ES2646591T3

ES2646591T3 - Métodos para la purificación de anticuerpos utilizando alcoholes alifáticos

Info

Publication number: ES2646591T3
Application number: ES13753180.2T
Authority: ES
Inventors: Alois Jungbauer; Peter SATZER; Anne-Luise TSCHELIESSNIG
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2017-12-14
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: EP2890710A1; DK2890710T3; EP2890710B1; PL2890710T3; WO2014033126A1; PT2890710T; EP3260464A1; US10501525B2; US20150225473A1; LT2890710T

Abstract

Un método para aislar una proteína de un sobrenadante de cultivo celular que comprende: (i) Alternativa 1: a1) combinar un sobrenadante de cultivo celular que comprende la proteína, con una sal catiónica divalente en condiciones adecuadas para la precipitación de impurezas en el sobrenadante para producir un sobrenadante primario que comprende la proteína; b1) combinar el sobrenadante primario con un alcohol alifático en condiciones adecuadas para formar un precipitado que contiene la proteína y aislar el precipitado que contiene la proteína; c1) volver a suspender el precipitado que contiene la proteína en un tampón que comprende una sal catiónica divalente en condiciones adecuadas para la precipitación de impurezas a partir del mismo para producir una solución que contiene la proteína; y d1) combinar la solución que contiene la proteína con un alcohol alifático en condiciones adecuadas para formar un precipitado que contiene la proteína purificada y aislar el precipitado que contiene la proteína purificada; o (ii) Alternativa 2: a2) combinar un sobrenadante de cultivo celular que comprende la proteína, con un alcohol alifático en condiciones adecuadas para formar un precipitado que contiene la proteína y aislar el precipitado que contiene la proteína; b2) volver a suspender el precipitado que contiene la proteína en un tampón que comprende una sal catiónica divalente en condiciones adecuadas para la precipitación de impurezas a partir del mismo para producir una solución que contiene la proteína; y c2) combinar la solución que contiene la proteína, con un alcohol alifático en condiciones adecuadas para formar un precipitado que contiene la proteína purificada y aislar el precipitado que contiene la proteína purificada.

Description

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canino-de ratón, un anticuerpo que comprende un Fc canino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, caninizado, un anticuerpo con CDR injertada, un anticuerpo de tiburón, un nanocuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que consiste en un solo dominio variable monomérico), un anticuerpo de camélido (por ejemplo, anticuerpos de miembros de la familia Camelidae), un microcuerpo, un intracuerpo (por ejemplo, un anticuerpo intracelular), y/o un derivado de los mismos. Un anticuerpo “purificado” puede ser uno que esté separado al menos aproximadamente un 50 % de las proteínas con las que se encuentra inicialmente (por ejemplo, como parte de un sobrenadante de hibridoma o preparación de ascitis). Un anticuerpo purificado puede ser uno que esté separado al menos aproximadamente un 60 %, 75 %, 90 % o 95 % de las proteínas con las que se encuentra inicialmente (por ejemplo, en una muestra de cultivo celular). Los métodos de preparación y utilización de diversos tipos de anticuerpos son muy conocidos por los expertos en la materia y serían adecuados para poner en práctica la presente invención (véase, por ejemplo, Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol N.º 1, 1998; Kohler and Milstein, Nature, 256: 495, 1975; Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Hoogenboom et al., J. Mol. Biol.,

227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581, 1991; Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95, 1991; Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826, 1996; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995; así como las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.816.567; 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016). En determinadas aplicaciones, los anticuerpos pueden estar contenidos en el sobrenadante de hibridoma (por ejemplo, un sobrenadante de cultivo celular acelular) o ascitis, por ejemplo, y pueden utilizarse directamente como tales o después de la concentración o dilución utilizando técnicas convencionales.

En otras aplicaciones, los anticuerpos pueden purificarse adicionalmente utilizando, por ejemplo, fraccionamiento salino y cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de afinidad, utilizando ligandos de Proteína A, Proteína G, Proteína A/G y/o Proteína L acoplados covalentemente a un soporte sólido, tal como perlas de agarosa, o combinaciones de estas técnicas antes del procesamiento, utilizando los métodos descritos en la presente memoria. Los anticuerpos se pueden conservar en cualquier formato adecuado, incluyendo una precipitación congelada (por ejemplo, a -20 ºC o a -70 ºC), en forma liofilizada, o en condiciones normales de refrigeración (por ejemplo, a 4 ºC). Cuando se conservan en forma líquida, se puede utilizar un tampón adecuado tal como solución salina tamponada con Tris (TBS, por las siglas del inglés Tris-Buffered Saline) o solución salina tamponada con fosfato (PBS, por las siglas del inglés Phosphate Buffered Saline). Otros tipos de anticuerpos y derivados de los mismos también pueden ser adecuados como entenderá un experto en la materia.

Los anticuerpos monoclonales producidos utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria pueden formularse en composiciones, pudiendo ser algunas de ellas composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones descritas en la presente memoria pueden adoptar cualquier forma adecuada para su uso en investigación y/o administración a un hospedador (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano). Las formas adecuadas incluyen, por ejemplo, líquidos, cápsulas, emulsiones, gránulos, películas, implantes, soluciones líquidas, pastillas para chupar, partículas múltiples, sobres, sólidos, comprimidos, trociscos, gránulos, polvos y/o suspensiones. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y los alcoholes polietilénicos, con o sin adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Las formas en cápsula pueden formarse de gelatina (por ejemplo, dura o blanda). Cualquiera de dichas composiciones puede incluir, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, almidón de maíz y/o similares. Las formas en comprimido pueden incluir, por ejemplo, excipientes y/u otros agentes tales como lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, disgregantes (por ejemplo, croscarmelosa sódica), talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de cinc, ácido esteárico, colorantes, diluyentes, agentes tamponantes, disgregantes, humectantes, conservantes y/o agentes aromatizantes. También se pueden utilizar formas de pastillas para chupar, normalmente con una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, emulsiones, geles y similares. Las composiciones también pueden prepararse en forma liofilizada. Otras formas también pueden ser adecuadas como entenderá un experto en la materia.

Las composiciones farmacéuticas pueden adoptar cualquiera de las formas descritas anteriormente, o las ya conocidas en la técnica. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse utilizando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables antes de su uso en investigación y/o administración a un hospedador (por ejemplo, un animal, tal como un ser humano). Un vehículo farmacéuticamente aceptable es un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, por ejemplo, el material puede utilizarse en investigación y/o administrarse a un sujeto, sin causar ningún efecto biológico indeseable o interaccionar de manera perjudicial con cualquiera de otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido y/o reacción en la que se utiliza el mismo. Naturalmente, el vehículo se seleccionará para minimizar cualquier degradación del agente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como sabe bien el experto en la materia. Los vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen por ejemplo, en Remington’s: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª edición, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). Normalmente, en la

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