CN101443036A - 癌症治疗和预防的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及癌症的预防和/或治疗，更特别地，涉及在无放射和标准化疗剂的情况下肿瘤的治疗，包括实体瘤和它们的转移灶。在一个实施方式中，本发明包含一种方法，其包括：a)提供具有肿瘤细胞的对象，b)从所述对象取出至少一部分的所述肿瘤细胞，以产生取出的细胞，c)使用刺激剂，包括毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物，离体(先体外后体内方法)处理至少一部分的所述取出的细胞，以产生处理过的肿瘤细胞；和d)在体内将所述处理过的肿瘤细胞(或其碎片)引入同一对象，以产生抗癌治疗效果。

Description

癌症治疗和预防的试剂和方法
发明领域
[001]本发明一般地涉及癌症的治疗，更特别地，涉及在无放射和标准化疗剂的情况下肿瘤的治疗，包括实体瘤和它们的转移灶。在优选的实施方式中，本发明涉及通过利用癌症疫苗预防和治疗肿瘤。
背景
[002]现代癌症疗法主要涉及放射、手术和化疗剂的应用。然而，这些措施的结果，尽管在一些肿瘤中是有益的，但在许多其它肿瘤中仅具有微小的效果或没有效果。而且，这些方法通常具有不可接受的毒性。
[003]放射和手术都具有相同的理论缺陷。已经认识到，在单个克隆原恶性细胞可以产生足够的后代来杀死宿主的情况下，整个瘤细胞群必须被根除。一般地，参见Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(Pergamon Press，第8版)(第1202-1204页)。“杀死全部细胞”的概念意味着如果要实现治愈，对于手术方法而言，肿瘤的全部切除是必需的，而在放射方法中，所有癌细胞的完全破坏是需要的。在实践中这几乎是不可能的；实际上，在存在转移的情况下，这是不可能的。
[004]而且，传统的化疗癌症治疗也很少导致肿瘤的完全消退，甚至产生中度应答所要求的显著剂量水平经常伴随着不可接受的毒性。抗癌剂一般具有负面血液效应(例如，有丝分裂停止和骨髓和淋巴组织中形成成分的分解)和免疫抑制作用(例如，受抑制细胞计数)，以及对上皮组织(例如，肠粘膜)、生殖组织(例如，精子发生受损)和神经系统的严重影响。P.Calabresi和B.A.Chabner，In：Goodman和Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics(Pergamon Press，第8版)(第1209-1216页)。高剂量水平和所导致的毒性在很大程度上由于抗癌剂本身缺乏靶特异性而不可避免。药物需要区分癌性的宿主细胞和非癌性的宿主细胞。大部分抗癌药在该水平下不加区分，且具有显著的内在毒性。
[005]标准化疗剂作为抗癌剂的成功也已经受到多重抗药性——对宽范围的结构上不相关细胞毒性抗癌化合物的抗性——这一现象的妨碍。J.H.Gerlach et al.，Cancer Surveys，5：25-46(1986)。递增的抗药性的潜在原因可能是由于在诊断时肿瘤内的一小群抗药细胞(例如，突变细胞)所致。J.H.Goldie和Andrew J.Coldman，Cancer Research，44：3643-3653(1984)。用单一的药物治疗这样的肿瘤首先引起肿瘤消退，其中作为杀死大多数药敏细胞的结果肿瘤大小收缩。随着药敏细胞死去，剩余的抗药细胞继续繁殖并最终占肿瘤细胞群的大部分。
[006]在开始时采用药物联合进行治疗被提出来作为解决方案，因为两种或更多种不同抗药性会在同一细胞中同时产生的概率很小。V.T.De Vita，Jr.，Cancer，51:1209-1220(1983)。然而，现在已知抗药性的原因在于膜转运蛋白“P-糖蛋白”，其可以赋予一般的抗药性。M.M.Gottesman和I.Pastan，Trends in Pharmacological Science，9：54-58(1988)。在表型上，肿瘤细胞随时间表现出所有药物的降低的细胞积累。简言之，联合化疗似乎不是答案。
[007]过继细胞免疫治疗已被提出作为替代性治疗方法，其利用机体自身的免疫系统，目的是提高靶细胞特异性，同时降低毒性。体内和体外用淋巴因子激活和增殖各种淋巴细胞群都已经得到研究，取得了各种程度的成功。例如，淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)都已经与白介素-2(IL-2)联合用于治疗转移性疾病。参见Rosenberg等，N.Engl.J.Med.316:889-97(1987)；Belldegrun等，Cancer Res.48:206-14(1988)。
[008]遗憾的是，包含高水平的IL-2来激活和扩增该细胞群本身就伴随着对患者的显著毒性。而且，靶细胞特异性细胞群难以体外扩增，因为在高水平的IL-2下培养的淋巴细胞最终发展出对IL-2的无反应性，并随后表现出增殖和细胞毒性的严重下降。参见Schoof等，CancerRes.50:1138-43(1990)。后一问题也已阻碍了在成功使用淋巴细胞作为人类基因治疗的细胞载体方面的努力。
[009]需要的是对于许多种肿瘤类型能够可靠杀死癌细胞的特异性抗癌方法。重要地，该治疗必须有效，且具有最小的宿主毒性。
发明概述
[010]本发明一般地涉及癌症的预防和/或治疗治疗，更特别地，涉及在无放射和标准化疗剂的情况下治疗肿瘤，包括实体瘤和它们的转移灶。在一个实施方式中，本发明包含一种方法，其包括：a)提供具有肿瘤细胞的对象，b)从所述对象取出至少一部分的所述肿瘤细胞，以产生取出的细胞，c)使用刺激剂，包括毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物，离体(先体外后体内，ex vivo)处理至少一部分的所述取出的细胞，以产生处理过的肿瘤细胞；和d)在体内将所述处理过的肿瘤细胞引入同一对象，以产生抗癌治疗效果。在引入所述处理过的肿瘤细胞之前，它们可以被洗涤(例如，用缓冲液、培养基等)，以最小化载入所述对象的试剂的量。在一个优选的实施方式中，本发明包括一种方法，包括a)提供具有肿瘤细胞的患者，b)从所述患者取出至少一部分的所述肿瘤细胞，以产生取出的细胞，c)离体使至少一部分的所述取出的细胞暴露于选自毒胡萝卜素和毒胡萝卜素相关化合物的试剂，以产生处理过的肿瘤细胞；d)裂解所述处理过的肿瘤细胞，以产生细胞碎片，和e)在体内将所述碎片引入同一患者，以产生抗癌治疗效果。优选的是，在一个实施方式中，在步骤(d)之前，所述处理的细胞被洗涤，以最小化载入下一步骤中的试剂的量。本发明不意图受限于步骤(c)的任何具体暴露/处理时间。各种暴露时间被考虑，包括1秒至72小时之间的时间，更优选30秒至1小时之间，仍更优选1分钟至30分钟之间。本发明不意图受限于步骤(d)中的裂解的类型。在一个实施方式中，处理过的肿瘤细胞通过冻融细胞进行裂解。在另一个实施方式中，使用了裂解剂；裂解剂可以是去污剂(例如，十二烷基硫酸钠)、酶(例如，由1ml Qiagen Buffer B1、20μl溶菌酶、45μl蛋白酶和0.35ml Qiagen Buffer B2组成的酶消化缓冲液)、或者简单溶液(例如，磷酸缓冲盐溶液)或用于渗透性裂解细胞的更复杂的溶液，例如在低渗裂解缓冲液(5mM磷酸钠，pH7.4，蛋白酶抑制剂混合物，5mM DTT)中。在另一个实施方式中，细胞用超声波处理。在另一个实施方式中，制备细胞提取物(例如，膜提取物、胞质提取物等)。在其它实施方式中，这些方法的组合被使用(例如，低渗裂解，随后用匀浆器处理，例如Polytron PT 3000，Kinematica，Luzern，Switzerland)。本发明不意图受限于如何引入细胞碎片或细胞成分；它们可以被静脉内(IV)、肌内(IM)、腹膜内(IP)、皮下(SC)、皮内(ID)施用，等等。对于某些癌症可以优选以某些方式施用碎片/提取物。例如，在皮肤癌的情况下，可优选(在一个实施方式中)通过皮肤(例如，皮下、经皮等)施用碎片/提取物，以治疗诸如黑素瘤的癌症。在前列腺癌的情况下，可优选(在一个实施方式中)腹膜内施用碎片/提取物。在另一方面，在一些实施方式中，碎片/提取物被施用到远离肿瘤的部位，并被施用入与肿瘤(例如，乳腺癌、肺癌等)的组织类型不相关的组织(例如，肌肉、皮肤等)。
[011]本发明还不意图受限于仅体内引入碎片/提取物；其它化合物(包括但不限于佐剂、促分裂原等)或成分(包括但不限于提供肽、多肽或蛋白质的连续或瞬时表达的表达构建体，或提供核酸分子的连续或瞬时产生的构建体)。关于其它化合物，本发明在一个实施方式中考虑了在碎片/提取物之前、之后或与其一起施用一种或多种细胞因子。表1提供了可与碎片/提取物一起体内施用或可选地仅仅与毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样试剂一起施用(即，该试剂在没有细胞或裂解液的情况下直接施用)以增强免疫应答的细胞因子的说明性例子。在特别优选的实施方式中，与毒胡萝卜素(或与毒胡萝卜素处理的细胞、碎片或裂解液)一起施用的细胞因子是干扰素-γ。
表1
Figure A200780016283D00081
Figure A200780016283D00091
在其它实施方式中，患者可以在用刺激骨髓中白细胞产生的一种或多种药物——例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，通用名为沙格司亭，商标名为Leukine)和粒细胞集落刺激因子G-CSF，通用名为非格司亭，商标名为Neupogen)——之前、之后进行治疗或同时进行治疗。关于优选的表达构建体，在一个实施方式中，本发明考虑在碎片/提取物之前、之后或与之一起引入CD40L表达质粒，以产生长期效应。
[012]在一个实施方式中，优选的是，碎片/提取物是不含细胞的，以避免将活的癌细胞重新引入患者(然而，在一些情况下，再次引入细胞而非提取物或者再次引入含有细胞的提取物是可能的，因为它们迅速死亡或被患者迅速破坏)。在一个实施方式中，所述肿瘤细胞通过活组织检查获得，并且提取物被施用入同一患者。在另一实施方式中，碎片/提取物被引入不同的患者(实际上，所述碎片/提取物可以被广泛用在多个患者上)。在仍第三个实施方式中，细胞被建立成细胞系，用于连续抗癌用途，换言之，在该第三个实施方式中，肿瘤细胞并非每次都从需要它们的患者得到，而是改为由细胞系提供(通常是与患者肿瘤相同的癌症类型)。使用常规技术，细胞系可以在液氮下被保存在合适的容器中(例如，DMSQ、培养基、胎牛血清等)。另一方面，它们可以在培养下连续传代，直到使用。本发明不意图受限于具体的癌症类型。各种癌症类型被考虑在内，包括但不限于皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、子宫癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、骨癌细胞和淋巴瘤(参见表2，说明性细胞系列表)。本发明不意图受限于单次治疗，即所述碎片/提取物(含或不含其它化合物或成分)可以被间隔施用(例如，每周一次、每月两次、每月一次、每六个月一次、每年一次等)。
[013]在一些从患者取出肿瘤细胞的实施方式中，考虑a)采用取出原发肿瘤(或其部分)的标准手术。在b)使用刺激剂——包括毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物——离体处理该肿瘤细胞以产生处理过的肿瘤细胞；c)从所述处理过的肿瘤细胞制备肿瘤细胞碎片/提取物，和d)将所述碎片/提取物体内引入同一患者之后，预期产生抗转移效应。以这种方式，本发明的实施方式可以与常规手术方法联合。例如，在一个实施方式中，在乳腺中的原发肿瘤可以通过常规手术(即，部分或全部乳房切除术)取出，并且碎片/提取物可以在术后给予患者，以治疗肿瘤转移。在一些实施方式中，无论是否已知患者具有转移(或者在转移已被检测出但转移性疾病的全部范围未知的情况下)，都进行该治疗。换言之，本发明的保护性治疗可在常规手术后被应用于患者，以及用于已知的转移性疾病的急性治疗。
表2
人细胞系和细胞株的名称和来源1
 
来源 细胞系或细胞株
结肠癌 SW1116、HCT116、SKCO-1、HT-29、KM12C、KM12SM、KM12L4、SW480
胰腺癌 BxPC-3、AsPC-1、Capan-2、MIAPaCa-2、Hs766T
结肠腺瘤 Vaco235
肺癌 A549
前列腺癌 PC-3、DU-145
乳腺癌 009P、013T
淋巴瘤 Daudi、Raji
乳房上皮组织 006FA
二倍体成纤维细胞 HCS(人角膜基质)、MRC-5
1SW116、HT-29、SW480、Raji类淋巴母细胞和胰腺细胞系获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
[014]另一方面，并非总是能够取出原发肿瘤。在一些从患者取出肿瘤的实施方式中，考虑a)采用取出转移灶(或其部分)的标准手术。在b)使用刺激剂——包括毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物——离体处理该肿瘤细胞以产生处理过的肿瘤细胞；c)从所述处理过的肿瘤细胞制备肿瘤细胞碎片/提取物，和d)将所述碎片/提取物体内引入同一患者之后，预期产生针对原发肿瘤(以及残余的转移性疾病)的抗肿瘤效应。以这种方式，本发明的实施方式可以与常规手术操作联合。
[015]在又一实施方式中，治疗对象，以预防癌症。在优选的实施方式中，治疗处于患特定癌症的风险(无论是因为年龄、遗传易感性、辐射暴露、吸烟暴露、吸入颗粒物、诱变剂消耗、HIV感染等)的对象。在一个实施方式中，本发明考虑了一种方法，其包括：a)提供具有发展癌症风险的患者以及癌细胞系，b)用选自毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物的试剂离体处理来自所述癌细胞系的细胞，以便产生处理过的癌细胞；和c)将所述细胞体内引入所述患者，以产生抗癌预防效应。当然，引入活的癌细胞可能是无吸引力的(即使它们将死亡或被破坏)。因此，在一个实施方式中，本发明考虑了一种方法，其包括：a)提供处于发展癌症风险的患者以及癌细胞系，b)用选自毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物的试剂离体处理来自所述癌细胞系的细胞，以便产生处理过的癌细胞；c)从所述处理过的癌细胞制备细胞碎片/提取物，和d)将所述碎片/提取物体内引入所述患者，以产生抗癌预防效应。在该特定实施方式中，癌细胞可以来自已建立的细胞系，而碎片/提取物可以被视为疫苗。本发明不意图受限于单次治疗，即所述碎片/提取物(含或不含其它化合物或成分)可以被间隔施用(例如，每周一次、每月两次、每月一次、每六个月一次、每年一次、每五年一次、每十年一次等)。本发明不意图受限于特定的癌症类型。各种癌症类型被考虑在内，包括但不限于皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、子宫癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、骨癌细胞和淋巴瘤(参见表2，说明性细胞系列表)。在优选的实施方式中，处于癌症风险的对象在治疗时不患有癌症。
[016]上述的疫苗可以被大量生产，以治疗群体。例如，在一个实施方式中，在五十岁以上(或五十五岁以上)的未患病人群可以被给予疫苗作为预防剂，例如作为一次性疫苗或随时间推移间隔地重复进行(例如，每2-5年或5-10年)。实际上，所述群体可以用“混合”疫苗治疗，该“混合”疫苗包含至少两种不同的癌症类型的碎片/提取物(即，在使用包括毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物在内的刺激剂离体处理该癌症细胞以便产生处理过的癌症细胞之后)，以提供更宽范围的抗癌保护。对于该“混合物”的不同癌症类型可以基于在一定年纪之后的特定群体中增加的发病率进行选择(例如，在男性五十五岁之后结肠癌和前列腺癌增加；在女性五十五岁之后乳腺癌和子宫颈癌增加)。
[017]在另一实施方式中，刺激剂，包括毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物，被体内施用。在一个实施方式中，毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物与载体一起、在载体中或在载体上被施用。在优选的实施方式中，毒胡萝卜素被包封在输送载体中。本发明不意图受限于输送载体的类型。在一个实施方式中，输送载体包括疏水性载体，例如疏水性颗粒，包括但不限于疏水作用珠(这类珠被用作层析试剂)，可在毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物存在下输送强大的炎性信号。图2B示出了结果，其中用毒胡萝卜素处理过的丁基琼脂糖珠被用于从抗原呈递细胞产生IL-8释放。在另一实施方式中，本发明考虑脂质体，其也是疏水性的，作为输送载体(参见图2C)。
[018]预期包封的毒胡萝卜素(例如，脂质体包封的)可以被全身或局部施用于癌症患者，包括但不限于患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者。它们可以被静脉内、鞘内、腹膜内、经鼻、以及经口施用。它们还可以通过肺内给药(例如，经吸入或气管导管)被引入。它们还可以通过皮肤施用来治疗癌症，包括皮肤癌，例如黑素瘤。它们可被单独施用或与其它化合物联合施用。它们可在手术之前被施用来降低患者中的转移负荷；或者它们可以术后被施用。
[019]上述的先体外后体内方法在某些情况下相对于直接体内施用(例如静脉注射)可具有优势。在先体外后体内治疗的情况下：1)毒胡萝卜素接触合适的靶细胞，即癌细胞；2)在培养中的暴露允许在将碎片/提取物再引入患者之前除去该试剂，即，在体内，患者仅暴露于非常少量的毒胡萝卜素(导致最小的毒性)，和3)缺乏全身暴露于刺激性抗原降低了诱导毒胡萝卜素抗体的机会。
[020]在另一方面，预期可能存在其中可采用直接体内施用的情况，使得1)毒胡萝卜素接触合适的靶细胞，即癌细胞；2)在体内，患者仅暴露于非常少量的毒胡萝卜素(导致最小的毒性)，和3)诱导毒胡萝卜素抗体的机会小。例如，在肿瘤通过选自内窥镜检查、支气管镜检查、膀胱镜检查、结肠镜检查、腹腔镜检查和导管插入的操作可触及(接近)时，靶向癌细胞而不使患者暴露于大量毒胡萝卜素是可能的。而且，皮肤癌特别适合于毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物的直接体内施用(无论在脂质体制剂中还是在其它疏水性制剂中)。皮肤表面的皮肤癌可以与毒胡萝卜素原位接触。皮肤内部的或恰在皮肤之下的皮肤癌可以被皮下、皮内或经皮接触。在一个实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括a)提供患有皮肤癌的患者；和b)使所述皮肤癌与毒胡萝卜素接触。在一个实施方式中，毒胡萝卜素以乳剂或霜剂被局部施用。在一个实施方式中，毒胡萝卜素通过贴剂被应用于皮肤。
[021]就皮肤而言，在某些实施方式中，本发明考虑使健康黑素细胞(或树突细胞)暴露于毒胡萝卜素(例如，通过脂质体输送、皮肤贴剂等)，以便引发保护性抗癌免疫应答。尽管不限制于具体机理，在这样的方法中，据认为，引入健康黑素细胞附近的毒胡萝卜素可以激活免疫系统，以抑制远处部位的黑素瘤进展(或防止远处位置黑素瘤形成)。无论机理如何，实验上显示(下文)，用毒胡萝卜素治疗甚至当施用于远离癌症的部位时也可以是有益的。
[022]本发明还考虑了直接体内施用的其它方式，其中1)毒胡萝卜素接触合适的靶细胞，即癌细胞；2)在体内，患者仅暴露于非常少量的毒胡萝卜素(导致最小的毒性)，和3)诱导毒胡萝卜素抗体的机会小。例如，在一个实施方式中，本发明考虑了直接体内施用的靶向方法，其中1)毒胡萝卜素被偶联于靶向分子或部分，以便使之接触合适的靶细胞，即癌细胞；从而，2)在体内，患者仅暴露于非常少量的毒胡萝卜素(导致最小的毒性并降低诱导毒胡萝卜素抗体的机会)。本发明不意图受限于靶向分子或部分，或偶联物的性质。各种靶向分子和部分被考虑在内。在一个实施方式中，靶向分子是抗体或其片段(Fab、单链等)，而偶联物如通过引用由此并入的Rodwell等人的美国专利4,671,958以及通过引用由此并入的Goers等人的美国专利4,867,973所描述的进行制备。本发明不意图受限于抗体的性质。单克隆抗体可被使用。然而，人源化或完全的人抗体是优选的。
[023]本发明不意图受限于靶向细胞的靶标的性质(即所述抗体的抗原性质)。例如，抗体可以靶向人癌细胞上的受体(例如雌激素受体)或者人癌细胞表面上的癌基因产物。另一方面，本发明不限于抗体靶向。在一个实施方式中，毒胡萝卜素可以直接偶联于雌激素，从而被输送至人癌细胞上的雌激素受体(无需使用抗体)。可选地，毒胡萝卜素可被偶联于其它甾体类雄激素(顺式-雄甾酮、雌二醇、睾酮、19-睾酮和5-α-二氢睾酮)或它们相应的肽类似物。在其它实施方式中，毒胡萝卜素可被偶联至生长因子，例如表皮生长因子，以类似于通过引用由此并入的Myers等人的美国专利5,087,616所描述的方式进行。
[024]尽管不限制于任何机理，据认为，使细胞暴露于毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物导致癌症细胞是免疫刺激的。当施用于具有肿瘤的对象时，所述提取物优选诱导杀肿瘤反应，导致肿瘤消退。应当理解，如此处所使用，术语“杀肿瘤反应”是指肿瘤被杀死，并且不意味着受限于任何杀死肿瘤细胞的特定方法。例如，可以是肿瘤细胞被直接杀死(例如，细胞-细胞相互作用)或间接杀死(例如，细胞因子如干扰素的释放)。关于细胞因子，此处表明，上文所述的碎片/提取物诱导免疫细胞中细胞因子的分泌。
[025]在一个实施方式中，本发明考虑了用于筛选毒胡萝卜素样免疫效应的化合物的体外测定。例如，在一个实施方式中，本发明考虑了一种方法，其包括a)提供癌细胞和前单核细胞系，所述前单核细胞系用编码驱动标记蛋白表达的NF-κB启动子的DNA构建体进行转染；b)用选自毒胡萝卜素和毒胡萝卜素相关化合物的试剂体外处理所述癌细胞，以产生处理过的癌细胞；c)将所述处理过的癌细胞体外引入所述前单核细胞系；和e)测量所述标记蛋白的量。在另一个实施方式中，本发明考虑了一种方法，其包括a)提供癌细胞和前单核细胞系，所述前单核细胞系用编码驱动标记蛋白表达的NF-κB启动子的DNA构建体进行转染；b)用选自毒胡萝卜素和毒胡萝卜素相关化合物的试剂体外处理所述癌细胞，以产生处理过的癌细胞；c)从处理过的癌细胞制备细胞提取物；d)将所述提取物体外引入所述前单核细胞系；和e)测量所述标记蛋白的量。所述筛选测定不意图受限于仅使用前单核细胞系。单核细胞样细胞系，例如细胞系RAW，也可以被使用。而且，当使用前单核细胞系时，本发明不意图受限于特定的细胞系；各种前单核细胞系是已知的，包括ML1、HL60和U-937。优选的前单核细胞系是人前单核细胞系THP-1和MonoMac-6。
[026]在一个实施方式中，所述先体外后体内方法被进一步修改，使得患者不暴露于所述碎片/提取物。相反地，免疫细胞被离体暴露于或完整的癌细胞或碎片/提取物。例如，从患者取出患者淋巴细胞，并使之离体暴露于处理(即，用毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物处理)的肿瘤细胞或碎片/提取物，以产生经刺激的淋巴细胞；之后，所述经刺激的淋巴细胞被再导入患者，并具有抗癌治疗效果。本发明不意图受限于免疫细胞的来源或性质。优选地，它们是造血细胞，诸如淋巴细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)、巨噬细胞、树突细胞(以及类似细胞)或能够发育成免疫细胞的细胞。尽管它们可以分离自多种来源，例如骨髓(例如，通过抽吸分离自股骨)、脾脏或外周血(例如，用肝素收集并通过Ficoll/Hypaque梯度分离)以及来自肿瘤(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)。优选的是，它们获自淋巴结。尽管它们可获自正常的无疾病供体，但仍优选的是它们获自携带肿瘤的宿主。
[027]本发明不意图受限于癌症治疗的制剂和方法。在一个实施方式中，毒胡萝卜素和毒胡萝卜素样化合物被考虑作为可通常用于增强免疫应答并具体是细胞免疫应答的试剂。在一个实施方式中，毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物被用于增强对病原体的免疫应答。这类病原体包括但不限于细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、结核分枝杆菌(Mtuberculosis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、土拉热弗朗西丝菌(Ftularensis))、病毒(例如，甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、HIV)、原生动物(例如，隐孢子虫(Cryptosporidiu)、贾第虫属(Giardia)、原形体(Plasmodium)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi))、真菌(例如，念珠菌属(Candida)、肺囊虫(Pneumocystis)、藓(Tinea))和寄生虫(例如，绦虫等)。本发明不意图受限于对病原体增强的应答得以实现的方式。在一个实施方式中，病原体的标准制备物(无论热杀死、福尔马林处理或类似方式)与毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物一起施用(例如IP、IM、SC、ID等)。在另一个实施方式中，来自病原体(一种或多种)的纯化抗原(例如，重组表达的蛋白质)与毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物一起被用于疫苗中。在仍另一个实施方式中，编码病原体抗原(一种或多种)的核酸(一种或多种)(提供肽、多肽或蛋白质的连续或瞬时表达的表达构建体，或者提供核酸分子的连续或瞬时产生的构建体)与毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物一起施用(例如IP、IM、SC、ID等)。
[028]本发明考虑了其中增强的免疫应答可以是有用的其它情况。例如，在一个实施方式中，本发明考虑了毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物可用于抵抗内毒素耐受。内毒素耐受被认为是适应反应，以保护机体在细菌感染期间免受先天免疫系统的超活化。然而，尽管预防了败血症的初步发展，但内毒素耐受也可导致在败血症存活者中对后续感染的免疫应答严重钝化(Kox等.(2000)Intensive Care Med.26，124)。尽管尽了相当大的努力来寻找治疗患者的败血症性休克的疗法，但目前大多数临床试验得到了令人失望的结果(Kox等.(2000)Intensive Care Med.26，124)。它们中的大多数针对通过施用IL-1拮抗剂或者抗-TNF或抗-LPS抗体下调过度炎性状态。这些疗法失败的原因之一可能是在败血症开始和治疗开始之间的延迟，从而，在患者进入医院时，最初的过度炎性状态已经被次生低炎症反应所抵消。因此，新的疗法集中于通过用促炎分子治疗来恢复免疫应答(Docke等.(1997)Nature Med.3(6)678)。在一个实施方式中，本发明考虑了通过向败血症对象和/或处于败血症风险的对象(例如，动物咬伤患者、枪伤患者等)施用毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物(或者体内，或者离体处理细胞并再输注)来恢复应答。
[029]已经发现毒胡萝卜素和毒胡萝卜素样化合物可抑制抗体应答。因此，本发明考虑在抗体应答是不期望的或需要被抑制的情况下(在具有哮喘症状的对象中，或在患有系统性红斑狼疮或特征在于不期望的抗体产生的其它自身免疫性疾病的对象中)施用毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素样化合物。
[030]已经发现，毒胡萝卜素和毒胡萝卜素样化合物可被局部(外部，topically)应用，用于脱毛。当以uM级的量用在皮肤上时，毛发可以被除去，并且在两周或更长(甚至可达18周)的时间内几乎不再重新生长。尽管更高剂量(mM)也将导致脱毛，但相关炎症将被避免。因此，50uM或更低的剂量(0.4uM至40uM)是优选的。
定义
[031]如本文所使用，“对象”可以是人或动物。患者是进行医疗护理的人，无论是在医院中，作为门诊病人，在诊所中，或是在医师诊室中。“处于癌症风险的对象”和“处于癌症风险的患者”可以是由于各种原因(无论是因为年龄、遗传易感性、辐射暴露、吸烟暴露、吸入颗粒物、诱变剂消耗、HIV感染等)而处于风险之中。例如，人可以因为他/她属于具有癌症史的家族而处于风险之中。另一方面，一个人可以由于遗传筛选分析的结果而处于风险之中。对于后者，突变的检测是临床诊断中日益重要的领域，包括但不限于癌症的诊断和/或有癌症倾向(即，处于风险中)的个体的诊断。蛋白质截短试验(PTT)是用于检测导致产生截短的蛋白产物的无义突变和移码突变的技术。与癌症有关的基因诸如人mutL同系物和人nutS同系物(两者都涉及结肠癌)和BRAC1(涉及家族性乳腺癌)现在可以连同其它一起以这种方式筛选突变。发现具有这类截短突变(以及其它类型的突变)的那些人被认为处于癌症风险中。
[032]Thapsigargicin和毒胡萝卜素是天然化合物(紧密相关的愈创木内酯)，其可以被合成或(更常见地)从Thapsia garganica L的根提取。实际上，存在至少15种在毒胡萝卜中发现的紧密相关的愈创木内酯(见下文的表3)。这16种天然化合物属于通过在C-2位置存在氧取代基而区分开的两个系列的分子。在三叶拉色芹内酯系列的化合物中，该取代基不存在。毒胡萝卜素可从许多来源商业获得：MPBiomedicals(Irvine CA)、Sigma、Calbiochem和AIomone Labs。Thapsigargicin也是商业可得的(Calbiochem)。
表3
在毒胡萝卜中发现的毒胡萝卜素的已知范围
Figure A200780016283D00191
Figure A200780016283D00192
Ang：当归酰；Sen：千里光酰；iVal：异戊内酰。
毒胡萝卜素通常被称为倍半萜内酯(见下文结构1)或倍半萜内四酯。毒胡萝卜素衍生物已经通过各种策略进行制备。例如，在O-10处乙酰基的水解已被进行来得到脱乙酰基毒胡萝卜素(见下文结构2)。
Figure A200780016283D00201
IR1＝(CH2)6CH3，R2＝(CH2)2CH3，R3＝OCCH3
2R1＝(CH2)6CH3，R2＝(CH2)2CH3，R3＝H
3R1＝(CH2)4CH3，R2＝(CH2)2CH3，R3＝OCCH3
1SR1＝R2＝(CH2)6CH3，R3＝H
羟基之一的乙酰化和内酯羰基还原成亚甲基也已被进行。如本文所使用，“毒胡萝卜素相关化合物”包括毒胡萝卜素衍生物、类似物和具有相似活性的化合物。因此，天然类似物(见上文表2)以及合成类似物(见下文)意图在本发明的范围之内。实际上，倍半萜化合物通常意欲在本发明的范围之内，具体而言，愈创木内酯意欲在本发明的范围之内。毒胡萝卜素的许多类似物已经通过烷基化或酰基化内半缩醛中的O-11和O-12而合成，所述内半缩醛通过还原thapsigargicin获得。α-排列的取代基的引入降低了类似物的Ca(2+)-ATP酶抑制效能，而所述酶更耐受β-排列的取代基，这意味着当抑制剂结合至所述酶时，内酯环的α-面紧密接触结合位点。合成制备的一些类似物已经表现出具有有效的活性(例如下文的化合物77)。其它类似物包括L12ADT。
Figure A200780016283D00202
方案1类似物合成a，1：2，4，6-三氯苯甲酰氯，当归酸，Et3N，甲苯，75℃(85％)；2：乙酸异戊烯酯，聚合物支撑的TsOH，4-
Figure A200780016283D0020142325QIETU
筛，DCM，RT(95％)；3：MeOH，3M HCl；4：(S)-2-甲基丁酸酐，DCM，DMAP，RT(90％，两步)。b，1：Ac2O，DMAP，DCM(99％)；2：NaBH4，MeOH，RT；3：2，4，6-三氯苯甲酰氯，当归酸，Et3N，甲苯，75℃；4：MeOH，3M HCl 40℃；5：(S)-2-甲基丁酸酐，DCM，DMAP，RT(60％，四步)。
关于衍生物，本发明考虑了多种衍生物，包括但不限于8-O-去丁酰基毒胡萝卜素、8-O-(4-氨基肉桂酰基)-8-O-去丁酰基毒胡萝卜素(称为ACTA)。毒胡萝卜素C8-衍生物(ZTG)通过用4-叠氮基[羧基-14C]苯甲酸酰基化去丁酰基-毒胡萝卜素而合成。
[033]关于“具有相似活性的”化合物，毒胡萝卜素(TG)是来自肌质网和内质网的Ca(2+)-ATP酶的有效抑制剂。先前的酶研究已经得出这样的结论：Ca(2+)-ATP酶在以<1nM的亲和性结合TG后被锁定在死端复合物(dead-end complex)中，并且该复合物十分类似于E(2)酶促态。然而，具有相似活性的化合物不需要通过同一机理起作用。可能具有相似效应的药物包括(但不限于)：2，5-二-(叔丁基)-1，4-苯并氢醌、缩胆囊素八肽(CCK-8)、环并偶氮酸、钙离子载体(calciumionophore)A23187、3，3′-二吲哚基甲烷(DIM)、环取代的DIM和1，1-二(3′-吲哚基)-1-(对位取代的苯基)甲烷(C-DIMs)、N，N-二甲基-D-赤-鞘氨醇(DMS)、益康唑、肌醇1，4，5-三磷酸和多杀巴斯德菌毒素(PMT)。
[034]如本文所使用，“抗癌治疗效果”包括下列的一种或多种：癌细胞生长的抑制、增加的癌细胞死亡(杀肿瘤反应)、肿瘤侵袭力降低、总肿瘤负荷降低、局部肿瘤负荷降低、原发肿瘤的尺寸减小、转移的预防、转移灶数量降低、转移灶大小减小、疾病进展的抑制(无论临时性或永久性)以及延长的寿命。尽管期望该治疗使得对象摆脱疾病，但本发明不意图受限于治愈癌症。即使癌症仅仅被减缓，仍有治疗益处。本发明不意图受限于该效应的大小。例如，原发肿瘤(或转移灶)的尺寸减小可以小至10％的减小或者大至90％的减小(或更高)。本发明也不意图受限于抗癌治疗效应的持续时间。该治疗(采用本文描述的各种实施方式)可以仅导致癌细胞生长的临时抑制、临时增加的癌细胞死亡、肿瘤侵袭力的临时降低、总肿瘤负荷的临时降低、局部肿瘤负荷的临时降低、原发肿瘤尺寸的临时减小、转移的的临时预防、转移灶数量的临时降低或转移灶大小的临时减小。该临时效果可持续数周至数月，或数月至数年。这些参数是相对易于测量的(例如，原发肿瘤尺寸的减小)。关于转移预防和延长的寿命，这些参数可针对特定肿瘤类型、阶段等的患者群体数据进行测量。如本文所使用，“抗癌预防效果”或“保护效果”包括降低新癌症发病率这一效果。该参数可以在动物中得到证明，并基于群体在人类中加以测量。
[035]如本文所使用，“标记物”和“标记”是可检测的化合物或部分。它们可以是酶、荧光分子等等。示例性的酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、细菌荧光素酶、昆虫荧光素酶和海肾荧光素酶(Renilla koellikeri)，所有这些在合适的底物和分析条件下都可以产生可检测的信号。
[036]本发明考虑了各种类型的“脂质体”，包括但不限于阳离子脂质体。本发明不意图受限于这类脂质体的精确组成。在一个实施方式中，脂质体包含一种或多种糖脂类。在优选的实施方式中，脂质体包含一种或多种磷脂。
附图说明
[037]图1给出了示例性数据，该数据示出了各种化合物对子宫颈癌HelLa细胞的促炎活性的效应。X轴：对照(--)；毒胡萝卜素(TG)；紫杉醇，衣霉素(Tunic)，布雷菲德菌素(BrefA)，放线菌酮(CHX)，和布雷菲德菌素(A23187)。Y轴：TNF-α(pg/ml)。
[038]图2A给出了示例性数据，该数据示出了毒胡萝卜素处理的Hela细胞和thaspigargicin处理的HeLa细胞在刺激人IL-8从单核细胞系THP-1释放中的比较。X轴：毒胡萝卜素或thapsigargicin浓度(μM)；Y轴：白介素-8(IL-8)浓度(pg/ml)。图2B示出了结果，其中用毒胡萝卜素处理的丁基琼脂糖珠被用于从抗原呈递细胞产生IL-8释放。在另一个实施方式中，本发明考虑脂质体作为输送载体，其也是疏水性的(参见图2C)。
[039]图3给出了说明性列表，该列表示出了来自各种组织的癌细胞系的流行率，所述组织已知在暴露于毒胡萝卜素相关化合物后分泌细胞因子。
[040]图4给出了示例性数据，该数据表明，基于毒胡萝卜素的免疫降低了肿瘤生长，并提高了C57B1/6小鼠的存活率。图A：随时间推移的肿瘤生长。短线：盐水对照。空心圆：未处理的B16细胞提取物。实心圆：2.5μM B16+TG细胞提取物。图B：随时间推移的细胞存活率。短线：盐水对照。空心圆：未处理的B16细胞提取物。实心圆：2.5μM B16+TG细胞提取物。
[041]图5给出了示例性数据，该数据表明，基于毒胡萝卜素的免疫对于裸鼠(Nu/Nu)中的肿瘤生长无效果。图A(箭头表示注射部位)：小鼠1和小鼠2；B16-TG诱导的炎症。小鼠3和小鼠4；B16对照。图B：随时间推移的细胞存活率。空心圆：未处理的B16细胞提取物。实心圆：2.5μM B16+TG细胞提取物。
[042]图6给出了示例性数据，该数据表明，在B16+TG细胞提取物(500μgI.P(腹膜内))免疫C57B1/6小鼠后肿瘤生长下降。X轴：在第0天B16-F10黑素瘤细胞注射后的天数。Y轴：肿瘤面积(mm2)。空心圆：两次B16+TG细胞提取物注射(第0天和第116天)，和两次B16-F10细胞注射(第0天和第116天)。实心正方形：第0天注射B16-F10细胞的未治疗的对照。实心三角形：第116天注射B16-F10的未治疗的对照。
[043]图7给出了示例性数据，该数据表明，在B16+TG细胞提取物(500μg)/CD40L表达质粒免疫C57B1/6小鼠后肿瘤生长下降。X轴：在第0天B16-F10黑素瘤细胞注射后的天数。Y轴：肿瘤面积(mm2)。空心圆：两次B16+TG细胞提取物/CD40L表达质粒腹膜内注射(第0天和第116天)以及两次B16-F10黑素瘤细胞注射(第0天和第116天)。空心正方形：两次B16+TG细胞提取物/CD40L表达质粒皮内注射(第0天和第116天)以及两次B16-F10黑素瘤细胞注射(第0天和第116天)。空心菱形：两次B16+TG细胞提取物/CD40L表达质粒皮下注射(第0天和第116天)以及两次B16-F10黑素瘤细胞注射(第0天和第116天)。实心正方形：第0天注射B16-F10黑素瘤细胞的未治疗的对照。实心三角形：第116天注射B16-F10黑素瘤细胞的未治疗的对照。
[044]图8给出了示例性数据，该数据表明，TG-处理的HeLa细胞提取物诱导单核细胞分化。图A：具有圆形形态的未处理单核细胞。图B：具有细长和扁平形态(箭头)的处理过的单核细胞。
[045]图9给出了示例性数据，该数据示出了在第7、8、9、14、15、16、21、22和23天(箭头)施用TG的脂质体制剂之后C57B1/6小鼠存活率的剂量依赖性提高。空心圆：在第0天B16-F10细胞注射(皮下(S.C.))后未处理的对照。实心菱形：在第0天B16-F10细胞注射(皮下(S.C.))后注射0.003mol％ TG(皮内(I.D.))。实心正方形：在第0天B16-F10细胞注射(皮下(S.C.))后注射0.003mol％ TG(皮内(I.D.))。实心三角形：在第0天B16-F10细胞注射(皮下(S.C.))后注射0.03mol％ TG(皮内(I.D，))。
[046]图10的图A给出了示例性数据，该数据示出了50,000个THP-1Clone A9对各种TLR配体的应答，如通过荧光素酶报道系统所测定的。Y轴：由萤火虫荧光素酶蛋白的化学发光性质得到的相对光单位(RLU)。
[047]图10的图B给出了示例性数据，该数据示出了使用50,000个THP-1 Clone A9的毒胡萝卜素(TG)剂量应答曲线，如通过荧光素酶报道系统所测定的。Y轴：由萤火虫荧光素酶蛋白的化学发光性质得到的相对光单位(RLU)。空心柱：单独的TG。实心柱：30,000个TG处理的Hela细胞。Med＝培养基对照。
[048]图11给出了示例性数据，该数据示出了MonoMac-6 Clone 5对各种TLR配体的应答，如通过荧光素酶报道系统所测定的。Y轴：由萤火虫荧光素酶蛋白的化学发光性质得到的相对光单位(RLU)。TG(2.5μM)。培养基＝对照。
[049]图12示出了CD40L的核苷酸序列。
[050]图13示出了制备用于连接入pVAX1的XbaI限制性位点的CD40L cDNA。
[051]图14示出了商购获得的pVAX1表达质粒的图谱。
实验
[052]下文描述了本发明考虑的一些例子和实施方式，并且不意图是限制性的。
实施例I
基本实验步骤
[053]本实施例提供了在下文的实施例II-VII中使用的基本材料和方法。尽管这些具体实验利用了具体的化合物和技术，但其它类似的化合物和技术也能够产生类似的数据。
细胞系
[054]人子宫颈上皮细胞系HeLa和小鼠B16-F10黑素瘤从美国TCC购买，并维持在添加了10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的DMEM培养基(Dulbecco′s modified eagle′s media)[D-MEM(
Figure A200780016283D0025142535QIETU
，Herndon VA)]中。下文描述的所有细胞应激/死亡相关处理在初步筛选中都使用HeLa细胞进行。人前单核细胞白血病THP-1(ATCC，Manassas VA)和前巨噬细胞MonoMac6细胞在该研究中被用作报道抗原呈递细胞。Ziegler-Heitbrock et al.，＂Establishment of a human cell line(Mono Mac 6)with characteristics of mature monocytes＂Int.J.Cancer41：450-461(1988)。两种细胞系都维持在添加了10％胎牛血清的RPMI-1640培养基((
Figure A200780016283D0025142535QIETU
)中。除非另外说明，所有细胞都于37℃维持在补充5％CO2的潮湿培养箱中。
化合物
[055]下列名单包括在本研究中评价的小分子化合物：毒胡萝卜素、thapsigargicin(MP Biomedicals，Irvine CA)、1，2-二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸四(乙酰氧基甲基)酯[BAPTA-AM，(EMDBiosciences，San Diego，CA)]、乙二醇-双(β-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酰氧基甲基酯[EGTA-AM(EMD Biosciences)]、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、粉防己碱、KCl、淀粉状肽Aβ1-42、1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油(OAG)、卡西霉素A23187、二苯基硼酸2-氨基乙酯(2-APB)、组胺、环并偶氮酸、2，5-二-(叔丁基)-1，4-氢醌[BHQ(EMD Biosciences)]、GdCl3、盐酸尼卡地平、1-(邻-氯-α，α二苯基苄基)咪唑(克霉唑)、蜂神经毒肽、蜂毒明肽、根赤壳菌素、布雷菲德菌素A、衣霉素、它莫西芬、伊屋诺霉素、十字孢碱、顺式-二氨二氯合铂(II)(顺铂)、紫杉醇、甲氨喋呤、放线菌酮和雷帕霉素。除非另外说明，所有化合物均购自Sigma-Aldrich。基于公开的文献，在加入到HeLa细胞之前，按照生产商的建议，化合物以一定的浓度范围溶解，并被温育1分钟至两天。炎症的已知调节物pam3cys-ser-(lys)4盐酸(Pam3Cys)、细菌鞭毛蛋白以及脂多糖购自EMD Biosciences。
DNA构建体
[056]所评价的细胞死亡诱导转基因包括人胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3、人胰岛素生长因子-1受体胞内结构域(IGF-IR IC)和神经激肽-1受体(NK1R)，都被克隆入pcDNA3.1载体(Invitrogen)。小鼠CD40L(或CD154)表达质粒如下产生：使用NCBI公开的小鼠CD40L核苷酸序列(图12)产生CD40L互补DNA，以及重叠编码该序列的寡核苷酸，所述寡核苷酸侧翼具有Xbal限制性位点(图13)随后使用PfuDNA聚合酶(Stratagene，San Diego CA)进行聚合酶链反应。得到的DNA用Xbal(New England Biolabs，Ipswich MA)消化并连接入类似消化的pVAX1表达载体(Invitrogen，Carlsbad CA)(图14)。该pVAX-CD40L构建体用DNA测序进行验证。
转染
[057]所有转染均使用HeLa细胞和Lipofectamine 
Figure A200780016283D0026142651QIETU
转染试剂(Invitrogen)、按照生产商的建议进行。NK1R-转染的细胞与1μM P物质肽(Sigma-Aldrich)温育，以在转染后一天诱导死亡。
其它细胞应激/死亡通路
[058]在HeLa细胞温育之后，在无血清的DMEM中进行血清饥饿1至24小时的时间。通过在42-45℃下温育细胞1-6小时诱导热休克。
促炎细胞因子释放的定量
[059]在细胞应激/死亡之后，收集所得到的细胞/细胞碎片，用过量磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，迅速进行冻/融循环(-80℃至25℃)三次，并通过UV分光光度测定法(A280)定量。为确定应激/死亡细胞内促炎信号的存在，40μg应激/死亡细胞被加入到50,000个THP-1中，并温育18小时。使用商业可得的ELISA系统，评价上清中下列促炎细胞因子的存在，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素8(IL-8)和IL-12。
毒胡萝卜素-依赖性炎性活性的产生
[060]在加入毒胡萝卜素(2.5μM)之前，B16-F10细胞在150mm组织培养板中培养，直到约80％汇合。使细胞在收集之前培养48小时，在过量磷酸缓冲盐溶液中洗涤3次，进行冻/融循环，并如上所述进行定量。未处理的细胞被类似收集，并在进一步的体内应用之前使用上述的THP-1系统，体外评价两种提取物的炎性活性。
小鼠免疫和肿瘤攻击
[061]在开始之前，所有下列描述的小鼠研究均得到Buck InstituteInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批准。6-8周龄的雌性C57B1/6和nu/nu小鼠购自Charles River Laboratories(Wilmington MA)。通过各种免疫途径，包括皮下、腹膜内和皮内途径，以两周间隔，注射500μg B16-F10提取物(有或没有毒胡萝卜素处理)三次，进行免疫。在最后的加强免疫两周之后，通过在对侧部位皮下注射100,000个活B16-F10细胞，进行活肿瘤攻击。
实施例II
毒胡萝卜素-敏感的内源性危险信号的识别
[062]筛选各种不同潜在的细胞应激和细胞死亡诱导剂。植物衍生的毒胡萝卜素毒素诱导患者来源的子宫颈癌细胞系(HeLa)中的TNF-α分泌，从而被鉴定用于上文所述的各种抗癌实施方式。相反，其它潜在的细胞应激子(即，例如，紫杉醇、衣霉素、布雷菲德菌素A、放线菌酮和卡西霉素)被检测，但不诱导免疫刺激活性(见图1)。
[062A]毒胡萝卜素也能够在读出系统中，利用单核细胞系，激活抗原呈递细胞(APC)，以分泌大量的炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(数据未示出)。
实施例III
毒胡萝卜素诱导的细胞因子分泌
[063]本实施例举例说明了癌细胞的毒胡萝卜素处理使得这些细胞对于抗原呈递细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等)是免疫刺激性的，所述抗原呈递细胞被激活，从而释放细胞因子。尽管不必理解本发明的机理，但认为IL-12在细胞介导的免疫应答(该免疫应答类型对于癌症控制和细胞内病原体感染可能是必需的)的发展中起作用。
[064]毒胡萝卜素相关化合物thapsigargicin(毒胡萝卜素的疏水性较低的类似物)和毒胡萝卜素激活IL-8从单核细胞系THP-1的剂量依赖性分泌(参见图2A)。在一些实施方式中，本发明考虑了毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物的直接施用。在其它实施方式中，毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物通过载体例如珠(见图2B，其中用毒胡萝卜素处理的丁基琼脂糖珠被使用)和脂质体(见图2C，其中包封在阳离子脂质体中的毒胡萝卜素被使用)进行施用。这些数据表明，毒胡萝卜素相关化合物能够激活有效的炎性反应。毒胡萝卜素处理还导致在各种患者来源的癌细胞系中IL-12、IL-8和TNF-α的分泌。(参见图3)。
实施例IV
用毒胡萝卜素处理的B16提取物进行体内免疫
[065]本实施例证明了用毒胡萝卜素处理的细胞进行免疫提供了针对癌症进展的保护作用。
[066]免疫原性低的小鼠黑素瘤细胞系B16用毒胡萝卜素体外处理，使之具有促炎性(即，能够根据实施例1II分泌细胞因子)。随后，小鼠用毒胡萝卜素处理的B16细胞免疫(在它们被洗涤、定量并通过冻融而裂解以产生细胞碎片溶液之后)(B16+TG；500μg)和未处理的B16细胞(B16)或盐水缓冲液作为对照进行免疫，三次，每两周一次。在最后免疫之后两周，小鼠被植入活B16癌细胞，并监测肿瘤进展。
[067]B 16+TG在C57B1/6小鼠中于免疫部位诱导出暂时炎性反应。该反应在盐水溶液或B16组中未看到。在用B16+TG免疫之后而不是在B16或盐水注射之后，C57B1/6小鼠表现出显著延迟的肿瘤进展以及提高的寿命。(分别见图4A和4B)。该数据表明，平均而言，在肿瘤移植后，治疗的动物活的时间几乎是两倍长。
[068]使用裸鼠(Nu/Nu)的类似实验证明，B16+TG(同样，在它们被洗涤、定量并通过冻融而裂解以产生细胞碎片溶液之后)在提高存活方面是无效的。裸鼠的毒胡萝卜素处理的细胞免疫展现出显著的原位炎症，但这对于控制肿瘤进展是无效的。(分别参见图5A和图5B)。尽管对于本发明的实施并非必需的，但这些数据与裸鼠具有干扰正常胸腺发育的遗传突变从而抑制功能性T淋巴细胞产生的这一假设一致。
[069]尽管不必理解本发明的机理，但认为T淋巴细胞，尤其是CD8+细胞毒性亚型，在瘤组织和细胞内病原体感染的组织的破坏中起作用。合起来看，这些数据表明，毒胡萝卜素处理的细胞激活发炎，这反过来以类似于佐剂的方式导致保护性T细胞应答的产生。
实施例V
B16+TG注射诱导的免疫保护记忆
[070]本实施例提供了一个实施方式，其中用B16+TG(即，TG处理的B16细胞，其之后被洗涤、定量并通过冻融而裂解以产生细胞碎片溶液)免疫提供了针对注射的黑素瘤的长期保护。
[071]C57B1/6小鼠用B 16+TG、根据实施例VI进行免疫，并随后用活B16-F10黑素瘤细胞进行攻击。在第0天和第116天，B16+TG免疫的小鼠不发展出黑素瘤。(见图6)。未接受B16+TG提取物的对照小鼠表现出典型的肿瘤进展速率。
[072]可选地，小鼠CD40L表达质粒用B16+TG提取物进行共免疫。当使用皮内注射进行免疫时，在第0天发现完全肿瘤。当使用皮下或腹膜内注射进行免疫时，在第0天发现部分肿瘤抑制。当在第116天再攻击第0天给予皮内注射的动物时，仅发现部分肿瘤抑制。(参见图7)。
[073]这些数据表明，用TG处理的B16提取物免疫的小鼠可以发展出针对B16黑素瘤的长期免疫性。在本实验中，该免疫性的程度似乎有点取决于施用途径。例如，腹膜内或皮下进行的免疫在第0天或第116天进行B16黑素瘤细胞注射之后不完全抑制肿瘤生长。(参见图7)。然而，条件未被优化。
[074]总之，这些数据表明，B16+TG可以在首次免疫和攻击之后的至少三个月的期限(即，116天)内针对活的癌细胞再攻击提供保护。这些数据还表明，B16+TG提取物可诱导抗原呈递细胞合成促炎细胞因子诸如TNF-α，所述促炎细胞因子可能激活通过B和/或T细胞的瞬时肿瘤特异性适应性免疫应答，从而体内延迟肿瘤生长。
实施例VI
通过B16-TG提取物诱导的单核细胞分化
[075]本实施例给出了关于毒胡萝卜素处理的细胞是否能够驱动单核细胞分化成其它抗原呈递细胞亚型的示例性数据。以前的研究已经证明，某些试剂作用于抗原呈递细胞，导致分化为成熟树突细胞。Hertz等，＂Microbial lipopeptides stimulate dendritic cell maturation viaToll-like receptor 2＂J.Immunol.166：2444-2450(2001)。尽管不必理解本发明的机理，但认为树突细胞是负责确定对于机体内任何给出的抗原是否激活适应性免疫应答或免疫耐受的主要细胞类型。
[076]未分化的、圆的单核细胞(参见图8A)用或不用毒胡萝卜素处理的HeLa细胞提取物处理24小时。然后，评价细胞形态的变化(即，例如，诱导的细胞伸长和/或变平)。结果表明，毒胡萝卜素处理的细胞诱导单核细胞形状从主要是圆形变为扁平和细长形。(参见图8B，黑箭头所示)。该形状变化被认为指示了未分化单核细胞到粘附细胞的成熟过程，其中，未分化单核细胞通常形态上是圆的，粘附细胞具有巨噬细胞或不成熟树突细胞典型的长的细胞突起。
实施例VII
TG脂质体制剂诱导的肿瘤缩小
[077]本实施例给出了数据，其表明含毒胡萝卜素的脂质体以剂量依赖的方式降低肿瘤进展。
[078]总脂质含量50mM、含渐增量的毒胡萝卜素(0.0003、0.003、和0.03mol％)的阳离子脂质体通过脂膜方法随后进行几个挤出循环进行配制。Kuntsfeld等，Journal of Investigative Dermatology，120：476-482(2003)。使用在氯仿中的各种浓度的毒胡萝卜素、足量的1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)以达到总共50mol％，以及50mol％的1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)，配制脂质体。在旋转蒸发仪中蒸发后产生脂膜，并在5％蔗糖缓冲液中再水合过夜。使用200nM挤出膜挤出脂质体，并于4℃储存在氩气下，直到使用。在第0天，四组两只雌性C57B1/6小鼠同时在左胁皮下移植1×105个活B16-F10黑素瘤细胞。接受脂质体包封的毒胡萝卜素的小鼠在肿瘤植入后第7、8、9、14、15、16、21、22和23天在从尾巴根部到右胁的范围内的远端部位皮内注射50μl每一含毒胡萝卜素脂质体制剂，并监测肿瘤进展。
[079]然后，在第0天，四组两只雌性C57B1/6小鼠同时在左胁皮下移植1×105个活B16-F10黑素瘤细胞。接受脂质体包封的毒胡萝卜素的小鼠在第7、8、9、14、15、16、21、22和23天在从尾巴根部到右胁的范围内的远端部位皮内注射50μl各自的含毒胡萝卜素脂质体制剂，并监测肿瘤进展。数据表明，脂质体包封的毒胡萝卜素能够以剂量依赖的方式减少肿瘤进展。(见图9)。
实施例VIII
毒素诱导的NF-κB启动子系统
[080]本实施例给出了毒素敏感的高通量报道分子(即，标记物或标记)系统的一个实施方式。
[081]编码驱动萤火虫荧光素酶表达的NF-κB启动子的稳定转染DNA构建体被整合入：i)人前单核细胞系THP-1；和ii)人前单核细胞系MonoMac-6。简言之，编码萤火虫荧光素酶基因上游的连环化NF-κB应答元件的DNA[Ting等，＂RIP mediates tumor necrosis factorreceptor 1 activation of NF-kappaB but not Fas/APO-1-initiatedapoptosis＂EMBO J.Nov 15；15(22)：6189-96(1996)]通过标准分子生物学技术被亚克隆入pEAK8载体骨架(Edge Biosystems，Gaithersburg MD)。采用Biorad Gene Pulser II电穿孔仪(Biorad，Hercules CA)、0.4cm电穿孔小槽以及200V、950μF，使用10μg DNA和700,000个THP-1或MonoMac6细胞，进行电穿孔。在电穿孔之后，在用300ng/ml嘌呤霉素氨基核苷(Sigma-Aldrich)选择之前，使细胞恢复两天，用于产生稳定转染的克隆。使用Top Count NXT发光计(Perkin Elmer，Wellesley MA)定量荧光素酶表达。简言之，在收集和分析之前，50,000个报道细胞与所示浓度的所列炎症介质在96孔白色板中温育18小时。
THP-1克隆A9
[082]TLR配体Pam-3-Cys(通过TLR2发信号)和细菌鞭毛蛋白(通过TLR5发信号)而不是细菌脂多糖(通过TLR4发信号)的THP-1衍生克隆A9的识别通过在TG温育期间在96孔白色板自动分析中监测NF-κB活性来加以测定。(参见图10A)
[083]在存在或不存在预先铺板的HeLa细胞下，还使用不同浓度的毒胡萝卜素。这些结果证明，比起单独的未处理HeLa细胞或毒胡萝卜素，Clone A9以协同地更高的水平识别毒胡萝卜素处理的HeLa细胞。(参见图10B)。
[084]合起来，这些数据支持Clone A9在鉴别通过TLR2调节炎症的新化合物和/或因子中的应用。
MonoMac-6克隆C5
[085]使用MonoMac-6细胞，产生第二种稳定的NF-κB报道构建体转染子。与克隆A9相比，MonoMac-6衍生的克隆C5表现出对细菌脂多糖的增强识别。克隆C5还识别Pam3Cys、鞭毛蛋白和毒胡萝卜素处理的HeLa细胞。(见图11)。
实施例IX
毒胡萝卜素诱导的脱毛
[086]本实施例给出了一个实施方式，其中毒胡萝卜素(TG)以局部(外部)溶液应用于诱导脱毛。制备含有不同浓度(对照为0，而测试样品为40uM、1.2mM和40mM)的TG的涂擦(rub-on)溶液(75％乙醇、22％环己烷和3％二甲亚砜)。各种溶液被局部应用于不同的小鼠。在高浓度下，可以迅速看到原位诱导的炎症(数据未示出)。在第3天，最高浓度下的炎症诱导出如此之多的炎症，以致该浓度明显不合适。在较低的浓度下，在涂擦部位处诱导出暂时的脱毛症/脱毛(数据未示出)。脱毛持续数周甚至数月，其中在4.5个月(18周)时仍可见脱毛。在一些动物中，一旦在TG处理的动物中(一种处理)完全无毛，则处理的区域在18周时开始重新长出一些毛发。因此，该低TG剂量(uM)可以被利用(例如，以洗剂的形式)来诱导脱毛或用于其它脱毛产品，用于化妆品和其它医疗应用。

Claims (24)

1.一种方法，包括：a)提供具有肿瘤细胞的患者，b)从所述患者取出至少一部分的所述肿瘤细胞，以产生取出的细胞，c)离体使至少一部分的所述取出的细胞暴露于选自毒胡萝卜素和/或毒胡萝卜素相关化合物的试剂，以产生处理过的肿瘤细胞；d)裂解所述处理过的肿瘤细胞，以产生细胞碎片，和e)将所述碎片体内引入所述患者，以产生抗癌治疗效果。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(c)进一步包括从所述处理过的肿瘤细胞制备肿瘤细胞提取物，并且步骤(d)包括将所述提取物体内引入同一患者，以产生抗癌治疗效果。
3.权利要求2所述的方法，其中所述提取物不含细胞。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述处理的时间为1分钟至30分钟之间。
5.权利要求1所述的方法，进一步包括将CD40L表达构建体引入所述患者。
6.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞选自前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、子宫癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞和骨癌细胞。
7.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是皮肤癌细胞。
8.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。
9.权利要求1所述的方法，其中所述抗癌治疗效果包括肿瘤尺寸的减小。
10.权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含毒胡萝卜素。
11.权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含thapsigargicin。
12.一种方法，其包括：a)提供处于发展癌症风险的患者以及癌细胞系，b)用选自毒胡萝卜素和毒胡萝卜素相关化合物的试剂离体处理来自所述癌细胞系的细胞，以便产生处理过的癌细胞；c)裂解所述处理过的癌细胞，以产生细胞碎片，和d)将所述碎片体内引入所述患者，以产生抗癌预防效应。
13.权利要求12所述的方法，其中步骤(c)进一步包括从所述处理过的肿瘤细胞制备肿瘤细胞提取物，和步骤(d)包括将所述提取物体内引入同一患者，以产生抗癌治疗效果。
14.权利要求13所述的方法，其中所述提取物不含细胞。
15.权利要求12所述的方法，其中步骤(b)的所述处理的时间为1分钟至30分钟之间。
16.权利要求12所述的方法，其中所述癌细胞系选自前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、子宫癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞和骨癌细胞。
17.权利要求12所述的方法，其中所述癌细胞系包括皮肤癌细胞。
18.权利要求12所述的方法，其中所述癌细胞系包括淋巴瘤细胞。
19.权利要求12所述的方法，其中所述试剂包含毒胡萝卜素。
20.权利要求12所述的方法，其中所述试剂包含thapsigargicin。
21.一种方法，其包括a)提供癌细胞和前单核细胞系，所述前单核细胞系用编码驱动标记蛋白表达的NF-κB启动子的DNA构建体进行转染；b)用选自毒胡萝卜素和毒胡萝卜素相关化合物的试剂体外处理所述癌细胞，以产生处理过的癌细胞；c)从所述处理过的癌细胞制备细胞碎片；d)将所述碎片体外引入所述前单核细胞系；和e)测量所表达的所述标记蛋白的量。
22.权利要求21所述的方法，其中所述标记包括萤火虫荧光素酶。
23.权利要求21所述的方法，其中所述前单核细胞系选自ML1、HL60和U-937。
24.权利要求21所述的方法，其中所述前单核细胞系选自人前单核细胞系THP-1和人前单核细胞系THP-1MonoMac-6。
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