ES2639307T3 - Péptidos con propiedades potenciadoras de infección vírica y su uso - Google Patents

Abstract

Uso in vitro o ex vivo del péptido LAH4 que tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1 o de un derivado funcional del mismo que presente la capacidad de mejorar la eficacia de transducción de un virus o vector viral, para promover la infección de una célula eucariótica por un virus o un vector viral, en donde el derivado funcional comprende - 19 o más aminoácidos, en particular 20, 21 o más aminoácidos; - su extremo N-terminal comprende uno o más residuos de aminoácido cargados positivamente a pH 7,4, seleccionados en particular entre lisinas y/o argininas; y - una región helicoidal central seleccionada del grupo que consiste en a) una hélice apolar que alberga un grupo de residuos de aminoácido hidrofóbicos en un lado de la hélice y residuos de alanina consecutivos en el otro lado de la hélice, definiendo dichos residuos de alanina consecutivos un ángulo de 60 a 180º en la representación de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferiblemente un ángulo de 140º; o b) una hélice anfipática que alberga un conjunto de residuos de aminoácido hidrofóbicos en un lado de la hélice y de dos a cuatro residuos de histidina en el otro lado de la hélice, que definen un ángulo hidrofílico comprendido entre 60º y 180º en la representación de rueda de Schiffer-Edmundson y preferiblemente un ángulo de 140º.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos con propiedades potenciadoras de infeccion vffica y su uso

La presente invencion se refiere a peptidos y derivados funcionales de los mismos y a su uso para mejorar la eficacia de transduccion de virus en celulas diana.

Antecedentes de la invencion

Las estrategias de terapia genica a menudos se ven limitadas por bajas eficacias de transduccion de las celulas diana por parte de los vectores virales recombinantes. Los vectores retrovirales, y en particular los vectores lentivirales (LVs) basados en el virus de inmunodeficiencia humano 1 (VIH-1) son vehmulos prometedores para la terapia genica (D'Costa et al., 2009). Estos vectores se usan actualmente en aplicaciones clmicas para tratar diversas enfermedades tales como inmunodeficiencias, enfermedades neurodegenerativas o neurologicas, anemias, infeccion de VIH. Algunas de las aplicaciones de los vectores retrovirales se basan en la transduccion de celulas diana espedficas ex vivo, tal como celulas madre/progenitoras hematopoyeticas que expresan el marcador CD34. Un factor limitante con el uso de parffculas lentivirales recombinantes es la capacidad de obtener fftulos altamente infecciosos durante la produccion de parffculas de vector lentiviral recombinante. Un modo de solventar esta limitacion es concentrar el sobrenadante viral durante las etapas de purificacion (Rodrigues et al., 2007). Sin embargo, los protocolos de purificacion son diffciles de establecer para algunos LVs, dependiendo de las glicoprotemas de envoltura usadas para pseudotipar parffculas virales - como es el caso de los GALVTR-LVs (LVs pseudotipados con glicoprotema de envoltura de virus de la leucemia de mono gibon fusionada a la cola citoplasmica de la glicoprotema de envoltura de virus de leucemia de raton anfotropico (MLV-A) (Sandrin et al., 2002)). Por lo tanto, muchas preparaciones de vector lentiviral presentan un fftulo bajo y su eficacia de transduccion es limitada. Otro factor limitante es la capacidad del propio vector lentiviral para infectar celulas diana. Se pueden usar varias glicoprotemas de envoltura, tales como VSV-G, RD114TR, GALVTR, para pseudotipar vectores lentivirales y tener una capacidad de infeccion variable en celulas diana tales como celulas CD34+ (Sandrin et al., 2002). Una estrategia para solventar estas limitaciones es la adicion de cofactores para optimizar los protocolos de transduccion, como polfmeros cationicos (p.ej., polibrene) o fragmentos de fibronectina (p.ej., retronectina) (Davis et al., 2004; Pollok et al., 1999). La Patente de EE.UU. n° 7.759.467 describe un metodo para aumentar la eficacia de transduccion de celulas hematopoyeticas por retrovirus, que comprende la infeccion de las celulas en presencia de fibronectina o fragmentos de fibronectina. Sin embargo, el metodo propuesto no es totalmente satisfactorio por al menos dos razones. En primer lugar, los fragmentos de fibronectina usados para mejorar la eficacia de los retrovirus presentan desventajas economicas significativas, ya que habitualmente comprenden unos 270 o mas aminoacidos. Adicionalmente, el uso de fibronectina o de fragmentos de fibronectina requiere recubrir las placas de cultivo y precargar los sobrenadantes virales sobre los fragmentos de fibronectina inmovilizados. Estas dos etapas son diffciles de estandarizar y pueden conducir a una saturacion de la transduccion de la celula diana dependiendo de las concentraciones de fragmentos de fibronectina y de sobrenadante viral usadas (Novelli et al., 1999).

De forma destacable, los peptidos cationicos naturales denominados SEVI han sido identificados recientemente en el semen humano como potenciadores fuertes de la capacidad de infeccion del VIH-1 (Munch et al., 2007; Roan et al., 2009). Esta familia de peptidos tambien ha sido descrita en la solicitud de patente internacional n° PCT/EP2007/050727, que describe fragmentos de los residuos de aminoacido 240 - 290 de la fosfatasa acida prostatica que promueven la infeccion viral de una celula.

La solicitud de patente internacional n° PCT/FR02/01772 describe peptidos cationicos anfipaticos que presentan una carga absoluta superior o igual a 2 a pH 7,4, y que comprenden al menos una porcion hidrofflica, comprendiendo dicha porcion al menos tres residuos que son capaces de protonarse a un pH inferior a 7,4 con el objetivo de transferir un acido nucleico o una protema en una celula. Este documento no describe ni sugiere el uso de dichos peptidos para mejorar la eficacia de transduccion de un virus o de un vector viral. Ademas, estos peptidos cationicos anfipaticos incluyen actividades antibioticas (Mason et al., 2009).

El objetivo de los inventores ha sido proporcionar los medios para mejorar la eficacia de transduccion de un virus o de un vector viral, por ejemplo mejorando la administracion de un gen a celulas diana. Puesto que los peptidos son interesantes por sus propiedades biodegradables, por su tamano reducido, la simplicidad de caracterizacion y la produccion a gran escala, se ha llevado a cabo una investigacion intensiva para identificar alternativas a la fibronectina y a los peptidos SEVI.

Sumario de la invencion

Los presentes inventores han descubierto que los peptidos particulares definidos en las reivindicaciones tienen la propiedad de promover la eficacia de transduccion de virus en celulas eucarioticas y en particular en celulas progenitoras/madre hematopoyeticas primarias humanas.

Segun un aspecto, la invencion se refiere al uso in vitro o ex vivo del peptido LAH4 o a un derivado funcional del mismo, segun se define en las reivindicaciones, para promover la infeccion de una celula eucariotica por un virus o un vector viral.

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Segun otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro o ex vivo para infectar celulas eucarioticas con un virus o un vector viral, que comprende poner en contacto las celulas con el virus o vector viral en presencia del peptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo, tal como se define en las reivindicaciones.

Segun otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vivo o ex vivo para aumentar la eficacia de la transferencia genetica a celulas diana con vectores virales, que comprende poner en contacto las celulas diana con el vector viral en presencia del peptido LAH4 o un derivado funcional del mismo, tal como se define en las reivindicaciones, para promover la transferencia de secuencias de acido nucleico (tales como un gen(es), cADNs, siARNs, shARNs, secuencias que permiten la produccion de oligonucleotidos antisentido) en las celulas diana.

Segun un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo para diagnosticar una infeccion por un virus en un sujeto, que comprende incubar una muestra del sujeto con una celula eucariotica y el peptido lAH4 o un derivado funcional del mismo, tal como se define en las reivindicaciones, para amplificar cualquier virus contenido en dicha muestra, e identificar el virus amplificado.

Segun un aspecto adicional, la invencion se refiere a nuevos peptidos derivados de LAH4, tal como se define en las reivindicaciones.

Segun otro aspecto, la invencion se refiere a un peptido como se define en las reivindicaciones para uso en terapia genica para promover la infeccion de una celula eucariotica por un virus o un vector viral. Ademas se refiere, tal como se define en las reivindicaciones, al uso en combinacion con un virus o vector viral en terapia genica.

Descripcion detallada de la invencion

En el contexto de la presente invencion, el termino “el peptido LAH4” se refiere al peptido con la secuencia de aminoacido que consiste en la SEQ ID NO: 1.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino “derivado funcional de LAH4” y las declinaciones del mismo significan cualquier peptido cuya secuencia ha sido disenada en base a la estructura primaria del peptido LAH4 y que tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral. En una realizacion particular, un derivado funcional de LAH4 es un peptido que tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus encapsulado en una envoltura gAlV, RD114, MLV, VSV o GP64 en celulas eucarioticas, en particular celulas humanas, de raton, de rata, de mono, de perro o de hamster, en particular una celula CD34+ humana. En una realizacion espedfica, el derivado funcional de LAH4 es un peptido que tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus encapsulado en una envoltura GALV en celulas CD34+ humanas.

Un derivado funcional de LAH4 segun la invencion presenta las siguientes caractensticas:

- comprende 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos. En una realizacion particular, el peptido comprende entre 20 y 30 aminoacidos, en particular entre 21 y 26, en particular entre 24 y 26;

- su extremo N-terminal comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4. En una realizacion particular, el extremo N-terminal comprende uno o dos residuos cargados positivamente a pH 7,4. En una realizacion particular, dichos aminoacidos son lisinas y/o argininas; y

- su region central forma una helice cuando se representa segun la representacion de rueda de Schiffer- Edmundson (Schiffer et al., 1967), que es bien conocida en la tecnica y corresponde a los 18 residuos de aminoacido que probablemente forman el dominio central del peptido. En una realizacion particular, la helice es una helice a segun la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson. En una realizacion adicional, el peptido segun la invencion es un peptido cationico anfipatico o un peptido que comprende una helice apolar. Segun esta realizacion, la region helicoidal central del peptido corresponde a los residuos de aminoacido que tienen una fuerte tendencia a formar una helice (Georgescu et al, 2010). En esta realizacion, la region helicoidal central del peptido puede ser:

- una helice apolar que alberga un grupo de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y residuos de alanina consecutivos en el otro lado de la helice, definiendo dichos residuos de alanina consecutivos un angulo de 60 a 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferencialmente un angulo de 140°

- o, una helice anfipatica que alberga un grupo de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y de dos a cuatro residuos de histidina en el otro lado de la helice, que definen un angulo hidrofflico de entre 60° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferiblemente un angulo de 140°.

En una realizacion particular, los aminoacidos del derivado funcional de LAH4 se seleccionan del grupo que consiste en alanina, histidina, leucina y lisina.

En el contexto de la presente invencion, el termino “peptido anfipatico” denota un peptido que comprende aminoacidos hidrofobicos e hidrofflicos, que son susceptibles de definir al menos una region hidrofflica y al menos una region hidrofobica distinta, segun se representa en la rueda de Schiffer-Edmundson.

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En el contexto de la presente invencion, el termino “peptido helicoidal apolar” denota un peptido que comprende alanina y residuos de aminoacido hidrofobicos que son susceptibles de definir al menos una region hidrofobica distinta, segun se representa en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson. Los residuos hidrofobicos representativos que pueden estar presentes en los peptidos de la invencion tienen un mdice de hidropatia superior o igual a +1,9 (Kyte et al, 1982). Por consiguiente, los residuos hidrofobicos representativos que pueden estar presentes en los peptidos de la invencion incluyen valina, isoleucina y leucina. En una realizacion preferida, los residuos hidrofobicos son residuos de leucina.

En el contexto de la presente invencion, el termino “peptido cationico” denota un peptido que tiene una carga positiva absoluta a pH 7,4. En una realizacion preferida, las cargas positivas son proporcionadas por residuo(s) de arginina y/o lisina. Los aminoacidos naturales cationicos no codificados por el codigo genetico tal como la ornitina tambien pueden proporcionar cargas negativas en los peptidos de la invencion.

En una realizacion alternativa, los restos cargados positivamente son acoplados a residuos de aminoacido. Dichos restos cargados positivamente incluyen, por ejemplo, etilenimina, espermina y espermidina, como es bien conocido en el campo.

Los peptidos derivados funcionales de LAH4 descritos en la presente memoria presentan la propiedad de aumentar la eficacia de transduccion de virus y vectores virales, y pueden ser seleccionados facilmente por un especialista en la tecnica mediante el uso, por ejemplo, de los metodos descritos en los ejemplos. En la presente memoria se describen metodos para identificar dichos derivados funcionales del peptido lAH4. En una realizacion particular, los metodos incluyen

- seleccionar el peptido LAH4 o un derivado funcional conocido del mismo (por ejemplo uno de los mencionados a continuacion en la presente memoria en las SEQ ID NOs: 1-27), un virus o vector viral de interes y una celula de interes;

- modificar el peptido LAH4 o el derivado funcional conocido del mismo para preparar un peptido variante; y

- medir la eficacia de transduccion de una celula por parte del virus o vector viral en presencia del peptido variante,

en donde el peptido variante se considera un derivado funcional cuando se determina una transduccion eficaz.

Los metodos tambien pueden incluir una etapa de comparar la eficacia de transduccion del virus o vector viral obtenido con el peptido variante con la eficacia de transduccion obtenida sin el peptido variante, o con la eficacia de transduccion obtenida con un peptido conocido por su capacidad para mejorar la eficacia de transduccion del virus o del vector viral en la celula.

La etapa de modificar el peptido LAH4 o un derivado funcional conocido del mismo puede comprender modificaciones tales como la mutacion de un primer residuo de aminoacido del peptido LAH4 o del derivado funcional conocido del mismo para preparar un peptido variante. En una realizacion variante, la modificacion incluye modificar covalentemente uno o mas residuos de aminoacido del peptido LAH4 o de un derivado funcional conocido del mismo, como se muestra mas adelante. Segun otra variante, la modificacion comprende la sustitucion de los aminoacidos L naturales por aminoacidos D (en una o mas posiciones del peptido, y en particular en todas las posiciones).

Los ejemplos de derivados funcionales del peptido LAH4 que pueden evaluarse usando dichos metodos incluyen los derivados funcionales preferidos mostrados en las SEQ ID NOs: 2-27. Los mismos derivados funcionales de las SEQ ID NOs: 2-27 y el peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1 tambien pueden usarse como base para el diseno de otros derivados funcionales segun la invencion. Ademas, los peptidos de las SEQ ID NOs: 1-27 que pueden usarse como controles en los metodos para identificar derivados funcionales segun la invencion.

En una realizacion particular de la invencion, los peptidos comprenden residuos de aminoacido seleccionados del grupo que consiste en alanina, leucina, histidina, arginina y lisina.

En una realizacion particular del uso y metodos de la invencion, el extremo N-terminal del peptido comprende una, dos o tres carga(s) positiva(s). En una variante espedfica de esta realizacion, la(s) carga(s) positiva(s) del extremo N-terminal del peptido es(son) proporcionada(s) por residuo(s) de arginina o lisina. En una variante adicional, los residuos cargados positivamente se encuentran en el final del extremo N. En una realizacion variante, el(los) primer(os) aminoacido(s) (p.ej. el primer residuo, o el primero y el segundo, o el primero y el tercero, etc.) es(son) residuo(s) neutro(s).

En una realizacion adicional del uso y metodos de la invencion, el residuo mas C-terminal es una alanina y en un aspecto adicional, cuando el extremo C del peptido comprende residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4, estan localizados junto a la alanina C-terminal o estan localizados en el extremo mas N-terminal.

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Los residuos representativos que pueden proporcionar cargas positivas en el extremo C son los residuos arginina y/o lisina.

En una realizacion particular del uso y los metodos de la invencion, el peptido comprende cuatro residuos de histidina. En una realizacion espedfica, dichos residuos de histidina forman dos pares de histidinas adyacentes en una helice representada segun la rueda de Schiffer-Edmundson. Segun una variante de esta realizacion, el peptido derivado de LAH4 comprende solo residuos de leucina o solo residuos de alanina en la porcion de la helice a definida por el angulo mas pequeno entre los pares de histidina.

Segun una realizacion espedfica, el peptido comprende cuatro residuos de histidina y tiene la secuencia

(K/R)a(K/R)b(K/A/L)cLdL(A/H/L)(A/H/L)(A/L)L(A/H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/L)(A/L)(H/L)(A/L)(H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/H/L)

(A/H/L)eLf(K/R)gK/R)hAi

en donde:

a, b, c y d representan 0 o 1, con la condicion de que a+b+c+d es igual a 2 o 3, o preferiblemente 4; e, f, g, h e i representan independientemente 0 o 1, siendo e+f+g+h+i igual a 2 o 3 o 4 o preferiblemente 5.

En una realizacion variante, los residuos de histidina son sustituidos por otros grupos que se protonan a pH acido: estos incluyen grupos que contienen imidazol o residuos de acido diaminopropionico.

Los peptidos espedficos usados en la invencion pueden ser lo representado en la SEQ ID NO: 1 a 27:

LAH4: KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA (SEQ ID NO: 1)

LAH4-L1: KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA (SEQ ID NO: 2)

LAH4-L1-dKC: KKALLAHALHLLALLALHLAHALA (SEQ ID NO: 3)

LAH4-L1-R: RRALLAHALHLLALLALHLAHALRRA (SEQ ID NO: 4)

LAH4-L0: KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA (SEQ ID NO: 5)

LAH4-L2: KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA (SEQ ID NO: 6)

LAH4-L3: KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA (SEQ ID NO: 7)

LAH4-L4iso: KKALLHALALLHAALLAHHLALALKKA (SEQ ID NO: 8)

LAH4-L5: KKALLHLALLHAALLAHLAALHLKKA (SEQ ID NO: 9)

LAH4-L6iso: KKALLHLALLLAALHALHLAALHLKKA (SEQ ID NO: 10)

LAH4-A1: KKALLAHALHLLAALALHLAHLLKKA (SEQ ID NO: 11)

LAH4-A2: KKALLLAALHHLAALALHLAHLLKKA (SEQ ID NO: 12)

LAH4-A3: KKALLLAALHHLLALAHHLAALLKKA (SEQ ID NO: 13)

LAH4-A4: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 14)

LAH4-A5: KKALLHALLAHLAALLHALLAHLKKA (SEQ ID NO: 15)

LAH4-A6iso: KKALLHALLAALLAHLHALLAHLKKA (SEQ ID NO: 16)

LAH4-A4-K1N: KALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 17)

LAH4-A4-K3N: KKKLLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 18)

LAH4-A4-dKC: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLA (SEQ ID NO: 19)

LAH4-A4-d1aa: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKK (SEQ ID NO: 20)

LAH4-A4-d2aa: KKLLHAALAHLLALAHHLLALLKK (SEQ ID NO: 21)

LAH4-A4-d2Caa: KKALLHAALAHLLALAHHLLALKK (SEQ ID NO: 22)

LAH4-A4-d3aa: KKLHAALAHLLALAHHLLALLKK (SEQ ID NO: 23)

LAH4-A4-d5aa: KKLHAALAHLLALAHHLLAKK (SEQ ID NO: 24)

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LAH2-A6: KKALLHAALAHLLALAAALLALLKKA (SEQ ID NO: 25)

K2-L10A12-K2: KKALLAAALAALLALAAALLALLKKA (SEQ ID NO: 26)

LAH4-A4-Leu: KKLLLHALLAHLLALLHHLLALLKKL (SEQ ID NO: 27).

Segun un segundo aspecto, la invencion se refiere a nuevos peptidos derivados de LAH4. En este segundo aspecto, la invencion se refiere a un peptido anfipatico que es un derivado funcional del peptido LAH4 de SEQ ID NO: 1, en donde el derivado funcional tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, que comprende

- 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos. En una realizacion particular, el peptido comprende entre 20 y 30 aminoacidos, en particular entre 21 y 26, en particular entre 24 y 26;

- un extremo N-terminal que comprende de uno a tres residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4;

- al menos dos residuos de histidina, en particular cuatro residuos de histidina, que definen un angulo hidrofflico comprendido entre 80° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, mas espedficamente un angulo de 140°;

- siendo seleccionados los otros aminoacidos del peptido entre residuos de alanina y leucina;

en donde en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson dicho peptido comprende solo residuos de alanina entre los residuos de histidina mas distantes en el angulo mas pequeno definido por dichos residuos de histidina.

Estos nuevos peptidos del segundo aspecto son derivados funcionales del peptido LAH4 tal como se han definido anteriormente.

En una realizacion particular del segundo aspecto, el angulo hidrofflico esta comprendido entre 120 y 180°, siendo el angulo mas preferido 140°.

Segun una realizacion particular de este segundo aspecto, el extremo N-terminal del peptido de la invencion comprende una, dos o tres (en particular una o dos) carga(s) positiva(s) a pH 7,4 (proporcionadas en particular por residuos de arginina y lisina, preferiblemente residuos de lisina). Los residuos cargados positivamente preferiblemente estan localizados en el final del extremo N-terminal, y preferiblemente de forma contigua si hay presente mas de uno residuo cargado positivamente.

En otra realizacion particular del segundo aspecto, el peptido de la invencion presenta un extremo C-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4. Los residuos representativos que pueden proporcionar cargas positivas en el extremo C-terminal son residuos de arginina y/o lisina.

En una realizacion adicional del segundo aspecto, el residuo C-terminal es una alanina y en un aspecto adicional, cuando el extremo C-terminal del peptido comprende residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4 estan localizados junto a la alanina C-terminal o estan localizados en el extremo mas N-terminal.

Segun otra realizacion particular del segundo aspecto, el peptido de la invencion comprende cuatro residuos de histidina. En una realizacion espedfica, dichos residuos de histidina forman dos pares de histidinas adyacentes en una helice a representada segun la rueda de Schiffer-Edmundson.

En una realizacion adicional del segundo aspecto, el peptido derivado de LAH4 es un isomero del peptido LAH4, es decir, contiene el mismo numero de residuos de alanina, histidina, leucina y lisina, en un orden diferente en la secuencia primaria.

Los peptidos representativos del segundo aspecto cubiertos por esta definicion se muestran en las SEQ ID NOs: 1125 y 27. Por tanto, la invencion se refiere a un peptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1125 y 27.

En un tercer aspecto, la invencion se refiere a nuevos peptidos derivados de LAH4 que presentan la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, que comprenden:

- 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos. En una realizacion particular, el peptido comprende entre 20 y 30 aminoacidos, en particular entre 21 y 26, en particular entre 24 y 26;

- un extremo N-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4;

- una helice apolar que alberga un grupo de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y residuos de alanina consecutivos en el otro lado de la helice, que definen un angulo de 60 a 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferencialmente un angulo de 140°.

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En una variante particular de este tercer aspecto, los otros aminoacidos del peptido se seleccionan entre residuos de alanina y leucina.

Estos nuevos peptidos del tercer aspecto son derivados funcionales del peptido LAH4 tal como se ha definido anteriormente.

Estos peptidos contienen una helice apolar, es decir, los residuos de aminoacido de la helice son hidrofobicos (o apolares). Los residuos de aminoacido hidrofobicos representativos contenidos preferiblemente en la helice apolar del peptido de la invencion comprenden residuos de alanina, isoleucina, leucina y valina, en particular residuos de alanina y leucina.

En una realizacion particular del tercer aspecto, los aminoacidos del grupo de aminoacidos hidrofobicos son seleccionados del grupo que consiste en residuos de leucina y alanina. En otra realizacion particular, los aminoacidos del grupo de aminoacidos hidrofobicos son residuos de leucina.

El peptido K2-L10A12-K2 (SEQ ID NO: 26) es un peptido representativo segun esta definicion.

Segun una realizacion particular del tercer aspecto, el extremo N-terminal del peptido de la invencion comprende una, dos o tres (en particular una o dos) carga(s) positiva(s) a pH 7,4 (proporcionadas en particular por residuos de arginina o lisina, preferiblemente residuos de lisina). Los residuos cargados positivamente preferiblemente estan localizados en el final del extremo N, y preferiblemente de forma contigua si hay presente mas de un residuo cargado positivamente.

En otra realizacion particular del tercer aspecto, el peptido de la invencion presenta un extremo C-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4. Los residuos representativos que pueden proporcionar cargas positivas en el extremo C-terminal son residuos de arginina y/o lisina.

En una realizacion adicional del tercer aspecto, el residuo C-terminal es una alanina y en un aspecto adicional, cuando el extremo C-terminal del peptido comprende residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4, estan localizados a continuacion de la alanina C-terminal o estan localizados en el extremo mas N-terminal.

Segun un cuarto aspecto, la invencion se refiere a un peptido anfipatico que es un derivado funcional de LAH4, en donde el derivado funcional de LAH4 tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, que comprende

- 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos. En una realizacion particular, el peptido comprende entre 20 y 30 aminoacidos, en particular entre 21 y 26, en particular entre 24 y 26;

- un extremo N-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4;

- al menos dos residuos de histidina, preferiblemente cuatro residuos de histidina, que definen un angulo hidrofflico comprendido entre 140° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, mas espedficamente un angulo de 140°;

en donde en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson dicho peptido comprende solo residuos de leucina entre los residuos de histidina mas distantes en el angulo mas pequeno definido por dichos residuos de histidina.

En una realizacion particular de este cuarto aspecto, los otros aminoacidos del peptido se seleccionan entre residuos de alanina y de leucina.

El peptido de este cuarto aspecto no el peptido LAH4-L4 de la SEQ ID NO: 36 y no es el peptido LAH4-L6 de la SEQ ID NO: 37.

En una realizacion particular de este cuarto aspecto, el peptido de la invencion es un isomero del peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1, cuya secuencia de aminoacido consiste en 8 residuos de alanina, 4 de histidina, 10 de leucina y 4 de lisina.

Segun una realizacion particular de este cuarto aspecto, el extremo N-terminal del peptido de la invencion comprende una, dos o tres (en particular una o dos) carga(s) positiva(s) a pH 7,4 (proporcionadas en particular por residuos de arginina o lisina, preferiblemente residuos de lisina). Los residuos cargados positivamente preferiblemente estan localizados al final del extremo N-terminal, y preferiblemente de forma contigua si esta presente mas de un residuo cargado positivamente.

En otra realizacion particular del cuarto aspecto, el peptido de la invencion presenta un extremo C-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4. Los residuos representativos que pueden proporcionar cargas positivas en el extremo C-terminal son residuos de arginina y/o lisina.

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En una realizacion adicional del cuarto aspecto, el residuo C-terminal es una alanina y en un aspecto adicional, cuando el extremo C-terminal de peptido comprende residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4, estan localizados junto a la alanina C-terminal o estan localizados en el extremo mas N-terminal.

Los peptidos representativos cubiertos por este cuarto aspecto incluyen los peptidos LAH4-L4iso, LAH4-L5 y LAH4- L6iso (SEQ ID NOs: 8-10). Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere a un peptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8-10.

Estan disponibles varios metodos para la produccion e peptido de la invencion y son conocidos por los especialistas en la tecnica. Segun un primer metodo, una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido de la invencion es expresada en bacterias tales como E. coli o cualquier otro sistema de expresion. A continuacion el peptido es purificado segun metodos convencionales. De acuerdo a un segundo metodo, el peptido es sintetizado usando un sintetizador (vease, por ejemplo, Bechinger, 1996).

Los peptidos de la invencion son derivados del peptido LAH4. Aunque este ultimo es reconocido como promotor de la transfeccion de acidos nucleicos en celulas eucarioticas, sus propiedades ventajosas en la promocion de la transduccion de virus no ha sido descrita o sugerida nunca. Aqu los inventores muestran que el peptido LAH4 y sus derivados promueven la infeccion viral de una celula diana y potencian la capacidad de infeccion de celulas por virus.

Otras realizaciones adicionales de la invencion son peptidos derivados del peptido LAH4 o de sus derivados funcionales, segun se describe a continuacion, con al menos una de las siguientes modificaciones covalentes:

- acilacion, acetilacion, enlace a un grupo portador macromolecular no peptfdico; preferiblemente en el extremo N;

- amidacion, enlace a un grupo portador macromolecular no peptfdico; preferiblemente en el extremo C;

- glicosilacion; preferiblemente en las cadenas laterales de los aminoacidos;

- enlace a una protema adaptadora, que promueve la captacion del peptido al interior de las celulas, o enlace a un grupo hidrofobico, preferiblemente un lfpido, un acido graso, un dansilo, un grupo carbobenzoxilo o t- butiloxicarbonilo;

- oxidacion, sulfatacion, esterificacion, formacion de lactona y/o fosforilacion.

La invencion tambien cubre multfmeros, por ejemplo dfmeros o tnmeros, de los peptidos descritos anteriormente. En el contexto de la presente invencion, un “multfmero” denota peptidos LAH4 funcionales que han sido unidos covalentemente unos a otros. Los dfmeros, que son dos peptidos LAH4 funcionales unidos entre sf, pueden obtenerse por ejemplo mediante introduccion de grupos tiol en el extremo C o N - estos grupos pueden usarse entonces para generar dfmeros por formacion de un puente de disulfuro. Por supuesto, tambien pueden usarse otros reactivos para generar dichos multimeros.

Segun la invencion, el peptido LAH4 o un derivado funcional del mismo (p.ej., una cualquiera de las SEQ ID NOs: 127) esta amidado en su extremo C o no esta modificado en su extremo C.

Los grupos portadores macromoleculares preferidos son polietilen glicol (PEG), polioxialquilen glicol, esteres de polisorbato, mannano, amilopectina, pululano, nanopartfculas de hidrogel de polisacaridos hidrofobizados auto- agregados, polilisina, anticuerpos o albumina.

En la presente memoria tambien se describen derivados retro, inverso o retro-inverso de los peptidos definidos anteriormente, que retienen las propiedades promotoras de la transduccion descritas en la presente memoria. Los peptidos pueden comprender al menos un aminoacido D, asf como iminoaminoacidos y aminoacidos raros. La descripcion tambien se refiere a mimeticos peptfdicos de los peptidos segun la invencion. Estos pueden caracterizarse por ejemplo por una modificacion de uno o mas enlaces peptfdicos, por ejemplo, por un enlace peptfdico inverso o por un enlace de ester. Pero incluye tambien peptidos con beta o gamma aminoacidos, etc...

Los peptidos de la invencion promueven la infeccion viral de una celula. Tal como se usa en la presente memoria, “virus” se refiere a virus naturales y a virus artificiales. Por ejemplo, paramixovirus (tal como el virus respiratorio sincitial, virus del sarampion), ortomixovirus (tal como el virus de la gripe), flavivirus (tal como el virus de la hepatitis C), hepadnavirus (tal como el virus de la hepatitis B), rabdovirus (tal como la rabia, VSV), coronavirus (tal como SARS), togavirus (tal como el virus Sindbis, el virus Chikungunya), filovirus (tal como el virus del ebola), arenavirus, poxvirus, herpesvirus, bunyavirus, bornavirus, arterivirus, baculovirus. Segun una realizacion particular, los virus son virus artificiales, que por ejemplo pueden comprender un acido nucleico disenado para terapia genica. En una realizacion preferida, los virus son virus con envoltura. En realizaciones preferidas, los virus son retrovirus y en particular lentivirus. Los inventores han demostrado que los peptidos de la presente invencion pueden promover la infeccion de celulas eucarioticas con vectores lentivirales (LVs) derivados de VIH-1 que comprenden envolturas pseudotipadas con glicoprotemas procedentes de virus estomatis vesicular (VSV), retrovirus endogeno de felino

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modificado (RD114), virus de leucemia de raton anfotrofico (MLV), virus de leucemia de mono gibon modificado (GALV) e incluso con glicoprotemas procedentes de baculovirus AcMNPV (GP64), siendo el ultimo un virus espedfico normalmente para celulas de insecto. En vista de la eficacia de la transduccion obtenida con los peptidos de la invencion y de la diversidad de las glicoprotemas usadas en los experimented descritos, es evidente que los presentes peptidos pueden usarse como medio general para aumentar las eficacias de transduccion de virus de envoltura en celulas eucarioticas.

Las celulas diana pueden ser cualquier clase de celulas eucarioticas tales como celulas de mairnfero, en particular celulas humanas, de raton, de rata, de mono, de perro o de hamster. En una realizacion particular, la celula diana es una celula CD34+, en particular una celula CD34+ tomada de un paciente que necesita terapia genica de su linaje hematopoyetico. Otros tejidos/celulas diana representativos, no limitativos, son las celulas cutaneas, de musculo, tugado, ojo, neuronas, linfocitos, fibroblastos, queratinocitos, adipocitos, mioblastos, hepatocitos, celulas tumorales, y de forma mas general cualquier celula eucariotica que sea conocida o que se identifique como diana de un virus.

La actividad de los peptidos con un virus dado y una celula diana dada se puede determinar usando un ensayo indicador, por ejemplo usando un ensayo de luciferasa o un ensayo de expresion GFP tal como se muestra en los ejemplos. En particular, los peptidos se pueden evaluar segun el siguiente metodo:

- las celulas (p.ej., celulas HCT116 o celulas 293T) se llevan a una placa de cultivo, por ejemplo una placa de 12 pocillos (p.ej. a 105 celulas/pocillo) y se mantienen durante una noche a 37°C);

- se incuban virus que comprenden el transgen GFP en ausencia o en presencia de diversas concentraciones de peptidos (p.ej., 3, 6 y/o 12 pg/mL) durante 15 minutos a 37°C;

- los virus, tanto solos como mezclados con los peptidos, son mezclados a continuacion con las celulas;

- opcionalmente, tras un tiempo suficiente para que se produzca la infeccion, por ejemplo 6 horas despues de la etapa previa, se puede eliminar el medio y sustituirlo por medio de cultivo fresco;

- las celulas son cultivadas otros 2 a 3 dfas;

- la eficacia de transduccion se determina monitorizando la expresion de GFP usando medios adaptados, por ejemplo citometna de flujo.

En la presente memoria tambien se describe un metodo para identificar peptidos utiles para promover la transduccion de una celula por un vector (encapsulado). Dicho metodo puede implementar las etapas proporcionadas en el parrafo anterior para identificar peptidos que potencian la infeccion viral en celulas al menos en un factor de 2, mas preferiblemente en un factor de 3, 5 o 10 con respecto a la infeccion viral en celulas en ausencia del peptido.

En los usos y metodos de la presente invencion, el peptido LAH4 y los derivados funcionales del mismo se usan en una cantidad efectiva. En la presente invencion, el termino “cantidad efectiva” del peptido denota la cantidad requerida para aumentar significativamente la eficacia de transduccion de un vector viral. Dicha cantidad efectiva generalmente dependera del peptido particular usado, de la celula diana y del vector viral implementado. Dicha cantidad puede determinarse segun metodos bien conocidos en la tecnica, en particular segun el metodo anterior que implementa un ensayo indicador y que se ilustra en los ejemplos. Por ejemplo, los inventores han demostrado que la concentracion optima de LAH4-L1 necesaria para promover la transduccion de celulas CD34+ con GALVTR- LV es de aproximadamente 12 pg/mL (concentracion final en el medio de transduccion).

Segun un aspecto adicional, la descripcion se refiere a un complejo de un peptido LAH4 o a un derivado funcional del mismo con una partteula vmca, en particular una partteula vmca con envoltura, mas particularmente con un vector viral con envoltura para terapia genica. Adicionalmente, otro aspecto de la descripcion se refiere a un metodo para preparar dicho complejo, que comprende mezclar el peptido con una partteula viral.

Segun otro aspecto, la descripcion se refiere a una mezcla de un peptido LAH4 o un derivado funcional del mismo con una partteula vmca (en particular una partteula vmca con envoltura, mas particularmente un vector viral con envoltura para terapia genica) y con una celula. Adicionalmente, otro aspecto de la descripcion se refiere a un metodo para preparar dicha mezcla, que comprende mezclar el peptido con la partteula viral y la celula.

Los peptidos segun la invencion pueden usarse en composiciones farmaceuticas. De esta manera, la presente descripcion se refiere a una composicion que comprende un peptido como el definido anteriormente y un vehteulo farmaceuticamente aceptable adecuado. Las composiciones farmaceuticas contienen uno o mas de los peptidos segun la invencion, o una sal fisiologicamente aceptable del peptido(s). Las composiciones farmaceuticas tambien pueden contener agentes auxiliares farmaceuticos habituales que contribuyen, por ejemplo, a la solubilidad, la estabilidad o la esterilidad de la composicion, o que incrementan la eficacia de la captacion en el organismo.

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En la presente memoria tambien se describe un peptido como el definido anteriormente, para uso como medicamente. En un ejemplo particular, el medicamento se usa para aumentar la eficacia de un vector viral de terapia genica (D'Costa et al., 2009).

La forma y el contenido de la composicion farmaceutica que contiene el peptido(s) dependen de la ruta de administracion. Preferiblemente, se seleccionan formulaciones galenicas y formas de aplicacion en las que el peptido(s) alcance(n) el sitio diana en condiciones no degradadas. El medicamento puede administrarse localmente en forma de inyeccion, gotas, spray, comprimidos, supositorios, crema, pomada, gel, etc. Es posible llevar a cabo la administracion en forma de bolo o repetidamente a lo largo de un periodo de tiempo.

El peptido, complejo o composicion farmaceutica o medicamento descritos en la presente memoria pueden administrarse in vivo, por ejemplo mediante inyeccion por via intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal o intracraneal. La descripcion tambien se refiere a un metodo para terapia genica, que comprende administrar a un paciente que lo necesite un peptido, complejo o composicion farmaceutica como los descritos anteriormente. El metodo comprende tambien la administracion de un vector vmco para terapia genica antes, despues o simultaneamente a la administracion del peptido de la invencion.

En la presente memoria se describe adicionalmente una composicion que comprende un peptido como el descrito anteriormente en un medio de cultivo, estando dicha composicion destinada a uso como reactivo promotor de infeccion para facilitar la transduccion de una celula con un virus o un vector viral, en particular un virus o vector viral con envoltura. De esta manera, la descripcion tambien se refiere a un reactivo promotor de infeccion vmca que comprende un peptido segun la presente invencion, en un medio adecuado, en particular en un medio de cultivo adecuado.

Segun otro aspecto, en la presente memoria se describe el uso del peptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo como un antibiotico.

Segun otro aspecto, en la presente memoria se describe el uso de un derivado funcional de LAH4 como peptido de penetracion celular (CPP, del ingles “cell penetrating peptide”). En particular, el peptido se usa como sistema de administracion para compuestos bioactivos tales como acido nucleico, por ejemplo ADN de plasmido, siARNs, oligonucleotidos antisentido, y otros compuestos bioactivos (peptidos o protemas, en particular peptidos o protemas terapeuticos, peptidos marcadores, anticuerpos, etc.). El CPP puede estar unido covalentemente o no covalentemente al compuesto bioactivo. En un ejemplo particular, el peptido es un derivado funcional de peptido LAH4.

En la presente memoria se describen ademas acidos nucleicos que codifican para los peptidos de la invencion y vectores de expresion para los peptidos inventivos, tales como plasmidos, cosmidos y vectores virales.

Los peptidos descritos en la presente memoria se usan para un amplio rango de aplicaciones terapeuticas y diagnosticas y son herramientas de laboratorio valiosas para el desarrollo y el estudio de la entrada de virus en celulas.

En la presente memoria se describe adicionalmente el uso del peptido LAH4 o de un derivado funcional del mismo como potenciador general de infecciones virales o de eficacias de transduccion para la practica rutinaria de laboratorio o para estrategias terapeuticas genicas basadas en sistemas de vector viral. Los peptidos potencian la entrada de vectores disenados para terapia genica en celulas in vitro, ex vivo o in vivo. Pueden administrarse en combinacion con un vector viral para terapia genica y mediar la entrada del vector viral en la celula diana. Los peptidos tambien son utiles in vitro porque promueven la captacion de virus en las celulas. De esta manera resultan utiles como herramienta para estudiar virus y sus mecanismos de accion. Otro ejemplo es el uso del peptido LAH4 o de sus derivados funcionales para estrategias diagnosticas, especialmente las de virus tipo VIH-1 y otros virus con envoltura. El peptido LAH4 y sus derivados funcionales potencian los tftulos de infeccion de las partmulas vmcas y por tanto potencian la captacion celular, permitiendo la deteccion de contaminaciones virales residuales. Por tanto, pueden usarse para aislar partmulas virales de muestras tales como suero, sangre, plasma, esperma o tejidos derivados de sujetos, en particular de un sujeto humano que se sospeche que esta infectado por un virus, mas espedficamente por un virus con envoltura. Los peptidos segun la invencion tambien pueden usarse para estudiar partmulas virales presentes en agua, comida (gripe aviar, SARS) o cualquier virus (con envoltura) usado en bioterrorismo. El aislamiento exitoso de virus podna verse favorecido varias veces en comparacion con los metodos diagnosticos rutinarios. Los metodos preferidos son los ensayos de afinidad de union y los metodos para eliminar virus cuantitativamente de disoluciones que se sospecha o que se sabe que comprenden virus a fin de obtener disoluciones seguras. En dichos metodos, los peptidos de la invencion preferiblemente estan unidos covalentemente a un soporte o una columna.

En la presente memoria se describen adicionalmente polinucleotidos que codifican para los peptidos segun la invencion, estando dichos polinucleotidos constituidos preferiblemente por ADN, ARN, ADN genomico o PNA. Otro aspecto de la descripcion se refiere a vectores que contienen el polinucleotido descrito en la presente memoria y celulas hospedantes modificadas geneticamente que contienen el vector descrito en la presente memoria.

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Los peptidos de la invencion pueden usarse para potenciar en general la entrada de partteulas vmcas en celulas diana. Los peptidos tambien pueden usarse como potenciador general de la tasa de infeccion/transduccion de partteulas virales con envoltura que portan glicoprotemas de envoltura ajenas (pseudopartteulas) como la protema G del Virus de Estomatitis Vesicular (VSV-G), la protema Env del MLV, etc. Los mencionados peptidos de la invencion promueven las tasas de infeccion de todas las partteulas de virus con envoltura analizadas. Esto nos permite llevar a cabo experimented de infeccion, especialmente en celulas primarias, que no habfan sido posibles anteriormente. Los peptidos de la invencion son por tanto utiles como herramientas de laboratorio in vitro.

Los peptidos de la invencion tambien pueden usarse para potenciar las tasas de administracion genica en estrategias de terapia genica ex vivo o in vivo basadas en sistemas de vectores, en particular en sistemas de vectores con envoltura. Por consiguiente, la descripcion tambien se refiere a un peptido como el descrito anteriormente para uso en terapia genica para promover la infeccion de una celula eucariotica con un virus o un vector viral en un sujeto que lo necesite. El peptido de la invencion puede usarse en combinacion con un virus o un vector viral en terapia genica. El peptido puede ser para administracion simultanea, separada o secuencial con el vector de terapia genica. La generacion de vectores retrovirales altamente infecciosos para terapia genica, especialmente para terapia genica ex vivo de celulas madre, es un procedimiento difteil. En particular, las eficacias de transduccion de vectores retrovirales para celulas madre son bajas. En presencia de los peptidos de la invencion, sin embargo, las celulas y las lmeas celulares madre pueden ser transducidas eficazmente con vectores retrovirales, dando como resultado mayores eficacias para la administracion genica en la celula diana en comparacion con las muestras que no contienen peptido.

En los metodos in vitro y ex vivo de la presente invencion, el peptido puede usarse con o sin inmovilizacion previa en un soporte solido. De forma ventajosa, no se requiere ninguna inmovilizacion para obtener un aumento de la eficacia de transduccion.

En una realizacion particular de los metodos in vitro de la invencion, se usan otros medios de mejora de la transduccion junto con el peptido LAH4 o el derivado funcional del mismo. Por ejemplo, en una realizacion particular, la eficacia de transduccion se incrementa con un peptido segun la invencion y con Retronectina o un peptido SEVI.

En la presente memoria se describe ademas un kit que comprende un peptido como el definido anteriormente y un virus o un vector viral.

La invencion se describe adicionalmente a traves de los siguientes ejemplos.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Capacidad de LAH4-L1 para potenciar los titulos infecciones de LV. A) Se usaron GALVTR-LVs, MLV-A-LVs, RD114TR-LVs, VSV-G-LVs y VLPs para transducir celulas HCT116 (1,2x10E5 TU/mL o 200 ng/mL de VIH-1 p24 para VLPs). Se usaron GP64-Lvs para transducir celulas 293T (0,8x10E5 TU/mL). Las transducciones se llevaron a cabo en ausencia o en presencia de 3, 6 o 12 pg/mL de LAH4-L1. Los datos se muestran como porcentajes de celulas GFP+ con desviaciones estandar (SD) de condiciones triplicadas. B) Los datos obtenidos en (A) se presentan como el numero de veces de incremento mediado por LAH4-L1 con las condiciones de control normalizadas a uno.

Figura 2. Determinacion de la concentracion optima de LAH4-L1 para promover la transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LVs. A) Celulas hCD34+ pre-activadas fueron transducidas con GALVTR-LVs (2x10E6 TU/mL, MOI 16) pre-incubados o no con diversas concentraciones de LAH4-L1. Se representan las eficacias de transduccion (cuadrados negros) como los porcentajes de celulas GPF+ obtenidos 5 dfas despues de la transduccion. La mortalidad (cteculos grises) se estimo dos dfas despues de la transduccion tras marcaje de ADN celular con 7-ADD. B) Celulas hCD34+ fueron transducidas con dos dosis diferentes de GALVTR-LVs (1 y 2x10E6 TU/mL, MOI 8 y 16) pre-incubados o no con la concentracion optima de LAH4-L1 (12 pg/mL). Los datos se obtienen de seis donantes de cordon umbilical diferentes (tres donantes por cada dosis de GALVTR-LV). Las barras indican el valor medio de las distribuciones.

Figura 3. Evaluacion de la seguridad de LAH4-L1 en el modelo de ratones de “Sistema Inmune Humano” (BALB-Rag/YC).

Antes de la inyeccion en siete ratones rag-/-/YC-/- de la misma camada, las celulas hCD34+ se dejaron sin transducir (triangulo) o fueron transducidas con GALVTR-LVs (MOI 8), en presencia de 12 pg/mL de LAH4-L1 (cuadrado) o de 20 pg/cm2 de Retronectina (cfrculo). A) Doce semanas despues de la inyeccion, se monitorizo el nivel de injerto efectivo de ratones HIS (BALB-Rag/YC) siguiendo los porcentajes de celulas hCD45+ (GFP+) transducidas en la sangre, la medula osea (BM, del ingles “bone marrow”), el bazo y el timo usando citometrta de flujo. B y C) Estudio de linfopoyesis T humana in vivo en el timo siguiendo la expresion de marcador TCRa/p humano en el subconjunto de celulas hCD45+ y la expresion de los marcadores CD4 y CD8 humanos en el subconjunto de celulas hCD3+. La linfopopoyesis T se analiza en las celulas sin transducir (B) o en las celulas transducidas (C). D a G) Estudio del desarrollo linfoide B humano, monocitos humanos y celulas asesinas naturales humanas in vivo en el bazo (D y E) y en la BM (F y G) siguiendo respectivamente la expresion de marcador CD19, CD14 y CD56 humano en el subconjunto de celulas hCD45+ sin transducir (D y F) o transducido (E y G). Los progenitores hematopoyeticos

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humanos tambien son analizados en la BM siguiendo la expresion de marcador CD34 humano en el subconjunto de celulas hCD45+.

Figura 4. Transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LV en presencia de derivados de LAH4-L1.

A) Tabla de secuencias de peptidos de diversos derivados de LAH4-L1 (la secuencia D-LAH4-L1 es identica a la lAh4-L1 pero con aminoacidos D). B) las celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/mL, MOI 8) pre-incubadas o no (Simulado) con LAH4-L1 o diferentes derivados de LAH4-L1 (12 pg/mL). Las eficacias de transduccion se expresan como porcentajes de la condicion de control de LAH4-L1. C) La mortalidad se estimo dos dfas despues de la transduccion tras marcado de ADN celular con 7-AAD. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por duplicado con SD.

Figura 5. Transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LVs en presencia de isomeros de LAH4-L1.

Tabla de secuencias de peptidos de la serie L (A) y la serie A (D) de isomeros de LAH4-L1. B y E) representacion de rueda helicoidal de Schiffer-Edmundson de la region de helice a anfipatica (aa6 a aa23) de los isomeros de LAH4- L1. El nombre del peptido y el angulo polar formado por los residuos de Histidina hidrofflicos (subrayados) se mencionan en el interior de la proyeccion de la rueda. C y F) celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/ mL, MOI 8) pre-incubadas con 12 pg/mL de LAH4-L1 o diferentes isomeros de LAH4-L1 de la serie L (C) o de la serie A (F). Las eficacias de transduccion se representan como los porcentajes de celulas GFP+ obtenidas 5 dfas despues de la transduccion. Los datos se expresan como el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por duplicado con SD.

Figura 6. Curvas dosis-respuesta de LAH4-L1, LAH4-A4 y LAH4-A5 en la transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LVs. A) celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/mL, MOI 8) pre- incubadas o no con varias concentraciones de LAH4-L1, LAH4-A4 y LAH4-A5 (3, 6 y 12 pg/mL). Las eficacias de transduccion se representan como los porcentajes de celulas GFP+ con SD obtenidos 5 dfas post-transduccion. B) La mortalidad se estimo como en la Figura 4C.

Figura 7. Transduccion de celulas CD34+ humanas con GALBTR-LVs en presencia de derivados de histidina de LAH4-A4. A) Tabla de secuencias de peptidos de LAH4-A4, LAH2-A4, LAH2-A6 y K2-L10A12-K2. B) Representacion de rueda helicoidal de Schiffer-Edmundson de la region de helice a anfipatica (aa6 a aa23) de los derivados de histidina de LAH4-A4. El nombre del peptido y el angulo polar formado por los residuos de Histidina hidrofflicos (subrayados) se mencionan en el interior de la proyeccion de la rueda. C) celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/ mL, MOI 8) pre-incubadas con LAH4-A4 o con diferentes isomeros de histidina de LAH4-A4 (12 pg/mL). Las eficacias de transduccion se expresan como los porcentajes de la condicion de control de LAH4-A4. D) La mortalidad se estimo como en la Figura 4C. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por duplicado con SD.

Figura 8. Transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LVs en presencia de derivados de lisina de LAH4-A4. A) Tabla de secuencias de peptido de LAH4-A4, LAH4-A4-dKN, LA4-A4-K1N, LAH4-A4-K3N y LAH4-A4- dKC. B) celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/mL, MOI 8) pre-incubadas con LAH4-A4 o con diferentes derivados de lisina de LAH4-A4 (12 pg/mL). Las eficacias de transduccion se expresan como los porcentajes de la condicion de control de LAH4-A4. C) La mortalidad se estimo como en la Figura 4C. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por duplicado con SD.

Figura 9. Transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LVs en presencia de varios derivados de LAH4-A4. A) Tabla de secuencias de peptidos. B) celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/mL, MOI 8) pre-incubadas con LAH4-A4 o diferentes derivados de LAH4-A4 (12 pg/mL). Las eficacias de transduccion se expresan como los porcentajes de la condicion de control de LAH4-A4. C) La mortalidad se estimo como en la Figura 4C. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por duplicado con SD.

Figura 10. Transduccion de celulas CD34+ humanas con GALVTR-LVs en presencia de LAH4-A4 o peptidos SEVI. A) celulas hCD34+ fueron transducidas con GALVTR-LVs (10E6 TU/mL, MOI 8) pre-incubadas con LAH4-A4 (12 pg/mL, 2,2 pM) o peptido SEVI (20 pg/mL, 2,2 pM). Las eficacias de transduccion se representan como los porcentajes de celulas GFP+ obtenidas 5 dfas post-transduccion. B) La mortalidad se estimo como en la Figura 4C. Datos obtenidos de tres donantes de sangre de cordon diferentes por duplicado. Las barras indican el valor medio de las distribuciones.

Figura 11. Transfeccion de celulas 293T con pEGFP en presencia de peptidos LAH4-A4, LAH4-L1 o K2- L10A12-K2. Se mezclo pEGFP-C1 (1 pg) en 50 pL de disolucion de NaCl 150 mM con 3 pg, 4,5 pg, 6 pg o 9 pg de LAH4-A4, o con 6 pg de LAH4-L1, o con 6 pg de K2-L10A12-K2. A continuacion, se diluyo la mezcla de ADN/peptido en 200 pL de DMEM sin FCS y se cargo en monocapas de celulas. 3 horas post-transfeccion se reemplazo el medio con DMEM que contema un 10% de FCS. 48 h despues, se estimaron las eficacias de transfeccion monitorizando la expresion de GFP mediante citometna de flujo. Los datos son el promedio de dos experimentos independientes llevados a cabo por duplicado con la SD.

Figura 12. Efecto de LAH4-A4 sobre los pseudotipos RD114TR-LVs y GALV-MLVs. Celulas hCD34+ fueron transducidas con sobrenadantes crudos de RD114TR-LVs (3,8x10E6 TU/mL) o de GALV-MLVs de vector retroviral de mono azul (5x10E5 TU/mL) en ausencia o en presencia de 12 pg/mL de los peptidos LAH4-L1, LAH4-L4iso, LAH4-A4 o LAH4-A5. Las eficacias de transduccion se representan como el porcentaje de celulas GFP+ con SD 5 obtenidas 5 dfas post-transduccion. Datos obtenidos de dos donantes de sangre de cordon diferentes por duplicado para el RD114TR-LV o de tres donantes de sangre de cordon diferentes sin duplicar para el GALV-MLV.

Ejemplos

Materiales y metodos Peptidos y Reactivos

10 Los peptidos fueron producidos mediante smtesis de peptidos en fase solida Fmoc estandar, se purificaron mediante HPLC RP preparativo y se analizaron mediante HPLc y MS (Genecust, Dudelange, Luxemburgo). Todos los peptidos fueron amidados en su extremo C-terminal, excepto el LAH4-A4-dNH2, y el SEVI. 7-amino-actinomicina D (7-AAD) se obtuvo en Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francia). La retronectina procedfa de Takara Bio Inc. (St- Germain-en-laye, Francia). El plasmido pEGFP-C1 era de Clontech (St-Germain-en-laye, Francia). Los anticuerpos 15 eran de Miltenyi (Pans, Francia).

Ademas de los peptidos representados en las SEQ ID NOs: 1-27, tambien se han usado los siguientes peptidos en el presente estudio:

LAH4-A4-P14: KKALLHAALAHLLPLAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 28)

LAK4-L1: KKALLAKALKLLALLALKLAKALKKA (SEQ ID NO: 29)

20 LAH8-L1: HHALLAHALHLLALLALHLAHALHHA (SEQ ID NO: 30)

LAH4-L1-dK: ALLAHALHLLALLALHLAHALA (SEQ ID NO: 31)

LAH4-L1-dKN: ALLAHALHLLALLALHLAHALKKA (SEQ ID NO: 32)

LAH4-A4-dKN: ALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 33)

LAH2-A4: KKALLAAALAALLALAHHLLALLKKA (SEQ ID NO: 34)

25 SEVI: GIHKQKEDSRLQFGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY (SEQ ID NO: 35)

Cultivo de lmea celular

Se cultivaron celulas HCT116 derivadas de carcinoma colorrectal humano (CCL-247, ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y celulas 293T (Merten et al, 2011) a 37°C, 5% de CO2 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM+Glutamax, Invitrogen/Gibco, Cergy-Pontoise, Francia) suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado 30 termicamente (Invitrogen/Gibco).

Produccion de vector viral y determinacion de titulo de vector

Se generaron vectores lentivirales (LVs) derivados de VIH-1 mediante transfeccion transitoria de fosfato de calcio de celulas 293T con cuatro plasmidos: el plasmido vector de transferencia que expresa GFP (pCCLsin-cPPT-hPGK- eGFP-WPRE) (Follenzi et al, 2000), el plasmido que codifica VIH-1 Rev (pK-Rev) (Merten et al, 2011), el plasmido 35 que codifica VIH-1 gagpol (pKLgagpol) (Merten et al, 2011), y la construccion apropiada de glicoprotema de envoltura (GP): pMDG (Gp de virus de estomatitis vesicular (Naldini et al, 1996)) para generar VSV-G-LVs; pHCMV- RD114TR (Gp de retrovirus endogeno felino modificado (Sandrin et al, 2002) para generar RD114TR-LVs; pBA- Ampho (GP de virus de leucemia de raton anfotropica) para generar MLV-A-LVs, pBA_AcMNPV_gp64 (GP de baculovirus) para generar GP64-LVs y pBA-GALVanfoKana (GP de virus de leucemia de mono gibon modificada 40 (Sandrin et al, 2002) para generar GALVTR-LVs. Se recolectaron los sobrenadantes virales 48 h post-transfeccion, se filtraron (0,45 pm), se dividieron en alfcuotas y se almacenaron a -80°C. Los tftulos infecciosos se determinaron mediante citometna de flujo (FacsCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) como se ha descrito previamente (Kutner et al, 2009). Resumidamente, se transdujeron celulas HCT116 con diluciones en serie de reserva de vector, se lavaron y 3 dfas despues se determinaron las eficacias de transduccion monitorizando la expresion de GFP. Para 45 la transduccion de celulas hCD34+, el tftulo final se expreso como unidades de transduccion por mililitro (TU/mL) y se definio la multiplicidad de infeccion (MOI). Los tftulos de partfculas ffsicas se determinaron midiendo el contenido de capsida p24 de VIH-1 (ng/mL) usando un kit ELISA comercial (PerkinElmer life science, Boston, MA, EE.UU.).

Los sobrenadantes virales de vector retroviral MLV pseudotipado con glicoprotemas de envoltura GALV fueron obtenidos de la lmea celular productora PG13-MFG-GFP (Merten 2004).

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Transduccion de linea celular

Se llevaron a placa celulas HCT116 (celulas 293T para transduccion con GP64-LVs) en placas de 12 pocillos (105 celulas/pocillo). Al siguiente d^a, los LVs fueron incubados en ausencia o en presencia de varias concentraciones de LAH4-L1 (3, 6 o 12 |jg/mL) durante 15 minutos a 37°C. A continuacion, los LVs fueron cargados sobre monocapas celulares. 6 horas post-transduccion, las celulas fueron lavadas y cultivadas adicionalmente de 2 a 3 dfas. Se determinaron las eficacias de transduccion monitorizando la expresion de GFP usando citometna de flujo.

Fuente, cultivo y transduccion de celulas CD34+ humanas

Se obtuvieron celulas CD34+ progenitoras de sangre de cordon umbilical mediante seleccion inmunomagnetica (Miltenyi Biotec, Paris, Francia) a partir de fracciones de celulas mononucleares de muestras de sangre de cordon obtenidas de alumbramientos sin complicaciones del Hospital Louise Michel, Evry, Francia, cumpliendo la legislacion de Bioetica Nacional Francesa. En primer lugar, las celulas hCD34+ fueron pre-activadas durante una noche en medio X-vivo 20 (Lonza, Levallois Perret, Francia) suplementado con citocinas como se ha descrito previamente (Charrier et al, 2011). A continuacion, se llevaron a placa celulas hCD34+ pre-activadas en placas de 48 pocillos (2,5x104 celulas/pocillo en 100 jL de medio de pre-activacion). La transduccion se completo anadiendo 100 jL de sobrenadantes LV pre-incubados 15 minutos a 37°C en ausencia o en presencia de peptidos. 6 h post-transduccion, todas las condiciones fueron diluidas a 1 mL con medio de diferenciacion (X-Vivo 20 con 50 U/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Gibco/Invitrogen), SCF (25 ng/mL), ligando Flt-3 (50 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) e IL-3 (10 ng/mL) (R&D Systems, Lille, Francia)). 2 dfas post-transduccion, la mita de la suspension celular fue reemplazada con medio de diferenciacion fresco. Se evaluaron las tasas de supervivencia de celulas descartadas mediante citometna de flujo tras etiquetar con 7-AAD. De 5 a 6 dfas post-transduccion, se evaluo la eficacia de transduccion siguiendo el porcentaje de expresion de GFP en la poblacion celular usando citometna de flujo. En el caso de un protocolo de transduccion lentiviral llevado a cabo en presencia de Retronectina, usamos el protocolo de precarga dinamica de GALVTR-LVs sobre placas recubiertas de retronectina (20 jg/cm2) como se ha descrito previamente (Jacome et al, 2009).

Produccion y monitorizacion de ratones HIS (BALB-Rag/YC)

Los ratones BALB/c rag2-/-yC-/- fueron alojados en condiciones libres de patogenos en Genethon y fueron tratados de acuerdo a las grnas del comite etico animal bajo el protocolo CE11003 (fechas de aprobacion 03/01/2011- 03/01/2012). Resumidamente, se inyectaron celulas hCD34+ (105 celulas/raton) transducidas o sin transducir intra- hepaticamente en cachorros recien nacidos BALB/c rag2-/-yC-/- irradiados. De once a trece semanas post-inyeccion, los ratones HIS (BALB-Rag/yC) fueron sometidos a eutanasia y se monitorizo el nivel de injerto eficaz de celulas hematopoyeticas humanas mediante citometna de flujo en la sangre, el timo, el bazo y la medula osea.

Transfeccion de lmea celular con derivados de LAH4-L1

Se llevaron a placa celulas 293T (1,5x10E5/pocillo) en placas de 48 pocillos el dfa antes de la transfeccion. Para la transfeccion, se mezclo 1 jg de pEGFP-C1 con la cantidad deseada de peptido en 50 jL de disolucion de NaCl 150 mM, se sometio a vortice y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, la mezcla ADN/peptido se diluyo en 200 jL de DMEM sin FCS y se cargo en monocapas de celulas. 3 horas post-transfeccion, el medio fue reemplazado con DMEM que contema un 10% de FCS. 48 h despues, la eficacia de transfeccion fue estimada monitorizando la expresion de GFP usando citometna de flujo.

Resultados y Discusion

Efecto de LAH4-L1 sobre las transducciones de celula diana con LVs prototipo usados en terapia genica.

Para estudiar el efecto de LAH4-L1 sobre la capacidad de infeccion de un LV, se transdujeron celulas HCT116 (o celulas 293T para GP64-LVs) con GALVTR-LVs, RD114TR-LVs, MLV-A-LVs y VSV-G-LVs (Figura 1A). Tal como se muestra en la Figura 1B, LAH4-L1 promueve la capacidad de infeccion del LV en diferente grado, observandose el mayor efecto para los GALVTR-LVs. De forma interesante, las partfculas de tipo vmco (VLPs), correspondientes a LVs producidos en ausencia de cualquier construccion de glicoprotema de envoltura, son incapaces de transducir celulas diana, incluso en presencia de LAH4-L1 (Figura 1A). Este resultado indica que la actividad de LAH4-L1 sobre los LVs depende del establecimiento de un mecanismo de entrada a la celula mediado por receptor.

Efecto de LAH4-L1 sobre la transduccion de progenitores hematopoyeticos humanos con GALVTR-LVs.

Los GALVTR-LVs se usan habitualmente en protocolos de terapia genica disenados para ser dirigidos a dianas de progenitores hematopoyeticos humanos (Jacome et al, 2009). Por tanto, se obtuvieron celulas CD34+ humanas a partir de muestras de sangre de cordon umbilical (UCB) y fueron transducidas con GALVTR-LVs en ausencia o en presencia de diversas concentraciones de LAH4-L1. La concentracion optima de LAH4-L1 necesaria para promover la transduccion de celulas hCD34+ se definio como 12 jg/mL (Figura 2A), ligeramente superior a la observada en celulas HCT116 (Figura 1A). No observamos ningun efecto citotoxico del LAH4-L1 por debajo de 32 jg/mL (Figura 2A). Adicionalmente, la transduccion de celulas hCD34+ en presencia de LAH4-L1 aumenta proporcionalmente a la entrada de GALVTR-LV y es reproducible de un donante de UCB a otro (Figura 2B).

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Monitorizacion de ratones HIS (BALB-rag/YC) con injertos de celulas hCD34+ transducidas con GALVTR-LV: evaluacion de la seguridad del peptido LAH4-L1.

El uso de ratones inmunodeficientes BALB/c rag2-/-yC-/- recien nacidos para la inyeccion de celulas hCD34+ da lugar a una reconstitucion robusta del sistema inmune humano. Los animales resultantes son denominados ratones de “Sistema Inmune Humano” (HIS) (BALB-Rag/yC) (Legrand et al, 2008). Este modelo animal es util para la evaluacion de la seguridad de compuestos que han estado en contacto con progenitores hematopoyeticos. Por tanto, decidimos estudiar la calidad del injerto de celulas hematopoyeticas en el modelo rag2-/-/yC-/- para celulas hCD34+ que han sido transducidas con GALVTR-LVs en presencia de LAH4-L1 o de Retronectina como control. Tal como se muestra en la Figura 3A, doce semanas despues de la inyeccion en ratones rag2-/-/yC-/-, las celulas CD45+ humanas, transducidas en presencia de LAH4-L1 o Retronectina, son facilmente detectables en la sangre, la medula osea (BM), el bazo y el timo. Para excluir cualquier efecto citotoxico o negativo del LAH4-L1 sobre la poblacion celular humana total, se monitorizo el nivel de injerto efectivo en ratones HIS (BALB-Rag/yC) para celulas humanas no transducidas (Figuras 3B-D-F) y tambien para celulas humanas transducidas (Figuras 3C-E-G). Tal como se muestra en las Figuras 3B y 3C, todos los ratones exhibieron timopoyesis humana en el timo, como evidencian los porcentajes de expresion de TCRa/p humano, celulas T humanas doble-positivas CD4/CD8 y positivas individuales CD4 y CD8 (Figuras 3B-C). El bazo y la BM de los ratones (Figuras 3D a 3G) conteman una poblacion grande de celulas CD19+ humanas que indican un desarrollo activo de linfoides B humanos, asf como una poblacion de monocitos humanos y celulas asesinas naturales. Los progenitores hematopoyeticos humanos (celulas hCD34+ y hCD45+) tambien son detectables en la BM (Figuras 3F-G). En conjunto, no observamos ningun efecto citotoxico o negativo del LAH4-L1 sobre la reconstitucion del sistema inmune humano en estos ratones. Observamos un desarrollo normal de los diferentes subconjuntos de celulas del sistema inmune humano, tanto en celulas transducidas como no transducidas, lo que indica que el LAH4-L1 es un aditivo de cultivo seguro y eficaz.

Estudios de funcion estructural de LAH4-L1.

Se han sintetizado derivados de LAH4-L1 para entender mejor la funcion espedfica de los residuos de lisina e histidina a la hora de potenciar la capacidad de infeccion del lV (Figura 4A). Tal como se muestra en la Figura 4B, la sustitucion de los cuatro residuos de histidina por 4 residuos de lisina (LAK4-L1) es perjudicial para la mejona de la transduccion de celulas CD34+ con GALVTR-LVs pero no es debido a un fuerte efecto citotoxico (Figura 4C). En nuestras condiciones de cultivo a pH neutro, los residuos de histidina del LAH4-L1 no estan protonados, lo que permite que el LAH4-L1 adopte una orientacion transmembrana. Mientras que en el LAK4-L1 los residuos de lisina a lo largo de todo el peptido estan protonados a pH neutro, lo que seguramente hace que este no adopte una orientacion transmembrana. Ademas, el LAK4-L1 es ineficaz a pesar de la presencia de nueve cargas cationicas a pH neutro. Esto sugiere con rotundidad que el LAH4-L1 actua a traves de un mecanismo molecular que no puede estar restringido exclusivamente a la neutralizacion de cargas repulsivas en la superficie viral y de membrana celular.

A continuacion, centramos nuestra atencion en los dos residuos de lisina presentes en ambos extremos del LAH4- L1. La sustitucion de los cuatro residuos de lisina por cuatro residuos de arginina (LAH4-L1-R) no presenta un efecto negativo. El LAH4-L1-R es tan eficaz como el LAH4-L1 para promover la transduccion de celulas hCD34+ con GALVTR-LVs (Figura 4B), sin citotoxicidad aparente (Figura 4C). Por el contrario, la sustitucion de los cuatro residuos de lisina por residuos de histidina (LAH8-L1) es perjudicial. Por lo tanto, la presencia de cargas cationicas a pH neutro (lisina o arginina) parece necesaria para potenciar la capacidad de infeccion de LV. Para determinar cuales de los residuos de lisina son cruciales, los del extremo N-terminal o los del C-terminal, se disenaron tres derivados de LAH4-L1 (Figura 4A): LAH4-L1-dK (no lisina), LAH4-L1-dKN (eliminacion de los residuos de lisina N- terminales) y LAH4-L1-dKC (eliminacion de los residuos de lisina C-terminales). Tal como se muestra en la Figura 4B, la transduccion de celulas hCD34+ con GALVTR-LV no es detectable en presencia de LAH4-L1-dK y LAH4-L1- dKN. La ausencia de residuos de lisina en el extremo N-terminal del LAH4-L1 es perjudicial. Por el contrario, LAH4- L1-dKC promueve la transduccion de celulas hCD34+ tan eficazmente como LAH4-L1.

Para definir si se pueden usar aminoacidos D en lugar de aminoacidos L, se sintetizo un peptido LAH4-L1 con aminoacidos D (D-LAH4-L1). Tal como se muestra en la Figura 4B, D-LAH4-L1 sigue promoviendo la transduccion lentiviral, aunque con una menor eficacia (43%) que LAH4-L1.

Diseno y evaluacion de isomeros de LAH4-L1 que albergan residuos de leucina o alanina entre el angulo (de 60° a 180°) comprendido entre los residuos de histidina en la representacion de rueda de Schiffer- Edmundson.

Se ha preparado una serie de peptidos isomeros de LAH4-L1 (Figuras 5A y D). La primera caractenstica de estos isomeros de LAH4-L1 es la diferencia en el angulo comprendido por los residuos de histidina (de 60 a 180°) cuando el peptido adopta una conformacion de helice a a pH neutro (Figuras 5B y E). La segunda caractenstica es la eleccion de residuos de aminoacido localizados entre los dos pares de residuos de histidina adyacentes cuando el peptido adopta una conformacion de helice a. Estos residuos consisten en residuos de leucina para serie L (Figura 5B) y en residuos de alanina para la serie A (Figura 5E). Por consiguiente, la nomenclatura de peptido refleja el numero de residuos de alanina o de leucina que estan presentes entre los dos pares de residuos de histidina adyacentes en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson. Por ejemplo, el peptido denominado LAH4-A4 es

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el peptido que alberga cuatro residuos de alanina entre los dos pares de residuos de histidina adyacentes que producen un angulo hidrofflico de 140° (Figura 5E). Todos estos peptidos han sido evaluados en relacion a su capacidad para promover la transduccion de celulas hCD34+ con gAlVtR-LVs. Cabe destacar, en las series L y A, que los peptidos mas eficaces albergan un angulo hidrofflico de 140°, esto es LAH4-L4 y LAH4-A4. LAH4-A5, con un angulo hidrofflico de 160°, tambien es altamente eficaz. Estos datos han sido confirmados con curvas de dosis- respuesta (Figura 6A). Para una concentracion de 3 y 6 pg/mL, el LAH4-A4 es aproximadamente cuatro veces mas eficaz que LAH4-L1 sin citotoxicidad aparente (Figura 6B).

Estudios de funcion estructural de LAH4-A4.

Para estudiar la funcion de los residuos de histidina, se disenaron tres derivados de LAH4-A4 (Figura 7A): LAH2-A4, que alberga solo dos residuos de histidina, que definen un angulo hidrofflico de 100° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson (Figura 7B); LAH2-A6, que alberga solo dos residuos de histidina, que definen un angulo hidrofflico de 140° (Figura 7B) y K2-L10-A12-K2, un peptido helicoidal apolar con residuos de lisina en cada extremo de la helice. Este peptido corresponde a un LAH4-A4 en el que todos los residuos de histidina han sido reemplazados por residuos de alanina (Figura 7A). Tal como se muestra en la Figura 6C, LAH2-A6 promueve la transduccion de celulas hCD34+ con GALVTR-LV de forma tan eficaz como el LAH4-A4, sin citotoxicidad aparente (Figura 7D). Por el contrario, LAH2-A4 no es funcional. Este peptido alberga un angulo no optimo (100°) comprendido entre los dos residuos de histidina en la representacion de rueda de Edmundson (Figura 7B). Cabe destacar que el peptido K2-L10A12-K2 promueve un 17% el nivel de transduccion de hCD34+ respecto al LAH4-A4. Por tanto, los residuos de histidina mejoran la eficacia del peptido LAH4-A4 pero no son estrictamente necesarios para promover la transduccion lentiviral.

Para definir mejor la funcion de los residuos de lisina, tanto en el extremo N-terminal como en el C-terminal de LAH4-A4, se disenaron cuatro derivados de LAH4-A4 (Figura 8A): LAH4-A4-dKN (eliminacion de los residuos de lisina N-terminales), LAH4-A4-K1N (eliminacion de solo un residuo de lisina N-terminal), LAH4-A4-K3N (sustitucion de la alanina de la posicion 3 por una lisina) y LAH4-A4-dKC (eliminacion de los residuos de lisina C-terminales). En presencia de LAH4-A4-dKN, la transduccion de celulas hCD34+ con GALVTR-LVs no es detectable (Figura 8B). Esta ausencia de transduccion no es la consecuencia de un fuerte efecto citotoxico (Figura 8C). La presencia de solo un residuo de lisina ubicado en el extremo N-terminal de LAH4-A4-K1N es suficiente para restaurar el 60% del nivel de transduccion de hCD34+ respecto a LAH4-A4. Ademas, el efecto del LAH4-A4 no se ve mejorado por la adicion de una lisina extra en el extremo N-terminal. De hecho, LAH4-A4-K3N no es tan eficaz como LAH4-A4 (Figura 8B).

Para definir la secuencia activa minima en LAH4-A4, se disenaron peptidos mas cortos (Figura 9A). Tal como se muestra en la Figura 9B, la eliminacion de la alanina C-terminal (LAH4-A4-d1aa) disminuye ligeramente la eficacia del LAH4-A4. La eliminacion de un residuo de aminoacido en ambos lados del peptido (LAH4-A4-d2aa) reduce la eficacia al 30% en comparacion con el LAH4-A4. Finalmente, la eliminacion de 2 residuos de aminoacido en el la C- terminal (LAH4-A4-d2Caa) o de 3 residuos de aminoacido (LAH4-A4-d3aa) o de 5 residuos de aminoacido (LAH4- A4-d5aa) disminuye la eficacia por debajo del 15% en comparacion con el LAH4-A4. En conclusion, un pequeno acortamiento de la longitud del peptido LAH4-A4 es perjudicial para la promocion de la transduccion lentiviral de celulas hCD34+.

Para determinar si los 4 residuos de alanina que definen el LAH4-A4 son los unicos 4 residuos de alanina necesarios para definir la potencia del LAH4-A4, se han reemplazado todos los demas residuos de alanina (posiciones 3, 8, 16 y 26) incluidos en el LAH4-A4 por residuos de leucina (LAH4-A4-Leu). Este peptido sigue siendo activo pero es dos veces menos potente que el LAH4-A4 (Figura 9B).

A continuacion, para determinar si la estructura helicoidal de los derivados de LAH4 es crucial para promover la transduccion lentiviral, se ha disenado un peptido que alberga una prolina en el medio de la helice (posicion 14) (LAH4-A4-P14). Tal como se muestra en la Figura 9b, la insercion de la prolina rompedora de la helice elimina el 80% de la transduccion lentiviral, lo que sugiere un papel crucial de la estructura de helice del LAH4-A4 en la promocion de la transduccion lentiviral.

Puesto que todos los derivados de LAH4 evaluados estan amidados, se ha sintetizado un peptido LAH4-A4 sin amidacion (LAH4-A4-dNH2). Tal como se muestra en la Figura 9B, el LAH4-A4 amidado es aproximadamente dos veces mas eficiente que en ausencia de amidacion.

En 2007, se aislo del semen un fragmento de la fosfatasa acida prostatica humana (los residuos de aminoacido 240 a 290), identificado como un fuerte potenciador de la capacidad de infeccion del VIH-1 (Munch et al., 2007). Este peptido denominado SEVI (potenciador de infeccion vmca de semen humano, del ingles “Semen Enhancer of Viral Infection”) es capaz de promover la transduccion de vectores lentivirales (Wurm et al., 2010). Evaluamos la capacidad de SEVI y LAH4-A4 para promover la transduccion de celulas hCD34+ con GALVTR-LV. Se han usado los peptidos LAH4-A4 o SEVI a la misma molaridad de 2,2 pM. Tal como se muestra en la Figura 10A, los datos obtenidos de tres donantes de sangre de cordon diferentes indican que la transduccion en presencia de LAH4-A4 es mas eficaz que en presencia de SEVI, sin citotoxicidad aparente dos dfas post-transduccion (Figura 10B).

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Los derivados de LAH4 han sido descritos previamente como agentes de transfeccion de ADN (Kichler et al, 2003). Por lo tanto, evaluamos la capacidad de LAH4-A4 para transfectar celulas 293T con un plasmido que expresa la protema GFP. Tal como se muestra en la Figura 11, 12 pg/mL de LAH4-A4 no son suficientes para promover eficazmente la transfeccion de celulas 293T. Sin embargo, un aumento en la concentracion de LAH4-A4 a 24 pg/mL permite una transfeccion altamente eficaz de celulas 293T, tal como se ha observado para el peptido de control LAH4-L1. De forma interesante, a la misma concentracion de 24 pg/mL, el K2-L10A12-K2 es incapaz de promover la transfeccion celular. La ausencia de residuos de histidina es perjudicial para dicha actividad, mientras que simultaneamente, solo 12 pg/mL de K2-L10A12-K2 siguen siendo capaces de promover algo de transduccion lentiviral en comparacion con LAH4-A4 (Figura 7B).

Efecto de LAH4-L1, LAH4-L4iso, LAH4-A4 y LAH4-A5 en la transduccion de progenitores hematopoyeticos humanos con RD114TR-LVs o GALV-MLV.

Se obtuvieron celulas CD34+ humanas de muestras de sangre de cordon umbilical (UCB) y fueron transducidas con RD114TR-LV (3,8x10E6 TU/mL) o GALVTR-MLV (5x10E5 TU/mL) que portaban un gen indicador GFP, en ausencia o en presencia de 12 pg/mL de LAH4-L1, LAH4-L4iso, LAH4-A4 o LAH4-A5. No observamos ningun efecto citotoxico de los peptidos y todos ellos promovieron la entrada de ambos virus (Figura 12). El peptido LAH4-A4 fue el mas eficaz. El experimento con el virus GALVTR-MLV demuestra que la infeccion mejora incluso con un genoma viral diferente al del VIH.

Referencias

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Merten, O. W., S. Charrier, N. Laroudie, S. Fauchille, C. Dugue, C. Jenny, M. Audit, M. A. Zanta-Boussif, H. Chautard, M. Radrizzani, G. Vallanti, L. Naldini, P. Noguiez-Hellin, y A. Galy. 2011. Large-scale manufacture and characterization of a lentiviral vector produced for clinical ex vivo gene therapy application. Hum. Gene Ther. 22: 34356.

Claims (27)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Uso in vitro o ex vivo del peptido LAH4 que tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1 o de un derivado funcional del mismo que presente la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, para promover la infeccion de una celula eucariotica por un virus o un vector viral, en donde el derivado funcional comprende

   - 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos;

   - su extremo N-terminal comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4, seleccionados en particular entre lisinas y/o argininas; y

   - una region helicoidal central seleccionada del grupo que consiste en

   a) una helice apolar que alberga un grupo de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y residuos de alanina consecutivos en el otro lado de la helice, definiendo dichos residuos de alanina consecutivos un angulo de 60 a 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferiblemente un angulo de 140°; o

   b) una helice anfipatica que alberga un conjunto de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y de dos a cuatro residuos de histidina en el otro lado de la helice, que definen un angulo hidrofflico comprendido entre 60° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson y preferiblemente un angulo de 140°.
2. 2. El uso segun la reivindicacion 1, en donde el extremo N-terminal del peptido comprende una o dos carga(s) positiva(s) proporcionada(s) por residuo(s) de arginina o lisina, en particular en donde los residuos cargados positivamente son los residuos mas N-terminales.
3. 3. El uso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el peptido comprende un extremo C-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4 proporcionados por residuos de arginina y/o lisina.
4. 4. El segun la reivindicacion 3, en donde:

   - el residuo mas C-terminal es una alanina y en donde los residuos de aminoacido cargados positivamente del extremo C-terminal del peptido se encuentran contiguos a la alanina C-terminal; o

   - el residuo(s) mas C-terminal es(son) uno o dos aminoacido(s) cargado(s) positivamente.
5. 5. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la region helicoidal central es una helice anfipatica como se ha definido en b) y en donde en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson dicho peptido comprende solo residuos de leucina o solo de alanina entre los residuos de histidina en el angulo mas pequeno definido por dichos residuos de histidina.
6. 6. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el peptido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 27.
7. 7. Un peptido anfipatico cationico que es un derivado funcional del peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1, en donde el derivado funcional tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, que comprende

   - 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos;

   - un extremo N-terminal que comprende de uno a tres residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4;

   - al menos dos residuos de histidina, preferiblemente dos pares de residuos de histidina, que definen un angulo hidrofflico comprendido entre 80° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson,

   - siendo seleccionados los otros aminoacidos del peptido entre residuos de alanina y leucina;

   en donde en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson dicho peptido comprende solo residuos de alanina entre los residuos de histidina mas distantes en el angulo mas pequeno definido por dichos residuos de histidina.
8. 8. El peptido segun la reivindicacion 7, en donde el extremo N-terminal comprende uno o dos residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4.
9. 9. El peptido segun la reivindicacion 7 u 8, en donde dicho angulo hidrofflico esta comprendido entre 120 y 180°, y preferiblemente donde dicho angulo es de 140°.
10. 10. Un peptido que es un derivado funcional del peptido LAH4, en donde el peptido LAH4 tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y en donde el derivado funcional tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, que comprende:

    - 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos;

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

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    50

    - un extremo N-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4; y

    - una helice apolar que alberga un grupo de residuos de aminoacido hidrofobicos en un la do de la helice y

    residuos de alanina consecutivos en el otro lado de la helice, que definen un angulo de 60 a 180° en la

    representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferiblemente un angulo 140°.
11. 11. Un peptido anfipatico cationico que es un derivado funcional de LAH4, en donde el derivado funcional de LAH4 tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o de un vector viral, que comprende

    - 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos;

    - un extremo N-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH

    7,4;

    - al menos dos residuos de histidina, en particular cuatro residuos de histidina, que definen un angulo hidrofflico comprendido entre 140° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, mas espedficamente un angulo de 140°;

    en donde en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson dicho peptido comprende solo residuos de leucina entre los residuos de histidina mas distantes en el angulo mas pequeno definido por dichos residuos de histidina,

    excepto los peptidos que consisten en las secuencias KKALLALALHHLALLAHLLALHLKKA (SEQ ID NO: 36) y KKKKALLHLHLLALHLHLLALLALKKK (SEQ ID NO: 37).
12. 12. Un peptido segun la reivindicacion 11, que es un isomero del peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1, cuya secuencia de aminoacidos consiste en 8 residuos de alanina, 4 de histidina, 10 de leucina y 4 de lisina.
13. 13. Un peptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8-27.
14. 14. Un metodo in vitro o ex vivo para infectar celulas eucarioticas con un virus o un vector viral, que comprende poner en contacto las celulas con el virus o el vector viral en presencia del peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1 o con un derivado funcional del mismo como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde las celulas preferiblemente son celulas madre/progenitoras hematopoyeticas, en particular celulas CD34+, mas particularmente celulas CD34+ humanas.
15. 15. Un metodo in vivo o ex vivo para aumentar la eficacia de una transferencia de acido nucleico al interior de una celula diana con un vector viral, que comprende poner en contacto la celula diana con el vector viral en presencia del peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1 o de un derivado funcional del mismo como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para promover la transferencia de un acido nucleico (tal como un gen(es), cADNs, siARNs, shARN, secuencia de oligonucleotidos antisentido) al interior de una celula diana, en donde las celulas preferiblemente son celulas madre/progenitoras hematopoyeticas, en particular celulas CD34+, mas particularmente celulas CD34+ humanas.
16. 16. Un metodo para diagnosticar una infeccion por un virus en un sujeto, que comprende incubar una muestra del sujeto con una celula eucariotica y el peptido LAH4 de la SEQ ID NO: 1 o con un derivado funcional del mismo segun se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, a fin de amplificar cualquier virus contenido en dicha muestra, e identificar el virus amplificado.
17. 17. El peptido segun se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, para uso en terapia genica para promover la infeccion de una celula eucariotica por parte de un virus o un vector viral, o para uso en combinacion con un virus o vector viral en terapia genica.
18. 18. Un peptido LAH4 que tiene la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1 o un derivado funcional del mismo que tiene la capacidad de mejorar la eficacia de transduccion de un virus o vector viral, en donde el derivado funcional comprende

    - 19 o mas aminoacidos, en particular 20, 21 o mas aminoacidos;

    - su extremo N-terminal comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4, seleccionados en particular entre lisinas y/o argininas; y

    - una region helicoidal central seleccionada del grupo que consiste en

    a) una helice apolar que alberga un grupo de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y residuos de alanina consecutivos en el otro lado de la helice, definiendo dichos residuos de alanina consecutivos un angulo de 60 a 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson, y preferiblemente un angulo de 140°; o

    b) una helice anfipatica que alberga un conjunto de residuos de aminoacido hidrofobicos en un lado de la helice y de dos a cuatro residuos de histidina en el otro lado de la helice, que definen un angulo hidrofflico comprendido entre 60° y 180° en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson y preferiblemente un angulo de 140°,

    5

    10

    15

    20

    25

    para uso en terapia genica para promover la infeccion de una celula eucariotica por parte de un virus o vector viral, o para uso en combinacion con un virus o un vector viral en terapia genica.
19. 19. El peptido LAH4 o un derivado funcional del mismo para uso segun la reivindicacion 18, en donde el extremo N- terminal del peptido comprende una o dos carga(s) positiva(s) proporcionada(s) por el residuo(s) de arginina o lisina, en particular en donde los residuos cargados positivamente son los residuos mas N-terminales.
20. 20. El peptido LAH4 o el derivado funcional para uso segun la reivindicacion 18 o 19, en donde el peptido comprende un extremo C-terminal que comprende uno o mas residuos de aminoacido cargados positivamente a pH 7,4 proporcionados por residuos de arginina y/o lisina.
21. 21. El peptido LAH4 o el derivado funcional para uso segun la reivindicacion 20, en donde:

    - el residuo mas C-terminal es una alanina y en donde los residuos de aminoacido cargados positivamente en el extremo C-terminal del peptido estan contiguos a la alanina C-terminal; o

    - el(los) residuo(s) mas C-terminal(es) es(son) uno o dos aminoacido(s) cargado(s) positivamente.
22. 22. El peptido LAH4 o el derivado funcional para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde la region helicoidal central es una helice anfipatica como se define en b) y en donde en la representacion de rueda de Schiffer-Edmundson dicho peptido comprende solo residuos de leucina o solo residuos de alanina entre los residuos de histidina en el angulo mas pequeno definido por dichos residuos de histidina.
23. 23. El peptido LAH4 o un derivado funcional para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde el peptido se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1 a 27.
24. 24. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el virus o vector viral es un virus o vector viral con envoltura.
25. 25. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el virus o vector viral es un virus o vector viral con envoltura.
26. 26. El peptido para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en donde el virus o vector viral es un virus o vector viral con envoltura.

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    Eficacia de transduccion de hCD34+

    (% de celulas GFP+)

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    (marcaje de 7-AAD) (% de control LAH4-A4)

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