ES2609839T3 - Método de vacunación - Google Patents

Abstract

La preparación de un antígeno específico para un patógeno infeccioso, para su uso en la amplificación de una respuesta inmunitaria preexistente contra dicho patógeno en un sujeto mamífero, en el que dicha respuesta inmunitaria preexistente resulta de la previa inmunización parenteral o vacunación del sujeto contra dicho patógeno, en la que dicha preparación de antígeno es sin adyuvante y se aplica a la piel intacta del sujeto con un dispositivo de parche de piel, y en el que dicha respuesta inmunitaria amplificada está orientada a Th1.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de vacunacion Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos mejorados para la vacunacion de un sujeto. En particular, la presente invencion describe el uso de la aplicacion de un antigeno de la piel para amplificar y mejorar la inmunidad preexistente contra un patogeno seleccionado en un sujeto. La presente invencion describe el uso de la aplicacion en la piel, en combinacion con la vacuna convencional o iniciacion para mejorar la inmunizacion o vacunacion de un sujeto contra un patogeno seleccionado.

Antecedentes de la invencion

La vacunacion de un sujeto es un metodo para generar una respuesta protectora inmunitaria contra un patogeno seleccionado. La vacunacion puede ser preventiva, es decir, realizada antes de la exposicion del sujeto al patogeno, y/o curativa, es decir, llevada a cabo despues de la exposicion, con el fin de aumentar, ampliar o estimular la defensa inmunologica del sujeto contra el agente patogeno.

La vacunacion convencional comprende la administracion parenteral, nasal u oral de un antfgeno al sujeto. La mayona de los programas de vacunacion comprende la (repetida) administracion parenteral (por ejemplo, inyeccion) a un sujeto de un antfgeno espedfico seleccionado del patogeno para asf inducir o amplificar el sistema inmunologico del sujeto contra el patogeno. La vacunacion convencional tambien puede ser oral o nasal.

Generalmente la vacunacion comprende un protocolo de administracion repetida, incluyendo una administracion de iniciacion seguida de una o varias administraciones de refuerzo. En la mayona de los casos, tal vacunacion de estfmulo primario, que requiere mas de una vez la inmunizacion, se realiza utilizando las mismas vacunas varias veces como estfmulos homologos. Ademas, en los programas de vacunacion convencionales, el antfgeno se usa generalmente en combinacion con uno o mas adyuvantes, con el fin de generar la respuesta inmunitaria apropiada.

Wu et al. (2005) describe un metodo de estfmulo primario heterologo convencional en el que la iniciacion se realiza mediante la inyeccion de un primer antfgeno (un plasmido de ADN que codifica un antfgeno) y la estimulacion que se realiza mediante la inyeccion de una segunda preparacion (un vector de adenovirus incompetente para la replicacion que codifica el mismo antfgeno). Este enfoque ha sido probado en el desarrollo de vacunas contra una serie de patogenos virales, incluyendo el VIH, virus de la hepatitis C, virus del Ebola y el virus de la encefalitis equina venezolana. La iniciacion con ADN seguida por la estimulacion con adenovirus tambien se ha evaluado como un enfoque para la inmunizacion contra una enfermedad bacteriana (McConnell et al., 2007).

La vacunacion convencional se ha investigado usando diferentes tipos de antfgenos, como por ejemplo, protemas, peptidos, celulas, patogenos inactivados, toxoides, partfculas similares a virus, etc.

La aplicacion topica de formulaciones de vacunas en la piel tambien se ha propuesto.

En particular, Partidos et al. 2003, han demostrado que una respuesta inmunitaria puede ser causada por via epicutanea, sujeta a condiciones espedficas de administracion, el uso de un adyuvante particular y el pretratamiento de la piel.

El documento US 7.378.097 se refiere tambien a la vacunacion mediante la aplicacion, sobre la piel previamente tratada, de composiciones de antfgeno adyuvante.

Mishra et al., 2006, propone un sistema de inmunizacion transcutanea usando nuevas construcciones vesiculares, vesosomas fusogenicos, que entregan antfgenos a traves de la administracion topica. Sin embargo, este sistema vesicular es un sistema lfquido, no oclusivo, y necesita la aplicacion de un antfgeno junto con un adyuvante sobre la piel hidratada.

Hammond et al., 2001, propone el metodo de vacunacion transcutanea de ratones con toxina del colera y adyuvante, por la cual se aplican soluciones lfquidas de antfgenos con adyuvante por via topica a la piel hidratada.

Todos los metodos anteriores requieren el uso de un adyuvante para provocar una respuesta inmunitaria. Ademas, utilizan preparaciones lfquidas, y la naturaleza de las respuestas inmunologicas provocadas no es controlada ni analizada.

Los documentos W02007/122226 y W02009/080933 describen la inmunizacion epicutanea usando preparaciones de antfgenos que carecen de adyuvante aplicadas sobre piel intacta. Esta aplicacion muestra que una respuesta protectora puede ser obtenida sin adyuvante anadido y sin el pretratamiento de la piel, mediante la aplicacion de un antfgeno en la piel.

A pesar de las estrategias y respuestas positivas para la vacunacion o la proteccion de sujetos marnfferos, todavfa hay una necesidad en la tecnica de metodos de inmunizacion mejorados, que son mas convenientes para el

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paciente e inducen una respuesta inmunitaria adecuada y eficaz para prevenir o tratar dolencias tales como enfermedades infecciosas.

Compendio de la invencion

La presente solicitud proporciona un nuevo metodo de desarrollo de la inmunidad contra patogenos en sujetos mairnferos. Mas particularmente, la invencion proporciona metodos de amplificacion y/u orientacion de la inmunidad preexistente en los sujetos que utilizan la aplicacion de antigenos epicutaneos. Tal como se divulgara en la presente solicitud, este metodo conduce a una fuerte respuesta inmunitaria orientada a TH1 y es mucho mas conveniente que los protocolos de vacunacion actuales. En particular, la invencion muestra que un estfmulo cutaneo provoca, tanto una amplificacion de una respuesta inmunitaria pre-existente como una polarizacion por TH1 de la respuesta inmunitaria, lo cual es particularmente adecuado para la vacunacion eficaz. La invencion tambien describe un metodo para estimulacion y/u orientacion a TH1 de la respuesta inmunitaria preexistente contra un patogeno en un sujeto mamnfero, en el que el metodo comprende aplicar en la piel de un sujeto, que tiene una respuesta inmunitaria preexistente contra un patogeno, un antfgeno espedfico para el patogeno; conduciendo dicha aplicacion en la piel a la estimulacion y orientacion a TH1 de la respuesta.

En particular, la invencion se refiere a la preparacion de un antigeno tal como es definido en las reivindicaciones. La invencion tambien se refiere a la preparacion de un antigeno espedfico para un patogeno, para su uso en la amplificacion y/u orientacion a Th1 de una respuesta inmunitaria preexistente contra dicho patogeno en un sujeto mamffero mediante la aplicacion de dicha preparacion en la piel del sujeto. Preferiblemente, la preparacion de antigeno es seca y/o sin adyuvante.

Preferiblemente, la preparacion de antigeno se aplica sobre piel intacta del sujeto. Ademas, en una realizacion preferida, la preparacion de antigeno se aplica sobre la piel del sujeto mediante un dispositivo de parche oclusivo.

La invencion tambien se refiere al uso de la preparacion de un antigeno espedfico para un patogeno para la fabricacion de un medicamento para amplificacion y preferiblemente orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria preexistente contra dicho patogeno en un sujeto mamffero, mediante la aplicacion de dicha preparacion a la piel del sujeto. Preferiblemente, el antfgeno es seco y/o sin adyuvante.

Tal como sera descrito en la presente solicitud, la inmunidad preexistente puede ser el resultado de la previa vacunacion convencional del sujeto contra dicho patogeno, de la previa iniciacion inmunologica convencional del sujeto contra dicho patogeno y/o de la previa exposicion natural del sujeto a dicho patogeno.

La presente invencion tambien describe un metodo de vacunacion de un mamffero frente a un patogeno seleccionado, en el que el metodo comprende (i) la administracion convencional al mamffero de un antfgeno espedfico para el patogeno, para causar o estimular una respuesta inmunitaria a dicho patogeno, y (ii) la(s) subsiguiente(s) aplicacion(es), en la piel del mamffero, de un antfgeno espedfico para el patogeno. Tal como se documentara en la presente memoria, dicha aplicacion en la piel permite la amplificacion y la orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria. La etapa (ii) puede ser llevada a cabo poco despues de la etapa (i), o mas tarde, siempre que aun exista una inmunidad contra el patogeno en el sujeto. La etapa (ii) consiste tfpicamente en 1, 2 o 3 tratamientos de estfmulo, que pueden realizarse en diferentes intervalos de tiempo para cada uno, dependiendo, por ejemplo, del agente patogeno, tfpicamente entre 1 y 18 meses.

Un objeto adicional de la presente invencion se refiere, por tanto, a la preparacion de un antfgeno para su uso en la vacunacion de un mamffero contra un patogeno seleccionado, siendo el antfgeno administrado convencionalmente por primera vez al mamffero para causar o estimular una respuesta inmunitaria a dicho patogeno, y subsecuentemente aplicado sobre la piel del mamnfero.

Esta invencion tambien describe un metodo de estimulacion de una respuesta inmunitaria en un sujeto mamffero inmunizado contra un patogeno, en el que el metodo comprende la aplicacion de un antfgeno espedfico para el patogeno sobre la piel de dicho sujeto, preferiblemente en una preparacion seca sin adyuvante. Mas preferiblemente, la preparacion de antfgeno es sin adyuvante y se aplica sobre una zona de piel intacta del sujeto.

Esta invencion tambien describe un metodo de amplificacion y orientacion a Th1 de una respuesta inmunitaria contra un patogeno en un sujeto mamffero pre-inmunizado, en el que el metodo comprende la aplicacion de un antfgeno espedfico para el patogeno sobre piel intacta de dicho sujeto pre-inmunizado, preferiblemente de una preparacion seca y/o sin adyuvante.

La invencion se refiere tambien a un antfgeno espedfico para un patogeno (preferiblemente en una preparacion seca y/o sin adyuvante) para su uso en la amplificacion y orientacion a Th1 de una respuesta inmunitaria contra dicho patogeno, en un sujeto mamffero pre-inmunizado por aplicacion(es) del antfgeno a la piel del sujeto.

La invencion tambien describe un metodo para inducir o estimular una respuesta inmunitaria especifica de patogeno, orientada a Th1 en un sujeto mamffero, en el que el metodo comprende la administracion convencional al mamffero de un antfgeno especifico para el patogeno para causar o estimular una respuesta inmunitaria contra dicho patogeno; y posteriormente la(s) aplicacion(es), en piel intacta del mamffero, de un antfgeno espedfico para el

patogeno, permitiendo la amplificacion de una respuesta inmunitaria orientada a Th1.

La invencion tambien describe un metodo para amplificar una respuesta inmunitaria preexistente contra un patogeno en un sujeto mairnfero, en el que el metodo comprende la aplicacion de una preparacion seca y sin adyuvante, de un antigeno espedfico para dicho patogeno, en piel intacta del sujeto.

5 La invencion tambien describe un metodo de estimulacion de una respuesta inmunitaria en un sujeto mamffero pre- inmunizado contra un patogeno, en el que el metodo comprende la aplicacion de una preparacion de antigeno espedfico para dicho patogeno sobre la piel de dicho sujeto bajo condiciones que permiten la amplificacion y la orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria.

Esta invencion tambien describe una composicion que comprende la preparacion inyectable de un antigeno 10 espedfico para un patogeno seleccionado; y la preparacion seca sin adyuvante de un antigeno espedfico para dicho

patogeno seleccionado, adecuada para su administracion a la piel, para aplicacion secuencial separada a un sujeto mamffero.

La invencion tambien describe un conjunto (kit) que comprende una preparacion inyectable de un antigeno espedfico para un patogeno seleccionado; y una preparacion seca, sin adyuvante, de un antigeno espedfico para 15 dicho patogeno seleccionado, adecuada para su administracion a la piel.

La invencion puede usarse en cualquier mamffero, particularmente cualquier sujeto humano, para inducir o amplificar una respuesta inmunitaria protectora y/o curativa contra cualquier patogeno. La invencion tambien se puede usar en el campo veterinario para tratar animales tales como ganado vacuno o animales domesticos, incluyendo vacas, cerdos, caballos, perros, gatos, etc. Es particularmente adecuada para vacunar contra patogenos 20 infecciosos.

Leyendas de las figuras

Fig. 1: Influencia del estfmulo de la piel en las respuestas de IgG1 anti-HBsAg Fig. 2: Influencia del estfmulo de la piel en las respuestas de IgG2a anti-HBsAg

Fig. 3: Celulas productoras de citoquina en ratones estimulados dos veces por aplicacion en la piel o inyeccion

25 Fig. 4: Secrecion de citoquinas en ratones estimulados dos veces por aplicacion en la piel o inyeccion

Fig. 5: Respuestas de IL-5 en ratones estimulados dos veces por aplicacion en la piel o inyeccion (ELISA)

Fig. 6: Respuestas de IFN-y en ratones estimulados dos veces por aplicacion en la piel o inyeccion (ELISA)

Fig. 7: Comparacion de la respuesta inmunitaria inducida en piel intacta y con remocion de cinta: nivel de IgE (7A) e IgG2a (7B) espedfico.

30 Fig. 8: Comparacion de la respuesta inmunitaria inducida en piel intacta y con remocion de cinta: recuento de eosinofilos en el esofago

Fig. 9: Comparacion de la respuesta inmunitaria inducida en piel intacta y con remocion de cinta: Expresion mRNA de citoquinas en el esofago: eotaxina (Fig. 9A), IL-5 (Fig. 9B) e IL-13 (Fig. 9C)

Fig. 10: Comparacion de la respuesta inmunitaria inducida en piel intacta y con remocion de cinta: Expresion mRNA 35 en el esofago: GATA-3 (Fig. 10A), Foxp3 (Fig. 10B)

Fig. 11: Comparacion de la respuesta inmunitaria inducida en piel intacta y con remocion de cinta: datos histologicos - relacion vellosidad/criptica en el yeyuno

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos para mejorar la vacunacion. En particular, la invencion 40 se refiere a la estimulacion de una inmunidad preexistente en un sujeto utilizando el suministro de antfgeno epicutaneo. La invencion describe metodos de vacunacion de “estfmulo primario” mejorados en los cuales el sistema inmunologico es inducido por la administracion convencional de una composicion de antfgeno de iniciacion, y estimulado por la aplicacion epicutanea de una composicion de antfgeno de estimulacion. La presente invencion tambien se refiere a metodos para producir una respuesta inmunitaria protectora orientada a TH1 contra un 45 patogeno en un sujeto pre-inmunizado usando administracion(es) de antfgeno epicutaneo. Este metodo es seguro para el paciente, practico, y produce una fuerte respuesta inmunitaria orientada a Th 1 en sujetos mamfferos.

La presente invencion muestra que una reaccion inmunologica espedfica provocada por iniciacion convencional, previa vacunacion y/o exposicion natural a un patogeno, la cual esta orientada a TH2, puede ser eficazmente amplificada y polarizada por TH1 tras la estimulacion epicutanea del sujeto. Los resultados presentados muestran 50 que una estimulacion epicutanea sin adyuvante y sin pretratamiento de piel conduce a una amplificacion eficaz y a la

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orientacion a TH1 de una respuesta inmunitaria preexistente. Los resultados muestran ademas que tal respuesta es particularmente pronunciada cuando el estimulo se realiza utilizando una preparacion de antigeno seco y un dispositivo de piel oclusivo.

La invencion puede usarse para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria y para producir inmunidad contra cualquier patogeno. La invencion tambien puede utilizarse para prevenir o tratar enfermedades provocadas por un patogeno.

La presente descripcion de la memoria se entendera mejor haciendo referencia a las siguientes definiciones: Definiciones

Como se usa en la presente memoria, la administracion o vacunacion "convencional" designa la administracion o vacunacion parenteral, oral o nasal. La administracion parenteral puede realizarse mediante inyeccion (por ejemplo, intramuscular, intradermica, intravenosa o subcutanea), puncion, y/o administracion transdermica. Una v^a de administracion parenteral preferida es mediante inyeccion.

La aplicacion epicutanea o cutanea designa la aplicacion del antigeno sobre la piel del sujeto bajo condiciones que permitan un contacto con la superficie de la piel. La aplicacion en la piel de acuerdo con la presente invencion se realiza preferiblemente en piel intacta (o no pretratada). La aplicacion en la piel debe mantenerse durante un penodo de tiempo suficiente para permitir la penetracion de un antigeno en la capa o capas superficiales de la piel y/o el contacto del antfgeno con celulas inmunes.

Dentro del contexto de la presente invencion, el termino "piel intacta" indica que debe mantenerse sustancialmente la integridad de la capa de estrato corneo. Trabajos anteriores han sugerido que, para una inmunoterapia epicutanea eficiente, una penetracion mejorada del antigeno y la activacion de la respuesta inmunitaria, es necesario eliminar el estrato corneo de la piel (por ejemplo, a traves de abrasivos o remocion de cinta profunda) o pasar a traves del estrato corneo (Por ejemplo, utilizando microagujas) (Frerichs et al., Vaccine 2008, p2782; Strid et al., Eur. J. Immunol 2004 p2100). Estos trabajos anteriores indican que, alterando la integridad del estrato corneo, los queratinocitos y las celulas de Langerhans se activan o estimulan, dando lugar a una mejor respuesta del organismo. En contraste con estas observaciones previas, la invencion muestra que es preferible aplicar antfgenos en la piel intacta (es decir, no tratada previamente), por ejemplo, sobre una superficie o porcion de la piel donde se mantiene esencialmente la integridad del estrato corneo. La invencion demuestra ciertamente que, para evitar una respuesta inmunitaria Th2 sesgada, es importante mantener la integridad del estrato corneo y el estado de activacion natural de los queratinocitos y celulas de Langerhans que estan situadas por debajo del estrato corneo. Manteniendo esta integridad, la respuesta obtenida esta altamente orientada en el sentido de tolerancia. Por consiguiente, aunque se puede realizar una limpieza suave de la superficie de la piel en el lugar de aplicacion, por ejemplo, hidratacion, limpieza con agua o una remocion simple muy suave, para eliminar, por ejemplo, corneocitos, la piel no debe ser tratada previamente para mantener la integridad sustancial del estrato corneo. En particular, no se debe realizar la remocion de cinta o abrasion fuerte de la piel, ya que tales pretratamientos alteran o eliminan todo o parte del estrato corneo y provocan la estimulacion de queratinocitos. De forma similar, se debe evitar la perforacion del estrato corneo.

Tal como se describe aqrn, el termino "vacunar" designa tfpicamente la administracion secuencial de uno o mas antfgenos a un mamffero, para producir y/o aumentar una respuesta inmunitaria contra el(os) antfgeno(s). La administracion secuencial incluye una inmunizacion de iniciacion seguida por una o varias inmunizaciones de estfmulo.

Dentro del contexto de la presente invencion, el termino "patogeno" se refiere a cualquier agente que pueda causar una condicion patologica. Ejemplos de “patogenos” incluyen, sin limitacion, celulas (por ejemplo, celulas bacterianas, celulas de marnffero enfermo, celulas de cancer de marnffero), hongos, parasitos, virus, priones o toxinas. Los patogenos preferidos son patogenos infecciosos. En una realizacion particular, el patogeno infeccioso es un virus, tal como el virus de la hepatitis, rotavirus, virus de la varicela, influenza, citomegalovirus, gripe, VIH, virus del Ebola o Rabia.

Ejemplos espedficos de patogenos infecciosos incluyen, sin limitacion, C. diphtheriae, C. tetani, B. Pertussis, Poliovirus, Paperas, Rubeola, Varicela, Streptococcus pneumoniae, Rotavirus, VPH (Virus del Papiloma Humano), Tripanosomiasis africana (enfermedad del sueno), Antrax, Influenza aviar (“gripe aviaria”), Enfermedad de la ulcera de Buruli, Colera, Fiebre hemorragica de Crimea-Congo, Dengue y fiebre hemorragica del dengue, fiebre hemorragica del Ebola, Enterovirus no polio, Haemophilus influenzae tipo B (HiB), Virus Hendra, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Influenza (Estacional), Fiebre de Lassa, Legionelosis, Lepra, Malaria, Fiebre hemorragica de Marburgo, Sarampion, Meningitis meningococica, Virus de Nipah, Peste, Poliomielitis, Fiebre del valle del Ritt, Viruela, Tuberculosis o Patogeno de la fiebre amarilla.

Un antfgeno, como es usado aqrn, designa cualquier molecula que puede causar una respuesta inmunitaria de celulas T o celulas B en un sujeto. Un antfgeno espedfico para un patogeno es, tfpicamente, un elemento obtenido o derivado de dicho patogeno, que contiene un epftopo, y que puede causar una respuesta inmunitaria contra el patogeno. Dependiendo del agente patogenico, el antfgeno puede ser de naturaleza diversa, tal como un (poli)

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peptido, protema, acido nucleico, Kpido, celula, etc. Formas debilitadas vivas de patogenos (por ejemplo, bacterias, virus), o formas muertas o inactivadas de los mismos pueden ser usadas, o material purificado del mismo, tales como protemas, peptidos, l^pidos, etc. El antigeno puede ser de origen natural o creado artificialmente. Puede ser exogeno para el mairnfero tratado, o endogeno (por ejemplo, antigenos tumorales). El antigeno puede producirse por tecnicas conocidas per se en la tecnica, tales como por ejemplo tecnologfas sinteticas o recombinantes, o enfoques enzimaticos.

Ejemplos espedficos de antfgenos adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, por ejemplo, antigenos virales, preferiblemente antigenos de superficie vmca, tales como, por ejemplo, antigeno del virus de Hepatitis B o A (HBsAg, HAsAg). Otros antigenos incluyen antigenos asociados a tumores, es decir, antfgenos expresados por una celula tumoral pero no por celulas normales, protemas bacterianas, etc.

En una realizacion particular, el antigeno es una protema, polipeptido y/o peptido. Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polfmero de residuos de aminoacido. Los terminos se aplican tambien a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos pueden ser residuos modificados o no naturales, tal como un mimetico qmmico artificial de un aminoacido correspondiente que se produce naturalmente. Debe entenderse que el termino "protema" tambien incluye fragmentos o variantes de diferentes antigenos, tales como fragmentos que contienen epftopos, o protemas obtenidas de un patogeno y subsiguientemente modificadas enzimaticamente, qmmicamente, mecanicamente o termicamente.

Como se expondra mas adelante, el antfgeno puede estar en diversos estados, tales como lfquido o seco. Tfpicamente, para la(s) aplicacion(es) en la piel, el antfgeno esta en estado seco, mientras que para la vacunacion convencional o iniciacion, el antfgeno esta en forma Uquida.

La invencion describe nuevos metodos para mejorar la inmunidad preexistente en un sujeto mamffero usando la aplicacion de un antfgeno epicutaneo. La invencion puede usarse para mejorar, estimular, reforzar, expandir y/o repolarizar una respuesta inmunitaria preexistente, la cual puede resultar de:

• vacunacion convencional previa del sujeto contra un patogeno seleccionado;

• iniciacion convencional previa del sujeto contra un patogeno seleccionado; y/o

• exposicion natural del sujeto a un patogeno seleccionado.

En una primera realizacion, la invencion reside asf en el uso de un antfgeno para estimular y preferiblemente polarizar por TH1 una respuesta inmunitaria existente contra un patogeno en un sujeto marnffero que ha recibido una vacuna convencional, administrandosele dicho antfgeno al sujeto por aplicacion(es) en la piel. La inmunidad preexistente puede ser resultado de una vacuna convencional realizada hace mucho tiempo en el sujeto, por ejemplo, durante la infancia. El penodo de tiempo entre la vacuna convencional y la administracion en la piel puede variar sustancialmente, siempre y cuando el sujeto aun presente una inmunidad preexistente. La presencia de tal inmunidad preexistente puede comprobarse, en caso necesario, mediante metodos convencionales. Este metodo es adecuado, por ejemplo, en el caso de sujetos vacunados contra hepatitis o tetanos durante la infancia. El antfgeno utilizado para el estfmulo de la piel puede ser inactivo o una subunidad (por ejemplo, influenza, hepatitis B o A, tos ferina) o vivo atenuado (varicela, tuberculosis, poliomielitis, influenza, rabia, fiebre amarilla, etc.).

En otra realizacion, la invencion reside en el uso de un antfgeno para estimular y preferiblemente polarizar por TH1 una respuesta inmunitaria existente contra un patogeno en un sujeto mamffero que ha recibido una iniciacion convencional, administrandose dicho antfgeno al sujeto mediante aplicacion(es) en la piel. Como se ilustra en los ejemplos, los inventores han demostrado que la combinacion de iniciacion parenteral y estfmulo cutaneo da como resultado una respuesta inmunitaria fuerte y orientada a Th1.

La invencion tambien describe un metodo para vacunar a un sujeto contra un patogeno, que comprende una primera etapa de iniciacion convencional del sujeto con un antfgeno para causar o estimular una respuesta inmunitaria contra dicho patogeno, seguida por una etapa de estimulacion de la respuesta inmunitaria por aplicacion en la piel de un antfgeno especffico para el patogeno.

La iniciacion puede comprender una o varias administraciones secuenciales de antfgeno. En un metodo mas tipico, la iniciacion convencional comprende una o dos administraciones de antfgeno. La iniciacion preferida es por inyeccion.

Para administracion(es) convencional(es), el antfgeno se combina tfpicamente con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen cualquier sustancia que, por ejemplo, activa o acelera el sistema inmunologico para provocar una respuesta inmunitaria especffica del antfgeno mejorada. Ejemplos de adyuvantes que pueden usarse en la presente invencion incluyen sales minerales, tales como fosfato de calcio, fosfato de aluminio e hidroxido de aluminio; ADN inmunoestimulador o ARN, tales como oligonucleotidos CpG; Protemas, tales como anticuerpos o protemas de union al receptor de tipo Toll; Saponinas, p. QS21; citoquinas; derivados muramil dipeptidos; LPS; MPL y derivados incluyendo 3D-MPL; GM-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos); imiquimod;

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part^culas coloidales; Adyuvante de Freund completo o incompleto; adyuvante de Ribi o toxina bacteriana, por ejemplo, la toxina del colera o enterotoxina (LT).

Para la iniciacion convencional se utiliza una composicion de antigeno de iniciacion, la cual comprende el antfgeno, tfpicamente en combinacion con un adyuvante. Dicha composicion esta generalmente en forma l^quida, adecuada para inyeccion. La composicion puede comprender ademas excipientes adecuados, tales como un diluyente, un vehnculo, una solucion isotonica, agua, etc.

Como se ha indicado anteriormente, la invencion combina la iniciacion convencional o vacunacion con estfmulo cutaneo. La etapa de estfmulo cutaneo comprende tfpicamente la aplicacion de una preparacion de antfgeno sobre la piel del sujeto, bajo condiciones que permitan un contacto con la piel. La aplicacion se realiza tfpicamente bajo condiciones y/o durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el antigeno penetre en el estrato corneo de la epidermis y/o alcance las celulas inmunes.

La aplicacion en la piel se realiza preferiblemente utilizando un dispositivo adecuado para mantener el contacto entre la preparacion de antigeno y la piel del sujeto. Dichos dispositivos incluyen, sin limitacion, un parche, una cinta, un aposito, una hoja o cualquier otra forma conocida por los expertos en la tecnica. Preferiblemente, el dispositivo para la piel es un parche, incluso mas preferiblemente un parche oclusivo. Los dispositivos de parche preferidos no alteran la integridad de la piel.

Los resultados presentados en la presente solicitud muestran que una pronunciada respuesta inmunitaria orientada a Th1 se produce cuando el estfmulo de la piel se realiza utilizando un dispositivo de parche de piel oclusivo.

En la realizacion mas preferida, el metodo de la invencion utiliza un dispositivo de parche de piel tal como se describe en las solicitudes de patente internacionales WO 2002/071950 y WO 2007/122226.

Dicho dispositivo es oclusivo y esta configurado para usar un antigeno en forma seca, manteniendose el antfgeno en el parche a traves de fuerzas electrostaticas y/o fuerzas de Van der Waals, sin adicion de adhesivo. La preparacion y las caractensticas de tal dispositivo (denominado Viaskin®) se describen en detalle en las solicitudes citadas anteriormente.

Para el funcionamiento de la presente invencion, es particularmente adecuado utilizar un dispositivo que comprende un soporte adaptado para crear con la piel una camara hermeticamente cerrada, en el que el lado del soporte que da hacia la piel dentro de la camara tiene el antigeno seco adherido a traves de fuerzas electrostaticas y/o fuerzas de Van der Waals. Tras la aplicacion a la piel, la humedad aumenta en la camara, dando lugar a la disolucion del antigeno y al contacto con la piel.

En otra realizacion preferida de la invencion, el antigeno se aplica sobre la piel del mairnfero usando un dispositivo de parche oclusivo que comprende un soporte al que esta unido el antigeno. Preferiblemente, el antfgeno esta unido al soporte del parche a traves de fuerzas electrostaticas o de Van der Waals, sin adicion de adhesivo. En realizaciones particulares, el soporte del parche puede estar compuesto de vidrio o un polfmero elegido del grupo que consiste en plasticos celulosicos (CA, CP), cloruro de polivinilo (PVC), polipropilenos, poliestirenos, poliuretanos, policarbonatos, poliacnlicos, poliolefinas, poliesteres, polietilenos y etileno vinil acrilatos (EVA).

En una realizacion mas preferida, el estfmulo de la piel se lleva a cabo utilizando una preparacion de antigeno seco, que se aplica preferiblemente sobre la piel usando un dispositivo de piel electrostatico. A este respecto, el termino "seco" designa el hecho de que la preparacion de antigeno de estfmulo es sustancialmente en polvo, por ejemplo, en forma de partfculas que pueden individualizarse o aglomerarse.

Aunque menos preferido, la preparacion de antfgeno de estfmulo puede estar en forma lfquida y aplicarse utilizando dispositivos conocidos, tales como dispositivos oclusivos que tienen un deposito o una membrana perforada.

En otra realizacion preferida, la invencion combina una preparacion de antfgeno de iniciacion con adyuvante lfquido y una preparacion de antfgeno de estfmulo seco.

Ademas, en una realizacion mas preferida, la preparacion de antfgeno de estfmulo se formula o se usa sin adyuvante. De hecho, la invencion muestra que, incluso en ausencia de adyuvante anadido en la preparacion de estfmulo, el metodo conduce a una respuesta inmunitaria potente y polarizada por TH1.

En otra realizacion preferida, la invencion combina asf una preparacion de antfgeno de iniciacion con adyuvante lfquido, y una preparacion de antfgeno de estfmulo, sin adyuvante, seca.

La preparacion de antfgeno de estfmulo puede contener excipientes inertes u otros ingredientes, tales como potenciadores de penetracion o reactivos de hidratacion. Sin embargo, se prefiere utilizar una preparacion de antfgeno de estfmulo que contenga, como unica sustancia activa, uno o varios antfgenos, es decir, desprovisto de otras sustancias activas tales como adyuvantes o potenciadores de penetracion.

En la etapa de estfmulo, uno o mas dispositivos de parche pueden aplicarse, una o mas veces, directamente a la piel intacta, sin ningun pretratamiento, preferiblemente sobre una parte sin pelo del cuerpo. De hecho, aunque

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abarcado por la presente solicitud, no se requiere tratar la piel antes de la aplicacion del dispositivo. Ademas, la presente solicitud muestra sorprendentemente que el pretratamiento de la piel influye sustancialmente en el tipo de respuesta inmunitaria inducida por los estfmulos epicutaneos. Mas particularmente, cuando la preparacion de antigeno es sin adyuvante y se aplica sobre piel intacta, la respuesta inmunitaria preexistente se amplifica fuertemente y se polariza por Th1. Esto fue totalmente inesperado y es particularmente ventajoso.

Por lo tanto, la invencion tambien describe un metodo para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno polarizado por Th1 en un sujeto, en el que el metodo comprende la aplicacion, sobre una piel intacta del sujeto, de una preparacion seca y sin adyuvante de dicho antigeno.

La presente invencion tambien describe una composicion que comprende una preparacion inyectable de un antigeno espedfico para un patogeno seleccionado y una preparacion seca sin adyuvante de un antigeno espedfico para dicho patogeno seleccionado, para su aplicacion secuencial separada a un sujeto mairnfero.

Esta invencion tambien describe una composicion, tal como se ha definido anteriormente, para su uso en la induccion, estimulacion o amplificacion de una respuesta inmunitaria especifica de un patogeno, orientada a Th1, en un sujeto mamffero. La composicion puede ser, como se ha definido anteriormente, para estimular una respuesta inmunitaria a una enfermedad seleccionada, en un sujeto mamnfero.

Esta invencion tambien describe un metodo para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto mamffero convencionalmente inmunizado contra un patogeno, en el que el metodo comprende la aplicacion sobre la piel de dicho sujeto, sin tratamiento previo y sin adyuvante anadido, de un antigeno espedfico para el patogeno, conduciendo tal aplicacion a un estfmulo de la respuesta inmunitaria.

El termino "inmunizado convencionalmente" significa que un mamffero ha sido previamente expuesto al antigeno (es decir, inicializado) mediante una administracion convencional del mismo. Los resultados presentados por los inventores muestran sorprendentemente que un estfmulo epicutaneo sin adyuvante y sin tratamiento previo de la piel conduce a una amplificacion eficaz y orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria previamente causada o estimulada por administracion(es) convencional(es).

En el desempeno de la presente invencion, el antigeno o antigenos usados para iniciacion y estfmulo pueden ser iguales o diferentes, siempre que el antigeno o antfgenos sean espedficos para el patogeno seleccionado. Tfpicamente, el antfgeno o antfgenos usados para iniciacion y estfmulo contienen al menos un epftopo de celulas T y/o celulas B en comun. Ademas, la cantidad de antfgeno utilizada puede ser adaptada por el experto en la materia. Pueden realizarse etapas de iniciacion despues de las dosificaciones publicadas. Para la estimulacion de acuerdo con la presente invencion, la cantidad de antfgeno en cada dispositivo de piel esta tfpicamente en el rango de 0,1 a 10000 |jg, preferiblemente de 20 a 5000 |jg.

La inmunizacion por estfmulo del metodo de la invencion puede comprender una o varias aplicaciones de la estimulacion, que pueden realizarse usando los mismos o distintos antfgenos, preferiblemente el mismo antfgeno, a diferentes intervalos de tiempo, dependiendo del sujeto, el antfgeno, el dispositivo de piel, La enfermedad, etc.

En una realizacion particular, cada estfmulo de antfgeno comprende entre 1 y 10 aplicaciones secuenciales de un dispositivo de piel, tfpicamente entre 1 y 5, preferiblemente 1, 2 o 3, durante un penodo de tiempo que puede extenderse desde 1 dfa hasta varios meses. Cada aplicacion puede ser separada de otra de 1 dfa a varias semanas, tfpicamente de 1 a 10 semanas.

Ademas, un tratamiento preferido de la invencion comprende tfpicamente 1, 2 o 3 estfmulos de antfgeno.

El primer estfmulo de antfgeno puede hacerse en cualquier momento despues de la iniciacion o exposicion al patogeno, siempre que las celulas inmunologicas espedficas del antfgeno esten todavfa presentes. Preferiblemente, la primera estimulacion se realiza entre 2 a 10 semanas despues de la iniciacion.

En una realizacion particular, la invencion se refiere, por lo tanto, a una inmunizacion primaria convencional seguida, tfpicamente de 3 a 6 semanas despues, por una unica inmunizacion de estfmulo de antfgeno.

Si es necesario, se puede realizar un segundo y, opcionalmente, un tercer estfmulo de antfgeno. El segundo y tercer estfmulos se pueden realizar dentro de intervalos de tiempo mensual, por ejemplo entre 2 y 18 meses despues del estfmulo previo.

A este respecto, en una realizacion particular, la invencion se refiere a una inmunizacion primaria convencional seguida, tfpicamente de 3 a 6 semanas despues, por un primer estfmulo de antfgeno y, tfpicamente de 1 a 18 meses mas tarde, preferiblemente de 1 a 12 meses despues, por ejemplo, 3 -6 semanas mas tarde, mediante un segundo estfmulo de antfgeno.

En otra realizacion particular, la invencion se refiere a (i) una inmunizacion primaria convencional, (ii) tfpicamente de 3 a 6 semanas despues, un primer estfmulo de antfgeno, (iii) tfpicamente de 1 a 18 meses mas tarde, preferiblemente de 1 a 12 meses despues, por ejemplo, de 3 a 6 semanas mas tarde, un segundo estfmulo de

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antigeno, y (iv) tipicamente de 1 a 18 meses despues, preferiblemente de 1 a 12 meses mas tarde, por ejemplo, de 3 a 6 semanas despues, un tercer y ultimo estimulo de antigeno.

La dosis espedfica de antigeno as^ como el numero de aplicaciones de estimulo y la duracion del contacto pueden ser adaptadas por el experto en la tecnica, dependiendo del sujeto, la naturaleza de la preparacion de antfgeno, el tipo de dispositivo de parche utilizado, etc. Para un dispositivo oclusivo, tal como un dispositivo Viaskin®, la duracion del contacto esta preferiblemente comprendida entre 5 y 72 horas. Preferiblemente, para cada aplicacion, el dispositivo se mantiene sobre la piel durante un periodo de 24 a aproximadamente 60 horas, mas preferentemente de aproximadamente 24 horas a 48 horas, tfpicamente durante 24 horas, 36 horas o 48 horas.

El tratamiento puede ser detenido en cualquier momento, por ejemplo, una vez que se ha establecido una suficiente amplificacion y/u orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria. A este respecto, la presente invencion muestra que una reaccion inmunologica espedfica provocada por iniciacion parenteral, que esta orientada a Th2, puede amplificarse eficazmente y polarizar por Th1 tras el estfmulo epicutaneo. Las celulas Th1 y Th2 son dos tipos de linfocitos T auxiliares CD4+ que difieren en su patron de produccion de citoquinas. Las celulas Th1 producen IFN-y, IL-2 y TNF-p y estan implicadas en respuestas inmunologicas mediadas por celulas que son beneficiosas en la defensa del huesped frente a patogenos intracelulares y celulas malignas. Las celulas TH2 secretan IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, que aumentan las respuestas de anticuerpos, incluyendo la produccion de IgE. Las respuestas Th1 y Th2 son mutuamente antagonistas, de manera que normalmente existen en equilibrio y se regulan mutuamente entre sf.

En el contexto de esta invencion, una orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria significa que la relacion de celulas inmunologicas Th1/Th2 o citoquinas aumenta, preferiblemente en por lo menos un 10%, como resultado de la estimulacion de la presente invencion.

Tal como se describe en la seccion experimental, un sobrenadante de celulas T, extrafdo de sujetos estimulados de acuerdo con la invencion, contiene concentraciones significativamente mas altas de IFN-y (que es la citoquina Th1 principal) y concentraciones significativamente mas bajas de IL-5, en comparacion con sujetos estimulados por la via convencional de administracion, demostrando asf una orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria. La orientacion a Th1 indica, en una realizacion espedfica, que la concentracion de IFN-y, o el numero de celulas productoras de IFN- Y, aumenta en por lo menos un 10% en comparacion con los sujetos tratados usando la via de administracion convencional, y/o que la concentracion de IL-5, o el numero de celulas productoras de IL-5, disminuye en por lo menos un 10% en comparacion con los sujetos tratados usando la via convencional de administracion.

Esta invencion tambien describe un metodo de amplificacion y orientacion a Th1 de una respuesta inmunitaria contra un patogeno en un sujeto marnffero inmunizado convencionalmente, en el que el metodo comprende la aplicacion, sobre la piel de dicho sujeto inmunizado parenteralmente, de un antfgeno espedfico para el patogeno, sin adyuvante anadido.

La invencion tambien describe un metodo de amplificacion y orientacion a Th1 de una respuesta inmunitaria contra un patogeno en un sujeto marnffero inmunizado convencionalmente, en el que el metodo comprende la aplicacion, en la piel sin tratamiento previo de dicho sujeto inmunizado parenteralmente, de un antfgeno espedfico para el patogeno, sin adyuvante anadido.

Los siguientes ejemplos son dados a titulo ilustrativo y no limitativo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Amplificacion y orientacion a TH1 de la respuesta inmunitaria mediante estimulacion de la piel

A. Material y metodos

Animales

Se adquirieron ratones BALB/c adultos de Charles River Laboratories (Francia). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas de la Comunidad Europea sobre cuidado de los animales.

Antfgeno

Antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B, es decir, HBsAg Dispositivo para la piel

Dispositivo Viaskin®, tal como se describe en el documento WO 2007/122226. El dispositivo es oclusivo y electrostatico. El antfgeno se mantiene en la superficie del soporte de respaldo, en forma seca y sin adyuvante, a traves de fuerzas electrostaticas.

Cuantificacion de IgE, IgG1, IgG2a espedficas

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Se recogieron muestras de sangre de plexo venoso retro-orbital antes y durante la inmunoterapia y el plasma se almaceno a -30°C hasta nuevos analisis.

Se utilizo un ELISA cualitativo, validado, usando las directrices de ICH, para IgG1 e IgG2a espedficas. Brevemente, las placas de microtitulacion se recubrieron con HBsAg a una concentracion de 2 pg/ml. Se distribuyeron diluciones en serie de 100 pl de cada suero por pocillo y se incubaron durante 24 horas a 4°C. Se utilizo como marcador un anticuerpo anti-raton IgG1 o IgG2a marcado con peroxidasa. Se utilizo el Reactivo (TMB) como sustrato enzimatico. Se trazaron las curvas de dilucion y se determino la titulacion del suero en la misma ordenada (eje y).

Produccion de citoquinas

Despues del ultimo muestreo de sangre, los ratones fueron sacrificados por dislocacion vertebral y los bazos se recogieron en condiciones esteriles.

Cuantificacion ELISA

El cultivo celular se realizo en presencia de HBsAg (0 - 50 pg.ml'1) en placas de microtitulacion de 24 pocillos (2.106 celulas/pocillo). Despues de 72 horas de estimulacion in vitro, los sobrenadantes fueron recogidos y la cuantificacion de IL-5 e IFNy se ensayaron utilizando conjuntos (kits) CytoSetTM (BioSource International Europe, Belgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

ELISpot

El cultivo celular se realizo en presencia de HBsAg (0 - 50 pg.ml'1), en placas de microtitulacion ELISpot (sistema R&D, EE.UU.) segun la recomendacion del fabricante (BD, EE.UU.). La cuantificacion de IL-5 e IFNy se determino despues de 48 horas de intro estimulacion.

Protocolo

• Iniciacion: se inmunizaron convencionalmente (por inyeccion i.m.) ratones BALB/C adultos (2 grupos de 7) con 2 mg HBsAg/10 pg AlOH

• Dia 28 post-iniciacion

- Suero recolectado

- Grupo 1 "HBsAg/Alum": estfmulo con 2mg de HBsAg/10 pg de AlOH

- Grupo 2 "Parches Viaskin®/HBsAg": estfmulo con Viaskin® cargado con 100mg de HBsAg. El Viaskin® se retiro 48 horas despues de la aplicacion.

• Dia 49 post-iniciacion (21 dfas despues del post-estimulo I)

• Suero recolectado

• Grupo 1: sin estfmulo

• Grupo 2: estfmulo con Viaskin® cargado con 100mg de HBsAg

Los parches para el estfmulo 1 y el estfmulo 2 se prepararon con 2 metodos diferentes: Para el estfmulo 1, se prepararon parches por liofilizacion y para el estfmulo 2, los parches se prepararon por secado. Sin embargo, en las dos preparaciones el antfgeno es cargado como polvo en los parches.

• Dia 63 post-iniciacion (14 dfas despues del post estfmulo II)

• Suero recolectado

Los bazos se tomaron para el analisis de las respuestas de celulas T

• Cuantificacion de anticuerpos: se cuantificaron los anticuerpos anti-HBsAg en suero (IgG1 e IgG2a) mediante ELISA utilizando placas revestidas con antfgeno los dfas 0, 28, 49 y 63.

• Respuestas de celulas T:

Ex vivo:

- Los esplenocitos se cultivaron con o sin HBsAg (5 mg/ml) durante 1 hora antes de la adicion de Brefeldin A/monensina, para bloquear la secrecion de citoquinas.

- Despues de 6 horas adicionales de cultivo, las celulas se tineron con anticuerpos contra moleculas de superficie, luego se fijaron y permeabilizaron antes de la tincion con anticuerpos contra IL-5, IL-2, IFN-y.

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- Resultados (no mostrados): no se detectaron celulas productoras de citoquinas por encima del fondo en ningun grupo experimental (excepto en esplenocitos de control estimulados con mitogenos)

Despues de la re-estimulacion in vitro:

- Los esplenocitos se cultivaron con o sin antigeno (5mg/ml y 20 mg/ml) antes de los analisis durante 72 horas.

• IL-5 e IFN-g productores de esplenocitos fueron cuantificados por ELISpot despues de 48 horas de cultivo con o sin HBsAg.

• La secrecion de citoquinas se determino en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA despues de 72 horas de cultivo con o sin HBsAg.

Analisis estadfstico

El software Graph Pad (San Diego, EE.UU.) se utilizo para el analisis estadfstico. Los datos se analizaron mediante analisis de varianza (ANOVA) y test de Dunnett cuando se compararon ratones tratados con controles, o utilizando el ANOVA y el test de Tukey cuando se compararon todos los grupos entre sr

B. Resultados

Influencia del estimulo epicutaneo de la invencion sobre las respuestas de IgG1 anti-HBsAg (Fig. 1)

Los resultados presentados muestran un aumento significativo de IgG1 por la primera aplicacion de parche de piel (ver Fig. 1, comparacion de D49 y D28).

Influencia del estimulo epicutaneo de la invencion sobre las respuestas de IgG2a anti-HBsAg (Fig. 2)

Los resultados presentados muestran un aumento significativo de IgG2a por la primera aplicacion de parche de piel (ver Fig. 1, comparacion de D49 y D28).

Las celulas productoras de citoquina en ratones aumentaron dos veces con el estimulo epicutaneo de la invencion o HBsAg/AlOH (ELISpot) (Fig. 3)

Los resultados presentados en la Fig. 3 muestran que el numero de celulas productoras de IFN-y es similar en ratones potenciados con Viaskin® o inyeccion intramuscular con adyuvante, mientras que las celulas productoras de IL-5 son menos en ratones estimulados con Viaskin®. Por tanto, a pesar de un iniciacion inducida por Th2 con HBsAg/AlOH, la estimulacion por Viaskin® provoco respuestas equilibradas Th1/Th2, contrastando con la respuesta Th2 preferente de HBsAg/AlOH (por inyeccion intramuscular).

Secrecion de citoquinas en ratones estimulados dos veces con el estimulo epicutaneo de la invencion o HBsAg/AlOH (ELISA) (Fig. 4)

A las 72 horas, IFN-y esta presente en concentraciones significativamente mas altas e IL-5 en concentraciones significativamente mas bajas en el sobrenadante de celulas T de ratones estimulados con Viaskin que con HBsAg/AlOH (por inyeccion intramuscular).

Las respuestas de IL-5 en ratones estimulados dos veces con el estfmulo epicutaneo de la invencion o HBsAg/AlOH (detalles de ELISA-ELISpot)

• A las 72 horas, IL-5 esta presente en concentraciones mas altas en ratones estimulados con Viaskin®, que en ratones impolutos.

• A las 72 horas, IL-5 esta presente en concentraciones significativamente mas bajas en ratones estimulados con Viaskin® que con HBsAg/AlOH.

• Se observa el mismo patron independientemente de las condiciones de re-estimulacion (in vitro con la cuantificacion ELISA de in vitro por ELISpot).

Las respuestas de IFN-g en ratones estimulados dos veces con el estfmulo epicutaneo de la invencion o HbsAg/AlOH (detalles de ELISA, ELISpot)

• Los esplenocitos de ratones inmunes liberan espontaneamente IFN-g, y esta liberacion fue mayor en ratones estimulados con Viaskin®.

• Si esta liberacion espontanea se resta:

• IFN-y no se detecta en concentraciones significativamente mas altas en ratones estimulados con HBsAg/AlOH que en ratones impolutos.

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• IFN-y se detecta en concentraciones significativamente mas altas en ratones estimulados con Viaskin® que en ratones impolutos.

C. conclusiones

El estfmulo de la piel de la invencion aumento significativamente las respuestas de IgG1 e IgG2a anti-HBsAg en ratones convencionalmente inicializados con HBsAg/AlOH. Los niveles de IgG1 e IgG2a fueron similares a los obtenidos por estimulacion convencional (inyeccion intramuscular con adyuvante). La estimulacion de la piel determino el aumento de IFN-y y la reduccion de respuestas anti-HBsAg IL-5.

Estos resultados demuestran, in vivo, una amplificacion exitosa y una re polarizacion de Th1 de las respuestas de tipo Th2 provocadas por la iniciacion HBsAg/ALOH convencional.

Ejemplo 2: Efecto del pretratamiento de la piel sobre el tipo de respuesta inmunitaria

A. Materiales y metodos

Los ratones BALB/c se sensibilizaron intragastricamente a un extracto de protema de cacahuete (PPE) mezclado con la toxina del colera como adyuvante durante 6 semanas (una vez a la semana).

A continuacion, se realizo una inmunoterapia durante 8 semanas consecutivas. 10 ratones sensibilizados se trataron epicutaneamente sobre piel intacta. 10 ratones sensibilizados se trataron epicutaneamente sobre piel pretratada por 10 remociones de cinta. La remocion de cinta consistio en 10 decapados con un adhesivo, lo que condujo a una alteracion sustancial de la integridad del estrato corneo. 10 ratones sensibilizados no fueron tratados. 10 ratones impolutos sirvieron como controles.

Al final de la inmunoterapia, todos los ratones fueron expuestos a un regimen sostenido de 10 dfas de cacahuete oral. Despues del sacrificio, las lesiones fueron evaluadas en el esofago y yeyuno mediante analisis histologico. La expresion de mRNA de Th1, Th2 y citoquinas Treg se midieron por TR-qPCR.

Las mediciones de las respuestas serologicas (IgE, IgG1 e IgG2a espedficas) se realizaron por ELISA, antes y al final de la inmunoterapia.

B. Resultados

Despues del tratamiento epicutaneo en piel intacta, sIgE disminuyo y sIgG2a aumento, respectivamente 0,036 ± 0,01 vs 0,231 ± 0,02|jg/ml (EPIT vs simulada, p<0,05) y 2,86 ± 0,78 vs 1,06 ± 0,28 jg/ml (p<0,05). Por el contrario, despues de la inmunoterapia en piel con remocion de cinta, sIGe aumento y sIgG2a no se modifico, respectivamente 0.383 ± 0.08 jg/ml (p<0.01 vs simulada) y 1.252 ± 0.22 jg/ml (ver las Figuras 7A y 7B).

Los resultados tambien muestran que la concentracion eosinofflica en el esofago en la mucosa fue sustancialmente mayor en ratones tratados con piel simulada y desnuda, 19,9 ± 1,5 y 26,7 ± 8,7, que los ratones tratados con piel intacta, 2,7 ± 0,9 (p<0,01 y p<0,05) e Impoluta, 1,1 ± 0,7 celulas/mm2 (p<0,01) (vease la Fig. 8). Ademas, las expresiones de eotaxina, IL-5 y mARN de IL-13 se redujeron significativamente mediante tratamiento epicutaneo en piel intacta (respectivamente 1,14, 1,35, 1,02) en comparacion con la simulada (2,57, 2,60, 2,50, p<0,05) y tratamiento de remocion de cinta (2,02, 1,95, 2,01, p<0,05) (veanse las figuras 9A, B y C).

Curiosamente, el mARN de GATA-3, que es un factor de transcripcion Th2, disminuyo significativamente en ratones tratados con piel intacta en comparacion con el grupo simulada (p<0,05), tal como se muestra en la Fig. 10A. Ademas, Foxp3, un factor de transcripcion Treg, se incremento significativamente en los ratones tratados sobre piel intacta, en comparacion con la simulada (p> 0,05) y piel desnuda (p<0,001) (ver Fig. 10B).

Por ultimo, como se muestra en la Fig. 11, la relacion vellosidad/cnptica duodenal fue significativamente menor en simulada (2,1 ± 0,2) y en ratones tratados remocion de cinta (2,4 ± 0,3) que en piel intacta tratada (2,9 ± 0,2) (p<0,05) y ratones (p<0,001 y p<0,05) Impolutos (3,3 ± 0,1).

C. Discusion

Los resultados obtenidos muestran que en la inmunoterapia epicutanea el perfil de la respuesta inmunitaria provocada depende del nivel de integridad del estrato corneo:

En piel intacta, se induce una disminucion de IgE/aumento de IgG2a

En la piel tratada con estrato corneo alterado: se induce un aumento de IgE/no IgG2a.

Tambien, despues de una dieta exclusivamente de cacahuete: la alta infiltracion de eosinofilos fue observada solamente en los ratones tratados sobre piel desnuda.

Conclusiones

Los resultados muestran que una respuesta inmunitaria eficaz puede obtenerse y amplificarse por terapia epicutanea usando estimulantes de antigeno sin adyuvantes aplicados usando un dispositivo oclusivo. El estimulo causa una respuesta inmunitaria Th1 orientada y particularmente fuerte cuando el antigeno se aplica sobre la piel 5 intacta.

Referencias bibliograficas

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Shiver, JW et al., 2002, Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency- 15 virus immunity.” Nature 415: 331-335.

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20 McConnell et al., 2007, “Adenovirus-based prime-boost immunization for rapid vaccination against Anthrax.” Molecular Therapy 15: 203-210.

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   REIVINDICACIONES

   1. La preparacion de un antigeno espedfico para un patogeno infeccioso, para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente contra dicho patogeno en un sujeto mairnfero, en el que dicha respuesta inmunitaria preexistente resulta de la previa inmunizacion parenteral o vacunacion del sujeto contra dicho patogeno, en la que dicha preparacion de antigeno es sin adyuvante y se aplica a la piel intacta del sujeto con un dispositivo de parche de piel, y en el que dicha respuesta inmunitaria amplificada esta orientada a Th1.
2. 2. La preparacion de antfgeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de la reivindicacion 1, en la que dicha preparacion de antigeno es seca.
3. 3. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de la reivindicacion 1, en la que dicha preparacion de antigeno se aplica a la piel del sujeto despues de la limpieza de la superficie de la piel en el lugar de aplicacion para eliminar los corneocitos.
4. 4. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicha preparacion de antigeno se aplica sobre un area sin tratamiento previo de la piel que tiene un estrato corneo sustancialmente no alterado.
5. 5. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha preparacion de antigeno se aplica sobre la piel del sujeto usando un dispositivo de parche oclusivo.
6. 6. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de la reivindicacion 5, en la que el dispositivo de parche oclusivo comprende un soporte al que se une el antigeno mediante fuerzas electrostaticas o de Van der Waals sin adicion de adhesivo.
7. 7. La preparacion de antfgeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho antigeno se administra como 1, 2 o 3 estfmulos de antigeno de piel al sujeto.
8. 8. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de la reivindicacion 7, que comprende un primer estfmulo de antigeno de piel de 2 a 8 semanas despues de la iniciacion, opcionalmente un segundo estfmulo de antigeno de piel de 1 a 12 meses despues de la primera estimulacion y, opcionalmente, un tercer estfmulo de antigeno de piel de 1 a 12 meses despues de la segunda estimulacion.
9. 9. La preparacion de antfgeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que se utiliza el mismo antigeno para el estfmulo de la piel y la previa iniciacion o vacunacion.
10. 10. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, en la que el patogeno infeccioso es un virus, una bacteria, un parasito o un hongo.
11. 11. La preparacion de antigeno para su uso en la amplificacion de una respuesta inmunitaria preexistente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el antfgeno es un antigeno de superficie viral o bacteriana.
12. 12. Una preparacion de antigeno sin adyuvante espedfico para un patogeno infeccioso, para su uso en la estimulacion de una respuesta inmunitaria en un sujeto marnffero pre-inmunizado contra dicho patogeno por iniciacion o vacunacion parenteral, aplicandose la preparacion de antfgeno en su forma seca sobre la piel intacta de dicho sujeto, cuya aplicacion provoca una amplificacion y una orientacion a Th1 de la respuesta inmunitaria aumentando en por lo menos un 10% la relacion de celulas inmunes Th1/Th2 o citoquinas.
13. 13. Una preparacion de antfgeno sin adyuvante espedfico para un patogeno infeccioso, para su uso en un metodo para inducir o estimular una respuesta inmunitaria orientada a Th1 por patogeno espedfico en un sujeto mamffero, en el que el metodo que comprende:

    - administrar parenteralmente al marnffero un antfgeno espedfico para que el patogeno provoque o estimule una respuesta inmunitaria contra dicho patogeno, y

    - aplicar subsecuentemente sobre piel intacta del marnffero un antfgeno espedfico para el patogeno, permitiendo la amplificacion de una respuesta inmunitaria orientada a Th1.