ES2642793T3 - Papel de uPAR soluble en la patogenia de enfermedad renal proteinúrica - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Papel de uPAR soluble en la patogenia de enfermedad renal proteinurica Campo de la invencion

Las realizaciones de la invencion se refieren a composiciones que modulan la expresion, la funcion, la actividad del receptor uroquinasa soluble (uPAR) en los rinones.

Antecedentes

El hecho de que las enfermedades renales glomerulares despues del trasplante renal puedan reaparecer horas despues de la cirugfa representa un misterio persistente en la medicina que alberga enormes desafms. Las ultimas decadas atestiguaron mucho progreso en la biologfa de los podocitos, sin embargo, la patogenia exacta que subyace a la mayona de enfermedades renales proteinuricas todavfa esta lejos de ser evidentes. Esto es cierto con la glomeruloesclerosis segmental focal (GEFS). Aunque las mutaciones a ciertas moleculas que incluyen podocina, nefrina, a-actinina, TRPC6, se han reivindicado responsables de alguna forma familiar de GEFS, se conoce poco acerca de la patogenia de la forma adquirida de GEFS. La GEFS frecuentemente da lugar a un fallo renal de fase final y recurriendo significativamente en un 30-60 % de los rinones trasplantados.

El documento WO 98/21230 A1, el documento WO 2009/055613 A2, el documento US 2008/152587A1 y el documento US 2007/244046 se refiere a los inhibidores de la union del activador del plasminogeno tipo uroquinasa (uPA) al receptor del activador del plasminogeno de uroquinasa (uPAR) y su uso, por ejemplo, en el tratamiento del cancer.

El documento WO 2005/116077 A2 se refiere a anticuerpos u otros ligandos espedficos para los complejos entre uPA y uPAR y a su uso en el tratamiento y el diagnostico de cancer.

El documento US 2004/265797 A1 se refiere a un peptido que se une a uPAR y que inhibe su union a la integrina y la vitronectina.

El documento WO 2008/077958 A2 se refiere al uso de uPAR soluble como un marcador de la inflamacion de bajo grado y el smdrome metabolico (SM) y las enfermedades relacionadas.

Sumario

Este Sumario se proporciona para presentar un resumen de la invencion para indicar brevemente la naturaleza y la sustancia de la invencion.

Las realizaciones de la invencion se refieren a composiciones para el tratamiento de enfermedades o trastornos renales, caracterizados por la proteinuria.

En una realizacion, la invencion proporciona una composicion para su uso en el tratamiento de proteinuria en una enfermedad o un trastorno renal caracterizado por proteinuria, la composicion que comprende un agente que inhibe la expresion o la actividad del receptor de uroquinasa soluble (suPAR), como se expone en la reivindicacion 1.

En una realizacion, la invencion proporciona un procedimiento de identificacion de un agente para la actividad en el tratamiento de proteinuria en una enfermedad o trastorno renal caracterizado por la proteinuria, que comprende las etapas expuestas en la reivindicacion 6.

En algunas realizaciones, la invencion proporciona procedimientos para diagnosticar a un paciente que tiene o esta en riesgo de desarrollar proteinuria, que comprende detectar suPAR o un biomarcador sangumeo que comprende suPAR en una muestra de sangre retirada del paciente, como se expone en las reivindicaciones 9 y 11.

En una realizacion, la invencion proporciona un ensayo para medir los niveles de receptor de uroquinasa soluble (suPAR) en una muestra de sangre retirada de un paciente que tiene proteinuria, comprendiendo el ensayo las etapas expuestas en la reivindicacion 10.

Otros aspectos se describen mas abajo.

Breve descripcion de los dibujos

Las Figuras 1A a 1F muestran que suPAR activa la integrina avp3 e induce la eliminacion del procedimiento de pie y la proteinuria en ratones. Figura 1A: la protema suPAR activa la integrina avp3 en podocitos cultivados. Los podocitos de raton completamente diferenciados se incubaron con protema suPAR a 1-5 pg/ml durante 24 h a 37 °C y se tineron con anticuerpo AP5. Figura 1B: La inyeccion de suPAR en ratones Plaur/- induce proteinuria. La protema suPAR se inyecto a traves de la vena de la cola en ratones Plaur/- a 1 mg/kg (n = 6), los ratones control recibieron la misma cantidad de BSA (n = 6). La orina se recogio antes y 8 h, 24 h despues de la inyeccion para el ensayo Bradford. *P<0,03 durante 24 h despues de la inyeccion frente a 0 h, y frente a todos los grupos BSA.

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Figura 1C: se deposito suPAR en los podocitos despues de la inyeccion de suPAR. Synpo, sinaptopodina. Figura 1D: la inyeccion de suPAR activo la integrina avp3 en los podocitos. Figuras 1E, 1F: Trasplante cruzado de rinon. Figura 1E: Los rinones derechos de ratones Plaur/- se trasplantaron en ratones 57BL/6 y despues se trataron con LPS (panel derecho) o PBS (panel izquierdo). Figura 1F: Los rinones derechos de ratones 57BL/6 se trasplantaron en ratones Plaur/- y despues se trataron con LPS o PBS.

Figuras 2A-2B: muestran que los sueros de pacientes recurrentes de GEFS tienen alto nivel de suPAR y activan la integrina avp3 en los podocitos. Figura 2A: Los pacientes recurrentes de GEFS tuvieron niveles mas altos de suPAR en suero que los pacientes no recurrentes y que los sujetos normales. Figura 2B: Los sueros de GEFS recurrente activaron la integrina avp3 en los podocitos cultivados.

Figuras 3A-3C: Trasplante cruzado de rinon y suPAR en los podocitos. La Figura 3A es una ilustracion esquematica de un trasplante cruzado. Figura 3B: suPAR se deposito en los podocitos en los ratones Plaur/- trasplantados. La inmunotincion se realizo en secciones de rinon despues del trasplante y el tratamiento de LPS. Synpo, sinaptopodina. Figura 3C: muestra que en los ratones Plaur/- tratados con LPS, se encontro una expresion aumentada en el rinon 57BL/6 trasplantado, pero ningun uPAR en podocitos de rinon Plaur/- nativo.

Figura 4: es un grafico que muestra que el transporte genico subcutaneo de suPAR por electroporacion (EP) en ratones WT B6 induce proteinuria (la flecha indica cuando se realizo la EP).

La Figura 5 es un grafico que muestra que el transporte genico subcutaneo de suPAR por electroporacion (EP) en ratones WT Balb/c induce proteinuria (la flecha indica cuando se realizo la EP). Ambas Figuras 4 y 5 muestran el papel del receptor de uroquinasa soluble en el desarrollo de la proteinuria y la enfermedad renal glomerular. Las Figuras 4 y 5 muestran la expresion de uPAR soluble etiquetado con GFP en el tejido subcutaneo de ratones. Desde aid, el uPAR soluble se produce y se secreta en el torrente sangumeo, resultando en la proteinuria.

La Figura 6 es un grafico que muestra que el transporte genico subcutaneo de suPAR por electroporacion (EP) en ratones knockout uPAR induce proteinuria (la flecha indica cuando se realizo la EP). 24 h despues del transporte genico de suPAR-GFP (EP) en la piel subcutanea (SC) de raton knockout uPAR, los ratones se examinaron al microscopio de IF. Los resultados mostraron que suPAR etiquetado con GFP se expresaba en areas subcutaneas de ratones knockout uPAR.

Las Figuras 7A-7B muestran expresion serica de uPAR soluble despues de la electroporacion genica en ratones WT y KO uPAR. La Figura 7A es una inmunotransferencia que muestra que el transporte genico de suPAR por EP en la piel aumenta el nivel de suPAR circulante en ratones WT. Los niveles se midieron 24 h despues de la electroporacion del vector genico suPAR en la piel. La Figura 7B muestra que el transporte genico de suPAR por EP en la piel genera suPAR circulante en ratones knockout uPAR. Los niveles se midieron 24 h despues de la electroporacion del vector genico suPAR en la piel.

Descripcion detallada

Las realizaciones de la presente invencion se refieren a descubrimientos que implican agentes que modulan y/o inhiben el receptor de uroquinasa (uPAR), en particular, el receptor de uroquinasa soluble (suPAR). En consecuencia, las composiciones para el uso de la presente invencion proporcionan el tratamiento de enfermedades o trastornos renales, caracterizados por proteinuria.

Varios aspectos de la invencion se describen a continuacion con referencia a las aplicaciones de ejemplo para ilustracion. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y procedimientos espedficos para proporcionar un completo entendimiento de la invencion. Un experto en la materia relevante, sin embargo, reconocera facilmente que la invencion puede practicarse sin uno o mas de los detalles espedficos o con otros procedimientos.

Todos los genes, nombres genicos y productos genicos desvelados en el presente documento se destinan a corresponder a homologos de cualquier especie para la que son aplicables las composiciones y los procedimientos desvelados en el presente documento. De esta manera, los terminos incluyen, pero no se limitan a genes y productos genicos de humanos y ratones. Se entiende que cuando se desvela un gen o producto genico de una especie particular, la divulgacion se destina a ser solamente ejemplar y no ha de interpretarse como una limitacion salvo que en el contexto en el que aparece lo indique claramente. De esta manera, por ejemplo, para los genes desvelados en el presente documento, que en algunas realizaciones se refieren a acidos nucleicos y secuencias de aminoacidos de mairnferos se destinan a abarcar genes homologos y/u ortologos y productos genicos de otros animales que incluyen, pero no se limitan a otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En realizaciones preferidas, los genes o las secuencias de acidos nucleicos son humanos.

Definiciones

La terminologfa usada en el presente documento es para el fin de describir solamente realizaciones particulares y no se destina a ser limitante de la invencion. Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una"

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y "el/la" se destinan a incluir asimismo las formas plurales, salvo que el contexto claramente indique lo contrario. Adicionalmente, en el grado en que los terminos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con" o variantes de los mismos se usen en la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, tales terminos se destinan a ser inclusivos de una manera similar a la frase "que comprende".

El termino "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular segun se determina por un experto en la materia, que dependera en parte de como se mide o se determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o mas de 1 desviacion estandar, por la practica en la tecnica. Alternativamente, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferentemente de hasta el 10%, mas preferentemente hasta el 5 % y mas preferentemente hasta el 1 % de un valor dado. Alternativamente, en particular con respecto a los sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar dentro de una orden de magnitud, preferentemente 5 veces y mas preferentemente 2 veces mas, de un valor. Donde se describen los valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, salvo que se indique de otra manera debe asumirse que el termino "aproximadamente" signifique dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Como se usa en el presente documento, la expresion "cantidad segura y eficaz" o "cantidad terapeutica" se refiere a la cantidad de un componente que es suficiente para producir una respuesta terapeutica deseada sin efectos secundarios adversos indebidos (tales como toxicidad, irritacion o respuesta alergica) acorde con una relacion beneficio/riesgo razonable cuando se usa de la manera de la presente invencion. Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una cantidad de un compuesto eficaz para producir la respuesta terapeutica deseada. La cantidad segura y eficaz espedfica o la cantidad terapeuticamente eficaz variara con tales factores como la afeccion particular a tratarse, la condicion ffsica del paciente, el tipo de mairnfero o animal a tratarse, la duracion del tratamiento, la naturaleza de la terapia simultanea (si la hay) y las formulaciones espedficas empleadas y la estructura de los compuestos o sus derivados.

Como se usa en el presente documento "proteinuria" se refiere a cualquier cantidad de protema que pasa a traves de un podocito que ha sufrido dano de podocito o a traves de una barrera mediada por podocito que normalmente no permitina ningun paso de protemas. En un sistema in vivo el termino "proteinuria" se refiere a la presencia de cantidades excesivas de protema serica en la orina. La proteinuria es un smtoma caractenstico de distres renal (rinon), urinario, pancreatico, smdromes nefroticos (es decir, proteinuria mayor de 3,5 gramos al dfa), eclampsia, lesiones toxicas de los rinones y es frecuentemente un smtoma de la diabetes mellitus. Con la proteinuria grave puede desarrollarse hipoproteinemia general y resulta en presion oncotica disminuida (ascitis, edema, hidrotorax).

La frase "se une espedficamente a", "es espedfico por" o "espedficamente inmunorreactivo con", cuando se refiere a un anticuerpo se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia de la protema en presencia de una poblacion heterogenea de protemas y otros compuestos biologicos. De esta manera, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una protema particular y no se unen en una cantidad significativa a otras protemas presentes en la muestra. La union espedfica a una protema en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad por una protema particular.

Como se usa en el presente documento, la expresion "aptamero" o "especie que se une al acido nucleico seleccionado" puede incluir ARN o ADN no modificado o qmmicamente modificado. El procedimiento de seleccion puede ser por, pero no se limita a, cromatograffa de afinidad y el procedimiento de amplificacion por transcripcion reversa (TR) o reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles).

Como se usa en el presente documento, "modulacion" significa bien un aumento (estimulacion) o bien una disminucion (inhibicion) en la expresion, las cantidades in vivo de un gen. Esto incluye cualquier cantidad in vivo, funcion y similares en comparacion con los controles normales. El termino incluye, por ejemplo, aumentado, potenciado, aumentado, agonizado, promovido, disminuido, reducido, suprimido, bloqueado o antagonizado. La modulacion puede aumentar la actividad o las cantidades mas de 1 vez, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, etc., sobre los valores basales. La modulacion tambien puede disminuir su actividad o cantidades por debajo de los valores basales.

El termino "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotido, puede abarcar una secuencia de polinucleotido relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion puede incluir tambien, por ejemplo, variantes "alelicas", "de corte y empalme", "especies" o "polimorficas". Una variante de corte y empalme puede tener identidad significativa con una molecula de referencia, pero generalmente tendra mayor o menor numero de polinucleotidos debido al corte y empalme alternativos de los exones durante el procesamiento del ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleotidos que vanan de una especie a otra. De utilidad particular en la invencion son las variantes de los productos genicos de tipo silvestre. Las variantes pueden resultar de al menos una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos y pueden resultar en ARNm alterados o en polipeptidos cuya estructura o funcion puede o puede no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alelicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se adscriben generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede ocurrir solo o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.

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Los polipeptidos resultantes generalmente tendran identidad de aminoacidos significante entre sr Una variante polimorfa es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimorfas tambien pueden abarcar "polimorfismos de un unico nucleotido" (SNP, por sus siglas en ingles) o mutaciones de una unica base en las que la secuencia de polinucleotidos vana en una base. La presencia de SNO puede ser indicativa de, por ejemplo, Una cierta poblacion con una propension a un estado de enfermedad, que es susceptibilidad frente a resistencia.

Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qmmica, por ejemplo, reemplazamiento de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, por ejemplo, oligonucleotidos derivados, pueden comprender porciones de origen no natural, tales como restos de azucares alterados u otros enlaces inter-azucar. Son ejemplares entre estos el fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen en la tecnica. Los acidos nucleicos derivados pueden contener tambien etiquetas, incluyendo radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenicos, sustratos, cofactores, inhibidores, partmulas magneticas y similares.

Un polipeptido o peptido "derivado" es uno que esta modificado, por ejemplo, por glucosilacion, pegilacion, fosforilacion, sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qrnmico o tratamiento suave con formalina. Un derivado tambien puede modificarse para contener una etiqueta detectable, bien directa o indirectamente, incluyendo, pero no limitado a, un radioisotopo, una etiqueta fluorescente y una enzimatica.

Como se usa en el presente documento, la expresion "fragmento o segmento", como se aplica a una secuencia de acido nucleico, un gen o un polipeptido, tendra ordinariamente al menos aproximadamente 5 bases de acidos nucleicos (para secuencia de acidos nucleicos o gen) o de aminoacidos (para polipeptidos) contiguos, tfpicamente al menos aproximadamente 10 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos, mas tipicamente al menos aproximadamente 20 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos, habitualmente al menos aproximadamente 30 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos, preferentemente al menos aproximadamente 40 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos, mas preferentemente al menos aproximadamente 50 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos e incluso mas preferentemente al menos aproximadamente 60 a 80 bases de acidos nucleicos o aminoacidos contiguos de longitud. "Fragmentos solapantes" como se usa en el presente documento, se refiere a fragmentos de acidos nucleicos o peptidos contiguos que empiezan en el extremo amino terminal de un acido nucleico o una protema y acaban en el extremo carboxi terminal del acido nucleico o la protema. Cada acido nucleico o fragmento peptfdico tiene al menos aproximadamente una posicion de un acido nucleico o de aminoacidos contiguos en comun con el siguiente acido nucleico o fragmento peptfdico, mas preferentemente al menos aproximadamente tres bases de acidos nucleicos o posiciones de aminoacidos en comun, lo mas preferentemente al menos aproximadamente diez bases de acidos nucleicos o posiciones de aminoacidos en comun.

Los terminos "biomolecula" o "marcadores" se usan intercambiablemente en el presente documento y se refieren a ADN, ARN (incluyendo ARNm, ARNr, ARNt y ARNtm), nucleotidos, nucleosidos, analogos, polinucleotidos, peptidos y cualquier combinacion de los mismos.

"Expresion/cantidad" de un gen, biomolecula o biomarcador en una primera muestra es a un nivel "mayor que" el nivel en una segunda muestra si el nivel de expresion/cantidad de un gen o biomarcador en la primera muestra es al menos aproximadamente 1 vez, 1,2 veces, 1,5 veces, 1,75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, el nivel de expresion/cantidad del gen o biomarcador en la segunda muestra o una muestra normal. Los niveles de expresion/cantidades pueden determinarse basandose en cualquier criterio adecuado conocido en la tecnica, incluyendo pero no limitado a ARNm, ADNc, protemas, fragmentos proteicos y/o genes copia. Los niveles/cantidades de expresion pueden determinarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Los terminos "deteccion", "detectar", "identificacion", "cuantificacion" incluyen el ensayo, la cuantificacion, la formacion de imagenes o de otra manera el establecimiento de la presencia o la ausencia del biomarcador transcriptomico o combinaciones de biomoleculas que comprenden el biomarcador y similares, o el ensayo de, la formacion de imagenes, la comprobacion, el establecimiento o de otra manera la determinacion de la prognosis y/o el diagnostico de enfermedades, trastornos o afecciones renales.

"Paciente" o "sujeto" se refiere a mamfferos e incluye sujetos humanos y veterinarios.

Como se usa en el presente documento, "un paciente en necesidad del mismo" se refiere a cualquier paciente que esta afectado con un trastorno caracterizado por proteinuria. En un aspecto de la invencion, "un paciente en necesidad del mismo" se refiere a cualquier paciente que puede tener, o esta en riesgo de tener un trastorno caracterizado por proteinuria.

Como se usa en el presente documento, la expresion "sustancia de prueba" o "agente terapeutico candidato" o "agente" se usan intercambiablemente en el presente documento y las expresiones se entienden que abarcan cualquier molecula, entidad qmmica, composicion, farmaco, agente terapeutico, agente quimioterapeutico o agente biologico capaz de prevenir, aliviar o tratar una enfermedad u otra afeccion medica. La expresion incluye

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compuestos de moleculas pequenas, reactivos antisentido, reactivos ARNip, anticuerpos, enzimas, moleculas organicas o inorganicas peptidicas, compuestos naturales o sinteticos y similares. Una sustancia o un agente de prueba pueden ensayarse de acuerdo con los procedimientos de la invencion en cualquier fase durante las pruebas clmicas, durante el ensayo previo a las pruebas o despues de la aprobacion por la FDA.

Como se usa en el presente documento la frase "diagnostico" significa identificar la presencia o la naturaleza de una afeccion patologica. Los procedimientos diagnosticos difieren en su sensibilidad y su especificidad. La "sensibilidad" de un ensayo diagnostico es el porcentaje de individuos enfermos quienes prueban positivos (porcentajes de "positivos verdaderos"). Los individuos enfermos no detectados por el ensayo son "falsos negativos". Los sujetos quienes no estan enfermos y quienes prueban negativo en el ensayo se denominan "verdaderos negativos". La "especificidad" de un ensayo diagnostico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de "falsos positivos" se define como la proporcion de aquellos sin la enfermedad quienes prueban positivo. Aunque un procedimiento diagnostico particular puede no proporcionar un diagnostico definitivo de una afeccion, es suficiente si el procedimiento proporciona una indicacion positiva que ayuda en el diagnostico.

Como se usa en el presente documento la frase "diagnosticar" se refiere a clasificar una enfermedad o un smtoma, determinar una gravedad de la enfermedad, monitorizar un avance de la enfermedad, pronosticar una aparicion de una enfermedad y/o prospectar la recuperacion. El termino "deteccion" puede abarcar opcionalmente cualquiera de lo anterior. El diagnostico de una enfermedad de acuerdo con la presente invencion puede realizarse determinando un nivel de un polinucleotido o un polipeptido en una muestra biologica obtenida del sujeto, en el que el nivel determinado puede correlacionarse con la predisposicion a, o la presencia o la ausencia de la enfermedad. Notese que una "muestra biologica obtenida del sujeto" tambien puede comprender opcionalmente una muestra que no se ha retirado ffsicamente del sujeto, como se describe en mayor detalle a continuacion.

Como se define en el presente documento, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto (es decir, una dosificacion eficaz) significa una cantidad suficiente para producir un resultado terapeuticamente (por ejemplo, clmicamente) deseable. Las composiciones pueden administrarse una de una o mas veces al dfa a una o mas veces a la semana; incluyendo un dfa sf un dfa no. El experto en la materia apreciara que ciertos factores pueden influir en la dosificacion y el tiempo requerido para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero no limitado a la gravedad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de los compuestos puede incluir un unico tratamiento o una serie de tratamientos.

El termino "muestra" se entiende que se interpreta en su sentido mas amplio. Una "muestra" se refiere a una muestra biologica, tal como, por ejemplo, una o mas celulas, tejidos o fluidos (incluyendo, sin limitacion, plasma, suero, sangre completa, fluido cerebroespinal, linfa, lagrimas, orina, saliva, leche, pus y exudados y secreciones tisulares) aislados de un individuo o de constituyentes de un cultivo celular, asf como muestras obtenidas de, por ejemplo, un procedimiento de laboratorio. Una muestra biologica puede comprender cromosomas aislados de celulas (por ejemplo, una extension de cromosomas en metafase), organulos o membranas aisladas de celulas, celulas enteras o tejidos, acido nucleico tal como ADN genomico en solucion o unido a un soporte solido tal como para analisis Southern, ARN en solucion o unido a un soporte solido tal como para analisis Northern, ADNc en solucion o unido a un soporte solido, oligonucleotidos en solucion o unidos a un soporte solido, polipeptidos o peptidos en solucion o unidos a un soporte solido, un tejido, una impresion de tejido y similares.

Pueden utilizarse numerosos procedimientos conocidos de coleccion de tejidos o fluidos para recoger la muestra biologica del sujeto para determinar el nivel de ADN, ARN y/o polipeptido de la variante de interes en el sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, biopsia de aguja fina, biopsia de aguja, biopsia de aguja central y biopsia quirurgica (por ejemplo, biopsia de cerebro) y lavado. Independientemente del procedimiento empleado, una vez que se obtiene una biopsia/muestra el nivel de la variante puede determinarse y de esta manera puede realizarse un diagnostico.

La expresion "molecula del receptor de uroquinasa", "uPAR" se entiende que incluye, soluble, unido a membrana, variantes, fragmentos, todos los miembros de la familia, isoformas, precursores, mutantes, alelos, fragmentos, especies, cepas de polinucleotidos sentido y antisentido, etc.

El termino "neutralizante" cuando se refiere a un agente de union marcado como diana tal como un anticuerpo se refiere a la capacidad de un anticuerpo de eliminar, o reducir significativamente, la actividad de un antfgeno diana. En consecuencia, un anticuerpo anti-uPAR "neutralizante" es capaz de eliminar o reducir significativamente la actividad de uPAR. Un anticuerpo neutralizante uPAR puede, por ejemplo, actuar bloqueando la union de uPA a su receptor uPAR. Bloqueando esta union, la activacion del plasminogeno mediada por uPA se elimina significativa o completamente.

"Activo" o "actividad" con respecto a un polipeptido uPAR se refiere a una porcion de un polipeptido uPAR que tiene una actividad biologica o una inmunologica de un polipeptido uPAR nativo. "Biologico/a" cuando se usa en el presente documento se refiere a una funcion biologica que resulta de la actividad del polipeptido uPAR nativo.

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Composiciones

La proteinuria puede provocarse principalmente por alteraciones de las protemas estructurales implicadas en el mecanismo celular de la filtracion. Las causas patofisiologicas de la proteinuria pueden dividirse en los siguientes grupos principales: (1) perturbaciones geneticamente determinadas de estructuras que forman la "unidad de filtracion glomerular" como la membrana basal glomerular, los podocitos o el diafragma ranurado, (2) procesos inflamatorios, bien causados directamente por procesos autoinmunes o bien directamente inducidos por microbios, (3) dano de los glomerulos provocado por agentes o (4) como el resultado final de la lesion tubulointersticial progresiva resultando finalmente en la perdida de funcion de la nefrona entera.

La senalizacion del receptor de uroquinasa (uPAR) en los podocitos se ha mostrado recientemente que provoca la enfermedad glomerular. En los ejemplos que siguen, en un modelo de raton de trasplante renal y en sueros de pacientes que la forma soluble del receptor de uroquinasa (suPAR) puede depositarse en el rinon y provocar enfermedad renal proteinurica. Como el uPAR de podocitos endogeno, el suPAR activa la integrina avp3 fuera de forma dependiente. Estos estudios identifican el primer factor circulante de la enfermedad glomerular. La retirada o el bloqueo de esta protema es una perspectiva prometedora para el mantenimiento de organos nativos asf como la supervivencia del trasplante.

uPAR es una protema anclada a glucosilfosfatidilinositol (GPI) con tres dominios extracelulares. La escision del ancla GPI genera suPAR. Se ha encontrado suPAR elevado en el suero de pacientes con VIH, enfermedades reumaticas o neurologicas, malignidades hematologicas y tumores epiteliales. Los resultados en el presente documento, entre otros, muestran que la forma soluble de uPAR tambien juega un papel en una enfermedad renal proteinurica similar a su forma anclada a membrana.

uPAR se induce y se activa en podocitos en respuesta a estfmulos proteinuricos, tales como LPS o PAN, dando lugar a motilidad de podocitos in vitro y borrado de FP y proteinuria in vivo. uPAR asociado a balsa lipfdica forma un complejo con la integrina p3, provocando de esta manera la activacion de la integrina p3. Esto a su vez promueve la senalizacion de Cdc42 y Rac1, provocando de esta manera borrado de FP de podocitos y proteinuria. La proteinuria provocada por la senalizacion uPAR-integrina p3 puede prevenirse y reducirse por cicloRGDfV,42, un inhibidor selectivo de la integrina avp3. La activacion de la senalizacion de Rac1 en los podocitos tambien contribuye a la proteinuria en la nefropatfa asociada al virus de la inmunodeficiencia humana y los ratones knockout rhoGDIalfa. La proteinuria inducida por Rac1 puede bloquearse por la inhibicion de Rac1 o bloqueando su diana corriente abajo aldosterona. De esta manera, la activacion de la senalizacion promigratoria Cdc42 y Rac1 en los podocitos es una causa ampliamente extendida del borrado de FP y la proteinuria.

La fosforilacion de la sinaptopodina por la PJA o CaMKII promueve la union 14-3-3, que protege la sinaptopodina contra la escision mediada por CatL, estabilizando de esta manera los niveles de sinaptopodina en estado estacionario. La sinaptopodina suprime los filopodios mediados por IRSp53:Mena bloqueando la union de Cdc42 y Mena a IRSp53 e induce fibras de estres por bloqueo competitivo de la ubiquitinacion de RhoA mediada por Smurf-1. La sinaptopodina tambien previene la degradacion mediada por CatL de la dinamina. La sinaptopodina estabiliza el filtrado renal bloqueando la reorganizacion del citoesqueleto de actina del podocito en un fenotipo migratorio. La desfosforilacion de la sinaptopodina por la calcineurina anula la interaccion con 14-3-3. Esto hace a los sitios de escision de CatL de la sinaptopodina accesibles y promueve la degradacion de la sinaptopodina. El LPS o diversas senales proximales distintas inducen la expresion de B7-1 y CatL en los podocitos, lo que provoca la proteinuria a traves de la degradacion aumentada de la sinaptopodina y la dinamina. En paralelo, el LPS u otras senales proximales pueden activar tambien Cdc42 y Rac1 a traves de la senalizacion de uPAR-integrina b3, a traves de la perdida de la inhibicion mediada por sinaptopodina de la senalizacion de Cdc42 o a traves de la activacion mediada por Nef-Src de Rac1. Como una consecuencia, el citoesqueleto de actina del podocito se desplaza de un fenotipo estacionario a uno de motilidad, provocando de esta manera el borrado de proceso de pies y proteinuria. CsA y E64 salvaguardan contra la proteinuria estabilizando los niveles proteicos en estado estacionario de la sinaptopodina y la dinamina en los podocitos, FP(4)-Mito bloqueando la senalizacion Cdcd42:IRSp53:Mena, cycloRGDfV bloqueando la senalizacion uPAR:integrina b3, NSC23766 bloqueando Rac1 y epleronona bloqueando la senalizacion de aldosterona.

uPAR se activa en los podocitos en respuesta a los estfmulos proteinuricos tales como LPS o PAN, dando lugar a una motilidad de podocitos aumentada in vitro asf como borrado de FP y proteinuria in vivo y los ratones deficientes en uPAR estan protegidos contra la proteinuria inducida por LPS. uPAR activado se asocia a la integrina p3 en balsas lipfdicas provocando de esta manera la activacion de la integrina p3. La integrina p3 activada a su vez induce la senalizacion pro-migratoria de Cdc42 y Rac1, provocando de esta manera borrado de FP de podocitos y proteinuria. La proteinuria iniciada por senalizacion de uPAR:integrina p3 puede bloquearse por cicloRGDfV, un inhibidor selectivo de la integrina avp3. De manera interesante, la activacion de la senalizacion de Rac1 en los podocitos tambien contribuye a la proteinuria en la nefropatfa asociada al HIV y los ratones knockout rhoGDI. La proteinuria inducida por Rac1 puede bloquearse por la inhibicion de Rac1 o bloqueando su diana corriente abajo aldosterona. De esta manera, la activacion de la senalizacion promigratoria RhoGTPasas Cdc42 y Rac1 en los podocitos es una causa ampliamente extendida de proteinuria.

De esta manera, en una realizacion preferida, una composicion modula la expresion y/o la actividad de las moleculas

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del receptor de uroquinasa de membrana y/o soluble. Preferentemente, el agente modula las moleculas de receptor de uroquinasa solubles. El agente puede ser cualquier agente que module la expresion de las moleculas del receptor de uroquinasa o la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa, tales como por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, anticuerpos, moleculas pequenas y similares.

En una realizacion preferida, el agente modula o inhibe la expresion, la funcion y/o la actividad de las moleculas de receptor de uroquinasa aproximadamente un 5 % en comparacion con un control normal, de preferencia aproximadamente un 10 %, de preferencia aproximadamente un 50 %, de preferencia aproximadamente un 80 %, un 90 %, un 100 %. La modulacion de, por ejemplo, la expresion o las cantidades de moleculas del receptor de uroquinasa soluble resulta en por ejemplo, una disminucion en la activacion de la integrina avp3 y el tratamiento de las enfermedades renales tales como proteinuria.

En otra realizacion preferida un agente inhibe o bloquea la senalizacion de uPAR activado-integrina p3 y la hipermotilidad FP de los podocitos. Esto sena un ejemplo de una actividad uPAR.

En otra realizacion preferida, el agente modula la degradacion y/o la tasa de degradacion de las moleculas de uPAR en comparacion a los controles normales aproximadamente un 5 %, de preferencia aproximadamente un 50 %, de preferencia aproximadamente un 80 %, un 90 %, un 100 %.

En otra realizacion preferida, los agentes que modulan la actividad y/o la expresion uPAR comprenden oligonucleotidos, polinucleotidos, peptidos, polipeptidos, anticuerpos, aptameros, moleculas pequenas, moleculas organicas, moleculas inorganicas o combinaciones de los mismos.

En otra realizacion preferida, la composicion comprende uno o mas agentes que modulan la expresion uPAR, la actividad y/o la funcion in vivo. Por ejemplo, un agente inhibe directamente la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa. En otro ejemplo, un agente inhibe directamente la union de uPAR a su ligando. En otra realizacion preferida, un imitador de un ligando uPAR se une a uPAR. En otra realizacion preferida, una composicion comprende un agente que directamente marca como diana las moleculas del receptor de uroquinasa, mediante, por ejemplo, la union a ellas, tales como, un anticuerpo, un oligonucleotido antisentido que inhibe la expresion de las moleculas del receptor de uroquinasa, un segundo agente que marca como diana otra molecula en la ruta de smtesis de las moleculas del receptor de uroquinasa o moleculas en las rutas que estan asociadas a las moleculas del receptor de uroquinasa, tales como por ejemplo, GTPasa etc.

Otra realizacion preferida es un agente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno asociados a la expresion y/o la actividad patologicas de las moleculas del receptor de uroquinasa que comprende administrarlo a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad eficaz de un agente que modula la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa, la funcion y/o la expresion in vivo para tratar los trastornos. Por ejemplo una enfermedad de los podocitos o un trastorno tal como proteinuria.

Por ejemplo, el agente pude ser un vector que expresa moleculas uPAR mutantes, un agente que marca como diana acidos nucleicos de uPAR que disminuyen la produccion in vivo de uPAR.

En otra realizacion preferida, una combinacion de agentes que modulan la expresion de uPAR, la funcion y/o la actividad y/o modulan la degradacion de uPAR se administra a un paciente, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizados por proteinuria y/o enfermedades o trastornos de los podocitos.

En una realizacion preferida, una enfermedad o trastorno caracterizados por proteinuria comprenden: enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis segmental focal, enfermedad de cambio mmimo, smdromes nefroticos, pre-eclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colageno, estres, ejercicio agotador, proteinuria ortostatica (postural) benigna, glomeruloesclerosis segmental focal (GEFS), nefropatfa de IgA, nefropatfa de IgM, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatfa membranosa, sarcoidosis, smdrome de Alport, diabetes mellitus, dano renal debido a farmacos, enfermedad de Fabry, infecciones, aminoaciduria, smdrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensa, nefritis intersticial, enfermedad de celulas falciformes, hemoglobinuria, mieloma multiple, mioglobinuria, cancer, Granulomatosis de Wegener o Enfermedad de Almacenamiento de Glucogeno Tipo 1.

En otra realizacion preferida, la modulacion de la expresion de uPAR, la funcion, la actividad, etc., se modula por un agente en el tratamiento de trastornos o enfermedades relacionadas con los podocitos. Para los fines de la presente divulgacion, las expresiones "enfermedad o enfermedades de podocitos" y "trastorno o trastornos de podocitos" son intercambiables y pueden significar cualquier enfermedad, trastorno, smdrome, anomalfa, patologfa o afeccion anormal de los podocitos o de la estructura o la funcion de sus partes constituyentes.

En otra realizacion preferida, un agente es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno de podocitos asociados a la expresion y/o la actividad patologicas de las moleculas del receptor de uroquinasa que comprende administrarlo a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad eficaz de un agente que modula la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa, la funcion y/o la expresion in vivo para tratar los trastornos o enfermedades de los podocitos.

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Tales trastornos o enfermedades incluyen pero no se limitan a la perdida de podocitos (podocitopenia), mutacion de podocitos, un aumento en la anchura del proceso de pies o una disminucion en la longitud del diafragma ranurado. En un aspecto, la enfermedad o el trastorno relacionados con los podocitos pueden ser un barrido o una disminucion de la densidad de podocitos. En un aspecto, la disminucion de la densidad de podocitos podna deberse a una disminucion en el numero de podocitos, por ejemplo, debido a apoptosis, separacion, carencia de proliferacion, dano del ADN o hipertrofia.

En una realizacion, la enfermedad o el trastorno relacionados con los podocitos pueden deberse a una lesion de los podocitos. En un aspecto, la lesion de los podocitos puede deberse a estres mecanico tal como alta presion sangumea, hipertension o isquemia, carencia de suministro de oxfgeno, una sustancia toxica, un trastorno endocrinologico, una infeccion, un agente de contraste, un traumatismo mecanico, un agente citotoxico (cis-platino, adriamicina, puromicina), inhibidores de la calcineurina, una inflamacion (por ejemplo, debida a una infeccion, un traumatismo, anoxia, obstruccion o isquemia), radiacion, una infeccion (por ejemplo, bacteriana, fungica o vmca), una disfuncion del sistema inmune (por ejemplo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad sistemica o nefropatfa de IgA), un trastorno genetico, una medicacion (por ejemplo, un agente antibacteriano, un agente antivmco, un agente antifungico, un agente inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un analgesico o un agente anticancer), un fallo organico, un trasplante de organo o uropatia. En un aspecto, la isquemia puede ser anemia de celulas falciformes, trombosis, trasplante, obstruccion, choque o perdida de sangre. En un aspecto, los trastornos geneticos pueden incluir el smdrome nefntico congenito del tipo Finnish, la nefropatfa membranosa fetal o mutaciones en protemas espedficas de podocitos, tales como a-actina-4, podocina y TRpC6.

En un aspecto, la enfermedad o el trastorno relacionados con los podocitos puede ser la expresion o la funcion anormales de las protemas del diafragma ranurado tales como podocina, nefrina, CD2AP, protemas de la membrana celular tales como TRPC6 y protemas implicadas en la organizacion del citoesqueleto tales como sinaptopodina, protemas de union a actina, familias lamb y colagenos. En otro aspecto, la enfermedad o el trastorno relacionados con los podocitos pueden estar relacionados con una perturbacion de GBM, con una perturbacion de la funcion de las celulas mesangiales y con la deposicion de complejos antfgeno-anticuerpo y anticuerpos anti-podocitos. En otro aspecto, la enfermedad o el trastorno relacionados con los podocitos pueden ser atrofia tubular.

En una realizacion preferida, la enfermedad o el trastorno relacionados con los podocitos comprenden proteinuria, tales como microalbumiuria o macroalbumiuria. De esta manera, En realizaciones particularmente preferidas, uno o mas agentes que modulan la expresion de uPAR, la funcion, la actividad, la degradacion, la tasa de degradacion y/o que inhiben la expresion de la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa pueden combinarse con uno o mas compuestos quimioterapeuticos distintos que se usan para tratar cualquiera de las enfermedades o trastornos de podocitos.

Puede usarse una amplia diversidad de agentes para marcar como diana uPAR, especialmente moleculas del receptor de uroquinasa. Estos agentes pueden disenarse para marcar como diana uPAR que tienen una actividad in vivo que reduzca la expresion y/o la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa.

Los agentes pueden regular las moleculas del receptor de uroquinasa basandose en el ADNc o las regiones reguladoras de las moleculas del receptor de uroquinasa. Por ejemplo, los agentes basados en ADN, tales como inhibidores antisentido y ribozimas, pueden utilizarse para marcar como diana tanto los intrones como los exones de los genes uPAR asf como al nivel del ARN.

Alternativamente, los agentes pueden marcar como diana las moleculas del receptor de uroquinasa basandose en las secuencias de aminoacidos que incluyen las propartes y/o las estructuras proteicas tridimensionales de las moleculas del receptor de uroquinasa. Los agentes basados en protemas, tales como anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales no humanos y anticuerpos humanizados, pueden usarse para marcar como diana espedficamente epftopos diferentes en las moleculas del receptor de uroquinasa. Los peptidos o los peptidomimeticos pueden servir como inhibidores de alta afinidad para unirse espedficamente al sitio activo de un uPAR particular, inhibiendo de esta manera la actividad in vivo del uPAR. Las moleculas pequenas pueden emplearse tambien para marcar uPAR como diana, especialmente aquellas que tienen alta selectividad hacia las moleculas del receptor de uroquinasa.

Ademas de marcar como diana las moleculas del receptor de uroquinasa, tambien pueden usarse agentes que inhiben competitivamente las moleculas del receptor de uroquinasa compitiendo con los ligandos naturales del receptor de uroquinasa.

En otra realizacion, uno de los agentes puede ser un inhibidor de proteasa, espedfico para las moleculas del receptor de uroquinasa.

Anticuerpos: otras realizaciones se refieren a agentes de union marcados que se unen a uPAR y afectan a la funcion de uPAR. Los ejemplos incluyen, anticuerpos monoclonales que se unen a uPAR y afectan a la funcion de uPAR. Otras realizaciones se refieren a anticuerpos anti-uPAR con alta afinidad de union por uPAR, con la capacidad de neutralizar uPAR in vitro e in vivo y la capacidad de inhibir la expresion y/o la funcion de uPAR.

Otra realizacion preferida se refiere a anticuerpos anti-uPAR completamente humanos con propiedades deseables

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desde una perspectiva terapeutica, incluyendo alta afinidad de union por uPAR, la capacidad de neutralizar uPAR in vitro e in vivo.

En una realizacion, los anticuerpos se unen a uPAR con afinidades muy altas (Kd). Por ejemplo un anticuerpo humano, de conejo, de raton, quimerico o humanizado que es capaz de unir uPAR con una Kd menor que, pero no limitada a, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10o 10-11 M, o cualquier intervalo o valor en los mismos. Las mediciones de afinidad y/o avidez pueden medirse por KinExA™ y/o BIACORE™.

Una realizacion incluye anticuerpos aislados, o fragmentos de aquellos anticuerpos, que se unen a uPAR. Como se sabe en la tecnica, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, policlonales, oligoclonales, monoclonales, quimericos, humanizados y/o anticuerpos completamente humanos. Las realizaciones descritas en el presente documento tambien proporcionan celulas para producir estos anticuerpos.

Se apreciara que las realizaciones no se limitan a ninguna forma particular de un anticuerpo o procedimiento de generacion o produccion. Por ejemplo, el anticuerpo anti-uPAR puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una region Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab').sub.2, Fv o Dab (los Dab son las unidades de union funcionales mas pequenas de los anticuerpos humanos). Ademas, el anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o de una celula producida recombinantemente que se ha transformado o transfectado con un gen o genes que codifican el anticuerpo.

Otras realizaciones incluyen moleculas de acidos nucleicos aisladas que codifican cualquiera de los agentes de union marcados como diana, anticuerpos o fragmentos de los mismos como se describe en el presente documento, vectores que tienen moleculas de acidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos anti-uPAR o una celula hospedadora transformada con cualquiera de tales moleculas de acidos nucleicos. Ademas, una realizacion es un procedimiento para producir un anticuerpo anti-uPAR cultivando celulas hospedadoras en condiciones en las que una molecula de acido nucleico se expresa para producir el anticuerpo seguido de la recuperacion del anticuerpo. Notese que las realizaciones tambien incluyen cualquier molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo que incluye secuencias de acidos nucleicos optimizadas para aumentar rendimientos de anticuerpos o fragmentos de los mismos cuando se transfectan en celulas hospedadoras para la produccion de anticuerpos.

Una realizacion adicional incluye un procedimiento para producir anticuerpos de alta afinidad a uPAR inmunizando a un mairnfero con uPAR humano, o un fragmento del mismo, y una o mas secuencias ortologas o fragmentos de las mismas.

Otra realizacion incluye un procedimiento para diagnosticar enfermedades o afecciones en las que un anticuerpo preparado como se describe en el presente documento se utiliza para detectar el nivel de uPAR en una muestra de paciente. En una realizacion, la muestra del paciente es sangre o suero sangumeo. En realizaciones adicionales, los procedimientos para la identificacion de factores de riesgo, el diagnostico de la enfermedad y la estadificacion de la enfermedad se presentan implicando la identificacion de la sobreexpresion de uPAR usando anticuerpos anti-uPAR.

1. Otra realizacion incluye un procedimiento para diagnosticar una afeccion asociada a la expresion de uPAR en una celula poniendo en contacto el suero o una celula con un agente de union marcado como diana o un anticuerpo anti-uPAR y en lo sucesivo detectar la presencia de uPAR. Las afecciones preferidas incluyen enfermedad renal que comprende: enfermedades o trastornos de los podocitos, proteinuria, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis segmental focal, enfermedad de cambio mmimo, smdromes nefroticos, pre-eclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colageno, estres, ejercicio agotador, proteinuria ortostatica (postural) benigna, glomeruloesclerosis segmental focal (GEFS), nefropatfa de IgA, nefropatfa de IgM, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatfa membranosa, sarcoidosis, smdrome de Alport, diabetes mellitus, dano renal debido a farmacos, enfermedad de Fabry, infecciones, aminoaciduria, smdrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensa, nefritis intersticial, enfermedad de celulas falciformes, hemoglobinuria, mieloma multiple, mioglobinuria, nefropatfa diabetica (ND), nefritis por lupus, Granulomatosis de Wegener o Enfermedad de Almacenamiento de Glucogeno Tipo 1.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona un kit de ensayo para detectar uPAR en tejidos de mamfferos, celulas o fluidos corporales para explorar enfermedades relacionadas con uPAR. El kit incluye un agente de union marcado como diana o un anticuerpo que se une a uPAR y un medio para indicar la reaccion del anticuerpo con uPAR, si esta presente. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra realizacion, el anticuerpo que se une a uPAR esta marcado. En aun otra realizacion el anticuerpo es un anticuerpo primario sin marcar y el kit incluye ademas un medio para detectar el anticuerpo primario. En una realizacion, el medio para la deteccion incluye un segundo anticuerpo marcado que es una anti-imimoglobulina. El anticuerpo puede marcarse con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un radionuclido y un material radiopaco.

Otras realizaciones incluyen composiciones farmaceuticas que tienen una cantidad eficaz de un agente de union marcado como diana o un anticuerpo anti-uPAR mezclado con un vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptables. Aun en otras realizaciones, el agente de union marcado como diana o el anticuerpo anti-uPAR, o un

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fragmento del mismo, se conjuga a un agente terapeutico. El agente terapeutico puede ser, por ejemplo, una toxina o un radioisotopo.

1. Aun otra realizacion incluye un agente de union marcado como diana o un anticuerpo anti-uPAR para tratar afecciones o enfermedades asociadas a la expresion de uPAR en un paciente, administrando al paciente una cantidad eficaz de un agente de union marcado como diana o un anticuerpo anti-uPAR. El agente de union marcado como diana o un anticuerpo anti-uPAR pueden administrarse solos, o pueden administrarse en combinacion con anticuerpos adicionales o terapia de farmacos quimioterapeuticos o de radiacion. Por ejemplo, puede administrarse una mezcla de anticuerpos uPAR monoclonales, oligoclonales o policlonales en combinacion con un farmaco que muestra inhibir un estado de la enfermedad o smtomas asociados a la misma. El procedimiento puede realizarse in vivo y el paciente es preferentemente un paciente humano. En una realizacion preferida, el procedimiento se refiere al tratamiento de una enfermedad renal que comprende: enfermedades o trastornos de los podocitos, proteinuria, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis segmental focal, enfermedad de cambio mmimo, smdromes nefroticos, preeclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colageno, estres, ejercicio agotador, proteinuria ortostatica (postural) benigna, glomeruloesclerosis segmental focal (GEFS), nefropatfa de IgA, nefropatfa de IgM, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatfa membranosa, sarcoidosis, smdrome de Alport, diabetes mellitus, dano renal debido a farmacos, enfermedad de Fabry, infecciones, aminoaciduria, smdrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensa, nefritis intersticial, enfermedad de celulas falciformes, hemoglobinuria, mieloma multiple, mioglobinuria, nefropatfa diabetica (ND), nefritis por lupus, Granulomatosis de Wegener o Enfermedad de Almacenamiento de Glucogeno Tipo 1.

En algunas realizaciones, el agente de union marcado como diana o el anticuerpo anti-uPAR se administra a un paciente, seguido de la administracion de un agente de limpieza para retirar el anticuerpo circulante en exceso de la sangre.

Agentes basados en acidos nucleicos: Los agentes basados en acidos nucleicos tales como las moleculas antisentido y las ribozimas pueden utilizarse para marcar como diana tanto los intrones como los exones de los genes uPAR asf como al nivel del ARN para inhibir la expresion genica de los mismos, inhibiendo de esta manera la actividad del uPAR marcado como diana. Ademas, tambien pueden utilizarse moleculas de triple helice para inhibir la actividad genica de uPAR. Tales moleculas pueden disenarse para reducir o inhibir bien el gen uPAR tipo silvestre o bien, si es apropiado, la actividad genica uPAR mutante. Las tecnicas para la produccion y el uso de tales moleculas son bien conocidas por los expertos en la materia y se describen sucintamente a continuacion.

En otra realizacion preferida, los genes uPAR se modulan marcando como diana secuencias de acidos nucleicos implicadas en la expresion y/o la actividad de moleculas uPAR. Por ejemplo, las regiones reguladoras senan una diana para disminuir la expresion de uPAR.

Las moleculas de ARN y ADN antisentido actuan bloqueando directamente la traduccion del ARNm hibridandose al ARN marcado como diana y previniendo la traduccion proteica. Los enfoques antisentido implican el diseno de oligonucleotidos que son complementarios a un ARNm de un gen diana. Los oligonucleotidos antisentido se uniran a los transcritos de ARNm del gen diana complementario y prevendran la traduccion. La complementariedad absoluta, aunque preferida, no se requiere.

Una secuencia "complementaria" a una porcion de un ARN, como se denomina en el presente documento, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridar con el ARN, formando un duplex estable; en el caso de los acidos nucleicos antisentido de doble cadena, puede ensayarse de esta manera una cadena sencilla del duplex de ADN o puede ensayarse una formacion de triplex. La capacidad de hibridar dependera tanto del grado de complementariedad como de la longitud del acido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto mas largo es el acido nucleico que hibrida, mas desapareamientos de bases con un ARN contendra y todavfa formara un duplex estable (o triplex, segun sea el caso). Un experto en la materia puede comprobar un grado tolerable de desapareamiento mediante el uso de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusion del complejo hibridado.

Los oligonucleotidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia sin traducir 5' y que incluye el codon de iniciacion AUG, debe trabajar mas eficazmente inhibiendo la traduccion. Sin embargo, las secuencias complementarias a las secuencias sin traducir 3' de los ARNm se han demostrado ser eficaces igualmente inhibiendo la traduccion de los ARNm. Wagner (1994) Nature 372:333-335. Por ejemplo, los oligonucleotidos complementarios bien a las regiones 5' o 3' no traducidas no codificantes del gen humano o de raton de las moleculas del receptor de uroquinasa podnan usarse en un enfoque antisentido para inhibir la traduccion de los ARNm de las moleculas del receptor de uroquinasa endogenas.

En otra realizacion preferida, el enfoque antisentido puede usarse para marcar reguladores negativos diana de la expresion y/o la funcion de uPAR.

Los oligonucleotidos complementarios a la region 5' sin traducir del ARNm deben incluir el complemento del codon de inicio AUG. Los oligonucleotidos antisentido complementarios a las regiones que codifican ARNm son inhibidores

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menos eficaces de la traduccion pero podnan usarse de acuerdo con la divulgacion. Ya se disenen para hibridar a la region 5', 3' o codificante del ARNm del gen diana, los acidos nucleicos antisentido son preferentemente al menos de seis nucleotidos de longitud y son mas preferentemente oligonucleotidos que vanan de 6 a aproximadamente 50 nucleotidos de longitud. En aspectos espedficos el oligonucleotido tiene al menos 10 nucleotidos, preferentemente al menos 17 nucleotidos, mas preferentemente al menos 25 nucleotidos y mas preferentemente al menos 50 nucleotidos.

Alternativamente, las moleculas antisentido pueden disenarse para marcar como diana la region traducida, es decir, el ADNc del gen uPAR. Por ejemplo, las moleculas de ARN antisentido que marcan como diana la secuencia de codificacion completa o una porcion de las moleculas del receptor de uroquinasa murino maduro (Kirschke y col. (2000) Euro. J. Cancer 36:787-795) pueden utilizarse para inhibir la expresion de las moleculas del receptor de uroquinasa y de esta manera reducir la actividad de su actividad enzimatica. Ademas, un ADNc de las moleculas del receptor de uroquinasa de longitud completa o parcial puede subclonarse en un vector de expresion pcADN-3 en orientacion inversa y una construccion tal puede transfectarse en celulas para producir poliARN antisentido para bloquear los transcritos endogenos de un uPAR, tales como moleculas del receptor de uroquinasa y de esta manera inhibir la expresion de uPAR.

Los estudios in vitro pueden realizarse para cuantificar la capacidad del oligonucleotido antisentido de inhibir la expresion genica. Se prefiere que estos estudios utilicen controles que distingan entre la inhibicion del gen antisentido y los efectos biologicos no espedficos de los oligonucleotidos. Tambien se prefiere que estos estudios comparen niveles del ARN diana o la protema con aquellos de un ARN control o protema internos. Adicionalmente, se preve que los resultados obtenidos usando el oligonucleotido antisentido se comparen con aquellos obtenidos usando un oligonucleotido control. Se prefiere que el oligonucleotido control sea de aproximadamente la misma longitud que el oligonucleotido de prueba y que la secuencia de nucleotidos del oligonucleotido difiera de la secuencia antisentido no mas de lo necesario para prevenir la hibridacion espedfica a la secuencia diana.

Los oligonucleotidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quimericas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de cadena sencilla o de doble cadena. El oligonucleotido puede modificarse en el resto de base, el resto de azucar o el esqueleto fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molecula, la hibridacion, etc. El oligonucleotido puede incluir otros grupos adjuntos tales como peptidos o agentes que faciliten el transporte a traves de las membranas celulares (Vease, por ejemplo, Letsinger (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:6553-6556) o la barrera hematoencefalica, agentes de escision activada por hibridacion. Vease, por ejemplo, Krol (1988) Bio Techniques 6:958-976 o agentes intercalantes. Vease, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549. El oligonucleotido puede conjugarse con otra molecula, por ejemplo, un peptido, un agente de reticulado activado por hibridacion, agente de transporte, agente de escision activada por hibridacion, etc.

El oligonucleotido antisentido puede comprender al menos un resto de base modificada que se selecciona del grupo que consiste en, pero no estando limitado a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, p-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, p-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, acido uracil-5-oxiacetico (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metilester del acido uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2- carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.

El oligonucleotido antisentido puede comprender al menos un resto de azucar modificado que se selecciona del grupo que consiste en, pero no estando limitado a arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.

En otra realizacion mas, el oligonucleotido antisentido comprende al menos un esqueleto fosfato modificado seleccionado del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforoamidotioato, un fosforoamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriester de alquilo y un formacetal o un analogo de los mismos.

Las moleculas de ribozima disenadas para escindir catalfticamente los transcritos de ARNm del gen diana pueden usarse tambien para prevenir la traduccion del ARNm del gen diana y, por lo tanto, la expresion del producto genico diana. Vease, por ejemplo Sarver y col. (1990) Science 247:1222-1225.

Las ribozimas son moleculas de ARN enzimaticas capaces de catalizar la escision espedfica del ARN. El mecanismo de la accion de las ribozimas implica la hibridacion espedfica de secuencia de la molecula de ribozima al ARN diana complementario, seguido de un evento de escision endonucleolftica. La composicion de las moleculas de ribozima debe incluir una o mas secuencias complementarias al ARNm del gen diana y debe incluir la secuencia catalftica bien conocida responsable de la escision del ARNm.

Aunque las ribozimas que escinden ARNm en las secuencias de reconocimiento espedficas de sitio pueden usarse para destruir el ARNm del gen diana, se prefiere el uso de ribozimas cabeza de martillo. Las ribozimas cabeza de martillo escinden ARNm en localizaciones dictadas por regiones que flanquean que forman pares de bases

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complementary al ARNm diana. El unico requisito es que el ARNm diana tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construccion y la produccion de ribozimas cabeza de martillo se conoce bien en la tecnica.

La expresion genica de uPAR endogeno tambien puede reducirse inactivando o "desactivando genes" del gen uPAR marcado como diana o su promotor usando recombinacion homologa marcada como diana. Smithies y col. (1985) Nature 317:230-234; Thomas y Capecchi, (1987) Cell 51:503-512; y Thompson y col. (1989) Cell 5:313-321.

Alternativamente, la expresion genica de uPAR endogeno puede reducirse marcando como diana secuencias de desoxirribonucleotido complementarias a la region reguladora del gen uPAR (es decir, el promotor del gen diana y/o los potenciadores) para formar estructuras de triple helice que prevengan la transcripcion del gen diana en las celulas diana en el cuerpo. Vease generalmente, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-584; Helene y col. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) Bioassays 14:807-815.

Las moleculas de acidos nucleicos a usarse en la formacion de triple helice para la inhibicion de la transcripcion deben ser de cadena sencilla y compuestas por desoxinucleotidos. La composicion de bases de estos oligonucleotidos debe disenarse para promover la formacion de la triple helice a traves de reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren que esten presentes extensiones considerables bien de purinas o bien de pirimidinas en una hebra de un duplex. Las secuencias de nucleotidos pueden estar basadas en pirimidinas, que resultaran en tripletes TAT y CGC a traves de las tres hebras asociadas de la triple helice resultante. Las moleculas ricas en pirimidina proporcionan complementariedad de bases a una region rica en purina de una unica hebra del duplex en una orientacion paralela a esa hebra. Ademas, pueden elegirse moleculas de acido nucleico que son ricas en purina, por ejemplo, contienen una extension de restos de G. Estas moleculas formaran una triple helice con un duplex de aDn que es rico en pares GC, en los que la mayona de restos purina se localizan en una unica hebra del duplex marcado como diana, dando como resultado tripletes GGC a traves de las tres cadenas en el triplex.

Biomarcadores

En una realizacion preferida, un biomarcador para el diagnostico de una enfermedad o trastorno caracterizados por proteinuria y/o la identificacion de individuos en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno caracterizados por proteinuria comprende: uPAR, dinamina, sinaptopodina, variantes, mutantes o fragmentos de los mismos.

Los biomarcadores pueden aumentar o disminuir la expresion entre sf. El panel de perfiles de expresion de biomarcadores se compara con los controles normales. En otros casos, la localizacion intra-celular cambia con el avance de la enfermedad.

En otra realizacion preferida, la identificacion de un individuo en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno caracterizados por proteinuria detecta al menos un biomarcador o fragmentos del mismo.

En otra realizacion preferida, el avance de la enfermedad o trastorno caracterizados por proteinuria se correlaciona con un aumento en uPAR.

Agentes terapeuticos candidatos:

En una realizacion preferida, los procedimientos (tambien denominados en el presente documento "ensayos de exploracion") se proporcionan para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, protemas, peptidos, peptidomimeticos, peptoides, moleculas pequenas, analogos u otros farmacos) que modulan la expresion de uPAR, la degradacion de la funcion y/o directamente sobre la actividad o la expresion de las moleculas del receptor de uroquinasa o las rutas de smtesis de las mismas. Los compuestos identificados de esta manera pueden usarse para modular la actividad de productos genicos diana, prolongar la vida media de una protema o peptido, regular la division celular, etc., en un protocolo terapeutico, para elaborar la funcion biologica del producto genico diana o para identificar los compuestos que interrumpen las interacciones genicas diana normales.

En otra realizacion preferida, se usa un ensayo de deteccion ensayo de deteccion de alto rendimiento (HTS) para detectar una biblioteca diversa de compuestos miembros. Los "compuestos" o "agentes terapeuticos candidatos" o "agentes candidatos" pueden ser cualquier molecula organica, inorganica, pequena, protema, anticuerpo, aptamero, molecula de acido nucleico o compuesto sintetico.

En otra realizacion preferida, los agentes candidatos modulan enzimas uPAR, precursores o moleculas implicados en las rutas. Preferentemente, la enzima son moleculas del receptor de uroquinasa. Estas enzimas pueden estar implicadas en diversas rutas bioqmmicas tales como rutas sinteticas, rutas de degradacion, por ejemplo ubiquitina, rutas enzimaticas, rutas de trafico de protemas, rutas metabolicas, rutas de transduccion de senales y similares.

En otra realizacion preferida, el ensayo de deteccion de alto rendimiento identifica agentes candidatos que marcan como diana y modulan las rutas implicadas en la expresion patologica o la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa. Los agentes candidatos senan utiles en el desarrollo y la identificacion de agentes novedosos para el tratamiento de enfermedades o trastornos de los podocitos, tales como, por ejemplo, proteinuria.

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En una realizacion, la divulgacion proporciona ensayos para detectar compuestos candidatos o de ensayo que modulan la degradacion, la tasa de degradacion, la actividad, la expresion y/o la funcion de moleculas uPAR, incluyendo por ejemplo uPAR circulante.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona ensayos para detectar compuestos candidatos o de ensayo que se unen a o modulan una actividad de la protema o el polipeptido de moleculas del receptor de uroquinasa o una porcion biologicamente activa de los mismos, mutantes o fragmentos o protemas de fusion de los mismos.

Los agentes candidatos incluyen numerosas clases qmmicas, aunque tfpicamente son compuestos organicos que incluyen compuestos organicos pequenos, acidos nucleicos que incluyen oligonucleotidos y peptidos. Los compuestos organicos pequenos pueden tener adecuadamente por ejemplo un peso molecular de mas de aproximadamente 40 o 50 aunque menos de aproximadamente 2.500. Los agentes candidatos pueden comprender grupos qrnmicos funcionales que interaction con protemas y/o ADN.

Los compuestos de ensayo pueden obtenerse usando cualquiera de los enfoques numerosos en los procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la tecnica, incluyendo, bibliotecas biologicas; bibliotecas peptoides (bibliotecas de moleculas que tienen las funcionalidades de peptidos, pero con un novedoso esqueleto no peptfdico que es resistente a la degradacion enzimatica pero sin embargo se mantienen bioactivos; vease, por ejemplo, Zuckermann, R. N. y col. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas de fase solida o de fase en solucion paralelas espacialmente direccionables; procedimientos de bibliotecas sinteticas que requieren desconvolucion; el procedimiento de biblioteca de una perla un compuesto; y procedimientos de bibliotecas sinteticas que usan seleccion por cromatograffa de afinidad. Los enfoques de biblioteca biologica y de biblioteca peptoide se limitan a bibliotecas peptfdicas, mientras que los otras cuatro enfoques son aplicables a peptidos, bibliotecas de oligomeros no peptfdicos o de pequenas moleculas de compuestos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Los ejemplos de procedimientos para la smtesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la tecnica, por ejemplo en: DeWitt y col. (1993) Proc. Natal. Acad. Sci. EE.UU. 90:6909; Erb y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:11422; Zuckermann y col. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho y col. (1993) Science 261:1303; Carrell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Ingl. 33:2059; Carell y col. (1994) Angew. Chem. In. Ed. Ingl. 33:2061; y Gallop y col. (1994) J. Med. Chem. 37:1233).

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solucion (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o sobre perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, Pat. de EE.UU. N.° 5.223.409), esporas (Ladner Pat. de EE.UU. N.° 5.223.409), plasmidos (Cull y col. (1992) Proc Nat'l Acad Sci USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra.).

En otra realizacion preferida, el agente terapeutico candidato comprende, protemas, peptidos, moleculas organicas, moleculas inorganicas, moleculas de acidos nucleicos y similares. Estas moleculas pueden ser naturales, por ejemplo de plantas, hongos, bacterias etc., o pueden sintetizarse o ser sinteticas.

Un compuesto prototipo puede esperarse que tenga actividad terapeutica basado en cualquier informacion disponible para el experto. Por ejemplo, un compuesto prototipo puede esperarse que tenga actividad terapeutica basado en la informacion contenida en la Physician's Desk Reference. Ademas, a modo de ejemplo no limitante, un compuesto puede esperarse que tenga actividad terapeutica basado en la experiencia de un clmico, la estructura del compuesto, los datos de relacion de actividad estructural, CE50, datos de ensayos, datos de ensayos de CI50, estudios animales o clmicos o cualquier otra base o combinacion de tales bases.

Un compuesto terapeuticamente activo es un compuesto que tiene actividad terapeutica, incluyendo por ejemplo, la capacidad de un compuesto para inducir una respuesta especificada cuando se administra a un sujeto o se ensaya in vitro. La actividad terapeutica incluye el tratamiento de una enfermedad o afeccion, incluyendo tanto el tratamiento profilactico como el paliativo. El tratamiento de una enfermedad o afeccion puede incluir la mejora de una enfermedad o afeccion en cualquier cantidad, incluyendo la prevencion, la paliacion y la eliminacion de la enfermedad o afeccion. La actividad terapeutica puede llevarse a cabo contra cualquier enfermedad o afeccion, incluyendo en una realizacion preferida contra cualquier enfermedad o trastorno asociados a la proteinuria. Para determinar la actividad terapeutica puede usarse cualquier procedimiento por el que pueda evaluarse la actividad terapeutica de un compuesto. Por ejemplo, pueden usarse procedimientos tanto in vivo como in vitro, incluyendo por ejemplo, evaluacion clmica, ensayos de CE50 y CI50 y curvas de respuesta a dosis.

Los compuestos candidatos para su uso con un ensayo o identificados por ensayos como agentes farmacologicos utiles pueden ser agentes farmacologicos ya conocidos en la tecnica o variaciones de los mismos o pueden ser compuestos previamente desconocidos que tengan cualquier actividad farmacologica. Los compuestos candidatos pueden ser de origen natural o disenarse en el laboratorio. Los compuestos candidatos pueden comprender un diastereomero unico, mas de un diastereomero o un unico enantiomero, o mas de un enantiomero.

Los compuestos candidatos pueden aislarse, de microorganismos, animales o plantas, por ejemplo, y pueden producirse recombinantemente o sintetizarse por procedimientos qrnmicos conocidos en la tecnica. Si se desea, los

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compuestos candidates pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la tecnica, incluyendo pero no limitado a, bibliotecas biologicas, bibliotecas de fase solida o de fase en solucion paralelas espacialmente direccionables, procedimientos de bibliotecas sinteticas que requieren desconvolucion, el procedimiento de biblioteca de "una perla un compuesto" y procedimientos de bibliotecas sinteticas que usan seleccion por cromatograffa de afinidad. El enfoque de biblioteca biologica se limita a bibliotecas peptidicas. los otros cuatro enfoques son aplicables a polipeptidos, bibliotecas de oligomeros no peptfdicos o de pequenas moleculas de compuestos son enfoques preferidos. Vease Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145-167 (1997).

En una realizacion, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para identificar un compuesto candidato como un profarmaco adecuado. Un profarmaco adecuado incluye cualquier pro-farmaco que pueda identificarse por el procedimiento. Cualquier procedimiento evidente al experto puede usarse para identificar un compuesto candidato como un profarmaco adecuado.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos para detectar compuestos candidatos para la adecuabilidad como agentes terapeuticos. La deteccion de la adecuabilidad de los agentes terapeuticos puede incluir la evaluacion de uno, algunos o muchos criterios con respecto al compuesto que puede afectar la capacidad del compuesto como agente terapeutico. Los factores tales como, por ejemplo, eficiencia, seguridad, eficacia, retencion, localizacion, selectividad del tejido, degradacion o persistencia intracelular pueden considerarse. En una realizacion, se proporciona un procedimiento de deteccion de compuestos candidatos para su adecuacion como agentes terapeuticos, donde el procedimiento comprende proporcionar un compuesto candidato identificado como un profarmaco adecuado, determinar la actividad terapeutica del compuesto candidato y determinar la persistencia intracelular del compuesto candidato. La persistencia intracelular puede medirse por cualquier tecnica evidente al experto en la materia, tal como por ejemplo por trazador radiactivo, marcaje de isotopos pesados o CLEM.

Al detectar compuestos para su adecuacion como agentes terapeuticos, se evalua la persistencia intracelular del compuesto candidato. En una realizacion preferida, los agentes se evaluan para su capacidad de modular el pH intracelular pueden comprender, por ejemplo, la evaluacion del pH intracelular durante un periodo de tiempo en respuesta a un agente terapeutico candidato. En una realizacion preferida, se determina el pH intra-podocito en presencia o ausencia del compuesto terapeutico candidato en un tejido humano. Puede usarse cualquier tecnica conocida por el experto en la materia para determinar el pH intracelular en la presente invencion. Vease, tambien, los detalles experimentales en la seccion de ejemplos que sigue.

Un aspecto adicional se refiere a procedimientos para inhibir la actividad de una afeccion o enfermedad asociadas a la proteinuria que comprende la etapa de tratar una muestra o un sujeto que se creen que tiene una enfermedad o afeccion con un profarmaco identificado por un compuesto de la divulgacion. Las composiciones de la divulgacion actuan como identificadores de profarmacos que tienen actividad terapeutica contra una enfermedad o afeccion. En un aspecto preferido, las composiciones de la divulgacion actuan como identificadores para farmacos que muestran actividad terapeutica contra afecciones que incluyen por ejemplo asociadas a proteinuria.

En una realizacion, un ensayo de deteccion es un ensayo a base de celulas en el que se mide la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa contra un aumento o disminucion de los valores de pH en las celulas. La determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para modular el pH y determinar la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa, por diversos procedimientos, incluyendo por ejemplo, fluorescencia, ensayos proteicos, transferencias y similares. La celula, por ejemplo, puede ser de origen mairnfero, por ejemplo, humano.

En otra realizacion preferida, el ensayo de deteccion es un ensayo de deteccion de alto rendimiento. La capacidad de un compuesto para modular la degradacion de uPAR, la expresion, la funcion etc. y/o modular la expresion de las moleculas del receptor de uroquinasa y/o la actividad pueden evaluarse como se describe en detalle en los ejemplos que siguen.

En otra realizacion preferida, las formas solubles y/o unidas a membrana de protemas aisladas, mutantes o porciones biologicamente activas de las mismas, pueden usarse en los ensayos si se desea. Cuando se usan formas unidas a membrana de la protema, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante. Los ejemplos de agentes solubilizantes incluyen detergentes no ionicos tales como n-octilglucosido, n-dodecilglucosido, n- dodecilmaltosido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, TRITON™ X-100, TRITON™ X-114, THESIT™, Isotridecipoli(eter de etilenglicol)n, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO) o sulfonato de N-dodecil=N,N- dimetil-3-amonio-1-propano.

Los ensayos libres de celulas tambien pueden usarse e implican una mezcla de reaccion que incluye moleculas del receptor de uroquinasa y el compuesto de ensayo en condiciones y periodos de tiempo para permitir la medicion de la actividad de las moleculas del receptor de uroquinasa en el tiempo, etc., en un intervalo de valores y concentraciones de agentes de ensayo.

La actividad enzimatica tambien puede detectarse, por ejemplo, usando transferencia de energfa de fluorescencia (FET) (vease, por ejemplo, Lakowicz y col., Pat. de EE.UU. N.° 5.631.169; Stavrianopoulos, y col., Pat. de EE.UU.

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N.° 4.868.103 ). Una etiqueta de fluoroforo en la primera molecula "donadora" se selecciona de tal manera que su energfa de fluorescencia emitida se absorbera por una etiqueta fluorescente en una segunda molecula "aceptora", que a su vez es capaz de fluorescer debido a la energfa absorbida. Alternativamente, la molecula de proterna "donadora" puede utilizar simplemente la ene^a fluorescente natural de los restos de triptofano. Las etiquetas se eligen de manera que emitan diferentes longitudes de onda, de tal manera que la etiqueta de la molecula "aceptora" pueda diferenciarse de aquella de la "donadora". Ya que la eficacia de la transferencia de energfa entre las etiquetas se relaciona con la distancia que separa las moleculas, puede evaluarse la relacion espacial entre las moleculas. En una situacion en la que se da la union entre las moleculas, la emision fluorescente de la etiqueta de la molecula "aceptora" en el ensayo debe ser maxima. Un caso de union FET puede medirse adecuadamente a traves de medios de deteccion fluorometricos convencionales bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, usando un fluonmetro).

En otra realizacion, la determinacion de la capacidad de la enzima (por ejemplo moleculas del receptor de uroquinasa) a unirse o "acoplarse" a su sitio de union en una molecula diana (uPAR) puede lograrse usando Analisis de Interaccion Biomolecular (BIA) a tiempo real (vease, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo y col. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). La "resonancia de plasmon de superficie" o "BIA" detecta las interacciones bioespedficas a tiempo real, sin marcar ninguno de los que interaction (por ejemplo, BLAcore). Los cambios en la masa en la superficie de union (indicativos de un caso de union) resultan en alteraciones del rndice refractario de la luz cerca de la superficie (el fenomeno optico de la resonancia de plasmon de superficie (RPS)), dando como resultado una senal detectable que puede usarse como una indicacion de reacciones a tiempo real entre moleculas biologicas.

En una realizacion, el producto diana o la sustancia de ensayo se ancla en una fase solida. El producto diana/compuesto de ensayo anclado en la fase solida puede detectarse al final de la reaccion. Preferentemente, el producto diana puede anclarse sobre una superficie solida y el compuesto de ensayo, (que no esta anclado), puede etiquetarse, bien directa o indirectamente, con etiquetas detectables analizadas en el presente documento.

Los agentes candidatos pueden obtenerse a partir de una amplia diversidad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sinteticos o naturales. Por ejemplo, numerosos medios estan disponibles para la srntesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos organicos y biomoleculas, incluyendo la expresion de oligonucleotidos aleatorizados. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de por ejemplo extractos bacterianos, fungicos y animales estan disponibles o se producen facilmente.

Bibliotecas qumicas: Los desarrollos en la qrnmica combinatoria permiten la srntesis rapida y economica de cientos a miles de compuestos discretos. Estos compuestos se disponen tfpicamente en bibliotecas de tamanos moderados de pequenas moleculas disenadas para la deteccion eficaz. Los procedimientos combinatorios pueden usarse para generar bibliotecas sin sesgar adecuadas para la identificacion de nuevos compuestos. Ademas, pueden generarse bibliotecas mas pequenas menos diversas que descienden de un unico compuesto parental con una actividad biologica previamente determinada. En cada caso, la carencia de sistemas de deteccion eficaces para marcar como diana espedficamente las moleculas biologicas terapeuticamente relevantes producidas por qrnmica de combinacion tales como inhibidores de enzimas importantes obstaculiza el uso optimo de estos recursos.

Una biblioteca qrnmica combinatoria es una coleccion de diversos compuestos qrnmicos generados bien por srntesis qrnmica o srntesis biologica, combinando un numero de "bloques de construccion" qrnmicos, tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca qrnmica combinatoria lineal, tal como una biblioteca de polipeptidos, se forma combinando un conjunto de bloques de construccion qrnmicos (aminoacidos) en un gran numero de combinaciones y potencialmente de cualquier forma posible, para una longitud de compuesto dada (es decir, el numero de aminoacidos en un compuesto polipeptfdico). Pueden sintetizarse millones de compuestos qrnmicos a traves de tal mezcla combinatoria de bloques de construccion qrnmicos.

Una "biblioteca" puede comprender de 2 a 50.000.000 diversos compuestos miembros. Preferentemente, una biblioteca comprende al menos 48 compuestos diversos, preferentemente 96 o mas compuestos diversos, mas preferentemente 384 o mas compuestos diversos, mas preferentemente, 10.000 o mas compuestos diversos, preferentemente mas de 100.000 miembros diversos y lo mas preferentemente mas de 1.000.000 compuestos miembros diversos. Por "diverso" se entiende que mas del 50 % de los compuestos en una biblioteca tienen estructuras qrnmicas que no son identicas a ningun otro miembro de la biblioteca. Preferentemente, mas del 75 % de los compuestos en una biblioteca tienen estructuras qrnmicas que no son identicas a ningun otro miembro de la coleccion, mas preferentemente mas del 90 % y lo mas preferentemente mas de aproximadamente el 99 %.

La preparacion de bibliotecas qrnmicas combinatorias se conoce bien por aquellos expertos en la materia. Para revisiones, vease Thompson y col., Synthesis and application of small molecule libraries, Chem Rev 96:555-600, 1996; Kenan y col., Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries, Trends Biochem Sci 19:57-64, 1994; Janda, Tagged versus untagged libraries: methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91:10779-85, 1994; Lebl y col., One-bead-one-structure combinatorial libraries, Biopolymers 37:177-98, 1995; Eichler y col., Peptide, peptidomimetic, and organic synthetic combinatorial libraries, Med Res Rev. 15:481-96, 1995; Chabala, Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads, Curr Opin Biotechnol. 6:632-9, 1995; Dolle, Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial

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chemistry, Mol Divers. 2:223-36, 1997; Fauchere y col., Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries, Can J. Physiol Pharmacol. 75:683-9, 1997; Eichler y col., Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries, Mol Med Today 1: 174-80, 1995; y Kay y col., Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries, Comb Chem High Throughput Screen 4:535-43, 2001.

Pueden usarse tambien otras qmmicas para generar bibliotecas de diversidad qmmica. Tales qmmicas incluyen, pero no se limitan a, peptoides (Publicacion PCT N.° WO 91/19735); peptidos codificados (Publicacion PCT WO 93/20242); bio-oligomeros aleatorios (Publicacion PCT N.° WO 92/00091); benzodiazepinas (Pat. de EE.UU. N.° 5.288.514); diversomeros, tales como hidantomas, benzodiazepinas y dipeptidos (Hobbs, y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.uU., 90:6909-6913 (1993)); polipeptidos vimlogos (Hagihara, y col., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)); peptidomimeticos no peptfdicos con armazon de p-D-glucosa (Hirschmann, y col., J. Amer. Chem. Soc., 114:92179218 (1992)); smtesis organicas analogas de pequenas bibliotecas de compuestos (Chen, y col., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)); oligocarbamatos (Cho, y col., Science, 261:1303 (1993)); y/o peptidil fosfonatos (Campbell, y col., J. Org. Chem. 59:658 (1994)); bibliotecas de acidos nucleicos (vease, Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra); bibliotecas de acidos nucleicos peptfdicos (vease, por ejemplo, Pat. de EE.UU. N.° 5.539.083); bibliotecas de anticuerpos (vease, por ejemplo, Vaughn, y col., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287); bibliotecas de carbohidratos (vease, por ejemplo, Liang, y col., Science, 274:1520-1522 (1996) y Pat. de EE.UU. N.° 5.593.853); bibliotecas de moleculas organicas pequenas (vease, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&E News, 18 de enero, pagina 33 (1993); isoprenoides (Pat. de EE.UU. N.° 5.569.588); tiazolidinonas y metatiazanonas (Pat. de EE.UU. N.° 5.549.974); pirrolidinas (Pat. de EE.UU. N.° 5.525.735 y 5.519.134); compuestos morfolino (Pat. de EE.UU. N.° 5.506.337); benzodiazepinas (Pat. de EE.UU. N.° 5.288.514); y similares.

Los dispositivos para la preparacion de bibliotecas combinatorias estan disponibles en el mercado (vease, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem. Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Ademas, numerosas bibliotecas combinatorias estan en sf mismas disponibles en el mercado (vease, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscu, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscu, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Bio sciences, Columbia, Md., etc.).

Moleculas Pequenas: Los compuestos de ensayo de moleculas pequenas pueden ser inicialmente miembros de una biblioteca qmmica organica o inorganica. Como se usa en el presente documento, "moleculas pequenas" se refiere a pequenas moleculas organicas o inorganicas de peso molecular por debajo de aproximadamente 3.000 Daltons. Las moleculas pequenas pueden ser productos naturales o miembros de una biblioteca qmmica combinatoria. Debe usarse un conjunto de moleculas diversas para cubrir una diversidad de funciones tales como carga, aromaticidad, enlaces de hidrogeno, flexibilidad, tamano, longitud de cadena lateral, hidrofobicidad y rigidez. Las tecnicas combinatorias adecuadas para sintetizar pequenas moleculas se conocen en la tecnica, por ejemplo, como se ejemplifica por Obrecht y Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular- Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998), e incluyen todas aquellas tales como las tecnicas de "dividir y poner en conjunto" o smtesis "paralela", tecnicas de fase solida y fase en solucion y tecnicas codificantes (vease, por ejemplo, Czarnik, Curr. Opin. Chem. Bio., 1:60 (1997). Ademas, un numero de bibliotecas de moleculas pequenas esta disponible en el mercado.

El procedimiento entero puede estar completamente automatizado. Por ejemplo, el muestreo de los materiales de muestra puede lograrse con una pluralidad de etapas, que incluyen extraer una muestra de un envase sencillo y transportar al menos una porcion de la muestra extrafda a la plataforma de prueba. El muestreo tambien puede incluir etapas adicionales, en particular y preferentemente, etapas de preparacion de la muestra. En un enfoque, solamente una muestra se extrae en la sonda auto-muestreadora en un momento y solamente una muestra reside en la sonda en un momento. En otras realizaciones, pueden meterse multiples muestras en la sonda auto- muestreadora separadas por disolventes. Aun en otras realizaciones, pueden usarse multiples sondas en paralelo para el auto-muestreo.

En el caso general, el muestreo puede efectuarse manualmente, de forma semi-automatica o de forma automatica. Una muestra puede extraerse de un envase de muestras manualmente, por ejemplo, con una pipeta o una sonda manual tipo jeringa y despues se transporta manualmente a un puerto de carga o un puerto de inyeccion de un sistema de caracterizacion. En un protocolo semi-automatico, algun aspecto del protocolo se efectua automaticamente (por ejemplo, transporte), pero algunos otros aspectos requieren la intervencion manual (por ejemplo, la extraccion de las muestras de una lmea de control del procedimiento). Preferentemente, sin embargo, la muestra o muestras se extraen de un envase de muestras y se transportan al sistema de caracterizacion, de forma completamente automatizada - por ejemplo, con un auto-muestreador.

En una realizacion, el auto-muestreo puede realizarse usando un microprocesador que controla un sistema automatizado (por ejemplo, un brazo de robot). Preferentemente, el microprocesador es programable por el usuario para acomodar bibliotecas de muestras que tienen disposiciones variables de muestras (por ejemplo, matrices cuadradas con "n-filas" por "n-columnas", matrices rectangulares con "n-filas" por "m-columnas", matrices redondas, matrices triangulares con lados equilateros "r" por "r" por "r", matrices triangulares con lados isosceles "r" por "s" por "s", etc., donde n, m, r y s son numeros enteros).

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El muestreo automatizado de los materiales de muestra puede efectuarse opcionalmente con un auto-muestreador que tiene una sonda de inyeccion calentada (punta). Un ejemplo de un auto-muestreador tal se desvela en la Pat. de EE.UU. N.° 6.175.409 B1.

De acuerdo con la presente divulgacion, uno o mas sistemas, procedimientos o ambos se usan para identificar una pluralidad de materiales de muestra. Aunque son posibles sistemas y procedimientos manuales o semiautomatizados, se emplea preferentemente un sistema o procedimiento automatizado. Esta disponible una diversidad de sistemas roboticos o automaticos para proporcionar mociones predeterminadas automatica o programable para el manejo, poner en contacto, dispensar o manipular de otra manera los materiales en forma solida, fluida ifquida o gaseosa de acuerdo con un protocolo predeterminado. Tales sistemas pueden adaptarse o aumentarse para incluir una diversidad de hardware, software o ambos para ayudar a los sistemas en la determinacion de las propiedades mecanicas de los materiales. El hardware y el software para aumentar los sistemas roboticos puede incluir, pero no se limitan a, sensores, transductores, hardware de adquisicion y manipulacion de datos, software de adquisicion y manipulacion de datos y similares. Los sistemas roboticos ejemplares estan disponibles en el mercado de CAVRO Scientific Instruments (por ejemplo, N.° de Modelo RSP9652) o BioDot (Microdrop Modelo 3000).

Generalmente, el sistema automatizado incluye un diseno de protocolo adecuado y un software de ejecucion que puede programarse con informacion tal como smtesis, composicion, informacion de localizacion u otra informacion con respecto a una biblioteca de materiales posicionada con respecto a un sustrato. El diseno de protocolo y el software de ejecucion esta tfpicamente en comunicacion con el software de control del robot para controlar un robot u otro aparato o sistema automatizado. El diseno de protocolo y el software de ejecucion esta tambien en comunicacion con el hardware/software para recoger datos de hardware de medicion de respuesta. Una vez que los datos se recogen en la base de datos, el software analftico puede usarse para analizar los datos y mas espedficamente, para determinar las propiedades de los farmacos candidatos, o los datos pueden analizarse manualmente.

Datos y analisis: La practica de la presente invencion puede emplear tambien procedimientos de biologfa convencionales, software y sistemas. Los productos de software de ordenador incluyen tfpicamente medios legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables en el ordenador para realizar las etapas logicas del procedimiento. Los medios legibles por ordenador adecuados incluyen disquetes, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, unidad de disco duro, memoria flash, ROM/RAM, cintas magneticas y etc. Las instrucciones ejecutables por ordenador pueden escribirse en un lenguaje de ordenador adecuado o una combinacion de varias lenguas. Los procedimientos de biologfa computacional basicos se describen en, por ejemplo Setubal y Meidanis y col., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi y Buehler, Bio-informatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) y Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2a ed., 2001). Vease Pat. de EE.UU. N.° 6.420.108.

La presente invencion puede hacer uso tambien de diversos productos de programas de ordenador y software para una diversidad de fines, tales como diseno de sondas, gestion de datos, analisis y funcionamiento de instrumentos. Veanse, las Pat. de EE.UU. N.° 5.593.839, 5.795.716, 5.733.729, 5.974.164, 6.066.454, 6.090.555, 6.185.561, 6.188.783, 6.223.127, 6.229.911 y 6.308.170.

Adicionalmente, la presente divulgacion se refiere a realizaciones que incluyen procedimientos para proporcionar informacion genetica sobre las redes tales como Internet.

Administracion de composiciones a pacientes

Las composiciones o los agentes identificados por los procedimientos descritos en el presente documento pueden administrarse a animales incluyendo seres humanos en cualquier formulacion adecuada. Por ejemplo, las composiciones para modular la degradacion proteica pueden formularse en vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables tales como un suero salino fisiologico o una solucion salina tamponada. Los vehfculos y diluyentes adecuados pueden seleccionarse a base del modo y la via de administracion y la practica farmaceutica convencional. Una descripcion de vehfculos y diluyentes farmaceuticamente aceptables ejemplares, asf como formulaciones farmaceuticas, puede encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto normativo en este campo, y en USP/NF. Pueden anadirse otras sustancias a las composiciones para estabilizar y/o conservar las composiciones.

Las composiciones para el uso de la invencion pueden administrarse a animales por cualquier tecnica convencional. Las composiciones pueden administrarse directamente a un sitio diana mediante, por ejemplo, transporte quirurgico a un sitio diana interno o externo, o por cateter a un sitio accesible por un vaso sangumeo. Otros procedimientos de transporte, por ejemplo, transporte liposomico o difusion desde un dispositivo impregnado con la composicion, se conocen en la tecnica. Las composiciones pueden administrarse en un unico bolo, inyecciones multiples o por infusion continua (por ejemplo, intravenosamente). Para administracion parenteral, las composiciones se formulan preferentemente en una forma libre de pirogenos esterilizada.

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Los compuestos pueden administrate con una o mas terapias. Los agentes quimioterapeuticos pueden administrate en un regimen metronomico. Como se usa en el presente documento, terapia "metronomica" se refiere a la administracion de dosis bajas continuas de un agente terapeutico.

La dosificacion, la toxicidad y la eficiencia terapeutica de tales compuestos pueden determinate por procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentacion, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal al 50 % de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50 % de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos toxicos y los efectos terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la relacion DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que exhiben indices terapeuticos altos. Aunque pueden usarse compuestos que exhiben efectos secundarios toxicos, debe llevarse cuidado disenando un sistema de transporte que marque como diana tales compuestos al sitio o el tejido afectado para minimizar el dano potencial a celulas no infectadas y, de esta manera, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse en la formulacion de un intervalo de dosificacion para su uso en humanos. La dosificacion de tales compuestos cae preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o sin toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invencion, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentracion en plasma circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentracion del compuesto de ensayo que logra una inhibicion semi-maxima de los smtomas) como se determina en el cultivo celular. Tal informacion puede usarse para determinar mas precisamente las dosis utiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatograffa lfquida de alto rendimiento.

Como se define en el presente documento, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto (es decir, una dosificacion eficaz) significa una cantidad suficiente para producir un resultado terapeuticamente (por ejemplo, clmicamente) deseable. Las composiciones pueden administrarse una de una o mas veces al dfa a una o mas veces a la semana; incluyendo un dfa sf un dfa no. El experto en la materia apreciara que ciertos factores pueden influir en la dosificacion y el tiempo requerido para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero no limitado a la gravedad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de los compuestos puede incluir un unico tratamiento o una serie de tratamientos.

Formulacion

Donde sea posible que una composicion se administre sola, es preferible presentarla como una formulacion farmaceutica. El principio activo puede comprender, para administracion topica, del 0,001 % al 10 % p/p, por ejemplo, del 1 % al 2 % en peso de la formulacion, aunque puede comprender como mucho un 10 % p/p pero preferentemente no en exceso del 5 % p/p y mas preferentemente del 0,1 % al 1 % p/p de la formulacion. Las formulaciones topicas de la presente invencion, comprenden un principio activo junto con uno o mas vehfculo o vehfculos aceptables para los mismos y opcionalmente cualquier otro principio o principios terapeuticos. El vehfculo o vehfculos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demas ingredientes de la formulacion y no deletereos al receptor de los mismos.

Las formulaciones adecuadas para la administracion topica incluyen preparaciones lfquidas o semi-lfquidas adecuadas para penetrar a traves de la piel al sitio donde el tratamiento se requiere, tales como linimentos, lociones, cremas, pomadas o pastas y gotas adecuadas para la administracion al ojo, el ofdo o la nariz. Las gotas de acuerdo con la presente invencion pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleaginosas esteriles y pueden prepararse disolviendo el principio activo en una solucion acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado e incluyendo preferentemente un agente de superficie activa. La solucion resultante puede clarificarse y esterilizarse despues por filtracion y transferirse al recipiente por una tecnica aseptica. Los ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para la inclusion en las gotas son nitrato o acetato fenilmercurico (0,002 %), cloruro de benzalconio (0,01 %) y acetato de clorhexidina (0,01 %). Los disolventes adecuados para la preparacion de una solucion oleaginosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

Las lociones de acuerdo con la presente invencion incluyen aquellas adecuadas para la aplicacion a la piel o al ojo. Una locion ocular puede comprender una solucion acuosa esteril que contiene opcionalmente un bactericida y puede prepararse por procedimientos similares a aquellos para la preparacion de gotas. Las lociones o los linimentos para la aplicacion a la piel pueden incluir tambien una gente para acelerar el secado y enfriar la piel, tales como un alcohol o una acetona y/o un humectador tal como glicerol o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de araquis.

Las cremas, las pomadas o las pastas de acuerdo con la presente invencion son formulaciones semi-solidas del principio activo para aplicacion externa. Pueden fabricarse mezclando el principio activo en forma finamente dividida o en polvo, solo o en solucion o suspension en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de una maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o lfquida, glicerol, cera de abeja, un jabon metalico; un mudlago; un aceite de origen natural tal como almendra, mafz, araquis, aceite de ricino o de oliva; grasa de lana o sus derivados, o un acido graso tal como acido

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estearico u oleico, junto con un alcohol tal como propilenglicol o macrogeles. La formulacion puede incorporar cualquier agente tensioactivo tal como un tensioactivo anionico, cationico o no ionico tal como esteres de sorbitan o derivados de polioxietileno de los mismos. Pueden incluirse tambien agentes de suspension tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorganicos tales como sflices silicaceas y otros ingredientes tales como lanolina.

Las realizaciones de las composiciones y los procedimientos de la invencion se ilustran en los siguientes ejemplos. Ejemplos

Los siguientes Ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion.

Ejemplo 1: uPAR soluble es un factor de recurrencia de la enfermedad glomerular

Materiales y procedimientos:

Anticuerpos: Anticuerpo integrina p3 activo (AP5), (GTI); uPAR (FL-290) (Santa Cruz Biotechnology); anticuerpo monoclonal de raton de sinaptopodina (G1), sinaptopodina de conejo policlonal (NT); kit de inmunoensayo uPAR humano Quantikina (R&D Systems); protema suPAR.

Animales y tratamientos: Todos los estudios animales se aprobaron por el Subcommittee on Research Animal Care of the Massachusetts General Hospital, numero de protocolo: 2004N000289/2. Los ratones PlaurA se obtuvieron de la Universidad de Leuven, Belgica; los ratones 57BL/6 se obtuvieron del Jackson Laboratory. Los modelos de raton LPS se utilizaron como se ha descrito previamente (Reiser, J. y col., J. Clin Invest. 113, 1390-7 (2004). El transporte de protema suPAR in vivo se realizo con ratones hembra PlaurA (n = 6) a traves de la vena de la cola a 1 mg/kg de peso corporal. Los controles (n = 6) recibieron la misma cantidad de BSA. La orina se recogio antes y 8 h, 24 h despues de la inyeccion de suPAR o BSA. La concentracion de protema en la orina se determino por ensayo Bradford (Sigma).

Trasplante cruzado de rinon derecho: Seis ratones hembra 57BL/6 y 6 ratones hembra PlaurA de los mismos intervalos de edad y peso corporal (7-8 semanas, 15-18 g) se reclutaron aleatoriamente en este estudio. El rinon derecho de ratones Plaur se trasplanto en ratones 57BL/6 en el lado derecho y viceversa. El trasplante de rinon se realizo como se ha descrito previamente (Coffman, T. y col., J. Immunol. 151.425-435 (1993); Han, W.R., Murray- Segal, L.J. y Mottram, P.L. Microsurgery. 19, 272-274 (1999)). Despues de recuperarse de la cirugfa, los ratones se trataron aleatoriamente con LPS a 10 mg/kg de peso corporal, i.p. o la misma cantidad de PBS para el control. 24 h despues de la inyeccion, los ratones se sacrificaron y el rinon se saco para analisis adicionales.

Pacientes: Los pacientes recurrentes y no recurrentes de GEFS fueron del Centro de Trasplantes de Rinon en el Hospital General de Massachusetts y del Hospital Jackson Memorial. Se obtuvo el informe del consentimiento de los padres antes de reclutar y este estudio se aprobo por el Institutional Review Board respectivo.

Determinacion de suPAR en suero: La concentracion de suPAR en suero se midio por el kit de inmunoensayo de uPAR humano Quantikina siguiendo el protocolo del fabricante.

Inmunocitoqumica: Los podocitos se cultivaron como se ha informado previamente (Sever, S. y col. J Clin. Invent. 117,2095-2104 (2007)). Despues del tratamiento, los podocitos completamente diferenciados se fijaron e inmunomarcaron como se describe.

Microscopio electronico de transmision (MET): El MET se realizo de acuerdo con los protocolos convencionales (Sever, S. y col., J Clin. Invest. 117, 2095-2104 (2007)).

Analisis estad^stico: Los analisis estadfsticos se realizaron usando un ensayo de la t de Student pareado o no pareado. La hipotesis nula se rechazo al nivel de 0,05. Los valores se presentan como Media ± SD.

Resultados:

Se investigo el papel de la forma soluble de uPAR en la enfermedad renal proteinurica. Primero se examinaron los efectos de la protema suPAR purificada en podocitos cultivados. Los podocitos de raton completamente diferenciados se trataron con suPAR humano durante 24 h a 1-5 pg/ml y se tineron las celulas con AP5, un anticuerpo probado para la integrina avp3 activa. En contraste con las celulas control tratadas con PBS, que teman tincion de AP5 despreciable, las celulas tratadas con protema suPAR humana teman una fuerte tincion de AP5 en la membrana, particularmente en el borde delantero (Figura 1A) indicando que la protema suPAR activa la integrina ayp3, similar a uPAR anclado a membrana.

A continuacion se examino el efecto de la protema suPAR en el desarrollo de proteinuria. La protema suPAR se transporto a ratones PlaurA a traves de la vena de la cola a 1 mg/kg de peso corporal. La orina se recogio antes de la inyeccion de suPAR (0 h), 8 h y 24 h despues de la inyeccion y se midio la protema total por el ensayo de Bradford. Como se ve en la Figura 1B, se observo un nivel aumentado de protema en orina 8 h despues de la inyeccion de suPAR y en las 24 h despues del transporte de protema suPAR, los ratones desarrollaron marcada

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proteinuria. Por el contrario, los ratones control quienes recibieron la misma cantidad de albumina de suero bobina (BSA) no desarrollaron ninguna proteinuria (Figura 1B). Para ver si se deposito algo de suPAR en el rinon, los ratones Plaur/- se sacrificaron y el rinon se saco para crioseccion y se procesaron a inmunohistoqmmica. Se encontro una expresion extensa de uPAR en los rinones tratados con transporte de protema suPAR. La doble inmunotincion con sinaptopodina, un marcador de podocitos ampliamente usado, mostro que suPAR se localizo principalmente en los podocitos (Figura 1E). No hubo expresion de uPAR o deposito en los rinones control tratados con BSA (Figura 1E). Estos resultados evidencian que el transporte de la protema suPAR podna depositarse en los podocitos y mas importante podnan inducir la proteinuria en ratones Plaur/-. Tambien se examino la actividad de la integrina avp3 en podocitos de ratones 32837 a los que se habfa transportado protema suPAR por doble inmunotincion con AP5 y anticuerpos de sinaptopodina y se descubrio que aumento significativamente, en comparacion con el control tratado con BSA, donde solo se observo integrina avp3 activa minima en el rinon e incluso menos en los podocitos (Figura 1D). Este descubrimiento es coherente con el trabajo in vitro anterior, evidenciando que suPAR, como su forma de membrana, activa la integrina avp3 y despues la GT-Pasa pequena, Rac, posiblemente a traves de una ruta que implica DOC180.

Para confirmar ademas el papel de suPAR en el desarrollo de proteinuria y la enfermedad renal, se realizo un trasplante cruzado y se examino el efecto de la forma soluble endogena de uPAR. El rinon derecho se escindio de ratones 57BL/6 normales y se trasplanto en Plaur/- en el lado derecho y viceversa (Figura 3A). Los ratones se eligieron aleatoriamente para recibir lipopolisacarido (LPS) para inducir proteinuria o PBS para el control despues de recuperarse de la cirugfa. Para los ratones 57BL/6 tratados con LPS, se encontro barrido de proceso de pies significativo en el rinon nativo de 57BL/6 (Figura 1E) y mas interesantemente, se observo un barrido de proceso de pies masivo cuando se observo en el rinon Plaur/- trasplantado igualmente (Figura 1E). Para los ratones 57BL/6 tratados con PBS sin embargo, no fue remarcable el barrido de proceso de pies bien en rinon trasplantado Plaur/- o rinon nativo 57BL/6 (Figura 1E). Para los ratones Plaur/- tratados con LPS, el barrido de proceso de pies se observo facilmente en el rinon 57BL/6 trasplantado pero no en el rinon Plaur/- nativo (Figura 1F). Por el contrario, no fue remarcable el barrido de proceso de pies bien en rinon nativo Plaur/- o rinon Trasplantado 57BL/6 de ratones control PBS (Figura 1F). Estos datos puestos juntos evidencian que el barrido de proceso de pies observado en el rinon trasplantado Plaur/- en los ratones 57BL/6 tratados con LPS no se debio al efecto mismo de la cirugfa, ni se debio al efecto directo del LPS, sino a algunos factores extra-renales circulantes. Para determinar si suPAR es responsable de los fenomenos, las secciones se inmunotineron tanto de rinon nativo como trasplantado con anticuerpo uPAR. Se descubrio una expresion de uPAR minima en podocitos de rinon 57BL/6 tratado con PBS pero no en aquellos de rinon Plaur/- tratado con PBS. Con ratones 57BL/6 tratados con LPS, se observo expresion de uPAR aumentada en podocitos en el rinon 57BL/6 nativo y de forma interesante, tambien se observo la clara expresion de uPAR o el deposito en los podocitos de rmonP/aur/- trasplantado (Figura 3B). Con ratones Plaur/- tratados con LPS, se encontro una expresion aumentada de uPAR en el rinon 57BL/6 trasplantado, pero ningun uPAR en podocitos de rinon Plaur/- nativo (Figura 3E). Combinado con el analisis de microscopio electronico, estos resultados indican que ademas de uPAR unido a membrana, el LPS tambien podna inducir la generacion de suPAR, que despues va al rinon, se deposita en los podocitos y mas importante induce el borrado del proceso de pies.

Las ultimas decadas atestiguaron mucho progreso en la biologfa de los podocitos, sin embargo, la patogenia exacta que subyace a la mayona de enfermedades renales proteinuricas era hasta este momento, lejos de estar clara. Esto es cierto con la glomeruloesclerosis segmental focal (GEFS). Aunque las mutaciones a ciertas moleculas que incluyen podocina, nefrina, a-actinina 4, TRPC6 se han reivindicado ser responsables de algunas formas familiares de GEFS, se conocfa poco acerca de la patogenia de la forma de GEFS adquirida. La GEFS frecuentemente da lugar a un fallo renal de fase final y recurriendo significativamente en un 30-60 % de los rinones trasplantados. Se encontro en el presente documento, que suPAR podna inducir el borrado de procesos de pies y proteinuria en ratones 57BL/6 y Plaur/-. Esto dio lugar al siguiente conjunto de experimentos para evaluar suPAR en pacientes de GEFS. El nivel de suero de suPAR de GEFS se midio en pacientes antes de trasplante y se descubrio que los pacientes recurrentes de GEFS (n = 14, 5469 ±1837 pg/ml) tuvieron un nivel significativo mayor de suPAR que aquellos pacientes no recurrentes (n = 4, 3586 ± 976 pg/ml, P < 0,022 frente a recurrente), y que aquellos sujetos normales (n = 8, 1673 ± 395 pg/ml, P < 0,001 frente a recurrente) (Figura 2A), evidenciando que suPAR es un factor causante en GEFS recurrente. Para explorar adicionalmente el efecto de los sueros de GEFs ricos en suPAR, los sueros se incubaron con podocitos cultivados y se descubrio que los sueros de GEFS de pacientes recurrentes pero no los sueros de sujetos normales, activaron la integrina avp3 (Figura 2B), un descubrimiento observado con suPAR purificado (Figura 1A).

Sumario: suPAR podna inducir el borrado de procesos de pies y proteinuria en ratones 57BL/6 o Plaur-/-, a traves de la activacion de la ruta de la integrina avp3. El nivel de suPAR es mucho mayor en GEFS recurrente, en comparacion con GEFS no recurrente y sujetos normales. Como con la protema suPAR purificada, los sueros de GEFS ricos en suPAR podnan activar la integrina avp3. Considerando la pequena masa molecular de suPAR, estos descubrimientos evidencian que suPAR es un factor recurrente de GEFS. Ya que es posible retirar o bloquear uPAR, garantiza una estrategia prometedora para potenciar la supervivencia del trasplante.

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion para su uso en el tratamiento de proteinuria en una enfermedad o trastorno renal caracterizado por proteinuria, comprendiendo la composicion un agente que inhibe la expresion o la actividad del receptor de uroquinasa soluble (suPAR).
2. 2. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente comprende un oligonucleotido antisentido, un polipeptido o una molecula pequena.
3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente es un polipeptido del receptor de uroquinasa (uPAR) mutante que bloquea la expresion o la actividad de suPAR.
4. 4. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el agente es un anticuerpo espedfico de suPAR.
5. 5. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, composicion que es una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo.
6. 6. Un procedimiento de identificacion de un agente para la actividad en el tratamiento de proteinuria en una enfermedad o trastorno renal caracterizado por proteinuria, que comprende:

   cultivar una celula de rinon o una lmea celular de rinon;

   poner en contacto dicha celula de rinon o lmea celular de rinon con uno o mas agentes; y medir la expresion o actividad de suPAR;

   en el que una reduccion en la expresion o actividad de suPAR indica que el agente tendra actividad en el tratamiento de proteinuria en una enfermedad o trastorno renal caracterizados por proteinuria.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que la expresion o actividad de suPAR se inhibe al menos en un 10 % en comparacion con un control normal.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que la expresion o actividad de suPAR se inhibe al menos en un 50 % en comparacion con un control normal.
9. 9. Un procedimiento de diagnostico de un paciente que tiene o esta en riesgo de desarrollar proteinuria, en el que el procedimiento comprende detectar un biomarcador sangumeo en una muestra de sangre retirada del paciente, comprendiendo el biomarcador sangumeo un polipeptido de suPAR.
10. 10. Un ensayo para medir los niveles de receptor de uroquinasa soluble (suPAR) en una muestra de sangre de un paciente que tiene proteinuria, que comprende:

    poner en contacto una muestra de sangre del paciente con un anticuerpo anti-suPAR marcado detectablemente y medir el receptor de uroquinasa soluble (suPAR) en la muestra de sangre.
11. 11. Un procedimiento de diagnostico de un paciente que tiene o esta en riesgo de desarrollar proteinuria, que comprende:

    detectar suPAR en una muestra de sangre retirada del paciente,

    correlacionar las cantidades de suPAR en la muestra del paciente con proteinuria y diagnosticar al paciente que tiene o esta en riesgo de desarrollar proteinuria.
12. 12. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que la enfermedad o trastorno renal caracterizado por proteinuria es: enfermedades o trastornos de los podocitos, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis segmental focal, enfermedad de cambio mmimo, smdromes nefroticos, preeclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colageno, estres, ejercicio agotador, proteinuria ortostatica (postural) benigna, glomeruloesclerosis segmental focal (GEFS), nefropatfa de IgA, nefropatfa de IgM, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatfa membranosa, sarcoidosis, smdrome de Alport, diabetes mellitus, dano renal debido a farmacos, enfermedad de Fabry, infecciones, aminoaciduria, smdrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensiva, nefritis intersticial, enfermedad de celulas falciformes, hemoglobinuria, mieloma multiple, mioglobinuria, nefropatfa diabetica (ND), nefritis por lupus, Granulomatosis de Wegener o Enfermedad de Almacenamiento de Glucogeno Tipo 1.