ES2833449T3 - Terapia génica para el tratamiento del VIH y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión que comprende (a) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional; y (b) al menos otras dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor de VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; donde la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de una 5'LTR de VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH- 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica para el tratamiento del VIH y usos de la misma

Campo de divulgación

La presente divulgación se refiere en general a los campos de la biología molecular y la virología. En particular, la divulgación se refiere a un vector de expresión útil en el tratamiento y prevención de infecciones por VIH así como a un método para inhibir la infección por VIH y la replicación en sistemas de cultivo de tejidos.

Antecedentes de la divulgación

El VIH-1 es el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) con un orden de 30 millones de personas infectadas en todo el mundo. El VIH provoca que el sistema inmunitario falle y aumente la probabilidad de muerte debido a infecciones oportunistas. La infección por VIH es un importante problema sanitario mundial, como lo demuestra su designación como pandemia por la Organización Mundial de la Salud. La mayoría de las personas infectadas con VIH, en particular en el mundo en desarrollo, con el tiempo desarrolla SIDA, el cual se cobra la vida de más de un millón de personas cada año.

El VIH-1 pertenece a la familia de virus Retroviridae y es un virus envuelto cuyo genoma consiste en dos moléculas de ARN monocatenario (ARNmc). El objetivo principal del VIH-1 son los linfocitos que expresan CD4+, tales como los linfocitos T CD4+. Una glucoproteína del virus VIH-1 interacciona con la molécula CD4 de las células objetivo y con correceptores de quimiocinas, CCRS o CXCR4, en la superficie de las células objetivo. Después de la fusión y la entrada en la célula objetivo, la nucleocápside que contiene el genoma vírico se disocia y libera el contenido del virus, incluyendo el ARNmc, en el citoplasma. Una enzima transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 sintetiza ADN vírico bicatenario (ADNbc) a partir del genoma de ARNmc. Después de la síntesis de la molécula de ADN bicatenaria del VIH-1, el ADN del VIH-1 se integra en el genoma del hospedador.

El ADN del VIH-1 integrado está flanqueado por secuencias de repetición largas terminales (LTR) 5' y 3' idénticas a partir de las cuales el VIH-1 puede iniciar la transcripción del genoma del VIH-1 integrado. La transcripción del ADN vírico precisa factores de transcripción, tales como NF-kB, que están regulados por aumento en los linfocitos T activados. Como consecuencia, la transcripción del virus es más activa en el linfocito T después de la activación del linfocito T, tal como durante la infección. El ARN vírico resultante de la transcripción del genoma del VIH-1 integrado se traduce posteriormente y se empaqueta en partículas víricas que luego salen de la célula para convertirse en virus infeccioso.

La terapia para la infección por VIH-1 incluye una terapia antirretrovírica combinada (TARc). La TARc, que incluye combinaciones de inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores de la proteasa, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores de la integrasa y de la fusión, ralentiza la progresión del VIH. Esto, a su vez, disminuye drásticamente la tasa de morbilidad y mortalidad por VIH/SIDA en las regiones del mundo donde la terapia está disponible. Sin embargo, la TARc no cura ni elimina por completo todos los síntomas del VIH/SIDA. Asimismo, la terapia TARc puede verse comprometida por mutaciones resistentes a fármacos y tiene una gama de efectos secundarios que pueden ser graves y que parecen ser acumulativos. Además, la interrupción de la terapia TARc conduce casi invariablemente a la reaparición de la replicación vírica detectable y a la progresión al SIDA, y se ha demostrado que está asociada con una mayor incidencia de todas las causas de mortalidad y sucesos graves no relacionados con el SIDA. Por estos motivos, así como por el alto coste de la TARc y la necesidad de un estricto cumplimiento del tratamiento, dicha terapia puede ser relativamente ineficaz para un gran número de pacientes.

Los vectores lentivíricos basados en el VIH se están convirtiendo rápidamente en el sistema de vectores de retrovirus de elección para la investigación y las aplicaciones clínicas de transferencia génica. La capacidad potenciada de los vectores lentivíricos para transducir tanto células madre en reposo como células totalmente diferenciadas que no están en división ha conducido al desarrollo de una amplia gama de vectores terapéuticos para el suministro de genes, así como herramientas de investigación prometedoras, tal como bibliotecas de atenuación génica de ARN de horquilla corta (ARNhc) y vectores para la inducción de pluripotencia en células completamente diferenciadas. Los primeros vectores de terapia génica clínica gammarretrovíricos restablecieron la función inmunitaria en pacientes con inmunodeficiencia combinada grave ligada a X (IDCG-X1), pero posteriormente se descubrió que provocaban trastornos proliferativos a través de la transactivación de protooncogenes. Los diseños de vectores lentivíricos más recientes pueden reducir significativamente dicho riesgo y esperan pruebas clínicas para la validación final de su seguridad prevista. El campo sigue cambiando y los resultados de las pruebas clínicas son impredecibles.

Por ejemplo, Trobridge et al., PLoS One, Vol. 4: e7693, 2009 (en adelante "Trobridge") enseñan que la inserción de un ARNhc dirigido por pol III en el mismo vector de expresión que un gen inhibidor de la fusión C46 dirigido por un promotor distinto daba como resultado una reducción significativa de la expresión de C46 en comparación con un vector que sí no incluía el ARNhc (véase la página 5, columna izquierda, primer párrafo y Figura 3 de Trobridge). En consecuencia, el vector dual fue sustancialmente menos eficaz (más de 27 veces menos eficaz) contra la infección por VIH que el vector que codifica el inhibidor de la fusión C46 solo (véase Id.). Además, el vector dual exhibió tasas significativamente más bajas de transferencia de genes anti-VIH a células hematopoyéticas en comparación con el vector que codifica el inhibidor de la fusión C46 solo (véanse las páginas 6 y 7, Tabla 1 y Figura 6). Trobridge atribuyó la mala expresión de C46 a la inclusión de la secuencia que codifica el ARNhc en el vector (véase la página 7, columna derecha, primer párrafo y página 9, columna izquierda, tercer párrafo). Trobridge también desvela que los niveles bajos de transferencia de genes son un obstáculo importante en los ensayos clínicos para la terapia génica anti-VIH (véase, por ejemplo, resumen, página 2, columna izquierda, primer párrafo completo y página 8, columna derecha, segundo párrafo completo).

Liu et al., desvela un enfoque novedoso para bloquear el correceptor CXCR4 del VIH-1 de una manera no tóxica (Mol. Biotechnol.; 56(10): 890-902, 21 de mayo de 2014). Walker et al., desvela la generación de un sistema inmunológico resistente al VIH-1 con células madre hematopoyéticas CD34+ transducidas con un vector lentivírica anti-VIH de combinación triple (J. Virol.; 86(10): 5719-5729, 15 de mayo de 2012). Burke et al., desvela la ingeniería de resistencia celular a la infección por VIH-1 in vivo usando un vector lentivírico terapéutico dual (Molecular Therapy - Nucleic Acids; 4(4): e236, 14 de abril de 2015. Wolstein et al., desvela la seguridad y eficacia preclínicas de un vector lentivírico anti-VIH-1 que contiene un ARN de horquilla corta para CCR5 y el inhibidor de la fusión C46 (Molecular Therapy - Methods & Clinical Development; 1: 11, 12 de febrero de 2014). El documento WO 2011/008348 A2 (Calimmune Inc., 20 de enero de 2011) desvela la inhibición por vector dual del virus de la inmunodeficiencia humana.

Sumario de la divulgación

La presente divulgación proporciona un enfoque terapéutico novedoso para su uso en el tratamiento, prevención y/o reducción de la infección por VIH en la que una combinación de diferentes etapas en la infección vírica son el objetivo de la terapia génica. En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un vector de expresión según la reivindicación 1. En particular, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende (i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional; y (ii) al menos otras dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus, donde la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1 (la secuencia desde la posición 350 a 368 también se denomina en el presente documento "PromA"). En algunas realizaciones, las al menos otras dos secuencias de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH. En otros aspectos, las al menos otras dos secuencias de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH.

En algunos aspectos, la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 9, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 17; (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1; (v) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 9; (vi) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 17; (vii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 36; y (viii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una secuencia de SEQ ID NO: 36.

En algunas realizaciones, la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un dúplex de ARN que comprende una Cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de las secuencias de SEQ ID NO: 6, la secuencia de SEQ ID NO: 14, la secuencia de SEQ ID NO: 22; la secuencia de SEQ ID NO: 40. En algunos aspectos, la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un ARNip seleccionado del grupo que consiste en (i) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7; (i) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15; (iii) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 23; y (iv) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 40 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 41.

En algunas realizaciones, la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un ARNhc seleccionado del grupo que consiste en (i) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8; (ii) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16; y (iii) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 24; y (iv) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 42.

En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH es un ARNip o ARNhc que tiene una región bicatenaria, donde una primera porción de la región bicatenaria comprende una secuencia que es idéntica a parte de una secuencia del correceptor del VIH y donde una segunda porción de la región bicatenaria comprende una secuencia que es complementaria a otra parte de la secuencia del correceptor del VIH. En algunas realizaciones, el correceptor del VIH es CCR5 o CXCR4. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor de VIH es un ARNhc que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 25. En algunos aspectos, el inhibidor del correceptor del VIH es capaz de reducir la expresión del correceptor del VIH cuando el vector se expresa en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, la proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo es una proteína C46. En algunas realizaciones, la proteína que inhibe la fusión del VIH tiene la secuencia de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la proteína que inhibe la replicación del VIH se selecciona del grupo que consiste en TRIM5a humano, TRIM5a de rhesus, TRIM5a quimérica, una proteína de fusión TRIM5-ciclofilina humana, ciclofilina, ubiquitina E3, APOBEC3G y antígeno 2 de células del estroma de la médula ósea (BST-2).

En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende al menos dos ácidos nucleicos que codifican un elemento de silenciamiento génico transcripcional. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende tres ácidos nucleicos que codifican un elemento de silenciamiento génico transcripcional. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector vírico. En algunas realizaciones, el vector vírico es un vector lentivírico o un vector retrovírico. En algunas realizaciones, el vector lentivírico se auto inactiva. En algunas realizaciones, el vector de expresión, cuando se expresa en una célula hospedadora, confiere resistencia a la infección por (1) cepas de VIH con tropismo para X4 y R5, (2) cepas de VIH resistentes a la terapia antirretrovírica de gran actividad (TARGA) o (3) cepas de VIH resistentes a TARG^a con tropismo para X4 y R5. En algunas realizaciones, cada uno de los ácidos nucleicos se expresa mediante promotores separados. En algunas realizaciones, al menos dos de los ácidos nucleicos son expresados por un mismo promotor.

En otra realización de la presente invención, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor del VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un primer promotor; la segunda secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un segundo promotor; y la tercera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un tercer promotor. En algunas realizaciones, al menos dos del primero, el segundo y el tercer promotor son iguales. En algunas realizaciones, el primero, el segundo y el tercer promotor son diferentes. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende además un cuarto ácido nucleico, donde el cuarto ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en otro ácido nucleico cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH, una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; donde los cuatro ácidos nucleicos están unidos operativamente a un cuarto promotor. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende al menos dos ácidos nucleicos de silenciamiento cuyo objetivo es la 5'LTR del VIH. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector lentivírico.

En otra realización de la presente invención, el vector de expresión comprende un primer ácido nucleico que codifica un ARNhc que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 25; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína C46; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una de una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1; donde la primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor H1 pol III, la segunda secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor pol II, tal como el promotor UbiquitinaC pol II, la tercera secuencia de ácido nucleico unida operativamente a uno de un promotor U6, U6.1 o U6.2 (U6, U6.1 y U6.2 pueden denominarse colectivamente en el presente documento "U6"). En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende además una cuarta secuencia de ácido nucleico, donde la cuarta secuencia de ácido nucleico es otra de una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'^lT^r del VIH -1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1; y donde la cuarta secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor U1. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector lentivírico.

En otra realización de la presente invención, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor del VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de fusión del VIH, donde el segundo ácido nucleico no es T20; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia con una región 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, la segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH tiene la secuencia de SEQ ID NO: 26.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora según la reivindicación 10. En una realización, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor del VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula madre/progenitora hematopoyética, un monocito, un macrófago, una célula mononuclear de sangre periférica, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o una célula dendrítica.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición según la reivindicación 14, que comprende el vector de expresión de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además otra molécula de ácido nucleico. Por tanto, una realización de acuerdo con este aspecto de la presente invención es una composición, incluyendo una composición farmacéutica, que comprende un vector de expresión que incluye una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector lentivírico. En algunas realizaciones, la composición está formulada como una emulsión. En algunas realizaciones, la composición está formulada con micelas, nanopartículas o nanocápsulas. En algunas realizaciones, las composiciones están encapsuladas dentro de un polímero. En algunas realizaciones, las composiciones están encapsuladas dentro de liposomas. En algunas realizaciones, las composiciones están encapsuladas dentro de minicélulas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otro aspecto de la presente divulgación hay una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH, donde el ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 9, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de s Eq ID NO: 17; (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 36; (v) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1; (vi) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 9; (vii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 17; y (viii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de las secuencias de SEQ ID NO: 6, la secuencia de SEQ ID NO: 14, la secuencia de SEQ ID NO: 22 o la secuencia de SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un ARNip seleccionado del grupo que consiste en (i) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7; (i) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15; (iii) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 23; y (iv) un ARNip que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 40 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un ARNhc seleccionado del grupo que consiste en (i) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8; (ii) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16; (iii) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 24; (iv) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 42.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión para su uso en el tratamiento del VIH según la reivindicación 12.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona vectores de expresión para su uso en métodos, incluyendo (i) métodos para inhibir la transcripción del VIH; (ii) métodos para inhibir la replicación del VIH; (iii) métodos para tratar una infección por VIH; (iv) métodos para prevenir una infección por VIH; (v) métodos para reducir una infección por VIH; y (vi) métodos para prevenir y/o reducir una infección por VIH productiva en un sujeto que no padece ninguna infección por VIH. Estos métodos deben llevarse a cabo mediante la administración o el contacto de una célula con un vector de expresión como se describe en el presente documento, una composición que comprende un vector de expresión y/u otros componentes o agentes activos, o coadministrar una composición que comprende (a) un vector de expresión y (b) otro componente o agente activo.

En una realización, la presente invención proporciona un vector de expresión de acuerdo con la invención para su uso en un método de inhibición de la transcripción del gen del VIH en una célula infectada con VIH que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'^lT^r del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1.

Otra realización de la presente invención es un vector de expresión de acuerdo con la invención para su uso en un método de inhibición de la replicación del gen del VIH en una célula infectada con el VIH, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz del vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'lTr del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector de expresión según la invención para su uso en un método de tratamiento de una infección por VIH en un sujeto, en el que el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector de expresión según la invención para su uso en un método para prevenir y/o reducir una infección por VIH en un sujeto, en el que el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión para su uso en un método de prevención y/o reducción de una infección por VIH productiva en un sujeto que no padece una infección por VIH, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'lTr del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método de inhibición de la transcripción del gen del VIH en una célula infectada con el VIH, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método de inhibición de la replicación génica del VIH en una célula infectada con el VIH, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH. En algunos ejemplos, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método de tratamiento de una infección por VIH en un sujeto, donde el uso comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método para reducir y/o prevenir una infección por VIH en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método para prevenir y/o reducir una infección por VIH productiva en un sujeto que no padece una infección por VIH, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método de tratamiento de una infección por VIH en un sujeto, donde el uso comprende la coadministración (i) de una cantidad eficaz de un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) una cantidad eficaz de al menos un ácido nucleico de silenciamiento seleccionado del grupo que consiste en (a) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 1, (b) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 9, (c) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de ^s E^q ID NO: 17; (d) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 36; (e) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1; (f) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 9; y (g) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 17; (h) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 36. En algunos ejemplos, el vector de expresión es un vector lentivírico. En algunos ejemplos, la coadministración es simultánea. En algunos ejemplos, el vector de expresión y el al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional se administran en diferentes momentos. En algunos ejemplos, el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH. En algunos ejemplos, el correceptor del VIH es CCR5 y la proteína inhibidora de la fusión del VIH es C46. En algunos ejemplos, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método para reducir y/o prevenir una infección por VIH en un sujeto que comprende la coadministración (i) de una cantidad eficaz de un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) una cantidad eficaz de al menos un ácido nucleico de silenciamiento seleccionado del grupo que consiste en (a) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 1, (b) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 9, (c) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 17; (d) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de ^s E^q ID NO: 36; (e) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1; (f) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 9; y (g) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95% con la secuencia de SEQ ID NO: 17; (h) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 36. En algunos ejemplos, el vector de expresión es un vector lentivírico. En algunos ejemplos, la coadministración es simultánea. En algunos ejemplos, el vector de expresión y el al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional se administran en diferentes momentos. En algunos ejemplos, el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH. En algunos ejemplos, el correceptor del VIH es CCR5 y la proteína inhibidora de la fusión del VIH es C46. En algunos ejemplos, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para tratar células madre hematopoyéticas humanas infectadas con VIH según la reivindicación 11. En una realización particular, el método comprende la transducción de células hematopoyéticas de un sujeto in vitro con el vector de expresión de la invención, donde las células hematopoyéticas transducidas se van a trasplantar al sujeto, donde las células hematopoyéticas transducidas son resistentes a la infección por VIH, donde el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. Las células hematopoyéticas son, por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o monocitos/macrófagos. En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas son células madre/progenitoras hematopoyéticas (HPSC) que generan granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por VIH después de un trasplante en un paciente. En algunas realizaciones, las HPSC son autólogas y positivas para CD34. En algunas realizaciones, las HPSC transducidas puede generar granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por cepas con tropismo para R5 y X4 del VIH. En algunas realizaciones, las HPSC transducidas puede generar granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por cepas de VIH que son resistentes a TARc.

En otra realización de este aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para reducir una infección por VIH en un sujeto que comprende transducir células hematopoyéticas con el vector de expresión de la invención, donde las células hematopoyéticas transducidas se van a trasplantar al sujeto, donde las células hematopoyéticas transducidas son resistentes a la infección por VIH, donde el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. Las células hematopoyéticas son, por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o monocitos/macrófagos. En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas son células madre/progenitoras hematopoyéticas (HPSC) que generan granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por VIH después de un trasplante en un paciente. En algunas realizaciones, las HPSC son autólogas y positivas para CD34. En algunas realizaciones, las HPSC transducidas puede generar granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por cepas con tropismo para R5 y X4 del VIH. En algunas realizaciones, las HPSC transducidas puede generar granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por cepas de VIH que son resistentes a TARc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para preparar los vectores de expresión descritos en el presente documento, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los nuevos vectores de expresión. En algunos ejemplos, el método de producción de un vector de expresión vírico que, cuando está presente en una célula, es capaz de inhibir la unión del VIH a la célula y prevenir la fusión del VIH en la célula o la replicación del VIH, comprende sintetizar un ADNc de un gen que expresa una proteína capaz de prevenir la fusión del VIH en una célula o la replicación del VIH; clonar el ADNc sintetizado en un sitio de restricción en un vector vírico; e insertar una unidad de expresión capaz de regular por disminución de la expresión de un correceptor del VIH en un sitio de restricción en el vector.

Otro aspecto más de la divulgación proporciona un kit que comprende un vector de expresión de la presente divulgación. El kit puede combinarse con otro ingrediente farmacéutico activo para su administración a un sujeto que lo necesite.

La presente divulgación está basada, en parte, en el reconocimiento de que un enfoque terapéutico cuyo objetivo son genes y/o proteínas que no son del VIH (es decir, genes y/o proteínas de la célula hospedadora) reduce la probabilidad de que surjan nuevas cepas de VIH resistentes a los inhibidores. En células madre hematopoyéticas CD34+ no tratadas (HPSC) y/o linfocitos T CD4+, el VIH se une a CD4 y CCR5 y luego se fusiona con la membrana celular. Después de la fusión, se introduce el ARN vírico y, posterior a la transcripción inversa a ADNc que se convierte en bicatenario, se integra en el genoma de la célula hospedadora donde se transcribe para producir más VIH. En HSC CD34+ y/o linfocitos T CD4+ tratados (combinación), la unión a CCR5 y la fusión con la membrana celular del VIH están bloqueadas. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que si el VIH supera estos dos bloques y se introduce el ARN vírico y se integra en el genoma de la célula hospedadora como ADN, la transcripción está bloqueada, ya que el ARNhc que induce el silenciamiento génico transcripcional (TGS), incluido dentro de los vectores de expresión de la presente divulgación, hace que el ADN del VIH sea transcripcionalmente inactivo.

Además, y en vista de las enseñanzas de Trobridge, el experto en la técnica se habría alejado de incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de fusión en el mismo vector que una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico inhibidora, y mucho menos incluir una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional. El experto en la técnica se habría dejado llevar simplemente porque Trobridge indica explícitamente que los vectores de combinación dual eran en realidad menos eficaces para inhibir la replicación del VIH que los vectores que codifican la proteína inhibidora de la fusión sola. En ese caso, los niveles muy bajos de transferencia de genes a las células hematopoyéticas exhibidos por el vector dual también habrían desanimado a un experto en la técnica de modificar un vector que codifica un solo ácido nucleico para incorporar secuencias de ácido nucleico adicionales porque tales niveles bajos de transferencia de genes han sido los razón principal del fracaso de las terapias génicas en los ensayos clínicos. Dado este, el experto en la lectura de Trobridge seguramente habría esperado un vector de combinación triple o un vector de combinación cuádruple, tal como se desvela en el presente documento, para no funcionar y ciertamente ser menos eficaz que cualquier sistema de vector único o de vector dual.

Los solicitantes sostienen que la presente divulgación proporciona resultados superiores en comparación con Trobridge. De hecho, los solicitantes han demostrado la capacidad de introducir de forma estable LVsh5/C46 (también denominado en el presente documento "Cal-1") en varias células hematopoyéticas, incluyendo linfocitos T CD4+ y HSPC CD34+, para permitir la expresión de un ARNhc (sh5) dirigido a CCR5 y C46. De hecho, los solicitantes han demostrado que el tratamiento de células objetivo con el vector LVsh5/C46 no mostró ningún indicio de toxicidad. (Véase, por ejemplo, Wolstein et al., "Preclinical Safety and Efficacy Of An Anti-HIV-1 Lentiviral Vector Containing A Short Hairpin r Na To CCR5 and The C46 Fusion Inhibitor," Molecular Therapy-Methods & Clinical Development (2014) 1, 11; doi:10.1038/mtm.2013.11; véase también Burke, et al. "Engineering Cellular Resistance To HIV-1 Infection In Vivo Using A Dual Therapeutic Lentiviral Vector," Molecular Therapy-Nucleic Acids (2015) 4, e236; doi:10.1038/mtna.2015.10).

Y, como se indica más adelante en el presente documento, la terapia antirretrovírica de gran actividad (por ejemplo, TARc) utiliza de dos a tres ingredientes farmacéuticos activos para suprimir eficazmente la replicación del VIH y mitigar el desarrollo de resistencias. Los solicitantes creen que un vector de combinación triple o cuádruple, tal como se desvela en el presente documento, también puede proporcionar un medio eficaz para el tratamiento y/o la supresión del VIH. En consecuencia y sin desear quedar ligados a teoría concreta alguna, Los solicitantes creen que un vector de combinación triple o cuádruple puede ser tan seguro como las construcciones de vector dual, al mismo tiempo que proporciona resultados comparativamente superiores.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra cómo el nuevo vector de combinación de la presente divulgación puede inhibir el VIH. Modelo de mecanismos dirigidos por la construcción del complejo VI en la protección contra la infección por VIH.

La figura 2 ilustra la posición de los ARNhc/ip inductores de TGS. Modelo del 5'LTR que incluye las posiciones de Nuc-0 y Nuc-1 y las secuencias objetivo de los ARNhc/ip candidatos principales. Estos se dirigen a la secuencia dentro de los sitios de unión de NF-kB en tándem (PromA) y una secuencia aguas arriba (si143), en la región de nuc-0. Estos inducen cambios epigenéticos similares. Los inventores han demostrado que estas moléculas actúan en el núcleo a través del reclutamiento de Agol seguido de HDAC 1 y 2 y HMT, por ejemplo, el Potenciador de Zeste.

La figura 3 muestra la conservación de la secuencia objetivo de ARNip 143, 136, 205 y PromA en el promotor 5'LTR del VIH-1 a través de los subtipos A-U.

La figura 4 muestra vectores lentivíricos autoactivantes que contienen LTR modificadas que permiten la integración pero no la expresión del genoma vírico, basado en el vector de la estructura-Cal-1 Calimmune (véase la publicación de Estados Unidos n.° US2012/0201794), que consiste en HI, promotor H1 y/o U6 , promotor U6 y/o U1, promotor U1; sh5, ARN de horquilla corta CCR5; o hcPrA, ARN de horquilla corta PromA; y/o sh143, ARN 143 en horquilla corta; UbC, promotor de ubiquitina C; y C46, inhibidor de la fusión C46. Para medir la expresión de la construcción, todas las construcciones modificadas contienen EGFP, proteína fluorescente verde mejorada. Resultados del ARNhc inductor de TGS. Estos resultados se presentan como una serie de Figuras.

La Figura 5a es un diagrama que muestra la región dentro de 5'LTR del VIH-1 a la que se dirigen los ARNip 143, 136, 205 y PromA. La flecha indica el sitio de inicio de la transcripción, la secuencia subrayada indica sitios de unión de NF-kB repetidos en tándem, siPromA-M2 y si143T son mutantes inactivos, utilizados como controles de especificidad. La figura 5b es un gráfico de los cultivos transfectados con Si136T-, si143-, si205S y PromA muestran una potente supresión de la transcripción del virus VIH-1SF162 15 días después de la infección en comparación con los controles mutantes inactivos. * ARNip objetivo idéntico a la cepa NL4.3 de1HIV-1. ** ARNip objetivo idéntico a la cepa SF162 del HIV-1.

En general, las figuras 5a-b muestran que los ARNip dirigidos a LTR del VIH suprimen de forma potente la transcripción del VIH. Para demostrar que los ARNip que se dirigen a la 5'LTR del ^v I^h eran capaces de suprimir de forma potente la transcripción del VIH-1, Se transfectaron células HeLa T4+ con los ARNip individuales, infectados con la cepa SF162 del VIH-1 y se realizaron ensayos de transcriptasa inversa (RT) durante un curso prolongado de infección. La secuencia objetivo de ARNip 143 es idéntica a la cepa SF162. Para determinar si un solo emparejamiento erróneo es crítico para reducir el efecto supresor, también se incluyó ARNip 143T, que tiene un solo emparejamiento erróneo de T en comparación con la cepa SF162. Este ARNip 143T emparejado erróneamente corresponde a la secuencia SF162 de 3'LTR disponible en GenBank (número de acceso M65024.1). También se incluyó el control de especificidad de secuencia siPromA-M2. Ambos ARNip completamente emparejados, 143 y PromA, suprimieron de forma potente la infección productiva con la cepa SF162 del VIH-1, con una reducción de más de 1.000 veces la actividad de RT en comparación con las células transfectadas de forma simulada. Curiosamente, 143T suprimió la infección por virus a un nivel comparable a 143 y PromA hasta el día 6 después de la infección, pero luego no pudo mantener la supresión del virus.

La figura 6 muestra las marcas de heterocromatina observadas en cultivos de VIH-1 suprimidos por ARNip. Para confirmar que el efecto supresor de los ARNip dirigidos a la LTR se estaba produciendo a través de mecanismos de silenciamiento génico transcripcional (TGS), se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en cultivos de HeLa T4+ con VIH-1 suprimido después de la transfección de ARNip 143, 136, 205 y PromA o cultivos con transcripción activa de VIH después de una transfección simulada. Las marcas de heterocromatina consistieron en TGS se observaron el día 6 después de la infección en cultivos transfectados con ARNip 143, 136, 205 y PromA, que incluyó el enriquecimiento de la trimetilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27me3) y la reducción de la acetilación de la histona 3 lisina 9 (H3K9Ac), en comparación con los cultivos transfectados de forma simulada. El análisis de ChIP de las marcas de heterocromatina también mostró un enriquecimiento de H3K9me3 y el reclutamiento de Agol en células transfectadas con si143 y siPromA.

Las marcas de heterocromatina observadas en cultivos de VIH-1 con supresión de ARNip, como se muestra en la Figura 6. El análisis de ChIP de marcas de heterocromatina mostró enriquecimiento de H3K27me3 y reducción de H3K9Ac en células transfectadas con si143 y siPromA.

La Figura 7 muestra una fuerte resistencia a los estímulos de reactivación por ARNhc. Para investigar el efecto de la secuencia objetivo de ARNip 143 en un modelo de latencia del VIH-1, las células J-Lat 9.2 se transdujeron de forma estable con horquilla corta (hc) 143 y/o shPromA usando vectores lentivíricos. Se intentó la reactivación del VIH-1 latente integrado en células J-Lat 9.2 utilizando SAHA, se midió TNF o una combinación de SAHA/TNF a diversas concentraciones y la expresión de GFP como una lectura de la transcripción del VIH, a las 48 horas. Se observó que las células J-Lat 9.2 transducidas con sh143 y/o shPromA eran en gran medida resistentes a la reactivación de SAHA, TNF o combinaciones de SAHA/TNF a concentraciones fisiológicas (Cillo et al., 2014 PNAS; De Pablo-Bernal et al., 2014 J Antimicrob Chemother) y mostró un nivel bajo de reactivación incluso a concentraciones suprafisiológicas del fármaco, mientras que los transducidos con un control de ARNhc mostraron una expresión de GFP muy elevada, lo que indica la reactivación de la infección latente por VIH-1. De manera importante, la línea celular J-Lat 9.2 transducida con sh143/shPromA dual pareció mostrar una protección ligeramente mejor contra los estímulos de reactivación. Estos datos demuestran que las células J-Lat 9.2 del modelo de latencia del VIH-1 son en gran medida resistentes a la reactivación mediante tratamientos farmacológicos cuando se transducen con sh143 y/o shPromA. Estos hallazgos son importantes en el contexto de las aplicaciones de la terapia génica, donde los pacientes podrían estar expuestos a diversos estímulos inmunes e inflamatorios.

Resistencia robusta a los estímulos de reactivación por ARNhc como se muestra en la Figura 7. Las células J-Lat 9.2 transducidas con sh143 y shPromA son menos susceptibles a la reactivación por tratamientos combinados de TNF/SAHA, particularmente a concentraciones fisiológicas de fármacos, en comparación con las células de control, como lo muestra la expresión de GFP que aumenta con la reactivación.

El análisis del ADN del VIH-1 intracelular se muestra en la Figura 8a.

El análisis del ARNm de LTR específico de VIH-1 se muestra en la Figura 8b.

El análisis del ADN integrado del VIH-1 en las células PM-1 se muestra en la Figura 9a.

El análisis del ARNm de gag específico de VIH-1 se muestra en la Figura 9b.

Descripción detallada

En general, la presente divulgación proporciona vectores de expresión, composiciones que comprenden vectores de expresión y vectores de expresión para su uso en métodos de tratamiento de sujetos mediante la administración de dichos vectores de expresión o composiciones.

Como se usa en el presente documento, los términos en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" se pretende que incluya "y", a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

Las expresiones "que comprende", "que incluye", "que tiene", y similares se usan indistintamente y tienen el mismo significado. De manera similar, "comprende", "incluye", "tiene", y similares se usan indistintamente y tienen el mismo significado. Específicamente, cada uno de los términos se define de acuerdo con la definición común de la ley de patentes de Estados Unidos de "que comprende" y, por lo tanto, se interpreta como un término abierto que significa "al menos lo siguiente", y también se interpreta que no excluyen funciones adicionales, limitaciones, aspectos, etc. Por tanto, por ejemplo, "un dispositivo que tiene componentes a, b y c" significa que el dispositivo incluye al menos los componentes a, b, y c. De forma similar, la frase: "un método que implica las etapas a, b y c" significa que el método incluye al menos las etapas a, b y c. Además, mientras que las etapas y los procedimientos pueden describirse en el presente documento en un orden particular, el experto en la materia reconocerá que las etapas de orden y procedimientos pueden variar.

Como se usa en el presente documento, una "célula infectada con VIH" se refiere a una célula en la que el genoma del VIH se ha integrado en el genoma celular e incluye células que producen el virus del VIH y células infectadas de forma latente con el VIH. Como se usa en el presente documento, una célula infectada de forma latente con el VIH es una célula en la que el genoma del VIH está integrado en el genoma de la célula hospedadora, pero que es transcripcionalmente inactivo pero capaz de reactivarse a un estado transcripcionalmente activo.

Como se usa en el presente documento, "poner en contacto la célula" se refiere a llevar una composición, formulación o agente en contacto con una célula de una manera que produzca un resultado eficaz (es decir, reducir, mitigar o eliminar la infección, transcripción o replicación el VIH). Poner en contacto la célula también incluye introducir una composición, formulación o agente en una célula.

Como se usa en el presente documento, las frases "inhibir la transcripción del VIH" se refieren a reducir o prevenir la transcripción de uno o más genes del VIH en la medida en que la formación de partículas del virus del VIH infeccioso en la célula se reduce, mitiga o elimina.

Como se usa en el presente documento, las frases "inhibir la replicación del VIH" se refieren a reducir o prevenir la replicación de uno o más genes del VIH en la medida en que la formación de partículas del virus del VIH infeccioso en la célula se reduce, mitiga o elimina.

Como se usa en el presente documento, el término "VIH" incluye no solo el VIH-1, sino también las diversas cepas de VIH-1 (por ejemplo, la cepa BaL o la cepa SF162) y los diversos subtipos de VIH-1 (por ejemplo, los subtipos A, B, C, D, F, G H, J y K).

Como se usa en el presente documento, "polinudeótido" se refiere a ADN mono o bicatenario, ARN, o versiones modificadas del mismo, incluyendo ácido nucleico peptídico y ácido nucleico bloqueado (LNA).

Como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico de silenciamiento" se refiere a cualquier polinucleótido que sea capaz de interactuar con una secuencia específica para inhibir la expresión génica. Los ejemplos de ácidos nucleicos de silenciamiento incluyen dúplex de ARN (por ejemplo, ARNip, ARNhc), LNA, ARN antisentido, polinucleótidos de ADN que codifican secuencias sentido y/o antisentido del ARNip o ARNhc, ADNzimas o ribozimas. La inhibición de la expresión génica no tiene por qué ser necesariamente la expresión génica de una secuencia enumerada específica, y puede ser, por ejemplo, expresión génica de una secuencia controlada por esa secuencia específica.

Como se usa en el presente documento, "elementos de silenciamiento génicos transcripcionales" son secuencias de ácidos nucleicos de silenciamiento que se dirigen a una secuencia dentro de la región de la repetición terminal larga en 5' (LTR) del VIH (incluido VIH-1).

Vectores de expresión

La presente divulgación proporciona vectores de expresión que comprenden al menos tres secuencias de ácido nucleico, donde los al menos tres ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en secuencias de ácidos nucleicos que codifican elementos de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH; secuencias de ácido nucleico que codifican inhibidores de un correceptor de VIH; secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que inhiben la fusión del VIH con una célula objetivo; secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que inhiben la replicación del VIH; y secuencias de ácido nucleico que codifican un inhibidor de la entrada del virus. Como se usa en el presente documento, "vector de expresión" o "vector" se refiere a una composición de materia que se puede usar para suministrar ácidos nucleicos de interés al interior de una célula de manera que la célula los exprese. En la técnica se conocen numerosos vectores, que incluyen, aunque sin limitación, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y vectores víricos. Los ejemplos de vectores víricos incluyen, pero sin limitación, vectores adenovíricos, vectores asociados con adenovirus, vectores retrovíricos (incluidos los vectores lentivíricos) y similares. En una realización, el vector de expresión es un vector vírico. Preferentemente, el vector vírica es un vector retrovírico o lentivírico.

En realizaciones, el vector de expresión comprende al menos primera, segunda y tercera secuencias de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional como se indica en la reivindicación 1; donde la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la replicación del VIH y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y donde la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico son diferentes.

Otras realizaciones más son vectores de expresión que comprenden (i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional como se indica en la reivindicación 1; y (ii) al menos otras dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus. En algunas realizaciones, cada una de las secuencias de ácido nucleico se expresa a partir de diferentes promotores en el vector de expresión. En algunas realizaciones, cada uno de los promotores puede ser igual o diferente entre sí. Por ejemplo, la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional puede expresarse a partir de un primer promotor; y cada una de las al menos otras dos secuencias de ácido nucleico se expresan a partir de promotores separados (por ejemplo, segundo y tercer promotores). En otras realizaciones, dos de las tres secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un solo promotor (es decir, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico o la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico). Incluso en otras realizaciones, tres secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un solo promotor.

En realizaciones adicionales, cada uno de los promotores (por ejemplo, primero, segundo, tercero y, opcionalmente, cuarto promotor) puede ser ARN polimerasa I (pol I), promotores de la polimerasa II (pol II) o polimerasa III (pol III). Los promotores pueden ser promotores constitutivos o promotores inducibles conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el promotor contiene al menos una porción de una LTR de VIH (por ejemplo, TAR) y es inducible por infección por VIH. En determinadas realizaciones, el primer promotor es un promotor de ARN pol III. Los promotores de ARN pol III adecuados para su uso en los vectores de expresión de la divulgación incluyen, pero sin limitación, un U6 humano, U6 de ratón y H1 humano y otros. En una realización, el primer promotor es un promotor H1 ARNA pol III. En otras realizaciones, el segundo promotor es un promotor de ARN pol II. En una realización particular, el segundo promotor es un promotor UbiquitinaC pol II. El segundo promotor, en algunas realizaciones, puede ser un promotor específico de tejido. Por ejemplo, los promotores específicos de tejido adecuados incluyen promotores específicos de macrófagos (por ejemplo, MPG-1 y similares) y promotores de linfocitos T (por ejemplo, CD4 y similares). En una realización, el tercer promotor es un promotor de ARN pol II. En otra realización, el tercer promotor es un promotor UbiquitinaC pol II. El tercer promotor puede, en algunas realizaciones, ser un promotor específico de tejido. El primero, segundo y tercer promotores pueden ser una combinación de cualquiera de los promotores descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, se prefieren los promotores de ARN pol III cuando la secuencia de ácido nucleico codifica una molécula de ARN inhibidora, tal como un ARNip o ARNhc. En otras realizaciones, se prefieren los promotores de ARN pol II cuando la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína.

En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector vírico. En algunas realizaciones, el vector vírico es un vector lentivírico, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, el vector vírico es un vector retrovírico, también se describe en el presente documento.

Los "retrovirus" son virus que tienen un genoma de ARN que se transcribe de forma inversa mediante transcriptasa inversa del retrovirus a una copia de ADNc que se integra en el genoma de la célula hospedadora. Los vectores retrovíricos y los métodos para preparar vectores retrovíricos son conocidos en la técnica. Brevemente, para construir un vector retrovírico, un ácido nucleico que codifica un gen de interés se inserta en el genoma vírico en el lugar de ciertas secuencias víricas para producir un virus que es de replicación defectuosa. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin las LTR y los componentes de empaquetamiento (Mann et al., Cell, Vol. 33:153-159, 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retrovírica y las secuencias de empaquetamiento, se introduce en esta línea celular, la secuencia de empaquetamiento permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que luego se secretan en los medios de cultivo. A continuación, el medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge, opcionalmente se concentra, y se utiliza para la transferencia génica.

"Lentivirus" se refiere a un género de retrovirus que es capaz de infectar células en división y que no están en división. Los ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de la inmunodeficiencia humana: incluyendo VIH de tipo 1 y VIH de tipo 2), el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA); visna-maedi, que causa encefalitis (visna) o neumonía (maedi) en ovejas, el virus de la encefalitis-artritis caprina, que causa inmunodeficiencia, artritis y encefalopatía en cabras; el virus de la anemia infecciosa equina, que causa anemia hemolítica autoinmune y encefalopatía en caballos; el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), que causa inmunodeficiencia en gatos; el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), que causa linfadenopatía, linfocitosis y posiblemente infección del sistema nervioso central en el ganado; y el virus de inmunodeficiencia de simios (VIS), que causa inmunodeficiencia y encefalopatía en primates subhumanos.

Un genoma lentivírico generalmente se organiza en una repetición terminal larga en 5' (LTR), el gen de gag, el gen de pol, el gen de env, los genes accesorios (nef, vif, vpr, vpu) y una LTR en 3'. La LTR vírica se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos de potenciador y promotor. La región U5 contiene las señales de poliadenilación. La región R (repetición) separa las regiones U3 y U5 y las secuencias transcritas de la región R aparecen tanto en los extremos 5' como 3' del ARN vírico. Véase, por ejemplo, "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)); O Narayan y Clements (1989) J. Gen. Virology, Vol. 70:1617-1639; Fields et al. (1990) Fundamental Virology Raven Press.; Miyoshi H, Blamer U, Takahashi M, Calibre F H, Verma I M. (1998) J Virol., Vol. 72(10):8150 7 y la patente de Estados Unidos n.° 6,013,516.

En la técnica se conocen vectores lentivíricos, incluidos varios que se han utilizado para infectar células madre/progenitoras hematopoyéticas (HPSC). Estos vectores se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: Evans et al., Hum Gene Ther., Vol. 10:1479-1489, 1999; Case et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol.

96:2988-2993, 1999; Uchida et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 95:11939-11944, 1998; Miyoshi et al., Science, Vol.

283:682-686, 1999; y Sutton et al., J. Virol., Vol. 72:5781-5788, 1998. En una realización, el vector de expresión es un lentivirus modificado y, por tanto, es capaz de infectar células en división y no en división. Dichos vectores lentivíricos comprenden un genoma lentivírico modificado que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo o la replicación del VIH. Además, el genoma lentivírico modificado preferentemente carece de genes para las proteínas de lentivirus requeridas para la replicación del virus, evitando así la replicación no deseada, tal como la replicación en las células objetivo. Las proteínas necesarias para la replicación del genoma modificado se proporcionan, preferentemente, en trans en la línea celular de empaquetamiento durante la producción del retrovirus recombinante (o específicamente lentivirus). En una realización, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular 293T. El vector lentivírico comprende, preferentemente, secuencias de las repeticiones terminales largas (LTR) en 5' y 3' de un lentivirus. En una realización, la construcción vírica comprende las secuencias R y U5 de la 5'LTR de un lentivirus y una 3'LTR inactivada o autoinactivante de un lentivirus. Las secuencias de LTR pueden ser secuencias de LTR de cualquier lentivirus, incluyendo de cualquier especie o cepa. Por ejemplo, las LTR pueden ser secuencias LTR del VIH, el virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) o el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB). Preferentemente, las secuencias de LTR son secuencias de LTR del VIH.

Elementos de silenciamiento génico transcripcional

Los vectores de expresión de la presente invención comprenden uno o más elementos de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH como se cita en la reivindicación 1. En algunas realizaciones, los vectores de expresión comprenden al menos dos de los ácidos nucleicos de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que los ácidos nucleicos de silenciamiento cuyo objetivo es una región dentro de la secuencia 5'LTR del VIH descrita en el presente documento son eficaces para inhibir la transcripción del genoma del VIH y, por tanto, representan un método mediante el cual se puede inhibir la replicación del VIH. A lo largo de la presente divulgación, la numeración de los ácidos nucleicos de silenciamiento se basa en el sitio de inicio 5'LTR U3 en la cepa HXB2 subtipo B (número de acceso K03455) (Wong-Staal, F. 1985, Nature 313:277-284).

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95% con una secuencia objetivo desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95% con la de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 97% con la de SEQ ID NO: 1. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 99 % con la de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95% con una secuencia objetivo desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de SEQ ID NO: 9. Incluso en otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 97 % con la de SEQ ID NO: 9. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 99 % con la de SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una secuencia objetivo desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de SEQ ID NO: 17. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 97% con la de SEQ ID NO: 17. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 99 % con la de SEQ ID NO: 17. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 17.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una secuencia objetivo desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de SEQ ID NO: 36. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 97 % con la de SEQ ID NO: 36. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de al menos un 99 % con la de SEQ ID NO: 36. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 36.

Como apreciarán los expertos en la materia, puede existir variación en la secuencia de la región 5'LTR entre cepas o subtipos de VIH-1 y, por tanto, puede haber alguna variación en la secuencia objetivo de VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13 o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13. Incluso en otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO 33, o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 33. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento tiene como objetivo una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO 39, o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1 es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95 % con la de la SEQ ID NO: 6. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 97 % con la de la SEQ ID NO: 6. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 99 % con la de la SEQ ID NO: 6. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1 es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95 % con la de la SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 97% con la de la SEQ ID NO: 14. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 99 % con la de la SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 14.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1 es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95 % con la de la SEQ ID NO: 22. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 97% con la de la SEQ ID NO: 22. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 99 % con la de la SEQ ID NO: 22. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una secuencia objetivo desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1 es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95 % con la de la SEQ ID NO: 40. En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 97 % con la de la SEQ ID NO: 40. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos el 99 % con la de la SEQ ID NO: 40. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico de silenciamiento es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de aproximadamente un 100 % con la de SEQ ID NO: 40.

La cadena antisentido de cualquier dúplex de ARN comprende una secuencia que es complementaria a la cadena sentido. Como se usa en el presente documento, una "secuencia que es complementaria a la cadena sentido" podrá formar un dúplex a pesar de tener una complementariedad de menos del 100 % con la cadena sentido si al menos una porción de la secuencia es capaz de formar un dúplex con la cadena sentido. En algunas realizaciones, la cadena antisentido es al menos un 95 % complementaria de la cadena sentido. En otras realizaciones, la cadena antisentido es al menos un 97 % complementaria de la cadena sentido. En realizaciones adicionales, la cadena antisentido es al menos un 99 % complementaria de la cadena sentido. En otras realizaciones adicionales, la cadena antisentido es aproximadamente un 100% complementaria de la cadena sentido. Se apreciará que el grado de identidad entre las cadenas sentido y antisentido del dúplex de ARN puede ser diferente del grado de identidad entre la cadena sentido y la secuencia objetivo respectiva.

Las dos cadenas que forman el dúplex de ARN pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las cadenas del dúplex de ARN se forman a partir de moléculas de ARN separadas, el dúplex de ARN puede ser un "ARN de interferencia pequeño" ("ARNip"). Un "ARN de interferencia pequeño" o "ARNip" es una molécula de ARN bicatenaria que es capaz de inhibir la expresión de un gen con el que comparte homología. La región del gen u otra secuencia de nucleótidos sobre la que existe homología se conoce como "región objetivo". Cuando las dos cadenas son parte de una molécula más grande y, por lo tanto, están conectadas por una cadena de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena del dúplex de ARN, el dúplex de ARN es un "ARN de horquilla corta" ("ARNhc").

En algunas realizaciones, el dúplex de ARN es un ARNip que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido. En una realización, el dúplex de ARN es un ARNip que tiene una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7)(denominado en el presente documento "ip143" o "ARNip143"). En otra realización, el dúplex de ARN es un ARNip que tiene una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15)(denominado en el presente documento "ip136" o "ARNip136"). En una realización adicional, el dúplex de ARN es un ARNip que tiene una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 23)(denominado en el presente documento "ip205" o "ARNip205"). En otra realización adicional, el dúplex de ARN es un ARNip que tiene una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 40 y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 41)(denominado en el presente documento "ARNip PromA" o "PromAip").

En otras realizaciones, el dúplex de ARN es un ARNhc que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido. En una realización, el ARN dúplex es un ARNhc que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6 (o una cadena sentido que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de la SED IQ NO: 6) y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7. En otra realización más, el ARNhc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8 (denominado en el presente documento "sh143" o "ARNhc143"). En otra realización, el ARN dúplex es un ARNhc que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14 (o una cadena sentido que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de la SED IQ NO: 14) y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15. En otra realización más, el ARNhc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 16 (denominado en el presente documento "sh136" o "ARNhc136"). En una realización adicional, el ARN dúplex es un ARNhc que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22 (o una cadena sentido que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de la SED IQ NO: 22) y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 23. En otra realización más, el ARNhc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 24 (denominado en el presente documento "sh205" o "ARNhc205"). En otra realización adicional, el ARN dúplex es un ARNhc que comprende una cadena sentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 40 (o una cadena sentido que tiene una identidad de al menos un 95 % con la de la SED IQ NO: 40) y una cadena antisentido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 41. En otra realización más, el ARNhc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 42 (denominado en el presente documento "shPromA" o "ARNhcPromA").

En otras realizaciones, el al menos un ácido nucleico de silenciamiento es un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ARN antisentido, ADN o mezclas de los mismos; una ADNzima; y una ribozima; cuyo objetivo es al menos una de una secuencia de SEQ ID NO: 1, una secuencia de SEQ ID NO: 9, una secuencia de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de SEQ ID NO: 36. Los métodos para la preparación y uso de moléculas de ADN y ARN antisentido, ribozimas y ADNzimas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Jakobsen et al, 2007, Retrovirology 4: 29-41.

En otras realizaciones, el ácido nucleico de silenciamiento puede ser un polinucleótido de ADN que codifica la secuencia sentido y/o antisentido del ARNip o ARNhc. Tales secuencias de ADN pueden insertarse en vectores, tales como plásmidos, vectores víricos, etc., para lograr la expresión del ARNip o ARNhc en la célula. En el caso del ARNip, las cadenas sentido y antisentido del ARNip pueden expresarse a partir del mismo vector o de diferentes vectores.

Secuencias de ácidos nucleicos que codifican inhibidores de un correceptor del VIH

En algunas realizaciones, el inhibidor de un correceptor del VIH es un ácido nucleico inhibidor, incluyendo un ARNip, un ARNhc, un aptámero, una ribozima y un oligonucleótido antisentido. Por tanto, en algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de un vector de expresión codifica un ácido nucleico inhibidor cuyo objetivo es un correceptor del VIH. "Diana" se refiere a la capacidad del inhibidor para unirse y/o interferir con una transcripción endógena que codifica el correceptor del VIH. Por ejemplo, el ácido nucleico inhibidor puede tener una secuencia que es sustancialmente complementaria de un ácido nucleico que codifica el correceptor del VIH de manera que el ácido nucleico inhibidor se une al ácido nucleico que codifica el correceptor del VIH bloqueando así la expresión o iniciando la degradación del ácido nucleico del correceptor. En consecuencia, en algunas realizaciones, el inhibidor de un correceptor de VIH es capaz de reducir la expresión del correceptor de VIH cuando el vector de expresión que codifica el inhibidor se expresa en una célula hospedadora.

En algunas realizaciones, un vector de expresión de la presente divulgación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria de al menos una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica un correceptor de VIH. Los ejemplos de correceptores de VIH incluyen CCR5 y/o CXCR4. Como se usa en el presente documento, "sustancialmente complementaria" se refiere a una secuencia que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % complementaria de una secuencia de polinucleótidos objetivo. En una realización, el oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que es un 100% complementaria de al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica CCR5 o CXCR4. En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido puede tener una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. En otras realizaciones, el oligonucleótido antisentido puede tener una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos.

En determinadas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico del vector de expresión codifica un ARNhc que tiene una estructura de tallo-bucle, donde el tallo o región bicatenaria comprende una primera porción de la región bicatenaria que tiene una secuencia que es idéntica a parte de la secuencia del correceptor del VIH, y donde una segunda porción de la región bicatenaria comprende una secuencia que es complementaria a otra parte de la secuencia del correceptor del VIH. En algunas realizaciones, la región de bucle del ARNhc puede comprender de aproximadamente 2 a aproximadamente 19 nucleótidos. En una realización particular, la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNhc que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25. En otra realización particular, la estructura del bucle de ARNhc comprende la secuencia de SEQ ID NO: 43.

Secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína que inhibe la fusión del VIH

En algunas realizaciones, los vectores de expresión de la presente divulgación comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo. En algunas realizaciones, la proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo es una proteína C46. C46 es un inhibidor de la fusión anclado a la membrana derivado de la repetición héptada en C-terminal de gp41 del VIH fusionada con una región de bisagra de inmunoglobulina humana y un dominio transmembrana CD34. C46 es un potente inhibidor de la fusión del VIH, que el experto en la técnica apreciará que, en un sentido, es análogo al fármaco soluble enfuvirtida (T20) aprobado por la FDA. Si bien es análogo, la proteína C46 no es T20 (por ejemplo, el péptido C46 tiene aproximadamente 10 aminoácidos más largo que T20) (véase, por ejemplo, Petit et al. Human Gene Therapy Methods. August 2014, 25(4): 232-240. doi:10.1089/hgtb.2014.034 y Felix et al. Mutations in gp120 Contribute to the Resistance of Human Immunodeficiency Virus Type 1 to Membrane-Anchored C-Peptide maC46, J Virol. 2009 May; 83(10): 4844-4853). El experto en la técnica también apreciará que la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH (por ejemplo, C46 o T20) actúa en un punto del ciclo de vida del VIH distinto de la unión del correceptor CCR5 o CXCR4. En algunas realizaciones, la seguridad de C46 se analizó en un ensayo clínico de fase I en el que los pacientes recibieron una infusión de linfocitos T autólogos transducidos con el vector retrovírico C46. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, ese estudio indicó que los pacientes no tenían efectos adversos relacionados con la terapia génica y no desarrollaron reacciones inmunes evidentes anti-C46.

En algunas realizaciones, los vectores de expresión de la presente divulgación comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo distinta de T20, es decir, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH no es T20.

En una realización, una secuencia de ácido nucleico de un vector de expresión codifica una proteína C46 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26.

En otra realización, una secuencia de ácido nucleico de un vector de expresión comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27.

El experto en la técnica apreciará que otras proteínas adecuadas que inhiben la fusión del VIH a una célula objetivo y pueden ser codificadas por una secuencia de ácido nucleico en los vectores de expresión de la presente divulgación e incluyen, sin limitación, T20 y sus proteínas relacionadas, enfuvirtida, CP32M y sifuvirtida (véase, por ejemplo, documento PCT/US2010/036247, publicado como WO 2011/008348 A2).

Secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína que inhibe la replicación del VIH

En algunas realizaciones, los vectores de expresión de la presente divulgación comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la replicación del VIH. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína 5 alfa (TRIM5a) que contiene un motivo tripartito o un derivado o fusión de la misma. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico codifica un TRIM5a quimérico. Una "TRIM5a quimérica" se refiere a una proteína TRIM5a que comprende dominios o fragmentos de proteínas TRIM5a de dos o más especies. En algunas realizaciones, la TRIM5a quimérica comprende un dominio amino terminal de una proteína TRIM5a humana y el dominio PRYSPRY carboxi terminal es de una proteína TRIM5a de rhesus.

En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína de fusión TRIM5-ciclofilina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión TRIM5-ciclofilina comprende los aminoácidos 1 a aproximadamente 309 de TRIM5a humana fusionada directamente con ciclofilina A humana de aproximadamente la longitud completa. En otras realizaciones, la proteína de fusión TRIM5-ciclofilina comprende los aminoácidos 1 a aproximadamente 322 de TRIM5a humana fusionados directamente con ciclofilina A humana de aproximadamente la longitud completa. En otras realizaciones más, la proteína de fusión TRIM5-ciclofilina comprende los aminoácidos 1 a aproximadamente 331 de TRIM5a humana fusionada directamente con ciclofilina A humana de aproximadamente la longitud completa. Otras proteínas adecuadas que inhiben la replicación del VIH que pueden estar codificadas por la segunda secuencia de ácido nucleico incluyen, pero sin limitación, ciclofilina, ubiquitina E3, APOBEC3G y antígeno 2 de células del estroma de la médula ósea (BST-2). En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína TRIM5a humana proporcionada por la SEQ ID NO: 28. En otras realizaciones, el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 29.

Ejemplos de vectores de expresión

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor del VIH, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con la célula objetivo y un tercer ácido nucleico codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH-1 como se cita en la reivindicación 1, para inhibir la transcripción del gen del VIH-1, donde la primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un primer promotor, la segunda secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un segundo promotor y el tercer ácido nucleico está operativamente unido a un tercer promotor. En algunas realizaciones, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un único promotor. En otras realizaciones, dos de las tres secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un solo promotor. En algunas realizaciones, la segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con la célula objetivo se selecciona de una proteína distinta de T20, es decir, la proteína no es T20. En algunas realizaciones, la proteína distinta de T20 es C46.

En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNip o ARNhc que comprende una región bicatenaria que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria de la de CCR5; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína C46; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH para inhibir la transcripción del gen del VIH como se cita en la reivindicación 1; donde la primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un primer promotor, la segunda secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un segundo promotor y el tercer ácido nucleico está operativamente unido a un tercer promotor. En algunas realizaciones, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un único promotor. En otras realizaciones, dos de las tres secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un solo promotor. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende una cuarta secuencia de ácido nucleico, tal como uno que codifica otro elemento de silenciamiento génico transcripcional.

Incluso en otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende una primera, segunda, tercera y cuarta secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico codifica un inhibidor de un correceptor de VIH (por ejemplo, ARNhc a CCR5 o CXCR4), la segunda secuencia de ácido nucleico codifica un inhibidor de fusión (por ejemplo, C46), la tercera secuencia de ácido nucleico codifica un inhibidor de la replicación del VIH (por ejemplo, proteína TRIM5a o un derivado o fusión de la misma) y la cuarta secuencia de ácido nucleico codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una de una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1 o una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1 para inhibir la transcripción del gen del VIH-1. En algunas realizaciones de la divulgación, el inhibidor de la transcripción del gen del VIH-1, el inhibidor de un correceptor del VIH y el inhibidor de la fusión del VIH con la célula objetivo o el inhibidor de la replicación del VIH se expresan a partir de diferentes promotores en el vector de expresión. En una realización, el inhibidor de un correceptor de VIH (por ejemplo, CCR5 o CXCR4) se expresa a partir de un promotor de ARN polimerasa III, mientras que el inhibidor de la fusión y/o replicación del VIH se expresa a partir de un promotor de la ARN polimerasa II. El experto en la técnica apreciará que se pueden expresar dos inhibidores diferentes en diferentes proporciones de la construcción de expresión.

Otros ejemplos de vectores de expresión de la presente divulgación se ilustran en la Figura 4. La Figura 4 también ilustra los promotores específicos a los que está unido operativamente cada ácido nucleico del vector de expresión.

Composiciones y composiciones farmacéuticas

La presente divulgación también proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más vetcores de expresión como se desvela en el presente documento. A modo de ejemplo, una composición puede comprender un vector de expresión que comprende un primer ácido nucleico que comprende un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia dentro de la 5'LTR del VIH, un segundo ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo o la replicación del VIH, y un tercer ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor del VIH. Otro ejemplo es una composición que comprende un vector de expresión que tiene una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNhc dirigido a CCR5 (o CXCR4), una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína C46 y un tercer ácido nucleico, a saber, un ácido nucleico de silenciamiento, cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En algunos ejemplos, la presente divulgación también proporciona composiciones que comprenden (i) un vector de expresión o una composición como se desvela en la publicación de Estados Unidos n.° 2012/0201794; y (ii) al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia dentro de la 5'LTR del VIH, como se desvela en el presente documento. Por ejemplo, en algunos ejemplos, tal composición puede comprender (i) un vector de expresión que comprende al menos dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional o un vector de expresión, célula o composición que comprende al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional. A modo de ejemplo, tal composición puede comprender (i) un vector de expresión que tiene una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNhc que se dirige a CCR5 (o CXCR4) y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína C46; y (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En algunos ejemplos, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de al menos uno de los vectores de expresión o composiciones como se describen en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, en determinados ejemplos, la composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de un vector de expresión y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para provocar la inhibición de la expresión del gen del VIH. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente una cantidad afectiva basándose en factores tales como el tamaño corporal, el peso corporal, la edad, el estado de salud, el sexo del sujeto, la etnia y los títulos de virus.

Cualquiera de los vectores de expresión desvelados en el presente documento (o combinaciones de los mismos) se puede formular como una composición farmacéutica. Las expresiones "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen efectos adversos, reacciones alérgicas u otras reacciones perjudiciales cuando se administra a un animal o humano. Por ejemplo, el ácido nucleico de silenciamiento puede formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, tampones, soluciones, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares aceptables para su uso en la formulación de productos farmacéuticos, tales como productos farmacéuticos adecuados para la administración a seres humanos. Los métodos para la formulación de compuestos con vehículos farmacéuticos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, (17a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985); y Goodman & Gillman: The Pharmacological Basis of Therapeutics (11a Edición, McGraw-Hill Professional, 2005).

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de los vectores de expresión o composiciones desvelados en el presente documento (o combinaciones de los mismos) en cualquier concentración que permita que el ácido nucleico de silenciamiento administrado alcance una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender el vector de expresión (o combinaciones de los mismos) en una cantidad de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 99,9% en peso. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su inclusión en cualquier composición farmacéutica incluyen agua, agua tamponada, soluciones salinas, tales como, por ejemplo, solución salina normal, o soluciones salinas equilibradas, tales como las soluciones equilibradas de Hank o Earle), glicina, ácido hialurónico, etc. La composición farmacéutica se puede formular para administración parenteral, tal como administración intravenosa, intramuscular o subcutánea. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, así como polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos, disolventes, diluyentes o vehículos incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, etc.), carboximetilcelulosa y mezclas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva), ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo).

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de los vectores de expresión desvelados en el presente documento (o combinaciones de los mismos) en forma encapsulada. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden estar encapsulados por polímeros biodegradables como polilactida-poliglicólido, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos), o pueden encapsularse en liposomas o microemulsión. Los liposomas pueden ser, por ejemplo, lipofectina o lipofectamina. Otro ejemplo puede comprender los vectores de expresión desvelados en el presente documento (o combinaciones de los mismos) en o sobre minicélulas bacterianas anucleadas (Giacalone et al, Cell Microbiology 2006, 8(10): 1624-33). Los vectores de expresión desvelados en el presente documento (o combinaciones de los mismos) se pueden combinar con nanopartículas.

La composición farmacéutica se puede formular para administración oral. Las formas de dosificación sólidas para administración oral pueden incluir, por ejemplo, comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos. En dichas formas farmacéuticas sólidas, la composición puede comprender al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio y/o fosfato dicálcico y/o cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; aglutinantes, tales como carboxilmetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, silicatos y carbonato de sodio; agentes humectantes, tales como alcohol acetílico, monoestearato de glicerol; absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; y/o lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicol sólido, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos. Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral pueden incluir, por ejemplo, emulsiones farmacéuticamente aceptables, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Las dosis líquidas pueden incluir diluyentes inertes, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (tales como, por ejemplo, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de germen, aceite de ricino, aceite de oliva, aceite de sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano y mezclas de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender potenciadores de la penetración para mejorar su liberación. Los potenciadores de la penetración pueden incluir ácidos grasos, tales como ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, reclineato, monooleína, dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerilo, mono- y di-glicéridos, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos. Las composiciones pueden incluir además agentes quelantes, tales como, por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato, homovanilato). Los vectores de expresión desvelados en el presente documento (o combinaciones de los mismos) pueden administrarse combinados con minicélulas o nanopartículas.

En algunas realizaciones, las composiciones se pueden formular como nanocápsulas. La estructura de las nanocápsulas consiste en un sistema nanovesicular que se forma en una disposición de núcleo y cubierta. La cubierta de una nanocápsula típica está hecha de una membrana o recubrimiento polimérico. En algunas realizaciones, las nanocápsulas se derivan de un material polimérico biodegradable o bioerosionable.

En algunas realizaciones, la nanocápsula es una nanocápsula enzimáticamente degradable. En algunas realizaciones, la nanocápsula consiste en un núcleo de proteína única y una cubierta polimérica delgada reticulada por péptidos. En algunas realizaciones, se puede seleccionar una nanocápsula de modo que sea específicamente reconocible y pueda ser escindida por una proteasa. En algunas realizaciones, los reticulantes escindibles incluyen una secuencia o estructura de péptidos que es un sustrato de una proteasa u otra enzima. Las nanocápsulas, métodos de síntesis y/o métodos de encapsulación adecuados se desvelan además en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2011/0274682.

En otras realizaciones, las composiciones pueden formularse como bio-nanocápsulas, que son cápsulas de tamaño nanométrico producidas por un microorganismo modificado genéticamente. Es posible usar, como bio-nanocápsula, una partícula derivada de proteína de virus o una partícula derivada de proteína de virus modificada, como partícula de antígeno de superficie del virus (por ejemplo, una partícula de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)). También es posible usar, como bio-nanocápsula, una cápsula de tamaño nanométrico que comprende una membrana de bicapa lipídica y una partícula derivada de proteína de virus o una partícula derivada de proteína de virus modificada, tal como una partícula de antígeno de superficie de virus (por ejemplo, una partícula de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)). Tales partículas se pueden purificar a partir de células eucariotas, tales como levaduras, células de insectos y células de mamíferos. El tamaño de una cápsula que se puede utilizar es de aproximadamente 10 nm a 500 nm, preferentemente se pueden usar de 20 nm a 250 nm y, lo más preferentemente, de 80 nm a 150 nm.

Usos médicos

En general, la presente divulgación proporciona vectores de expresión para diversos usos médicos, incluyendo vectores de expresión para su uso en (i) métodos para inhibir la transcripción del VIH; (ii) métodos para inhibir la replicación del VIH; (iii) métodos para tratar una infección por VIH; (iv) métodos para prevenir una infección por VIH; (v) métodos para reducir una infección por VIH; (vi) métodos para prevenir o reducir una infección por VIH productiva en un sujeto que no padece ninguna infección por VIH; (vii) métodos para inhibir la unión de un correceptor de VIH; y (viii) métodos para inhibir la fusión del VIH con una célula objetivo. Estos métodos deben llevarse a cabo o lograrse mediante la administración o el contacto de una célula con, un vector de expresión como se describe en el presente documento, una composición que comprende un vector de expresión y/u otro componente o agentes activos, o coadministrar (a) una composición que comprende un vector de expresión y (b) otro componente o agente activo. La presente divulgación también proporciona los presentes vectores de expresión, composiciones que comprenden vectores de expresión, etc. para su uso en un método para inhibir la transcripción del gen del VIH, la unión al correceptor del VIH, la fusión del VIH a la célula objetivo o la replicación del VIH para tratar o prevenir la infección por VIH en un sujeto.

Más específicamente, la presente divulgación proporciona un vector de expresión para su uso en un método de tratamiento, prevención y/o reducción de la infección por VIH en un paciente o sujeto, tal como los que necesitan tratamiento o terapia. Como se usa en el presente documento, "tratar" significa afectar a un sujeto, tejido o célula para obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado e incluye inhibir la afección, es decir, detener su desarrollo; o aliviar, mitigar o mejorar los efectos de la afección, es decir, provocar la reversión o regresión de los efectos de la afección. "Reducir" significa reducir el grado o la intensidad de una afección para que no se produzca en una célula o en un sujeto que puede estar en riesgo de tener la afección. Como se usa en el presente documento, "prevenir" significa prevenir que ocurra una afección en una célula o sujeto que puede estar en riesgo de sufrir la afección, pero no necesariamente significa que la afección no se desarrollará al final o que un sujeto no desarrollará al final una afección. La prevención incluye retrasar la aparición de una afección en una célula o sujeto. En una realización, el tratamiento logra el resultado de prevenir o reducir la replicación del VIH. El tratamiento también puede lograr el resultado de prevenir la reactivación del virus VIH1 latente en el sujeto receptor.

En algunas realizaciones, un vector de expresión para su uso en la prevención y/o reducción de la infección por VIH en un sujeto comprende un vector de expresión para su uso en la prevención y/o reducción de la infección por VIH en un sujeto que padece una infección por VIH. Como se usa en el presente documento, la expresión "prevenir o reducir la infección por VIH en un sujeto que padece una infección por VIH" se refiere a eliminar, reducir o retrasar la producción de virus VIH infeccioso en un sujeto ya infectado con VIH de manera que la infección de tejido no infectado con VIH en el sujeto se prevenga, reduzca o retrase. En otra realización, un vector de expresión para su uso para prevenir o reducir la infección por VIH en un sujeto comprende un vector de expresión para su uso para prevenir o reducir una infección por VIH productiva en un sujeto que no padece infección por VIH. Como se usa en el presente documento, "prevenir o reducir una infección por VIH productiva en un sujeto que no padece infección por VIH" se refiere a un vector de expresión para su uso en la prevención o reducción del desarrollo de una infección por VIH de un sujeto que no ha sido previamente infectado por el VIH.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero que es susceptible a la infección por VIH, tal como un ser humano, ratón o primate. Típicamente, el mamífero es un ser humano (homo sapiens).

Como se usa en el presente documento, el término "administrar" significa proporcionar una composición, formulación o agente específico a un sujeto que necesita tratamiento, incluyendo aquellos descritos en el presente documento.

Se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de las dosis para cualquier paciente particular puede variar y dependerá de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto específico que se emplee, la estabilidad metabólica y duración de la acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el modo y tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y el huésped que se somete a la terapia.

En algunas realizaciones, los métodos desvelados en el presente documento deben comprender administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector de expresión o composición farmacéutica que comprende un vector de expresión como se proporciona en el presente documento. La administración de tales composiciones puede conferir resistencia a la infección por cepas del VIH con tropismo a R5 y X4. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede ser VIH negativo o VIH positivo. En algunas realizaciones, el sujeto puede no haber recibido nunca terapia TARc, estar recibiendo terapia TARc, haber fracasado o fallado la terapia TARc. En otras realizaciones, el sujeto puede haber progresado a SIDA o tener una enfermedad definitoria de SIDA (por ejemplo, SIDA/linfoma).

A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos deben comprender administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión, donde el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNhc que se dirige a CCR5 (o CXCR4), una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína C46 y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia en la 5'LTR del VIH como se menciona en la reivindicación 1.

En algunas realizaciones, el vector de expresión se utiliza en un método para tratar una infección por VIH en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector de expresión o una composición que comprende un vector de expresión, donde el vector de expresión comprende (i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional como se indica en la reivindicación 1; y (ii) al menos otras dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus. En otras realizaciones, el vector de expresión se utiliza en un método para prevenir y/o reducir una infección por VIH en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector de expresión o una composición que comprende un vector de expresión, donde el vector de expresión comprende (i) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional como se indica en la reivindicación 1; y (ii) al menos otras dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus.

En otras realizaciones, el vector de expresión se utiliza en un método de tratamiento, prevención y/o reducción de una infección por VIH en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector de expresión o una composición que comprende un vector de expresión, donde el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH, en el que el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión del VIH es distinto de T20.

En otros ejemplos, el vector de expresión se utiliza en un método de tratamiento, prevención y/o reducción de la infección por VIH en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende (i) un vector de expresión que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) un ácido nucleico que codifica al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia de la 5'LTR del VIH.

En otros ejemplos más, el vector de expresión se utiliza en métodos de tratamiento de una infección por VIH en un sujeto, que comprenden la coadministración (i) de una cantidad eficaz de un vector de expresión, una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión o una célula que comprende al menos dos ácidos nucleicos, donde los al menos dos ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; y (ii) una cantidad eficaz de al menos un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia en la 5'LTR del VIH. En algunos ejemplos, la coadministración es simultánea. En otros ejemplos, el vector de expresión y el al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional se administran en diferentes momentos.

En otros ejemplos más, el vector de expresión se utiliza en métodos de tratamiento, prevención y/o reducción de una infección por VIH en un sujeto, que comprende coadministrar (i) una cantidad eficaz de un vector de expresión, una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión, o una célula como se desvela en la publicación de Estados Unidos n.° 2012/0201794 (donde los vectores de expresión de la publicación '794 se denominan en el presente documento "Cal-1"); y (ii) una cantidad eficaz de al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional, una composición o conjugado que comprende al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional, o una célula que comprende al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional. En algunos ejemplos, el elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona de los descritos en el documento PCT/AU2015/050507, presentada el viernes, 28 de agosto de 2015, que se publica como WO 2016/029275 A1. En algunos ejemplos, la coadministración es simultánea. En otros ejemplos, el vector de expresión y el al menos un elemento de silenciamiento génico transcripcional se administran en diferentes momentos. El experto en la técnica podrá proporcionar un régimen y/o programa de dosificación apropiado para la coadministración del vector de expresión y el elemento de silenciamiento génico transcripcional.

Otras realizaciones más se refieren a un método in vitro para tratar células madre hematopoyéticas humanas infectadas con VIH que comprende proporcionar células madre hematopoyéticas extraídas de sangre circulante o médula ósea de un paciente hospedador; y tratar las células hematopoyéticas con el vector de expresión de la invención, donde las células hematopoyéticas transducidas se van a trasplantar en el sujeto, donde las células hematopoyéticas transducidas son resistentes a la infección por VIH, donde el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1. Las células hematopoyéticas transductoras son, por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o monocitos/macrófagos. En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas son células madre/progenitoras hematopoyéticas (HPSC) que generan granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por VIH después de un trasplante en un paciente. En algunas realizaciones, las HPSC son autólogas y positivas para CD34. En algunas realizaciones, las HPSC transducidas puede generar granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por cepas con tropismo para R5 y X4 del VIH. En algunas realizaciones, las HPSC transducidas puede generar granulocitos, monocitos/macrófagos y linfocitos que son resistentes a la infección por cepas de VIH que son resistentes a TARc.

En otras realizaciones, la invención proporciona un método in vitro para tratar células madre hematopoyéticas humanas infectadas con VIH, comprendiendo el método proporcionar células madre hematopoyéticas extraídas de la sangre circulante o la médula ósea de un paciente hospedador humano; y tratar las células madre hematopoyéticas con un vector de expresión (o una composición que comprende una expresión) como se desvela en el presente documento; donde las células madre hematopoyéticas retratadas se administrarán o trasplantarán en el mismo paciente y donde, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor del VIH; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia de una 5'LTR del VIH seleccionada del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1.

Células hospedadoras y métodos para producir células hospedadoras

La presente invención también proporciona una célula hospedadora que comprende los vectores de expresión nuevos de la presente invención. Una "célula hospedadora" o "célula objetivo" significa una célula que se va a transformar usando los métodos y vectores de expresión de la divulgación. En algunas realizaciones, las células hospedadoras son células de mamífero en las que se puede expresar el vector de expresión. Las células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen, pero sin limitación, células humanas, células murinas, células de primate no humano (por ejemplo, células de mono rhesus), células progenitoras humanas o células madre, células 293, células HeLa, células D17, células MDCK, células BHK y células Cf2Th. En determinadas realizaciones, la célula hospedadora que comprende un vector de expresión de la invención es una célula hematopoyética, tales como células madre/progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, células madre/progenitoras hematopoyéticas positivas para CD34 (HPSC)), un monocito, un macrófago, una célula mononuclear de sangre periférica, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o una célula dendrítica. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula hematopoyética CCR5+. En otras realizaciones, la célula hospedadora puede ser una célula hospedadora de un paciente o emparejada con un paciente. En determinadas realizaciones, una célula hospedadora transducida con los vectores de expresión de la divulgación son resistentes a la infección por cepas de VIH con tropismo para X4 o R5, incluyendo cepas resistentes a TARGA.

Las células hematopoyéticas (por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y/o monocitos/macrófagos) para su transducción con un vector de expresión de la invención pueden ser alogénicas o autólogas. Las HPSC son, en algunas realizaciones, positivas para CD34 y se pueden aislar de la médula ósea o la sangre periférica del paciente. Las HPSC positivas para CD34 aisladas (y/u otras células hematopoyéticas descritas en el presente documento) son, en algunas realizaciones, transducidas con un vector de expresión de la invención como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en una realización, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH con una célula objetivo y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional cuyo objetivo es una secuencia dentro de la 5'LTR del VIH como se menciona en la reivindicación 1.

Después de la transducción de las células hematopoyéticas (por ejemplo, FIPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos CD8+ o monocitos/macrófagos) con un vector de expresión como se desvela en el presente documento, las células transducidas son para reintroducción o trasplante en el paciente. Las células transducidas pueden inyectarse por vía parenteral en el paciente o reintroducirse por cualquier otra vía conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las células hematopoyéticas transducidas se inyectan por vía intravenosa en el paciente. En algunas realizaciones, la célula hematopoyética es una HPSC y una dosis eficaz es una cantidad que es suficiente para reconstituir al menos parcialmente el sistema inmunológico con células resistentes al VIH. La dosis podría ser para la administración en una o más administraciones y puede ser desde aproximadamente 0,5 x 106 HPSc por kg de peso del paciente hasta aproximadamente 1 x 109 HPSC por kg de peso del paciente. En otra realización, la célula hematopoyética es un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o un monocito/macrófago y una dosis eficaz puede ser de aproximadamente 1 x 109 células por paciente a 1 x 1011 células por paciente. Sin embargo, la determinación precisa de lo que se consideraría una dosis eficaz puede basarse en factores individuales de cada paciente, incluyendo su tamaño, la edad, la gravedad de la infección por VIH (por ejemplo, el título de virus) y la cantidad de tiempo desde la contracción del virus. Un experto en la técnica, específicamente un médico, podría determinar el número de células hematopoyéticas transducidas que constituirían una dosis eficaz sin someterse a una experimentación indebida. Kits

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un kit que comprende un vector de expresión o una composición que comprende una expresión como se describe en el presente documento. El kit puede comprender un recipiente, donde el recipiente puede ser una botella que comprende el vector de expresión o composición en forma de dosificación oral o parenteral, comprendiendo cada forma de dosificación una dosis unitaria del vector de expresión o composición que comprende el vector de expresión. El kit puede comprender una etiqueta o similar, que indica el tratamiento de un sujeto según el presente método.

Metodología detallada

Síntesis

La presente divulgación también incluye un método para producir un vector de expresión vírico que es capaz de inhibir la unión del VIH a la célula y prevenir la fusión del VIH a la célula y/o la replicación del VIH cuando se expresa en una célula hospedadora. En un ejemplo, el método comprende sintetizar un ADNc de un gen que expresa una proteína capaz de prevenir la fusión del VIH en una célula o la replicación del VIH; clonar el ADNc sintetizado en un sitio de restricción en un vector vírico; e insertar una unidad de expresión capaz de regular por disminución la expresión de un correceptor de VIH en un sitio de restricción en el vector. El ADNc puede ser de cualquier gen que exprese cualquiera de los inhibidores de la replicación o fusión de proteínas descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, el ADNc es un ADNc de C46. En otra realización, el ADNc es un ADNc de TRIM5a o una fusión de ciclofilina del mismo. La unidad de expresión capaz de regular por disminución la expresión de un correceptor del VIH puede ser cualquiera de las moléculas de ARN inhibidoras descritas en el presente documento, tal como ARNip, ARNhc, o antisentido dirigido al correceptor. En un ejemplo, la unidad de expresión es un ARNhc dirigido a CCR5. En algunos ejemplos, un ARNhc dirigido a un promotor del VIH-1 se clona en un vector existente, TAL como un vector que expresa un ARNhc dirigido a CCR5 y/o C46. En algunos ejemplos, el plásmido existente se corta con una enzima de restricción. A continuación, se puede usar una enzima en fusión para fusionar cuatro o más conjuntos de segmentos de ADN mediante recombinación homóloga, los cuatro o más conjuntos de secciones de ADN diseñadas para contener aproximadamente 15 pb de secuencia homóloga, lo que permite la recombinación de bloques G individuales. Un primer bloque G, a saber, Bloque G 1, contiene una secuencia promotora U1 y la mitad de la secuencia shPromA. Un segundo bloque G, a saber, Bloque G 2, contiene la otra mitad de la secuencia shPromA. La recombinación va seguida de la transformación de E. coli con selección de antibióticos.

Dúplex de ARN. Se diseñaron dúplex de ARN bicatenario cuyo objetivo era la región 5'LTR del VIH-1. Los dúplex de ARN fueron sintetizados por Invitrogen. Cada construcción de ARNip tenía 19 pb de longitud y se diseñó con un saliente TT en 3'.

Cultivo celular. Los medios y reactivos para cultivo celular se adquirieron en Gibco. Las células HeLa T4+ se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero bovino fetal, 5 U/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina (DMEM suplementado) y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Las células HeLa T4+ se mantuvieron bajo selección con G418 (500 pg/ml) e higromicina (300 pg/ml), respectivamente.

Infección viva por VIH-1 y transfección de ARNip. Se sembraron cultivos celulares para experimentos de curso temporal utilizando virus competentes en replicación con 5 x 104 células HeLa-T4+, se incubaron durante la noche y, a continuación, se transfectaron con 50 pM del panel de ARNip apropiado. Al día siguiente, los cultivos transfectados con ARNip HeLa-T4+ se infectaron con la cepa SF162 del VIH-1, utilizando 140 pg/pl. Los sobrenadantes se recolectaron durante un periodo de tiempo de 15 días para el análisis de la producción de virus usando el ensayo de transcriptasa inversa (RT) descrito a continuación. Los cultivos para el experimento de ChIP se sembraron con 2 x 105 células HeLa-T4+, se incubaron durante la noche y, a continuación, se infectaron con la cepa SF162 de VIH-1 usando 1.000 pg/pl y se dejó que la infección prosiguiera durante 3 días. A continuación, los cultivos infectados se transfectaron con ARNip 300 pM 143, 136, 205, PromA o simulacros de transfección durante 48 horas antes de la cosecha para el ensayo de ChIP. Las transfecciones se realizaron usando RNAiMax (Invitrogen, Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cuantificación de virus. La actividad de la transcriptasa inversa (RT) en los sobrenadantes de cultivo se determinó como se ha descrito anteriormente (Suzuki, K., Craddock, B. P., Okamoto, N., Kano, T., Steigbigel, R. T., J Virol Methods, 44: 189-98, 1993). El ARNm del VIH-1 se cuantificó utilizando un ensayo de RT-PCR en tiempo real específico para gag de VIH como se ha descrito anteriormente (Suzuki et al., J RNAi Gene Silencing, 2005). Brevemente, las reacciones de RT-PCR se realizaron con RT-PCR de un solo paso SuperScript (Invitrogen) usando 0,4 |^jM de cebadores sentido y antisentido, y 0,1 ^j M de sonda Taqman fluorogénica específica de secuencia. Se construyeron curvas patrón utilizando el plásmido pNL4-3 de VIH genómico para VIH-1 y un fragmento de PCR de beta-actina clonado en TA (Invitrogen, Monte Waverley, Australia). Los cebadores y las sondas utilizados son proporcionados por las SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35.

Tratamientos farmacológicos.

Los cultivos del modelo de células latentes J-Lat 9.2 se trataron con varias concentraciones de SAHA (0-100 uM), TNF (0-100 ng/ml) o una combinación de SAHA/TNF (0-25 uM, 0-100 ng/ml) durante 48 horas. La expresión de GFP se midió usando citometría de flujo (LSRFortessa-BD) para detectar la reactivación del provirus de VIH-1 integrado y se analizó usando FlowJo.

Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Se sembraron células HeLa T4+ (5 x 105) en matraces T-25 y 24 horas después se infectaron con la cepa SF162 de VIH-1 como se ha descrito anteriormente. El día 3 después de la infección, los cultivos se transfectaron con 300 pmol de cada uno de los ARNip 143, 143T, 136, 205 y el ARNip principal PromA actual o transfectado de forma simulada como un cultivo de control como se ha descrito anteriormente. A las 48 horas de la transfección, los cultivos se recolectaron para el ensayo de ChIP usando el kit EZ Magna A/G ChIP (Millipore, Australia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los gránulos se sometieron a ultrasonidos durante 20 minutos (1 minuto con ultrasonidos, 1 minuto sin ultrasonidos) en un sonicador COVARIS 5 con un ciclo de trabajo del 5 %: intensidad 4, ráfaga/ciclos 200 y la proteína se aisló según las instrucciones del fabricante. Las inmunoprecipitaciones se realizaron utilizando 5 ug/ml de cada anticuerpo, específicos para las histonas H3K27me3 (# 17-622) y H3K9Ac (# 17-658) obtenidas de Merck Millipore, por cada 2x106 equivalentes de células.

Análisis estadístico. Los datos de ChIP se probaron para determinar su significación utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica y se dan como media ± SEM. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis se realizaron utilizando Graphpad Prism versión 6.0 (Graphpad Software, San Diego, CA).

Ejemplos

Ejemplo 1. Los ARNip que se dirigen a la región U3 pueden inducir la supresión del VIH-1.

Se usó la cepa SF162 del VIH-1 de subtipo B para infectar cultivos de HeLa T4+ y se recolectaron los sobrenadantes durante un período de tiempo prolongado y se midió la transcriptasa inversa (RT). Para confirmar si un solo apareamiento erróneo puede disminuir el efecto supresor, se incluyó ARNip 143T, que contenía un solo apareamiento erróneo de T, ya que corresponde a una variación común en la posición 16 entre los subtipos A del VIH-1, D, F, G y U (Figura 5) y la secuencia GenBank 3'LTR de SF162 del VIH-1 (número de acceso M65024.1). Los ARNip, 143, 136T, ARNip, 205S y PromA, suprimieron de forma potente la infección productiva por VIH-1SF162 con una reducción > 1.000 veces de la actividad de la RT en comparación con las células transfectadas de forma simulada el día 15 después de la infección. Curiosamente, el ARNip 143T suprimió la infección por virus de forma similar al ARNip 143 y PromA hasta el día 6 después de la infección, pero no pudo mantener la supresión del virus más allá de este punto. Estos datos indican que un solo apareamiento erróneo objetivo es suficiente para interrumpir la supresión prolongada del virus VIH-1 inducida por ARNip.

Para determinar la conservación de la secuencia de los ARNip 143, 136 y 205, se realizó una alineación de secuencia a través de los subtipos A a G y U del VIH-1 y se generaron logotipos de secuencia (Figura 3) (Crooks, Hon, Chandonia, y Brenner, 2004, Genome Res 14: 1188-90; Schneider, y Stephens, 1990, Nucleic Acids Res 18, 6097-100). Por ejemplo, la conservación de la secuencia de ARNip 143 mostró una mediana de identidad del 94,9 % en 19 posiciones de nucleótidos con un intervalo de identidad de 9/19 nucleótidos que tienen > 95% de conservación, 13/19 nucleótidos que tienen > 90% de conservación y 18/19 nucleótidos que tienen > 80% de conservación. Como se ha informado anteriormente, siPromA está altamente conservado en todos los subtipos, con la excepción de una deleción de un pb en el subtipo C y mostró una identidad mediana del 98,4 % en 19 posiciones de nucleótidos (Figura 3).

Ejemplo 2. Se observaron marcadores de heterocromatina en cultivos de VIH-1 suprimidos por el nuevo ARNip candidato 143 y PromA.

Para determinar si la supresión del VIH-1 mediada por ARNip 143 se asoció con marcas de heterocromatina como se describe para PromA, se realizaron ensayos de ChIP para las modificaciones epigenéticas en 5'LTR 48 horas después de la transfección. Se observaron aumentos significativos en H3K27me3; ~ 10 veces en cultivos transfectados con ARNip 143 (p <0,0001) y > 5 veces en cultivos transfectados con ARNip PromA (p <0,0001) en comparación con los cultivos transfectados de forma simulada (Figura 6a). También se observaron aumentos significativos en H3K9me3; ~ 5 veces en cultivos transfectados con ARNip 143 y ARNip PromA (p <0,001) en comparación con los cultivos transfectados de forma simulada (Figura 6b). Se observó un reclutamiento significativo de Agol en cultivos transfectados con ARNip 143 y siPromA en comparación con cultivos transfectados de forma simulada (Figura 6d). Se observaron reducciones significativas en el marcador de acetilación de histonas H3K9Ac en cultivos transfectados con ARNip 143 y PromA (4 y 6 veces, ambos p <0,05) (Figura 6e). De manera similar, se informaron de aumentos significativos en H3K27me3 en cultivos transfectados con ARNip 136 y si205 en comparación con cultivos transfectados de forma simulada (Figura 6f). Por último, se informaron de disminuciones significativas en cultivos transfectados con ARNip 136 y si205 en comparación con cultivos transfectados de forma simulada (Figura 6 g). Conjuntamente, estos datos sugieren fuertemente que los miméticos de ARNip 143, 136 y 205 silencian el VIH a través de mecanismos TGS.

Ejemplo 3. El ARNhc dirigido a la 5'LTR disminuye la reactivación inducida por tratamientos farmacológicos en células latentes de VIH-1 J-Lat 9.2.

Para ampliar el estudio e investigar el efecto de la secuencia objetivo de ARNip143 en un modelo de latencia del VIH-1, se generaron células J-Lat 9.2 transducidas de manera estable con horquilla corta sh143, shPromA o transducidos con shPromA y sh143 usando vectores lentivirus separados. A continuación, se intentó reactivar el VIH-1 latente integrado en las células J-Lat 9.2 usando SAHA, TNF o una combinación de SAHA/TNF en varias concentraciones y la expresión de GFP se midió como una lectura de la transcripción del VIH, a las 48 horas. Se observó que las células J-Lat 9.2 transducidas con sh143, shPromA o sh143/shPromA dual eran en gran medida resistentes a la reactivación de SAHA, TNF o combinaciones de SAHA/TNF a concentraciones fisiológicas y mostraron un nivel bajo de reactivación incluso a concentraciones de fármaco suprafisiológicas, mientras que los transducidos con un control de ARNhc mostraron una expresión de GFP muy elevada, lo que indica la reactivación de la infección latente por VIH-1 (Figura 7). De manera importante, la línea celular J-Lat 9.2 transducida con sh143/shPromA dual pareció mostrar un efecto ligeramente mejor en la protección contra los estímulos de reactivación. Estos datos demuestran que las células J-Lat 9.2 del modelo de latencia del VIH-1 son en gran medida resistentes a la reactivación mediante tratamientos farmacológicos cuando se transducen con sh143 y/o shPromA.

Ejemplo 4. Análisis de ADN y ARNm vírico intracelular con transgenes lentivíricos anti-VIH: ejemplo de construcciones lentivíricas de ARNhc inductoras de Cal-1 y TGS.

(1) Vector lentivírico Cal-1 basado en inhibidores de entrada del VIH-1.

Experimento infeccioso in vitro basado en MOLT-4. Se prepararon tres conjuntos de muestras basados en células MOLT-4:

a. Células MOLT-4 solas sin transducción de lentivirus Cal-1;

b. Una mezcla de 80 % de células MOLT-4 sin ninguna transducción de Cal-1 y 20 % de células MOLT-4 transducidas con Cal-1. El grado de células transducidas se determinó mediante análisis de citometría de flujo de expresión de C46. Esta configuración experimental fue para monitorizar el efecto transgénico de una población mixta de células MOLT-4 no transducidas (80 %) y células MOLT-4 transducidas Cal-1 (20 %);

c. MOLT-4 se transdujeron con Cal-1 al 100 % con el lentivirus Cal-1 según lo determinado por la expresión de C46 por citometría de flujo.

Aproximadamente 0,5 millones de estas células están infectadas con VIH-1 BaL y se tomaron muestras los días 4, 7, 10, 14 para análisis de ADN intracelular y análisis de ARNm del virus.

Análisis del ADN del VIH-1 intracelular (Figura 8a): El ADN integrado del VIH se analizó usando un conjunto de sonda y cebador de la región LTR del VIH-1.

Se analizó el ADN integrado de VIH-1 en las células MOLT-4 (Figura 8a). Durante el período de tiempo se observó un aumento significativo de los niveles de ADN de VIH-1 en células MOLT-4. Esto es indicativo de un alto nivel de integración de VIH-1 en células MOLT-4.

El cultivo de células MOLT-4 mixto con transducción de Cal-1 al 20 % mostró que el ADN del VIH-1 se detectó el día 10 y el día 14. Sin embargo, el nivel de ADN del VIH-1 observado fue de 10-50 veces menor en comparación con las células MOLT-4 no transducidas. No se detectó ADN de VIH-1 en las células MOLT-4 transducidas al 100 % con Cal-1.

Para detectar el nivel de ARN intercelular de VIH-1, se analizó el ARNm de LTR específico de VIH-1 (Figura 8b). Se detectó ARNm de LTR de VIH-1 asociado celular específico de VIH-1 excepcionalmente elevado en células MOLT-4 () durante los días de cultivo.

Por el contrario, se observó una reducción significativa del ARNm de LTR de VIH-1 asociado a células de VIH-1 en células MOLT-4 transducidas con Cal-1 al 100% (■). Se observó que estos niveles se redujeron más de 1.000 veces. El nivel de reducción en este grupo experimental (10-100 veces) en el ARNm de LTR del VIH-1 asociado a células del VIH-1 en las células MOLT-4 mixtas con una eficiencia transducida del 20% de Cal-1 (A ) es indicativo de protección parcial Infección por VIH. Estas observaciones demuestran que el vector de lentivirus Cal-1 es capaz de inducir una reducción de más de 1.000 veces la transcripción del VIH en células MOLT-4.

A pesar de que el nivel de ADN de VIH-1 no se detecta en las células MOLT-4 transducidas con Cal-1, el ARNm de LTR asociado a células de VIH-1 todavía era detectable (■) en la Figura 8b. Esto es una indicación de que estaba teniendo lugar un nivel muy bajo de transcripción de ARN a partir de una población muy pequeña de ADN integrado de VIH-1 en células MOLT-4.

Un número de células estimado por esta PCR de ADN fue de aproximadamente 1-2 x 10e5 cantidad equivalente de células de ADN por una reacción de PCR. Por lo tanto, la sensibilidad de detección del VIH-1 en este formato de ensayo es de 2 copias por 1-2 x 10e5 células. Si la frecuencia integrada del ADN del VIH-1 fuera inferior a 2 copias por 1-2 x 10e5 células, el ensayo no sería capaz de detectar el ADN del VIH-1 en este formato.

Es posible que los niveles de ARNm de LTR de VIH-1 observados fueran el resultado de una fracción muy pequeña de células MOLT-4, que fracasaron en transducirse con Cal-1.

(2) Vector lentivírico de ARNhc inductor de TGS.

Experimento infeccioso in vitro basado en PM-1. Se prepararon tres conjuntos de muestras basadas en la línea de linfocitos T PM-1 CD4+:

a. células PM-1 solas sin transducción de ARNhc de lentivirus;

b. células PM-1 transducidas con shPromA (ARNhc dirigido a la región promotora del VIH-1 (se describió el detalle de la construcción shPromA: Suzuki K, et.al, Mol Ther Nucleic Acids 2013, 2:e137);

c. células PM-1 transducidas con control shPromA-Scrambled.

Aproximadamente 0,5 millones de estas células se infectaron con la cepa JR-FL del VIH-1 y se tomaron muestras el día 10 para el análisis del ADN intracelular y del ARNm del virus.

Se analizó el ADN integrado de VIH-1 en las células PM-1 (Figura 9a). Los tres conjuntos de condiciones experimentales contenían cantidades relativamente similares de ADN del VIH-1.

Para detectar el nivel de ARN intercelular de VIH-1, se analizó el ARNm de gag específico de VIH-1 (Figura 9b). A pesar de la presencia de ADN del VIH-1 en células PM-1 transducidas con shPromA (Figura 9a), la transcripción del VIH-1 se suprimió en gran medida. Específicamente, se observó una reducción de alrededor de 1.000 veces en comparación con el control de infección simulado con PM-1 no transducido y el control shPromA-Scrambled. Estas observaciones son una indicación de que shPromA es capaz de inducir una reducción de aproximadamente 1.000 veces la transcripción del VIH-1 utilizando el modelo celular PM-1.

Basado en los datos anteriores, se predice que un enfoque de combinación que comprende el ARNhc inductor de Cal-1 y TSG generará un orden de supresión superior a 106 en las líneas de linfocitos T transducidos en comparación con la infección simulada no transducida. Por lo tanto, los inventores esperan observar una supresión completa de la expresión de la transcripción del VIH-1 por este sistema de vector de lentivirus anti-VIH de combinación triple y/o cuádruple.

Ejemplo 5

Los solicitantes creen que los vectores de combinación triple o cuádruple de acuerdo con la presente divulgación son al menos tan seguros y eficaces como las construcciones de vectores duales, tales como Cal-1, descritos en el presente documento. Los solicitantes han demostrado que el trasplante autólogo que utiliza vectores lentivíricos Cal-1 es seguro y media el marcaje genético estable en sangre periférica de macaco tras un único trasplante utilizando acondicionamiento mieloablativo y sin métodos de selección para células modificadas genéticamente. Los solicitantes también han demostrado que los animales trasplantados con células CD34+ transducidas con Cal-1 exhiben a largo plazo, injerto de múltiples linajes de células marcadas con genes, y que estas células son capaces de resistir la exposición al SHIV ex vivo e in vivo. En efecto, los ensayos ex vivo muestran que la eficacia de la transducción de Cal-1 de las células CD34+ se correlaciona con los niveles de mareaje genético en sangre periférica y tejidos de animales trasplantados medidos antes de la infección, que las células CD4+ de animales trasplantados con Cal-1 son resistentes a la infección por SHIV ex vivo y que las células marcadas con genes experimentan una selección positiva dependiente del virus. Los solicitantes también han demostrado en experimentos de clasificación de subconjuntos que existe un aumento preferencial en el marcado en subconjuntos susceptibles al SHIV, es decir, en el compartimento de linfocitos T.

Con base en al menos estos hallazgos, los solicitantes creen que la incorporación de uno o más elementos de silenciamiento génico transcripcional en el vector Cal-1 existente producirá un vector de construcción triple o cuádruple que es al menos tan seguro y al menos tan eficaz como Cal-1 (o al menos tan seguro y eficaz como un vector que comprende uno o más elementos de silenciamiento génico transcripcional). Como tal, la potencia y toxicidad combinadas de las construcciones lentivíricos (LV) de combinación triple y cuádruple (véase la Figura 10) se probarán en una serie de experimentos in vitro e in vivo, con el objetivo específico de demostrar si combinar el efecto del vector de expresión que comprende el ARNhc contra CCR5 y/o el inhibidor de la fusión C46) con el efecto de los ARNhc que inducen el silenciamiento génico transcripcional (TGS) del mismo vector lentivírico es complementario o incluso sinérgico en términos de control del reservorio vírico. En la actualidad existe una evidencia creciente de que tales construcciones multiplexadas pueden expresar y permitir de forma eficiente el procesamiento de múltiples ARNhc usando combinaciones de los promotores H1, U6 y U1.

2a) Una vez que se sintetizan las construcciones lentivíricas de la presente divulgación, los inventores demostrarán que hay niveles de expresión efectivos y esperados de cada uno de los ARNhc inductores de TGS e inhibidores de CCR5 y que se expresan y procesan con la misma eficacia.

2b) Los solicitantes demostrarán que las construcciones lentivíricas de la presente divulgación pueden inducir TGS tan eficazmente como el elemento de silenciamiento génico transcripcional solo mediante el seguimiento de la dinámica de infección con un virus de tropismo CXCR4 (NL4.3) y un virus pseudotipado VZV-G. Ambos virus evadirán el ARNhc de CCR5 y el último evadirá C46, permitiendo que el grado de silenciamiento logrado a través de TGS inducido por ARNhc expresado a partir de construcciones de la presente divulgación se evalúe in vitro independientemente de los efectos de los otros componentes de ácidos nucleicos (por ejemplo, dirigido a CCR4 y/o C46, etc.). En paralelo, usando un ensayo indicador de p-lactamasa (BLAM), los inventores demostraron la inhibición de la entrada de un virus CCR5 usando para demostrar que las construcciones de la presente divulgación tienen una eficacia equivalente a las construcciones descritas en la publicación de Estados Unidos n.° 2012/0201794. Esto se confirmará cuantificando el marcaje lentivírico relativo y el ADN del VIH-1 en estos cultivos. Estos experimentos demostrarán la equivalencia de expresión y eficacia de cada ARNhc individual cuando se administra mediante construcciones lentivíricas estándar (construcción de agente único/doble) o compleja (agente triple/cuádruple).

2c) Una vez demostrado esto, se llevarán a cabo experimentos similares a los descritos en el documento PCT/AU2015/050507 (publicado como WO 2016/029275 A1) para comparar la eficacia y el alcance de los efectos fuera de la objetivo entre (1) los vectores/construcciones de expresión como se describe en la publicación de Estados Unidos N.° 2012/0201794, (2) el candidato principal de TGS del documento PCT/AU2015/050507 (publicado como WO 2016/029275 a 1) y (3) las construcciones de la presente divulgación. Estos experimentos demostrarán si alguna de las construcciones de la presente divulgación tiene efectos mayores que los descritos en la publicación de Estados Unidos n.° 2012/0201794 o los descritos en el documento PCT/AU2015/050507 (publicado como WO 2016/029275 A1), y, particularmente, porque actúan en diferentes estadios del ciclo de vida, si el efecto es aditivo o incluso sinérgico.

2d) Una vez que los experimentos in vitro hayan demostrado al menos efectos aditivos de uno de los LV de la presente invención, se utilizarán para la evaluación in vivo de la eficacia en el modelo de ratón BLT como se ha descrito anteriormente en un experimento de cuatro brazos que compara su eficacia directamente con la construcción principal TGS LV del documento PCT/AU2015/050507 (publicado como WO 2016/029275 A1), la publicación de Estados Unidos n.° 2012/0201794 y el vector vacío. El criterio de valoración principal será el tamaño del reservorio de VIH integrado en los linfocitos T CD4+ del bazo. Los criterios de valoración secundarios incluirán los recuentos de linfocitos T pVL y CD4+.

2e) Una vez que se demuestra in vivo la ventaja potencial de la construcción LV de la presente divulgación, además de la transducción y la exposición de HSC CD34+, los inventores reconstituirán ratones BLT con linfocitos T CD4+ transducidos obtenidos de un donante infectado por VIH para demostrar que, en presencia de un reservorio de virus establecido, una construcción de LV principal de la presente divulgación puede silenciar eficazmente virus integrados preexistentes.

Resultados: Los inventores esperan que la construcción LV viii) cumpla mejor con los resultados de a)-c) y que debido a múltiples objetivos de virus, el efecto supresor será al menos aditivo. Se espera que los estudios in vivo confirmen un control más potente y prolongado del reservorio viral, el virus pVL y el mantenimiento de los recuentos de linfocitos T CD4+, tanto en la periferia como en los tejidos. También se obtendrán datos preliminares de toxicidad.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión que comprende (a) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional; y (b) al menos otras dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor de VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH; una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la entrada del virus; donde la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de una 5'LTR de VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 9, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de s Eq ID NO: 17; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es la secuencia de SEQ ID NO: 36.

3. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un dúplex de ARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos un 95 % con una de la SEQ ID NO: 6 , la secuencia de SEQ ID NO: 14, la secuencia de SEQ ID NO: 22 o la secuencia de SEQ ID NO: 40.

4. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde la al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un elemento de silenciamiento génico transcripcional es un ARNhc seleccionado del grupo que consiste en (i) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8; (ii) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16; (iii) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 24; y (iv) un ARNhc que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 42.

5. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteína que inhibe la replicación del VIH se selecciona del grupo que consiste en TRIM5a humana, TRIM5a de rhesus, TRIM5a quimérica, una proteína de fusión TRIM5-ciclofilina humana, ciclofilina, ubiquitina E3, APOBEC3G y antígeno 2 de células del estroma de la médula ósea (BST-2).

6. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las al menos otras dos secuencias de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor de VIH; y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH.

7. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de ácido nucleico que inhibe un correceptor de VIH tiene una secuencia de SEQ ID NO: 25.

8. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína inhibidora de fusión del VIH tiene la secuencia de SEQ ID NO: 26.

9. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el vector vírico es un vector lentivírico autoactivante o un vector retrovírico.

10. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica otro ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia dentro de la región 5'LTR del VIH, donde el cuarto ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 143 hasta aproximadamente la posición 161 de la 5'LTR del VIH-1, (ii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 136 hasta aproximadamente la posición 154 de la 5'LTR del VIH-1, (iii) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 205 hasta aproximadamente la posición 223 de la 5'LTR del VIH-1; y (iv) un ácido nucleico de silenciamiento cuyo objetivo es una secuencia desde aproximadamente la posición 350 hasta aproximadamente la posición 368 de la 5'LTR del VIH-1; y donde la cuarta secuencia de ácido nucleico es diferente a la tercera secuencia de ácido nucleico.

11. Un método in vitro para el tratamiento de células madre hematopoyéticas humanas infectadas por el VIH, que comprende proporcionar células madre hematopoyéticas extraídas de sangre circulante o médula ósea de un paciente huésped; y tratar las células madre hematopoyéticas con el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento del VIH.

13. Una célula hospedadora transducida por el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Una composición que comprende el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.