ES2642056T3 - Procedimiento y kit para establecer in vitro un pronóstico de gravedad en un paciente con choque séptico - Google Patents

Description

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conservación de las muestras. Más precisamente, en este protocolo, los ARN totales se han extraído con la ayuda de los kits PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytix) respetando las recomendaciones del fabricante.

La calidad de los ARN totales extraídos se analizó por el bio analizador AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) con la ayuda del sistema Lab-on-chip RNA 6000 Nano Assay (Agilent). Los ARN totales comprenden los ARN de transferencia, los ARN mensajeros (ARNm) y los ARN ribosomales.

2.2 Estudio de descubrimiento:

Para el estudio de descubrimiento, la reacción de transcripción inversa de los ARNm se realiza según el protocolo de Affymetrix a partir de 50 ng de ARN total. Se ha utilizado un cebador oligonucleotídico para dirigir todos los ARN durante la transcripción inversa. El conjunto de las etapas se ha realizado con el kit WTO NuGen y se han hibridado sobre unos chips de ADN. La hibridación del ARNc se realiza con los biochips GeneChipHuman Genome U133 Plus 2 antes de la etapa de amplificación de la señal por la incubación con la mezcla SAPE que contiene la estreptavidina ficoeritrina, y después los anticuerpos IgG de cabra anti estreptavidina mezclados con el anticuerpo biotinilado anti IgG de cabra. Esta última etapa utiliza la plataforma Fluidic FS450. El análisis de los datos Affymetrix empieza por la captura de la imagen del biochip por el escáner GeneChip 3000 de Affymetrix. Los datos se normalizan después por RMA (Robust Multile-Array Average). Todos los datos basados en la intensidad de la señal se utilizan después de la normalización. Las diferencias de niveles de expresión en ARNm entre los pacientes fallecidos en los 28 primeros días (pacientes no sobrevivientes) y los pacientes sobrevivientes, se determinan mediante el método SAM (Tusher, Tibshirani, and Chu, 2001).

Entre los genes diferencialmente expresados entre los pacientes sobrevivientes, no sobrevivientes y los controles sanos, se constata una sobreexpresión de LILRB2 en los pacientes sobrevivientes comparada con el nivel de expresión obtenido al mismo tiempo en los controles sanos y en los no sobrevivientes, cuyos niveles de expresión son comparables. Estos resultados se presentan en la figura 1 anexa con 2 conjuntos de sondas Affymetrix independientes, respectivamente identificados en 207697_x_at y 210146_x_at, lo que confirma la fortaleza y la fiabilidad de los resultados. En la figura 1, respectivamente figura 1A y figura 1B, los datos se presentan en intensidad de fluorescencia para los 2 conjuntos de sondas Affymetrix 207697_x_at y 210146_x_at, respectivamente, para los 3 grupos de pacientes: voluntarios sanos (véase la tabla 2), pacientes no sobrevivientes y sobrevivientes (véase la tabla 1).

La intensidad de fluorescencia de los conjuntos de sondas 207697_x_at y 210146_x_at se ha comparado para los pacientes sobrevivientes y no sobrevivientes. Los resultados se presentan a continuación.

Conjunto de sondas

SFC AUC Valor de p

207697_x_at

1,53 0,84 0,0002

210146_x_at

1,19 0,78 0,0012

SFC: Standard Fold Change AUC: Area Under Curve Valor de p: según el ensayo de Mann Whitney

Después, se ha correlacionado la intensidad de fluorescencia para los 2 conjuntos de sondas Affymetrix. Los resultados se presentan en la figura 2.

Correlación r del coeficiente de Spearman

0, 68

Intervalo de confianza 95%

0,565 a 0,762

Significatividad del valor P del ensayo de Spearman

< 0,0001

Como se destaca de la figura 2, se constata una muy buena correlación para los 2 conjuntos de sondas Affymetrix.

Entre los genes diferencialmente expresados entre los pacientes sobrevivientes, no sobrevivientes y los controles sanos, se constata también una sobreexpresión de LILRB1 en los pacientes sobrevivientes comparada con el nivel de expresión obtenido al mismo tiempo en los controles sanos y en los no sobrevivientes. Estos resultados se presentan en la figura 3 anexa con 1 conjunto de sondas Affymetrix independiente, respectivamente identificada en 207697_x_at y 211336_x_at para los 3 grupos de pacientes: voluntarios sanos, pacientes no sobrevivientes y sobrevivientes. Los resultados se dan en intensidad de fluorescencia.

Después, se ha correlacionado la intensidad de fluorescencia entre los 2 conjuntos de sondas Affymetrix de los genes LILRB1 (211336_x_at) y LILRB2 (207697_x_at). Los resultados se presentan en la figura 4. Se observa una correlación significativa (0,86[0,81-0,90]) entre los resultados de expresión de los dos genes LILRB2 y LILRB1.

2.3 Validación técnica (transferencia de plataforma):

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A fin de confirmar los resultados con la ayuda de otra técnica de biología molecular, se ha medido la expresión de ARN de LILRB2 por RT-PCR cuantitativa sobre la misma cohorte.

Brevemente, se ha realizado una reacción de transcripción inversa (RT) a partir de 200 ng de ARN total en un volumen final de 20 l, con la ayuda de los kits SuperScript VILOTM system (Invitrogen, Carlsbad, Ca, USA) respetando las recomendaciones del fabricante. Cada solución de ADNc se ha diluido al 1/10 de agua DEPC. Se ha preparado un estándar para el gen de interés (LILRB2) y el gen de referencia (HPRT1) mediante una amplifiación PCR (reacción en cadena de polimerasa) llevada a cabo hasta saturación. Los amplicones obtenidos se purificaron después (kit PCR de purificación, Qiagen Ltd) y se verificó la presencia de un amplicón único mediante electroforesis capilar con la ayuda del bioanalizador AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) y del sistema Lab-on-chip DNA Assay (Agilent).

Se ha utilizado el LightCyclerTM 480 (Roche), y se han efectuado las reacciones PCR con la ayuda del kit LightCycler 480 Probes Master (Roche Molecular Biochemicals). Se ha efectuado cada PCR en un volumen final de 20 l que contiene 10 l de LightCycler 480 Probes Master, 2x conc, 2 l de cebadores-sonda MIX, 10x conc que contiene los cebadores sentido y antisentido (0,5 M de concentración final) así como la sonda Taqman (0,1 M de concentración final), y 8 l de solución de ADNc diluida a la 20ª. Después de una etapa de desnaturalización de 10 minutos a 95ºC, la amplificación se ha efectuado con la ayuda de 40 ciclos de un protocolo de "touch-down" PCR (10 segundos a 95ºC, 29 segundos de hibridación a 68-58ºC, seguido de una extensión de 11 segundos a 72ºC). Al final de cada ciclo, se ha medido la fluorescencia liberada por la sonda de hidrólisis Taqman.

Las combinaciones de cebadores necesarias para la cuantificación del gen de referencia HPRT1 y del gen de interés LILRB2 se describen a continuación. Para HPRT1, el nº de acceso Genbank es NM_000194.2 y la región amplificada es 630-788. Para LILRB2, variante 1, el nº de acceso Genbank es NM_005874.3 y la región amplificada es 2006-2182 y para la variante 2, el número de acceso Genebank es NM_001080978.2 y la región amplificada es 1791-1879.

LILRB2:

Cebador sentido 5'-->3'

CCAGAGCCCACAGACAGAGG (SEC ID Nº 1)

Cebador antisentido 5'-->3'

TGTCCTTCACGGCAGCATAGA (SEC ID Nº 2)

Sonda TaqMan

GACTCCACACTCAGTAGAAG (SEC ID Nº 3)

HPRT1: amplicón 158pb

Cebador sentido 5'-->3'

CCAAAGATGGTCAAGGTCGC (SEC ID Nº 4)

Cebador antisentido 5'-->3'

GACACAAACATGATTCAAATCC (SEC ID Nº 5)

Sonda TaqMan

CAAGTTTGTTGTAGGATATGCCC (SEC ID Nº 6)

La cantidad de ARNm diana LILRB2 relativa a la cantidad de ARNm del gen de referencia HPRT1 se ha analizado mediante la técnica de cuantificación relativa con el LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). La “Second Derivative Maximum Method” del programa LightCyclerTM (Roche) se ha utilizado para determinar automáticamente el Crossing Point (Cp) para cada muestra. El valor de Cp se ha definido como el número de ciclos para el cual la fluorescencia era significativamente diferente del ruido de fondo.

Se han realizado cinco diluciones en series a 1/10 por cuadruplicado con cada estándar a fin de generar una curva de calibración que expresa el Cp en función del logaritmo del número de copias. Las diluciones del estándar se han optimizado a fin de que la curva de calibración cubra el nivel de expresión esperado para el gen diana y el gen de referencia. Las curas estándar relativas que describen la eficacia de PCR para el gen diana y el gen de referencia se han generado y utilizado para realizar una cuantificación relativa denominada CRNQ (calibrated normalized relative quantities) descrita por Jan Hellemans et al. (qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biology 2007).

La figura 5 anexa muestra la correlación entre la intensidad de fluorescencia del conjunto de sondas (207697_x_at) obtenida con la plataforma Affymetrix y las mediciones CNRQ obtenidas en RT-qPCR sobre la cohorte de descubrimiento para el gen LILRB2. Los resultados muestran una correlación significativa (0,81[0,72-0,86]) entre los resultados Affymetrix y los de RT-PCR cuantitativa, confirmando la pertinencia del gen.

Correlación r del coeficiente Spearman

0,8075

Intervalo de confianza 95%

0,7254 a 0,8670

Significatividad del valor p del ensayo Spearman

< 0,0001

2.4 Validación biológica:

A fin de validar la asociación entre la expresión de LILRB2 y la predicción de supervivencia en los pacientes con choque séptico, se ha medido la expresión de los ARNm de LILRB2 mediante RT-PCR cuantitativa sobre una cohorte de validación (que incluye 262 pacientes en choque séptico, con 172 sobrevivientes y 90 no sobrevivientes

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Claims (1)

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