo del tiempo. Círculos blancos: extractos de células B16 no tratadas. Círculos negros: extractos de células B16+TG 2,5 μM.

35 La Figura 6 presenta datos ejemplares que muestran un crecimiento tumoral reducido tras la inmunización de ratones C57B1/6 con extracto de células B16+TG (500 μg i.p.). Eje X: días tras la inyección el día 0 de células de melanoma B16-F10. Eje Y: área tumoral (mm2). Círculos blancos: dos inyecciones de extracto de células B16+TG (día 0 y día 116) y dos inyecciones de células B16-F10 (día 0 y día 116). Cuadrados negros: control no tratado el día 0 con células B16-F10. Triángulos negros: control no tratado inyectado con B16-F10 el día 116. La Figura 7 presenta datos ejemplares que muestran un tamaño tumoral reducido tras la inmunización de ratones C57B1/6 con extracto de células B16+TG (500 μg)/plásmido de expresión de CD40L. Eje X: días tras el día 0 de inyección de células de melanoma B16-F10. Eje Y: área tumoral (mm2). Círculos blancos: dos inyecciones intraperitoneales de extracto de células B16+TG/plásmido de expresión de CD40L (día 0 y día 116) y dos inyecciones de células de melanoma B16-F10 (día 0 y día 116). Círculos blancos: dos inyecciones intradérmicas

45 de extracto de células B16+TG/plásmido de expresión de CD40L (día 0 y día 116) y dos inyecciones de células de melanoma B16-F10 (día 0 y día 116). Rombos blancos: dos inyecciones subcutáneas de extracto de células B16+TG/plásmido de expresión de CD40L (Día 0 y Día 116) y dos inyecciones de células de melanoma B16-F10 (Día 0 y Día 116). Cuadrados negros: control no tratado inyectado el día 0 con células de melanoma B16-F10. Triángulos negros: control no tratado inyectado el día 116 con células de melanoma B16-F10. La Figura 8 presenta datos ejemplares que muestran la inducción de la diferenciación de monocitos por células HeLa tratadas con TG. Panel A: monocitos no tratados que tienen una morfología redondeada. Panel B: monocitos tratados que tienen una morfología alargada y aplanada (flechas). La Figura 9 presenta datos ejemplares que muestran una mejora dependiente de la dosis de la supervivencia de ratones C57B1/6 después de que las formulaciones liposomales de TG se administraran los días 7, 8, 9, 14, 15,

55 16, 21, 22 y 23 (flechas). Círculos blancos: control no tratado tras la inyección (s.c.) el día 0 de células B16-F10. Rombo negro: TG al 0,003 % en moles (i.d.) tras la inyección (s.c.) del día 0 de células B16-F10. Cuadrado negro: TG al 0,003 % en moles (i.d.) tras la inyección (s.c.) el día 0 de células B16-F10. Triángulo negro: TG al 0,03 % en moles (i.d.) tras la inyección (s.c.) el día 0 de células B16-F10. El panel A de la Figura 10 presenta datos ejemplares que muestran la respuesta de 50.000 THP-1 clon A9 a diversos ligandos de TLR, determinado mediante un sistema indicador de luciferasa. Eje Y: unidades de luz relativas (ULR) generadas por las propiedades quimioluminiscentes de la proteína luciferasa de luciérnaga. El panel B de la Figura 10 presenta datos ejemplares que muestran una curva de respuesta a la dosis de tapsigargina (TG) usando 50.000 THP-1 clon A9, determinado mediante un sistema indicador de luciferasa. Eje

Y: unidades de luz relativas (URL) generadas por las propiedades quimioluminiscentes de la proteína luciferasa

65 de luciérnaga. Barras blancas: TG sola. Barras negras: 30.000 células HeLa tratadas con TG. Med = control de medio.

La Figura 11 presenta datos ejemplares que muestran la respuesta de MonoMac-6 Clon 5 a diversos ligandos de TLR, determinado mediante un ensayo indicador de luciferasa. Eje Y: unidades de luz relativas (ULR) generadas por las propiedades quimioluminiscentes de la proteína luciferasa de luciérnaga. TG (2,5 μM). Medio = Control. La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos de CD40L.

5 La Figura 13 muestra el ADNc de CD40L preparado para el ligamiento en el sitio de restricción XbaI de pVAX1. La Figura 14 muestra el mapa del plásmido de expresión pVAX1 disponible en el mercado.

PARTE EXPERIMENTAL

A continuación se representan determinadas ilustraciones y realizaciones contempladas por la presente invención.

EJEMPLO I

Procedimientos básicos de laboratorio

15 El presente ejemplo proporciona materiales y métodos básicos que se utilizan en los siguientes Ejemplos II -VII a continuación. Aunque estos experimentos en particular utilizaron compuestos y técnicas específicos, otros compuestos y técnicas similares también tienen la capacidad de generar datos similares.

Líneas celulares

La línea celular de epitelio de cuello uterino humano HeLa y el melanoma de ratón B16-F10 se adquirieron de la Colección americana de cultivos tipo y se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco [D-MEM (Cellgro®, Herndon VA)] complementado con suero fetal bovino al 10 % (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO). Todos los tratamientos

25 relacionados con el estrés/muerte descritos a continuación se realizaron utilizando células HeLa en las exploraciones iniciales. Las células de leucemia promonocíticas humana THP-1 (ATCC, Manassas VA) y promacrofágicas MonoMac6 se utilizaron como las células presentadoras de antígeno indicadoras utilizadas en el presente estudio. Ziegler-Heitbrock et al., "Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes" Int. J. Cancer 41: 456-461 (1988). Ambas líneas se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Cellgro®) complementado con suero fetal bovino al 10 %. A menos que se indique otra cosa, todas las células se mantuvieron a 37 ºC en un incubador humidificado complementado con CO2 al 5 %.

Compuestos

35 El siguiente listado incluye los compuestos de molécula pequeña evaluados en el presente estudio: tapsigargina, tapsigargicina (MP Biomedicals, Irvine CA), tetra(acetoximetil) éster de ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’tetraacético [BAPTA-AM, (EMD Biosciences, San Diego, CA)], éster de etilenglicol-bis(β-aminoetil)-N,N,N’,N’tetraacetoximetilo [EGTA-AM (EMD Biosciences )], ácido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA), tetrandrina, KCl, péptido amiloide Aβ1-42, 1-oleoil-2-acetil-sn-glicerol (OAG), calcimicina A23187, 2-aminoetil difenilborinato (2-APB), histamina, ácido ciclopiazónico, 2,5-di-(t-butil)-1,4-hidroquinona [BHQ (EMD Biosciences)], GdCl3, clorhidrato de nicardipina, 1-(o-cloro-α-αadifenilbencil)imidazol (clotrimazol), apamina, caribdotoxina, radicicol, brefeldina A, tunicamicina, tamoxifeno, ionomicina, estaurosporina, clorhidrato de cis-diaminoplatino (II) (cisplatino), paclitaxel, metotrexato, cicloheximida y rapamicina. A menos que se indique otra cosa, todos los compuestos se adquirieron en Sigma-Aldrich. Los compuestos se disolvieron según las recomendaciones del

45 fabricante antes de la adición a las células HeLa, en una serie de concentraciones basada en la bibliografía publicada, y se incubaron entre 1 minuto y dos días. Los mediadores de inflamación conocidos clorhidrato de pam3cys-ser-(lys)4 (Pam3Cys), flagelina bacteriana y lipopolisacárido se adquirieron en EMD Biosciences.

Construcciones de ADN

Los transgenes inductores de muerte celular evaluados incluyen caspasa 8, caspasa 9, caspasa 3 humanos, el dominio intracelular del receptor del factor de crecimiento de insulina 1 humano (IGF-1RIC) y el receptor de neurocinina-1 (NK1R), todos clonados en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen). El plásmido de expresión de CD40L (o CD 154) se generó creando ADN complementario de CD40L utilizando la secuencia de nucleótidos de CD40L de

55 ratón publicada en el NCBI (Figura 12) y oligonucleótidos solapantes que codifican esta secuencia flanqueada por sitios de restricción XbaI (Figura 13) seguido de reacción en cadena de la polimerasa utilizando ADN polimerasa Pfu (Stratagene, San Diego CA). El ADN resultante se digirió con XbaI (New England Biolabs, Ipswich MA) y se ligó en el vector de expresión pVAX1 digerido de forma similar (Invitrogen, Carlsbad CA) (Figura 14). La construcción pVAX-CD40L se verificó mediante secuenciación de ADN.

Transfecciones

Todas las transfecciones se realizaron utilizando células HeLa y reactivo de transfección Lipofectamine 2000® (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las células transfectadas con NK1R se incubaron con el

65 péptido sustancia P 1 μM (Sigma-Aldrich) para inducir la muerte un día después de la transfección.

Otras rutas de estrés/muerte celular

La privación de suero se realizó después de la incubación de las células HeLa en DMEM sin suero durante tiempos que variaban de 1 a 24 horas. Se indujo el choque de calor incubando las células a 42-45 ºC entre 1-6 horas. 5 Cuantificación de la liberación de citocinas proinflamatorias.

Después del estrés/muerte celular se recogieron las células/ residuos de células resultantes, se lavó 3 veces con un exceso de solución salina tamponada con fosfato, se hicieron pasar rápidamente a través de un ciclo de tres veces de congelación/descongelación (-80 ºC a 25 ºC) y se cuantificó mediante espectrofotometría de UV (A280). Para determinar la presencia de señales proinflamatorias dentro de las células estresadas/muertas, se añadieron 40 μg de células estresadas/muertas a 50.000 THP-1 y se incubó durante 18 horas. Se evaluó en los sobrenadantes la presencia de citocinas proinflamatorias, incluyendo el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interleucina 8 (IL-8) e IL12, utilizando sistemas de ELISA disponibles en el mercado.

15 Generación de actividad inflamatoria dependiente de tapsigargina

Se cultivaron células B16-F10 en placas de cultivo de tejidos de 150 mm hasta una confluencia de ~80 % antes de la adición de tapsigargina (2,5 μM). Se permitió a las células incubarse durante 48 horas antes de la recolección, tres lavados con un exceso de solución salina tamponada con fosfato, ciclos de congelación-descongelación y la cuantificación como se describe anteriormente. Las células no tratadas se recogieron de forma similar y se evaluó in vitro la actividad inflamatoria en ambos extractos utilizando el sistema THP-1 descrito anteriormente antes del uso posterior in vivo.

25 Inmunizaciones en ratones y exposición a tumor

Antes del inicio, el Buck Institute Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aprobó todos los siguientes estudios descritos en ratón. Se adquirieron ratones C57B1/6 y nu/nu hembra de 6-8 semanas en Charles River Laboratories (Wilmington MA). Las inmunizaciones se realizaron inyectando tres veces 500 μg de extracto de B16-F10 (con o sin tratamiento con tapsigargina) a intervalos de dos semanas mediante diversas vías de inmunización incluyendo las vías subcutánea, intraperitoneal e intradérmica. La exposición al tumor en vivo se realizó inyectando

100.000 células B16-F10 vivas por vía subcutánea en un sitio contralateral dos semanas después de la última dosis de refuerzo.

35 EJEMPLO II

Identificación de una señal de peligro endógena sensible a tapsigargina

Se exploró una diversidad de distintos agentes inductores de estrés celular y muerte celular potenciales. La toxina de origen vegetal tapsigargina indujo la secreción de TNF-α en una línea de células de cáncer de cuello uterino obtenida de un paciente (HeLa) y así se identificó para su uso en las diversas realizaciones antineoplásicas descritas anteriormente. Por el contrario, se analizaron otros posibles estresantes celulares (es decir, por ejemplo, taxol, tunicamicina, brefeldina A, cicloheximida y calcimicina) pero no indujeron actividad inmunoestimuladora. (Véase la Figura 1).

45 La tapsigargina también tuvo la capacidad de activar una célula presentadora de antígeno (CPA) en un sistema de lectura que utiliza una línea celular monocítica para secretar grandes cantidades de la citocina inflamatoria factor de necrosis tumoral α (TNF-α). (Datos no mostrados).

EJEMPLO III

Secreción de citocinas inducida por tapsigargina

El presente ejemplo ilustra que el tratamiento de células cancerosas con tapsigargina hace a estas células

55 inmunoestimuladoras para células presentadoras de anticuerpos (monocitos, macrófagos, células dendríticas, etc.) las cuales se activan para liberar citocinas. Aunque no es necesario entender el mecanismo de una invención, se cree que la IL-12 desempeña un papel en el desarrollo de las respuestas inmunitarias mediadas por células (el tipo de respuesta inmunitaria que puede ser necesaria para el control del cáncer y de la infección por patógenos intracelulares).

Un compuesto relacionado con tapsigargina, tapsigargicina (un análogo de la tapsigargina menos hidrófobo) y la tapsigargina activaron una secreción de IL-8 dependiente de la dosis a partir de la línea celular monocitaria THP-1. (Véase la Figura 2A). La presente invención, en algunas realizaciones, contempla la administración directa de tapsigargina y/o de compuestos relacionados con tapsigargina. En otras realizaciones, se administran tapsigargina 65 y/o compuestos relacionados con tapsigargina a través de un vehículo tal como perlas (véase la Figura 2B, en la que se emplearon perlas de butil sefarosa tratadas con tapsigargina) y liposomas (véase la Figura 2C, en la que se

empleó tapsigargina encapsulada en liposomas catiónicos). Estos datos muestran que los compuestos relacionados con tapsigargina tienen la capacidad de activar una potente reacción inflamatoria. El tratamiento con tapsigargina también dio como resultado la secreción de IL-12, IL-8 y TNF-α en una diversidad de líneas de cáncer obtenidas de pacientes. (Véase la Figura 3).

5 EJEMPLO IV

Inmunización in vivo con extractos de B16 tratados con tapsigargina

El presente ejemplo demuestra que la inmunización con células tratadas con tapsigargina confiere protección frente a la progresión del cáncer.

Se trató in vitro la línea celular de melanoma de ratón poco inmunogénica B16 con tapsigargina, para hacerla proinflamatoria (es decir, capaz de secretar citocinas en conformidad con el Ejemplo III). Posteriormente, los ratones

15 se inmunizaron tres veces, una vez cada dos semanas, con células B16 tratadas con tapsigargina (después de lavarlas, cuantificarlas y lisarlas mediante congelación y descongelación, para crear una solución de fragmentos celulares) (B16+TG; 500 μg) y de células B16 (B16) no tratadas o tampón de solución salina como controles. Dos semanas después de la inmunización final, se les implantó a los ratones células cancerosas B16 vivas y se controló la progresión tumoral.

B16+TG indujo una respuesta inflamatoria transitoria en ratones C57B1/6 en el sitio de la inmunización. Esta respuesta no se observó en los grupos de solución salina o de B16. Los ratones C57B1/6 presentaron una progresión tumoral significativamente retrasada y una esperanza de vida mejorada tras la inmunización con B16+TG, pero no tras las inyecciones de B16 y solución salina. (Véanse las Figuras 4A y 4B, respectivamente). Los

25 datos muestran que los animales tratados vivieron, en promedio, casi el doble de tiempo después de los injertos tumorales.

Un experimento similar utilizando ratones desnudos (Nu/Nu) demostró que B16+TG (otra vez, tras lavar las células, cuantificarlas y lisarlas mediante congelación y descongelación para crear una solución de fragmentos celulares) fue ineficaz en mejorar la supervivencia. La inmunización de ratones desnudos con células tratadas con tapsigargina demostró una inflamación significativa in situ, pero esto fue ineficaz en el control la progresión tumoral. (Véanse la Figura 5A y Figura 5B, respectivamente). Aunque no es necesario para la práctica de la presente invención, estos datos son consistentes con la hipótesis de que los ratones desnudos poseen una mutación genética que interfiere con el desarrollo tímico normal, inhibiendo de este modo la generación de linfocitos T funcionales.

35 Aunque no es necesario entender el mecanismo de una invención, se cree que los linfocitos T, en particular el subconjunto de citotóxicos CD8+, desempeñan un papel en la destrucción tanto de tejidos neoplásicos como de los infectados por patógenos intracelulares. Considerados en su conjunto, estos datos indican que las células tratadas con tapsigargina activan la inflamación, lo que a su vez conduce a la generación de una respuesta de linfocitos T protectora, de una manera similar a los adyuvantes.

EJEMPLO V

Memoria inmunoprotectora inducida por inyecciones de B16+TG

45 El presente ejemplo proporciona una realización en la que una inmunización con B16+TG (es decir, células B16 tratadas con TG que después de eso se lavaron, cuantificaron y lisaron mediante congelación y descongelación, para crear una solución de fragmentos celulares) confiere protección prolongada frente a un melanoma inyectado. Los ratones C57B1/6 se inmunizaron con B16+TG de acuerdo con el Ejemplo VI y posteriormente se expusieron a células de melanoma B16-F10 vivas. En el día 0 y el día 116 los ratones inmunizados con B16+TG no desarrollaron un tumor de melanoma. (Véase la Figura 6). Los ratones de control que no habían recibido el extracto de B16+TG demostraron las tasas de progresión tumoral típicas.

Como alternativa, se coinmunizó un plásmido de expresión de CD40L de ratón con el extracto de B16+ TG. Cuando

55 la inmunización se realizó utilizando inyecciones intradérmicas se observó la represión tumoral completa en el día 0. Cuando la inmunización se realizó utilizando inyecciones subcutáneas o intraperitoneales se observó una represión tumoral parcial en el día 0. Cuando los animales a los que se les proporcionó el día 0 una inyección intradérmica se reexpusieron en el día 116, solo se observó una represión tumoral parcial. (Véase la Figura 7).

Estos datos demuestran que los ratones inmunizados con extractos de B16 tratados con TG pueden desarrollar una inmunidad prolongada frente al melanoma B16. En el presente experimento, la extensión de esta inmunidad, parece depender un tanto de la vía de administración. Por ejemplo, las inmunizaciones proporcionadas por vía intraperitoneal o vía subcutánea no suprimieron el crecimiento tumoral de forma completa después de la inyección de células de melanoma B16 en el día 0 o el día 116. (Véase la Figura 7). Sin embargo, las condiciones no se han

65 optimizado.

En conclusión, estos datos muestran que B16+TG puede proteger frente a la reexposición a células cancerosas vivas durante un período de al menos tres meses (es decir, 116 días) tras las inmunizaciones iniciales y la exposición. Estos datos también sugieren que los extractos de B16+TG pueden inducir la síntesis de citocinas proinflamatorias, tales como TNF-α, por parte de células presentadoras de antígeno, las cuales es probable que

5 activen una respuesta inmunitaria adaptativa específica de tumor transitoria por linfocitos B y/o T para retrasar el crecimiento tumoral in vivo.

EJEMPLO VI

Diferenciación de monocitos inducida por extractos de R16-TG

El presente ejemplo presenta datos ejemplares en cuanto a si las células tratadas con tapsigargina tienen la capacidad de dirigir la diferenciación de monocitos en otros subtipos de células presentadoras de antígeno. Los datos previos han demostrado que determinados agentes actúan sobre células presentadoras de antígeno dando

15 como resultado la diferenciación en células dendríticas maduras. Hertz et al., “Microbial lipopeptides stimulate dendritic cell maturation via Toll-like receptor 2” J. Immunol. 166: 2444-2450(2001). Aunque no es necesario entender el mecanismo de una invención, se cree que las células dendríticas son el tipo celular principal responsable de la determinación de si se activa una respuesta inmunitaria adaptativa o una inmunotolerancia para cualquier antígeno dado del cuerpo.

Se trataron monocitos redondeados no diferenciados (véase la Figura 8A) con o sin extractos de células HeLa tratados con tapsigargina durante 24 horas. Se evaluaron después los cambios en la morfología celular (es decir, por ejemplo, alargamiento y/o aplanamiento celular inducido). Los resultados indican que las células tratadas con tapsigargina inducen un cambio en la forma de los monocitos, de principalmente redondeados a planos y alargados.

25 (Véase la Figura 8B, indicado por flechas negras). Este cambio de forma se cree que es indicativo de un proceso de maduración de monocitos no diferenciados, que en general son de morfología redonda, a células adherentes con procesos celulares largos típicos de los macrófagos o de las células dendríticas inmaduras.

EJEMPLO VII

Reducción tumoral inducida por la formulación liposomal de TG

El presente ejemplo presenta datos que muestran que los liposomas que contienen tapsigargina reducen la progresión tumoral de una manera dependiente de la dosis.

35 Se formularon liposomas catiónicos con un contenido en lípidos total de 50 mM, que contenían cantidades crecientes de tapsigargina (0,0003, 0,003 y 0,03 % en moles), mediante el método de película lipídica seguido de varios ciclos de extrusión. Kuntsfeld et al., Journal of Investigative Dermatology, 120: 476-482 (2003). Los liposomas se formularon utilizando diversas concentraciones de tapsigargina, suficiente 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) para llevar el total al 50 % en moles y 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano (DOTAP) al 50 % en moles en cloroformo. Las películas lipídicas se generaron después de la evaporación en un evaporador rotatorio y se rehidrataron en tampón de sacarosa al 5% durante una noche. Los liposomas se extruyeron utilizando una membrana de extrusión 200 nM y se conservaron en gas argón a 4 ºC hasta su uso. Se injertaron de forma simultánea en el día 0 cuatro grupos de dos ratones C57B1/6 hembras con 1x105 células de melanoma B16-F10

45 vivas por vía subcutánea en el flanco izquierdo. Los ratones que recibieron tapsigargina encapsulada en liposomas se inyectaron por vía intradérmica con 50 μl de cada formulación de liposomas que contenían tapsigargina después del implante tumoral en los días 7, 8, 9, 14, 15, 16, 21, 22 y 23, en sitios alejados que variaban de la base de la cola al flanco derecho, y se controló la progresión tumoral. Después, se injertaron de forma simultánea en el día 0 cuatro grupos de dos ratones C57B1/6 hembras con 1x105 células de melanoma B16-F10 vivas, por vía subcutánea en el flanco izquierdo. Los ratones que recibieron tapsigargina encapsulada en liposomas se inyectaron por vía intradérmica con 50 μl de cada formulación de liposomas que contenían tapsigargina, en los días 7, 8, 9, 14, 15, 16, 21, 22 y 23, en sitios alejados que variaban de la base de la cola al flanco derecho, y se controló la progresión tumoral. Los datos indican que la tapsigargina encapsulada en liposomas tiene la capacidad de disminuir la progresión tumoral de una manera dependiente de la

55 dosis. (Véase la Figura 9).

EJEMPLO VIII

Sistemas de promotor NF-κB inducido por toxina

El presente ejemplo presenta una realización de un sistema indicador (es decir, un marcador o etiqueta) de alto rendimiento sensible a toxina.

Se integró una construcción de ADN transfectada de forma estable que codifica un promotor NF-κB que dirige la

65 expresión de la luciferasa de luciérnaga en: i) la línea celular premonocítica humana THP-1 y ii) la línea celular premonocítica humana MonoMac-6. Brevemente, el ADN que codifica un elemento de respuesta a NF-κB

concatemerizado cadena arriba del gen de la luciferasa de luciérnaga [Ting et al., “RIP mediates tumor necrosis factor receptor 1 activation of NF-kappaB but not Fas/APO-1-initiated apoptosis” EMBO J. Nov 15; 15(22): 618996(1996)] se subclonó en la estructura del vector pEAK8 (Edge Biosystems, Gaithersburg MD) mediante técnicas de biología molecular convencionales. Se realizaron electroporaciones utilizando 10 μg de ADN y 700.000 células 5 THP-1 o MonoMac6, utilizando un electroporador Gene Pulser II de Biorad (Biorad, Hercules CA), electrocubetas de 0,4 cm, y 200 V, 950 μF. Después de la electroporación, se permitió que las células se recuperaran durante dos días antes de la selección con el aminonucleósido puromicina 300 ng/ml (Sigma-Aldrich) para la generación de clones transfectados de forma estable. La expresión de luciferasa se cuantificó utilizando un luminómetro Top Count NXT (Perkin Elmer, Wellesley MA). Brevemente, se incubaron 50.000 células indicadoras con las concentraciones

10 indicadas de los mediadores de inflamación enumerados, durante 18 horas en placas de cultivo blancas de 96 pocillos, antes de la recolección y el análisis.

THP-1 clon A9

15 El reconocimiento del clon A9 obtenido de THP-1 de los ligandos de TLR Pam-3-Cys (señalización a través de TLR2) y flagelina bacteriana (señalización a través de TLR5), pero no de lipopolisacárido bacteriano (señalización a través de TLR4), se determinó controlando la actividad de NF-κB en ensayos automatizados en placas de cultivo blancas de 96 pocillos durante la incubación con TG. (Véase la Figura 10A).

20 Además se utilizaron diversas concentraciones de tapsigargina en presencia o ausencia de células HeLa sembradas en placa con anterioridad. Estos resultados demostraron que el clon A9 reconoció las células HeLa tratadas con tapsigargina a niveles mayores desde el punto de vista sinérgico que las células HeLa no tratadas o solo tapsigargina. (Véase la Figura 10B).

25 En conjunto, estos datos respaldan el uso del clon A9 en la identificación de compuestos y/o factores nuevos que modulan la inflamación a través de TLR2.

MonoMac-6 clon C5

30 Se creó un segundo transfectante estable con la construcción indicadora de NF-κB utilizando células MonoMac-6. Al contrario del clon A9, el clon C5 obtenido de MonoMac-6 demostró un reconocimiento mejorado de lipopolisacárido bacteriano. El clon C5 también reconoció a Pam3Cys, flagelina y células HeLa tratadas con tapsigargina. (Véase la Figura 11).

35 EJEMPLO IX

Pérdida de pelo inducida por tapsigargina

El presente ejemplo presenta una realización en la que se utiliza tapsigargina (TG) en una solución tópica para

40 inducir pérdida de pelo. Se prepararon soluciones para frotar (etanol al 75 %, ciclohexano al 22 % y dimetilsulfóxido al 3 %) que contenían TG a una diversidad de concentraciones (un control a 0 y muestras de prueba a 40 uM, 1,2 mM y 40 mM). Las diversas soluciones se aplicaron a distintos ratones por vía tópica. A las concentraciones altas se pudo observar rápidamente inflamación inducida in situ (datos no mostrados). La inflamación en el día 3, a la concentración más alta, indujo tanta inflamación que está claro que la concentración no es apropiada. A las

45 concentraciones más bajas se indujo alopecia /pérdida de pelo transitoria en el sitio de frotado (datos no mostrados). La pérdida de pelo persistió durante semanas e incluso meses, con pérdida de pelo aún visible a los 4,5 meses (18 semanas). En algunos animales en el área tratada, una vez completamente alopécica en los animales tratados con TG (un tratamiento), comenzaban a volver a crecer algunos pelos en el punto de 18 semanas. Por lo tanto, estas dosificaciones bajas (μM) de TG pueden emplearse (por ejemplo, en lociones) para inducir pérdida de pelo o para su

50 uso en otros productos depilatorios para aplicaciones cosméticas u otras aplicaciones médicas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> THE BUCK INSTITUTE FOR AGE RESEARCH 55

<120> REACTIVOS Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DEL CÁNCER

<130> N.106194 60

<140> EP 07754097,9

<141>

<150> US 11/389,695 65 <151>

<160>4

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 5 <211> 783

<212> ADN

<213> Mus musculus

10 <400> 1

<210> 2 15 <211> 795

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 2 20

<210> 3

<211> 260

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

<210> 4

<211> 795

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 4

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método de preparación de un agente antineoplásico que comprende:

   5 (a) exponer ex vivo una porción de células obtenidas de una línea de células de cáncer o una porción de células tumorales obtenidas de un paciente a un agente seleccionado de:

   (i) un análogo de tapsigargina seleccionado de desacetiltapsigargina, 8-O-(12-[L-leucinoilamino]dodecanoil)8-O-desbutanoiltapsigargina (=L12ADT), 8-O-desbutanoiltapsigargina, 8-O-(4-aminocinamoil)-8-O

   10 desbutanoiltapsigargina (=ACTA) y 8-(4-Azidobenzoil)tapsigargina (=ZTG); o

   (ii) una guaianolida encontrada en Thapsia, seleccionada de tapsitranstagina, tapsivillosina A, tapsivillosina B, tapsivillosina C, tapsivillosina D, tapsivillosina E, tapsivillosina F, tapsivillosina G, tapsivillosina H, tapsivillosina I, tapsivillosina J, tapsivillosina K, trilobolida y nortrilobolida,

   15 con el fin de crear células tumorales tratadas;

   (b) lisar dichas células tumorales tratadas para crear fragmentos celulares, en los que dichos fragmentos son adecuados para generar un efecto terapéutico antineoplásico.

   20 2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende adicionalmente preparar extractos de células tumorales a partir de dichas células tumorales tratadas, y en el que dichos extractos son adecuados para generar un efecto terapéutico antineoplásico.
2. 3. El método de la reivindicación 2, en el que dichos extractos carecen de células. 25

3. 4.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento de la etapa (a) es durante un tiempo de entre 1 minuto y 30 minutos.

4. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el que dichas células tumorales se seleccionan del grupo que consiste en

   30 células de cáncer de próstata, células de cáncer de mama, células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer uterino, células de cáncer pancreático, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de hueso.
5. 6. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células tumorales son células de cáncer de piel. 35

6. 7.

   El método de la reivindicación 1, en el que dichas células tumorales son células de linfoma.

7. 8.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente comprende el análogo de tapsigargina.

   40 9. El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente comprende la guaianolida encontrada en Thapsia.
8. 10. Un agente antineoplásico producido mediante un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un paciente.

   45 11. El agente antineoplásico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho tratamiento comprende adicionalmente introducir una construcción de expresión de CD40L en dicho paciente.
9. 12. El agente antineoplásico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho tratamiento comprende

   una reducción del tamaño del tumor. 50