ES2645082T3 - Métodos y composiciones de tratamiento de heridas y reducción del riesgo de hernias incisionales - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de un sitio de una incisión abdominal en un sujeto, comprendiendo la composición farmacéutica un primer agente de material precursor que comprende fibrinógeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partículas de plata.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones de tratamiento de heridas y reduccion del riesgo de hernias incisionales Introduccion

Las hernias incisionales son una complicacion frecuente de la cirugla abdominal, lo que resulta en una considerable morbilidad del paciente y un aumento de los costes sanitarios. Se realizan anualmente en los Estados Unidos 4-5 millones de incisiones abdominales (laparotomlas) con hernias resultantes tras el 11-23 % de estos procedimientos. Las hernias incisionales pueden resultar en una morbilidad grave mas alla de la deformidad cosmetica de una protusion visible en la pared abdominal anterior, incluyendo obstruccion intestinal, isquemia intestinal, fistula enterocutanea y limitaciones significativas en la actividad flsica del paciente y el empleo remunerado. En consecuencia, cada ano se realizan mas de 400.000 reparaciones de hernias incisionales por lo que es uno de los procedimientos mas comunes realizados por los cirujanos generales. Se estima que el aumento en los EE.UU. de los costes sanitarios debido a la reparacion de la hernia incisional excede actualmente ocho mil millones de dolares por ano, sin incluir los costes de las prestaciones por desempleo para esta poblacion de pacientes moderadamente joven. Las investigaciones indican que las hernias incisionales son el resultado de una curacion inadecuada o deficiente de la pared abdominal miofascial tras la cirugla. Por consiguiente, cada uno de los factores de riesgo reconocidos para la formation de una hernia inhibe la cicatrization, incluyendo obesidad morbida, diabetes, tabaquismo, enfermedad pulmonar cronica, infection del sitio quirurgico y una deficiente tecnica quirurgica. Dado que la incidencia de los principales factores de riesgo va en aumento, se preve que aumente tambien la prevalencia de las hernias incisionales.

A pesar de la magnitud e importancia de la condition cllnica, la investigation centrada en la prevention de las hernias incisionales es escasa. Si bien los estudios actuales y los esfuerzos de investigacion se centran en la mejora de los materiales de reparacion y las tecnicas quirurgicas, la solution optima al problema de las hernias incisionales es la prevencion.

El documento WO 01/97826 desvela una composition hemostatica que comprende al menos un ion procoagulante metalico y al menos un biopollmero procoagulante. El documento WO 99/42146 desvela un producto que comprende trombina y micropartlculas que tienen fibrinogeno unido, como una preparation para su uso en terapia de heridas o reparacion quirurgica.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento de un sitio de la incision abdominal en un sujeto, la composicion farmaceutica comprende un primer agente de material precursor que comprende fibrinogeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partlculas de plata.

En una realization, en la composicion farmaceutica, el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata se adaptan para combinarse in situ.

En una realizacion, el primer agente de material precursor se aplica antes de la aplicacion del segundo agente de material precursor. En una realizacion, el segundo agente de material precursor se aplica antes de la aplicacion del primer agente de material precursor.

En un aspecto, en la composicion farmaceutica, las partlculas de plata son micropartlculas de plata. En un aspecto adicional, las partlculas de plata son esfericas.

En realizaciones adicionales, las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 5 pm o mas. En aspectos adicionales, las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 200 pm o mas.

En algunos aspectos, la composicion farmaceutica comprende 25 mg/ml de partlculas de plata. En aspectos adicionales, la composicion farmaceutica comprende 250 mg/ml de partlculas de plata.

Se proporciona asimismo un dispositivo para aplicar una composicion farmaceutica para tratar una herida en un sujeto, comprendiendo el dispositivo, un recipiente esteril que contiene un primer agente de material precursor que comprende fibrinogeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partlculas de plata en una cantidad eficaz para tratar un sitio de la incision abdominal.

En una realizacion, el recipiente esteril comprende una primera camara que contiene el primer agente de material precursor, una segunda camara que contiene el segundo agente de material precursor y una tercera camara que contiene las partlculas de plata. En una realizacion adicional, el recipiente esteril comprende una jeringa.

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La invencion tambien proporciona un kit que comprende un recipiente esteril que contiene el primer agente de material precursor que comprende fibrinogeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partlculas de plata en una cantidad eficaz para tratar un sitio de la incision abdominal y un paquete sellado configurado para mantener la esterilidad del recipiente esteril.

Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 muestra graficos de: FIG. 1A, el porcentaje de hernias incisionales cllnicas en ratas Sprague-Dawley (machos, 250-300 g) tratadas con diferentes dosis de micropartlculas de plata frente a una solucion salina y solamente pegamento de fibrina (controles); y FIG. 1B, las areas de hernia anatomica con dosis variables de controles de micropartlculas de plata, solucion salina y pegamento de fibrina, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgacion. Los resultados son la desviacion media y estandar.

La FIG. 2 muestra una fotomicrografla de una seccion transversal tenida con hematoxilina-eosina de una incision fascial que se esta curando tratada con plata en el dla post-operatorio 28, que revelo micropartlculas de plata, una reaccion a cuerpos extranos (p. ej., infiltrado inflamatorio que consiste en celulas gigantes sin histiocitos epitelioides), y fibrosis de la herida precoz que consiste en fibras de colageno y no hay granulomas evidentes (aumento de 40X), de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgacion.

La FIG. 3 muestra un grafico del tamano de la herida (%) frente al tiempo (semanas) de experimentos de cicatrizacion de raton diabetico para las composiciones de la presente divulgacion en comparacion con un control negativo, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgacion.

Antes de que la presente invencion se describa con mayor detalle, queda entendido que esta invencion no se limita a las realizaciones particulares descritas, y como tal, pueden por supuesto, variar. Queda entendido tambien que la terminologla usada en la presente memoria es meramente para el fin de describir realizaciones particulares, y no tiene por objeto ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion se materializa en las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, queda entendido que cada valor intermedio, hasta la decima de la unidad del llmite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el llmite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, se engloba dentro de la invencion. Los llmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos y estan abarcados tambien dentro de la invencion, sujetos a cualquier llmite especlficamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos llmites, los intervalos que excluyen uno cualquiera o ambos de esos llmites incluidos estan incluidos tambien en la invencion.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comunmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta invencion. Aunque puede usarse tambien cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la practica o ensayo de la presente invencion, a continuacion se describen los metodos y materiales ilustrativos y representativos.

Cabe senalar que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el", y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe senalar ademas que las reclamaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaration tiene por objeto servir como base antecedente para el uso de una terminologla tan exclusiva como "unicamente", "solo" y similares en relation con la recitation de los elementos de la revindication o el uso de una limitation "negativa".

Como resultara evidente para los expertos en la materia tras la lectura de la presente divulgacion, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en la presente memoria tiene componentes distintos y caracterlsticas que pueden separarse con facilidad o combinarse con las caracterlsticas de cualquiera de las muchas otras realizaciones. Cualquier metodo indicado puede llevarse a cabo en el orden de eventos indicados o en cualquier otro orden que sea logicamente posible.

La referencia a cualquier publication es para su divulgacion antes de la fecha de presentation y no deberla interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a anteceder a dicha publicacion en virtud de una invencion previa. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas podrlan ser diferentes de las fechas de publicacion vigentes que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.

Descripcion detallada

La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas para su uso en un metodo de tratamiento de un sitio de la incision abdominal en un sujeto, conforme se describe en las reivindicaciones.

Asimismo se desvela en la presente memoria metodos y composiciones de tratamiento de una herida en un sujeto. Los metodos incluyen la aplicacion de una composition farmaceutica que incluye un primer agente de material

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precursor que incluye fibrinogeno, un segundo agente de material precursor que incluye trombina y partlcuias de plata en un sitio de la incision abdominal en una cantidad eficaz para tratar el sitio de la incision abdominal. Tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas y dispositivos para su uso en los metodos en cuestion.

A continuacion, se describen en primer lugar los metodos en cuestion con mayor detalle para tratar una herida en un sujeto, seguido de un examen de las composiciones y dispositivos que encuentran uso en los metodos en cuestion, as! como una discusion de diversas aplicaciones representativas en las que los metodos en cuestion, composiciones y dispositivos encuentran uso.

METODOS

Los aspectos de la presente divulgacion incluyen un metodo de tratamiento de una herida en un sujeto. El metodo incluye la aplicacion de una composicion farmaceutica que incluye un primer agente de material precursor que incluye fibrinogeno, un segundo agente de material precursor que incluye trombina y partlculas de plata a un sitio de la incision abdominal en una cantidad eficaz para tratar el sitio de la incision abdominal. Como tal, en algunos casos, el tratamiento de una herida en un sujeto incluye la aplicacion de la composicion farmaceutica a una herida en el sujeto, tal como un sitio de la incision abdominal en el sujeto.

Por "tratamiento" o "tratar" se entiende aliviar, prevenir, curar, reducir la aparicion, etc., de una afeccion en un sujeto. En algunos casos, la reduccion de la aparicion incluye la disminucion de la gravedad y/o incidencia de una afeccion en un sujeto. En algunos casos, la reduccion de la aparicion incluye la reduccion del riesgo de aparicion de una afeccion en un sujeto o grupo de sujetos. Por ejemplo, en un grupo de sujetos, una reduccion del 50 % en el riesgo de aparicion de una afeccion significa que, en promedio, la afeccion es detectable en el 50 % de los sujetos en el grupo, mientras la afeccion no sea significativamente detectable en el otro 50 % de los sujetos del grupo. Los porcentajes pueden usarse cuando se hace referencia a un grupo de sujetos o a un sujeto individual. En ciertos casos, la afeccion incluye una hernia, tal como una hernia incisional. Por ejemplo, la hernia incisional puede encontrarse en un sitio de la incision abdominal, tal como un sitio de la incision abdominal realizada en un procedimiento quirurgico.

En ciertos casos, el tratamiento de una herida incluye la promocion de la curacion de la herida. En algunos casos, la promocion de la curacion de una herida incluye un aumento en la eficacia de la cicatrizacion y/o un aumento en la resistencia del sitio de la herida curada resultante en comparacion con una herida que no ha sido tratada con los metodos y composiciones de la presente divulgacion. En algunos casos, la promocion de curacion de una herida incluye la reduccion de la aparicion de una cicatrizacion defectuosa y/o reduccion de la gravedad de la cicatrizacion anormal en comparacion con una herida que no ha sido tratada con los metodos y composiciones de la presente divulgacion. En ciertas realizaciones, el metodo de tratamiento de una herida en un sujeto reduce el riesgo de hernia incisional en el sujeto. Por "hernia incisional" se entiende una hernia que se produce en un sitio de la incision e implica la cicatrizacion anormal o incompleta a nivel subcutaneo (p. ej., a nivel del musculo o fascia). En algunos casos, la cicatrizacion anormal o incompleta puede dar lugar a una mayor susceptibilidad a una hernia incisional. Por "reducir el riesgo" se entiende que el riesgo de la aparicion de una hernia incisional en un sujeto tratado por el metodo de la presente divulgacion es menor que en un sujeto que no ha sido tratado por el metodo de la presente divulgacion. En algunos casos, el metodo reduce el riesgo de hernia incisional en un 30 % o mas, tal como 35 % o mas, incluyendo 40 % o mas, o 45 % o mas, o 50 % o mas, o 55 % o mas, o 60 % o mas, o 65 % o mas, o 70 % o mas, o 75 % o mas, u 80 % o mas, u 85 % o mas, o 90 % o mas, o 95 % o mas, por ejemplo, en un 99 % o mas. En ciertos casos, el metodo reduce el riesgo de hernia incisional en un 60 % o mas. Por ejemplo, el metodo puede reducir el riesgo de una hernia cllnica en un sujeto. Por "hernia cllnica" se entiende una hernia que se observa (p. ej., por la vista, tacto, sonido, olor, etc.) durante el tratamiento de un paciente, en lugar de determinarse a traves de estudios de laboratorio. Por ejemplo, una hernia cllnica puede observarse como una protusion visible en la pared abdominal.

En ciertas realizaciones, el metodo de tratamiento de una herida en un sujeto que reduce la gravedad de una hernia en un sujeto deberla producir una hernia en el sujeto. En algunos casos, una reduccion en la gravedad de la hernia corresponde a una reduccion en el tamano de la hernia en el sujeto. Por ejemplo, el metodo puede reducir el tamano de una hernia anatomica en un sujeto. Por "hernia anatomica" se entiende una hernia que es detectable por metodos distintos, o ademas de, la observacion cllnica (p. ej., por diseccion del sujeto, IRM, TC, ultrasonidos y similares). El tamano de una hernia anatomica se puede medir mediante la determinacion de la separacion entre los musculos abdominales (p. ej., musculos rectos) en el sitio de la incision. Por ejemplo, el tamano de una hernia anatomica puede estimarse multiplicando el diametro craneocaudal maximo por el promedio de dos mediciones de diametro transversal (p. ej., aproximacion de una elipse). En algunos casos, el metodo reduce el tamano de una hernia incisional en un 15 % o mas, tal como 20 % o mas, incluyendo 25 % o mas, o 30 % o mas, tal como 35 % o mas, incluyendo 40 % o mas, o 45 % o mas, o 50 % o mas, o 55 % o mas, o 60 % o mas, o 65 % o mas, o 70 % o mas, o 75 % o mas, u 80 % o mas, u 85 % o mas, o 90 % o mas, o 95 % o mas, por ejemplo, en un 99 % o mas. En ciertos casos, el metodo reduce el riesgo de hernia incisional en un 55 % o mas.

En ciertas realizaciones, el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata se adaptan para combinarse in situ. Por ejemplo, el primer agente de material precursor, el

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segundo agente de material precursor y las partlculas de plata pueden adaptarse para combinarse en el sitio de la incision abdominal a medida que el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata se aplican al sitio de la incision abdominal. Por consiguiente, en algunos casos, el metodo incluye la combinacion del primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata in situ (p. ej., en el sitio de la incision abdominal). Por ejemplo, la aplicacion de la composicion farmaceutica puede incluir la aplicacion del primer agente de material precursor antes de la aplicacion del segundo agente de material precursor. En algunos casos, el primer agente de material precursor se aplica inmediatamente antes de la aplicacion del segundo agente de material precursor. En otros casos, la aplicacion de la composicion farmaceutica incluye la aplicacion del segundo agente de material precursor antes de la aplicacion del primer agente de material precursor. Por ejemplo, el segundo agente de material precursor se puede aplicar inmediatamente antes de la aplicacion del primer agente de material precursor. En otras realizaciones, el primer y segundo agentes de material precursor se aplican de forma esencialmente simultanea. En otras realizaciones, el primer y segundo agentes de material precursor se combinan entre si para formar la composicion farmaceutica antes de la aplicacion de la composicion farmaceutica en el sitio de la incision abdominal. Por ejemplo, el primer y segundo agentes de material precursor se combinan entre si para formar la composicion farmaceutica inmediatamente antes de la aplicacion de la composicion farmaceutica en el sitio de la incision abdominal.

Las partlculas de plata pueden combinarse con el primer y segundo agentes de material precursor en cualquier etapa deseada del proceso de aplicacion. Por ejemplo, las partlculas de plata pueden combinarse con el primer agente de material precursor antes de la combinacion del primer agente de material precursor con el segundo agente de material precursor, como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones, las partlculas de plata pueden combinarse con el segundo agente de material precursor antes de la combinacion del primer agente de material precursor con el segundo agente de material precursor, como se ha descrito anteriormente. En algunas otras realizaciones, las partlculas de plata pueden combinarse con el primer y segundo agentes de material precursor despues de la combinacion del primer agente de material precursor con el segundo agente de material precursor entre si, como se ha descrito anteriormente. En algunas otras realizaciones, el primer y segundo agentes de material precursor y las partlculas de plata se combinan esencialmente al mismo tiempo. Por ejemplo, el primer y segundo agentes de material precursor y las partlculas de plata pueden combinarse in situ como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones, las partlculas de plata se combinan con el primer y segundo agentes de material precursor para formar la composicion farmaceutica antes de la aplicacion de la composicion farmaceutica en el sitio de la incision abdominal. Por ejemplo, el primer y segundo agentes de material precursor y las partlculas de plata pueden combinarse entre si para formar la composicion farmaceutica inmediatamente antes de la aplicacion de la composicion farmaceutica en el sitio de la incision abdominal. En otras realizaciones, las partlculas de plata se combinan con tanto el primer como el segundo agente de material precursor antes de la combinacion del primer y segundo agentes de material precursor entre si para formar la composicion farmaceutica.

En ciertas realizaciones, el metodo incluye la administracion de la composicion farmaceutica en una cantidad eficaz para tratar el sitio de la incision abdominal. Por "cantidad eficaz" se entiende una dosificacion suficiente como para causar un efecto significativamente detectable en el sujeto diana, segun se desee. En algunos casos, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica es una cantidad de la composicion farmaceutica suficiente para inducir una reaccion a cuerpos extranos en el sujeto en el sitio de aplicacion. En ciertos casos, la reaccion a cuerpos extranos incluye infiltrado inflamatorio que consiste en celulas gigantes sin histiocitos epitelioides. En ciertos casos, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica incluye 10 mg/ml de partlculas de plata o mas, tal como 25 mg/ml de partlculas de plata o mas, incluyendo 50 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 75 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 100 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 150 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 200 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 250 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 300 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 350 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 400 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 450 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 500 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 550 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 600 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 650 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 700 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 750 mg/ml de partlculas de plata o mas. En ciertos casos, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica incluye 50 mg/ml de partlculas de plata. En algunos casos, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica incluye 500 mg/ml de partlculas de plata.

En ciertas realizaciones, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica incluye una relacion peso/peso de partlculas de plata a fibrinogeno de 0,1 (peso/peso) o mas, o 0,2 (peso/peso) o mas, o 0,3 (peso/peso) o mas, o 0,4 (peso/peso) o mas, o 0,5 (peso/peso) o mas, o 0,6 (peso/peso) o mas, o 0,7 (peso/peso) o mas, o 0,8 (peso/peso) o mas, o 0,9 (peso/peso) o mas, o 1 (peso/peso) o mas, o 1,1 (peso/peso) o mas, o 1,2 (peso/peso) o mas, o 1,3 (peso/peso) o mas, o 1,4 (peso/peso) o mas, o 1,5 (peso/peso) o mas, o 1,6 (peso/peso) o mas, o 1,7 (peso/peso) o mas, o 1,8 (peso/peso) o mas, o 1,9 (peso/peso) o mas, o 2 (peso/peso) o mas, o 2,1 (peso/peso) o mas, o 2,2 (peso/peso) o mas, o 2,3 (peso/peso) o mas, o 2,4 (peso/peso) o mas, o 2,5 (peso/peso) o mas, o 2,6 (peso/peso) o mas, o 2,7 (peso/peso) o mas, o 2,8 (peso/peso) o mas, o 2,9 (peso/peso) o mas, o 3 (peso/peso) o mas. Por ejemplo, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica puede incluir una relacion en peso/peso de partlculas de plata a fibrinogeno de 2,2 (peso/peso) o mas.

En ciertas realizaciones, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica incluye una cantidad de partlculas de plata, como se describe en la presente memoria, aplicada a una determinada superficie de la herida, tal como 0,5

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22222 mas, u 8 cm o mas, o 9 cm o mas, o 10 cm o mas, u 11 cm o mas, o 12 cm o mas, o 13 cm o mas, o 14 cm o 2 2 2 2 2 2 2 mas, o 15 cm o mas, o 16 cm o mas, o 17 cm o mas, o 18 cm o mas, o 19 cm o mas, o 20 cm o mas, o 25 cm 22222 o mas, o 30 cm o mas, o 35 cm o mas, o 40 cm o mas, o 45 cm o mas, o 50 cm o mas. Por ejemplo, una

cantidad eficaz de la composicion farmaceutica puede incluir una cantidad de partlculas de plata, tal como 250

mg/ml, aplicada a una superficie de la herida de 10 cm2 o mas. En algunos casos, una cantidad eficaz de la

composicion farmaceutica puede incluir una cantidad de partlculas de plata, tal como 2,2 (peso/peso), aplicada a

una superficie de la herida de 10 cm2 o mas.

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS

Los aspectos de la presente divulgacion incluyen una composicion farmaceutica para el tratamiento de una herida en un sujeto. En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye un pegamento de fibrina y partlculas de plata en una cantidad eficaz para tratar un sitio de la incision abdominal. Por "composicion farmaceutica" se entiende una composicion que incluye uno o mas agentes terapeuticos usados en la prevencion, diagnostico, alivio, tratamiento o cura de una enfermedad o afeccion en un sujeto (p. ej., un sujeto animal o humano).

En ciertas realizaciones, el pegamento de fibrina incluye al menos un primer agente de material precursor y un segundo agente de material precursor. El primer agente de material precursor puede incluir fibrinogeno y el segundo agente de material precursor puede incluir trombina. El pegamento de fibrina es un biopollmero formado por la adicion de trombina a fibrinogeno. La trombina es un iniciador o catalizador que escinde enzimaticamente el fibrinogeno que altera la carga y conformation de la molecula, formando un monomero de fibrina. Los monomeros de fibrina se agregan entonces formando el biopollmero de fibrina. Despues de la combination de los dos componentes de trombina y fibrinogeno, la solution permanece en estado llquido durante varios segundos antes de la polimerizacion. El agente de pegamento de fibrina, ya sea inmediatamente despues de la mezcla de los materiales precursores o mediante la administration de los materiales por separado para su mezcla in situ, se adapta por lo tanto para administrarse en el sitio de la herida en el sujeto a traves de una jeringa, cateter u otros inyectores, requiriendo as! solamente un procedimiento mlnimamente invasivo. El pegamento de fibrina tambien es biocompatible y no toxico para el sujeto. Otros ejemplos de pegamento de fibrina que pueden ser utiles de acuerdo con diversos aspectos de la presente divulgacion se describen en las siguientes referencias: "Fibrin sealant adhesive systems: a review of their chemistry, material properties and clinical applications" J Biomater Appl. 1993;7:309-52 y patente de Estados Unidos n.° 5.962.405. En ciertas realizaciones, el pegamento de fibrina incluye componentes adicionales, tales como, entre otros, un inhibidor de la fibrinolisis, albumina (p. ej., albumina humana), citrato de tri- sodio, histidina, niacinamida, polisorbato 80, agua (p. ej., agua esteril, tal como agua para inyeccion), cloruro de calcio, cloruro de sodio, combinaciones de los mismos, y similares. Por ejemplo, el primer agente de material precursor puede incluir, ademas de fibrinogeno, uno o mas de un inhibidor de la fibrinolisis, albumina (p. ej., albumina humana), citrato de tri-sodio, histidina, niacinamida, polisorbato 80, agua (p. ej., agua esteril, tal como agua para inyeccion), y similares. En algunos casos, el segundo agente de material precursor puede incluir, ademas de trombina, uno o mas de albumina (p. ej., albumina humana), agua (p. ej., agua esteril, tal como agua para inyeccion), cloruro de calcio, cloruro de sodio, y similares. Ejemplos adicionales de componentes que pueden incluirse en el pegamento de fibrina incluyen, entre otros, inhibidores de la proteasa, tales como aprotinina.

Como se ha descrito anteriormente, en ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye partlculas de plata. Las partlculas de plata pueden ser micropartlculas de plata. En algunos casos, el tamano de las micropartlculas de plata es suficiente para inducir una reaction a cuerpos extranos en el sujeto en el sitio de aplicacion. Por ejemplo, las micropartlculas tienen un diametro medio que oscila de 2 pm a 1.000 pm. En comparacion, las nanopartlculas tienen un diametro medio de 1 nm a 1.000 nm. En algunos casos, las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 2 pm o mas, tal como 3 pm o mas, incluyendo 4 pm o mas, o 5 pm o mas, o 7 pm o mas, o 10 pm o mas, o 15 pm o mas, o 20 pm o mas, o 25 pm o mas, o 50 pm o mas, o 75 pm o mas, o 100 pm o mas, o 150 pm o mas, o 200 pm o mas, o 250 pm o mas o 500 pm o mas. Por ejemplo, las micropartlculas de plata pueden tener un diametro medio que oscila de 2 pm a 1.000 pm, tal como de 2 pm a 750 pm, incluyendo de 3 pm a 500 pm, o de 5 pm a 250 pm. En ciertos casos, las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 5 pm o mas. En algunos casos, las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 200 pm o mas. En algunas realizaciones, las micropartlculas de plata incluyen una mezcla de micropartlculas de plata que tienen un intervalo de diferentes tamanos en los tamanos que se han descrito anteriormente. Como se usa en la presente memoria, el termino "medio" es la media aritmetica.

En ciertos casos, las partlculas de plata tienen una forma esencialmente simetrica. Por ejemplo, las partlculas de plata pueden tener una forma que es esencialmente esferica, ellptica, cillndrica, y similares. En algunas realizaciones, las partlculas de plata tienen una forma esencialmente esferica. En otras realizaciones, las partlculas de plata pueden tener una forma irregular. En ciertos casos, las partlculas de plata tienen una superficie exterior esencialmente lisa. En otros casos, las partlculas de plata tienen una superficie exterior con textura (p. ej., rugosa). En algunos casos, las partlculas de plata incluyen una mezcla de partlculas de plata que tienen diferentes formas y/o texturas como se ha descrito anteriormente. En ciertos casos, las partlculas de plata tienen una forma y/o textura suficientes para inducir una reaccion a cuerpos extranos en el sujeto en el sitio de aplicacion. Por ejemplo, las partlculas de plata pueden tener una forma esferica, una forma de barra, una forma de estrella, una forma irregular,

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combinaciones de las mismas, y similares.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye 10 mg/ml de partlculas de plata o mas, tal como 25 mg/ml de partlculas de plata o mas, incluyendo 50 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 75 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 100 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 150 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 200 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 250 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 300 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 350 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 400 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 450 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 500 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 550 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 600 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 650 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 700 mg/ml de partlculas de plata o mas, o 750 mg/ml de partlculas de plata o mas. En ciertos casos, la composicion farmaceutica incluye 50 mg/ml de partlculas de plata. En algunos casos, la composicion farmaceutica incluye 500 mg/ml de partlculas de plata.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye una relacion en peso/peso de partlculas de plata a fibrinogeno de 0,1 (peso/peso) o mas, o 0,2 (peso/peso) o mas, o 0,3 (peso/peso) o mas, o 0,4 (peso/peso) o mas, o 0,5 (peso/peso) o mas, o 0,6 (peso/peso) o mas, o 0,7 (peso/peso) o mas, o 0,8 (peso/peso) o mas, o 0,9 (peso/peso) o mas, o 1 (peso/peso) o mas, o 1,1 (peso/peso) o mas, o 1,2 (peso/peso) o mas, o 1,3 (peso/peso) o mas, o 1,4 (peso/peso) o mas, o 1,5 (peso/peso) o mas, o 1,6 (peso/peso) o mas, o 1,7 (peso/peso) o mas, o 1,8 (peso/peso) o mas, o 1,9 (peso/peso) o mas, o 2 (peso/peso) o mas, o 2,1 (peso/peso) o mas, o 2,2 (peso/peso) o mas, o 2,3 (peso/peso) o mas, o 2,4 (peso/peso) o mas, o 2,5 (peso/peso) o mas, o 2,6 (peso/peso) o mas, o 2,7 (peso/peso) o mas, o 2,8 (peso/peso) o mas, o 2,9 (peso/peso) o mas, o 3 (peso/peso) o mas. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede incluir una relacion en peso/peso de partlculas de plata a fibrinogeno de 2,2 (peso/peso) o mas.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye una cantidad de partlculas de plata, como se describe en la presente memoria, aplicada a una determinada superficie de la herida, tal como 0,5 cm2 o mas, o 1 cm o mas, o 2 cm o mas, o 3 cm o mas, o 4 cm o mas, o 5 cm o mas, o 6 cm o mas, o 7 cm o mas, u 8 cm o mas, o 9 cm o mas, o 10 cm o mas, u 11 cm o mas, o 12 cm o mas, o 13 cm o mas, o 14 cm o mas, o 15 cm o mas, o 16 cm o

mas, o 17 cm o mas, o 18 cm o mas, o 19 cm o mas, o 20 cm o mas, o 25 cm o mas, o 30 cm o mas, o 35 cm o

mas, o 40 cm2 o mas, o 45 cm2 o mas, o 50 cm2 o mas. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede incluir una

cantidad de partlculas de plata, tal como 250 mg/ml, aplicada a una superficie de la herida de 10 cm2 o mas. Se

pueden utilizar otras cantidades de partlculas de plata por superficie de la herida, tal como cualquiera de varios mg/ml de partlculas de plata descrita en la presente memoria aplicada a cualquier variedad de superficies de la herida como se describe en la presente memoria. En algunos casos, la composicion farmaceutica puede incluir una cantidad de partlculas de plata, tal como 2,2 (peso/peso), aplicada a una superficie de la herida de 10 cm2 o mas.

En ciertas realizaciones, las partlculas de plata son esencialmente solidas. Las partlculas esencialmente solidas pueden, en algunos casos, ser porosas (p. ej., microporosas, nanoporosas, etc.). No obstante, las partlculas esencialmente solidas no abarcan partlculas huecas que tengan un espacio vaclo rodeado por un recubrimiento. En estas realizaciones, las partlculas de plata no incluyen partlculas huecas. En ciertos casos, las partlculas de plata no incluyen un material polimerico. Por ejemplo, las partlculas de plata pueden incluir solamente plata (p. ej., plata, oxido de plata, iones de plata, etc.).

DISPOSITIVOS

Aspectos de la presente divulgacion incluyen un dispositivo para aplicar una composicion farmaceutica para el tratamiento de una herida en un sujeto. El dispositivo incluye un recipiente esteril que contiene un primer agente de material precursor que incluye fibrinogeno, un segundo agente de material precursor que incluye trombina y partlculas de plata en una cantidad eficaz para tratar un sitio de la incision abdominal. Por "esteril" se entiende que no existen practicamente microbios (tales como hongos, bacterias, virus, esporas, etc.).

En ciertas realizaciones, el recipiente esteril se configura para mantener el primer y segundo agentes de material precursor en camaras separadas durante el almacenamiento y hasta su uso. En algunos casos, el recipiente esteril incluye dos o mas camaras que incluyen los agentes de material precursor para el pegamento de fibrina. Por ejemplo, el recipiente esteril puede incluir una primera camara que incluye un primer agente de material precursor (p. ej., fibrinogeno) y una segunda camara que incluye un segundo agente de material precursor, (p. ej., trombina). La primera y segunda camaras pueden ser camaras distintas que no permiten que el primer y segundo agentes de material precursor se pongan en contacto entre si hasta su uso.

En algunos casos, el recipiente esteril se configura para mantener el primer y segundo agentes de material precursor y las partlculas de plata en camaras separadas durante el almacenamiento y hasta su uso. Por ejemplo, el recipiente esteril puede incluir la primera y segunda camaras como se ha descrito anteriormente y una tercera camara que contiene las partlculas de plata. Las partlculas de plata pueden proporcionarse en un disolvente apropiado. Por ejemplo, las partlculas de plata pueden proporcionarse en un disolvente, tal como, entre otros, agua, una solucion (p. ej., solucion de cloruro de calcio), un tampon, y similares. La primera, segunda y tercera camaras pueden ser camaras distintas que no permiten que el primer y segundo agentes de material precursor y las partlculas de plata se pongan en contacto entre si hasta su uso.

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En algunos casos, el recipiente esteril incluye una boquilla. La boquilla puede estar en comunicacion fluida con las dos o mas camaras del recipiente esteril. Por ejemplo, la boquilla puede estar en comunicacion fluida con la primera, segunda y tercera camaras como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, el recipiente esteril se configura para dispensar el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata a traves de una unica boquilla. En estas realizaciones, el recipiente esteril puede configurarse para mezclar el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata a medida que el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata se dispensen desde el contenedor esteril a traves la boquilla. Las realizaciones del recipiente esteril que incluye una boquilla como se ha descrito anteriormente pueden facilitar la mezcla y aplicacion in situ del primer agente de material precursor, del segundo agente de material precursor y de las partlculas de plata a un sitio de la incision abdominal.

En ciertas realizaciones, el recipiente esteril incluye una jeringa. La jeringa puede incluir una primera camara, una segunda camara y una tercera camara como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la jeringa puede configurarse como una jeringa de tres cilindros con cada tubo separado que contiene uno del primer agente de material precursor, del segundo agente de material precursor o de las partlculas de plata.

Las realizaciones del dispositivo para la aplicacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de una herida en un sujeto tambien pueden incluir otros tipos de dispositivos convenientemente adaptados para aplicar la composicion farmaceutica al sujeto. Por ejemplo, el dispositivo puede incluir un recipiente presurizado. El recipiente presurizado puede incluir una o mas camaras como se ha descrito anteriormente (p. ej., una primera camara, una segunda camara, una tercera camara, etc.). El recipiente presurizado puede configurarse para mantener el contenido de las una o mas camaras a una presion mayor que la presion atmosferica convencional. En algunos casos, el recipiente presurizado incluye una valvula, y puede configurarse para dispensar el contenido de las una o mas camaras cuando la valvula esta en una posicion abierta permitiendo de este modo que el contenido presurizado del recipiente sea liberado del recipiente. Por ejemplo, el recipiente presurizado puede configurarse como un recipiente pulverizador (p. ej., un recipiente pulverizador con palanca de bomba), un recipiente en aerosol y similares.

UTILIDAD

Los metodos y composiciones en cuestion encuentran uso en varias aplicaciones diferentes en las que se desea el tratamiento de una herida en un sujeto. En algunos casos, la herida puede ser una herida cronica, tal como una ulcera (p. ej., una ulcera por presion, una ulcera de pie diabetico, y similares). En ciertos casos, la herida puede ser una herida quirurgica o una herida por traumatismo, tal como, entre otros, una herida de tejido blando quirurgica o traumatica (p. ej., una herida muscular quirurgica o traumatica, una herida fascial quirurgica o traumatica, etc.).

Por ejemplo, la herida puede ser una herida en un sitio de la incision en un sujeto, tal como un sitio de la incision abdominal. En ciertas realizaciones, los metodos y composiciones encuentran uso en el tratamiento de una herida en un sujeto, en el que el tratamiento incluye la promocion de la curacion de la herida en el sujeto. Los metodos y composiciones en cuestion tambien encuentran uso en la prevencion o reduccion del riesgo de aparicion de efectos secundarios no deseados asociados con una herida en un sujeto. Por ejemplo, las composiciones en cuestion de la invention encuentran uso como agente terapeutico indicado para su uso profilactico en la prevencion y/o reduccion en el riesgo de aparicion de efectos secundarios no deseados asociados con una herida, tal como un sitio de la incision abdominal. Por lo tanto, los metodos y composiciones en cuestion encuentran uso en protocolos de cirugla abdominal para promover la curacion de un sitio de la incision abdominal en un sujeto.

KITS

Tambien se proporcionan kits que encuentran uso en la practica de los metodos en cuestion, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, kits para la practica de los metodos en cuestion pueden incluir un recipiente esteril que contiene un primer agente de material precursor, un segundo agente de material precursor y partlculas de plata en una cantidad eficaz para promover la curacion en un sitio de la incision abdominal. Como se ha descrito anteriormente, el primer agente de material precursor puede incluir fibrinogeno y el segundo agente de material precursor puede incluir trombina. En ciertas realizaciones, los kits incluyen un paquete sellado configurado para mantener la esterilidad del recipiente esteril. El paquete sellado puede sellarse de modo que esencialmente no haya contaminantes externos, tales como suciedad, microbios (p. ej., hongos, bacterias, virus, esporas, etc.), llquidos, gases, y similares, que son capaces de entrar en el paquete sellado. Por ejemplo, el paquete sellado puede sellarse de modo que el paquete sea estanco y/o hermetico.

En ciertas realizaciones, el kit puede incluir uno o mas recipientes distintos. Uno o mas recipientes distintos pueden incluir cada uno un componente diferente de la composicion farmaceutica, tal como el primer agente de material precursor en un primer recipiente, un segundo agente de material precursor en un segundo recipiente y las partlculas de plata en un tercer recipiente. Uno o mas recipientes pueden proporcionarse como recipientes individuales distintos o pueden estar conectados o formados como una sola unidad. En algunos casos, los

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recipientes estan configurados para ser congelados durante el almacenamiento. En ciertos casos, los recipientes estan configurados para contener un componente liofilizado, tal como el primer agente de material precursor o el segundo agente de material precursor. Por ejemplo, el recipiente puede ser un vial, una botella y similares.

Ademas de los componentes anteriores, los kits en cuestion pueden incluir adicionalmente instrucciones para la practica de los metodos en cuestion. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits en cuestion de diversas formas, una o mas de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en que estas instrucciones pueden estar presentes es como informacion impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja u hojas de papel en el que se imprime la informacion, en el embalaje del kit, en un prospecto, etc. Otros medios serlan un medio legible por ordenador, p. ej., CD, DVD, Blu-ray, memoria legible por ordenador, etc., sobre el que se ha grabado o almacenado la informacion. Otro medio que puede estar presente es una direccion de sitio web que puede usarse a traves de Internet para tener acceso a la informacion en un sitio eliminado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

Como puede apreciarse a partir de la divulgacion proporcionada anteriormente, la presente divulgacion tiene una amplia variedad de aplicaciones. Por consiguiente, los siguientes ejemplos se ofrecen para fines de ilustracion y no tienen por objeto interpretarse como una limitacion de la invencion de ninguna manera. Los expertos en la materia reconoceran facilmente varios parametros no crlticos que podrlan cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente similares. Asl, los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos en la materia una divulgacion y descripcion completas de como realizar y usar la presente invencion, y no tienen por objeto limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion, ni tienen por objeto representar que los experimentos a continuacion sean todos o los unicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros usados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) pero deberlan tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura se representa en grados Celsius y la presion es la atmosferica o esta cerca de la atmosferica.

Ejemplos

EJEMPLO 1

METODOS

Modelos de animal

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobacion previa del Comite Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de San Francisco, Universidad de California. Los animales se aclimataron a las condiciones de laboratorio durante un mlnimo de 5 dlas antes de someterse a cirugla y se les proporciono acceso al agua y alimento equilibrado comercial convencional para ratas ad libitum.

Modelo de hernia incisional

Las ratas Sprague-Dawley (macho, 250-300 g, Charles River, Cambridge, MA) se sometieron a un procedimiento de modelo de hernia incisional establecido, en el que > 80 % de los animales desarrollan hernias incisionales en un periodo de 28 dlas. Los animales se colocaron bajo anestesia con isoflurano, el cabello de la pared abdominal ventral se afeito con una maquinilla electrica y el campo quirurgico se preparo con alcohol al 70 %. Un colgajo cutaneo de grosor completo, rectangular de 6 cm x 3 cm, basado en 2 cm de lateral a la llnea media ventral se elevo a traves del plano prefascial avascular, separando de ese modo la incision en la piel del entorno de cicatrizacion fascial subyacente. La relacion 1:2 de longitud del colgajo a la anchura se mantuvo para prevenir la isquemia del colgajo cutaneo. Se realizo una incision por laparotomla en la llnea media de 5 cm, los intestinos se manipularon y luego la incision miofascial se cerro con 2 suturas interrumpidas (rapidamente absorbibles) con catgut 5-0 simple colocadas a 5 mm de los bordes miofasciales cortados y a un tercio de la distancia de los extremos craneal y caudal de la incision por laparotomla en la llnea media, respectivamente, antes de que el colgajo cutaneo se cierre con una sutura continua con vicryl 4-0 para evitar la evisceracion intestinal. Inmediatamente despues de la cirugla, se infundieron 0,4 ml de bupivacalna al 0,25 % por via subcutanea en torno a la incision abdominal y las ratas se observaron cada 2 minutos hasta que despertaron y reanudaron la actividad normal. Las ratas se regresaron a jaulas individuales y se realizo un seguimiento dos veces al dla. A las 12 y 18 horas despues de la operacion, se les inyecto por via subcutanea 0,05 mg/kg de buprenorfina.

Modelo modificado de hernia incisional

Las ratas Sprague-Dawley (macho, 250-300 g) se sometieron a un modelo modificado de hernia incisional en el que los animales se colocaron bajo anestesia con isoflurano y la pared abdominal ventral se preparo y abrio como se ha descrito anteriormente. En estos animales, la incision por laparotomla en la llnea con un grosor completo de 5 cm, se cerro con una sutura continua con vicryl 4-0 colocada a 5 mm de los bordes miofasciales cortados para promover la cicatrizacion normal. El cierre de la piel y el tratamiento post-quirurgico de los animales eran identicos a lo descrito

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previamente. Disenos del estudio

Prevention de las hernias incisionales

Se realizo el primer conjunto de experimentos para determinar si una combinacion de micropartlculas metalicas de plata y pegamento de fibrina podrla reducir el riesgo de aparicion de hernias incisionales en ratas usando un modelo experimental establecido. En los experimentos descritos en la presente memoria, se administraron tres dosis de micropartlculas de plata (0,25, y 250 mg/ml) en combinacion con pegamento de fibrina esteril (TISSEEL®, Baxter Healthcare Corp., Hayward, CA). Estas dosificaciones fueron aproximadamente 10 a 100 veces menores que la dosis de referencia oral cronica (DRf) para la plata administrada por via oral en seres humanos. Se utilizaron micropartlculas de plata con un diametro medio de 250 pm.

Cincuenta y tres animales fueron asignados aleatoriamente a cada uno de los dos grupos de tratamiento y dos grupos de control, solucion salina y solo pegamento de fibrina (vehlculo). Los animales en los grupos de tratamiento tenlan 25 mg/ml (dosis baja) o 250 mg/ml (dosis alta) de micropartlculas de plata dispersadas en pegamento de fibrina (0,1 ml aplicados por cm2 de la incision miofascial) aplicado topicamente a las incisiones miofasciales suturadas antes del cierre de la piel. Los animales en los grupos de control tenlan un volumen identico de solucion salina esteril (0,5 ml) o solo pegamento de fibrina aplicado a sus incisiones miofasciales suturadas antes del cierre de la piel. Para los grupos de tratamiento, el pegamento de fibrina se mezclo con las micropartlculas de plata apirogenas (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en el momento de la administration topica. En el dla 28, todos los animales se eutanasiaron por sobredosis de anestesicos y toracotomla bilateral, toda la pared abdominal ventral se extirpo y la piel se separo del tejido miofascial. El musculo de la pared abdominal se fotografio y se evaluo para la presencia de un defecto herniario y las secciones de tejido que se inclulan en la interfase de cicatrization junto con el tejido normal adyacente se fijaron inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10 % en preparation para la histologla. Se tomaron biopsias de la interfase de incision del musculo herniado/curacion y se congelaron en nitrogeno llquido para el analisis de ARNm de colageno. Las ratas con una protusion visible en la pared abdominal antes de la eutanasia se clasificaron por tener una hernia cllnica. Una vez que se extirpo la pared abdominal, se examino cuidadosamente para la separation visible entre los musculos rectos. Si esta presente, el area total de separation se estimo multiplicando el diametro craneocaudal maximo x el promedio de dos mediciones de diametro transversal (p. ej., aproximacion de una elipse) y clasificandose como una hernia anatomica.

Se llevaron a cabo experimentos adicionales para determinar si la combinacion de otro tipo de micropartlculas metalicas (oro) y pegamento de fibrina o micropartlculas metalicas de plata y otra matriz proteica natural (Matrigel™) tuvieron el mismo efecto en la prevention de hernias incisionales en ratas usando el mismo modelo experimental descrito anteriormente. En este conjunto de experimentos descritos en la presente memoria, tres dosificaciones de micropartlculas de oro se administraron en combinacion con pegamento de fibrina esteril (0,25, y 250 mg/ml de micropartlculas de oro dispersadas en TISSEEL® con 0,1 ml aplicados por cm2 de la incision miofascial). Estas dosificaciones fueron las mismas que las usadas anteriormente en los experimentos que implican micropartlculas metalicas de plata. Se usaron micropartlculas de oro con un diametro medio de 45 pm.

Treinta y dos animales se asignaron aleatoriamente a cada uno de los dos grupos de tratamiento y recibieron o bien 25 mg/ml (dosis baja) o 250 mg/ml (dosis alta) de micropartlculas de oro dispersadas en pegamento de fibrina (0,1 ml aplicados por cm2 de la incision miofascial) aplicado por via topica a las incisiones miofasciales suturadas antes del cierre de la piel. El pegamento de fibrina se mezclo con micropartlculas de oro apirogenas (Sigma Chemicals) en el momento de la administracion topica. En el dla 28, todos los animales se eutanasiaron por sobredosis de anestesicos y toracotomla bilateral, toda la pared abdominal ventral se extirpo y la piel se separo del tejido miofascial. Se evaluaron los animales como se ha descrito anteriormente.

Veinticinco animales adicionales fueron asignados aleatoriamente a cada uno de los tres grupos de tratamiento que recibieron 0,25 mg/ml (dosis baja) o 250 mg/ml (dosis alta) de micropartlculas de plata dispersadas en Matrigel™ (BD Biosciences, San Jose, CA, 0,1 ml aplicados por cm2 de la incision miofascial) aplicadas por via topica a las incisiones miofasciales suturadas antes del cierre de la piel. El Matrigel™ se mezclo con las micropartlculas de plata en el momento de la administracion topica. En el dla 28, todos los animales se eutanasiaron por sobredosis de anestesicos y toracotomla bilateral, toda la pared abdominal ventral se extirpo, la piel se separo del tejido miofascial y los animales se evaluaron como se ha descrito previamente.

Cicatrization normal miofascial

Se realizo un segundo conjunto de experimentos para determinar el efecto de las micropartlculas de plata en la cicatrizacion normal miofascial, como se mide por la fuerza tensil, la histologla y la expresion genica de colageno I de la incision, usando un modelo modificado de hernia incisional.

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Sesenta animales fueron asignados aleatoriamente a cada uno de los dos grupos de tratamiento y dos grupos de control (solucion salina o pegamento de fibrina solo) antes de cerrar el colgajo cutaneo con una sutura continua con vicryl 4-0. Los animales en los grupos de tratamiento tenlan o bien una dosis baja o una dosis alta de micropartlculas de plata combinada con pegamento de fibrina (incision miofascial de 1 ml/10 cm2 o 0,5 ml/5 cm) aplicado por via topica en sus incisiones miofasciales suturadas antes del cierre de la piel, cubriendo una superficie total de 5 cm2. Los animales en los grupos de control tenlan un volumen identico de solucion salina esteril (0,5 ml) o pegamento de fibrina aplicado a sus incisiones miofasciales suturadas antes del cierre de la piel. En el dla 28, todos los animales se eutanasiaron, la pared abdominal ventral se extirpo y la piel se separo del tejido miofascial. Las suturas fasciales se retiraron y dos tiras fasciales que miden 5 cm x 2 cm (orientacion craneocaudal x transversal) se cortaron de cada pared abdominal resecada usando una plantilla de corte para minimizar la variabilidad entre los especlmenes resecados. Las tiras fasciales se sometieron a analisis mecanico tensiometrico. El tejido muscular adicional que inclula la interfase de incision musculo-curacion fue tomado para histologla junto con biopsias que se congelaron en nitrogeno llquido para el analisis de colageno.

Histologla

Las biopsias recientes de la interfase fascia-fascia de la pared abdominal se fijaron en formalina, se embebieron en parafina, se seccionaron, y se tineron con hematoxilina y eosina o tricromo. Un patologo independiente de los diferentes grupos de tratamiento analizo a ciegas las secciones tisulares.

Expresion de ARNm de colageno, citoquinas inflamatorias y factor de crecimiento

La expresion de ARNm del colageno (tipos I y III), las citoquinas inflamatorias (interleucina (IL)-1, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF-a) y factores de crecimiento especlficos para la cicatrizacion (factor de crecimiento transformante (TGF-p), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF)) se analizaron usando transcriptasa inversa-PCR. El ARN total se extrajo a partir de especlmenes fasciales homogeneizados usando un reactivo TRIZOL. Despues de la extraccion con precipitacion con cloroformo e isopropanol, el sedimento de ARN se lavo con etanol al 75 % y luego se volvio a suspender en 40,5 pl de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC). Se tomo entonces un microlitro de la solucion de ARN para la verificacion espectrofotometrica de la presencia de ARN usando NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE). Todas las reacciones de transcripcion inversa (RT) se realizaron simultaneamente usando una mezcla maestra para eliminar la variabilidad y asegurar la fidelidad de la eficiencia de RT. El ADNc se sintetizo usando el kit GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) en volumenes de 20 pl, que contenla menos de 1 pg de ARN total, 2, 5 pM de hexameros aleatorios, 1U//pl de inhibidor de RNasa, 1 mM de cada dNTP, 5 mM de solucion de MgCh, y 2,5 U/pl de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina. Esta reaccion se incubo a 42 °C durante 15 minutos, 99 °C durante 5 minutos y 5 °C durante 5 minutos. El colageno I y III, IL-1, IL-6, TNF-a, TGF-p, PDGF, VEGF, FGF, IGF, y cebadores de gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se disenaron usando las secuencias conservadas de las secuencias de ARNm publicadas de GenBank completas y parciales de diversas especies. Los cebadores usados fueron: Col1 directo: CGGTGGTTATGACTTCAGCTTC; Col1 inverso: TCAGGCTCTTGAGGGTAGTGTC;

Col3 directo: GGTCCTGCAGGTAACAGTGGT; Col3 inverso: CATCACCTTTTGGTCCAGCTAC; IL-1

ACAAT GAGTGACACTGCCTTCC; IL-1 inverso:

AAG CACAAATAGTGCCCAGTG; IL-6 inverso: CAGCAGATGGGCT GT ACCTT AT; TNF-a inverso:

GACAT GAACCGACCCTTCCT; TGF-b inverso: CAAGACCAGGACGGTCATTTAC; PDGF inverso:

ACGTCTACCAGCGCAGCTATT; VEGF inverso:

TGTTGGTCACACAAGCGTAGAG; FGF inverso:

ATTGTGGATGAGTGTTGCTTCC; IGF inverso:

AGCATCCAGCTT CAAAT CTCAC; IL-6

TGTACTCAGGCTCACAGAGCAG; TNF-a

CCTT GTCCCTT GAAGAGAACCT; TGF-p TAGTTGGTATCCAGGGCTCTCC; PDGF GATCAAGAAGTTGGCCGATGT; VEGF ATCGGGGTACTCCTGGAAGAT; FGF

ATGATGTGCAGAGCATCAACTG; IGF GT ACAT CTCCAGCCTCCTCAGA; GAPDH

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GTTACCAGGGCTGCCTTCTC; GAPDH inverso: GGGTTTCCCGTTGATGACC. La amplification por PCR se llevo a cabo en un total de 5 pl con los siguientes componentes: 2,5 pl de 2X mezcla maestra Power Sybr Green (Applied Biosystems), 1,0 pl de 0,2 pm de cebador (directo e inverso), 1,0 pl de ADN (10 ng para el primer ensayo, dilution 1:10 para el segundo ensayo), y 0,5 pl de dH2O. Las reacciones de amplificacion se llevaron a cabo en 60 ciclos secuenciales de 95 °C durante 10 minutos, 95 °C durante 15 segundos, y 60 °C durante reacciones de 1 minuto sobre un instrumento 7900HT (Applied Biosystems). Los productos de pCr se analizaron digitalmente en tiempo real para determinar la intensidad de fluorescencia mediante el calculo del valor de Ct para cada curva y se cuantificaron usando el metodo de calculo de Delta-Delta Ct.

Analisis tensiometrico

El ensayo mecanico de las tiras fasciales de la pared abdominal se realizo en un periodo de 4 h de necropsia. El analisis de resistencia a la rotura de la interfase fascia-fascia se realizo usando un tensiometro Instron (modelo MicroTester®; Instron Corporation, Canton, MA) ajustado a una velocidad de cruceta de 10 mm/min. La resistencia a la rotura se definio como la fuerza en Newtons requerida para romper la incision miofascial curada para cada tira fascial. Las tiras fasciales se montaron en el marco de carga por medio de sujetadores neumaticos, precargados a 0,1 Newtons con la longitud de calibre medida entre las sujeciones. El marco de carga aplico cargas de ensayo a las

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tiras fasciales hasta que se produjo la rotura tisular mecanica. Los datos de la fuerza y deformacion del tejido se capturaron simultaneamente a traves de un analisis por ordenador y de los datos realizado usando software de Bluehill® (Instron Corporation).

Analisis estadistico

Se uso el ensayo t de Student para determinar las diferencias en las mediciones mecanicas tensiometricas. Se uso el ensayo exacto de Fisher para determinar las diferencias en la incidencia de hernias incisionales. Los valores se notificaron como la media ± desviacion estandar. Los valores de P <0,05 se consideraron significativos.

RESULTADOS

Prevencion de hernias incisionales

El tratamiento con micropartlculas de plata redujo significativamente la formacion de hernias incisionales en ratas. Las hernias cllnicas se desarrollaron despues de 28 dlas en el 100 % de los controles tratados con solucion salina y en el 65 % de los controles tratados con pegamento de fibrina en comparacion con el 41 % y 11 % de las ratas tratadas con dosis bajas y dosis altas de micropartlculas de plata, respectivamente (p <0,05; FlG. 1A). Del mismo modo, las dosis bajas y altas de micropartlculas de plata redujeron significativamente el tamano de hernias anatomicas en ratas despues de 28 dlas en un 57 % y 88 %, respectivamente (p <0,05; FIG. 1B). El pegamento de fibrina solo redujo la incidencia de hernias cllnicas en un 35 % y el tamano de la hernia anatomica en un 16 %. La histologla de las incisiones miofasciales tratadas con plata en seccion transversal demostro de manera fiable tres zonas concentricas distintas de tejido. En el centro de la incision de curacion eran micropartlculas (indicado por la flecha) dentro de un infiltrado inflamatorio no granulomatoso, adyacente a una zona de colageno recien sintetizado, junto al musculo (esqueletico) recto abdominal (FIG. 2). No hubo diferencia significativa en el colageno 1 o 3, citoquina o expresion genica del factor de crecimiento en la interfase de incision musculo-hernia/curacion entre los diferentes grupos experimentales en un intervalo temporal de 28 dlas (datos no mostrados). El tratamiento de las incisiones miofasciales con micropartlculas metalicas de plata despues del cierre de la sutura aumento la cicatrizacion y de este modo disminuyo la velocidad de formacion de la hernia incisional.

Cicatrizacion normal miofascial

Las micropartlculas de plata no tuvieron efecto significativo alguno sobre la cicatrizacion normal miofascial en las ratas despues de 28 dlas. El analisis tensiometrico de las tiras fasciales de la pared abdominal de todos los grupos experimentales no revelo diferencia significativa alguna en la fuerza tensil relativa (solucion salina: 16,4 ± 6,8 N, solo pegamento de fibrina: 12,7 ± 5,3 N, dosis baja: 15,6 ± 5,3 N, dosis alta: 13,0 ± 4,6 N; p> 0,4). Del mismo modo, no hubo diferencia significativa en la histologla o expresion genica entre los grupos experimentales (datos no mostrados).

DISCUSION

La aplicacion topica de micropartlculas de plata en pegamento de fibrina en laparotomlas en la llnea media redujo significativamente el desarrollo de hernias incisionales en una forma dependiente de la dosis. La dosis baja (25 mg/ml) y la dosis alta (250 mg/ml) de plata disminuyeron la incidencia de hernias en aproximadamente un 59 % y 89 %, respectivamente. Ademas, las dos dosificaciones de micropartlculas de plata redujeron el tamano medio de los defectos herniarios que se desarrollaron en un grado similar. La histologla de las laparotomlas curativas revelo la formacion de tres zonas distintas de tejido dispuestas concentricamente alrededor de la herida. Localizadas en la zona central se encontraban las micropartlculas de plata que pareclan embebidas dentro de una reaccion a cuerpos extranos no granulomatosos, (infiltrado inflamatorio) que contiene celulas gigantes multinucleadas. Adyacente a la zona central se encontraba un area de fibrosis temprana compuesta por fibroblastos y fibras de colageno maduras. La tercera zona y la zona mas exterior consistlan en un musculo recto abdominal. La histologla de las heridas revelo que las micropartlculas se concentraron en el medio de la incision curativa en las que aparecieron para inducir una reaccion a cuerpos extranos, incluyendo colageno y fibrosis temprana, que unen la distancia que separa los bordes mediales de los musculos rectos. El tratamiento con micropartlculas de plata disminuyo la formacion de hernia incisional. No obstante, el tratamiento con micropartlculas de plata no se asocio con un aumento dependiente de la dosis en la actividad genica de colageno, citoquina o factor de crecimiento en el intervalo temporal de 28 dlas. Dado que se espera que estos genes sean normalmente quiescentes durante cuatro semanas despues de las heridas, el tratamiento con micropartlculas de plata no dio lugar a un cambio prolongado en la expresion genica. La aplicacion topica del pegamento de fibrina sin micropartlculas de plata en las laparotomlas en la llnea media redujo el desarrollo de las hernias incisionales cllnicas y anatomicas en un 16-35 %. El analisis de histologla en este grupo mostro que el pegamento de fibrina solo indujo una reaccion a cuerpos extranos, no obstante en un menor grado del que la reaccion a cuerpos extranos inducida por las micropartlculas de plata. Aunque menos importante que la reaccion a cuerpos extranos inducida por las micropartlculas de plata, estos datos indicaron una correlacion directa mecanica entre la induction de una reaccion a cuerpos extranos y la prevencion de las hernias incisionales.

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10

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65

Las micropartlcuias de plata no tuvieron efecto medido alguno en la histologla, expresion genica o fuerza tensil de normalmente la curacion de incisiones abdominales. En general, se podrla predecir que las micropartlculas de plata solo aumentarlan la respuesta de curacion fibrotica en todas las circunstancias, y que unicamente el tratamiento con plata no solo reducirla la formation de una hernia incisional, sino que tambien aumentarla la fuerza de una cicatrization normal. Inesperadamente, como se muestra en los experimentos discutidos anteriormente, las micropartlculas de plata mejoraron la cicatrizacion miofascial en condiciones en un modelo deficiente de cicatrizacion mientras que no tenga efectos adversos significativos (tales como cicatrizacion excesiva) en un modelo de cicatrizacion normal. Sin desear quedar ligado a teorla particular alguna, en ciertas realizaciones, el mecanismo por el que la plata mejora la cicatrizacion miosfacial puede asociarse con el desarrollo de una reaction a cuerpos extranos con respecto a las partlculas metalicas de plata.

Como se muestra en los experimentos discutidos anteriormente, el tratamiento con solo partlculas de plata no tuvo efecto medido alguno como se ha descrito anteriormente. El tratamiento con solo pegamento de fibrina redujo la incidencia de hernias cllnicas en un 35 % y el tamano de la hernia anatomica en un 16 %. No obstante, el pegamento de fibrina con partlculas de plata redujo la incidencia de hernias cllnicas en un 59 % y 89 % en ratas tratadas con dosis bajas y altas de micropartlculas de plata, respectivamente, y redujo el tamano de hernias anatomicas en un 57 % y 88 % en ratas tratadas con dosis altas y bajas de micropartlculas de plata, respectivamente. De este modo, el tratamiento con pegamento de fibrina con micropartlculas de plata mostro un efecto que no era mas que aditivo en la reduction de la incidencia de hernias cllnicas y el tamano de las hernias anatomicas en comparacion con la administration de solo partlculas de plata o solo pegamento de fibrina.

Los experimentos discutidos anteriormente que inclulan el tratamiento con partlculas de oro dispersadas en pegamento de fibrina no mostraron efecto medido en la reduccion de la incidencia de la hernia cllnica. Ademas, los experimentos discutidos anteriormente que incluyeron el tratamiento con partlculas de plata dispersadas en una matriz proteica natural (Matrigel™) tampoco mostraron efecto medido alguno en la reduccion de la incidencia de la hernia cllnica. De este modo, el tratamiento con pegamento de fibrina con micropartlculas de plata redujo tanto la incidencia de hernias cllnicas como el tamano de las hernias anatomicas en comparacion con la administracion de partlculas de oro en pegamento de fibrina o partlculas de plata en una matriz proteica natural (Matrigel™).

EJEMPLO 2

Los experimentos se realizaron usando un modelo de cicatrizacion de raton diabetico para ensayar la eficacia de las composiciones de la presente divulgation en comparacion con un control negativo.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobacion previa del Comite Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de San Francisco, Universidad de California. Se obtuvieron geneticamente ratones C57BL/KsJ-db/db diabeticos en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y tenlan un periodo de vida de entre 8-10 semanas en el momento del ensayo. Los animales se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante un mlnimo de 2 dlas antes de someterse a la cirugla y a todos se les proporciono acceso al agua y alimento equilibrado comercial convencional para ratas ad libitum.

Los ratones se colocaron bajo anestesia con isoflurano y el dorso se afeito con una maquinilla electrica. 0,1 ml de 1/30 dilution de 0,3 mg/ml de buprenorfina se inyectaron por via subcutanea, a continuation, el dorso se preparo con una solution antiseptica de betadine. Un clrculo de diametro de 2,0 cm se trazo en el area preparada. 0,5 ml de bupivacalna (0,25 %) se inyectaron en torno al perlmetro del seguimiento para la analgesia local. El area circular marcada se extirpo a continuacion, incluyendo la capa de panlculo carnoso. Cada animal tenia su herida marcada sobre laminas de plastico transparente individuales para seguimientos semanales, y luego los animales fueron asignados al azar en un grupo de control (n = 19) o un grupo experimental (n = 33). Se aplicaron aproximadamente 0,2 a 0,3 ml de solucion salina a las heridas abiertas en los ratones de control, y la Composition A se aplico por via topica a las heridas en los ratones experimentales. La Composicion A incluia micropartlculas de plata dispersadas en pegamento de fibrina (250 pm de diametro medio en una concentration de 250 mg/ml en pegamento de fibrina con 0,1 ml aplicados por cm2 de la herida abierta). Los ratones se devuelven a jaulas individuales y se les permitio despertar y reanudar la actividad normal. Los ratones fueron examinados a intervalos semanales y la cicatrizacion fue seguida en las laminas de plastico transparente cada semana hasta la escara se cayo, lo que indica que la herida subyacente habia sanado. Despues de que las heridas hubieran epitelizado, los ratones se eutanasiaron por sobredosis de anestesicos y toracotomia bilateral, y el tejido curado se extirpo para el analisis histoquimico. Las areas de seguimiento de la herida se midieron usando un programa de formacion de imagenes, Image J.

Se realizo un analisis estadistico del tamano de la herida (p. ej., area de la herida) en comparacion con los valores medios de los grupos de control y experimentales usando una calculadora para el ensayo t de Student (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la FIG. 3.

Tabla 1

Tiempo (semanas)

Tamano de la herida,% (grupo de control) Tamano de la herida,% (grupo experimental) Desviacion estandar (grupo de control) Desviacion estandar (grupo experimental)

0

100,0 100,0 - -

1

103,0 86,7 17,0 12,0

2

80,6 52,8 19,9 16,2

3

22,7 0,9 14,9 3,4

4

2,1 0,0 5,4 -

5

0,0 0,0 - -

Los resultados mostrados en la Tabla 1 y en la FIG. 3 indican que los ratones tratados con la Composicion A tenlan un tiempo de cicatrizacion promedio que era de aproximadamente 1 semana menos que el de los ratones de control. 5

Lo anterior ilustra meramente los principios de la divulgacion. La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento de un sitio de una incision abdominal en un sujeto, comprendiendo la composicion farmaceutica un primer agente de material precursor que comprende fibrinogeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partlculas de plata.
2. 2. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el primer agente de material precursor, el segundo agente de material precursor y las partlculas de plata estan adaptados para combinarse in situ.
3. 3. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el primer agente de material precursor se aplica antes de la aplicacion del segundo agente de material precursor.
4. 4. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el segundo agente de material precursor se aplica antes de la aplicacion del primer agente de material precursor.
5. 5. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que las partlculas de plata son micropartlculas de plata.
6. 6. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que las partlculas de plata son esfericas.
7. 7. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 5 pm o mas.
8. 8. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que las micropartlculas de plata tienen un diametro medio de 200 pm o mas.
9. 9. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la composicion farmaceutica comprende 25 mg/ml de partlculas de plata.
10. 10. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la composicion farmaceutica comprende 250 mg/ml de partlculas de plata.
11. 11. Un dispositivo para aplicar una composicion farmaceutica para tratar una herida en un sujeto, comprendiendo el dispositivo:

    un recipiente esteril que contiene un primer agente de material precursor que comprende fibrinogeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partlculas de plata en una cantidad eficaz para tratar un sitio de una incision abdominal.
12. 12. El dispositivo de la reivindicacion 11, en el que el recipiente esteril comprende una primera camara que contiene el primer agente de material precursor, una segunda camara que contiene el segundo agente de material precursor y una tercera camara que contiene las partlculas de plata.
13. 13. El dispositivo de la reivindicacion 11, en el que el recipiente esteril comprende una jeringa.
14. 14. Un kit que comprende:

    un recipiente esteril que contiene un primer agente de material precursor que comprende fibrinogeno, un segundo agente de material precursor, que comprende trombina, y partlculas de plata en una cantidad eficaz para tratar un sitio de una incision abdominal; y

    un envase sellado configurado para mantener la esterilidad del recipiente esteril.