ES2638163T3 - Sistema óptico para un citómetro de flujo - Google Patents

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ES2638163T3 ES07751588.0T ES07751588T ES2638163T3 ES 2638163 T3 ES2638163 T3 ES 2638163T3 ES 07751588 T ES07751588 T ES 07751588T ES 2638163 T3 ES2638163 T3 ES 2638163T3
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Collin A. Rich
Richard L. Fisher
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Abstract

Sistema de citómetro de flujo con un sistema óptico, que comprende: un canal de flujo (14) con una zona de interrogación (12); una fuente de iluminación (16) que incide en el canal de flujo (14) en la zona de interrogación (12) desde una dirección particular; y un sistema óptico (10) que incluye un sistema de lente (18) con múltiples superficies de lente (20) dispuestas alrededor de la zona de interrogación (12) a lo largo de un plano perpendicular al canal de flujo, y cada superficie de lente está dispuesta para recoger y colimar luz procedente de la zona de interrogación (12); y un sistema de detección (22) con múltiples detectores (24) adaptados para detectar luz procedente del sistema de lente (18), incluyendo cada detector (24) un filtro local correspondiente (26); caracterizado por que: el sistema de lente (18) incluye por lo menos cinco superficies de lente (20) dispuestas alrededor de la zona de interrogación (12) que incluyen una superficie de lente de dispersión hacia delante, dos superficies de lente de dispersión lateral, y por lo menos dos superficies de lente de fluorescencia, incluyendo el sistema de lente (18) una pieza unitaria con múltiples facetas que definen las superficies de lente (20); y por que cada filtro local (26) filtra independientemente unas longitudes de onda específicas, de tal manera que la luz filtrada por un filtro local para un primer detector (24) no afecte a la luz detectada por un segundo detector (24).

Description

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DESCRIPCION
Sistema optico para un citometro de flujo.
La presente invention se refiere en general al campo de citometros de flujo y, mas especificamente, a un sistema optico nuevo y util en el campo de citometria de flujo.
Antecedentes
El sistema optico convencional para citometros de flujo incluye una lente colectora para recoger luz procedente de la zona de interrogation, divisores de haz para dividir la luz en diferentes canales sobre la base de la longitud de onda y varios subsistemas detectores con filtros para dejar pasar solamente longitudes de onda particulares (tales como, 515-545 nm, 564-606 nm y 653-669 nm).
Para utilizar el sistema optico convencional, los divisores de haz y los filtros deben disponerse en un orden muy particular (orden monotonamente creciente o decreciente). Por ejemplo, un primer divisor de haz debe dividir entre las dos bandas de frecuencia inferiores, un primer subsistema detector debe filtrar entre la banda de frecuencia mas inferior, un segundo divisor de haz debe dividir entre las dos bandas de frecuencia superiores, un segundo subsistema detector debe filtrar entre las bandas de frecuencia medias, y un tercer subsistema detector debe filtrar entre las bandas de frecuencia mas altas. Para cambiar la detection de longitud de onda del sistema optico convencional (por ejemplo, para sustituir la banda de frecuencia que es originariamente la mas alta por una banda de frecuencia que es ahora la mas baja) se requeriria la reorganization de todo el sistema optico (incluyendo canjear tanto los filtros como los divisores de haz). En otras palabras, con un sistema optico convencional, la etapa de filtrar la luz del primer canal afecta a la luz del segundo canal.
Asi, el usuario debe disponer habilmente los filtros en un orden particular o los subsistemas de detector no funcionaran correctamente. Esta limitation impide la facil canjeabilidad de los filtros y la facil modification de los parametros de deteccion. Ademas, la disposition particular de la tabla optica reduce la fiabilidad y la robustez del citometro de flujo puesto que la alineacion de los divisores de haz afecta a la deteccion de cada uno de los subsistemas de detector.
Asi, existe una necesidad en el campo de citometros de flujo de crear un sistema optico nuevo y util. Esta invencion proporciona tal sistema optico nuevo y util.
Ejemplos de diversos sistemas de citometro de flujo anteriores con sistemas opticos que incluyen multiples lentes y filtros se describen en las patentes US 2006/0002634, EP 1396736 y US 4933813. Sin embargo, estas disposiciones pueden mejorarse en particular para permitir un establecimiento y modificacion mas faciles de los parametros de deteccion.
La patente US n° 4.293.221 divulga sistemas de flujo para analisis fotometrico de particulas, tales como celulas biologicas, particularmente para obtener contornos multidimensionales de tipo hendidura-exploracion, asi como otras imagenes. En un enfoque amplio, las celulas tenidas de fluorocromo en suspension fluyen a traves de una hendidura enfocada de luz de excitation laser que define una region de excitacion plana en el plano X-Y. Cuando cada celula tintada de fluorocromo fluye a traves de la region de excitacion, se generan emisiones de fluorescencia en la intersection de la region de excitacion y la celula. Para generar un contorno de tipo hendidura-exploracion a lo largo del eje Z, se vigilan las emisiones de fluorescencia cuando la celula fluye a traves de la region de excitacion y una pluralidad de secciones transversales paralelas sustancialmente planas de la celula a lo largo del eje Z se excitan para fluorescencia. Para generar contornos de tipo hendidura- exploracion a lo largo de los ejes X e Y celulares, diversas formas de realization del sistema optico definen diversas combinaciones de partes lineales celulares dentro de la section transversal del eje Z. La fluorescencia u otras emisiones procedentes de estas partes lineales celulares se combinan entonces integrandose para generar los contornos deseados. En otro enfoque amplio descrito, un volumen tridimensional de una celula en flujo se ilumina con radiation de excitacion que no sea un haz estrecho. Tres sistemas opticos ven un punto central en el sistema de flujo. Los sistemas opticos son de formation de imagen por hendidura y tienen tres respectivos ejes ortogonales uno con relation a otro y estan situados simetricamente alrededor de la corriente, de tal modo que el eje de
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flujo forme angulos iguales con cada eje optico. Un tubo fotomultiplicador para cada sistema optico detecta la fluorescencia de las celulas tomadas como imagen.
Por tanto, segun la presente invention, se proporciona un citometro de flujo como se describe en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 es una representation esquematica de la primera forma de realization preferida de la invencion.
Las figuras 2 y 3 son unas vistas detalladas superior y lateral, respectivamente, de una lente colectora de una variation de la primera forma de realizacion preferida de la invencion.
La figura 4 es una representacion esquematica de una segunda forma de realizacion preferida de la invencion.
Descripcion de las formas de realizacion preferidas
La siguiente descripcion de las formas de realizacion preferidas de la invencion no esta destinada a limitar la invencion a estas formas de realizacion preferidas, sino mas bien a habilitar a cualquier experto en la materia a realizar y utilizar esta invencion.
Como se muestra en la figura 1, el sistema optico 10 de las formas de realizacion preferidas de la invencion esta integrado preferentemente en un citometro de flujo. En este entorno preferido, el citometro de flujo define un canal de flujo 14 con una zona de interrogation 12 e incluye una fuente de iluminacion 16 que incide en la zona de interrogacion 12 desde una direction particular. El sistema optico 10 incluye preferentemente un sistema de lente 18 con multiples superficies de lente 20 dispuestas alrededor de la zona de interrogacion 12, y un sistema de detection 22 con multiples detectores 24 dispuestos para detectar la luz recogida y colimada por el sistema de lente 18. Los multiples detectores 24 estan acoplados cada uno de ellos a un filtro local 26 que filtra independientemente la luz recogida para longitudes de onda especificas. Aunque el sistema optico 10 de la forma de realizacion preferida se ha disenado especificamente para una zona de interrogacion 12 de un citometro de flujo, el sistema puede utilizarse alternativamente en cualquier sistema adecuado para recoger luz desde un punto a lo largo de multiples trayectorias.
El sistema de lente 18 de la primera forma de realizacion preferida funciona para recoger y colimar la luz dispersa y/o emitida desde la zona de interrogacion 12. El sistema de lente 18 incluye cinco o mas superficies de lente 20 (una hacia delante, dos de dispersion lateral y dos o mas de fluorescencia). En la forma de realizacion preferida, el sistema de lente 18 esta compuesto de lentes independientes. En una forma de realizacion alternativa, el sistema de lente 18 puede estar formado como una pieza unitaria con multiples facetas. El sistema de lente 18 esta dispuesto preferentemente a lo largo de un plano paralelo a la fuente de luz y perpendicular al canal de flujo 14, pero puede disponerse alternativamente de cualquier manera adecuada.
El sistema de lente 18 puede incluir por lo menos cinco lentes enteras (preferentemente, una lente esferica 011-0330 producida por Optosigma de Santa Ana, California). Las lentes enteras incluyen preferentemente una apertura numerica utilizable de aproximadamente 0,31. En una variacion, como se muestra en la figura 2, el sistema de lente 18 incluye lentes truncadas (preferentemente, una lente asferica 46-347 producida por Edmund Optics de Barrington, Nueva Jersey). En otras variaciones, las lentes pueden ser enteras o truncadas, pueden ser esfericas o asfericas y pueden ser similares o disimilares entre ellas.
El truncado de las lentes funciona para incrementar la capacidad de recoger luz del sistema de lente 18, mientras se mantiene una estrecha proximidad a la zona de interrogacion. Hay un limite al tamano maximo de la apertura numerica de la lente debido a la disposition geometrica de las lentes alrededor de la zona de interrogacion 12. Truncando las lentes, estas pueden localizarse a la misma distancia de la zona de interrogacion 12 que una lente esferica, al tiempo que tienen una altura incrementada y, por tanto, una apertura numerica incrementada. Con una capacidad de recoger luz incrementada (o
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apertura numerica incrementada de la superficie de lente), el sistema sera capaz de proporcionar una imagen mas brillante y permitira la visualization de detalles mas finos. Preferentemente, las lentes se truncan para eliminar el borde de la lente. Mas preferentemente, como se muestra en las figuras 2 y 3, las lentes se truncan aproximadamente un 35% en la direction horizontal para eliminar tanto el borde como una parte de la lente dentro del diametro de apertura transparente. Sin embargo, las lentes pueden truncarse en cualquier cantidad adecuada para aumentar la capacidad de recoger luz del sistema de lente 18, mientras mantienen una estrecha proximidad a la zona de interrogation. La anchura de la lente es la dimension en el plano de la figura 1. La apertura numerica de la lente puede incrementarse aumentando la altura de la lente. La eficiencia de recogida de potencia de la lente aumenta proporcionalmente con el incremento en altura. Las lentes asfericas truncadas incluyen preferentemente una apertura numerica utilizable de aproximadamente 0,49.
Las superficies de lente 20 pueden incluir revestimientos que funcionan para convertir las superficies de lente 20 en filtros especificos de longitud de onda. Los revestimientos pueden incluir diversos compuestos inorganicos u organicos, de tal manera que los compuestos absorban longitudes de onda de luz especificas mientras transmiten otras longitudes de onda. Cada lente presenta preferentemente un revestimiento diferente, de tal manera que filtrara una longitud de onda especifica que sea diferente de las longitudes de onda filtradas por las otras superficies de lente 20. Alternativamente, por lo menos dos superficies de lente 20 pueden presentar el mismo revestimiento. Las superficies de lente revestidas 20 pueden trabajar cooperativamente con los filtros locales 26 acoplados a los detectores 24 que filtran longitudes de onda especificas o pueden filtrar independientemente unas longitudes de onda especificas.
El sistema detector de la primera forma de realization preferida funciona para detectar luz procedente del sistema de lente 18. El sistema detector incluye preferentemente multiples detectores 24. Los detectores son preferentemente un tubo fotomultiplicador (“PMT”) o un fotodiodo, pero pueden incluir alternativamente cualquier dispositivo adecuado, tal como una camara, para detectar luz u otra energia electromagnetica. En la primera forma de realizacion preferida, el sistema detector incluye un detector 24 para cada superficie de lente 20 del sistema de lente 18. Los detectores 24 estan dispuestos preferentemente en una trayectoria directa desde las superficies de lente 20, y la luz recogida y dirigida por el sistema de lente 18 es guiada preferentemente a los detectores 24 por una trayectoria de luz apropiada. La trayectoria de luz es preferentemente un canal de aire por simplicidad, pero puede ser alternativamente un cable de fibra optica o cualquier otro guiaondas apropiado. Segun un ejemplo mostrado en la figura 4, el sistema detector incluye mas detectores 24 que las superficies de lente 20 del sistema de lente 18. En esta forma de realizacion, el sistema de lente 18 incluye tambien dispositivos opticos convencionales, tales como divisores de haz 28, para derivar la luz recogida y dirigida al sistema detector. En esta forma de realizacion, los divisores de haz 28 son preferentemente no selectivos con respecto a la longitud de onda, lo que preserva la libertad para filtrar independientemente unas longitudes de onda especificas (utilizando filtros locales 26) en cada uno de los diversos detectores 24.
Los detectores 24 estan acoplados cada uno de ellos a un filtro local 26 que filtra independientemente unas longitudes de onda especificas. El filtro local 26 es accedido preferentemente con facilidad por el usuario, de tal modo que el usuario pueda canjear filtros diferentes y cambiar la detection de longitud de onda del sistema detector. La etapa de filtrar la luz del primer canal no afecta preferentemente a la luz del segundo canal del sistema detector. Asi, el usuario puede canjear facilmente los filtros en cualquier orden para conseguir los mismos parametros de deteccion. Ademas, puesto que cada uno de los detectores esta alineado independientemente con el filtro local y la superficie de lente, el sistema optico experimenta una fiabilidad incrementada y la robustez con respecto a citometros de flujo convencionales.
Como un experto en la materia reconocera a partir de la description detallada previa y de las figuras y reivindicaciones, pueden realizarse modificaciones y cambios a las formas de realizacion preferidas. La invention esta definida en las siguientes reivindicaciones.

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Sistema de citometro de flujo con un sistema optico, que comprende:
    un canal de flujo (14) con una zona de interrogation (12);
    una fuente de iluminacion (16) que incide en el canal de flujo (14) en la zona de interrogacion (12) desde una direction particular; y
    un sistema optico (10) que incluye
    un sistema de lente (18) con multiples superficies de lente (20) dispuestas alrededor de la zona de interrogacion (12) a lo largo de un plano perpendicular al canal de flujo, y cada superficie de lente esta dispuesta para recoger y colimar luz procedente de la zona de interrogacion (12); y
    un sistema de detection (22) con multiples detectores (24) adaptados para detectar luz procedente del sistema de lente (18), incluyendo cada detector (24) un filtro local correspondiente (26);
    caracterizado por que:
    el sistema de lente (18) incluye por lo menos cinco superficies de lente (20) dispuestas alrededor de la zona de interrogacion (12) que incluyen una superficie de lente de dispersion hacia delante, dos superficies de lente de dispersion lateral, y por lo menos dos superficies de lente de fluorescencia, incluyendo el sistema de lente (18) una pieza unitaria con multiples facetas que definen las superficies de lente (20); y por que
    cada filtro local (26) filtra independientemente unas longitudes de onda especificas, de tal manera que la luz filtrada por un filtro local para un primer detector (24) no afecte a la luz detectada por un segundo detector (24).
  2. 2. Sistema segun la reivindicacion 1, en el que por lo menos una de las multiples lentes esta curvada esfericamente.
  3. 3. Sistema segun la reivindicacion 2, en el que la lente esferica presenta un valor de apertura numerica utilizable comprendido entre 0,25 y 0,35.
  4. 4. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las superficies de lente incluyen un revestimiento adaptado para convertir la superficie de lente en un filtro especifico en longitud de onda.
  5. 5. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sistema detector (22) incluye un detector (24) para cada superficie de lente (20) del sistema de lente (18); y en el que la luz recogida y colimada por las superficies de lente (20) es guiada en una trayectoria directa hasta los detectores (24).
  6. 6. Sistema segun la reivindicacion 5, en el que la luz recogida y colimada por las superficies de lente (20) es guiada en una trayectoria no bifurcada hasta los detectores (24).
  7. 7. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sistema detector (22) incluye multiples detectores (24) para cada superficie de lente (20) del sistema de lente (18), incluyendo ademas por lo menos un divisor de haz (28) que deriva la luz recogida y colimada procedente de la superficie de lente (20) hacia los multiples detectores (24), y en el que el divisor de haz (28) es no selectivo con respecto a la longitud de onda.
  8. 8. Sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada uno de los detectores (24) esta independientemente alineado con su filtro local (26) y superficie de lente (20) correspondientes.
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