ES2645765T3 - Nuevos complejos basados en iridio para ECL - Google Patents
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Abstract
Un compuesto quimioluminiscente basado en iridio de Fórmula I**Fórmula** en la que R1-R16 es hidrógeno, haluro, grupo ciano o nitro, amino, alquilamino, alquilamino sustituido, arilamino, arilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, éster de ácido carboxílico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfóxido, sulfodióxido, fosfonato, fosfinato o R17, en la que R17 es arilo, arilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, alquilo ramificado, alquilo ramificado sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrógeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrófilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, éster de ácido carboxílico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfóxido, sulfodióxido, fosfonato, fosfinato o, en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo aromático o un anillo aromático sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrógeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrófilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, éster de ácido carboxílico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfóxido, sulfodióxido, fosfonato, fosfinato o, en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo alifático o un anillo alifático sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrógeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrófilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, éster de ácido carboxílico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfóxido, sulfodióxido, fosfonato, fosfinato y, en el que al menos uno de R13-R16 es -Q-Y, en el que Q representa un conector e Y es un grupo funcional y en el que el grupo funcional Y se selecciona del grupo que consiste en ácido carboxílico, éster de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halógeno, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, azida y fosforamidita.
Description
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DESCRIPCION
Nuevos complejos basados en iridio para ECL Antecedentes de la invencion
La presente invencion se refiere a novedosos complejos luminiscentes de Ir(III) basados en iridio, conjugados que comprenden estos complejos como un marcador y su aplicacion, por ejemplo, en la deteccion de un analito basada en electroquimioluminiscencia.
La quimioluminiscencia electrogenerada (tambien llamada electroquimioluminiscencia y abreviada como ECL) es el procedimiento mediante el que las especies generadas en los electrodos experimentan reacciones de transferencia de electrones de alta energia para formar estados excitados que emiten luz. Los primeros estudios detallados de ECL los describieron Hercules y Bard et al. a mediados de los anos sesenta. Despues de aproximadamente 40 anos de estudio, la ECL se ha convertido en una tecnica analitica muy potente y es ampliamente utilizada en las areas de, por ejemplo, inmunoensayo, analisis de alimentos y de aguas y deteccion de armas biologicas.
Existe un numero tremendo de compuestos que parecen ser de interes para su uso en dispositivos organicos emisores de luz (OLED). Estos compuestos son adecuados para su uso en materiales solidos o se pueden disolver en liquidos organicos. Sin embargo, no se puede sacar ninguna conclusion con respecto a su utilidad en un medio acuoso como, por ejemplo, el requerido para la deteccion de un analito en una muestra biologica.
En general, los procedimientos de deteccion basados en ECL se basan en el uso de complejos de rutenio solubles en agua, que comprenden Ru(II+) como ion metalico.
A pesar de las mejoras significativas conseguidas en las ultimas decadas, todavia existe una tremenda necesidad de ensayos de diagnostico in vitro mas sensibles basados en electroquimioluminiscencia.
El documento JP 2007 169474 A divulga ciertos complejos electroquimioluminiscentes basadosen Ir. Estos complejos de Ir se utilizan en la fabricacion de un material polimerico emisor de luz.
Vease tambien el documento WO2005/118606.
Ahora se ha encontrado sorprendentemente que ciertos complejos luminiscentes de Ir(III+) basados en iridio representan marcadores muy prometedores para futuros procedimientos de deteccion basados en ECL de alta sensibilidad.
Resumen de la invencion
La presente invencion divulga un compuesto quimioluminiscente basado en iridio de Formula I
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en la que R1-R16 es hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, amino, alquilamino, alquilamino sustituido, arilamino, arilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o R17, en la que R17 es arilo, arilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, alquilo ramificado, alquilo ramificado sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o,
en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo aromatico o un anillo aromatico sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o,
en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo alifatico o un anillo alifatico sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato y,
en el que al menos uno de R13-R16 es -Q-Y, en el que Q representa un conector e Y es un grupo funcional.
La presente invencion tambien divulga un conjugado que comprende el compuesto anterior y, unido covalentemente al mismo, un agente de union por afinidad.
La presente invencion se refiere ademas al uso de un compuesto o de un conjugado como se divulga en la presente invencion para realizar una medicion de luminiscencia o una reaccion de electroquimioluminiscencia en una solucion acuosa, especialmente en un dispositivo electroquimioluminiscente o sistema de deteccion electroquimioluminiscente.
Ademas, la presente invencion divulga un procedimiento para medir un analito mediante un procedimiento in vitro, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar una muestra que se sospecha o se sabe que comprende el analito, (b) poner en contacto dicha muestra con un conjugado de acuerdo con la presente invencion en condiciones apropiadas para la formacion de un complejo de conjugado de analito y (c) medir el complejo formado en la etapa (b) y obtener de este modo una medida del analito.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un compuesto quimioluminiscente basado en iridio de Formula I
en la que R1-R16 es hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, amino, alquilamino, alquilamino sustituido, arilamino,
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arilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o R17, en la que R17 es arilo, arilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, alquilo ramificado, alquilo ramificado sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o, en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo aromatico o un anillo aromatico sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o, en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo alifatico o un anillo alifatico sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato y en el que al menos uno de R13-R16 es -Q-Y, en el que Q representa un conector e Y es un grupo funcional.
En un modo de realizacion, al menos uno de R1 a R16 del compuesto de acuerdo con la Formula I esta sustituido por al menos un grupo hidrofilo.
En un modo de realizacion, los sustituyentes preferentes para alquiloxi sustituido son cadenas de etilenoxi que comprenden 1-40 unidades de etilenoxi, o que comprenden 1-20 unidades de etilenoxi o que comprenden 110 unidades de etilenoxi.
Los grupos hidrofilos preferentes son amino, alquilamino con alquilo significando una cadena lineal tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o una cadena alquilo ramificada tal como isopropilo, isobutilo, ferc-butilo, preferentemente una cadena alquilo lineal tal como metilo o etilo, alquilamino sustituido, este contiene, por ejemplo, una o dos cadenas ramificadas o lineales unidas al atomo de N, que estan sustituidas con un grupo hidrofilo adicional tal como hidroxilo o sulfo, preferentemente este alquilamino sustituido contiene dos residuos hidroxipropilo o hidroxietilo, arilamino en el que arilo se refiere a un residuo aromatico tal como fenilo o naftilo, preferentemente fenilo, arilamino sustituido con arilo siendo como se ha definido anteriormente y un residuo adicional formado por un grupo hidrofilo, alquilamonio con alquilo siendo como se ha definido anteriormente y, preferentemente siendo un residuo trimetilamonio o trietilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, preferentemente un ester de alquilo tal como ester de metilo o etilo, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido con alquilo y alquilo sustituido siendo como se ha definido anteriormente o ariloxi o ariloxi sustituido con arilo y arilo substituido siendo como se ha definido anteriormente, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato.
Preferentemente, dicho grupo hidrofilo se selecciona entre amino, alquilamino, alquilamino sustituido, arilamino, arilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, hidroxi, sulfo, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido y fosfonato, cuando sea aplicable, cada uno preferentemente como se ha definido en el parrafo anterior.
En un modo de realizacion adicional, el grupo hidrofilo se selecciona entre sulfo, sulfonamida, sulfodioxido.
En un modo de realizacion, al menos uno de los grupos R1 a R12 de Formula I es un grupo sulfo.
En un modo de realizacion, al menos uno de R1 a R12 de los residuos de fenilfenantridina comprendidos en la Formula I esta sustituido por al menos un grupo hidrofilo.
En un modo de realizacion, los residuos de fenilfenantridina comprendidos en la Formula I se seleccionan entre las fenilfenantridinas sustituidas que se proporcionan a continuacion.
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En el compuesto de acuerdo con la presente invencion, el conector Q tiene preferentemente una longitud de cadena principal de entre 1 y 20 atomos. En otras palabras, la conexion mas corta entre el anillo de piridilo de Formula I y el grupo funcional Y consiste en de 1 a 20 atomos. En un modo de realizacion, el conector Q en el complejo electroquimioluminiscente de esta invencion es una cadena alquilo C1-C20 saturada, insaturada, no sustituida, sustituida, lineal o ramificada, o una cadena arilalquilo C1-C20 (en la que, por ejemplo, un anillo de fenileno representa una longitud de cuatro atomos de carbono), o una cadena de 1 a 20 atomos con una cadena principal que consta de atomos de carbono y uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, N y S, o una cadena de 1 a 20 atomos con una cadena principal que consta de atomos de carbono y uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, N y S que comprende al menos un grupo arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido (en el que, por ejemplo, un anillo de fenileno representa una longitud de cuatro atomos). En un modo de realizacion, el conector Q en un compuesto de acuerdo con la presente invencion es una cadena alquilo C1-C12 saturada, o una cadena arilalquilo C1-C12, o una cadena de 1 a 12 atomos con una cadena principal que consta de atomos de carbono y uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, N y S, o una cadena de 1 a 12 atomos con una cadena principal que consta de atomos de carbono y uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, N y S que comprende al menos un grupo arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido (en el que, por ejemplo, un anillo de fenileno representa una longitud de cuatro atomos).
En un modo de realizacion, el grupo funcional Y comprendido en el complejo basado en iridio de acuerdo con la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en acido carboxilico, ester de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halogeno, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, azida y fosforamidita.
Un conjugado que comprende un compuesto electroquimioluminiscente basado en iridio de Formula I como se divulga y se define en el presente documento y, unido covalentemente al mismo, una sustancia biologica. Ejemplos de sustancias biologicas adecuadas son celulas, virus, particulas subcelulares, proteinas, lipoproteinas, glucoproteinas, peptidos, polipeptidos, acidos nucleicos, acidos nucleicos peptidicos (PNA), oligosacaridos, polisacaridos, lipopolisacaridos, metabolitos celulares, haptenos, hormonas, sustancias farmacologicas, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoacidos y azucares.
En un modo de realizacion, la sustancia biologica de un conjugado de acuerdo con la presente invencion, es decir,
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unida covalentemente a un compuesto de acuerdo con la Formula I es un agente de union por afinidad. Como apreciara el experto en la tecnica, en un conjugado de acuerdo con la presente invencion, el grupo funcional Y del compuesto de acuerdo con la Formula I se ha utilizado para formar un enlace covalente con un grupo sobre el agente de union por afinidad. En el caso de que un reactivo de union por afinidad no contenga en si mismo un grupo apropiado para unirse o reaccionar con el grupo Y, dicho grupo se puede introducir facilmente en el agente de union por afinidad basandose en procedimientos bien establecidos.
Sin desear mayor limitacion, pero en aras de la claridad, el agente de union por afinidad puede comprender cualquiera de los siguientes; un antigeno, una proteina, un anticuerpo, biotina o analogo de biotina y avidina o estreptavidina, azucar y lectina, una enzima, un polipeptido, un grupo amino, un acido nucleico o un analogo de acido nucleico y un acido nucleico complementario, un nucleotido, un polinucleotido, un acido nucleico peptidico (PNA), un polisacarido, un agente secuestrador de iones metalicos, un agonista de receptor, un antagonista de receptor o cualquier combinacion de los mismos. Por ejemplo, el agente de union por afinidad puede ser un socio de un par de union especifica, en el que el otro socio de dicho par de union esta asociado con o es la diana sobre una superficie celular o una estructura intracelular.
Preferentemente, un agente de union por afinidad es un socio o miembro de un par de union por afinidad o, como tambien es llamado por el experto en la tecnica, un socio o miembro de un par de union especifica.
Un agente de union por afinidad tiene al menos una afinidad de 107 l/mol por su diana, por ejemplo, un miembro de un par de union especifica como un anticuerpo por el otro miembro del par de union especifica como su antigeno. Un agente de union por afinidad tiene preferentemente una afinidad de 108 l/mol o incluso mas preferentemente de 109 l/mol por su diana.
En un modo de realizacion, la presente invencion se refiere a un conjugado en el que el agente de union por afinidad se selecciona del grupo que consiste en antigeno, anticuerpo, biotina o analogo de biotina, avidina o estreptavidina, azucar, lectina, acido nucleico o analogo de acido nucleico y acido nucleico complementario, receptor y ligando.
En un modo de realizacion, la presente invencion se refiere a un conjugado en el que el agente de union por afinidad se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo, biotina o analogo de biotina, avidina o estreptavidina y acido nucleico.
En un modo de realizacion, el conjugado de acuerdo con la presente invencion comprende unirse covalentemente a un compuesto de acuerdo con la Formula I como se divulga y define anteriormente en el presente documento y un agente de union por afinidad que es un oligonucleotido o un anticuerpo.
Los analogos de biotina son aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina.
El termino "oligonucleotido" o "acido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere en general a polinucleotidos cortos, en general de cadena sencilla, que comprenden un minimo de 8 nucleotidos y un maximo de aproximadamente 1000 nucleotidos. En un modo de realizacion preferente, un oligonucleotido tendra una longitud de al menos 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, 24, 27 o 30 nucleotidos. En un modo de realizacion preferente, un oligonucleotido tendra una longitud de no mas de 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 o 30 nucleotidos.
El termino oligonucleotido se debe entender de forma amplia e incluye ADN y ARN, asi como analogos y modificacion de los mismos.
Un analogo de acido nucleico puede contener, por ejemplo, un nucleotido sustituido que lleva un sustituyente en las bases estandar desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG), desoxicitosina (dC), desoxitimidina (dT), desoxiuracilo (dU). Ejemplos de dichas nucleobases sustituidas son: pirimidinas 5-sustituidas como 5-metil-dC, aminoalil-dU o -dC, 5-(aminoetil-3-acrilimido)-dU, 5-propinil-dU o -dC, dU o dC 5-halogenada; pirimidinas N-sustituidas como N4-etil-dC; purinas N-sustituidas como N6-etil-dA, N2-etil-dG; purinas 8-sustituidas como 8-[6-amino)-hex-1-il]-8-amino-dG o - dA, dA o dG 8-halogenada, 8-alquil-dG o -dA y dA 2-sustituida como 2-amino-dA.
Un analogo de acido nucleico puede contener un nucleotido o un analogo de nucleosido. Es decir, las nucleobases naturales se pueden intercambiar usando analogos de nucleobases como 5-nitroindol-d-ribosido; 3-nitro-pirrol-d- ribosido, desoxiinosina (dl), deoxixantosina (dX); 7-desaza-dG, -dA, -dl o -dX; 7-desaza-8-aza-dG, -dA, -dl o -dX; 8- aza-dA, -dG, -dl o -dX; d-formicina; pseudo-dU; pseudo-iso-dC; 4-tio-dT; 6-tio-dG; 2-tio-dT; iso-dG; 5-metil-iso-dC; 8- aza-7-desaza-dA unido por N8; 5,6-dihidro-5-aza-dC; y eteno-dA o pirolo-dC. Como es obvio para el experto en la tecnica, la nucleobase en la hebra complementaria se tiene que seleccionar de tal manera que la formacion de duplex sea especifica. Si, por ejemplo, se usa 5-metil-iso-dC en una hebra (por ejemplo (a)), la iso-dG tiene que estar en la hebra complementaria (por ejemplo (a')).
En un analogo de acido nucleico, el esqueleto del oligonucleotido se puede modificar para contener residuos de azucares sustituidos, analogos de azucar, modificaciones en el resto fosfato internucleosidico y/o ser un PNA.
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Un oligonucleotido puede contener, por ejemplo, un nucleotido con una desoxirribosa sustituida como 2'-metoxi-, 2'- fluoro-, 2'-metilseleno-, 2'-aliloxi-, 4'-metil-dN (en la que N es una nucleobase, por ejemplo, A, G, C, T o U).
Los analogos de azucar son, por ejemplo, xilosa; ribosa con un puente 2',4' como (2'-O,4'-C-metileno) (oligomero conocido como LNA) o (2'-O,4'-C-etileno) (oligomero conocido como ENA); L-ribosa, L-d-ribosa, hexitol (oligomero conocido como HNA); ciclohexenilo (oligomero conocido como CeNA); altritol (oligomero conocido como ANA); un analogo de ribosa triciclica en el que los atomos C3' y C5' estan conectados por un puente de etileno que se fusiona con un anillo de ciclopropano (oligomero conocido como tricicloADN); glicerina (oligomero conocido como GNA); glucopiranosa (oligomero conocido como ADN homo); carbarribosa (con un ciclopentano en lugar de una subunidad de tetrahidrofurano); hidroximetilmorfolina (oligomeros conocidos como ADN morfolino).
Tambien se sabe que un gran numero de modificaciones del resto fosfato internucleosidico no interfieren con las propiedades de hibridacion y dichas modificaciones de la cadena principal tambien se pueden combinar con nucleotidos sustituidos o analogos de nucleotidos. Ejemplos son oligonucleotidos de fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato y metilfosfonato.
El PNA (que tiene un esqueleto sin fosfato ni d-ribosa) tambien se puede usar como un analogo de ADN.
Los nucleotidos modificados, analogos de nucleotidos, asi como modificaciones del esqueleto del oligonucleotido anteriormente mencionados se pueden combinar como se desee en un oligonucleotido en el sentido de la presente invencion.
El termino "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido mas amplio y abarca especificamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (p.ej., anticuerpos biespecificos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biologica deseada.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirian en usos de investigacion, diagnostico o terapeuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteinicos o no proteinicos. En algunos modos de realizacion, un anticuerpo se purifica (1) hasta mas de un 95 % en peso de anticuerpo como se determina mediante, por ejemplo, el procedimiento de Lowry, y en algunos modos de realizacion hasta mas de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante el uso de, por ejemplo, un secuenciador de cubilete giratorio o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, azul de Coomassie o tincion con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en celulas recombinantes, puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estara presente. De manera ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
Los "anticuerpos nativos" son habitualmente glucoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150 000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.
La "region variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar "VH". El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar "VL". Estos dominios son, en general, las partes mas variables de un anticuerpo y contienen los sitios de union a antigeno.
El termino "variable" hace referencia al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en su secuencia entre anticuerpos y se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVR), en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuracion de lamina p, conectadas por tres HVR, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lamina p. Las HVR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antigeno de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, National Institute of Health, Bethesda, MD
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(1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participacion del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) y lambda (A), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de las secuencias de aminoacidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir, ademas, en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen en general en, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4.a ed., W.B. Saunders, Co. (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molecula de fusion mas grande, formada por asociacion covalente o no covalente del anticuerpo con una o mas de otras proteinas o peptidos.
Los terminos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se definen mas adelante. Los terminos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una region Fc.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porcion de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la region de union a antigeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La digestion con papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos identicos de union a antigeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de union a antigeno unico, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina genera un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinacion de antigeno y todavia es capaz de reticular el antigeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio de union a antigeno completo. En un modo de realizacion, una especie de Fv bicatenario consiste en un dimero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en cercana asociacion no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv) se pueden unir covalentemente un dominio variable de la cadena ligera y uno de la cadena pesada mediante un conector peptidico flexible, de tal manera que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimerica" analoga a la de una especie de Fv bicatenario. Es en esta configuracion en la que las tres HVR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de union a antigeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad de union a antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende unicamente tres HVR especificas para un antigeno) tiene capacidad para reconocer y unirse al antigeno, aunque a una afinidad mas baja que el sitio de union completo.
El fragmento Fab contiene los dominios de cadena pesada y ligera y contiene tambien el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada que incluyen una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion en el presente documento para un Fab' en el que el residuo o residuos de cisteina de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios de VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptidica. En general, el polipeptido de scFv comprende adicionalmente un conector polipeptidico entre los dominios de VH y VL, que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la union a antigeno. Para una revision de scFv, vease, por ejemplo, Plueckthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) paginas 269-315.
El termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de union a antigeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptidica (VH-VL). Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de union a antigeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecificos. Los diacuerpos se describen mas en detalle, por ejemplo, en los documentos EP 0404 097; WO 1993/01161; en Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y en Holliger, P. et al., PNAS USA 90
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(1993) 6444-6448. Los triacuerpos y tetracuerpos tambien se describen en Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134.
El termino ''anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones que se producen de forma natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el caracter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos distintos. En ciertos modos de realizacion, dicho anticuerpo monoclonal incluye tipicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptidica que se une a una diana, en el que la secuencia polipeptidica de union a diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la seleccion de una unica secuencia polipeptidica de union a diana entre una pluralidad de secuencias polipeptidicas. Por ejemplo, el procedimiento de seleccion puede ser la seleccion de un clon unico entre una pluralidad de clones, como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de union a diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de union a diana, para mejorar su produccion en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecifico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de union a diana alterada es tambien un anticuerpo monoclonal de la presente invencion. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparacion de anticuerpos monoclonales se dirige contra un unico determinante en un antigeno. Ademas de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas al no estar tipicamente contaminadas por otras inmunoglobulinas.
Como se ha mencionado, los compuestos y conjugados divulgados en el presente documento tienen propiedades bastante favorables. Por ejemplo, los compuestos o conjugados divulgados, respectivamente, muestran una alta eficacia ECL. Esta alta eficacia tambien esta presente si las mediciones correspondientes se realizan en un sistema acuoso en comparacion con muchos, muchos marcadores ECL que solo han mostrado una alta eficacia ECL cuando se analizan en un disolvente organico. Por ejemplo, muchos colorantes OLED se analizan habitualmente en acetonitrilo y, o no son solubles en una solucion acuosa o, si son solubles, no muestran electroquimioluminiscencia eficaz en una solucion acuosa.
En un modo de realizacion preferente, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto o de un conjugado, respectivamente, como se divulga en la presente invencion para llevar a cabo una reaccion de electroquimioluminiscencia en una solucion acuosa. Una solucion acuosa es cualquier solucion que comprende al menos un 90 % de agua (en peso/peso). Obviamente, dicha solucion acuosa puede contener ademas ingredientes como compuestos tampon, detergentes y, por ejemplo, aminas terciarias como tripropilamina como donante de electrones en la reaccion de ECL.
En un modo de realizacion, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto o de un conjugado, respectivamente, como se divulga en la presente invencion en un procedimiento de deteccion basado en electroquimioluminiscencia.
En un modo de realizacion, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto o de un conjugado, respectivamente, como se divulga en la presente invencion en la deteccion de un analito.
Un analito de acuerdo con la presente invencion puede ser cualquier molecula inorganica u organica, incluyendo cualquier sustancia biologica de interes. Ejemplos de sustancias biologicas adecuadas que representan un analito en el sentido de la presente invencion son celulas, virus, particulas subcelulares, proteinas, lipoproteinas, glucoproteinas, peptidos, polipeptidos, acidos nucleicos, oligosacaridos, polisacaridos, lipopolisacaridos, metabolitos celulares, haptenos, hormonas, sustancias farmacologicas, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoacidos y azucares.
El analito se puede seleccionar del grupo que consiste en un polipeptido, un carbohidrato y una molecula de farmaco inorganico u organico.
Un polipeptido o proteina es una molecula que esta esencialmente compuesta de aminoacidos y que tiene al menos dos aminoacidos unidos por enlace peptidico. En el caso del analito de interes que se va a investigar en un procedimiento descrito en el presente documento, el polipeptido constara preferentemente de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25 y 30 hasta aproximadamente 10 000 aminoacidos. Preferentemente, el polipeptido contendra de 5 a 2000, tambien preferentemente de 10 a 1000 aminoacidos.
En el caso de que el analito sea un acido nucleico, estos acidos nucleicos son preferentemente oligonucleotidos de ADN o ARN de origen natural.
En un modo de realizacion, la presente invencion se refiere a un procedimiento para medir un analito mediante un procedimiento in vitro, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar una muestra que se sospecha o se sabe que comprende el analito, (b) poner en contacto dicha muestra con un conjugado de acuerdo entre un
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agente de union por afinidad y un compuesto de acuerdo con la Formula I como se divulga en la presente invencion en condiciones apropiadas para la formacion de un complejo de conjugado de analito, (c) medir el complejo formado en la etapa (b) y obtener de este modo una medida del analito.
En un modo de realizacion, la medicion en el procedimiento anterior para la deteccion de un analito se lleva a cabo utilizando un procedimiento de deteccion basado en electroquimioluminiscencia. Tambien se prefiere que el procedimiento se lleve a cabo en una solucion acuosa.
Ejemplo 1
Sintesis de fenil-fenantridinas sustituidas Ejemplo 1.1
Procedimiento general para la sintesis de 2-aminobifenilos sustituidos:
Con la reaccion de acoplamiento de Suzuki-Miyaura, como se describe por Youn, S.W., en Tetrahedron Lett. 50 (2009) 4598-4601, entre derivados de 2-bromoanilina comercialmente disponibles y el correspondiente acido arilboronico se pueden sintetizar los 2-aminobifenilos apropiados, que se requieren para reacciones adicionales para obtener las fenantridinas.
Procedimiento tipico:
a: 10 % en moles de PdCl2(PPh3)2, K2CO3, DMF/H2O (5/1), 80 °C, 24 h Otros ejemplos:
Ejemplo 1.2
Procedimiento general para la sintesis de fenantridinas sustituidas:
A la solucion enfriada con hielo de 2-arilanilina 1 (0,01 mol) en cloroformo (20 ml) se anadio cloruro de acido de arilo 2 (0,01 mol) y se agito en condiciones inertes durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla resultante se calento a reflujo con agitacion durante las 2 horas siguientes. La mezcla de reaccion se trato por adicion gota a gota de piridina (0,02 moles en 10 ml de cloroformo) durante un periodo de 60 minutos. Se dejo que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agito durante la noche. La mezcla se lavo bien con HCl 0,5 M, se seco sobre MgSO4 y se concentro a vacio. El producto bruto se purifico por cromatografia ultrarrapida sobre gel de silice, hexano/acetato de etilo 3:2 para dar el producto 3 puro con un rendimiento de un 66 %.
Se sometieron a reflujo benzamido-2-bifenilo 3 (0,01 mol) y POCl3 (5 ml) en 20 ml de tolueno y la mezcla se agito bajo nitrogeno durante 18 horas, siguiendo el procedimiento descrito por Lion, C., en Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566. La mezcla de reaccion enfriada se diluyo con CH2Cl2 (30 ml) y se vertio sobre hielo, se lavo con NH4OH al 25 % y agua destilada. La fase organica se seco sobre MgSO4 y se concentro a vacio, seguido de cromatografia ultrarrapida (gel de silice, hexano/acetato de etilo 1:1) para dar el producto 4 6-fenilfenantridina.
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Rendimiento: 52 %. Solido blanco. 1H-RMN (CDCI3, 400 MHz) 8 7,54-7,85 (m, 9H), 8,10 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,28 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,67 (d, J = 8,4 Hz, 1H).
Usando 2-naftalen-2-il-fenilamina en lugar de 2-aril-anilina:
1H-RMN (400 MHz, CDCls) 8 8,64 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 8,29 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 8,92 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 7,48 Hz, 1H), 7,79-7,75 (m, 2H), 7,69 (t, J = 14,0, 8,2 Hz, 1H), 7,63-7,61 (m, 2H), 7,53-7,46 (m, 4H), 7,19 (t, J = 14,3, 7,2 Hz, 1 H).
EM: [M+H]+ 306,3
Utilizando cloruro de naftaleno-carbonilo en lugar de cloruro de benzoilo:
1H-RMN (400 MHz, CDCls) 8 8,74 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,15 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,97-7,94 (m, 2H), 7,90-7,85 (m, 2H), 7,80-7,69 (m, 2H), 7,62 (t, J = 14,2, 7,1 Hz, 1 H), 7,59-7,55 (m, 2H).
EM: [M+H]+ 306,3
Ejemplo 1.3
Procedimiento para la si'ntesis de 6-(2-sulfofenil)-fenantridina
La 6-(2-sulfofenil)-fenantridina se puede sintetizar por calentamiento suave de arilanilina (0,01 mol) con anhidrido ciclico del acido 2-sulfobenzoico (0,01 mol) en CH3CN durante 6 horas utilizando el procedimiento descrito por Nicolai, E., en Chem. Pharm. Bull. 42 (1994) 1617-1630.
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Despues de la purificacion, el producto se puede convertir en la fenantridina apropiada basandose en el procedimiento descrito en el ejemplo 1.2.
Ejemplo 1.4
Procedimiento para la si'ntesis de 6-fenil-alquilsulfonil-fenantridina
La 6-fenil-alquilsulfonil-fenantridina se puede sintetizar por calentamiento suave de alquilsulfonil-arilanilina (0,01 mol) con cloruro de benzoilo (0,01 mol) en cloroformo usando el procedimiento descrito por Lion, C., en Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566, vease el ejemplo 1.2.
Despues de la purificacion, el producto se puede convertir en la fenantridina apropiada basandose en el procedimiento descrito en el ejemplo 1.2.
1H-RMN (400 MHz, CDCls) 8 8,92 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8,75 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,68 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,35 (dd, J = 8,7, 2,0 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,89 (t, J = 15,3, 7,1 Hz, 1H), 7,81-7,73 (m, 3H), 7,64-7,56 (m, 3H), 3,12 (s, 3H).
EM: [M+H]+ 334,3
La 6-(4-metilsulfofenil)-fenantridina se puede preparar tambien siguiendo el procedimiento descrito por Cymerman, J., en J. Chem. Soc. (1949) 703-707.
Ejemplo 1.5
Si'ntesis de 6-[4-(2-{2-[2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-fenil]-fenantridina
'O' v ^ o
Si'ntesis de tosilato de 2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-ol:
Procedimiento: (JACS, 2007, 129, 13364) A una solucion de 2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-ol (7 g, 33,6 mmol) y trietilamina (4,9 ml, 35,3 mmol) en CH2Cl2 seco (100 ml) se anadieron cloruro de 4-toluenosulfonilo (6,7 g,
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35,3 mmol) y DMAP (120 mg). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 20 h. La mezcla de reaccion se lavo con 80 ml de HCl (1 M) y despues con agua. El extracto se seco sobre MgSO4 anhidro, se filtro y el filtrado se evaporo. El residuo se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
Rendimiento: 11,0 g (90 %).
RMN:
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) 5 7,75-7,64 (m, 2H), 7,31-7,26 (m, 2H), 4,16-4,06 (m, 2H), 3,62 (m 2H), 3,59-3,40 (m, 10H), 3,30 (s, 3H) 2,38 (s, 3H).
13C{1H}-RMN (101 MHz, CDCls) 5 144,75 (s), 132,90 (s), 129,77 (s), 127,8 (s), 71,82 (s), 70,60 (s), 70,48 (s), 70,47 (s), 70,41 (s), 70,39 (s), 69,23 (s), 68,55 (s), 58,90 (s), 21,53 (s).
Sintesis de ester eti'lico del acido 4-PEG4-benzoico:
Procedimiento: (JACS, 2007, 129, 13364) Una mezcla del compuesto 2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-il-4- metilbencenosulfonato de etilo (8,1 g, 22,3 mmol), ester etilico del acido 4-hidroxibenzoico (3,7 g, 22,3 mmol), K2CO3 (15,4 g, 111,5 mmol) y 18-corona-6 (0,59 g, 2,2 mmol) se calento a reflujo en acetona (120 ml) durante 22 h. La mezcla de reaccion se concentro y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se lavo con H2O, se seco sobre MgSO4 anhidro y se filtro. El filtrado se evaporo a sequedad y el residuo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de silice (diclorometano/metanol = 100:1) para obtener el compuesto (1,93 g, 88 %).
Rendimiento: 7 g (88 %).
RMN:
1H-RMN (400 MHz, CDCls) 5 8,01-7,84 (m, 2H), 6,96-6,85 (m, 2H), 4,29 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 4,12 (dd, J = 5,4, 4,3 Hz, 2H), 3,82 (dd, J = 5,4, 4,2 Hz, 2H), 3,71 -3,56 (m, 10H), 3,51 -3,45 (m, 2H), 3,32 (s, 3H), 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
13C{1H}-RMN (101 MHz, CDCls) 5 166,29 (s), 162,47 (s), 131,45 (s), 123,01 (s), 114,11 (s), 71,90 (s), 70,84 (s), 70,60 (s), 70,59 (s), 70,58 (s), 70,48 (s), 69,51 (s), 67,54 (s), 60,57 (s), 58,98 (s), 14,35 (s).
EM(+):
[M+Na+]+ calculado: 379,1727, hallado: 379,1743.
Sintesis de acido 4-PEG4-benzoico:
Procedimiento: (JACS, 2007, 129, 13364) Una mezcla de 4-(2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-iloxi) benzoato de etilo (7 g, 19,6 mmol) y KOH (2,3 g, 41,24 mmol) en 200 ml de EtOH/H2O (1:1 v/v) se calento a reflujo durante la noche. Despues de enfriar, la mezcla se neutralizo con HCl (2 N). La mezcla resultante se extrajo con EtOAc y se evaporo hasta sequedad. El solido blanco resultante se recristalizo en EtOAc/hexanos.
Rendimiento: 5,3 g (85 %).
RMN:
1H-RMN (300 MHz, CDCls) 5 11,17 (s, 1H), 8,14-7,89 (m, 2H), 7,03-6,75 (m, 2H), 4,29-4,02 (m, 2H), 3,92-3,81 (m, 2H), 3,78-3,57 (m, 10H), 3,57-3,46 (m, 2H), 3,35 (s, 3H).
13C{1H}-RMN (75 MHz, CDCls) 5 171,46 (s), 163,24 (s), 132,30 (s), 121,98 (s), 114,33 (s), 71,96 (s), 70,91 (s), 70,67 (s), 70,66 (s), 70,64 (s), 70,54 (s), 69,55 (s), 67,66 (s), 59,08 (s).
EM(-):
[M-H]- calculado: 327,1438, hallado: 327,1456.
Sintesis de N-bifenil-2-il-4-(2-{2-[2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benzamida:
Procedimiento: A una disolucion de acido 4-(2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-iloxi)benzoico (3 g, 9,14 mmol) y 0,2 ml de DMF en 30 ml de DCM seco a 0°C se anadio cloruro de oxalilo (1,05 ml, 12,34 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 0 °C durante 1 h. Despues, la mezcla se concentro a sequedad. El residuo aceitoso se uso sin purificacion adicional en la siguiente etapa.
Una solucion de 2-fenilanilina (1,6 g) y piridina (2,4 ml) en cloroformo (80 ml) bajo atmosfera inerte se enfrio a 0°C. Se anadio lentamente cloruro de fenil-4-(2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-iloxi)benzoilo (3,1 g, 9,14 mmol) en 20 ml a la solucion y se dejo que la mezcla final alcanzara temperatura ambiente. La solucion se calento a reflujo durante 2 h y
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se agito durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se extrajo con HCl (1 M, 2 x 100 ml), NaHCC>3 (100 ml) y agua (50 ml). La fase organica se seco con MgSO4 y se purifico por cromatografia en gel de silice (EtOAc/hexano).
Rendimiento: 4,1 g (90 %).
RMN:
1H-RMN (400 MHz, CDCls) 5 8,49 (dd, J = 8,3, 0,9 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,61-7,35 (m, 9H), 7,33-7,25 (m, 1H), 7,19 (m, 1H), 6,91-6,84 (m, 2H), 4,16-4,10 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,77-3,58 (m, 10H), 3,56-3,49 (m, 2H), 3,36 (s, 3H).
13C{1H}-RMN (101 MHz, CDCls) 5 164,56 (s), 161,65 (s), 138,18 (s), 135,12 (s), 132,32 (s), 129,97 (s), 129,39 (s), 129,22 (s), 128,66 (s), 128,57 (s), 128,16 (s), 127,13 (s), 124,18 (s), 121,23 (s), 114,57 (s), 71,95 (s), 70,89 (s), 70,64 (s), 70,63 (s), 70,54 (s), 69,54 (s), 67,63 (s), 59,04 (s), 53,51 (s).
EM(+):
[M+H]+ calculado: 480,2386, hallado: 480,2383; [M+Na]+ calculado: 502,2200, hallado: 502,2204.
Si'ntesis de 6-[4-(2-{2-[2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-fenil]-fenantridina:
Procedimiento: N-Bifenil-2-il-4-(2-{2-[2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-benzamida (4 g, 8,34 mmol), POCl3 (10 ml) en 10 ml de tolueno se sometieron a reflujo durante 20 h. Se dejo que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se anadieron 100 ml de diclorometano. La solucion se vertio sobre hielo y la mezcla se neutralizo con NH4OH (20 %). La fase organica se extrajo y se lavo sucesivamente con agua destilada y salmuera, y se seco sobre MgSO4. La solucion resultante se purifico por cromatografia ultrarrapida (gel de silice, acetato de etilo/hexano 1:1, Rf = 0,14).
Rendimiento: 1 g (25 %).
RMN:
1H-RMN (300 MHz, CDCls) 5 8,68 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,59 (dd, J = 8,1, 1,4 Hz, 1H), 8,23 (dd, J = 8,1, 1,1 Hz, 1H), 8,15 (dd, J = 8,3, 0,7 Hz, 1H), 7,84 (ddd, J = 8,3, 7,1, 1,3 Hz, 1H), 7,79-7,57 (m, 5H), 7,15-7,03 (m, 2H), 4,29 -4,19 (m, 2H), 3,93-3,90 (m, 2H), 3,80-3,60 (m, 12H), 3,59-3,49 (m, 2H), 3,37 (s, 3H).
13C{1H}-RMN (75 MHz, CDCls) 5 160,92 (s), 159,45 (s), 143,84 (s), 133,59 (s), 131,26 (s), 130,61 (s), 130,26 (s), 129,05 (s), 128,90 (s), 127,19 (s), 126,85 (s), 125,39 (s), 123,70 (s), 122,29 (s), 122,01 (s), 114,68 (s), 72,02 (s), 70,97 (s), 70,74 (s), 70,72 (s), 70,69 (s), 70,62 (s), 69,80 (s), 67,68 (s), 59,15 (s).
EM(+) JM358-F5, [M+H]+ calculado: 462,2280, hallado: 462,2275.
Ejemplo 2
Procedimiento general para la si'ntesis del complejo dimerico reticulado con cloro:
El procedimiento general se publico por Nonoyama, M., J. Organomet. Chem. 86 (1975) 263-267.
Los dimeros de iridio se sintetizaron de la siguiente manera: IrC^3H2O y 2,5 equiv. de 6-fenilfenantridina se calentaron a 120 0C durante 18 h bajo nitrogeno en una mezcla 2-etoxietanol/agua (3:1, v/v). Despues de enfriar a temperatura ambiente, el precipitado se separo por filtracion y se lavo sucesivamente con metanol y Et2O, se seco para dar el dimero deseado.
Ejemplo 2.1
Complejo con fenilfenantridina no sustituida
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[(6-fenilfenantridina)2lrCl]2.
Rendimiento: 71 %. Solido pardo. 1H-RMN (DMSO-ds, 400 MHz) 8 6,45 (d, J = 6,8, 4H), 6,58 (t, J = 7,1, 13,9 Hz, 4H), 6,95 (t, J = 7,1, 14,2 Hz, 4H), 7,56 (t, J = 7,4, 16,0 Hz, 4H), 7,68 (t, J = 8,1, 16,2 Hz, 4H), 7,93 (t, J = 8,0, 14,6 Hz, 4H), 8,07-8,13 (m, 8H), 8,80 (d, J = 7,3 Hz, 4H), 8,93-9,01 (m, 12H).
Ejemplo 2.2
Complejo con fenilfenantridina sustituida
Una mezcla de 6-[4-(2-{2-[2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-fenil]-fenantridina (1 g, 2,16 mmol), IrC^3H2O (346 mg, 0,98 mmol) en 16 ml de 2-EtOEtOH:H2O (12:4) se calento a reflujo durante la noche bajo atmosfera de nitrogeno. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se anadieron 60 ml de agua para obtener un precipitado aceitoso. El sobrenadante se desecho y se anadieron 50 ml de agua al residuo. La mezcla se agito durante 1 h para obtener un precipitado rojo-pardusco. El solido se filtro y se lavo con agua (50 ml) y Et2O (30 ml). El solido pardo se disolvio en la menor cantidad de diclorometano y precipito tras la adicion de Et2O. Este producto en bruto se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
Rendimiento: 550 mg (50 %).
RMN:
1H-RMN (300 MHz, CDCls) 8 8,74 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 8,36 (dd, J = 8,0, 5,2 Hz, 8H), 7,90 (dd, J = 14,7, 7,7 Hz, 8H), 7,81 (d, J = 9,0 Hz, 4H), 7,79-7,67 (m, 4H), 6,78-6,65 (m, 4H), 6,32 (dd, J = 8,8, 2,5 Hz, 4H), 5,89-5,83 (m, 4H), 5,28 (d, J = 2,5 Hz, 4H), 3,67-3,10 (m, 100H, cadena PEG, contiene algunas impurezas)
EM (ESI-EM(+)):
[M+2Na+]2+ calculado: 1171,3463, hallado 1171.3473; [(CAN)2lr]+ calculado: 1113,3877, hallado: 1113,3892.
Ejemplo 3
A) Sintesis de derivados del acido carboxialquiloxi-picoli'nico:
Una mezcla del acido 3-hidroxi-2-piridincarboxilico (0,01 mol), 4-bromobutanoato de etilo o 6-bromohexanoato de etilo (0,021 mol) y una mezcla de carbonato de potasio (5 equiv.) en DMF (20 ml) se calento a 90 °C durante 20 horas bajo nitrogeno. Despues de enfriar, la mezcla de reaccion se vertio sobre una mezcla de hielo y agua y se
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extrajo tres veces con diclorometano (30 ml), se seco sobre MgSC>4 anhidro, se filtro y el disolvente se evaporo a sequedad. Se purifico por cromatografia ultrarrapida (silice, hexano/acetato de etilo 3:1) para proporcionar el producto (basado en la patente US 5.219.847).
El ester formado se hidrolizo mediante adicion de NaCH en MeCH (pH = 10). El pH de la solucion se ajusto despues a 6,0 y se agito a t.a. durante una noche. El disolvente se elimino a vacio y el residuo se cristalizo en hexano/acetona para dar el producto deseado.
Acido 3-(carboxi-pentiloxi)-piridin-2-carboxilico Rendimiento: 51 %. Solido gris. 1H-RMN (DMSC-d6, 400 MHz) 5 1,391,45 (m, 2H), 1,51-1,57 (m, 2H), 1,67-1,74 (m, 2H), 2,19-2,23 (m, 2H), 4,04-4,07 (m, 2H), 7,47-7,50 (m, 1H), 7,61 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 8,1 Hz, 1H).
B) Sintesis de acido 5-[4-(2-carboxi-etil)-fenil]-piridin-2-carboxi'lico
A 4 ml de 1,2-dimetoxietano se anaden acido 5-bromo-piridin-2-carboxilico (93 mg, 0,46 mmol) y acido 4-(2- carboxietil)bencenoboronico (106 mg, 0,55 mmol), 0,51 ml de una solucion acuosa 2 M de carbonato de sodio y diclorobis-(trifenilfosfina)paladio(II) (20 mg, 0,03 mmol) bajo una atmosfera de argon. La mezcla se agita a 90 °C durante la noche, se enfria y se inactiva con agua. Se anade acetato de etilo y el pH de la mezcla se ajusta a pH = 2 con acido clorhidrico 1 M. Despues de tres extracciones con acetato de etilo, las fases organicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se evaporan a vacio. El residuo se purifica por cromatografia en gel de silice (eluyente: diclorometano/metanol 5: 1).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,00 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,25 (dd, J = 8,2, 2,3 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 2,91 (t, J = 15, 7,5 Hz, 2H), 2,61 (t, J = 15,1,7,6 Hz, 2H).
EM: [M+H]+ 272,3.
Ejemplo 4
Procedimiento general para la sintesis de complejos de iridio
Un complejo dimerico reticulado con cloro (0,5 mmol), picolinato (1,25 mmol) y Na2CO3 (3 mmol) se mezclaron en 2- etoxietanol (12 ml) y la mezcla se calento a 120 0C durante 15 horas. A la mezcla enfriada se anadio agua destilada (25 ml), el producto bruto se separo luego por filtracion y se lavo con agua, seguido de porciones de n-hexano y Et2O. El producto se purifico por cromatografia en columna (silice, n-hexano/diclorometano) para dar un polvo rojo.
(Basado en Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001) 1704-1711).
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25
Acido Ir(6-fenilfenantridin)2-piridin-2-carboxilico:
1H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,17 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 9,09 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,71 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,62 (t, J = 14,8, 7,8 Hz, 2H), 8,43-8,33 (m, 4H), 8,23 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,92-7,77 (m, 4H), 7,65 (t, J = 15, 7,9 Hz, 2H), 7,57-7,46 (m, 3H), 7,36 (t, J = 14,8, 7,8 Hz, 1H), 7,19-7,16 (m, 2H), 7,10 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,04 (t, J = 14,2, 6,8 Hz, 1 H), 6,92 (t, J = 14,1, 6,7 Hz, 1H), 6,80 (t, J = 13,7, 6,8 Hz, 1H), 6,67 (t, J = 13,7, 6,6 Hz, 1H), 6,51 (d, J = 6,8 Hz, 1 H).
EM: [M+H]+ 826,4.
Acido Ir(6-fenilfenantridin)2-5-(metoxi)piridin-2-carboxilico:
1H-RMN (400 MHz, CDCI3) 5 9,15 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 9,09 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,70 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 8,44-8,35 (m, 3H), 8,21 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,97 (d, J = 2,7, 1H), 7,91-7,86 (m, 2H), 7,82-7,80 (m, 2H), 7,68 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,57-7,53 (m, 3H), 7,36 (t, J = 15,2, 7,2 Hz, 1H), 7,14 (t, J = 15,1, 7,6 Hz, 1H), 7,086,93 (m, 4H), 6,78 (t, J = 14,9, 7,6 Hz, 1H), 6,65 (t, J = 14,8, 7,6 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H).
EM: [M+H]+ 854,2.
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Acido Ir(6-fenilfenantridin)2-4-(hidroximetil)piridin-2-carboxilico:
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,14 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 8,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,87 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 8,73 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 8,68 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,51 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,26-8,24 (m, 2H), 8,10 (t, J = 14,7, 7,3 Hz, 1H), 8,02-7,96 (m, 3H), 7,68 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,62 (t, J = 15,2, 7,1 Hz, 1H), 7,53-7,48 (m, 2H), 7,39-7,37 (m, 2H), 7,16 (t, J = 15,3, 7,2 Hz, 1H), 7,10-7,04 (m, 2H), 6,86 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 6,78 (t, J = 14,2, 7,1 Hz, 1H), 6,67 (t, J = 14,9, 7,3 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 5,32 (s, 1H), 4,33 (s, 2H).
EM: [M+H]+ 854,2.
Acido Ir(6-fenilfenantridin)2-3-hidroxipiridin-2-carboxilico:
1H-RMN (400 MHz, CDCy 8 9,15 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 9,06 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,65-8,57 (m, 3H), 8,46-8,41 (m, 2H), 8,34 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,94-7,78 (m, 5H), 7,72 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,58-7,55 (m, 2H), 7,40 (t, J = 14,0, 7,0 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 15,2, 7,0 Hz, 1H), 7,05-6,95 (m, 5H), 6,77 (t, J = 13,7, 7,0 Hz, 1H), 6,66 (t, J = 13,6, 6,4 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 6,6 Hz, 1H).
EM: [M+H]+ 839,2.
Acido Ir(6-fenil-benzofenantridin)2-piridin-2-carboxilico:
1H-MN (400 MHz, CDCy 8 9,04 (m, 4H), 8,82 (m, 2H), 8,77-8,70 (m, 1H), 8,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,29-8,27 (m, 2H), 8,15-8,09 (m, 4H), 7,85 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,78-7,71 (m, 4H), 7,65 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,62-7,553 (m, 2H), 7,45-7,40 (m, 2H), 7,23-7,17 (m, 1H), 7,13-7,05 (m, 3H), 7,05-7,00 (m, 1H), 6,83 (dd, J = 10,8, 4,0 Hz, 1H), 6,68 (dd, J = 10,9, 3,8 Hz, 1H), 6,51 (dd, J = 7,6, 0,9 Hz, 1H).
EM: [M+H]+ 924,2.
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Acido Ir(6-fenilfenantridin)2-2-(carboxietil-fenil)piridin-2-carboxilico:
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,24 (m, 1H), 9,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,97 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,88 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 8,73 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,68 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 8,50 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,45 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 8,34 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 8,28 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 8,13-8,00 (m, 4H), 7,92 (dd, J = 8,1, 2,1 Hz, 1H), 7,63 (t, J= 15,2, 7,0 Hz, 2H), 7,54-7,42 (m, 3H), 7,35 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,17 (t, J = 15,2, 7,0 Hz, 1H), 7,10-7,06 (m, 3H), 7,02 (t, J = 15,7, 7,3 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 6,77 (t, J = 14,0, 7,1 Hz, 1H), 6,71 (t, J = 14,8, 7,0 Hz, 1H), 6,45 (d, J = 6,7 Hz, 1 H), 2,86 (t, J = 15,2, 7,5 Hz, 2H), 2,55 (t, J = 15,4, 7,7 Hz, 2H).
EM: [M+H]+ 972,3.
Si'ntesis de JM 360:
Una suspension de dimero de Ir (150 mg, 0,065 mmol), acido picolinico (17 mg, 0,137 mmol) y Na2CO3 (70 mg, 0,65 mmol) en 20 ml de diclorometano/etanol (4:1) se sometio a reflujo durante la noche. Despues de enfriar, la mezcla se concentro hasta sequedad. El residuo se purifico por cromatografia ultrarrapida en diclorometano/MeOH (gradiente de 100:0 a 10:1). El compuesto se recristalizo en diclorometano/Et2O.
Rendimiento: 30 %.
RMN:
1H-RMN (300 MHz, CDCy 5 9,06 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,98 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,61 (m, 3H), 8,46-8,21 (m, 4H), 8,13 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,83 (m, 4H), 7,61 (m, 2H), 7,57-7,41 (m, 3H), 7,30 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,24-7,12 (m, 1H), 6,89 (t, J = 7,2 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 8,9, 2,5 Hz, 1H), 6,61 (dd, J = 8,8, 2,6 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,99 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 3,85-3,41 (m, 32H), 3,34 (s, 3H), 3,33 (s, 3H).
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EM: [2M+2Na+]2+ calculado: 1258,4012, hallado: 1258,4030. [M+H]+ calculado: 1236,4197, hallado: 1236,4227. Ejemplo 5
ECL con un novedoso complejo de iridio
®
La senal de electroquimioluminiscencia de varios complejos metalicos se evaluo en un analizador ELECSYS (Roche Diagnostics GmbH). Las mediciones se llevaron a cabo de forma homogenea en ausencia de microparticulas paramagneticas recubiertas con estreptavidina. Las soluciones madre de cada complejo metalico a 0,1 mg/ml de DMSO se diluyeron con tampOn PBS dando como resultado soluciones 10 nM. Las soluciones 10 nM se manipularon como muestras en el analizador ELECSYS®. Se incubaron 20 pl de muestra junto con 90 pl de Reactivo 1 (ProCell) y 90 pl de Reactivo 2 (ProCell) durante 9 minutos a 37 °C y posteriormente se cuantificO la senal de electroquimioluminiscencia.
Resultados de la ECL:
Referencia Ru(bpy)3 = 10 000 en total en concentraciOn 10 nM
- JM 360 = 31 258 en total en concentraciOn 10 nM
- RC 72 = 45 512 en total en concentraciOn 10 nM RC 72
Ejemplo 6
Si'ntesis de un complejo de iridio con grupo reactivo para la bioconjugacion
El acido Ir(6-fenilfenantridin)2-2-(carboxietil-fenil)piridin-2-carboxilico (15 mg) se disolviO en una mezcla de acetonitrilo seco (5 ml) y piridina seca (0,01 ml). Se anadiO carbonato de disuccinimidilo (DSC) (1,5 equiv.) y la mezcla se agitO bajo nitrOgeno a temperatura ambiente durante la noche. La soluciOn se anadiO a cloroformo (10 ml), se lavO con HCl 0,5 M (1 x 2 ml), NaHCO3 acuoso saturado (1 x 2 ml) y agua (2 x 5 ml), se secO sobre MgSO4 y se concentrO a vacio para dar un polvo rojo.
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Ester N-succinimidilico del acido Ir(6-fenilfenantridin)2-2-(carboxietil-fenil)piridin-2-carboxilico:
1H-RMN (400 MHz, CD3CN) 8 9,25 (m, 1H), 9,17 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,75-8,68 (m, 1H), 8,60-8,54 (m, 3H), 8,47 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,43 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,06 (t, J = 15,4, 7,2 Hz, 1 H), 7,97-7,95 (m, 3H), 7,77-7,70 (m, 2H), 7,61 (t, J = 15,2, 7,0 Hz, 1H), 7,52-7,44 (m, 3H), 7,36 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,18 (t, J = 15,2, 7,0 Hz, 1H), 7,12-7,09 (m, 3H), 7,04-6,98 (m, 2H), 6,78 (t, J = 14,9, 7,2 Hz, 1H), 6,71 (t, J = 14,8, 7,5 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,07-3,01 (m, 4H), 2,80 (s, 4H).
EM: [M+H]+ 1069,3
Ejemplo 7
Sintesis de un complejo de iridio conjugado con biotina
El ester NHS del acido Ir(6-fenilfenantridin)2-2-(carboxietil-fenil)piridin-2-carboxilico (12 mg) y trifluoroacetato de N- biotinil-3,6-dioxaoctan-1,8-diamina (4 mg) se disolvieron en DMF seca (5 ml). Se anadio piridina (0,016 ml en 2 ml de DMF) y la mezcla se agito bajo nitrogeno a temperatura ambiente durante la noche. La solucion se anadio a cloroformo (10 ml), se lavo con HCl 0,5 M (1 x 2 ml), NaHCO3 acuoso saturado (1 x 2 ml) y agua (2 x 5 ml), se seco sobre MgsO4 y se concentro a vacio para dar un polvo rojo. El producto se purifico por cromatografia en columna (silice, n-hexano/acetato de etilo) para dar polvo rojo.
Claims (10)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Un compuesto quimioluminiscente basado en iridio de Formula I
imagen1 en la que R1-R16 es hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, amino, alquilamino, alquilamino sustituido, arilamino, arilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o R17, en la que R17 es arilo, arilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, alquilo ramificado, alquilo ramificado sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o,en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo aromatico o un anillo aromatico sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato o,en la que en R1-R12 y/o en R13-R16, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo alifatico o un anillo alifatico sustituido, en el que el sustituyente se selecciona entre hidrogeno, haluro, grupo ciano o nitro, un grupo hidrofilo como amino, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, ester de acido carboxilico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonamida, sulfoxido, sulfodioxido, fosfonato, fosfinato y,en el que al menos uno de R13-R16 es -Q-Y, en el que Q representa un conector e Y es un grupo funcional y en el que el grupo funcional Y se selecciona del grupo que consiste en acido carboxilico, ester de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halogeno, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, azida y fosforamidita. - 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el conector Q es una cadena alquilo C1-C20 saturada, insaturada, no sustituida o sustituida, lineal o ramificada o una cadena de 1 a 20 atomos con una cadena principal que consta de atomos de carbono y uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, N y S.
- 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el conector Q es una cadena alquilo C1-C1251015202530saturada o una cadena de 1 a 12 atomos con una cadena principal que consta de atomos de carbono y uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, N y S.
- 4. Un conjugado que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y, unido covalentemente al mismo, un agente de union por afinidad.
- 5. El conjugado de la reivindicacion 4, en el que el agente de union por afinidad se selecciona del grupo que consiste en antigeno y anticuerpo, biotina o analogo de biotina y avidina o estreptavidina, azucar y lectina, acido nucleico o analogo de acido nucleico y acido nucleico complementario y receptor y ligando.
- 6. El conjugado de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, en el que dicho agente de union por afinidad es un acido nucleico o un anticuerpo.
- 7. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para realizar una reaccion de electroquimioluminiscencia en una solucion acuosa.
- 8. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en un procedimiento de deteccion basado en electroquimioluminiscencia.
- 9. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en la deteccion de un analito.
- 10. Un procedimiento para medir un analito mediante un procedimiento in vitro, comprendiendo el procedimiento las etapas dea) proporcionar una muestra que se sospecha o se sabe que comprende el analito,b) poner en contacto dicha muestra con un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en condiciones apropiadas para la formacion de un complejo de conjugado de analito,c) medir el complejo formado en la etapa (b) y obtener de este modo una medida del analito.
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