ES2644118T3

ES2644118T3 - Método para prevenir las alergias

Info

Publication number: ES2644118T3
Application number: ES13702074.9T
Authority: ES
Inventors: Pierre-Henri Benhamou; Christophe Dupont; Lucie Mondoulet
Original assignee: DBV Technologies SA
Current assignee: DBV Technologies SA
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2013-02-04
Publication date: 2017-11-27
Anticipated expiration: 2033-02-04
Also published as: AU2017254938B2; IL233596A0; US20140377311A1; EP3248616A1; AU2013218164A1; PT2812025T; CA2862568A1; CA2862568C; CN104114185A; AU2017254938A1; JP2015508753A; KR20150035492A; ES2798378T3; WO2013117519A1; EP3248616B1; EP2812025A1; EP2812025B1; KR102072683B1; JP6193266B2; DK2812025T3

Abstract

Una composición que comprende un alérgeno de la leche para su uso en el tratamiento de un niño menor de 6 años que tiene una alergia detectada a la leche, para evitar que dicho niño desarrolle una alergia adicional a un alérgeno alimentario diferente, en donde la composición se administra repetidamente epicutáneamente a dicho niño utilizando un dispositivo de parche oclusivo no invasivo, protegiendo dicha administración al niño del desarrollo de al menos una alergia adicional al alérgeno alimentario diferente.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para prevenir las alergias Campo de la invencion

La presente invencion describe composiciones y metodos para prevenir la alergia en un sujeto. En particular, la presente invencion se refiere a la prevencion epicutanea de alergias en ninos. La invencion describe tambien composiciones para uso en tales metodos, as! como a su fabrication, y su uso para originar la protection contra cualquier alergia, en particular alergias alimentarias o respiratorias.

Antecedentes de la invencion

La alergia ocupa un lugar cada vez mas importante en la practica medica diaria. Es un fenomeno mundial de salud publica clasificado como la cuarta lacra mundial por la OMS. En Francia, uno de cada tres franceses es alergico y tanto la alergia respiratoria como la alimenticia afectan a una portion creciente de la poblacion de adultos y ninos.

La desensibilizacion (o inmunoterapia) es la tecnica segun la cual, mediante la administration de cantidades mlnimas de alergenos, es posible suprimir mas o menos la reaction alergica a estos alergenos. Mediante la administracion progresiva del alergeno, en dosis constantes o variables, el sujeto se hace mas tolerante al alergeno. La inmunoterapia ha demostrado ser eficaz en pacientes afectados con alergia grave dependiente de IgE, sensibilizada a un numero restringido de alergenos. La desensibilizacion puede reducir los slntomas relacionados con la reaccion alergica a corto plazo, as! como la progresion de la sintomatologla hacia signos cllnicos mas graves, tales como, por ejemplo, la transformation de la rinitis alergica en asma (Tij et al., 2004). Desde el comienzo del ano 2000, ha sido reconocido por la OMS como el unico metodo para tratar basicamente la alergia.

Aunque los mecanismos de action de la inmunoterapia todavla no son bien conocidos, parecen implicar (i) un aumento de las IgG y, en particular, de las fracciones de IgG4, bloqueando estos anticuerpos in vitro los efectos biologicos de las IgE; (ii) una modification de la respuesta inmunologica de TH1 y TH2, promoviendo una respuesta TH1/TH2 mas equilibrada; y/o (iii) una production de celulas T que producen interleucina 10 (IL-10), que exhiben propiedades antialergicas contra mastocitos, ciertos linfocitos T y eosinofilos y tambien promueven la produccion de IgG4.

La inmunoterapia puede realizarse mediante varios protocolos o rutas, incluyendo subcutanea, sublingual, nasal o epicutanea. La inmunoterapia subcutanea es ampliamente utilizada. Aunque es costosa y requiere la intervention de un medico especialista en cada inyeccion, todavla hoy se considera como la via estandar de desensibilizacion en ninos (Pajno et al., 2005). Sin embargo, no se produce sin riesgos, ya que la frecuencia de muertes se estima en 1 por 2,5 millones de inyecciones con un promedio de 3,4 muertes al ano. Ademas, no se usan alergenos potencialmente anafilacticos con alto riesgo de reaccion, tales como los frutos secos y la mayorla de los alergenos alimentarios, para el tratamiento de desensibilizacion subcutanea.

La inmunoterapia sublingual es considerada por la OMS como una alternativa satisfactoria a la inmunoterapia subcutanea. Mucho mejor tolerada por los pacientes, la inmunoterapia sublingual es considerada, por muchos autores, que proporciona una mejor relation costo-efectividad que las otras vlas de administracion, ya que no requiere la intervencion de un medico y puede ser autoadministrada por los pacientes (Pajno et al., 2005). Ademas, las reacciones adversas son raras durante los tratamientos a traves de una via sublingual, estimada en de 0,1 a 0,2 reacciones por 1.000 dosis administradas. Tales reacciones son principalmente menores, afectando a la cavidad bucal o al area sublingual o a la esfera gastrointestinal (La Rosa et al, 1999).

En terminos de efectividad, sin embargo, la via sublingual se considera menos eficaz que la via subcutanea: requiere el uso de una mayor cantidad de alergenos y no se puede autorizar con todos los alergenos. Esto es as! a pesar de que las pruebas a traves de esta ruta para la desensibilizacion a los cacahuetes y a la leche de vaca estan en curso. La seguridad del uso de esta tecnica con otros alergenos alimentarios aun no se ha evaluado.

La inmunoterapia intra-nasal ha demostrado ser eficaz en 17 estudios controlados de cada 18. Por lo tanto, es una via eficaz y segura para tratar, al menos, la rinitis alergica. Sin embargo, generalmente es poco tolerada por los pacientes, lo que limita cada vez mas su uso cllnico. En un estudio que comparaba diferentes rutas de desensibilizacion, los tratamientos via nasal se interrumpieron prematuramente en aproximadamente el 50% de los casos antes de un ano, mientras que el cese temprano ocurrio en menos del 10% de los ninos tratados por via subcutanea o sublingual (Pajno et al, 2005). Prado et al., 2010 Mol. Immunol., Vol. 47, no. 11-12, paginas 21482151, se refiere a la aplicacion intranasal de nanoveslculas bioactivas llamadas exosomas especlficos de alergenos de oliva particulares, y su uso para prevenir la sensibilization a alergenos del polen de abedul.

La inmunoterapia epicutanea se basa en la aplicacion a la piel. Este metodo comprende tlpicamente la aplicacion repetida de un alergeno conocido por provocar una alergia existente en la piel de un sujeto, llevando generalmente a la difusion del alergeno en las capas superficiales de la piel. Los experimentos llevados a cabo por los inventores han demostrado que el tipo de respuesta inmunitaria generada por la inmunoterapia epicutanea puede ser controlada por las condiciones de tratamiento. Por ejemplo, la solicitud internacional asignada comunmente

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WO2009/080934 describe que se puede obtener una potente desensibilizacion a un alergeno mediante terapia epicutanea usando un alergeno, sin adyuvante, aplicado sobre un area intacta de la piel. De manera similar, la solicitud internacional comunmente asignada WO2009/071599 describe que se puede obtener una fuerte desensibilizacion al cacahuete por inmunoterapia epicutanea. Dioszeghy et al., 2011 J.Immunol., Vol. 186, n° 10, paginas 5629-4637, se refiere a mecanismos de inmunoterapia epicutanea a traves de piel intacta en ratones sensibilizados con ovoalbumina. En los experimentos y publicaciones anteriores, los efectos especlficos de alergeno de inmunoterapia epicutanea fueron investigados por los inventores. Continuando con esta investigacion, los inventores han encontrado ahora sorprendentemente que, dependiendo de las condiciones de tratamiento, se puede emplear inmunoterapia epicutanea como tratamiento profilactico para prevenir el desarrollo de alergias en pacientes alergicos. Este resultado inesperado permite, por lo tanto, el diseno de un tratamiento profilactico para prevenir alergias en sujetos.

Sumario de la invencion

La presente solicitud proporciona nuevos metodos para prevenir alergias en sujetos mamlferos mediante la administracion epicutanea profilactica de un alergeno. Esta invencion describe un metodo para prevenir alergias en un nino, en el que el metodo comprende la administracion epicutanea de un alergeno a dicho nino, siendo el alergeno administrado al nino tras la deteccion de una reaccion alergica al mismo alergeno o un alergeno diferente.

La invencion tambien describe un metodo para prevenir la alergia en un nino que comprende administrar epicutaneamente a un nino al menos un alergeno, en el que el nino es menor de 6 anos y tiene una reaccion alergica detectada a al menos un alergeno. El nino es preferiblemente un bebe o un nino pequeno.

La invencion tambien describe un metodo para prevenir la alergia en un nino, en el que el nino es alergico a la leche o al acaro del polvo domestico y tiene menos de 6 anos, y en el que el metodo comprende administrar epicutaneamente a dicho nino al menos una protelna de la leche o de acaros del polvo domestico. Como se describira en la solicitud, dicha administracion epicutanea previene el inicio o desarrollo de la alergia a otros alergenos en dicho nino.

La invencion tambien describe un metodo para prevenir la alergia en un nino, comprendiendo el metodo detectar o verificar dicha primera reaccion alergica, administrando epicutaneamente a dicho nino al menos un alergeno responsable de dicha primera reaccion alergica, protegiendo dicha administracion epicutanea al nino del desarrollo de al menos una alergia adicional a otro alergeno.

La invencion tambien describe un metodo para proteger a un nino del desarrollo de alergias multiples, comprendiendo el metodo detectar o verificar en un nino la ocurrencia de una reaccion alergica y, tras la deteccion o verificacion de dicha reaccion alergica, administrar epicutaneamente a dicho nino al menos un alergeno responsable de dicha reaccion alergica, induciendo dicha administracion epicutanea una respuesta inmune en dicho nino que protege al nino del desarrollo de alergias multiples.

La invencion tambien describe una composition para usar en la prevention de alergias en un sujeto, en la que la composition comprende un alergeno y se aplica epicutaneamente a un nino alergico. Mas preferiblemente, el nino es menor de 6 anos, mas preferiblemente el nino es un bebe o un nino pequeno. Aun mas preferiblemente, el nino es alergico a la leche o a los acaros del polvo de la casa. Lo mas preferiblemente, el nino es tratado despues de la deteccion de su primera alergia.

Como se describe en la presente memoria, la invencion se puede usar para prevenir el desarrollo de alergias adicionales en los sujetos tratados, incluyendo alergias alimenticias, respiratorias o de contacto. Es especialmente adecuado para el tratamiento de bebes o ninos pequenos que presentan un primer evento alergico a un primer alergeno, desensibilizan al nino frente al primer alergeno y evitan el desarrollo de nuevas alergias a otros alergenos diferentes.

Mas especlficamente, la invencion se refiere a una composicion como se define en las reivindicaciones.

En una realization preferida, la invencion se refiere a una composicion que comprende un alergeno de la leche para uso en el tratamiento de un nino menor de 6 anos que tiene una alergia detectada a la leche, para evitar que dicho nino desarrolle una alergia adicional a un alergeno alimentario diferente, en el que la composicion se administra repetidamente epicutaneamente a dicho nino usando un dispositivo de parche oclusivo no invasivo, protegiendo dicha administracion al nino del desarrollo de al menos una alergia adicional al alergeno alimenticio diferente. El nino es preferiblemente un bebe o un nino pequeno. La alergia detectada a la leche es preferiblemente la primera alergia detectada en dicho nino y el alergeno se administra preferiblemente tras la deteccion o verificacion de dicha primera reaccion alergica. El alergeno se aplica preferiblemente sobre una zona intacta de la piel y/o en ausencia de adyuvante. Ademas, el alergeno se aplica preferentemente repetidamente durante un periodo de 3 a 36 meses.

En otra realizacion preferida, la composicion de la invencion es para proteger a dicho nino del desarrollo de alergias multiples.

En otra realizacion preferida, la composicion de la invencion es para proteger a dicho nino del desarrollo de una alergia a los cacahuetes.

Leyendas de las figuras

Figura 1: diseno del estudio. Se sensibilizaron ratones BALB/c a la leche y se dividieron en 2 grupos en los que uno 5 fue tratado (EPIT) y el otro fue no tratado (simulado). El tratamiento se realizo durante 8 semanas. Despues de este perlodo, todos los ratones recibieron cacahuetes con el mismo protocolo habitualmente utilizado para sensibilizar a ratones frente al extracto de protelnas de cacahuete (PPE). Los ratones fueron entonces expuestos a cacahuetes durante 10 dlas. La inflamacion del esofago se evaluo mediante la medicion de la infiltracion de eosinofilos en el esofago, determinada por la histologla. Tambien se investigaron respuestas serologicas y respuestas celulares.

10 Fig. 2: Respuestas especlficas de IgE (Figura 2a) e IgG2 (Figura 2b) frente a la leche despues de la sensibilizacion al dla 43 (D43), durante EPIT el dla 78 (D78) y al final del tratamiento, dla 99 y dla 127 (D99 y D127). Los resultados se expresan como media ± DE. ** p < 0,01.

Figura 3: Respuestas de IgE especlfica (Figura 3a) e IgG2 (Figura 3b) frente a PPE despues de EPIT pero antes de ser expuestos a PPE (D99) y despues de ser expuestos a PPE (D127). Los resultados se expresan como media ± 15 DE. * p <0,05, *** p <0,001.

Figura 4: Respuestas celulares de esplenocitos reactivados in vitro por leche (CMP) o PPE medido por IL-4 (Figura 4a) e IL-5 (Figura 4b). Los resultados se expresan como media ± DE. * p <0,05.

Figura 5: Induccion de linfocitos T Foxp3 + CD25 + CD4 + (Treg) a partir de esplenocitos reactivados in vitro. Al final de los experimentos, se recogieron los esplenocitos y se reactivaron in vitro durante 3 dlas en presencia de leche 20 (parte izquierda del grafico) y PPE (parte derecha del grafico). El porcentaje de Treg por el total de poblacion de celulas T CD4 + se expreso como media + SD. * p <0,05, ** p <0,01.

Figura 6: Infiltracion de eosinofilos en el esofago evaluada por analisis histologicos. Los resultados se expresan como media ± DE. ** p < 0,01.

Descripcion detallada de la invencion

25 La invencion proporciona un nuevo tratamiento profilactico de alergias. Es especialmente adecuado para tratar a los ninos que presentan una reaccion alergica frente a un alergeno, para protegerlos contra el desarrollo de nuevas alergias frente a otros alergenos diferentes. La presente solicitud describe que es particularmente eficaz para tratar a ninos pequenos que muestran una reaccion alergica frente a la leche o a acaros del polvo domestico, protegiendo as! a los ninos de desarrollar alergias adicionales frente a otros alergenos. De hecho, los ninos pequenos, tales 30 como los bebes o ninos infantiles, que desarrollan una reaccion alergica frente a un primer alergeno, son muy susceptibles de convertirse en alergicos frente a otras sustancias. La presente invencion permite el tratamiento de tales sujetos alergicos y reduce la aparicion de otras alergias.

La presente descripcion se entendera mejor haciendo referencia a las siguientes definiciones:

Definiciones

35 "Administracion epicutanea" se refiere a la aplicacion de una sustancia (por ejemplo, un alergeno) sobre la piel del sujeto bajo condiciones que permiten un contacto con la superficie de la piel. La aplicacion de la piel se realiza preferiblemente sin ninguna perforation o pretratamiento de la piel. La aplicacion de la piel se mantiene preferiblemente en condiciones que permiten la penetration del alergeno en la(s) capa(s) superficial(es) de la piel y/o durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el contacto del alergeno con las celulas inmunes. La 40 administracion epicutanea se realiza preferiblemente con un dispositivo para la piel, tal como un parche.

En el contexto de esta invencion, se entiende que el termino "prevenir" alergias incluye la protection del sujeto contra el desarrollo de alergias adicionales, previniendo la aparicion de una sensibilidad frente a otros alergenos, el retraso en la aparicion o la ocurrencia de tal sensibilidad o alergia frente a otros alergenos o inhibiendo o reduciendo la magnitud de cualquier reaccion alergica adicional.

45 Dentro del contexto de la presente invencion, la expresion "piel intacta" indica que la integridad de la capa del estrato corneo debe ser sustancialmente mantenida. Para el funcionamiento de la invencion, de hecho, es mas preferido aplicar antlgenos en la piel intacta (es decir, no pretratada), por ejemplo, sobre una superficie o portion de la piel donde la integridad del estrato corneo sea mantenida esencialmente. Mantener la integridad del estrato corneo y el estado de activation natural de los queratinocitos y las celulas de Langerhans, que se encuentran por debajo del 50 estrato corneo, es importante para evitar una respuesta inmune Th2 sesgada. Manteniendo esta integridad, la respuesta obtenida esta altamente orientada en el sentido de la tolerancia. Por consiguiente, aunque se pueda realizar una limpieza suave de la superficie de la piel en el lugar de aplicacion, por ejemplo, una hidratacion, limpieza con agua o una sola remocion muy suave, para eliminar, por ejemplo, corneocitos, la piel no debe ser tratada previamente, manteniendo as! la integridad sustancial del estrato corneo. En particular, no se debe realizar una

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separacion de esparadrapo o una abrasion fuerte de la piel, ya que tales pretratamientos alteran o eliminan todo o parte del estrato corneo y provocan la estimulacion de los queratinocitos. De manera similar, se debe evitar la perforacion del estrato corneo.

El termino “alergeno” se refiere a una molecula inmunologica implicada en una reaccion alergica. El alergeno puede ser de naturaleza diversa, tal como un llpido, protelna, peptido, polipeptido, metal, plastico, etc. En una realizacion particular, el alergeno es una protelna, polipeptido y/o peptido. El alergeno puede estar en un estado natural, o ser producido artificialmente (por ejemplo, por tecnicas recombinantes y/o enzimaticas, por ejemplo). El alergeno puede ser estructuralmente alterado o modificado para mejorar su estabilidad, inmunogenicidad, etc. El alergeno puede ser puro o estar mezclado con otros constituyentes. El alergeno puede ser una mezcla de varias moleculas (por ejemplo, un extracto). Como se discutira mas adelante, el alergeno puede usarse en diferentes estados, tales como en llquido o seco.

Metodos para prevenir alergias

La presente invencion describe composiciones y metodos para el tratamiento preventivo de alergias. En particular, los inventores han hecho el descubrimiento inesperado de que la administration epicutanea de un alergeno puede inducir o estimular una respuesta inmune no alergenica especlfica en un sujeto, protegiendo as! al sujeto del desarrollo de alergias adicionales frente a otros alergenos diferentes. Mediante la aplicacion de inmunoterapia epicutanea en sujetos con antecedentes alergicos, es posible no solo desensibilizar una alergia existente, sino que tambien prevenir el desarrollo de otras alergias. Como se describe en detalle a continuation, los experimentos de los inventores in vivo demuestran que la aplicacion epicutanea de protelnas de leche a mamlferos alergicos a la leche desensibiliza contra la leche y tambien protege frente a la exposition a otros alergenos, incluyendo los cacahuetes y los acaros del polvo. Estos resultados son particularmente sorprendentes y notables puesto que, utilizando un alergeno alimentario, es posible provocar una inmunidad protectora contra el desarrollo de alergias adicionales frente a otros alergenos alimentarios as! como alergenos respiratorios o de contacto. La invencion es particularmente adecuada para proteger a los ninos que exhiben una primera respuesta alergica, que estan en riesgo de desarrollar alergias adicionales. La invencion es particularmente adecuada para tratar a ninos pequenos, tales como bebes (0-1 anos) y ninos pequenos (1-3 anos). Sin estar limitado por la teorla, los inventores creen que la reaccion puede estar causada por una estimulacion de la production de celulas Treg por terapia epicutanea, lo que conduce a un mejor control de las celulas productoras de IgE y otras celulas inmunologicas alergicas en el sujeto.

La invencion describe un metodo para prevenir alergias adicionales en un nino que tiene una reaccion alergica detectada, que comprende administrar epicutaneamente a dicho nino al menos un alergeno, preferiblemente un alergeno responsable de dicha reaccion alergica detectada.

Los inventores han descubierto que dicho efecto protector ocurre una vez que ha ocurrido al menos una primera reaccion alergica en un sujeto. Los resultados presentados en esta solicitud demuestran que la aplicacion epicutanea de un alergeno en dichos sujetos puede inducir o estimular Tregs. La capacidad para inducir Tregs epicutaneamente nunca antes se habla descrito en la tecnica. Los resultados presentados muestran ademas que Tregs son inducidos en estos sujetos cuando el alergeno administrado epicutaneamente es un alergeno responsable de la reaccion alergica detectada en el sujeto. Por lo tanto, es posible que la al menos una primera reaccion alergica (por ejemplo, una sensibilidad a un alergeno) sea necesaria para inducir la produccion de celulas Treg y que el tratamiento epicutaneo usando el alergeno pueda amplificar esta poblacion Treg actuando de este modo sobre la(s) respuesta(s) alergica(s) correspondiente(s). El presente tratamiento permite la generation de una respuesta inmune no alergenica especlfica, que inhibe el desarrollo de alergias posteriores frente a nuevos alergenos.

Por lo tanto, la invencion es particularmente adecuada para tratar a ninos, en particular a ninos menores de 6 anos. En estos ninos, el sistema inmunologico no ha sido expuesto todavla a multiples alergenos. En particular, los alergenos alimentarios son todavla limitados en estos ninos. Por consiguiente, tras la detection de una primera reaccion alergica, el tratamiento epicutaneo preventivo de la invencion es particularmente eficaz. Ademas, debido a que las alergias pueden desarrollarse temprano, al tratar a estos ninos es posible prevenir el desarrollo de multiples alergias.

Por lo tanto, el tratamiento se aplica preferiblemente a ninos menores de 6 anos que presentan una respuesta alergica. La invencion es particularmente adecuada para tratar a bebes y ninos pequenos. La respuesta alergica detectada en dichos ninos es tlpicamente una alergia a la leche o una alergia al acaro del polvo. Por consiguiente, el metodo es particularmente adecuado para tratar a ninos menores de 6 anos que tienen una alergia a la leche o al acaro del polvo. Al administrar epicutaneamente a estos sujetos una cantidad profilactica de un alergeno de la leche o de acaros de polvo de casa, es posible proteger eficazmente a los ninos contra el desarrollo de nuevas alergias.

Se prefiere realizar el tratamiento poco despues de la deteccion o verification de la presencia de una reaccion alergica en el sujeto. De hecho, actuando de manera temprana (es decir, antes de que el sujeto haya estado expuesto a multiples alergenos), es posible inducir una respuesta inmune fuerte y potente que se espera que impida el desarrollo de una amplia gama de alergias. A este respecto, es mas preferible tratar a los ninos tras la deteccion o

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verificacion de una primera reaccion alergica, de manera que se puede contemplar un efecto protector contra todos los demas alergenos.

En una realizacion preferida, el alergeno se administra antes de la deteccion de una segunda reaccion alergica frente a un segundo alergeno en el nino tratado. La deteccion o verificacion de una reaccion alergica se puede llevar a cabo usando tecnicas en si conocidas en la tecnica. Ejemplos de metodos adecuados incluyen el uso de una prueba de pinchazo, la dosificacion de IgE, o un ensayo de parche de atopia. La deteccion de una reaccion alergica incluye la deteccion de una sensibilidad frente a un alergeno, incluso si no hay signos cllnicos de la alergia que estan presentes. Generalmente, la deteccion viene primero de la aparicion de slntomas clasicos alergicos (inflamacion, deglucion, etc). Puede entonces ser probado de nuevo, o verificado, por ejemplo, por un medico, usando cualquiera de las tecnicas anteriores, si es necesario. Una vez que se ha detectado o verificado una reaccion alergica para un sujeto, puede iniciarse el tratamiento de la invencion. La eficacia del tratamiento aumentara si el tratamiento se inicia en breve (por ejemplo, inmediatamente o dentro de semanas, por ejemplo menos de 4 semanas) despues de la deteccion o verificacion de la respuesta alergica. De hecho, al actuar temprano, se genera un efecto preventivo hacia cualquier otra alergia. Para ello, es mejor que el tratamiento se realice tras la deteccion de la primera respuesta alergica en el sujeto y antes de la deteccion de una alergia adicional (por ejemplo, antes de la aparicion de IgE detectable especlfica para un segundo alergeno en dicho nino). Sin embargo, el tratamiento tambien es potente en sujetos que muestran varias reacciones alergicas, ya que todavla puede generar una proteccion general contra alergias adicionales.

Por lo tanto, el metodo es particularmente eficaz para tratar a los bebes (menores de 1 ano) o a los ninos pequenos (de 1 ano a 3 anos) que tienen una primera reaccion alergica.

En particular, el metodo es para el tratamiento de ninos menores de 6 anos que tienen una reaccion alergica detectada frente a la leche o al acaro del polvo domestico.

La invencion tambien describe un metodo que comprende la aplicacion epicutanea de al menos un alergeno al sujeto. Mas preferiblemente, al menos un alergeno aplicado es un alergeno responsable de la reaccion alergica detectada en el sujeto. De hecho, utilizando un alergeno de este tipo, se obtiene un efecto protector y el sujeto tambien puede ser desensibilizado frente al alergeno. Ademas, los inventores han mostrado sorprendentemente que el alergeno causante es capaz de inducir Tregs en el sujeto, mientras que los alergenos no relacionados no pueden.

Un alergeno "responsable" de la reaccion alergica detectada (o un alergeno "causante") designa cualquier alergeno derivado de la sustancia a la que el sujeto es alergico. El alergeno puede ser un componente de la sustancia alergica (por ejemplo, una protelna de la leche o acaro del polvo domestico), o un fragmento de tal componente (por ejemplo, un fragmento de una protelna) que tiene epltopo(s) inmunogenico(s). Como se ha indicado anteriormente, el alergeno puede ser un extracto entero, una mezcla purificada, un inmunogeno aislado, etc.

En una realizacion de la invencion, la reaccion alergica detectada es una alergia a la leche y el alergeno administrado comprende una protelna de leche o un fragmento de la misma que tiene epltopo(s) inmunogenico(s).

La invencion tambien describe que la reaccion alergica detectada es una alergia a los acaros del polvo domestico y que el alergeno administrado comprende una protelna del acaro del polvo domestico o un fragmento del mismo que tiene epltopo(s) inmunogenico(s).

El protocolo de tratamiento epicutaneo puede ser ajustado por el medico. Tlpicamente, el alergeno se aplica repetidamente (es decir, varias veces), durante un perlodo de tiempo suficiente para causar una respuesta inmune protectora. En una realizacion preferida, el tratamiento se realiza durante un perlodo de al menos 3 meses, preferiblemente al menos 6 meses, y mas preferiblemente entre 6 y 36 meses. Durante este perlodo de tratamiento, el alergeno puede administrarse a diversas frecuencias, tales como semanalmente, cada dos dlas o diariamente. La dosis de alergeno utilizada para cada aplicacion puede ser ajustada por el experto en la tecnica. Tlpicamente, puede comprender entre 0,1 y 10000 pm, preferiblemente entre 20 y 1000 pm. La inmunidad protectora en el sujeto puede ser verificada en cualquier momento por examen convencional. En particular, la existencia de una respuesta inmunitaria protectora en los sujetos tratados puede ser verificada por una disminucion o desaparicion o ausencia de signos cllnicos de alergia, tales como trastornos digestivos, signos cutaneos (por ej. eccema o atopia dermatica), rinitis, o asma. Tambien puede realizarse la dosificacion de celulas inmunes o mediadores (tales como IgE) en el sujeto, aunque la ausencia de signos cllnicos es suficiente. Una vez que se ha generado la inmunidad protectora, es posible reducir el tratamiento (dosis, frecuencia de aplicacion, tiempo de aplicacion), o incluso detenerlo. Como se indico anteriormente, el tratamiento se mantiene tlpicamente durante un perlodo de tiempo de al menos 3 meses, con aplicaciones repetidas a intervalos diferentes.

En una realizacion preferida, el alergeno se aplica sin adyuvante. Sin embargo, aunque no se prefiera, el alergeno puede combinarse con un adyuvante, es decir, cualquier sustancia que, por ejemplo, active o acelere el sistema inmunitario para provocar una respuesta inmune mejorada. Ejemplos de adyuvantes incluyen sales minerales, tales como fosfato de calcio, fosfato de aluminio e hidroxido de aluminio; ADN o ARN inmunoestimulador, tales como oligonucleotidos CpG; protelnas, tales como anticuerpos o protelnas de union al receptor de tipo Toll; saponinas, p. ej. QS21; citoquinas; derivados muramil dipeptidos; LPS; MPL y derivados incluyendo 3D-MPL; GM-CSF (Factor

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estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos); imiquimod; partlcuias coloidales; adyuvante de Freund completo o incompleto; adyuvante de Ribi o la toxina bacteriana, p. ej., la toxina del colera o enterotoxina (LT).

En una realizacion preferida adicional, el alergeno se aplica sobre una zona intacta de la piel.

Se prefiere particularmente aplicar el alergeno sin adyuvante y en la piel intacta.

El alergeno se puede aplicar usando diferentes tecnicas o dispositivos adecuados para mantener el contacto entre el alergeno y la piel del sujeto. Dichos dispositivos incluyen, sin limitacion, un parche, una cinta, un aposito, una hoja o cualquier otra forma conocida por los expertos en la tecnica. Preferiblemente, el dispositivo de piel es un parche, incluso mas preferiblemente un parche oclusivo. Los dispositivos de parche preferidos no alteran la integridad de la piel, es decir, no son perforantes. En la realizacion mas preferida, el metodo de la invencion utiliza un dispositivo de parche de piel como se describe en las solicitudes de patente internacionales WO2002/071950 y WO 2007/122226. Dicho dispositivo es oclusivo y esta configurado para usar un alergeno en forma seca, manteniendose el alergeno en el parche a traves de fuerzas electrostaticas y/o de Van der Waals, sin la adicion del adhesivo. La preparacion y las caracterlsticas de tal dispositivo (denominado Viaskin®) se describen en detalle en las solicitudes identificadas anteriormente, que se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.

Para el funcionamiento de la presente invencion, resulta particularmente adecuado utilizar un dispositivo que comprende un soporte adaptado para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, teniendo este soporte, en su cara enfrentada a la piel dentro de la camara, el antlgeno seco adherido a traves de fuerzas electrostaticas y/o fuerzas de Van der Waals. Tras la aplicacion a la piel, la humedad aumenta en la camara, dando lugar a la disolucion del alergeno y el contacto con la piel.

En otra realizacion preferida de la invencion, el antlgeno se aplica sobre la piel del sujeto usando un dispositivo de parche oclusivo que comprende un soporte al que esta unido el alergeno. Preferentemente, el alergeno esta unido al soporte del parche a traves de fuerzas electrostaticas o de Van der Waals, sin la adicion del adhesivo. En realizaciones particulares, el soporte del parche puede comprender vidrio o un pollmero seleccionado del grupo que consiste en plasticos celulosicos (CA, CP), cloruro de polivinilo (PVC), polipropilenos, poliestirenos, poliuretanos, policarbonatos, poliacrllicos, poliolefinas, poliesteres, polietilenos y acrilatos de etileno-vinilo (EVA). El parche puede estar asegurado a la piel por un borde adhesivo.

En una realizacion mas preferida, la invencion usa una preparacion alergenica seca, que se aplica preferiblemente sobre la piel usando un dispositivo de piel electrostatica. A este respecto, el termino "seco" designa el hecho de que el alergeno esta sustancialmente en polvo, por ejemplo, en forma de partlculas que pueden individualizarse o aglomerarse.

Aunque menos preferido, el alergeno puede estar en forma llquida y ser aplicado usando dispositivos conocidos, tales como dispositivos oclusivos que tienen un deposito o una membrana perforada.

La invencion describe un metodo para prevenir la alergia en un nino, comprendiendo el metodo administrar epicutaneamente, a un nino menor de 6 anos que tiene una reaccion alergica detectada a la leche o al acaro del polvo domestico, al menos una protelna de la leche o de acaros del polvo domestico, previniendo dicha administracion epicutanea el inicio de la alergia a otros alergenos en dicho nino.

La invencion tambien describe un metodo para proteger a un nino del desarrollo de alergias multiples, comprendiendo el metodo la deteccion o verificacion en un nino de la aparicion de una primera reaccion alergica y, tras la deteccion de dicha primera reaccion alergica, la administration epicutanea a dicho nino de un alergeno responsable de dicha primera reaccion alergica, induciendo dicha administracion epicutanea una respuesta inmune en dicho nino que protege al nino del desarrollo de alergias multiples.

La invencion tambien describe una composition para uso para prevenir la alergia en un sujeto, en donde la composicion comprende un alergeno y se aplica epicutaneamente a un nino que tiene una reaccion alergica detectada. Mas preferiblemente, el nino es menor de 6 anos. Aun mas preferiblemente, el nino es alergico a la leche o a los acaros del polvo domestico. Lo mas preferiblemente, el nino es tratado despues de la deteccion de su primera alergia.

La invencion tambien describe un metodo para inducir Tregs en un sujeto alergico, comprendiendo el metodo la aplicacion epicutanea al sujeto de un alergeno causante.

Otros aspectos y ventajas de la invencion se describiran en la siguiente section experimental, que debe considerarse como ilustrativa.

Ejemplos

Metodos

Ratones

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En el estudio se utilizaron ratones BALB/c hembra de tres semanas de edad (Charles River Laboratories, Francia). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas comunitarias de cuidado de los animales.

Protocolo de sensibilizacion a la leche

Se sensibilizaron ratones BALB/c de tres semanas de edad a la leche al recibir 6 administraciones intragastricas semanales de leche mezclada con 10 pg de toxina de colera como adyuvante. Los sueros se recogieron a partir del plexo venoso retro-orbital antes y al final del periodo de sensibilizacion. A los ratones sin tratamiento previo se les extrajo sangre en los mismos dlas.

Protocolo de inmunoterapia epicutanea a la leche

Se realizo inmunoterapia epicutanea (EPIT) una vez a la semana durante 8 semanas consecutivas. En primer lugar, los ratones se anestesiaron intraperitonealmente con ketamina y xilazina y se afeitaron con una afeitadora electrica y crema depilatoria. Al dla siguiente se colocaron 100 pm de protelnas de leche en la espalda y se mantuvieron con un vendaje adhesivo durante 48 horas.

Protocolo de sensibilizacion a los cacahuetes

Dos semanas despues del final de la inmunoterapia epicutanea, los ratones se sometieron a un programa de sensibilizacion de cacahuetes validado mediante la administracion de una sola dosis (80 mg) de protelnas de cacahuete por via oral. Los ratones control (no sensibilizados a la leche, no tratados con leche) fueron sometidos al mismo programa de sensibilizacion del cacahuete como un control positivo. Los ratones sin tratamiento previo se incluyeron como controles negativos.

Exposicion oral sostenida del cacahuete

Los cacahuetes fueron reintroducidos en su regimen. Este consistla en la alimentacion exclusiva con cacahuetes en lugar de comida estandar de raton durante 4 dlas consecutivos. Los animales recibieron entonces cacahuetes mezclados en alimento estandar durante los 6 dlas siguientes y administracion intragastrica diaria de una solucion que contenla 10 mg de protelna de cacahuete durante los ultimos 3 dlas de esta segunda fase. Al final, los ratones fueron sacrificados despues de una anestesia profunda y se tomaron muestras para examinar la histologla del esofago, la expresion de ARNm de citoquinas en la mucosa esofagica y las citoquinas secretadas por esplenocitos reactivados. Tambien se tomaron muestras de sangre para medir las respuestas serologicas frente a los cacahuetes.

Ensayo de IgE, IgG1 e IgG2a especlficas en muestras de plasma

Se recogieron muestras de sangre bajo anestesia a partir del plexo venoso retro-orbital y las muestras de plasma se almacenaron a -20°C hasta nuevos analisis. Los anticuerpos especlficos se determinaron usando un ELISA cuantitativo, que se ha desarrollado internamente. Brevemente, las placas de microtitulacion se revistieron con 100 pl por pocillo de materiales alergenicos de la leche o del cacahuete a una concentration de protelna de 5 pg/ml. Se distribuyeron diluciones en serie de 50 pl de cada suero por pocillo y se incubaron durante 24 h a + 4 °C. Se utilizo como marcador un anticuerpo IgE, IgG1 o IgG2a anti-raton marcado con fosfatasa alcalina (Serotec, Oxford, Inglaterra). Se utilizo fosfato de para-nitrofenilo (pNPP - Sigma, Francia) como sustrato enzimatico. Las IgE, IgG1 e IgG2a especlficas se cuantificaron por comparacion con curvas de concentracion-respuesta obtenidas con un ensayo de IgE, IgG1 o IgG2a total realizado en condiciones identicas utilizando una fase solida recubierta con un anticuerpo IgE, IgG1 o IgG2a anti-raton (Serotec, Oxford, Inglaterra), que es complementaria al marcador, en lugar de protelnas alergenicas. Los patrones de inmunoglobulina de raton se obtuvieron de Serotec (Oxford, Inglaterra).

Respuestas celulares

Despues del sacrificio de ratones, los bazos se agitaron en una suspension de celulas individuales y se lavaron tres veces en RPMI-1640 (Gibco, Francia). Las celulas se contaron y se ajustaron a una densidad de cultivo de 4 x 106 celulas/ml y se colocaron suspensiones celulares de 500 pl en cada pocillo de una placa de microtitulacion de 24 pocillos (Nunc) junto con medio de 500 pl o leche o PPE (100 pg/ml). Despues de 72 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizo la presencia de citoquinas usando BioPlex cytokine Assay (BioRad, marnes-la-Coquette, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recuento celular y la tincion de CD4, CD25 y Foxp3 se realizaron usando anticuerpos especlficos (BD Pharmingen). La adquisicion se realizo en el citometro Canto II mediante la adquisicion de 5000 eventos en una puerta FSClo/SSClD predefinida. El porcentaje de celulas CD25 y Foxp3 positivas dentro de la poblacion de CD4+ se evaluo a continuation utilizando el software Flow Jo.

Resultados

Respuestas serologicas (figuras 2 y 3)

La sensibilizacion a la leche se realizo desde el dla 1 hasta el dla 43, y seguido por el tratamiento con EPIT de leche (vease el protocolo de la Fig. 1).

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Como se muestra en la Fig. 2a, la sensibilizacion a la leche se marca en ratones mediante una produccion de IgE especlfica (fig. 2a: dla 43).

En ratones sensibilizados con leche, el tratamiento EPIT de la leche (fig. 2a: del dla 44 al dla 127) indujo:

• En primer lugar, un aumento de la IgE especlfica (fig. 2a: del dla 78 al dla 98) durante el perlodo de 8 semanas de tratamiento,

• luego una disminucion de la IgE especlfica (fig 2a: del dla 99 al dla 127) un mes despues del final del EPIT, como se observo en estudios cllnicos;

• eventualmente, un aumento significativo (fig. 2b: de D78 a D127) de IgG2a especlfica, un marcador biologico Thl. El dla 127, la tasa alcanzada de IgG2a especlfica sobre IgE especlfica mostro una modificacion de la respuesta inmune de un perfil Th2 a un perfil Thl mas marcado, firmando as! la eficacia EPIT.

Durante la segunda fase del protocolo, los ratones fueron expuestos a PPE. Los resultados muestran que, entre los ratones expuestos al cacahuete al dla 99 (protocolo de sensibilizacion a la cacahuete), solo los ratones tratados simuladamente y los ratones control exhiben un aumento de la IgE especlfica a los cacahuetes (figura 3a). Por el contrario, en ratones previamente tratados por inmunoterapia epicutanea de leche, se observo un aumento significativo en la IgG2a especlfica a los cacahuetes (figura 3b), lo cual es caracterlstico de una respuesta tolerante a los cacahuetes. Estos resultados muestran que el tratamiento EPIT de la leche protegio a los ratones de la posterior alergia al EPP.

Respuesta celular (figuras 4 y 5)

i) Citoquinas (figura 4)

La Figura 4 muestra respuestas celulares de esplenocitos reactivados in vitro por la protelna de la leche de vaca (CMP) o por el extracto de protelna de cacahuete (PPE) medido por IL-4 (figura 4a) e IL-5 (figura 4b). Los resultados se expresan como media ± DE.

Figura 4-parte izquierda y figura 4b-parte izquierda: La reactivacion in vitro de los esplenocitos del grupo simulado fue marcada por una produccion de IL-4 e IL-5, que son citocinas Th2, en comparacion con el control y EPIT (p <0,05). Este fenomeno marca un efecto de protection del EPIT aplicado a los ratones EPIT de leche.

Figura 5-parte derecha y figura 5b-parte derecha (efecto del protocolo de exposition de la protelna del cacahuete en los grupos EPIT/simulado/control): exposicion a cacahuetes en ratones simulados tratados sensibilizados con leche y los ratones control se marcaron por una alta produccion de IL-4 e IL-5, que son citocinas Th2, en comparacion con los ratones tratados con EPIT sensibilizados con leche (p <0,05). Este fenomeno marca un efecto de proteccion global del EPIT aplicado a ratones sensibilizados con protelna de leche.

ii) Treg (figura 5)

La induction especlfica de celulas Treg se analizo despues de:

- Sensibilizacion (figura 5-leche - parte izquierda),

- Leche EPIT (figura 5-leche / - parte derecha),

- Exposicion de PPE en ratones simulados (figura 5 - PPE - parte izquierda),

- Exposicion de PPE en ratones tratados con EPIT de leche (figura 5 - PPE - parte derecha).

Los resultados de los inventores muestran que, en el grupo EPIT tratado con leche, se induce un alto nivel de celulas Treg (CD4+CD25+Foxp3+) despues de la sensibilizacion a la leche. Esta poblacion de Treg es inducida especlficamente por inmunoterapia. Por el contrario, el numero de celulas Treg no aumento por reactivacion in vitro en presencia de PPE. Sin estar limitado por la teorla, parece probable que la presencia de celulas Treg inducidas especlficamente por EPIT-leche (figura 5-leche / parte derecha) dirige la respuesta inmune al PPE hacia un perfil tolerante sin produccion de citocinas Th2.

Infiltracion de eosinofilos en el esofago (figura 6)

La exposicion sostenida del cacahuete oral a los cacahuetes provoca principalmente al esofago e induce una alta infiltracion de eosinofilos para los ratones sensibilizados a los cacahuetes (control, figura 6).

Se observo una mayor infiltracion de eosinofilos en ratones sensibilizados y no tratados con leche, y luego expuestos a cacahuetes con el protocolo de sensibilizacion del PPE (figura 6).

Cuando los ratones sensibilizados y tratados con EPIT a la leche fueron expuestos a cacahuetes para inducir la inflamacion del esofago, no se observo infiltracion eosinofllica en el esofago (EPIT, figura 6), a un nivel similar al de los ratones no tratados (ratones no sensibilizados a la leche y a los cacahuetes: no tratados, figura 6).

Discusion

5 Este estudio ha mostrado sorprendentemente in vivo que una desensibilizacion temprana a la leche influye significativamente en la respuesta inmune a otros alergenos. Esta es la primera demostracion de un efecto preventivo sobre la alergia causada por la terapia epicutanea. De hecho, el tratamiento EPIT frente a la leche indujo una production especlfica de celulas T reguladoras (Treg). La induction de la tolerancia a la leche a traves de Treg evito la sensibilization frente a otros alergenos, tales como los cacahuetes o HDM. Se demostro que despues de un 10 proceso de desensibilizacion eficaz a la leche por EPIT, los animales tratados fueron protegidos de la sensibilizacion frente a PPE y se obtuvo una respuesta tolerante con una alta produccion de IgG2a especlfica y bajos niveles de citocinas Th2 secretadas por esplenocitos reactivados. Ademas, el protocolo de desensibilizacion al cacahuete indujo una muy baja infiltracion eosinofllica en el esofago.

Estos resultados demuestran, por lo tanto, que el tratamiento EPIT puede inducir una protection eficaz contra 15 alergias adicionales en sujetos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende un alergeno de la leche para su uso en el tratamiento de un nino menor de 6 anos que tiene una alergia detectada a la leche, para evitar que dicho nino desarrolle una alergia adicional a un alergeno alimentario diferente, en donde la composicion se administra repetidamente epicutaneamente a dicho nino

5 utilizando un dispositivo de parche oclusivo no invasivo, protegiendo dicha administracion al nino del desarrollo de al menos una alergia adicional al alergeno alimentario diferente.
2. La composicion para su uso de la reivindicacion 1, en la que el nino es un bebe o un nino pequeno.
3. La composicion para su uso de la reivindicacion 1 o 2, en la que la alergia detectada es la primera alergia detectada en dicho nino y en la que el alergeno se administra despues de la deteccion o verificacion de dicha

10 primera reaccion alergica.
4. La composicion para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el alergeno se aplica en ausencia de adyuvante.
5. La composicion para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el alergeno se aplica sobre una zona intacta de la piel.

15 6. La composicion para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el alergeno se aplica

repetidamente durante un periodo de 3 a 36 meses.
7. La composicion para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para proteger a dicho nino del desarrollo de alergias multiples.
8. La composicion para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para proteger a dicho nino del 20 desarrollo de una alergia al cacahuete.