ES2642054T3

ES2642054T3 - Síntesis en un solo reactor de derivados tetrazólicos de sirolimus

Info

Publication number: ES2642054T3
Application number: ES14187517.9T
Authority: ES
Inventors: Madhup Dhaon; Chu-Nung Hsiao; Subhash Patel; Peter Bonk; Sanjay Chemburkar; Yong Chen
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2005-12-14
Filing date: 2006-12-12
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2026-12-12
Also published as: CA2631971C; KR20150056880A; AU2006338175B2; JP5457678B2; KR101773527B1; EP1973919A4; NZ568304A; CA2997700A1; EP2712867A1; WO2007094886A3; EP2862863B1; CN101331138A; AU2006338175A2; US7700614B2; US8129521B2; US20100204466A1; TWI386413B; EP2862863A1; CN102746321A; JP2009519963A

Description

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DESCRIPCION

Sfntesis en un solo reactor de derivados tetrazolicos de sirolimus Campo Tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar una composicion que comprende zotarolimus y un antioxidante.

Antecedentes de la invencion

Introduccion

Sirolimus

Igual que el moai miro hacia el suelo, una expedicion canadiense en 1964 excavo en la tierra para desenterrar un hongo que produjo una poderosa molecula inmunosupresora, antifungica y anti-proliferacion celular. De la Isla de Pascua a los laboratorios en Canada, el hongo aterrizo en las manos de Suren Sehgal, que elucido las propiedades de un compuesto purificado del hongo Streptomyces hygroscopicus en 1972, pero este hallazgo fue abandonado, vfctima de las prioridades corporativas. Sehgal resucito la investigacion en 1987 y desarrollo el compuesto como inmunosupresor. Hoy en dfa, la rapamicina (bautizada como Rapa Nui, el nombre por el que los nativos de la isla de Pascua conocfan su patria) se utiliza para reducir el riesgo de trasplantes de organos y los efectos secundarios de los stents y esta siendo investigado como un farmaco antitumoral.

La rapamicina, tambien conocida como sirolimus, es un antibiotico trienico macrocfclico que inhibe el crecimiento de hongos, particularmente contra Candida albicans, tanto in vitro como in vivo (Baker et al., 1978; Sehgal, 1975; Sehgal, 1976; Sehgal et al., 1975; Vezina et al., 1975). Se ha demostrado que el sirolimus solo (Surendra, 1989) o combinado con picibanilo (Eng, 1983) tiene actividad antitumoral. En 1977, se demostro que el sirolimus era eficaz como inmunosupresor en modelos experimentales de encefalomielitis alergica (un modelo para esclerosis multiple), artritis adyuvante y artritis reumatoide (Martel et al., 1977). El sirolimus tambien inhibe eficazmente la formacion de anticuerpos de tipo IgE (Martel et al., 1977). Su estructura se muestra a continuacion (VI).

ABT-578 [40-epi-(1-tetrazolil)-rapamicina], conocido hoy en dfa como zotarolimus, es un antibiotico trieno macrolido semisintetico derivado de sirolimus. El Zotarolimus es un potente inhibidor de la proliferacion de linfocitos de celulas T, similar a su precursor sirolimus. El Zotarolimus ha encontrado aplicaciones excepcionales en el recubrimiento de stents cardiovasculares, especialmente los stents liberadores de farmacos ("DES" en sus siglas inglesas) para minimizar la restenosis (Mollison et al., 2003). El Zotarolimus existe en dos formas isomericas, un pirano principal (isomero de 6 miembros en la posicion 10) y un isomero de oxepano minoritario (isomero de 7 miembros en la posicion 9), ambos los cuales son isomeros N-1 (Mollison, 2000).

Se han intentado otras modificaciones qufmicas de la rapamicina. Estas incluyen la preparacion de derivados mono- y di-ester de rapamicina (Caufield, 1992), 27-oximas de rapamicina (Failli, 1992a); analogo 40-oxo de rapamicina (Caufield, 1991); rapamicinas bicfclicas (Kao, 1992a); dfmeros de rapamicina (Kao, 1992b); eteres silflicos de rapamicina (Failli, 1992b); y arilsulfonatos y sulfamatos (Failli, 1993).

Ademas de sus actividades antifungicas, inmunosupresoras y antitumorales, el sirolimus reduce la proliferacion neointimal en modelos animales, asf como la tasa de restenosis en humanos. El sirolimus tambien exhibe un efecto antiinflamatorio, una caracterfstica que apoya su seleccion como agente para el tratamiento de la artritis reumatoide. Los stents recubiertos con analogos de sirolimus, tales como everolimus y especialmente zotarolimus, son eficaces para prevenir la restenosis en pruebas clfnicas.

Stents y otros dispositivos medicos implantables

Los stents se usan para tratar disminuciones serias en el diametro del vaso o del conducto debido a una variedad de enfermedades y afecciones, especialmente enfermedades ateroscleroticas, y se usan a menudo despues de la angioplastia. Si bien se utilizan con frecuencia en arterias, los stents tambien se utilizan en otras estructuras, incluyendo venas, conductos biliares, esofago, traquea, bronquios grandes, ureteres y uretras. Los stents son la innovacion del dentista ingles Charles Stent (1845-1901).

Aunque son eficaces en el tratamiento del estrechamiento deletereo del lumen, los stents vasculares en un caso de ironfa medica, tambien corren el riesgo de volver a crear la afeccion para cuyo tratamiento se utilizaron. Los stents pueden incurrir en el desarrollo de tejido endotelial grueso dentro del lumen -- la neointima. Si bien el grado de

desarrollo varia, la neointima puede crecer para obstruir la luz del vaso, un tipo de restenosis.

imagen1

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(VI)

Sirolimus (rapamicina)

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Esquema 1

Los isomeros de ABT-578 (zotarolimus)

imagen2

Pirano 1 (isomero N-1) ;Lt)

imagen3

Oxepano 2 qh)

Slntesis anteriores de zotarolimus

Mollison presento varios metodos para generar zotarolimus a partir de sirolimus (Mollison, 2000). Por ejemplo, el hidroxilo C-40 de sirolimus se activa con la formacion de triflato, y el triflato se purifica a continuacion mediante cromatograffa en columna. Durante la purificacion de triflato, parte del intermediario activado revierte a sirolimus y su epimero, epi-sirolimus, debido a la presencia del agua durante la cromatograffa. El triflato purificado se hace reaccionar a continuacion en una segunda etapa con tetrazol para producir el derivado 40-epitetrazol de sirolimus, es decir, zotarolimus. El producto bruto se purifica a continuacion mediante cromatograffa en columna. Sin embargo, incluso con esta purificacion, el producto final podrfa contener impurezas de sirolimus y epi-sirolimus.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de una realizacion de un metodo en un solo reactor para preparar zotarolimus de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 2 muestra un diagrama de flujo de una realizacion de un metodo en un solo reactor para preparar

zotarolimus de acuerdo con la presente invencion.

Compendio de la invencion

5 La invencion describe metodos para realizar derivados de rapamicina en un solo reactor, y proporciona composiciones preparadas por medio de tales metodos que incluyen antioxidantes.

En un primer aspecto, la invencion proporciona un metodo para preparar una composition que comprende

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y un antioxidante comprendiendo el procedimiento:

15 (a) hacer reaccionar una molecula de formula

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con anhfdrido trfflico para producir una molecula de Formula VII:

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(Formula VII)

(b) hacer reaccionar la molecula de Formula VII con una molecula de Formula IV:

y

(c) anadir un antioxidante; en donde:

Rf*»

•OW

\

/

(Formula IV)

R9 y R10 son cada uno H;

las reacciones de las etapas (a) y (b) se realizan en un solo reactor; y

la etapa (b) se lleva a cabo en diisopropiletilamina y diclorometano o acetato de isopropilo.

La etapa (a) del metodo se lleva a cabo en presencia de una base no nucleofila, tal como 2,6-dimetilpiridina o diisopropiletilamina. La etapa (a) tambien se lleva a cabo en un disolvente, tal como acetato de isopropilo o diclorometano. En algunas realizaciones, el diclorometano se intercambia por acetato de isopropilo antes o durante la etapa (b).

En la molecula representada por la formula IV, R9 y R10 son h

La etapa (b) se lleva a cabo en presencia de un disolvente, que es diisopropiletilamina y acetato de isopropilo o diclorometano.

En la presente invention, el zotarolimus se proporciona mediante el nuevo metodo de la invention a partir de rapamicina.

La invencion proporciona composiciones de zotarolimus preparadas mediante los metodos de la invencion formulados con un antioxidante, tal como 3,5-di-terc-4-butilhidroxitolueno, DL-a-tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo, terc-butil-4-hidroxianisol o 2-terc-butil-4-hidroxianisol y acido fumarico. En una realization, el antioxidante es 3,5-di-terc-4-butilhidroxitolueno.

Description detallada de la invencion

La invencion proporciona un procedimiento en un solo reactor para la preparation de un analogo tetrazolico de sirolimus en la position C-40, produciendo zotarolimus, eliminando practicamente las impurezas de sirolimus y epi- sirolimus de metodos anteriores y presentando un metodo mas eficiente de fabrication del producto farmaceutico. En este metodo, se genera triflato en acetato de isopropilo (IPAc) o diclorometano (DCM) como disolvente en

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presencia de una base no nucleofila como 2,6-lutidina, u otras piridinas sustituidas como 2,6-di-terc-butilpiridina o 2,4,6-colidina, piridina, o diisopropiletil amina de base de Hunig (DIEA). Cuando se utiliza IPAc como disolvente durante la formacion de triflato, las sales se pueden filtrar y la solucion de triflato disolver con tetrazol en presencia de DIEA. Cuando se utiliza DCM como disolvente durante la formacion de triflato, el disolvente se cambia a IPAc. Posteriormente, la reaccion de Sn2 con tetrazol se lleva a cabo en IPAc y tetrazol con DIEA como base. El producto bruto despues de la eliminacion del disolvente se purifica mediante cromatograffa en columna en THF/heptano seguido de heptano/acetona. El producto purificado se puede aislar como un solido por tratamiento con t-butil metil eter (t-BME)/heptano. El zotarolimus asf obtenido es inestable a temperatura ambiente, pero puede estabilizarse mediante la adicion de antioxidantes, tales como BHT (2,6-di-t-butil-4-metilfenol, hidroxitolueno butilado), 2,6-di-t butil-4-etilfenol (DEP), 2,6-di-t-butil-4-metoxifenol (DMP). Algunas de las ventajas significativas del metodo en un solo reactor incluyen:

1. Eliminacion de la purificacion del triflato, que en los metodos anteriores era una fuente significativa de impurezas en el producto final;

2. Reduccion adicional de los niveles de subproductos de sirolimus y epi-sirolimus, formados durante la reaccion Sn2, purificando el producto bruto del metodo en THF:heptano;

3. Utilizacion de los disolventes aproticos de la reaccion Sn2 que pueden ser facilmente recuperados y reutilizados, reduciendo asf los costes y los problemas medioambientales de los metodos anteriores;

4. Facil aislamiento y purificacion del producto mediante disolucion en t-BME y adicion de heptano o mediante un procedimiento de adicion inversa;

5. Facil estabilizacion del producto limpio anadiendo antioxidantes; y

6. Facil aislamiento mediante liofilizacion en acetonitrilo o acetonitrilo:agua.

Definiciones

"Sustancia terapeutica" significa cualquier sustancia que cuando se administra a un sujeto apropiadamente a dosis apropiadas, tiene un efecto beneficioso sobre el sujeto.

Cuando cualquier sustituyente o variable (p.ej., arilo, alcoxilo, R1, R2, R3, R5, R6, etc.) aparece mas de una vez en una formula, tal definicion de variable o de sustituyente en cada caso es independiente de su definicion en cada otro caso, a menos que se indique lo contrario. Las combinaciones de sustituyentes y/o variables que estan en un constituyente de los compuestos de la invencion solo son admisibles si tales combinaciones dan como resultado un compuesto estable.

La nomenclatura entre parentesis utilizada en la definicion de sustituyentes tales como R1 (p.ej., (H, OR6) pretende reflejar los sustituyentes en ambas valencias del atomo relevante. La invencion no se limita a isomeros particulares y el orden de los radicales entre parentesis no sugiere una configuracion concreta.

"Aciloxi" significa -OC(O)-(alquilo) y -OC(O)-(arilo).

"Alquenilo" solo o combinado, significa un radical alquilo que tiene uno o mas dobles enlaces. Algunos ejemplos de tales radicales alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etenilo, propenilo, 1 -butenilo, cis-2-butenilo, trans-2-butenilo, isobutilenilo, cis-2-pentenilo, trans-2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 1-pentenilo, 1-hexenilo, 1- octenilo, decenilo, dodecenilo, tetradecenilo, hexadecenilo, cis- y trans-9-octadecenilo, 1,3-pentadienilo, 2,4- pentadienilo, 2,3-pentadienilo, 1,3-hexadienilo, 2,4-hexadienilo, 5,8,11,14-eicosatetraenilo y 9,12,15-octadecatrienilo.

"Alcoxilo" significa un grupo alquilo unido a oxfgeno.

"Alquilo", solo o combinado, significa un radical alquilo de cadena lineal o cadena ramificada que contiene de 1 a aproximadamente 22 atomos de carbono, de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 atomos de carbono o de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 atomos de carbono. Algunos ejemplos de tales radicales incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isoamilo, hexilo, octilo, nonilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, octadecilo y eicosilo.

"Alquilcicloalquenilo" y "alquenilcicloalquenilo" significan un radical cicloalquenilo como se ha definido anteriormente que esta sustituido con un radical alquilo o alquenilo como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de radicales alquilcicloalquenilo y alquenilcicloalquenilo incluyen, pero no se limitan a, 1 -metil-2-ciclopentilo, 1 -hexil-2- ciclopentenilo, 1-etil-2-ciclohexenilo, 1-butil-2-ciclohexenilo, 1-(9-octadecenil)-2-ciclohexenilo y 1-(2-pentenil)-2- ciclohexenilo.

"Alquilcicloalquilo" y "alquenilcicloalquilo" significan un radical cicloalquilo como se ha definido anteriormente que esta sustituido con un radical alquilo o alquenilo como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de radicales

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alquilcicloalquilo y alquenilcicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 2-etilciclobutilo, 1-metilciclopentilo, 1- hexilciclopentilo, 1-metilciclohexilo, 1-(9-octadecenil)ciclopentilo y 1-(9-octadecenil)ciclohexilo.

"Alquinilo" solo o combinado, significa un radical alquilo que tiene uno o mas enlaces triples. Algunos ejemplos de tales grupos alquinilo incluyen, pero no se limitan a, etinilo, propinilo (propargilo), 1 -butinilo, 1 -octinilo, 9-octadecinilo, 1,3-pentadiinilo, 2,4-pentadiinilo, 1,3-hexadinilo, y 2,4-hexadiinilo.

"Amino" significa -NH2, -N(alquilo)2, -NH(alquilo), -N(arilo)2, y -NH(arilo).

"Aralquilo", solo o combinado, significa un radical alquilo o cicloalquilo tal como se ha definido anteriormente en el que un atomo de hidrogeno esta sustituido con un radical arilo como se ha definido anteriormente, tal como bencilo, 2-feniletilo y similares.

"Arilo" solo o combinado, significa un radical fenilo o naftilo que porta opcionalmente uno o mas sustituyentes seleccionados entre alquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heterociclo, alcoxiarilo, alcarilo, alcoxi, halogeno, hidroxi, amina, ciano, nitro, alquiltio, fenoxi, eter, trifluorometilo y similares, tales como fenilo, p-tolilo, 4-metoxifenilo, 4-(terc-butoxi)fenilo, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 4-hidroxifenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo , y similares.

"Cicloalquenilo" solo o combinado, significa un radical cicloalquilo que tiene uno o mas dobles enlaces. Algunos ejemplos de radicales cicloalquenilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentenilo, ciclohexenilo, ciclooctenilo, ciclopentadienilo, ciclohexadienilo y ciclooctadienilo.

"Cicloalquenilalquilo" significa un radical alquilo tal como se ha definido anteriormente que esta sustituido con un radical cicloalquenilo como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de radicales cicloalquenilalquilo incluyen, pero no se limitan a, 2-ciclohexen-1-ilmetilo, 1-ciclopenten-1-ilmetilo, 2-(1-ciclohexen-1-il)etilo, 3-(1-ciclopenten-1- il)propilo, 1-(1-ciclohexen-1-ilmetil)pentilo, 1-(1-ciclopenten-1-il)hexilo, 6-(1-ciclohexen-1-1-il)hexilo, 1-(1-ciclopenten-

1- il)nonilo y 1-(1-ciclohexen-1-il)nonilo.

"Cicloalquilo" solo o combinado significa un radical cicloalquilo que contiene de 3 a aproximadamente 10, preferiblemente de 3 a aproximadamente 8 y lo mas preferiblemente de 3 a aproximadamente 6 atomos de carbono. Algunos ejemplos de tales radicales cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo y perhidronaftilo.

"Cicloalquilalquilo" significa un radical alquilo tal como se ha definido anteriormente que esta sustituido con un radical cicloalquilo como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de radicales cicloalquilalquilo incluyen, pero sin limitacion, ciclohexilmetilo, ciclopentilmetilo, (4-isopropilciclohexil)metilo, (4-t-butilciclohexil)metilo, 3-ciclohexilpropilo,

2- ciclohexilmetilpentilo, 3-ciclopentilmetilhexilo, 1-(4-neopentilciclohexil)metilhexilo, y 1-(4-

isopropilciclohexil)metilheptilo.

"Cicloalquilcicloalquilo" significa un radical cicloalquilo como se ha definido anteriormente que esta sustituido con otro radical cicloalquilo como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de radicales cicloalquilcicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclohexilciclopentilo y ciclohexilciclohexilo.

"Halogeno" incluye fluor, cloro, bromo y yodo.

"Heterociclo" incluye un anillo heterocfclico bicfclico mono- o bicfclico de 5 a 7 miembros estable o bicfclico de 7 a 10 miembros que esta saturado o insaturado y consiste en atomos de carbono y de uno a tres heteroatomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S, y en donde los heteroatomos de nitrogeno y azufre pueden ser oxidados y el heteroatomo de nitrogeno puede ser cuaternizado e incluyendo cualquier grupo bicfclico en el que un anillo heterocfclico se fusiona con un anillo de benceno. El anillo heterocfclico puede anclarse en cualquier heteroatomo o atomo de carbono que de como resultado una estructura estable. Algunos ejemplos de elementos heterocfclicos incluyen piperidilo, piperidinilo, piperazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, furilo y tienilo. El heterociclo puede estar sustituido de tal manera que los atomos de carbono anclados a un heteroatomo no esten directamente sustituidos con un heteroatomo, con uno a cuatro miembros que pueden ser alquilo C1-C6, arilo, hidroxilo, alcoxilo C1-C6, aciloxi, amino, N-acilamino, nitro y halogeno.

"Heterocfclico" significa estructuras anulares que contienen al menos otro tipo de atomo, ademas del carbono, en el anillo. El mas comun de los otros tipos de atomos incluyen nitrogeno, oxfgeno y azufre. Algunos ejemplos de heterocfclicos incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, piperidilo, imidazolidinilo, tetrahidrofurilo, tetrahidrotienilo, furilo, tienilo, piridilo, quinolilo, isoquinolilo, piridazinilo, pirazinilo, indolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, piridinilo, benzoxadiazolilo, benzotiadiazolilo, triazolilo y tetrazolilo.

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"Cetona" significa -C(O)-.

N-acilamino significa NHC(O)-(alquilo) y -NHC(O)-(arilo).

"Heterociclo que contiene nitrogeno" significa estructuras anulares en las que 2 carbonos y un nitrogeno del anillo son tambien parte del ligando macrocfclico de quince miembros. La estructura anular 10 puede contener de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 o de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 atomos de carbono, puede estar sustituido o no sustituido, parcialmente o totalmente insaturado o saturado, y tambien puede contener atomos de nitrogeno, oxfgeno y/o azufre en la porcion del anillo que no es tambien parte del ligando macrocfclico de quince miembros.

"Ciclico saturado, parcialmente saturado o insaturado" significa estructuras anulares fusionadas en las que 2 carbonos del anillo son tambien parte del ligando macrocfclico de quince miembros. La estructura anular puede contener de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 atomos de carbono o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 atomos de carbono, y puede contener tambien una o mas otras clases de atomos ademas del carbono. El mas comun de los otros tipos de atomos incluyen nitrogeno, oxfgeno y azufre. La estructura anular tambien puede contener mas de un anillo.

"Estructura anular saturada, parcialmente saturada o insaturada" significa una estructura anular en la que un carbono del anillo es tambien parte del ligando macrocfclico de quince miembros. La estructura anular puede contener de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 atomos de carbono y tambien puede contener atomos de nitrogeno, oxfgeno y/o azufre.

Practica de la invencion

Para preparar una composicion que comprende

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y un antioxidante comprendiendo el procedimiento:

(a) hacer reaccionar una molecula de formula

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con anhfdrido trfflico para producir una molecula de Formula VII:

imagen9

(b) hacer reaccionar la molecula de Formula VII con una molecula de Formula IV:

Rio

R r\

ll N

/

N

(Formula IV)

y

(c) anadir un antioxidante; donde:

R9 y R10 son cada uno H;

las reacciones de las etapas (a) y (b) se realizan en un solo reactor; y

Etapa (a)

Base La etapa (a) se lleva a cabo en presencia de una base no nucleofila, preferiblemente 2,6-dimetilpiridina o

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diisopropiletilamina.

Disolvente Esta etapa se lleva a cabo tambien en presencia de un disolvente, tal como acetato de isopropilo o diclorometano. Si el disolvente es diclorometano, se puede cambiar por acetato de isopropilo antes o durante la etapa (b).

Etapa (b)

En la molecula de formula IV, Rg y R10 son H.

Disolvente La etapa (b) tambien se lleva a cabo en presencia de un disolvente, que es diisopropiletilamina con acetato de isopropilo o diclorometano.

El Esquema 2 representa un resumen de una realizacion preferida de la invencion;

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que describe las etapas en el proceso en un solo reactor para preparar zotarolimus. En una primera realizacion, el sirolimus (comercialmente disponible o producido como se ha descrito ((Paiva et al., 1991; Sehgal et al., 1975; Vezina et al., 1975) se disuelve en DCM:tolueno (por ejemplo 1:2) 100. La mezcla de reaccion se concentra hasta sequedad 105, y el proceso de secado azeotropico 105 se repite 1-5 veces mas, mas preferiblemente 2-4 veces, mas preferiblemente dos veces, preferiblemente con DCM:tolueno. El solido espumoso resultante se disuelve en IPAc 110, y a continuacion se anade 2,6-lutidina 115. La solucion se enfrfa a -30°C 115. A continuacion se anade lentamente anhfdrido trfflico a la solucion 115. Despues de agitar la mezcla de reaccion, la solucion se filtra bajo nitrogeno. Las sales recuperadas 120 se lavan con IPAc 125. A las sales se les anaden 1-H-tetrazol y DIEA 130. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente (p.ej., 22-25°C) 135 y a continuacion se concentra. La mezcla de reaccion bruta se purifica utilizando, por ejemplo, una columna de gel de sflice y utilizando, p.ej., THF:heptano 1:1 para la elucion 140. Las fracciones se controlan para determinar el isomero N-1 (que eluye mas lentamente que el isomero N-2), se agrupan y se concentran, formando un aceite. El aceite se disuelve en DCM mfnimo y la solucion se carga en una columna de gel de sflice empaquetada, por ejemplo, en heptano/acetona 65:35 145. La columna se eluye, por ejemplo, con heptano:acetona 65:35, las fracciones controladas para el producto puro, se agrupan y se concentran 150.

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Compendio del procedimiento en un reactor para sintetizar zotarolimus

HO

r-.c s o

Etapa 1a

2,6-lutidina,Tf20

SPAi. a DCM,

-ot: a

c5Se79NO

Peso Mo 10.46.23

Peso Mol. 914.1?

ntermcdio tif ato

Rapamicina

Etapa 1b

IPAc o DCM, tetrazol

diisopropil etil amina

Etapa 2: Punficacion en columna

Etapa 3: Aislamiento y secado

Peso mol.: 960,21

Peso mol.:

somero N2

A-l 1957# (AffT-S7S)

El producto purificado se disuelve a continuacion en t-BME, y despues se anade lentamente n-heptano para formar un precipitado mientras se agita vigorosamente la solucion 150. Los solidos precipitados se agitan a 5-10°C, se filtran, se lavan de nuevo con heptano y se secan sobre el embudo con nitrogeno. El producto se disuelve en acetona y se trata con BHT 155. La solucion se concentra, se disuelve en acetona, y despues se concentra a sequedad. El producto se seca a continuacion a vacfo a 47°C 160.

En una segunda realizacion preferida, en el diagrama de flujo mostrado en la Figura 2, se disuelve sirolimus en DCM 200, 205. Se anade 2,6-lutidina, la solucion se enfrfa a -30°C y se anade lentamente anhfdrido trifflico 210. La mezcla de reaccion 215 se mezcla y se anade tetrazol, seguido de DIEA 220. La mezcla de reaccion se incuba a aproximadamente 25°C 225, y despues se carga en columnas de gel de sflice preparadas, por ejemplo, en THF:n- heptano 1:1 (v/v) 230. La mezcla de reaccion bruta se purifica con THF:n-heptano 1:1. Las fracciones que contienen el producto se recogen y se concentran 235. Los solidos concentrados se disuelven en DCM mfnimo y se cargan en una columna de gel de sflice 240, se embalan, por ejemplo, en n-heptano:acetona 70:30. La columna se eluye, y las fracciones que contienen producto puro se concentran 245. El producto purificado se disuelve en t-BME y se anade lentamente a n-heptano 250. Los solidos precipitados se filtran, se lavan con n-heptano y se secan 255. Se anade BHT a los solidos, y los solidos se disuelven en acetona, se filtran y se concentran 260. El residuo se trata con acetona dos veces 260 y se concentra cada vez hasta sequedad. El producto se seca a continuacion a vacfo 260.

En una tercera realizacion, se disuelve sirolimus (rapamicina) en diclorometano. Se anade 2,6-lutidina y la solucion se enfrfa a -30°C. Se anade lentamente anhfdrido trifflico. Despues de agitar la reaccion, la solucion se calienta a 10°C. La solucion de reaccion se concentra y el residuo se disuelve en IPAC. Se anade 1-H-tetrazol, seguido de DIEA y la mezcla de reaccion se agita a 22-25°C. Despues la solucion se concentra y se purifica sobre una columna de gel de sflice eluyendo, por ejemplo, con THF:heptano 1:1. Las fracciones que contienen el isomero N-1 se recogen, se combinan y se concentran. El aceite resultante se disuelve en DCM mfnimo y se carga sobre una columna de gel de sflice empaquetada, por ejemplo, en heptano/acetona 65:35. La columna se eluye con

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heptano:acetona, y las fracciones que contienen el producto puro se concentran. El concentrado se disuelve en t- BME y se anade lentamente a n-heptano con agitacion vigorosa. El precipitado se agita a continuacion a 5-10°C durante no mas de 1 hora, se filtra, se lava con heptano y se seca sobre el embudo con nitrogeno. Se anade BHT a los solidos, y la mezcla se disuelve en acetona. A continuacion, la solucion se pasa a traves de un filtro y se concentra. El residuo se trata con acetona dos veces mas y se concentra cada vez a sequedad. El producto final se seca a vacfo a 50°C.

Diferentes reactivos pueden ser sustituidos en los metodos de la invencion para llevar a cabo la invencion. Por ejemplo, la 2,6-di-t-butilpiridina y la DIEA pueden sustituir a la 2,6-lutidina para hacer triflato. Otras bases se pueden usar en esta etapa, incluyendo piridina, otras piridinas sustituidas, tales como 2,6-di-terc-butilpiridina o 2,4,6-colidina, y 4-dimetilaminopiridina (DMAP), N-metilmorfolina y otras que son evidentes para un experto en la tecnica. Tambien se pueden usar diversos disolventes y bases (en lugar de DIEA) en los metodos de la invencion. Los ejemplos se proporcionan en la Tabla 1 a continuacion.

TABLA 1

Reaccion de desplazamiento Sn2 en diversas bases

Condiciones de reaccion: Comentarios

IPAc/DlEA: Isomero N-1 favorecido

DCM/DIEA: Misma proporcion de isomeros N-1:N-2

IPAc/DIEA: 1/2 eq DIEA, reaccion lenta

DME/DIEA: Similar a IPAc

THF/DIEA: Similar a IPAc

Dioxano/DIEA: Igual que IPAc

ACN/DIEA: Reaccion lenta, proporcion baja

DMA/DIEA: Descomp.

DMF/DIEA: Descomp.

IPAc/Lut: Reaccion muy lenta, descomp.

IPAc/TEA: Lenta, misma proporcion de isomeros N-1:N-2

IPAc/NMM: Reaccion lenta, isomero N-2 favorecido

THF/TEA: Proporcion baja N-1:N-2

IPAc/DBU: Reaccion heterogenea, isomero N-2 favorecido

IPAc/K2COa: Reaccion heterogenea, isomero N-2 favorecido

IPAC/DMAP: Reaccion heterogenea

IPAC/sin base: Descomposicion de triflato

THF/KOtBu: Heterogenea, lenta, isomero N-2 favorecido, descomposicion.

IPAc/DIEA: 33°C calentado, aumenta la velocidad de reaccion

Bases y disolventes. Las bases fuertes, tales como 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno (DBU), carbonato de potasio (K2COs), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y terc-butoxido de potasio (KOtBu) producen una descomposicion considerable y generalmente favorecen la formacion de isomeros N-2 y por lo tanto no se prefieren. Las bases mas debiles, tales como lutidina, TEA y NMM ralentizan la reaccion Sn2 con la formacion de ambos isomeros N-1 y N-2 a razones de aproximadamente 1:1. Los disolventes aproticos, tales como IPAc, DME, dioxano y THF tienen un buen rendimiento, favoreciendo el isomero N-1 y son preferidos. El uso de DCM proporciona isomeros en una razon de aproximadamente 1:1. Los disolventes polares aproticos como DMA y dMf conducen a la descomposicion del producto de reaccion.

Temperatura. La reaccion puede acelerarse por calentamiento, aunque normalmente se observa descomposicion. Sin embargo, la reaccion normalmente se completa en 4 horas o antes; por lo tanto la mezcla de reaccion puede ser procesada anteriormente, minimizando la degradacion. Las temperaturas que son preferibles para acelerar la reaccion de desplazamiento de SN2 incluyen 20-35°C, preferiblemente 22-33°C, mas preferiblemente 25-33°C, y lo mas preferiblemente 28-30°C.

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Antioxidantes. Para estabilizar el zotarolimus producido por los procedimientos en un solo reactor, se pueden utilizar antioxidantes. Pueden estar presentes en las composiciones a aproximadamente 1% en peso, mas preferiblemente de 0,05% a 0,75%, y en el caso de 3,5-di-terc-4-butilhidroxitolueno (BHT), 0,5%. Algunos ejemplos de antioxidantes incluyen 3,5-di-terc-4-butilhidroxitolueno, DL-a-(tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo, 3-terc-butil-4- hidroxianisol o 2-terc-butil-hidroxianisol y acido fumarico. Preferentemente, el antioxidante es BHT.

Ejemplos

Ejemplo 1 Procedimiento en un solo reactor con diclorometano-tolueno-acetato de isopropilo con filtracion (1)

En este ejemplo, se preparo zotarolimus a partir de rapamicina en un procedimiento en un solo reactor utilizando diclorometano, tolueno y acetato de isopropilo; a continuacion la preparacion se purifico, se concentro y se seco. El producto purificado se caracterizo despues por sus resonancias RMN H1, 13C de los espectros COSY, ROESY, TOCSY, HSQC y HMBC.

Se disolvio rapamicina (10 g) en diclorometano (DCM, 25 ml) y tolueno (50 ml). La mezcla de reaccion se concentro hasta sequedad. Este procedimiento de secado azeotropico se repitio dos veces con DCM/tolueno. El solido espumoso se disolvio en acetato de isopropilo (IPAc, 65 ml), y se anadio 2,6-lutidina (3,2 ml). La solucion se enfrio a -30°C en acetonitrilo-bano de hielo seco, y se anadio lentamente anhfdrido de triflico (2,8 ml) en 10 minutos. La mezcla de reaccion se agito durante 30 minutos, y despues se filtro bajo atmosfera de nitrogeno. Las sales se lavaron con IPAc (10 ml). Se anadieron 1-H-tetrazol (2,3 g), seguido de diisopropiletilamina (DIEA, 7,4 ml). La mezcla de reaccion se agito durante 6 horas a temperatura ambiente y despues se concentro. La mezcla de reaccion bruta se purifico en una columna de gel de sflice (350 g) eluyendo con THF/heptano 1:1. Las fracciones que contenfan el producto que elufa posteriormente (predominantemente el isomero N-1) se recogieron y se concentraron. El aceite concentrado se disolvio en DCM mfnimo y se cargo en una columna de gel de sflice cargada empaquetada en heptano:acetona 65:35. La columna se eluyo con heptano:acetona 65:35, y las fracciones que contenfan el producto puro se concentraron.

El producto purificado se disolvio a continuacion en t-butilmetileter (t-BME, 13,5 g) y se anadio lentamente n-heptano (53 g) con agitacion vigorosa. Los solidos precipitados se agitaron a 5-10°C durante 2 horas, se filtraron, se lavaron con heptano y se secaron en el embudo con nitrogeno para proporcionar 3,2 g de producto humedo. Los solidos (1,0 g) se disolvieron en acetona (10 ml) y se trataron con 2,6-di-terc-butil-4-etilfenol (DEP, 0,2%). La solucion se concentro, se disolvio en acetona (10 ml) y se concentro hasta sequedad. El producto se seco a vacfo durante 18 horas a 47°C, proporcionando 0,83 g de zotarolimus. El producto se caracterizo por su RMN H1, RMN C13 a partir de sus espectros COSY, ROESY, TOCSY, HSQC y HMBC.

RMN H1 (DMSO-d6, posicion entre parentesis): ppm 0,73 (Me, 43); 0,81 (Me, 49); 0,84 (Me, 46); 0,89 (Me, 48); 0,98 (Me, 45); 1,41, 1,05 (CH2, 24); 1,18, 1,10 (CH2, 36); 1,52 (CH,37); 1,53 (CH2, 12 y 42); 1,59, 1,30 (CH2, 5); 1,41, 1,67 (CH2, 4); 1,11, 1,73 (CH2, 38); 1,21, 1,83 (CH2, 15); 1,21, 1,83 (CH2, 13); 1,62 (Me, 44); 1,73 (Me, 47); 1,76 (CH, 35); 1,60, 2,09 (CH2, 3); 1,93,2,21 (CH2, 41); 2,05 (CH, 11); 2,22 (CH, 23); 2,47 (CH, 25); 2,40, 2,77 (CH2, 33); 3,06 (OCH3, 50); 3,16 (OCH3, 51); 3,22, 3,44 (CH2, 6); 3,29 (OCH3, 52); 3,29 (CH, 31); 3,60 (CH, 39), 3,62 (CH, 16); 3,89 (CH, 27); 4,01 (CH, 14); 4,02 (CH, 28); 4,95 (CH, 2); 5,02 (CH, 34); 5,10 (=CH, 30); 5,17 (CH, 40); 5,24 (OH, 28); 5,46 (=CH, 22); 6,09 (=CH, 18); 6,15 (=CH, 21); 6,21 (=CH, 20); 6,42 (=CH, 19); 6,42 (OH, 10),9,30 (CH, 53).

RMN C13 (DMSO-d6, posicion entre parentesis): ppm 10,4 (Me, 44); 13,1 (Me, 47); 13,6 (Me, 46); 14,5 (Me, 49); 15,5 (Me, 43 y 48); 20,3 (CH2, 4); 21,6 (Me, 45); 24,4 (CH2, 4); 26,2 (CH2, 12); 26,4 (CH2, 3); 26,8 (CH2, 41); 27,2 (CH2, 42); 29,6 (CH2, 13); 31,6 (CH2, 38),31,7 (CH, 37); 32,9 (CH, 35); 34,8 (CH, 11); 35,2 (CH, 23); 38,2 (CH2, 36); 39,1 (CH, 25); 39,4 (CH2, 33); 39,6 (CH2, 24), 40,0 (CH2,15);43,4 (CH2, 6); 45,2 (CH, 31); 50,6 (CH, 2); 55,4 (OCH3, 50); 55,8 (OCH3, 52); 57,0 (OCH3, 52); 55,9 (CH, 40); 66,2 (CH, 14); 73,4 (CH, 34); 75,6 (CH, 28); 77,4 (CH, 39); 82,3 (CH, 16); 85,7 (CH, 27); 99,0 (CH,10); 125,3 (=CH, 30); 127,0 (=CH, 18 y 19); 130,4 (=CH, 21); 132,2 (=CH, 20); 137,2 (=CMe, 29); 137,7 (=CMe, 17); 139,2 (=CH, 22); 144,6 (CH, 53); 167,0 (C=O, 8); 169,1 (C=O, 1); 199,0 (C=O, 9); 207,5 (C=O, 32); 210,7 (C=O, 26).

Ejemplo 2 Procedimiento en un solo reactor con diclorometano-acetato de isopropilo (2)

En este ejemplo, se preparo zotarolimus a partir de rapamicina en un procedimiento en un solo reactor utilizando diclorometano e acetato de isopropilo. El compuesto se purifico despues, se concentro y se seco.

Se disolvio rapamicina (10 g) en diclorometano (DCM, 100 g). Se anadio 2,6-lutidina (2,92 g). La solucion se enfrio a -30°C en acetonitrilo-bano de hielo seco, y se anadio lentamente anhfdrido trifflico (4,62 g) en 10 minutos. La mezcla de reaccion se agito durante 20 minutos y despues se calento a 10°C en 15 minutos. La solucion de reaccion se concentro a continuacion. El residuo se disolvio en IPAc (55 g). A continuacion se anadieron 1-H-tetrazol (2,68 g),

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seguido de diisopropiletilamina (DIEA, 7,08 g). La mezcla de reaccion se agito durante 6 horas a temperature ambiente y despues se concentro. La mezcla de reaccion bruta se purifico en una columna de gel de sflice (360 g), eluyendo con THF:heptano 1:1. Se recogieron las fracciones que contenfan el producto que elufa mas tarde (principalmente N-1) y se concentraron. El aceite concentrado se disolvio en DCM mfnimo y se cargo en una columna de gel de sflice (180 g) que se envaso en heptano:acetona 65:35. La columna se eluyo a continuacion con heptano:acetona 65:35, y las fracciones que contenfan el producto puro se concentraron.

El producto purificado se disolvio en t-butilmetileter (t-BME, 23 g) y se anadio lentamente a n-heptano (80 g) con agitacion vigorosa. Los solidos precipitados se agitaron a 5-10°C durante no mas de 1 hora, se filtraron, se lavaron con heptano y se secaron en el embudo con nitrogeno. Se anadio BHT (0,015 g) a los solidos. Los solidos se disolvieron en acetona (20 g), se pasaron a traves de un filtro y se concentraron. El residuo se trato dos veces con acetona (20 g) y se concentro cada vez hasta sequedad. El producto se seco despues a vacfo durante 18 h a no mas de 50°C para proporcionar 2,9 g de zotarolimus.

Ejemplo 3 Procedimiento en un solo reactor con diclorometano (3)

En este ejemplo, se preparo zotarolimus a partir de rapamicina en un procedimiento en un solo reactor utilizando diclorometano. A continuacion, el compuesto se purifico, se concentro y se seco como se describe en el Ejemplo 2.

Se disolvio rapamicina (7,5 g) en DCM (30 g). Se anadio 2,6-lutidina (1,76 g). La solucion se enfrio a -30°C en acetonitrilo-bano de hielo seco, y se anadio lentamente anhfdrido trfflico (2,89 g) en 10 minutos. La mezcla de reaccion se agito durante 20 minutos y a continuacion se analizo para determinar la presencia de rapamicina para determinar el consumo en la reaccion. Se anadio 1-H-tetrazol (1,44 g), seguido de DIEA (5,29 g). La mezcla de reaccion se agito durante 6 horas a temperatura ambiente, y despues se cargo directamente sobre una columna de gel de sflice (270 g) preparada en THF:n-heptano 1:1 (v/v). La mezcla de reaccion bruta se purifico con THF:n- heptano 1:1. Las fracciones que contenfan el producto que elufa mas tarde se recogieron y se concentraron. Los solidos concentrados se disolvieron en DCM mfnimo y se cargaron en una columna de gel de sflice (135 g) empaquetada en n-heptano:acetona 70:30. La columna se eluyo con n-heptano:acetona 70:30, y las fracciones que contenfan producto puro, identificadas mediante cromatograffa en capa fina (TLC), se concentraron.

El producto purificado se disolvio en t-BME (9 g) y se anadio lentamente a n-heptano (36 g) con agitacion vigorosa a 10 ± 10°C. Los solidos precipitados se agitaron a 5-10°C durante no mas de 1 hora, se filtraron, se lavaron con n- heptano y se secaron en el embudo con nitrogeno. Se anadio BHT (0,006 g) a los solidos. Los solidos se disolvieron en acetona (20 g), se pasaron a traves de un filtro y se concentraron. El residuo se trato dos veces con acetona (20 g cada vez) y se concentro cada vez hasta sequedad. El producto se seco al vacfo durante no mas de 18 horas a no mas de 50°C para proporcionar 2,5 g de zotarolimus.

El procedimiento anterior, cuando se lleva a cabo con rapamicina en presencia de 2,6-di-terc-butilpiridina o 2,4,6- colidina (2,3,5-trimetilpiridina) como no nucleofilo en la etapa 1a proporciono zotarolimus de pureza aceptable, pero un rendimiento inferior.

Ejemplo 4 Purificacion mediante cromatograffa lfquida de alta presion (HPLC) de zotarolimus preparado por el metodo de sfntesis en un solo reactor

En este ejemplo, se preparo zotarolimus a partir de rapamicina utilizando un metodo de sfntesis en un solo reactor de la invencion (usando DCM), y a continuacion se sometio a una ronda adicional de purificacion utilizando HPLC.

Se disolvio rapamicina (3,75 g) en diclorometano (DCM, 15 g). Se anadio despues 2,6-lutidina (0,88 g). La solucion se enfrio a -30°C en acetonitrilo-bano de hielo seco, y se anadio lentamente anhfdrido trfflico (1,45 g) en 10 minutos. La mezcla de reaccion se agito durante 20 minutos, y despues se anadio 1-H-tetrazol (0,72 g), seguido de DIEA (2,65 g). La mezcla de reaccion se agito durante 6 horas a 25°C, y despues se cargo directamente sobre una columna de gel de sflice (115 g) preparada en n-heptano:acetona 70:30. La mezcla de reaccion bruta se purifico con n-heptano:acetona 70:30. Las fracciones que contenfan el producto se recogieron y se concentraron.

Los solidos concentrados se disolvieron en acetonitrilo-agua y se cargaron en una columna C-18 TechniKrom (5 cm x 25 cm), y se eluyeron con acetonitrilo-agua 64:36 que contenfa BHT al 0,1%. Las fracciones se analizaron mediante (RP)-HPLC de fase inversa, y las fracciones del producto se reunieron y se concentraron para eliminar el acetonitrilo. El producto se extrajo con acetato de etilo o acetato de isopropilo, se seco (sulfato de sodio) y se concentro.

El producto purificado se disolvio en t-BME (4,5 g) y se anadio lentamente a n-heptano (18 g) con agitacion vigorosa a ~10°C. Los solidos precipitados se agitaron a 5-10°C durante no mas de 1 hora, se filtraron, se lavaron con n-

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heptano y se secaron en el embudo con nitrogeno. Se anadio BHT (0,005 g) a los solidos. Los solidos se disolvieron en acetona (20 g), se pasaron a traves de un filtro y se concentraron. El residuo se trato con acetona dos veces (20 g) y se concentro cada vez hasta sequedad. El producto se seco al vacfo durante no mas de 18 horas a no mas de 50°C para dar 1,2 g de zotarolimus de alta calidad.

Ejemplo 5 Analisis de estabilidad de zotarolimus preparado mediante metodos de sfntesis en un solo reactor

Este ejemplo demuestra que el zotarolimus preparado de acuerdo con los metodos de la invencion puede estabilizarse utilizando antioxidantes.

Varios lotes de zotarolimus preparados por los metodos en un reactor perdieron potencia significativa con el paso del tiempo. La perdida de potencia fue mayor a temperatura elevada, pero no hubo cambios aparentes en el perfil de impurezas. La Tabla 2 presenta la potencia de un lote de zotarolimus a diversos intervalos de tiempo y condiciones de temperatura. Por ejemplo, incluso en un recipiente sellado a temperatura ambiente (25°C), la potencia disminuye de 95,1% a 69,8% a lo largo de 3 meses. Esta perdida se exacerbo en un recipiente sellado cuando se mantuvo a 40°C de 96,0% a 37,4% en solo dos meses.

La investigacion posterior revelo que esta perdida de potencia era debida a la degradacion oxidativa de la molecula que daba lugar a multiples productos de degradacion. Se realizo un estudio de estabilidad para evitar esta oxidacion utilizando antioxidantes fenolicos y se identifico BHT como un compuesto adecuado. Las Tablas 3 y 4 presentan datos de estabilidad utilizando BHT a diversas concentraciones (% representado p/p) y temperaturas. Por ejemplo, a 40°C, BHT al 0,5% mantuvo la potencia del 96,5% inicial a una potencia final de 95,9% durante aproximadamente tres meses, mientras que en condiciones similares en ausencia de BHT, la potencia se habfa reducido al 37,4% del 96% inmediatamente despues de 2 meses.

TABLA 2

Datos de estabilidad del zotarolimus (temperatura indica almacenamiento, % de potencia)

Tiempo despues de la sfntesis: 5° C (sellado) 25° C (sellado) 25° C (sin sellar) 40° C (sellado)

Inicial: 95,7 95,1 95,5 96,0

2 semanas: 98,2 95,7 98,0 81,1

1 mes: 95,0 88,8 91,6 61,9

2 meses: 95,4 81,6 87,1 37,4

3 meses: 95,1 69,8 75,5 Terminado

TABLA 3

Estabilidad de Zotarolimus con diversas concentraciones de BHT a 4°C

BHT: 0,0% 0,1% 0,2% 0,5% 1,0%

0 semanas: 97,2 96,7 96,3 96,5 95,9

2 semanas: 95,2 96,7 96,7 96,5 96,3

4 semanas: 96,4 97,3 97,5 96,2 96,6

6 semanas: 96,6 96,8 96,9 95,7 96,1

8 semanas: 97,5 96,9 96,9 96,9 96,9

12 semanas: 95,9 96,8 96,8 -- 95,5

TABLA 4

Estabilidad de Zotarolimus con diversas concentraciones de BHT a 40°C

BHT (p/p): 0,1% 0,2% 0,5% 1,0%

0 semanas: 96,7 96,3 96,5 95,9

2 semanas: 96,5 96,6 96,1 95,4

4 semanas: 96,9 97,2 96,4 96,4

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Estabilidad de Zotarolimus con diversas concentraciones de BHT a 40°C

BHT (p/p): 0,1% 0,2% 0,5% 1,0%

6 semanas: 96,1 97,1 95,7 95,6

8 semanas: 96,2 97,0 96,1 96,5

12 semanas: 95,6 -- 95,9 95,8

Estos estudios de estabilidad confirman que para mantener la pureza, la potencia y la estabilidad del zotarolimus, es muy importante la adicion de un antioxidante como BHT.

Ejemplo 6 Aislamiento y caracterizacion de isomeros en equilibrio de zotarolimus

El analisis en fase inversa de zotarolimus en una columna de C-18 o fenilo indico que el isomero principal, que elufa antes, era la forma de pirano de 6 miembros frente a un isomero de oxepano (2) de 7 miembros y el isomero de oxepano como componente minoritario eluyo 3-4 minutos mas tarde. En una HPLC de fase normal (gel de sflice- YMC Co. Ltd, Kyoto, Japon), las dos formas no tenfan una separacion en el momento inicial; sin embargo la forma de oxepano eluyo inmediatamente antes de la forma de pirano.

Con el fin de demostrar este equilibrio, cada forma se aislo por multiples inyecciones de HPLC de zotarolimus en una columna de fenilo de fase inversa a pH 4. Cada forma aislada fue a continuacion re-inyectada para estudiar su equilibrio a varios intervalos. El estudio indico que la forma de pirano alcanzo un estado de equilibrio en 3-4 dfas, mientras que la forma de oxepano (un componente minoritario) no se habfa equilibrado completamente, incluso despues de casi 6 dfas. Hubo alguna formacion de acido de anillo abierto durante el estudio. Los resultados de este estudio mostrados en la Tabla 5 (con tampon) y en la Tabla 6 (sin tampon) indican claramente que las dos formas estan en equilibrio, en donde la forma de pirano es mas termodinamicamente estable.

Tambien se llevaron a cabo estudios en condiciones no tamponadas en una mezcla disolvente de acetonitrilo/agua. Se realizaron inyecciones multiples de zotarolimus en una columna C-18 Altima (Alltech Associates, Inc.; Deerfield, IL) utilizando acetonitrilo al 66% en agua en un medio no tamponado. Se recogieron las formas de pirano y oxepano. Estas formas se reinyectaron en la columna C-18 para estudiar la razon de equilibrio a varios intervalos. Estos datos, descritos en las Tablas 4 y 5, sugirieron que el equilibrio entre dos isomeros fue rapido y se completo en ~7-8 horas. Estas observaciones confirmaron que el zotarolimus existe en una mezcla en equilibrio de pirano (1) vs oxepano (2) ~10:1.

TABLA 5

Estudios de equilibrio de las formas pirano y oxepano de zotarolimus en tampon de pH 4

Pirano (P): Oxepano (O)

Hora: Razon P/O Hora Razon P/O

1,5 horas: 99:1, 0,5 horas 1:99

3,5 horas: 98:2, 3,5 horas 18:82

5,5 horas: 97:3, 5,5 horas 21:71

7,5 horas: 96:4 7,5 horas 36:63

50 horas: 92:8 50 horas 70:28

5 dfas: 90:9 5 dfas 83:16

Razon 6 dfas: 9,8:1 Razon 6 dfas 6,6:1

TABLA 6

Estudios de equilibrio de formas pirano y oxepano de zotarolimus sin tampon

Pirano (P): Oxepano (O)

Hora: Razon P/O Hora Razon P/O

2 horas: 90:9 1,5 horas 26:70

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Estudios de equilibrio de formas pirano y oxepano de zotarolimus sin tampon

Pirano (P): Oxepano (O)

Hora: Razon P/O Hora Razon P/O

3,5 horas: 88:9 3,5 horas 80:17

5 horas: 87:9 5 horas 87:10

8 horas: 86:9 7 horas 88:9

Razon 8 horas: 9,8:1 Razon 7 horas 10:1

Se entiende que la descripcion detallada anterior y los ejemplos adjuntos son meramente ilustrativos y no deben tomarse como limitaciones del alcance de la invencion, que esta definida unicamente por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes. Seran evidentes para los expertos en la tecnica diversos cambios y modificaciones de las realizaciones descritas. Tales cambios y modificaciones, incluyendo sin limitacion los relacionados con las estructuras qufmicas, sustituyentes, derivados, intermedios, sfntesis, formulaciones y/o metodos de uso de la invencion, pueden realizarse sin apartarse del alcance de la misma.

Referencias

Baker, H., A Sidorowicz, S.N. Sehgal, and C. Vezina. 1978. Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. III. In vitro and in vivo evaluation. J Antibiot (Tokyo). 31:539-45.

Caufield. Patente de Estados Unidos Num. 5.023.262. 1991. Hydrogenated Rapamycin Derivatives.

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Failli. Patente de Estados Unidos Num. 5.177.203. 1993. Rapamycin 42-Sulfonates and 42-(N-Carboalkoxy) Sulfamates Useful as Imunosuppressie Agents.

Higuchi, T., y V. Stella. 1987. Pro-drugs as Novel Delivery systems.

Hughes, P., 1. Musser, M. Conklin, y R. Russo. 1992. The isolation, synthesis and characterization of an isomeric form of rapamycin. Tetrahedron Lttrs. 33:4739-4742.

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Martel, R.R., J. Klicius, y S. Galet. 1977. Inhibition of the immune response by rapamycin, a new antifungal antibiotic. Can J Physiol Pharmacol. 55:48-51.

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Sehgal, S.N. Patente de Estados Unidos Num. 3,929,992. 1975. Rapamycin and Process of Preparation. Sehgal, S.N. Patente de Estados Unidos Num. 3,993,749. 1976. Rapamycin and Process of Preparation. Sehgal, S.N., H. Baker, y C. Vezina. 1975. Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. II. Fermentation, isolation and characterization. J Antibiot (Tokyo). 28: 727-32.

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Vezina, C., A. Kudelski, y S.N. Sehgal. 1975. Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle. J Antibiot (Tokyo). 28:721-6.

Por razones de integridad, varios aspectos de la descripcion en los siguientes apartados numerados:

5

imagen11

que comprende:

(a) hacer reaccionar una molecula de formula II:

imagen12

con anhidrido triflico para producir una molecula de formula III:

5

10

15

20

25

30

35

40

imagen13

y

(b) hacer reaccionar la molecula de formula III con una molecula de formula IV:

imagen14

en donde

R1 se selecciona del grupo que consiste en =O (H, H) y (H, OH);

R2 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, -C(=O)R6, -C(=O)OR6, -C(=O)NHR6, y -C(=S)OR6;

R3 se selecciona del grupo que consiste en =O y OR5; o R2 y R3 pueden tomarse en conjunto para formar un radical de formula A-C(R7)(R8)-O-B, donde A es un enlace al oxfgeno unido al carbono 28 y B es un enlace al carbono 26;

R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C4;

R6 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C6, grupos arilo y grupos heterocfclicos;

R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, o R7 y R8 tomados en conjunto son =O

R9 y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquenilo, alquenilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquilo, alquilcicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquinilo, aralquilo, arilo, cicloalquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo, heterociclilo, aza, amida, amonio, oxa, tia, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosforilo, fosfinilo, fosfino, fosfonio, ceto, ester, alcohol, carbamato, urea, tiocarbonilo, boratos, boranos, boraza, sililo, siloxi, silaza y combinaciones de los mismos.

Apartado 2. El metodo del apartado 1, realizado en un solo reactor.

Apartado 3. El metodo del apartado 1, en donde la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de una base no nucleofila.

Apartado 4. El metodo del apartado 3, en donde la base no nucleofila comprende una piridina sustituida, diisopropiletilamina o piridina.

Apartado 5. El metodo del apartado 4, en donde la piridina sustituida comprende 2,6-lutidina, 2,6-di-terc- butilpiridina o 2,4,6-colidina.

Apartado 6. El metodo del apartado 3, en donde la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de un disolvente.

Apartado 7. El metodo del apartado 6, en donde el disolvente comprende acetato de isopropilo o diclorometano.

5

10

15

20

25

30

35

40

Apartado 9. El metodo del apartado 1, en donde R10 es H, y R9 es uno seleccionado del grupo que consiste en H, metilo y fenilo.

Apartado 10. El metodo del apartado 1, en donde R9 y Ri0 son H.

Apartado 11. El metodo del apartado 1, en donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de un disolvente.

Apartado 12. El metodo del apartado 11, en donde el disolvente comprende un disolvente aprotico.

Apartado 13. El metodo del apartado 12, en donde el disolvente aprotico comprende perfluorohexano, a,a,a-trifluorotolueno, pentano, hexano, ciclohexano, metilciclohexano, decahidronaftaleno, tetracloruro de carbono, dioxano, fluorotriclorometano, benceno, tolueno, trietilamina, disulfuro de carbono, eter diisopropflico, eter dietflico, eter t-butilmetflico, cloroformo, acetato de etilo, 1,2-dimetoxietano, eter 2- metoxietflico, tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano, tetrahidrofurano, cloruro de metileno, piridina, 2- butanona, acetona, hexametilfosforamida, N- metilpirrolidinona, nitrometano, dimetilformamida, acetonitrilo, sulfolano, dimetilsulfoxido, diisopropiletilamina, acetato de isopropilo, diclorometano, N,N-dimetilformamida o carbonato de propileno.

Apartado 14. El metodo del apartado 1, en donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de diisopropiletilamina y un disolvente seleccionado del grupo que consiste en acetato de isopropilo, diclorometano, 1,2-dimetoxietano, tetrahidrofurano y acetonitrilo.

Apartado 15. El metodo del apartado 1, en donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de diisopropiletilamina y acetato de isopropilo o diclorometano.

Apartado 16. El metodo del apartado 1, en donde R1 es =O R2 es H R3 es =O y R4 es H

Apartado 17. Un metodo de preparation de una molecula de formula V:

imagen15

imagen16

5

10

15

imagen17

(b) hacer reaccionar la molecula de formula VII con una molecula de formula IV:

imagen18

en donde

Apartado 18. El metodo del apartado 17, realizado en un solo reactor.

Apartado 19. El metodo del apartado 17, en donde la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de una base no nucleofila.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Apartado 21. El metodo del apartado 20, en donde la piridina sustituida comprende 2,6-lutidina, 2,6-di-terc- butilpiridina o 2,4,6-colidina.

Apartado 22. El metodo del apartado 20, en donde la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de un disolvente.

Apartado 23. El metodo del apartado 22, en donde el disolvente comprende acetato de isopropilo o diclorometano.

Apartado 24. El metodo del apartado 22, en donde el disolvente comprende diclorometano y se intercambia por acetato de isopropilo antes o durante la etapa (b).

Apartado 25. El metodo del apartado 17, en donde R10 es H, y R9 se selecciona del grupo que consiste en H, metilo y fenilo.

Apartado 26. El metodo del apartado 17, en donde R9 y Ri0 son H

Apartado 27. El metodo del apartado 17, en donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de un disolvente.

Apartado 28. El metodo del apartado 27, en donde el disolvente comprende un disolvente aprotico.

Apartado 29. El metodo del apartado 28, en donde el disolvente aprotico comprende perfluorohexano, a,a,a-trifluorotolueno, pentano, hexano, ciclohexano, metilciclohexano, decahidronaftaleno, tetracloruro de carbono, dioxano, fluorotriclorometano, benceno, tolueno, trietilamina, disulfuro de carbono, eter diisopropflico, eter dietflico, eter t-butilmetflico, cloroformo, acetato de etilo, 1,2-dimetoxietano, eter 2- metoxietflico, tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano, tetrahidrofurano, cloruro de metileno, piridina, 2- butanona, acetona, hexametilfosforamida, N metilpirrolidinona, nitrometano, dimetilformamida, acetonitrilo, sulfolano, dimetilsulfoxido, diisopropiletilamina, acetato de isopropilo, diclorometano, N, N-dimetilformamida o carbonato de propileno.

Apartado 30. El metodo del apartado 17, en donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de diisopropiletilamina y acetato de isopropilo o diclorometano.

Apartado 31. Un metodo de preparation de una molecula de formula III:

imagen19

que comprende:

5

10

15

20

25

30

imagen20

con anhfdrido trfflico,

en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en =O (H, H) y (H, OH);

R3 se selecciona del grupo que consiste en =O y OR5; o R2 y R3 pueden tomarse en conjunto para formar un radical de formula A-C(R7)(Rs)-O-B, donde A es un enlace al oxfgeno unido al carbono 28 y B es un enlace al carbono 26;

R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C4;

Apartado 32. El metodo del apartado 31, en donde la reaction con anhfdrido trfflico se lleva a cabo en presencia de una base no nucleofila.

Apartado 33. El metodo del apartado 32, en donde la base no nucleofila comprende una piridina sustituida, diisopropiletilamina o piridina.

Apartado 34. El metodo del apartado 33, en donde la piridina sustituida comprende 2,6-lutidina, 2,6-di-terc- butilpiridina o 2,4,6-colidina.

Apartado 35. Un metodo de preparation de una molecula de formula I:

5

10

15

imagen21

que comprende:

hacer reaccionar una molecula de formula III:

imagen22

con una molecula de formula IV:

RsC

N

en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en =O (H, H) y (H, OH);

R2 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, -C(=O)R6, -C(=O)OR6, -C(=O)NHRa, y -C(=S)OR6;

R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C4;

imagen23

5

10

15

20

25

R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, o R7 y R8 tomados en conjunto son =O;

R9 y Ri0 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquenilo, alquenilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquilo, alquilcicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquinilo, aralquilo, arilo, cicloalquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo, heterociclilo, aza, amida, amonio, oxa, tia, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosforilo, fosfinilo, fosfino, fosfonio, ceto, ester, alcohol, carbamato, urea, tiocarbonilo, boratos, boranos, boraza, sililo, siloxi, silaza y combinaciones de los mismos.

Apartado 36. El metodo del apartado 35, llevado a cabo en presencia de trietilamina, diisopropiletilamina, piridina, N-metilimidazol o 4-dimetilaminopiridina con la molecula de formula IV.

Apartado 37. El metodo del apartado 35, en donde R10 es H, y R9 se selecciona del grupo que consiste en H, metilo y fenilo.

Apartado 38. El metodo del apartado 35, en donde R9 y R10 son H

imagen24

que comprende:

hacer reaccionar una molecula de formula VI:

imagen25

con anhfdrido trfflico.

5

10

15

Apartado 40. El metodo del apartado 39, llevado a cabo en presencia de una base no nucleofflica.

Apartado 41. El metodo del apartado 40, en donde la base no nucleofila comprende una piridina sustituida, diisopropiletilamina o piridina.

Apartado 42. El metodo del apartado 41, en donde la piridina sustituida comprende 2,6-lutidina, 2,6-di-terc- butilpiridina o 2,4,6-colidina.

Apartado 43. Un metodo de preparation de una molecula de formula V:

imagen26

que comprende:

hacer reaccionar una molecula de formula VII:

imagen27

con una molecula de formula IV:

imagen28

5

10

15

20

25

30

35

40

en donde R9 y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquenilo, alquenilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquilo, alquilcicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquinilo, aralquilo, arilo, cicloalquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo, heterociclilo, aza, amida, amonio, oxa, tia, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosforilo, fosfinilo, fosfino, fosfonio, ceto, ester, alcohol, carbamato, urea, tiocarbonilo, boratos, boranos, boraza, sililo, siloxi, silaza y combinaciones de los mismos.

Apartado 44. El metodo del apartado 43, llevado a cabo en presencia de trietilamina, diisopropiletilamina,

piridina, N-metilimidazol o 4-dimetilaminopiridina con la molecula de formula IV.

Apartado 45. El metodo del apartado 43, en donde R10 es H, y R9 se selecciona del grupo que consiste en

H, metilo y fenilo.

Apartado 46. El metodo del apartado 43, en donde R9 y R10 son ambos H.

Apartado 47. Una composition que comprende una molecula de formula I:

imagen29

y un antioxidante, en donde

R1 se selecciona del grupo que consiste en =O (H, H) y (H, OH);

R3 se selecciona del grupo que consiste en =O y OR5; o R2 y R3 pueden tomarse en conjunto para formar un radical de formula A-C (R7)(Rs)-O-B, donde A es un enlace al oxfgeno unido al carbono 28 y B es un enlace al carbono 26;

R4 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo C1-C4;

R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, o R7 y R8 tomados en conjunto son =O; y

en donde R9 y R10 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquenilo, alquenilcicloalquenilo, alquenilcicloalquilo, alquilo, alquilcicloalquenilo, alquilcicloalquilo, alquinilo, aralquilo, arilo, cicloalquenilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcicloalquilo, cicloalquenilalquilo, heterociclilo, aza, amida, amonio, oxa, tia, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, fosforilo, fosfinilo, fosfino, fosfonio, ceto, ester, alcohol, carbamato, urea, tiocarbonilo, boratos, boranos, boraza, sililo, siloxi,

5

10

15

20

silaza y combinaciones de los mismos.

Apartado 48. La composicion del apartado 47, en la que el antioxidante comprende 3,5-di-terc-4-butilhidroxi tolueno, DL-a-tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo, 3-terc-butil-4-hidroxianisol, 2 terc-butil-4- hidroxianisol, o acido fumarico, o combinaciones de los mismos.

Apartado 49. Una composicion que comprende una molecula de formula V:

imagen30

y un antioxidante, en donde

Apartado 50. La composicion del apartado 49, en donde el antioxidante comprende 3,5-di-terc-4- butilhidroxitolueno, DL-a-tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo, 3-terc-butil-4-hidroxianisol, 2- terc-butil-4-hidroxianisol, acido fumarico, 2,6-di-t-butil-4-etilfenol, 2,6-di-t-butil-4-metoxifenol o combinaciones de los mismos.

Claims

5

10

1. Un metodo para preparar una composition que comprende

imagen1

y un antioxidante; comprendiendo el procedimiento:

(a) hacer reaccionar una molecula de formula:

imagen2

con anhfdrido trfflico para producir una molecula de Formula VII:

5

10

15

20

25

30

imagen3

(b) hacer reaccionar la molecula de Formula VII con una molecula de Formula IV:

imagen4

y

(c) anadir un antioxidante; en donde:

R9 y R10 son cada uno H;

las reacciones de las etapas (a) y (b) se realizan en un solo reactor; y

la etapa (b) se lleva a cabo en diisopropiletilamina y diclorometano o acetato de isopropilo.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de una base no nucleofila que comprende una piridina sustituida, diisopropiletil amina o piridina y en presencia de un disolvente, en donde el disolvente comprende acetato de isopropilo o diclorometano.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la base no nucleofila es 2,6-dimetilpiridina o diisopropiletilamina.
4. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el antioxidante se elige entre 3,5-di- terc-4-butilhidroxitolueno (BHT), DL-a-tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo, 3-terc-butil-4-hidroxianisol, 2-terc-butil-4-hidroxianisol y acido fumarico.
5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el antioxidante es 3,5-di-terc-4-butilhidroxi tolueno (BHT).