CZ300806B6 - Imunostimulacní úcinky trilobolidu a zpusob jeho prípravy - Google Patents

Abstract

Rešení se týká trilobolidu pro použití ke stimulaci imunitního systému, zejména ke stimulaci sekrece interferonu gamma, a využití tohoto úcinku v terapii. Dále se týká zpusobu prípravy trilobolidu z rostlin timoje trojlalocného (Laser trilobum (L.) Borkh.), hladýše andelikového (Laserpitium archangelica Wulf. in Jacq.) nebo hladýšovce horského (Laserpitium siler L.).

Description

Imunostimulační účinky trilobolidu a způsob jeho přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká imunostimulačních účinků trilobolidu, přípravku obsahujícího trilobolid a způsobu přípravy trilobolidu.

io Dosavadní stav techniky

Seskviterpenoidní laktony jsou skupinou přírodních nízkomolekulámích látek, vyskytujících se v rostlinách a vykazujících široké spektrum účinků. Mezi seskviterpenoidní laktony patří trilobolid (vzorec I).

Trilobolid lze získat z kořene rostliny timoje trojlaločného (Laser trilobum (L.) Borkh.) (Smítalová, Z.; Buděšínský, M.; Šaman, D.; Holub, M. Coli Czech Chem Commun 1986, 51, 1323—

1339) nebo dvou druhů hladýše (Laserpitium archangelica Wulf. in Jacq. a Laserpitium siler L.), ve kterých je tato látka obsažena ve značném množství, a lze jí poměrně snadno, v dobrém výtěžku a ve vysoké čistotě, získat extrakcí a chromatografickou separací. Sběr rostlinného materiálu je, vzhledem k tomu, že se jedná o sběr kořenů rostlin, náročný a pro vytrvalou rostlinu i destruktivní, navíc nutně omezený jen do nechráněných oblastí jejího výskytu. Pro některé látky příbuzné trilobolidu (např. thapsigargin) byla navržena totální syntéza (Ley, S. V.; Antonello, A.; Balskus, E. P.; Booth, D. T.; Christensen, S. B.; Cleator, E.; Gold, H.; Hogenauer, K.; Hiinger, U.; Myers, R. M.; Oliver, S. F.; Simic, O.; Smith, M. D.; Sohoel, H.; Woolford, J. A. PNAS 2004, 101, 12073-12078; Balí, M.; Andrews, S. P.; Wierschem, F.; Cleator, E.; Smith, M. D.; Ley, S. V. Org Lett 2007,9,663-666). Provedení těchto totálních syntéz je velmi náročné, proto30 že obsahují desítky reakčních stupňů a dosahují celkových výtěžků nižších než 1 %.

V eukaryotní buňce mají významnou úlohu ionty vápníku, protože ovlivňují radu fyziologických a patofyziologických mechanismů. Endoplazmatické retikulum (ER) je buněčná organela, která má klíčovou úlohu v udržení homeostáze vápníku v buňce. Hladina volných iontů vápníku je ve „zdravé“ buňce udržována na velmi nízké úrovni, řádově 10“⁷ mol/I. Gradient koncentrace Ca²⁺je v ER o 3 až 4 řády vyšší než v cytosolu. Po signálu, např. hormonem, je vápník z organely uvolňován do cytosolu. Transport vápníku zpátky do ER je zajišťován ATPasou sarko/endoplazmatického retikula (SERCA). Existují čtyři izoformy tohoto enzymu, SERCA 1, SERCA 2a a 2b, SERCA 3. SERCA 3 je přítomna v imunokompetentních buňkách, zejména makrofázích. Při transportu Ca²⁺ jsou předávány dva ionty Ca²⁺ z cytosolu buňky přes membránu ER do lumen ER. Tento proces vyžaduje energii (ATP) a dochází při něm ke konformační změně (Berridge,

M. J. Cell Calcium 2002, 32, 235-249; Wu, K. D.; Lee, W. S.; Wey, J.; Bungard, D.; Lytton, J. Am J Physiol 1995, 269, C775-C784).

Je-li C.a-pumpa (SERCA) zablokována, zvyšuje se hladina intracelulámího vápníku vyprázd5 něním zásob Ca²⁺ v ER. Současně dochází i k dalšímu přesunu Ca² z extracelulámího prostoru do cytosolu buňky. Výsledkem je dlouhodobé zvýšení hladiny intracelulámího vápníku. Dysbalance intraluminálního vápníku v ER vede zároveň k tzv. stresu ER. Tyto jevy modulují buněčnou signalizaci a genovou expresi (Bcrridge. M. J. Cell Calcium 2002, 32, 235-249; Wu, K. D.; Lee, W. S.).

io

Existují standardní inhibitory SERCA: thapsigargin (TG), cyklopiazonová kyselina (CPA), 2,5di-(t-butyl)-l,4-benzohydrochinon (DBHQ). Mechanismus účinku inhibitoru spočívá v konformační změně enzymu a tedy snížení afinity SERCA jak pro Ca²⁺ tak pro ATP (Sagara, Y.; Wade, J, B,; Inesi, G. J Biol Chem 1992, 267, 1286-1992). Inhibitor TG je selektivní pro ís všechny 4 isozymy SERCA (Šuplat, D.; Targos, B.; Sabala, P.; Baranska, J.; Pomorski, P. Biochem Biophys Res Commun 2004, 323, 870-875) a nemá afinitu k ATPasam jiného typu (Seidler, N. W.; Joana, I.; Vegh, M.; Martonosi, A. J Biol Chem 1989, 264, 17816-17823). Inhibice isozymů SERCA je řádově 10’⁷ mol/1. CPA je mykotoxin produkovaný kmeny Penicillium cyclopium a Aspergillus flavus. Jeho účinnost je podobná jako u TG (Šuplat, D.; Targos, B.;

Sabala, P.; Baranska, J.; Pomorski, P. Bíochem Biophys Res Commun 2004, 323, 870-875; Seidler, N. W.; Joana, I.; Vegh, M.; Martonosi, A. J Biol Chem 1989, 264, 17816-17823). DBHQ je méně účinný inhibitor (EC₅₀ je 580 x 10’⁷ mol/1 oproti EC₅₀ je 35 x 10 ⁷ mol/I pro TG v membránách krevních destiček). Působí jen u izoformy SERCA 3 (Authi, K. S.; Bokkala, S.; Patel, Y.; Kakkar, V. V.; Munkonge, F. Bíochem J 1993, 294, 119-126; Authi, K. S,; Bokkala,

S.; Patel, Y.; Kakkar, V. V.; Munkonge, F. Biochem J 1993, 294, 119-126). Inhibitory SERCA se používají experimentálně k zvýšení hladiny intracelulámího vápníku.

Změny koncentrace vápníku (Ca²⁺) v cytoplasmě ovlivňují v podstatě všechny buněčné funkce. Děje se tak prostřednictvím Ca²‘-regulačních proteinů, specifických kináz a fosfatas. Tyto enzy30 my modulují rychlé procesy, jako jsou svalová kontrakce a sekrece nebo pomalejší procesy, jako jsou buněčný růst a diferenciace (Groenendyk, J.; Lynch, J.; Michalek, M. Mol Cells 2004, 17, 383-389).

Z literatury vyplývá, že terapeutický potenciál SERCA inhibitorů se prezentuje především v oblastech infekčních a nádorových onemocnění. Experimentálně byla prokázána inhibice replikace virů ve vztahu k změně homeostáze Ca² a stresu ER (např. rotavirus, hepatitis C virus, herpes simplex virus, cytomegalovirus aj.) (Michelangeli, F.; Liprandi, F.; Chemello, Μ. E.; Ciarlet, M.; Ruiz, M.-C. J Virol 1995, 69, 3838-3847; Cheshenko, N.; Del Rosario, B.; Woda, C.; Marcellino, D.; Satlin, L. M.; Herold, B. C. J Cell Biol 2003, 163, 283-293; Isler, J. A.; Maguire, T. G.;

Alwine, J. C. J Virol 2005, 79, 15388-15397; Nakagawa, M.; Sakamoto, N.; Tanabe, Y.; Koyama, T.; Itsui, Y.; Takeda, Y.; Chen, C. H.; Kakinuma, S.; Oooka, S.; Maekawa, S.; Enomoto, N.; Watanabe, M. Gastroenterology 2005, 129, 1031-1041). Mykobakteriální infekce jsou standardně léčeny clotrimazolem (Ahmad, Z.; Sharma, S.; Khuller, G. K. FEMS Microbiol Lett 2005, 251, 19-22). Tato látka imidazolového typu a její další deriváty se rovněž řadí mezi

SERCA inhibitory (Snajdrova, L.; Xu, A.; Narayanan, N. J Biol Chem 1998, 273,28032-28039).

Protinádorové účinky SERCA inhibitorů (TG a clotrimazolu) byly experimentálně dokumentovány (Khalid, Μ. H.; Tokunaga, Y.; Caputy, A. J.; Walters, E. J Neurosurg 2005, 103, 79-86; Meira, D. D.; Marinho-Carvalho, Μ. M.; Teixeira, C. A.; Veiga, V. F.; Da Poian, A. T.; Holan50 dino, C.; de Freitas, M. S.; Sola-Penna, M. Mol Genet Metab 2005, 84, 354-362). Zvýšení intracelulámího Ca² do mikromolámích koncentrací vyvolává apoptózu buněk. Tohoto efektu je využito pro léčbu nádoru prostaty nezávislého na androgenu. Je vyvíjeno proléčivo, směrované pouze k nádorovým buňkám (Denmeade, S. R.; Jakobsen, C. M.; Janssen, S.; Khan, S. R.; Garrett, E. S.; Lilja, H.; Christensen, S. B.; Isaacs, J. T. J Nat Cancer Inst 2003, 95, 990-1000;

Janssen, S.; Rosen, D. M.; Ricklis, R. M.; Dionne, C. A.; Lilja, H.; Christensen, S. B.; Isaacs, J.

T.; Denmeade, S. R. Prostatě 2006, 66, 358-368). Údajů o účincích SERCA inhibitorů na imunitní systém je málo. Imunomodulační účinky látek se prezentují jako schopnost produkovat cytokjny a chemokiny. Imunostímulační účinek TG byl dokumentován v myších makrofázích a lidských epiteliálních buňkách, které produkovaly cytokiny IL-6 a IL-8, resp. (Bost, K. L.;

Mason, M. J. J Immunol 1995, 155, 285-296; Yu, Y.; De Waele, C.; Chadee, K. Inflamm Res 2001, 50, 220-226). Všechny tři inhibitory SERCA (TG, CPA a DBHQ) aktivují produkci IL-4 (Onose, J.-i; Teshima, R.; Sawada, J-i. Immunol Lett 1998,64, 17-22). Sekrece prozánětlivých cytokinů TNF-α a IL— I β není jednoznačná a závisí na typu buněk. Je prokázáno, že sekrece IL-8 aktivovaná TG je závislá na Ca²⁺, Všechny tři inhibitory rovněž stimulují produkci chemotakticío kého proteinu MCP-1 (Steube, K. G.; Meyer, C.; Drexier, H. G. Mol Cell Biol Res Commun 2000, 3, 60- 65). Dosud však nebyla připravena žádná imunomodulační léčiva založená na inhibitorech SERCA.

V současné době je známo, že trilobolid je účinným inhibitorem Ca -ATPasy s afinitou v nano15 molámí koncentraci (Wictome, M.; Holub, M.; East, J. M.; Lee, A. G. Biochem Biophys Res Commun 1994, 199,916-921). Trilobolid inhibuje SERCA jak v živočišných buňkách, tak buňkách vyšších rostlin (Thomson, L. J.; Halí, J. L.; Williams, L. E. Plant Physiol 1994, 104, 12951300). Až doposud nebylo navrženo žádné terapeutické využití tohoto laktonu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je trilobolid pro použití ke stimulaci imunitního systému.

Význakem vynálezu je, že stimulací imunitního systému je stimulace sekrece interferonu gamma (IFN-γ).

Dalším význakem vynálezu je trilobolid pro použití pro léčbu stavů vybraných ze skupiny zahrnující choroby způsobené viry, bakteriemi, prvoky, červy nebo houbami, atopické alergie, stavy snížené aktivity imunitního systému, zejména při léčbě glukokortikoidy, způsobené stresovými situacemi, kolorektálním karcinomem a akutní pankreatitidou.

Imunokompetentní buňky jsou v přítomnosti trilobolidu stimulovány k produkci IFN-γ. Tento účinek je způsoben jejich schopností proniknout do buňky, selektivně se navázat na ATPasu sarko/endoplazmatického retikula (SERCA) a ireverzibilně ji inhibovat. Koncentrace trilobolidu vyvolávající produkci IFN-γ aplikovaného ke kultivovaným buňkám je v řádech nmol/1 - pmol/l. Stanovení koncentrace IFN-γ v kultivačním médiu nebo v biologických tekutinách lze provádět nejlépe přímo, např. pomocí metody ELISA nebo nepřimo na základě biosyntézy oxidu dusnatého (NO). Efekt trilobolidu je pozorovatelný u různých zvířecích druhů (např. myš, lab. potkan, člověk).

IFN-γ je cytokin, který je produkovaný imunokompetentními buňkami jako jsou lymfocyty skupin: CD8+ T buňky, Thl CD4+ T buňky, NK, NK T buňky a makrofágy. Existuje více mechanismů jeho přímých proti virových a dalších antimikrobiálních účinků. Patří mezi ně především stimulace proteinů z rodiny 2',5'-oligoadenylát syntetáz (OAS), stimulace proteinové kinázy R (PKR) (Esteban, M.; Patino, C. J Interferon Cytokine Res 2000, 20, 867-877), deaminázy adenosinu (Boehm, Lf.; Klamp, T.; Groot, M.; Howard, J. C. Annu Rev Immunol 1997, 15, 749-795), indolamin 2,3-dioxygenasy (Bodaghi, B.; Goureau, O.; Zipeto, D.; Laurent, L.; Virelizier, J.-L.; Michelson, S. J Immunol 1999, 162, 957-964), a v neposlední řadě také inducibilní syntasy oxidu dusnatého (iNOS) (Karupiah, G.; Xie, Q.-w.; Buller, R. M. L.; Nathan, C.; Duarte, C.; MacMicking, J, D. Science 1993,261,1445-1448).

IFN-γ je typickým představitelem tzv. Thl imunitní odpovědi a v procesu aktivity imunitního systému zastává klíčové místo. Při nedostatečné Thl odpovědi se zvyšuje citlivost organizmu k rozvoji infekčních, ale i nádorových onemocnění. Pro velký počet infekčních onemocnění (např.

_ 7 .

AIDS, tuberkulóza, leishmanióza, lepróza, atd.) je naopak charakteristický tzv. Th2 imunitní profil, ve kterém má rozhodující význam interleukin-4 (IL—4). Th2 imunitní fenotyp je z hlediska obranyschopnosti proti mnohým infekčním onemocněním nežádoucí. Z hlediska léčby je naopak žádoucí Thl imunitní odpověď zvýšit (Xing, Z.; Wang, J. Curr Pharmaceut Design 2000, 6, 599s 611). Proto je IFN-γ považován za vážného kandidáta pro léčbu různých typů onemocnění a patologických stavů, zvláště takových, kdy je potřeba poměr Thl/Th2 imunitní odpovědi zvrátit ve prospěch odpovědi Thl, jmenovitě vzhledem k produkci IFN-γ.

Způsob využití trilobolidu vychází ze známých a výše zmíněných mechanismů účinku IFN-γ. io Především jde o virová onemocnění ze skupin DNA virů, RNA virů i retro virů, např.: herpes simplex typ 1 a 2 (HSV-1, -2) (Gosselin, J.; Tomolu, A.; Gallo, R. C.; Flamand, L. Blood 1999,

94, 4210—4219; Melkova, Z.; Esteban, M. J immunol 1995, 155, 5711-5718), cytomegalovirus (CMV) (Bodaghi, B.; Goureau, O.; Zipeto, D.; Laurent, L.; Virelizíer, J-L.; Michelson, S. J Immunol 1999, 162, 957-964; Lučin, P.; Jonjic, S.; Messerle, M.; Polic, B.; Hengel, H.;

Koszinowski, U. H. J Gen Virol 1994, 75, 101-110), virus Epstein-Barrové (EBV) (Kawanishi, M. Intervirology 1995, 38, 206-213), polio virus (Komatsu, T.; BÍ, Z.; Reiss, C. S. J Neuroimmunol 1996, 68, 101-108), virus vakcinie (VV) (Tanaka-Kataoka, M.; Kunikata, T.; Takayama, S.; Iwaki, K.; Ohashi, K.; Ikeda, M.; Kurimoto, M. Cytokine 1999, 11, 593-599), virus vesikulámi stomatitidy (Komatsu, T.; Bi, Z.; Reiss, C. S, J Neuroimmunol 1996, 68, 101—

1 08; Lohoff, M.; Marsig, E.; Róllinghoff, M. J Immunol 1990, 144, 960-963), hepatitis B virus (HBV) (Guidottí, L. G.; McClary, H.; Loudis, J. M.; Chisari, F. V. J Exp Med 2000, 191, 12471252), hepatitis C virus (Sharara, A. I.; Perkins, D. J,; Misukonis, M. A.; Chán, S. U.; Dominitz, J. A.; Weinberg, J. B. J Exp Med 1997, 186, 1495-1502), coxackíe virus B4 (Flodstróm, M.; Horwitz, M. S.; Maday, A.; Balakrishna, D.; Rodriguez, E.; Sarvetnick, N. Virology 2001, 281,

205-215) a dalších.

Inhibiční účinky IFN-γ na růst byly zjištěny i u nevirových patogenních organismů (Murray, H. W. Am J Med 1994, 97, 459-467): protozoa - Toxoplasma gondii, Leishmania donovani, L. major, L. mexicana, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, Ρ. νϊναχ, P. berghei, P.

chabaudi, P. cynomolgi, Cryptosporidium parvum. Entamoeba histolytica, Giardia lamblia', červi - Schistosoma mansoni; houby: Histoplasma capsiůatum, Candida albicans,, C. parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immits, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Aspergillus fumigatus; bakterie: Listena monocytogenes, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. intracellulare, Salmonella typhimurium, Francisella tularensis, Bručela abortus, Nocardia asteroids, Chlamydia psittaci, C. trachomatis, Klebsiella pneumoniae, Rickettsia prowazekii, R. conorii, R. tsutsugamushi, Yersinia enterocolitica, Rhodococcus equi, Ehrlichia risticii, Staphylococcus aureus.

Při imunosupresivních stavech se z klinického hlediska považuje za účelné provádět cílenou sti40 mulaci Thl imunitní odpovědi. Zvýšení hladiny IFN^y je vhodné např. v oblasti léčby alergických onemocnění (např. atopická dermatitida), při akutní pankreatitidě, kolorektálním karcinomu nebo při déletrvaj ící léčbě glukokortikoidy.

Dosavadní poznatky o příznivém terapeutickém působení IFN-γ vycházejí z experimentálních, ale i mnohých klinických testů, kdy byl podán jako léčivo samotný IFN-γ, tedy nikoliv látka (léčivo), která by endogenní syntézu IFN-γ v organizmu aktivovala. Limitujícími faktory farmakoterapie interferonem-γ jsou zejména: složitý výrobní proces, způsob podání pacientům a vysoká tržní cena. Dávky doporučované pro terapeutický antimikrobiální efekt jsou udávané v rozmezí 25-100 gg/m², přičemž u aktivních infekcí je doporučováno 5-7 injekcí týdně (Murray, H. W.

Am J Med 1994, 97, 459-467), Oproti podání exogenního rekombinantního IFN-γ, jehož biologický poločas je 4-8 hod. (Grassegger, A.; Hopfl, R. Clin Exp Dermatol 2004, 29, 584-588), je výhodnou farmakologickou alternativou endogenní produkce IFN-γ. Stimulátorů endogenní produkce IFN-γ však existuje velmi omezený počet a v klinické praxi pouze jeden, který současně indukuje další cytokiny (Gupta, A. K.; Cherman, A. M.; Tyring, S. K. J Cutan Med Surg 2004, 8,

3 3 8-3 52), Jde o 5 % krém Aldara (Laboratories 3M Santé). Účinnou látkou je imiquimod. Tento léčivý přípravek je v České republice (a podobné v jiných státech) schválen pouze pro topickou léčbu zevních genitálních a perianálních kondylomat a malých povrchových bazocelulámích karcinomů dospělých. Zatím je však s tímto přípravkem málo klinických zkušeností. Jsou zaznamenány časté reakce na lokální aplikaci (asi 33 % pacientů) a chybí údaje o vymizení nálezu více než 24 měsíců po ukončení léčby. Výhodou předkládaného vynálezu je, že byla nalezena látka, která má v imunokompetentních buňkách schopnost velmi účinně stimulovat produkci cytokinů, zejména IFN-γ.

Význakem vynálezu je dále stimulace imunitního systému podáváním trilobolidu. Trílobolid stimuluje sekreci IFN-γ.

Význakem vynálezu dále je způsob léčby stavů vybraných ze skupiny zahrnující choroby způsobené viry, bakteriemi, prvoky, červy nebo houbami, atopické alergie, stavy snížené aktivity imunitního systému, zejména při léčbě glukokortikoidy, stresových situacích, kolorektálním karcií s nomu a akutní pankreatitidě, podáváním tri lobo I idu.

Význakem předkládaného vynálezu je dále trílobolid pro použití pro stimulaci imunitního systému v kombinaci s antivirotiky, antibiotiky a antimykotiky. U některých závažných virových onemocnění je současná léčba antivirotiky málo účinná. Autority v oboru proto doporučují, aby budoucí léčba byla prováděna pomocí kombinace virostatik a imunostimulátorů, jmenovitě 1FNγ, např. u hepatitidy C (Bedossa, P.; Paradis, V. Clin Liver Dis 2003, 7, 195-210). Při rozvoji systémových mykóz (např. Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus) u imunosuprimovaných pacientů, kteří neodpovídali na léčbu běžnými antimykotiky, pomohl IFN-γ velmi rychle k úplnému vyléčení během 4-6 týdnů (Summers, S. A.; Dorling, A.; Boyle, J. J.; Shaunak, S. Am

J Tmasplant 2005, 5, 2067-2069). Kombinace s IFN^y pomáhá snížit rezistenci ke klasickým antivirotikům u hepatitidy B (Parvez, Μ. K.; Sehgal, D.; Sarin, S. K.; Basir, S. F.; Jameei, S. Worid J Gastroenterol 2006, 12, 3006-3014). Obdobná situace ohledně rezistence na standardní léčívaje u dalších infekčních onemocnění (např. život ohrožující chronické granulomatózní onemocnění (Marciano, Β. E.; Wesley, R.; De Carlo, E. S.; Anderson, V, L.; Bamhart, L. A.;

Damell, D.; Málech, H. L.; Gallin, J. I.; Holland, S. M. Clin Infect Dis 2004,39, 692-699), TBC (Suárez-Méndez, R.; García-García, I.; Femández-Olivera, N.; Valdés-Quintana, M.; MilanésVirelles, Μ. T.; Carbonell, D.; Machado-Molina, D.; Valenzuela-Silva, C. M.; López-Saura, P. A. BMC Infect Dis 2004, 4, 44). IFN-γ se může uplatnit nejen ve fázi klinických příznaků jako účinná adjuvantní terapie u pacientů s rezistencí na standardní chemoterapii, ale i profylakticky.

(J protozoáíního onemocnění (prvok rodu Leishmania) je klinicky přínosná i monoterapie interťeronem-γ (Sundar, S.; Murray, H. W. J Infect Dis 1995, 172, 1627-1629). Kombinace protiinfekčních léčiv s IFN-γ je přínosná i z hlediska zkrácení celkové doby léčby, jak to bylo prokázáno např. při léčbě hepatitidy B (kombinace antivirotika lamívudinu + IFN-γ) (Parvez, Μ. K.; Sehgal, D.; Sarin, S. K.; Basir, S. F.; Jameei, S. Worid J Gastroenterol 2006,12,3006-3014).

Předmětem předkládaného vynálezu je také terapeutický přípravek pro stimulaci imunitního systému, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje jako účinnou látku trílobolid a případně farmaceuticky přijatelné pomocné látky.

Po vyhodnocení dostupnosti zdrojů a praktické i ekonomické náročnosti jednotlivých způsobů přípravy čistých látek nebo analyticky přesně charakterizovaných preparátů obsahujících trilobolid byl zvolen postup přípravy vycházející z dobře přístupného rostlinného zdroje, schopného pěstování v polních podmínkách.

Bylo nově zjištěno, že rostlina Laser trilobum obsahuje trílobolid i v dalších orgánech než v kořenech, z nichž byl trílobolid již drive izolován, a to především v semenech, což bude využito pro pěstování této rostliny ve vhodných polních podmínkách a pro sběr semen, respektive celých okolíků k extrakci účinných látek. Výhodou využití semen k izolací trilobolidu a jeho derivátů je to, že rostlina není pri sběru rostlinného materiálu zničena, jak je tomu v případě použití kořenů.

CZ 300806 Bó

Předmětem vynálezu je také způsob přípravy trilobolidu, jehož podstata spočívá v tom, že rozdrcená nebo rozemletá čerstvá nebo sušená semena, případně celé semenné okolíky rostliny vybrané ze skupiny zahrnující timoj trojlaločný (Laser trilobum (L.) Borkh.), hladýš andělikový (Laserpitium archangelica Wulf. in Jacq.) nebo hladýšovec horský Laserpitium siler L., syn.

Siler montanum Crantz) se postupně extrahují organickými rozpouštědly, stanoví se extrakt, který obsahuje tri lobolid, rozpouštědlo z tohoto extraktu se pak odpaří a odparek se chromatograficky rozdělí gradientovým vymýváním rozpouštědly od nejméně polárních s postupným přidáváním polárnějších rozpouštědel, přičemž se obsah jednotlivých látek v takto získaných frakcích po odpaření rozpouštědla sleduje, například chromatografií na tenké vrstvě silikagelu (obvykle stej10 nými kombinacemi rozpouštědel), frakce obsahující trilobolid se pak spojí a trilobolid se z nich oddělí.

Význakem vynálezu je, že pokud je rostlinný materiál, tj. semena nebo semenné okolíky, čerstvý, extrahuje se vodou v kombinaci s polárními organickými rozpouštědly například methanolem nebo ethanolem, a pak se po odpaření Části organického rozpouštědla z vodního podílu extrahuje požadovaná frakce octanem ethylnatým.

Pokud je rostlinný materiál suchý, extrahuje se organickými rozpouštědly postupně pořadí stoupající polarity, například petroléterem, octanem ethylnatým, chloroformem, ethanolem. Zvlášt20 ním postupem je extrakce superkritickým oxidem uhličitým, v případě potřeby pak s přidáním malého podílu polárního unášeče, například ethanolu.

Význakem vynálezu dále je, že extrakt obsahující trilobolid se stanoví chromatograficky, například metodou tenkovrstvé chromatografie nebo metodou vysokoúčinné kapalinové chromatogra25 fie (HPLC), například s ultrafialovou nebo hmotově spektometrickou detekcí.

Ve výhodném provedení vynálezu je chromatografickým nosičem pro dělení odparku extraktu obsahujícího trilobolid silikagel. S výhodou je pak silikagel v koloně deaktivovaný zakotvenou vodou, nejlépe v rozsahu 10 - 15 % hmoty vody k silikagelu.

Význakem vynálezu je, že chromatografická frakce děleného odparku extraktu, obsahující trilobolid, se stanoví buď chromatograficky použitím standardu (pokud je k dispozici) nebo vyhodnocením infračervených spekter či spekter získaných z tandemového spojení chromatografie s vysokým rozlišením s hmotnostním detektorem (HPLC-MS). Z dobře ošetřené chromatografické frakce (pro typický HPLC záznam viz Obr. 2) lze pak první podíl trilobolidu získat např. krystalizací.

Význakem vynálezu dále je, že trilobolid se z původní surové frakce základního chromatografického dělení na koloně silikagelu oddělí další chromatografií (např. preparativní HPLC) nebo krystalizací.

Z matečných louhů, přečištěných na krátkém sloupci silikagelu, lze pak získat ještě další podíly trilobolidu. Konečné množství trilobolidu a jednotlivých jeho minoritních derivátů lze ze zbylých matečných louhů nakonec získat preparativní HPLC. Pro praktické použití je ekonomicky výhodný postup spočívající v krystalizací. Opakovanou krystalizací lze dosáhnout až 98% čistoty (stanovené analytickou HPLC).

Podstatou vynálezu je využití imunostimulačních vlastností trilobolidu. Konkrétně jde o farmakologický účinek, tj. schopnost aktivovat produkci IFN-γ. Součástí vynálezu je i způsob přípravy trilobolidu z rostlinného zdroje s úmyslem snadné a finančně dostupné přípravy pro farmaceutické nebo nutraceutické technologie.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. představuje strukturní chemický vzorec trilobolidu.

Obr. 2. znázorňuje záznam UV absorpcí HPLC spektra látek ve frakci obsahující maximum trilobolidu (viz Příklad 1), Analytické podmínky chromatografie na koloně 4 x 250 mm, naplněné obrácenou fází (Separon SGX C-18) a promývané kombinací rozpouštědel (50-100% vody v methanolu) v gradientovém režimu po dobu 60 min, při průtoku 0,6 ml/min, je R] trilobolidu 35,21 min.

Obr. 3. ukazuje vliv trilobolidu na aktivaci buněk (peritoneální makrofágy, laboratorní potkan) ío imunitního systému v podmínkách in vitro.

Obr. 4. ukazuje vliv trilobolidu na aktivaci buněk (peritoneální makrofágy, myš) imunitního systému v podmínkách in vitro.

Obr. 5. ukazuje vliv trilobolidu na aktivaci buněk (peritoneální makrofágy, laboratorní potkan) imunitního systému.

Obr, 6. znázorňuje rychlost aktivace buněk imunitního systému z hlediska sekrece interferonugamma (IFN-γ) po přidání trilobolidu.

Obr. 7. ukazuje vliv trilobolidu na aktivaci buněk (peritoneální makrofágy, myš) imunitního systému v podmínkách in vitro.

Obr. 8. ukazuje vliv trilobolidu na aktivaci mononukleámích buněk z lidské periferní krve (PBMC) v podmínkách in vitro.

Vynález je dále objasněn na následujících příkladech, aniž je jimi jakkoliv omezen.

Příklady provedení vynálezu Metody

Body tání byly stanovovány na Kofflerově bloku firmy Boetius bez provedených korekcí. Optic30 ká rotace byla měřena polarimetrem Rudolph Research Analytical Autopol IV. Infračervená spektra byla zaznamenána zařízením Broker IPS-88. NMR spektra byla měřena spektrometrem Varian Unity-500 (*H při 500 MHz, ¹³C pří 125,7 MHz). Chemické posuny protonových spekter byly vztaženy na TMS (v CDCh) a uhlíkových spekter na signál rozpouštědla 8(CDCI₃) 77,0 ppm. Homonukleámí 2D-COSY a 2D-ROESY spektra byla použita pro strukturní určení proto35 nových signálů a heteronukleámí 2D-HMQC nebo 2D-HMBC spektra v kombinaci s ^l3C APT spektry byla použita pro přiřazení všech uhlíkových signálů. Hmotová spektra byla zaznamenána přístrojem Waters Q-tof Microspectrometer vybaveném ionizačním zdrojem El nebo ESI (v kombinaci s HPLC). Spektra HPLC byla zaznamenána na zařízení sestaveném z prvků firem Waters, Spectra-Physics a LDC s použitím kolon uvedených v analytických podmínkách zázna40 mu znázorněného na Obr. 2.

Příklad 1

Příprava trilobolidu

Rostlinný materiál, v tomto případě kořeny a oddenky, jsou volně na vzduchu a ve stínu usušeny, rozemlety a pak extrahovány organickými rozpouštědly, Vhodným typem extrakce je perkolace v kameninové nebo skleněné nádobě rozpouštědly o postupně se zvyšující polaritě (bez plynulého so gradientu). Dostatečným je postup, kdy po extrakci jedním rozpouštědlem následuje extrakce dalším polárnějším, vždy v několika opakováních, až do vyčerpání extrahovaných látek, tj. do nulového odparku (obvykle 3 až 5 opakování). Perkolace bez míchání materiálu (jen několikahodinovým stáním rozpouštědla překrývajícího celou náplň) se provádí za laboratorní teploty. Z .7 .

takto získaného extraktu je pak odstraněno rozpouštědlo odpařením za sníženého tlaku (ve vakuové odparce). Odparek extraktu je pak dále dělen chromatografií na koloně naplněné silikagelem do několika chromatografických frakcí obsahujících jednotlivé látky nebo skupiny látek o stejné polaritě.

V tomto případě byl materiál (1300 g) napřed extrahován petroléterem (o b.v. 50 - 80 °C) pětkrát po sobě, a pak ještě třikrát chloroformem. Získaný odparek petroléterového extraktu (50 g) byl po předchozím oddělení krystalického laserolidu (ze zahuštěného extraktu) chromatograficky dělen na sloupci silikagelu (deaktivovaného zakotvením 12 % vody) promýváním směsí petroléteru s io octanem ethylnatým (v postupném gradientu Pe - AcOEt = 1:0 až 1:1). Touto chromatografií bylo získáno dvacet frakcí (spojených podle obsahu stejných látek monitorovaných tenko vrstvou chromatografií) a pak z frakcí obsahujících trilobolid byl izolován trilobolid napřed krystalizací (0,8 g) v čistotě 98 % a z matečných louhů (1,5 g) pak následnou chromatografií ještě další podíl (0,6 g).

Chloroformový podíl (20 g) obsahuje podle HPLC analýzy (provedené na koloně s obrácenou fází Separon SGX C—18) ještě 43 % trilobolidu. Ten byl taktéž frakcionován napřed sloupcovou chromatografií (jako nahoře), a pak dočištěn preparativní HPLC chromatografií na stejné obrácené fázi v koloně 26 x 600 mm, v gradientovém režimu s kombinací rozpouštědel (55-100 % vody v methanolu) po dobu 360 min, při průtoku 5 ml/min. V dalších přísunech byla perkolace petroléterem redukovaná (jen do dvojího opakování) pro odstranění méně polárních látek (včetně řady seskviterpenových laktonů), čímž se trilobolid stal pak hlavní složkou chloroformového extraktu, ze kterého byl výhodně získán krystalizací.

Příklad 2

Příprava trilobolidu

Další vylepšený postup se vyhýbá použití rozpouštědel s nezanedbatelnou toxickou a velkou ekologickou zátěží (chloroformu), a též destrukci rostliny tím, že se namísto kořenů a oddenků zpracovávají její semena.

Vysušená a rozdrcená semena (60 g) byla extrahována ve stejném zařízení jak uvedeno v Příkladu 1, Krátkodobá perkolace (1 hod) petroléterem byla provedena jen pro odstranění nízkopolámích alifatických (voskových a olejovitých) látek a nepolárních částí chlorofylu. Pak následovala pětinásobná perkolace octanem ethylnatým (AcOEt) až do úplného vyčerpání extrahovaných látek. Po odpaření rozpouštědla ve vakuové odparce byl získán AcOEt extrakt (3,8 g), který podle HPLC analýzy (v podmínkách popsaných v Příkladu 1) obsahoval 10 hlavních látek, mezi nimi v pořadí pátý i trilobolid (0,95 g). Ten byl pak z extraktu izolován stejnou chromatografickou frakcionací a dočištěním HPLC preparací jak je uvedeno v příkladu 1.

Příklad 3

Příprava trilobolidu

Tento postup již maximálně redukuje použití organických rozpouštědel a využívá výhod extrakce superkritickým oxidem uhličitým v kapalném stavu, které se provádí ve specializovaném komerčním zařízení pro extrakce superktitickými kapalinami (supercritical fluid extractions: SFE).

Vysušená a nájemný prášek rozdrcená semena (4 g) byla vložena do extraktem mezi vrstvy skleněných kuliček sloužících pro rozptýlení toku extrakční kapaliny do celého objemu náplně.

Extraktor byl opatřen teplotně řízenou vodní lázní. Dávkování superkritického CO₂ a pak přidavCZ 300806 B6 ného ethanolu bylo prováděno vysokotlakými čerpadly. Tlak kapaliny odcházející z extrakční kolony byl redukčním ventilem snížen na atmosférický, a jednotlivé extrakční frakce byly sbírány do skleněných záchytných nádob. Extrakce byla provedena za mírného zvýšení teploty extrakce (40 °C) v oblasti nižších tlaků (200 bar) a s postupným přidáváním ethanolu jako modi5 fikátoru polarity extrakční kapaliny. Čistým CO₂ byla napřed odstraněna převážná většina nízko polárních balastních látek. Trilobolid byl získán v dalších frakcích, nejvíce při přidání 10 % ethanolu k CO2. Frakce obsahující trilobolid byly soustředěny a tento souhrnný extrakt byl pak chromatografií na krátkém sloupci zbaven polárních balastů. Z takto přečištěného podílu extraktu byl získán čistý trilobolid krystalizací.

Strukturní a chemická identita trilobolodu je charakterizovaná těmito fyzikálně chemickými a spektroskopickými údaji: Bod tání 190 až 192 °C; optická rotace [α]β^2ΰ - 66.3° (c 0,74 v methanolu). Charakteristické pásy infračerveného spektra 3455, 3480 cm^-1 (hydroxyly), 1785 cm^-1 (γlakton), 1725, 1250 cm^-1 (acetát) 1712 (ester konjugovaný s dvojnou vazbou), 1652 cm'¹ (dvojná vazba). Charakteristická data hmotnostního spektra ESI-MS: 545 (522+23; M+Na) a fragmentace zEI-MS: m/z 462 (522-60; M-HOAc), m/z 362 (522-60-100; M-HOAc-Cj-nenasycená kyselina), m/z 360 (522-60-102; M-HOAc-Cs-nasycená kyselina), m/z 260 (522-60-100-102; M-všechny tři estery). Úplná strukturní informace vyplývající z protonových a uhlíkových spekter jaderné magnetické rezonance (*H a ¹³C NMR) je shrnuta v Tabulce 1).

Tabulka 1: Charakteristická H¹ a ¹³C NMR data trilobolidu v CDCI3

		« zCM>
		A z0-00
		Ti M z*'— -A Λπ HaC co——01111M0..Z3	A ' ý...... 7/	I
		TS	/Xh. 12
Charakteristická NMR data trilobolidu
	5 (ppm)	”c	δ (ppm)
1	4.44 m	1	50.53
2a	1.63 ddd (J= 14.6,5.8,4.8)	2	32.01
2b	2.53 dt(J = 14.6, 8.6,8.6)	3	79.62
3	5.58 m	4	131.44
6	5.68 m	5	143.26
8	5.65 t (J = 3.8,3.8)	6	77.53
9a	2.09 dd (J = 14.8,3.8)	7	78.63

-9CZ 300806 B6

9b	3.20 bdd (J= 14.8,3.8)	8	66.48
13	1.48 s	9	38.48
14	1.31 bs	10	85.90
15	1.90 m	11	78.68
3-0 Ang:	6.12 qq (J = 7.2(3x), 1.5(3x))	12	175.66
	2.02 dq (J = 7.2,1.5(3x))	13	16.26
	1.915 p(J= 1.5(4x))	14	22.33
7-OH	3.68 bs	15	13.08
8-OMeBut;	2.34 m	3-0 Ang:	167.11
	1.69 m + 1.44 m		127.73
	0.901 ((J = 7.4)		138.52
	1.14 d(J = 7.2)		15.86
10-OAc:	1,97 s		20.70
11-OH	2.79 s	8-ÓMeBut:	175,52
			41.40
			26.12
			11.63
			16.26
		10-OAc:	171.06
			22.46

Příklad 4

Vliv trilobolidu na aktivaci buněk imunitního systému v podmínkách in vitro - produkce NO

Produkce oxidu dusnatého (NO) byla měřena u peritoneálních makrofágů, získaných z potkanů ínbredního kmene Lewis. Buňky byly získány výplachem peritoneální dutiny fyziologickým io roztokem (16 ml). Buňky byly v množství 2 χ 10⁶ ml kultivovány na 96-jamkových mikrodestičkách v kompletním RPMI -1640 kultivačním médiu (10% fetální sérový albumin, 2 mmol/1 Lglutamin, 50 pg/ml gentamicin, 50 pmol/l 2-merkaptoethanol), finální objem 100 pl/jamka, při °C, 5% CO₂, 100% vlhkost, po dobu 24 hodin, a to v nepřítomnosti (tj. kontroly), a nebo v přítomnosti vzrůstajících koncentrací trilobolidu. K významnému zvýšení biosyntézy NO, stano15 vené na základě vzniklé koncentrace dusitanů (měřeno spektrofotometricky pomocí Griesseova činidla při 540 nm) v kultivačním médiu, dochází ve srovnání s kontrolními buňkami v koncentracích 0,1-1,0 pmol/l trilobolidu.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 3.

Příklad 5

Vliv trilobolidu na aktivaci buněk imunitního systému v podmínkách in vitro - produkce NO

Byla měřena produkce oxidu dusnatého (NO) u peritoneálních makrofágů, získaných z myší Ínbredního kmene C57BL/6. Buňky byly získány výplachem peritoneální dutiny fyziologickým roztokem (8 ml). Buňky byly v množství 2 x 10⁶/ml kultivovány způsobem uvedeným v Příkladu 4 po dobu 24 hodin, a to v nepřítomnosti (tj. kontroly) nebo v přítomnosti vzrůstajících koncentrací trilobolidu. Trilobolid byl podán bud’ samotný nebo současně s další imunostimulační látkou, tj. bakteriálním lipopolysacharidem (LPS, 100 pg/ml). U myších buněk dochází k malému zvýšení produkce NO po trilobolidu samotném. Jeho biosyntéza je však podstatně zvýšena v kombinaci s LPS, a to v koncentracích 1-5 pmol/l trilobolidu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4.

Příklad 6

Vliv trilobolidu na aktivaci buněk imunitního systému in vitro - sekrece IFN-γ

Tento experiment demonstruje sekreci zástupce tzv. Thl cytokinů, interferonu-gamma (IFN-γ) u peritoneálních makrofágů, získaných z potkanů inbredního kmene Lewis. Buňky byly v množství 2 x 10 ml kultivovány způsobem uvedeným v Příkladu 4 po dobu 24 hodin, a to v nepřítomnosti (tj. kontroly) a nebo v přítomnosti vzrůstajících koncentrací trilobolidu. Koncentrace cytokinů byla měřena v kultivačním médiu imunochemickou metodou ELISA dle instrukcí komerčně dosio tupného ELISA kitu pro IFN-γ, měřeno při 450 nm. K významnému zvýšení produkce IFN-γ dochází ve srovnání s kontrolními hodnotami již v koncentrací 0,05 pmol/l trilobolidu a se vzrůstající koncentrací trilobolidu produkce IFN-γ dále velmi výrazně vzrůstá. Výsledky jsou uvedeny na obr. 5.

Příklad 7

Rychlost aktivace buněk imunitního systému

Byl sledován Časový průběh aktivace peritoneálních buněk z hlediska sekrece interferonugamma (IFN-γ) po přidání trilobolidu, a to v koncentraci 0,1 pmol/l. Pokus byl proveden in vitro s použitím peritoneálních makrofágů (2x10 ml), získaných z potkanů a kultivovaných obdobně jako v Příkladu 4. Zatímco kontrolní buňky neprodukují téměř žádný IFN-γ, v intervalu 2-5 hodin dochází k výrazné sekreci tohoto cytokinů do kultivačního média. Výsledky jsou uvedeny na obr. 6.

Příklad 8

Vliv trilobolidu na aktivaci buněk imunitního systému v podmínkách in vitro

Na základě výsledku uvedeném v Příkladu 7 byla měřena sekrece interferonu-gamma (IFN-γ), zástupce skupiny tzv. Thl cytokinů, u peritoneálních makrofágů, získaných z myší inbredního kmene C57BL/6. Buňky byly v množství 2 x 10 ml kultivovány po dobu 5 hodin, kultivační podmínky uvedené v příkladu 4 a 5, a to v nepřítomnosti (tj. kontroly) a nebo v přítomnosti 1 pmol/l trilobolidu. Trilobolid byl testován buď samotný nebo současně s dalším referenčním imunostimulátorem, tj. bakteriálním lipopoly sacharidem (LPS, 100 pg/ml). Samotný trilobolid je schopný aktivovat produkci IFN-γ, efekt je vysoce signifikantní. Tento účinek je ještě výraznější v kombinaci s LPS. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 7.

Příklad 9

Vliv trilobolidu na aktivaci mononukleárních buněk z lidské periferní krve v podmínkách in vitro

Účinek trilobolidu na aktivaci imunitního systému u člověka je demonstrován kultivací lidských mononukleárních buněk (PBMC). Buňky byly v množství 2,5 x 10 ml kultivovány po dobu 24 hodin v přítomnosti 1 pmol/l trilobolidu za obdobných podmínek uvedených v příkladu 4. Sekrece interferonu-gamma (IFN-γ), zástupce skupiny tzv. Thl cytokinů, je nulová u kontrolních, tj.

nestimulovaných buněk, zatímco v přítomnosti trilobolidu stoupá více než 300x. Výsledky jsou uvedeny na obr. 8.

.11.

Průmyslová využitelnost:

Trilobolid a jeho účinky podle vynálezu lze využít ve farmaceutickém průmyslu jako léčiva nebo jako nutraceutika v humánní a veterinární praxi.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Trilobolid pro použití ke stimulaci imunitního systému.
2. 2. Trilobolid pro použití podle nároku 1, kde stimulací imunitního systému je stimulace sekre15 ce interferonu gamma (IFN-γ).
3. 3. Trilobolid pro použití podle nároku 2 pro léčbu stavů vybraných ze skupiny zahrnující choroby způsobené viry, bakteriemi, prvoky, červy nebo houbami, atopické alergie, stavy snížené aktivity imunitního systému, zejména při léčbě glukokortikoidy, stresových situacích, kolorektál20 ním karcinomu a akutní pankreatitidě.
4. 4. Trilobolid pro použití podle nároku 2 nebo 3 v kombinaci s antivirotiky, antibiotiky a antimykotiky.

   25 5. Terapeutický přípravek pro stimulaci imunitního systému, vyznačený tím,že obsahuje jako účinnou látku trilobolid a případně farmaceuticky přijatelné pomocné látky.

   6. Způsob přípravy trilobolidu, vyznačený tím, že rozdrcená nebo rozemletá čerstvá nebo sušená semena, případně celé semenné okolíky rostliny vybrané ze skupiny zahrnující timoj

   30 trojlaločný (Laser trílobum (L.) Borkh.), hladýš andělikový (Laserpitium archangelica Wulf. in Jacq.) nebo hladýšovec horský (Laserpitium siler L., syn. Siler montanum Crantz) se postupně extrahují organickými rozpouštědly, stanoví se extrakt, který obsahuje trilobolid, rozpouštědlo z tohoto extraktu se pak odpaří a odparek se chromatograficky rozdělí na koloně gradientovým vymýváním rozpouštědly od nejméně polárních s postupným přidáváním polárnějších rozpouště35 del, přičemž se sleduje obsah jednotlivých látek v takto získaných frakcích po odpaření rozpouštědla, frakce obsahující trilobolid se pak spojí a trilobolid se z nich oddělí.

   7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že pokud je rostlinný materiál, tj. semena nebo semenné okolíky, čerstvý, extrahuje se vodou v kombinaci s polárními organickými roz40 pouštědly, s výhodou methanolem nebo ethanolem, a pak se po odpaření části organického rozpouštědla z vodního podílu extrahuje požadovaná frakce octanem ethylnatým.

   8. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že pokud je rostlinný materiál suchý, extrahuje se organickými rozpouštědly postupně v pořadí stoupající polarity, s výhodou petroléterem,

   45 octanem ethylnatým, chloroformem, ethanolem.

   9. Způsob podle nároku 6, v y z n a č e n ý t í m, že se suchý rostlinný materiál extrahuje superkritickým oxidem uhličitým,

   50 10. Způsob podle nároku9, vyznačený tím, že se suchý rostlinný materiál extrahuje superkritickým oxidem uhličitým s přidáním malého podílu polárního unášeče, s výhodou ethanolu.

   11. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že extrakt obsahující trilobolid se stanoví chromatograficky, s výhodou metodou tenkovrstvé chromatografie (TLC) nebo vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).
5. 5 12. Způsob podle nároku6, vyznačený tím, že chromatografickým nosičem pro dělení odparku extraktu obsahujícího trilobolid je silikagel, s výhodou deaktivovaný zakotvenou vodou v rozsahu 10 až 15 % hmotn. vody, vztaženo na hmotnost silikagelu.

   13. Způsob podle nároku6, vyznačený tím, že frakce z chromatografického dělení ío odparku extraktu, obsahující trilobolid, se stanoví buď chromatograficky použitím standardu nebo vyhodnocením infračervených spekter čí spekter získaných z tandemového spojení chromatografie s vysokým rozlišením s hmotnostním detektorem (HPLC-MS).

   14. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že trilobolid se z frakce z chromatografic15 kého dělení odparku extraktu, obsahující trilobolid, oddělí chromatografií nebo krystalizací.

   20 4 výkresy