ES2634454T3 - Conjugados de oligosacárido aniónico - Google Patents

Abstract

Un conjugado de oligosacárido aniónico de fórmula (I):**Fórmula** en la que: S1 y S2 cada uno representa independientemente un resto de un oligosacárido persulfatado aniónico; x1 representa un número entero de 1 a 4; x2 representa un número entero de 0 a 11; x3 representa un número entero de 0 a 10; x4 representa 0 o 1; y x5 representa un número entero de 1 a 4, en el que dicho resto es la parte de dicho oligosacárido persulfatado aniónico que permanece en dicho conjugado cuando dicho oligosacárido persulfatado aniónico se une al resto de dicho conjugado y en el que S1 y S2 están unidos de forma covalente al resto del conjugado mediante la unión de cada uno de dichos oligosacáridos persulfatados aniónicos al resto del conjugado a través de sus extremos reductores.

Description

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DESCRIPCION

Conjugados de oligosacarido anionico Campo de la invencion

La invencion se refiere a conjugados de oligosacarido anionico que se pueden usar para imitar la estructura y/o actividad de las moleculas bioactivas anionicas conocidas como glucosaminoglucanos (GAG). La invencion tambien se refiere al uso de conjugados de oligosacarido anionico para sondear las propiedades de union de los GAG y desarrollar nuevos agentes biologicamente activos mejorados. La invencion tambien se refiere a metodos para la preparacion de los conjugados de oligosacarido anionico. Los conjugados de oligosacarido anionico de este tipo son utiles en la profilaxis y/o tratamiento de patologfas y en particular trastornos respiratorios inflamatorios.

Antecedentes de la invencion

Se continuan usando, y desarrollando, compuestos a base de sacaridos anionicos naturales y sinteticos, para su uso como agentes terapeuticos. Los ejemplos de los compuestos de este tipo se desvelan, por ejemplo, en el documento WO 2006/017726 A2 o en el documento EP 0 771 815 A1. Un ejemplo bien conocido de un compuesto de este tipo es el producto natural heparina que se ha usado clmicamente durante mas de 80 anos como un anticoagulante. La heparina ha experimentado dos generaciones de mejoras dando como resultado productos con una selectividad y/o especificidad mas elevada para la diana. El primero fue un metodo semisintetico que generaba una heparina de bajo peso molecular que presentaba una especificidad de accion mas elevada. El segundo enfoque implicaba a un pentasacarido sintetico que era selectivo para la protema diana. El enfoque sintetico, sin embargo, consistfa en aproximadamente 40 etapas qmmicas, resaltando la dificultad tecnica asociada con la smtesis de los compuestos de este tipo.

Un enfoque para superar los desaffos planteados por la smtesis de heparina, y los GAG mas ampliamente, ha sido el direccionamiento hacia mimeticos de GAG. Una clase de mimeticos de este tipo son los homo-oligosacaridos naturales sulfatados semisinteticos. Sin embargo, existe una desigualdad entre el tamano pequeno de los oligosacaridos a los que se puede acceder facilmente a partir de fuentes naturales y los oligo- y polisacaridos de mayor tamano grandes que producen actividad en muchos sistemas biologicos. En particular, el acceso a los oligosacaridos que comprenden 6 o mas monosacaridos, a la vez que se mantienen los objetivos de diversidad estructural y bajo coste, es especialmente diffcil.

Existe una necesidad continua de producir mimeticos de GAG que presenten un alto grado de selectividad y/o especificidad, y que se puedan producir mediante metodos rentables, sencillos.

Sumario de la invencion

En un aspecto la invencion proporciona un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

imagen1

en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos;

x1 representa un numero entero de 1 a 4;

x2 representa un numero entero de 0 a 11;

x3 representa un numero entero de 0 a 10;

x4 representa 0 o 1; y

x5 representa un numero entero de 1 a 4.

Los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion tienen una diversidad estructural sustancial y se pueden producir de forma sencilla y eficaz. La longitud del conector generalmente flexible entre los oligosacaridos anionicos se puede adaptar para imitar y/o determinar relaciones espaciales entre partes de los GAG que interactuan con una diana molecular dada, en consecuencia a su vez conduce a la produccion de mimeticos de GAG que poseen un alto grado de selectividad y/o especificidad.

En algunas realizaciones x1 y/o x5 son 1 o 2, preferentemente 2. En algunas realizaciones x2 representa un numero entero de 0 a 4. En algunas realizaciones x3 es un numero entero de 2 a 6, preferentemente 2. En algunas realizaciones x4 es 1. En algunas realizaciones S1 y S2 se seleccionan independientemente entre maltotriosa,

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maltotetraosa, maltopentaosa, xilotetraosa, xilopentaosa, quitotetraosa y quitopentaosa cada uno de los cuales comprende al menos un sustituyente anionico tal como un sustituyente sulfato o fosfato.

En otro aspecto la invencion proporciona un metodo para preparar un oligosacarido anionico de formula (I):

imagen2

en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos; xi representa un numero entero de 1 a 4;

X2 representa un numero entero de 0 a 11;

X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4,

metodo que comprende las etapas de:

a) transformar cada uno de los oligosacaridos en oligosacaridos anionicos; y

b) conjugar los oligosacaridos;

en el que las etapas a) y b) se pueden realizar en cualquier orden.

En otro aspecto la invencion proporciona el uso de un oligosacarido anionico de formula (I):

imagen3

en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos;

X1 representa un numero entero de 1 a 4;

X2 representa un numero entero de 0 a 11;

X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4,

en la profilaxis y/o tratamiento de patologfas, en particular trastornos respiratorios inflamatorios. En otro aspecto la invencion proporciona el uso de un oligosacarido anionico de formula (I):

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en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos; X1 representa un numero entero de 1 a 4;

X2 representa un numero entero de 0 a 11;

X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4,

en un ensayo o identificacion sistematica.

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En otro aspecto la invencion proporciona un ensayo o identificacion sistematica para determinar el efecto biologico de uno o mas conjugados de oligosacarido anionico, ensayo que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un ligando, celula o animal con uno o mas conjugados de oligosacarido anionico teniendo cada uno independientemente la siguiente formula (I):

imagen5

en

la que

S1

ys2

x1

x2

x3

X4

x5

y

cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos;

representa un numero entero de 1 a 4;

representa un numero entero de 0 a 11;

representa un numero entero de 0 a 10;

representa 0 o 1; y

representa un numero entero de 1 a 4;

b) cuantificar un efecto del uno o mas conjugados de oligosacarido anionico en el ligando;

celula o animal.

En otro aspecto la invencion proporciona un metodo para modular la actividad de un ligando que comprende poner en contacto el ligando con un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

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en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos;

X1 representa un numero entero de 1 a 4;

X2 representa un numero entero de 0 a 11;

X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra el espectro de MALDI-MS del polisulfato de W-Fmoc-1-A/-glicinamidomaltotriosido usando la tecnica de formacion de complejos con el peptido (RG)-igR. La masa del pico principal corresponde al complejo (5810.51) menos el ion peptidico (4227.57) da 1582.94 para el glucoconjugado sulfatado (calc. para 10 O- sulfatos es 1583.38).

La Figura 2 muestra el perfil de elucion para preparacion mediante HPLC preparativa de derivados de Fmoc de malto-oligosacaridos (preparados a partir de "jarabe Pentrup").

La Figura 3 muestra los efectos de 5 mg/kg de compuestos en leucocitos en fluido de lavado nasal recogido 8 horas despues de estimulacion en un modelo de rinitis alergica en cobayas. Los compuestos son, C1: pentosano, C2: (Maltopentaosa)-(Et2)-(Maltopentaosa) y C3: (Maltopentaosa)-Et4-(Maltopentaosa).

La Figura 4 muestra los efectos de budesonida y el conjugado de oligosacarido anionico a diferentes dosis en el contenido de protema total aumentada por antfgeno en fluido BAL (mg/ml) a partir de cobayas alergicos/asmaticos.

Bud = Budesonida; D2 = Conjugado de oligosacarido anionico ID 9; Concentraciones del farmaco 0,1 y

2,5 mg/kg.

** significativamente diferente a P < 0,01 a partir del control positivo * significativamente diferente a P < 0,05 a partir del control positivo ++ significativamente diferente a partir del control negativo

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La Figura 5 muestra los efectos de budesonida y el conjugado de oligosacarido anionico a diferentes dosis en el influjo total de leucocitos aumentado por antigeno en fluido BAL (X 107/ml) a partir de cobayas alergicos/asmaticos.

Bud = Budesonida; D2 = Conjugado de oligosacarido anionico ID 9; Concentraciones del farmaco 0,1 y

2.5 mg/kg.

* significativamente diferente a P < 0,01 a partir del control positivo

* significativamente diferente a P < 0,05 a partir del control positivo ++ significativamente diferente a partir del control negativo

La Figura 6 muestra los efectos de budesonida y el conjugado de oligosacarido anionico a diferentes dosis en el influjo de eosinofilos y neutrofilos aumentado por antfgeno en fluido BAL (x 107/ml)

Bud = Budesonida; D2 = Conjugado de oligosacarido anionico ID 9; Concentraciones del farmaco 0,1 y

2.5 mg/kg.

*** significativamente diferente a P < 0,001 a partir del control positivo.

+++ Significativamente diferente a P < 0,001; ++ Significativamente diferente a P < 0,01 y + significativamente diferente a P < 0,05 a partir del control negativo.

Descripcion detallada de la invencion

Debe de quedar claro que el alcance de la invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. En la presente descripcion cualquier divulgacion que se encuentre fuera del alcance de dichas reivindicaciones solamente tiene fines ilustrativos.

Como se usa en el presente documento, el termino "anionico" describe la carga negativa neta de un material. Se entendera que un material dado con carga negativa puede tener uno o mas contraiones o con carga positiva asociados con el mismo, o viceversa. En solucion, un material con carga negativa se podna disociar a partir de uno o mas contraiones con carga positiva que esta asociado con el estado solido. Como se usa en el presente documento, el termino "anionico" se usa para describir una propiedad de ese material y no el complejo global con uno o mas contraiones que por lo general haran que el complejo sea neutro. Se entiende que ciertos grupos funcionales tienen carga negativa, neutra o tienen carga positiva a valores de pH variables. Si un material es anionico se determinara basandose en la suma de estas cargas. Por consiguiente, a un pH dado, si un material tiene un grupo funcional con carga positiva y dos grupos funcionales con carga negativa, entonces el material tiene una carga negativa neta y es anionico en el sentido en el que el termino se usa en el contexto de la presente invencion. En realizaciones preferentes, los conjugados de la presente invencion tienen una carga negativa neta en solucion acuosa a un pH de 5. En realizaciones preferentes, las sales formadas entre los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion y el uno o mas contraiones son sales farmaceuticamente aceptables.

Los ejemplos de grupos funcionales que transmiten un caracter anionico en los conjugados de la presente invencion son: grupos basados en azufre tales como -SO2OH, -OSO2OH, -OSO2H, -SO2H y -OSO2-; y grupos basados en fosforo tales como: -OPO2OH, -OP(S)(OH)2, -OP(O)(OR)2, -OP(S)(OR)2, -OP(O)OHR, -OP(S)OHR, -OP(O)OR-iR2, - OP(S)OR-iR2, -OP(S)(OH)(SH) y fosfato dclico. Se entendera que un numero de los grupos funcionales mencionados anteriormente se pueden desprotonar facilmente y que llegaran a ser anionicos en solucion acuosa a, por ejemplo, un pH de 5. Otros grupos funcionales mostrados anteriormente son neutros (por ejemplo, -OSO2- y - OP(O)(OR)2) y en consecuencia se pueden usar en combinacion con grupos funcionales anionicos para controlar el grado de caracter anionico presente dentro del conjugado.

Los derivados anionicos preferentes de grupos hidroxilo incluyen grupos sulfato y fosfato. En particular, se entendera que en solucion acuosa a pH 5, los grupos sulfato y fosfato son grupos anionicos como se define en el presente documento.

Como se usa en el presente documento el termino oligosacarido se refiere a un carbohidrato que puede contener cualquier numero de unidades de monosacarido, tal como de 2 a 10 unidades de monosacarido, conectadas mediante enlaces alfa- y/o beta-glucosfdicos. Por ejemplo el oligosacarido puede comprender entre 2 y 6 unidades de monosacarido.

Los ejemplos de monosacaridos son eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa y talosa.

Los ejemplos de oligosacaridos que comprenden 2 o mas monosacaridos son lactosa, sacarosa, amilosa, los celo- oligosacaridos, los malto-oligosacaridos [tales como maltosa, maltotriosa (0-a-D-glucopiranosil-(1^4)-0-a-D- glucopiranosil-(1^4)-D-glucopiranosa), maltotetraosa (0-a-D-glucopiranosil-{(1^4)-0-a-D-glucopiranosil}2-(1^4)-D- glucopiranosa) y maltopentaosa (0-a-D-glucopiranosil-(1^4)-0-a-D-glucopiranosil}3-(1^4)-D-glucopiranosa)], los dextro-oligosacaridos, los quito-oligosacaridos, los xilo-oligosacaridos, mano-oligosacaridos (tal como los producidos por la hidrolisis de mananos, incluyendo mananos de levadura) y los p1,3-gluco-oligosacaridos.

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Los oligosacaridos preferentes para su uso en la presente invencion son los malto-oligosacaridos (tales como maltotriosa, maltotetraosa y maltopentaosa), los quito-oligosacaridos (tales como quitotetraosa y quitopentaosa) y los xilo-oligosacaridos (tales como xilotetraosa y xilopentaosa).

En un aspecto la invencion proporciona un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

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en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos; xi representa un numero entero de 1 a 4;

X2 representa un numero entero de 0 a 11;

X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4.

Los oligosacaridos anionicos (S1 y S2) de formula (I) se conjugan de forma covalente entre sf a traves de al menos un atomo de azufre que forma parte de esa porcion del conjugado que esta entre los oligosacaridos anionicos que en el presente documento se denomina "conector". En los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion, el resto de conector tambien se puede denominar porcion de aglucona. El conector puede influir en el tamano, flexibilidad o rigidez, hidrofilia e hidrofobia del conjugado de oligosacarido anionico. Por consiguiente, el conector se elige preferentemente para maximizar un efecto biologico dado. El conocimiento de la relacion de estructura-actividad entre el GAG (o los GAG) que se desea imitar y/o congeneres y/o informacion estructural con respecto a los complejos de ligando-receptor (por ejemplo, a partir de cristalograffa de rayos X, RMN) puede influir en la eleccion del conector. Por lo general el conector no interactua con el receptor de GAG.

Los conjugados preferentes se pueden representar con las siguientes formulas:

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en la que S1 y S2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos, X1 representa un numero entero de 1 a 4, y X5 representa un numero entero de 1 a 4;

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en la que S1 y S2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos, X1 representa un numero entero de 1 a 4, X3 representa 0 o un numero entero de 1 a 10, y X5 representa un numero entero de 1 a 4; y

imagen10

en la que S1 y S2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos, X1 representa un numero entero de 1 a 4, X2 representa 0 o un numero entero de 1 a 11, y X5 representa un numero entero de 1 a 4.

Los conjugados anionicos especialmente preferentes de la presente invencion se pueden representar con la siguiente formula:

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en la que S1 y S2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos, xi y X5 igual a 2 y X2 representa 0 o un numero entero de 1 a 4.

En un aspecto la presente invencion proporciona un metodo para preparar un oligosacarido anionico de formula (I):

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en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos;

X1 representa un numero entero de 1 a 4;

X2 representa un numero entero de 0 a 11;

X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4,

metodo que comprende las etapas de:

a) transformar cada uno de los oligosacaridos en oligosacaridos anionicos; y

b) conjugar los oligosacaridos;

en el que las etapas a) y b) se pueden realizar en cualquier orden.

En la tecnica se conocen metodos para la transformacion de un oligosacarido en un oligosacarido anionico a traves de la sulfatacion y/o fosforilacion de uno o mas grupos hidroxilo, incluyendo metodos para la sulfatacion selectiva de cualquiera de grupos hidroxilos primarios o hidroxilos secundarios o amino o combinaciones de los mismos. Tal sulfatacion y/o fosforilacion puede ser de todos los grupos hidroxilo libre o puede ser sulfatacion y/o fosforilacion parcial de los grupos hidroxilo libre.

Aunque la invencion contempla la transformacion de cada uno de los oligosacaridos en oligosacaridos anionicos antes y/o despues de preparar el conjugado, es preferente hacerlo de este modo antes de la formacion del conjugado. Una razon para una preferencia de este tipo es ayudar a controlar la homogeneidad del producto final.

Sin desear quedar ligado por la teona, se cree que mediante el acoplamiento de moleculas ammicas mas pequenas juntas para formar moleculas anionicas de mayor tamano, se consigue un control mayor sobre los productos y el grado de homogeneidad. Por ejemplo, la sulfatacion de oligosacaridos pequenos (disacaridos a tetrasacaridos), que contienen 3 grupos "sulfatables" por resto, avanza hacia la finalizacion. Por otro lado, la sulfatacion de oligosacaridos de mayor tamano es un metodo mas dificil, y por lo general se obtiene una mezcla heterogenea de especies subsulfatadas. Se cree que en los sistemas mas grandes, el alcance de la heterogeneidad parece que esta relacionado con el numero, o densidad, de grupos sulfato - cuantos mas grupos "sulfatables" estan presentes, mas heterogenea es la mezcla. Como un ejemplo, de los dos pentasacaridos, Arixtra® y sulfomaltopentaosa, el primero contiene 8 grupos sulfato y se obtiene facilmente en forma pura, mientras que la maltopentaosa, que tiene 16 grupos sulfatables, se obtiene con una mezcla. Ademas, en la sulfatacion del nonasacarido Trestatina A, el grado medio de sulfatacion obtenida es 2,4 de un posible que 3 por sub-unidad (ignorando el extremo reducido), lo que representa igual aproximadamente 22 grupos sulfato/ molecula. Suponiendo que la sulfatacion sea un suceso estocastico, y usando la distribucion de Poisson para calcular la distribucion de moleculas con el numero de sulfatos designado, podna parecer que la mezcla contiene moleculas con entre 14 y 27 grupos sulfato. Ademas, excepto para la molecula per-sulfatada, existe un numero muy grande de posibles isomeros para cada especie sulfatada - por ejemplo el numero de isomeros para las especies que contienen 22 grupos sulfato es 81.000. Como se puede observar, la sulfatacion de oligosacaridos de longitud incluso mas discreta (nonasacarido) puede generar mezclas complejas.

Por otro lado la sulfatacion de un trisacarido, que puede contener un total de 9 grupos "sulfatables", produce una mezcla que tiene una pureza de un 98 % con respecto al trisacarido persulfatado. El acoplamiento de dos de tales disacaridos trisacaridos sulfatados en conjunto producen un neo-hexasacarido persulfatado (18 grupos sulfato) con

una pureza de un 96 %. Ademas, tambien se reduce el numero de posibles isomeros para las especies subsulfatadas.

El Esquema 1 muestra ejemplos de diferentes rutas de smtesis (Rutas A, B y C) que se pueden tomar para sintetizar 5 los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion. El patron de sustitucion en el anillo de hexosa representativo del oligosacarido que se representa se ha omitido con fines de claridad. El experto en la materia observara que los grupos sulfato protonados que se muestran en las estructuras 6 a 11 representan ejemplos de oligosacaridos anionicos dado que la expresion se usa en el presente documento debido a la capacidad de los grupos funcionales para desprotonarse facilmente, por ejemplo en agua a un pH de 5. Como se ha indicado 10 anteriormente, la transformacion de los oligosacaridos en oligosacaridos anionicos se puede producir antes o despues de la conjugacion de los oligosacaridos. En este sentido, el Esquema 1 muestra ejemplos de estrategias de smtesis preferentes en las que la sulfatacion de los oligosacaridos se produce antes de la conjugacion.

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Amoniaco,

liofilizacion

RUTAA

Cloroacetilacion

(Anhidrido cloroacetico.NaHr'O,)

Desproteccion

RUTAB

Sulfatacion [Vi ,SOyi>MHP>)

Azidatriflica

Sulfatacion (tv SOy DM I7.1 h)

RUTAC

Desproteccion

1-W-glicosil <|lidimmi<lii si n to n

Cloroacetilacion

Componente Biisito A

hs^v^h Componente Biisito B

Componente Biisito C

Es<|ueimi 1

La etapa de conjugacion de los oligosacaridos se puede conseguir usando el enfoque mostrado en el Esquema 1. Por lo general se elegiran oligosacaridos que tengan un extremo reductor libre. La conjugacion a traves del extremo 5 reductor de cada uno de los oligosacaridos se puede producir despues de una aminacion inicial del extremo reductor de cada uno de los oligosacaridos. A traves de la reaccion del grupo amino de las glucosamina producida de este modo con uno o mas restos a base de glicina, es posible proporcionar un compuesto intermedio reactivo de

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estructura 9, por ejemplo, para el acoplamiento a otro de los oligosacaridos funcionalizados de este tipo. Dos restos a base de glicina utiles son compuestos de glicina con N protegido (por ejemplo Fmoc) y 2-haloacetilo tales como cloruro de 2-cloroacetilo o cloruro de 2-bromoacetilo. El acoplamiento de los dos restos de oligosacarido derivatizado se produce a traves de un conector que comprende al menos un atomo de azufre. En el Esquema 1, el Componente Basico B representa un compuesto de ditiol. Sin embargo se entiende que un conector de este tipo solamente es representativo y no excluye conjugados de formula (II) del alcance de la presente invencion. Los ejemplos espedficos del ditiol del Componente Basico B, que puede estar disponible en el mercado, se proporcionan a continuacion junto con identificadores para su uso dentro de la memoria descriptiva:

imagen14

Como se usa en el presente documento, el termino "conjugado" adquiere su significado convencional y de forma espedfica se refiere al acoplamiento covalente de dos oligosacaridos. Se entendera que en las estructuras a las que se hace referencia en el presente documento (tal como la formula (I)) los oligosacaridos anionicos S1 y S2 estan unidos de forma covalente al resto del conjugado. Por consiguiente se observara que S1 y S2 son restos monovalentes de oligosacaridos anionicos. El experto en la materia reconocera que un acoplamiento de este tipo por lo general se produce como resultado de la perdida de parte de cada uno de los oligosacaridos con dos se consideran en aislamiento. Por ejemplo, la reaccion de aminacion representada en el Esquema 1 que transforma el compuesto de oligosacarido 1 en el compuesto de amina 2 se produce con la perdida del grupo hidroxilo del compuesto 1. Sin embargo, el experto en la materia de forma rutinaria a identificara las porciones del oligosacarido hexosa del conjugado de oligosacarido anionico del compuesto 11 en el Esquema 1. De forma analoga el experto en la materia sera capaz de identificar de forma rutinaria las porciones del oligosacarido anionico indicadas con S1 yS2 en la formula (I):

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En otras palabras, S1 y S2 pueden representar las porciones residuales de cada uno de los oligosacaridos anionicos que no forman parte del conector.

Se ha encontrado que los conectores de la presente invencion proporcionan un enfoque facil para la smtesis de conjugados de oligosacarido anionico complejos. En particular, los conectores proporcionan al experto en la materia un acceso rapido a una serie de conjugados de oligosacarido anionico que tienen diferentes longitudes e hidrofilias. Si el deseo de quedar ligado por la teona, se cree que el uso del grupo funcional tio (tal como en los compuestos de ditiol representas anteriormente) permite la conjugacion de conjugados de oligosacarido anionico complejos sin que se produzcan reacciones secundarias no deseadas. La facilidad con la que se pueden sintetizar los conjugados permite al experto en la materia investigar el papel que las propiedades del conector pueden desempenar en la imitacion de los GAG con los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion.

La naturaleza generalmente convergente de la smtesis de los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion proporciona al experto en la materia la capacidad de crear bibliotecas de compuestos estructuralmente diversos con relativa facilidad. Se pueden introducir grados de diversidad estructural mediante la eleccion de cada uno de los oligosacaridos anionicos S1 y S2 de formula (I) (que pueden ser iguales o diferentes), asf como la longitud

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y forma del resto conector. En algunas realizaciones, los precursores sinteticos de los componentes de este tipo se pueden preparar en aislamiento y se pueden introducir en un enfoque de combinacion. Por ejemplo usando tan pocos como 3 oligosacaridos anionicos y 3 restos conectores, experto en la materia es capaz de producir facilmente tantos como 27 conjugados de oligosacarido anionico diferentes.

La presente invencion proporciona metodos para preparar grandes numeros de conjugados anionicos estructuralmente diversos que pueden formar la base para bibliotecas de mimeticos de GAG. Los conjugados anionicos pueden tener aplicaciones en el tratamiento de enfermedades que implican la interaccion entre los GAG y uno o mas ligandos. Los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion son utiles en el tratamiento trastornos respiratorios inflamatorios que incluyen anafilaxia, asma, enfermedad respiratoria alergica, rinitis alergica, fibrosis subepitelial en hiperreactividad de las vfas respiratorias, sinusitis cronica, rinitis alergica perenne, aspergilosis broncopulmonar alergica en pacientes con fibrosis qmstica, EPOC, ARDS/ALI, bronquitis eosinofflica, bronquiectasia, broncoespasmo, constriccion bronquial, hiperreactividad bronquial, hipertrofia bronquial e inflamacion bronquial. Como se usa en el presente documento, la expresion "espasmo bronquial" se refiere a un espasmo involuntario de las vfas respiratorias de un paciente. Constitucion bronquial es tanto un termino como una afeccion medica que se puede intercambiar con "espasmo bronquial" en su uso con respecto a los fines de la presente solicitud. Como se usa en el presente documento, la expresion "inflamacion bronquial" se refiere a una inflamacion de las vfas respiratorias de un paciente. Ademas, los smdromes alergicos, por ejemplo asma, pueden comenzar mediante virus del enfriamiento comun, especialmente el rinovirus y los compuestos desvelados se pueden usar para el tratamiento de infecciones en los conductos respiratorios superiores, tales como enfriamiento y grite y las producidas por rinovirus y coronavirus. La constriccion bronquial tambien es un smtoma de anafilaxia y los compuestos desvelados se pueden usar para el tratamiento de la anafilaxia.

La anafilaxia es una reaccion alergica, de inicio rapido, grave que puede producir la muerte. La obstruccion de las vfas respiratorias superiores potencialmente mortal, broncoespasmos e/o hipotension caracteriza a la anafilaxia grave. En Estados Unidos existen aproximadamente 100.000 episodios cada ano, de los cuales aproximadamente un 1 % da como resultado la muerte y aproximadamente un 66 % son nuevos casos. La mayona de los casos se puede describir un desencadenamiento espedfico pero aproximadamente un 20 % de los casos se denominan idiopaticos. La epinefrina se ha aceptado como el tratamiento de eleccion durante muchos anos, pero se ha descrito como subutilizado y no siempre eficaz (Golden, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 7: 331-336, 2007). La preferencia de los medicos es el tratamiento con corticosteroides y antihistammicos a pesar de la poca evidencia de su eficacia durante la enfermedad aguda. Los antihistammicos pueden ayudar con patologfas mediadas por histamina, pero no con los efectos que surgen a partir de otros mediadores y puede tener una eficacia limitada en la prevencion de la activacion de mastocitos y basofilos en desarrollo. Al igual que los antihistammicos, se ha sugerido que los corticosteroides desempenan un papel en la gestion de la enfermedad a pesar de que existen pocas evidencias de su eficacia en ensayos clmicos, pero su uso sugerido se encuentran la base de que la administracion inicial de corticosteroides en pacientes con asma aguda es beneficioso (El-Shanawany et al., Clin. Exp. Immunol. 153: 1-9, 2008). Los corticosteroides no seran eficaces durante la enfermedad aguda ya que sus acciones requieren smtesis de protemas y por lo tanto sus actividades se retrasan.

La anafilaxia implica la activacion de mastocitos y/o basofilos. Mas comunmente se desencadena por la exposicion a venenos de insecto, alimentos, medicamentos e inyecciones de inmunoterapia con alergenos a traves de un mecanismo que implica a la IgE y el receptor de afinidad elevada hacia IgE en mastocitos y basofilos. La IgE sintetizada como respuesta a la exposicion a alergenos se llega a fijar a receptores de IgE (FceRI) en la superficie de mastocitos y basofilos. La agregacion de receptor por IgE produce activacion celular, liberacion de mediador formado previamente (incluyendo histamina, triptasas (incluyendo p-triptasa), carboxipeptidasa A, TNF-a y quimasa) y desencadenamiento de la respuesta de hipersensibilidad inmediata. Los mediadores de granulos formados previamente se liberan por exocitosis en minutos. Del mismo modo la smtesis de metabolitos del acido araquidonico incluyendo prostaglandinas y leucotrienos, y factor de activacion de plaquetas (PAF) se produce en minutos, nietas de la smtesis y liberacion de citoquinas y quimioquinas inflamatorias pueden necesitar horas y estos mediadores contribuyen a la fase tardfa de una reaccion anafilactica bifasica. Las citoquinas y quimioquinas liberadas incluyen IL-5, IL-4, IL-13, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos (G), macrofago (M)-cSf, GM-CSF, IL-1p, iL-3, IL-6, II-8, IL-10, IL-16, IL-18 e IL-22. Por lo general estos mediadores producen el reclutamiento y activacion de celulas adicionales incluyendo basofilos, eosinofilos y celulas Th2 (Ogawa y Grant, Immunol. Allergy Clin. N. Am., 27: 249-260, 2007). En algunos pacientes de los que se describe que tienen anafilaxia idiopatica, los receptores FceRI se pueden agregar a traves de mecanismos autoinmunes en ausencia de IgE (Simons, J. Allergy Clin. Immunol. 121: S402-7, 2008) y existe una cierta evidencia de una ruta alternativa que implica a IgG y al receptor de IgG. Esta ultima ruta no desencadena la liberacion de histamina; en su lugar PAF es el mediador inicial principal (Peavy y Metcalfe, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 8: 310-314, 2008).

En la fase inicial de la anafilaxia, la histamina estimula la vasodilatacion y aumenta la permeabilidad vascular, ritmo cardiaco, contraccion cardiaca y secrecion glandular. La prostaglandina D2 es un broncoconstrictor, vasoconstrictor pulmonar y coronario, y un vaso dilatado del periferico. Los leucotrienos tambien estimulan la broncoconstriccion y aumentan la permeabilidad vascular, asf como la estimulacion de la remodelacion de las vfas respiratorias. Del mismo modo PAF produce broncoconstriccion y aumento de la permeabilidad vascular. El TNF-a activa los neutrofilos, recluta otras celulas efectoras, y aumenta la smtesis de quimioquinas, lo que conduce a un reclutamiento

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adicional de celulas inflamatorias. Estos efectos de solapamiento y sinergicos contribuyen a la patofisiologfa global de la anafilaxia que de forma variable se presenta con urticaria generalizada y angioedema, broncoespasmos, y otros smtomas respiratorios, hipotension, smtomas cardiovasculares (incluyendo desmayos), y nauseas as^ como otros smtomas gastrointestinales (Peavy y Metcalfe, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 8: 310-314, 2008). La IL-4 es una citoquina fundamental en la fase tardfa de la anafilaxia y tambien en la estimulacion y mantenimiento de la proliferacion de celulas Th2 e intercambio de linfocitos B hacia la smtesis de IgE, el efecto mas rapido o radical de esta citoquina en la anafilaxia es aumentar de forma notable la capacidad de respuesta de las celulas dirigidas a mediadores vasoactivos incluyendo histamina, serotonina, PAF y cisteinil leucotrienos (Ogawa y Grant, Immunol. Allergy Clin. N. Am., 27: 249-260, 2007). El asma se caracteriza por la inflamacion de los conductos respiratorios dando como resultado el estrechamiento temporal de las vfas respiratorias que transportan el aire desde la nariz y la boca a los pulmones. Los smtomas del asma pueden estar causados por agentes alergenos o irritantes que se inhalan en los pulmones, dando como resultado vfas respiratorias inflamadas, obstruidas y con estrangulamiento. Los smtomas incluyen dificultad respiratoria, estornudos, tos, opresion en el pecho. En los casos graves, el asma puede ser potencialmente mortal. El asma probablemente no es una sola enfermedad, sino que en su hogar es un complejo de multiples smdromes separados que se superponen. La siguiente clasificacion se basa en los informes de Wenzel. Lancet; 368: 804-813, 2006, y Green et al., Curr. Opin. Allergy Immunol. 7: 43-50, 2007.

• Asma alergica: este es el fenotipo de asma mas grande. Es especialmente cierto en el asma infantil pero probablemente tambien en una proporcion elevada de adultos con asma. Los individuos que presentan este fenotipo normalmente experimentan sus primeros smtomas en la infancia, pero se pueden presentar en cualquier edad. La historia familiar de asma y una exposicion inicial a los alergenos son importantes en el comienzo del asma alergica. Ademas de las terapias convencionales, se han usado de forma satisfactoria algunas terapias dirigidas: inmunoterapia o anticuerpos monoclonales contra la IgE. Sin embargo, no todas las personas con asma alergica responden a la terapia anti-IgE.

• Asma ocupacional: hasta un 15 % del asma de inicio en adultos entra en este grupo. Presenta los siguientes subfenotipos: (1) desarrollo de una respuesta mediada por via inmunologica con respecto al agente causal, normalmente un agente de alto peso molecular - tiene similitudes con el asma alergica a traves de desarrollo de anticuerpos de IgE; (2) desarrollo de una respuesta mediada por via inmunologica con respecto a desencadenantes de peso molecular alto o bajo y no se observa de manera coherente una respuesta a IgE; (3) desarrollo de una respuesta de inicio rapido no inmunologica despues de la exposicion a una concentracion elevada de productos qmmicos irritantes.

La inflamacion de las vfas respiratorias es similar en ambos fenotipos inmunologicos y se parece a la del asma alergica por ejemplo por la presencia de eosinofilos, linfocitos, mastocitos y el engrosamiento de la membrana basal reticular. A diferencia del asma causada por productos qmmicos irritantes es bastante diferente y se caracteriza por fibrosis de la pared bronquial y denudacion epitelial y exudados fibrinohemorragicos en la submucosa sin inflamacion eosinofflica. Los tipos inmunologicos de esta asma pueden continuar en ausencia de exposicion al agente causal.

• Asma inducida por aspirina: la aspirina y otros farmacos antiinflamatorios no esteroideos son los desencadenantes. Es comun en la poblacion de asma severa y se asocia con poca evidencia de atopia, leucotrienos elevados y un recuento elevado de eosinofilos tanto en tejidos como en sangre. Existe la rinosinusitis severa y politicos nasales e inicio en estado adulto. Este fenotipo es poco sensible a los corticosteroides.

• Asma relacionada con la menstruacion: esto no esta bien caracterizado. Probablemente solamente se produce en una pequena proporcion de mujeres, pero puede ser grave.

• Asma inducida por el ejercicio: parece que los mecanismos que desencadenan este asma implican respuestas celulares inflamatorias agudas (normalmente mastocitos), epiteliales y vasoactivas, pero la patogenesis no esta clara. Si el asma inducido por el ejercicio representa el desarrollo de broncoconstriccion como respuesta al ejercicio en todos los asmaticos o si se produce solamente en algunos no esta claro.

Aunque la inflamacion es una evidencia distintiva del asma, no todos los fenotipos asma tienen inflamacion predominantemente eosinofflica, aunque este es el mas comun y el mejor estudiado.

• Asma eosinofflica: los estudios han definido un fenotipo eosinofflico mediante examenes de esputo o biopsia en pacientes con grados variables de gravedad asmatica y han demostrado de manera coherente que aproximadamente un 50 % de los asmaticos tienen este fenotipo. Otros estudios han sugerido que la inflamacion eosinofflica puede estar presente en una proporcion mas elevada de pacientes que la detectada usando un examen de esputo o de biopsia. En un estudio se cree que un 50 % de los pacientes con asma severa de la que se crefa que no era eosinofflica tema realmente inflamacion eosinofflica, pero en el pulmon distal.

• Asma neutrofflica: se observa mas comunmente en pacientes con enfermedad grave. Muchos pacientes con inflamacion neutrofflica pueden tener inflamacion eosinofflica simultanea en biopsias de tejido mientras que la evaluacion del esputo puede mostrar un claro predominio de neutrofilos. La asociacion de neutrofilos con asma grave podna estar causada por el tratamiento con dosis elevadas de esteroides, que han demostrado que disminuyen la apoptosis de neutrofilos in vitro. El asma neutrofflica se asocio con aumentos de IL-8 y elastasa

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de neutrofilos. Aproximadamente un 20 % de los pacientes presentaban asma neutrofflica y un 8 % adicional presentaba inflamacion tanto eosinofflica como neutrofflica (a partir de un estudio de 93 pacientes).

• Asma paucigranulocffico: pacientes con recuentos de celulas en esputo en el intervalo normal (~30 % de los 93 pacientes presentaban este subfenotipo).

La rinitis alergica es una enfermedad de las vfas respiratorias superiores inducida por alergenos, caracterizada por hiperreactividad de la mucosa de las vfas respiratorias y episodios de cronicidad de los smtomas con periodos de exacerbacion aguda. Los individuos alergicos se sensibilizan y pueden desarrollar anticuerpos IgE contra alergenos tales como polen, acaros del polvo, caspa de animales y esporas de moho. La respuesta alergica inmediata al anffgeno se denomina respuesta de fase inicial. Los mediadores liberados durante esta fase son histamina, quininas, proteasas neutras y una diversidad de citoquinas. La activacion de los mastocitos conduce a la produccion de leucotrienos y prostaglandinas y juntos estos mediadores dan lugar a la rinorrea acuosa, estornudos y picazon a los minutos de exposicion al alergeno. Esto va seguido varias horas mas tarde por la respuesta de fase taroffa que implica la infiltracion de celulas inflamatorias y la liberacion de mediadores en la mucosa nasal. Los smtomas son similares a los de la fase de respuesta inicial, pero predomina la congestion (Walls et al., Med. J. Aust.; 182: 28-33, 2005). La rinitis alergica se ha subdividido en enfermedad "intermitente" y "persistente". La enfermedad intermitente describe una afeccion por la cual los smtomas estan presentes menos de 4 dfas a la semana, o menos de 4 semanas a la vez. La enfermedad persistente se refiere a que los smtomas estan presentes durante mas de 4 dfas a la semana y mas de 4 semanas a la vez (Pawanker, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol.; 4: 1-4, 2004.)

La rinitis alergica y el asma alergica son enfermedades que implican una respuesta inflamatoria. Tienen una etiologfa subyacente similar y las citoquinas fundamentales para cada enfermedad son el subconjunto Th2 de citoquinas de linfocitos T, IL-5, IL-4 e IL-13 y GM-CSF. Estas enfermedades se caracterizan por un marcado infiltrado de celulas inflamatorias que comprende eosinofilos, mastocitos, linfocitos T y celulas del linaje monocffico. Las moleculas de adhesion, P-selectina, MAC-1 y PECAM-1 desempenan un papel importante en la extravasacion de leucocitos y es probable que esten implicadas en el proceso inflamatorio. Ademas, la familia eotaxina de quimioquinas desempena un papel fundamental en estas enfermedades ya que son los principales factores quimiotacticos que estimulan la infiltracion de linfocitos T eosinofilos y CD4 +.

Recientemente se han descrito citoquinas de la familia IL-17 (en particular IL-25 (IL-17E)) como iniciadoras o amplificadoras de la inflamacion alergica. Son de particular interes IL-17 (IL-17A) e IL-25. Los estudios in vivo sugieren que IL-25 puede desempenar un papel fundamental en el desarrollo de la inflamacion alergica mediada por Th2. Se examinaron los estudios con ratones transgenicos en los que los efectos sobre las reacciones alergicas de la expresion forzada de IL-25 en las vfas aereas indicaban que IL-25 aumentaba la inflamacion alergica mediada por celulas Th-2. Ademas, la administracion de IL-25 por instilacion intra-traqueal dio como resultado tanto en hiperreactividad de las vfas respiratorias como hipersecrecion de moco, e inflamacion eosinofflica en el tejido pulmonar, procesos que requenan a IL-13 y la senalizacion de IL-13 respectivamente, e IL-5/eotaxina (Tamachi et al., J. Allergy Clin. Immunol. 118: 606-614, 2006; Sharkhuu et al., Clin. Exp. Allergy 36: 1575-1583, 2006). Los datos obtenidos con un anticuerpo bloqueante de IL-25 indican que IL-25 es cntica para el desarrollo de hiperreactividad de las vfas respiratorias. El bloqueo de la actividad de IL-25 redujo de forma significativa los niveles de secrecion de IL-5, IL-13 e IgE, infiltracion de eosinofilos e hiperplasia de celulas caliciformes en asma alergica (Ballantyne, J. Allergy Clin. Immunol. 120: 1324-1331, 2007). En otro trabajo que usa un modelo de raton de asma se encontro que IL-17 es producido principalmente por macrofagos alveolares, y la expresion se regulaba de forma positiva por mediadores liberados de mastocitos (Song et al., J. Immunol. 181: 6117-6124, 2008). En pacientes con asma, la expresion de IL-17 aumentaba en los pulmones, esputo, BAL fluido o suero y la gravedad de la hiperreactividad de las vfas respiratorias se correlacionaba con los niveles de IL-17 (Wang y Liu, Curr. Opin. Immunol. 20: 697-702, 2008). Sin embargo, parece que los efectos de IL-17 estan principalmente en los niveles de neutrofilos, ya que la sobreexpresion de IL-17 o la administracion de IL-17 en los pulmones da como resultado un influjo de neutrofilos asociado con niveles elevados de quimioquinas que actuan sobre los neutrofilos. Existe una buena evidencia de que los niveles de neutrofilos contribuyen a broncoconstriccion, AHR no espedfica, hipersecrecion de protemas mucosas y dano al tejido pulmonar, en particular en asma severa (Linden et al., Eur. Respir. J. 25: 159-172, 2005).

La estructura tridimensional de un solo miembro de la familia IL-17 se ha resuelto. Esto revelaba que IL-17F es un homologo estructural de la familia de nodulos de cistema de protemas y se dimeriza de forma similar a los miembros de la familia del factor de crecimiento nervioso (NGF). El nucleo del monomero de IL-17F comprende dos pares de hebras p antiparalelas (pares 1: hebras 1 y 2; Par 2: hebras 3 y 4). Dos puentes disulfuro conectan las hebras 2 y 4 y un tercer disulfuro conecta el bucle entre las hebras 3 y 4 de un promotor con la extension N-terminal del monomero adyacente. Basandose en un alineamiento de secuencias de aminoacidos, se cree que el plegamiento del nodulo de cistema y la localizacion de las hebras p se conservan en todos los miembros de la familia IL-17. La IL-17, en particular, se debena parecer a la estructura de IL-17F, mientras que la IL-25 (IL-17E) puede tener sus extremos N- terminales en una conformacion diferente (Hymowitz et al., EMBO J. 20: 5332-5341, 2001). Un examen de la estructura de IL-17F, coloreada de acuerdo con el potencial de superficie electrostatica, revela una protema que presenta muchos restos de superficie basicos orientados de un modo tal que la union a glucosaminoglucano es una posibilidad. Una comparacion de las secuencias de aminoacidos de IL-17F, IL-17 e IL-25 indica la conservacion global de restos basicos, pero con IL-25 siendo mas basico que las otras dos protemas. Por lo tanto, un conjugado de oligosacarido anionico se une a estas citoquinas, con la union de IL-25 con la afinidad mas alta elevada La

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localizacion de los sitios de union a receptor en IL-17, IL-17F e IL-25 no se ha determinado. Sin embargo, una caractenstica sorprendente de la estructura de IL-17F es una gran cavidad en el area de la superficie de contacto del dfmero. Hymowitz et al., EMBO J. 20: 5332-5341, 2001 creen que los aminoacidos que forman esta region presentan caractensticas esperadas de un bolsillo que se puede unir a otra protema (posiblemente un dominio receptor) y a partir de un analisis de la secuencia de aminoacidos este bolsillo debena estar conservado en todos los miembros de la familia incluyendo IL-25. Este bolsillo de union al receptor potencial es colindante sobre una lmea de grupos de restos basicos que es indicativa de una region de union a conjugado de oligosacarido anionico. Dado que la union del conjugado de oligosacarido anionico interfiere con la union de IL-17 e IL-25 a sus receptores, es probable que esta lmea de restos basicos colindante con el bolsillo de union al receptor sea el sitio en el que el conjugado anionico se une a IL-17 e IL-25.

Existe una comprension creciente de que el asma y la rinitis alergica son componentes de una unica enfermedad inflamatoria de las vfas respiratorias. Esta conclusion se apoya en datos epidemiologicos que demuestran que mas de un 80 % de personas con asma alergica tienen rinitis alergica y que hasta un 50 % de los pacientes con rinitis alergica tienen asma (Gelfand, J. Allergy Clin. Immunol, 114: S135-138, 2004; Passalacqua et al fondo, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 4: 177-183, 2004). Ademas, los estudios longitudinales y de seguimiento han demostrado que la rinitis suele preceder al asma y es un factor de riesgo para el asma. La rinitis alergica aumenta el riesgo de desarrollar asma al menos en tres veces y el tratamiento correcto de la rinitis alergica con esteroides intranasales tiene un efecto favorable en los smtomas bronquiales, reduciendo en forma significativa la tasa de admision hospitalaria y las visitas al servicio de urgencias por exacerbacion del asma (Passalacqua et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 4: 177-183, 2004). Estas enfermedades son una mezcla compleja de patologfas, que implican al menos a las diversas citoquinas, quimioquinas y moleculas de adhesion celular indicadas anteriormente.

Los mastocitos e histaminas desempenan un papel importante durante la respuesta inicial de la rinitis alergica. Sin embargo, a medida que la rinitis alergica evoluciona el papel de las histaminas disminuye, haciendo que los antihistammicos sean menos eficaces como terapia (Gelfand, J. Allergy Clin. Immunol 114: S135-138, 2004). Durante la respuesta inicial de la rinitis alergica, los mastocitos sensibilizados se desgranulan a los minutos de exposicion al alergeno liberando mediadores formados previamente y recien sintetizados incluyendo histamina, proteasas, cisteinil leucotrienos, prostaglandinas y citoquinas. La evolucion de la rinitis alergica depende de los mediadores asociados con la infiltracion de eosinofilos, basofilos, neutrofilos, celulas mononucleares y linfocitos T (Gelfand, J. Allergy Clin. Immunol, 114: S135-138, 2004; Passalacqua et al, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 4: 177-183, 2004). La asociacion de eosinofilos e IL-5 con la rinitis alergica se ha observado desde hace algun tiempo. Los estudios repetidos han encontrado un aumento de los niveles de citoquinas de tipo Th2 incluyendo IL-5 e IL-4, y un aumento de las cantidades de protema eosinofila cationica (ECP), un marcador de eosinofilos activados, despues de provocacion con alergeno (Blaiss, Allergy Asthma Proc. 26: 35-40, 2005). El influjo de eosinofilos se correlaciona estrechamente con el desarrollo de los smtomas. Ademas la perdida de integridad epitelial en la mucosa nasal de pacientes con rinitis se correlaciona con los recuentos de eosinofilos en lugar de los recuentos de mastocitos o neutrofilos (Borish, J. Allergy Clin Immunol. 112: 1021-1031,2003). Parece que la rinitis alergica evoluciona a partir de un proceso agudo, principalmente mediado por mastocitos que responde a antihistammicos, a traves de una enfermedad inflamatoria cronica que esta principalmente mediada por eosinofilos y es mucho menos sensible a los antihistammicos. Este es el caso de los pacientes con rinitis alergica persistente. La evolucion a un estado que es resistente a los antihistammicos histaminas tambien se puede producir dentro de una estacion de alergia, para sufrimientos estacionales. Para otros pacientes enfermedad intermitente leve los antihistammicos siguen siendo una terapia eficaz, que refleja exposiciones a alergenos intermitentes, que no tienen una duracion suficiente como para conducir la evolucion de la enfermedad en la fase de resistencia a antihistammicos.

El tratamiento de primera lmea para el asma son los corticosteroides inhalados (ICS), que normalmente se usan en combinacion con agonistas p2 (Barnes, Br. J. Pharmacol. 147 Supl 1: 5297-303, 2006). Los agonistas p2 alivian los smtomas en lugar de tratar la inflamacion subyacente y tienen el potencial de hacer que el asma empeore si se usan con frecuencia en ausencia de los ICS. Sin embargo, parece que esta es la terapia preferente (a pesar de sus efectos secundarios) debido a su efecto inmediato. A la terapia con agonistas p2 en ausencia de ICS se le ha concedido un listado de "caja negra" en la FDA debido a los posibles problemas cardiacos asociados con esta terapia. Aunque los efectos secundarios son mas bajos que con las formulaciones orales, los ICS no estan exentos de efectos adversos locales y sistemicos. Un efecto secundario de los corticosteroides es la supresion del eje hipotalamico-pituitaria-adrenal (HPAA): se observan efectos adversos clmicamente relevantes y esto es mas evidente con algunos medicamentos que otros. La densidad osea y las fracturas tambien pueden ser un problema: se pueden detectar ciertos efectos de los ICS sobre el metabolismo oseo, pero la importancia clmica no esta clara. Por ultimo, el retraso del crecimiento en los ninos es otra cuestion que puede preocupar a los pacientes (Allen, Adv Pediatr. 53: 101-110, 2006). En resumen, los efectos secundarios son aceptables dadas las complicaciones severas del asma sostenido/incontrolado.

Otras terapias para el asma incluyen:

(1) El omalizumab, un anticuerpo anti-IgE (Genetech) se considera no rentable para el tratamiento del asma convencional. Se usa principalmente como terapia complementaria a los ICS porque no mejora la capacidad de respuesta de las vfas respiratorias y tiene una eficacia discreta. Las restricciones de las dosis y el mecanismo de

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administracion (inyeccion subcutanea) son una desventaja anadida. Por otra parte, una advertencia de la US Food and Drug Administration (FDA) ha relacionado la inyeccion de omalizumab con una anafilaxia potencialmente mortal y, de forma mas preocupante, en algunos pacientes la aparicion de esta anafilaxia se retrasa de mas de 2 horas despues de la inyeccion a mas de 24 horas despues de la inyeccion.

(2) Anti-leucotrienos (anti-LT), que pueden causar broncodilatacion. Su efecto es aditivo al de los agonistas de receptores p2 de accion corta, aunque por sf solos tienen un efecto relativamente discreto. Los anti-LT afectan principalmente a la respuesta asmatica inicial (EAR), mientras que los ICS muestran efectos pronunciados en las respuestas asmaticas tardfas (Palmqvist et al., Allergy 60: 65, 2005). Por estas razones los anti-LT se han sometido a ensayo en combinacion con los ICS. Los anti-leucotrienos no son rentables. Practicamente no tienen efectos secundarios, pero su eficacia es baja.

Las terapias habituales para la rinitis alergica son antihistammicos o corticosteroides intranasales (Neilsen y Dahl, Am. J. Respir. Med. 2: 55-65, 2003; Yanez y Rodrigo, Ann. Allergy Asthma Immunol. 89: 479-84, 2002). Los antagonistas de H1 de primera generacion mas antiguos (antihistammicos) tienen una serie de efectos secundarios adversos, siendo los mejor reconocidos la somnolencia y los efectos anticolinergicos. Los farmacos de segunda generacion se desarrollaron para superar estos efectos. Sin embargo, estudios recientes han indicado que la division entre los antagonistas H1 de primera y segunda generacion en terminos de somnolencia no es un caso claro (Golightly y Greos, Drugs 65: 341-84, 2005). Se urgio a poner etiquetas para la Cetirizina, el antihistammico mas potente aprobado por la FDA, incluyen una advertencia sobre el posible efecto adverso de somnolencia y precaucion con la conduccion y el uso de equipo pesado cuando se ingiere el farmaco. Ademas, se debena evitar el uso simultaneo de alcohol o de otros supresores del sistema nervioso central (SNC) debido a que se puede producir una reduccion adicional en el estado de alerta y rendimiento del SNC. Por otra parte, los antihistammicos no son eficaces contra la congestion asociada con la rinitis alergica cronica. La rinitis alergica evoluciona a una enfermedad que esta principalmente mediada por eosinofilos y es resistente a la terapia con antihistammicos. Cuando esto ocurre los corticosteroides intranasales (INCS) son la terapia principal. De hecho, para muchos profesionales clmicos los INCS son los farmacos de eleccion para el tratamiento de todas las rinitis alergicas ya que el corticosteroide actua para reducir la inflamacion eosinofflica. Aunque por lo general se considera que los INCS son seguros, la recomendacion es reducir la dosis del esteroide tanto como sea posible y optimizar las estrategias de ahorro de esteroides (Skoner, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2: 7-10, 2002).

La etiologfa subyacente de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) es diferente a la de las enfermedades inflamatorias alergicas (Sutherland y Martin, J Allergy Clin. Immunol. 112: 819-27, 2003). La EPOC implica un proceso inflamatorio cronico que afecta a las vfas respiratorias perifericas y al parenquima pulmonar y la inflamacion es peor durante las exacerbaciones. Un factor principal que contribuye al desarrollo de la EPOC es la respuesta inflamatoria al humo del cigarrillo. Los indicadores patologicos de la EPOC son la destruccion del parenquima pulmonar (enfisema pulmonar), inflamacion de las vfas respiratorias perifericas pequenas (bronquitis respiratoria) e inflamacion de las vfas respiratorias centrales. La mayona de los pacientes con EPOC tienen las tres afecciones patologicas (bronquitis obstructiva cronica, enfisema y obstruccion de la mucosa) que presentan diferentes patrones de inflamacion (Adcock e Ito, Proc. Am. Thorac. Soc. 2: 313-319, 2005). Se considera que neutrofilos y macrofagos son los principales efectores de la enfermedad. Los analisis de esputo y fluido de lavado broncoalveolar muestran aumentos tanto en neutrofilos como en macrofagos en estas secreciones de pacientes con EPOC. Ademas, existe una creciente evidencia de que existe un subgrupo significativo de pacientes con EPOC que tienen eosinofilia cronica en las vfas respiratorias.

Los macrofagos alveolares desempenan un papel fundamental en la EPOC. Estan localizados en sitios de destruccion alveolar, y sus recuentos estan correlacionados de forma positiva con gravedad de la enfermedad, obstruccion de las vfas respiratorias y grado de dano de la pared alveolar y enfisema. Los neutrofilos de los tejidos de las vfas respiratorias aumentan en las vfas respiratorias grandes y pequenas de los pacientes con EPOC durante las exacerbaciones y en la EPOC severa, o durante las infecciones. Los pacientes con EPOC tambien presentan cualquiera de un aumento de la proporcion de linfocitos T CD8+/CD4+, o un aumento en los recuentos totales de linfocitos T tanto CD8+ como CD4+ en la pared de las vfas respiratorias (MacNee, Proc. Am. Thorac. Soc. 2: 258266, 2005). Los bronquiolos estan obstruidos por fibrosis e infiltrados con macrofagos y linfocitos T.

Existen tres formas morfologicas de EPOC: bronquitis cronica, bronquiolitis obstructiva y enfisema (Szilasi et al., 2006. Pathol. Oncol. Res. 12: 52-60). La inflamacion asociada con la bronquitis cronica se localiza en el epitelio de las vfas respiratorias centrales. El proceso inflamatorio es asociado con un aumento de la produccion de moco y eliminacion mucociliar defectuosa. La inflamacion se observa en la mucosa, en las capas de musculo liso y glandulas submucosales. En las vfas respiratorias grandes, la implicacion de celulas mononucleares, macrofagos, linfocitos T CD8+ y celulas plasmaticas es comun en la EPOC estable y durante exacerbaciones de la bronquitis cronica. Los linfocitos T CD8+ liberan factor a de necrosis tumoral (TNF-a), un potente mediador proinflamatorio. El papel del neutrofilos no es claro. Los neutrofilos se observan en las vfas respiratorias grandes sumamente durante exacerbaciones y en la EPOC severa. Sin embargo, se observan inicialmente en el lumen de las vfas respiratorias y el esputo.

La bronquiolitis obstructiva o la obstruccion de las vfas respiratorias pequenas es una afeccion inflamatoria que afecta a las vfas respiratorias pequenas y perifericas. La caractenstica habitual es el lumen colapsado con aumento

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de moco. Los macrofagos y los linfocitos T CD8+ dominan la inflamacion de las vfas respiratorias pequenas, aunque los cambios inflamatorios mostraban una correlacion positiva con la obstruccion del flujo de aire en la EPOC. Por ejemplo, en la EPOC estable de leve a moderada, los macrofagos eran dominantes, mientras que en la enfermera severa los neutrofilos eran el componente inflamatorio predominante, mientras que durante las exacerbaciones leves se encuentran eosinofilos. El aumento del numero de fibroblastos y miofibroblastos y la mejora de la matriz extracelular se encuentra en el subepitelio de las vfas respiratorias pequenas en la bronquiolitis obstructiva. Esta patologfa sugiere un mecanismo de lesion repetitiva y cicatrizacion que conduce a fibrosis y tejido cicatricial. El resultado neto es el estrechamiento de las vfas respiratorias.

El enfisema se define mediante la ampliacion permanente del espacio aereo causada por la destruccion y agrandamiento del tejido pulmonar mas alla del bronquiolo terminal. El mecanismo de la enfermedad implica una inflamacion no regulada y la liberacion de grandes cantidades de enzimas proteolfticas. El desequilibrio de proteasa/antiproteasa es la supuesta causa del enfisema pulmonar. Aunque la inflamacion esta dominada por los linfocitos T CD8+, los macrofagos y los neutrofilos producen cantidades excesivas de proteasas, incluyendo elastasa de leucocitos, catepsina G, proteinasa 3, metaloproteinasas de matriz (MMP), cistema proteinasas y activador de plasminogeno. Estas enzimas destruyen la elastina y otros componentes de la pared alveolar con la elastasa siendo la enzima mas implicada en este proceso.

Los mediadores pro inflamatorios de estas patologfas incluyen leucotrieno-B4, IL-8 y otras quimioquinas (por ejemplo, MIP-1a, MCP-1), TNF-a, IL-13 e IL-4 (Barnes, Pharmacol. Rev. 56: 515-548, 2004). Se ha sugerido que los efectos inhibitorios de TNF-a e IL-4 en la produccion de la citoquina reguladora TGF-p por celulas epiteliales bronquiales pueden contribuir a la evolucion de la respuesta inflamatoria. Ademas, el aumento de los niveles de IL-6, IL-1p, TNF-a, e IL-8 se midio en esputo con aumentos adicionales durante las exacerbaciones.

La EPOC es una carga muy significativa para la sociedad. Es la quinta causa principal de muerte en el Reino Unido. Afecta a un 5 % de la poblacion adulta y es la unica causa importante de muerte en Estados Unidos en la que la morbilidad y la mortalidad estan aumentando. Para 2020 se calcula que la EPOC sera la tercera causa principal de muerte y la quinta causa principal de discapacidad en todo el mundo (Halpin y Miravitlles, Proc. Am. Thorac. Soc. 3: 619-623, 2006). Las terapias existentes para la EPOC son extremadamente inadecuadas. Ninguno de la evolucion lenta de la enfermedad y la respuesta a los tratamientos es deficiente. La EPOC es relativamente resistente a los efectos antiinflamatorios de los corticosteroides. Sin embargo, las opciones farmacologicas actuales incluyen farmacos para ayudar a dejar de fumar, agonistas p2 de accion corta y larga, anticolinergicos de accion corta y larga, corticosteroides inhalados, teofilina, N-acetil cistema y otros mucoltticos y oxfgeno (Anzueto, Am. J. Med. 119: S46- S53, 2006; Barnes y Stockley, Eur. Respir. J. 25: 1084-1106, 2005). Los agonistas p2 de accion corta y larga se introdujeron para mejorar la broncodilatacion. A menudo se usan en combinacion con anticolinergicos porque producen broncodilatacion a traves de diferentes vfas. Los corticosteroides inhalados se usan a menudo en combinacion con el agonista p2 y las mejoras en las tasas de exacerbacion son mayores que las observadas con el componente individual. La teofilina es un broncodilatador util. El modo de accion de la N-acetil cistema no esta claro, pero puede actuar como un agente mucolttico o antioxidante para mejorar los smtomas de la tos y en algunos pacientes parece reducir la frecuencia de la exacerbacion.

A pesar de estas terapias, la unica intervencion que claramente muestra que reduce la mortalidad en ensayos clmicos es dejar de fumar.

La lesion pulmonar aguda (ALI) y el smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) son afecciones respiratorias inflamatorias asociadas con altas tasas de mortalidad. La patogenesis de ALI y ARDS implican respuestas de defensa del hospedador no controladas que conducen a inflamacion, dano endotelial, aumento de la coagulacion, disminucion de la fibrinolisis y fibroproliferacion. El ARDS es un smdrome clmico resultante de una diversidad de etiologfas. En 1994 se recomendo una definicion de la enfermedad por la American-European Consensus Conference sobre el Comite de ARDS; Los criterios incluyen: (1) inicio agudo, (2) infiltrados bilaterales en la radiograffa de torax, (3) presion de cuna en la arteria pulmonar < 18 mm de Hg o ausencia de evidencia clmica de hipertension en la auricula izquierda y (4) proporcion de Pao2/Fio2 < 300 (que define ALI) o proporcion de Pao2/Fio2 <200 (que define al ADRS como una forma mas severa de ALI) (Cepkova y Matthay, J. Intensive Care Med., 21: 119-143, 2006). El dano alveolar difuso es una caractenstica del ARDs. Los sucesos iniciadores que conducen a dano alveolar difuso y posteriormente a ALI o ARDS incluyen neumoma, aspiracion, embolia pulmonar, casi ahogamiento, lesion por inhalacion, edema pulmonar por repefusion, traumatismo, cirugfa, quemadura, sobredosis de farmacos, pancreatitis aguda, derivacion cardiopulmonar y transfusiones de sangre masivas, pero la sepsis general esta asociada con el riesgo mas elevado de desarrollar ALI o ARDS. Existen tres fases superpuestas de la enfermedad: Fase exudativa (en los primeros 4-7 dfas), fase proliferativa (> 7-14 o 21 dfas) y fase fibrotica (> 14 o 21 dfas) (MacLaren y Stringer, Pharmacotherapy, 27: 860-873, 2007).

La fase temprana inicial (fase exudativa) se caracteriza por una mayor permeabilidad de las barreras endoteliales y epiteliales del pulmon, con acumulacion de fluido edematoso rico en protemas y altamente celular en el intersticio pulmonar y alveolos. El fluido del edema contiene membranas hialinas y una diversidad de celulas inflamatorias, pero con predominio de neutrofilos. Por lo tanto la expresion patologica relacionada denominada: dano alveolar difuso, consiste en membranas hialinas mas al menos uno de los siguientes: necrosis alveolar de tipo I o de celulas

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endoteliales, edema, fibrosis intersticial, proliferacion prominente de celulas alveolares de tipo II. Algunos pacientes se recuperan durante la primera semana de la enfermedad, otros mueren durante esa fase, pero algunos evolucionan en una fase sub-aguda de ALI/ARDS que se desarrolla 7 o mas dfas despues del inicio. Durante esta fase sub-aguda el espacio alveolar se llena con celulas mesenquimales, sus productos y nuevos vasos sangumeos. Existen evidencias de fibrosis intersticial y alveolar con proliferacion de celulas tipo II y destruccion de porciones de microcirculacion en los pulmones. En algunos pacientes la insuficiencia respiratoria continua mas alla de 14 dfas, y esta fase cronica se caracteriza por una fibrosis pulmonar extensa con perdida de la arquitectura alveolar normal y el desarrollo progresivo de regiones enfisematosas en el pulmon (Cepkova y Matthay, J. Intensive Care Med., 21: 119143, 2006).

Durante la fase aguda hay una marcada acumulacion de neutrofilos. Los neutrofilos predominan en el fluido del edema pulmonar y el fluido de lavado broncoalveolar obtenido de personas afectadas. Los macrofagos alveolares secretan citoquinas por ejemplo interleuquina (IL)-1, IL-6, IL-8, IL-10 y factor de necrosis tumoral (TNF)-a, que actuan localmente para estimular la quimiotaxis de neutrofilos y para activar neutrofilos. A continuacion los neutrofilos liberan agentes oxidantes, proteasas (incluyendo elastasa de neutrofilos), leucotrienos y otros mediadores proinflamatorios (Ware y Matthay, New England J. Med. 342: 1334-1349). Estos mediadores interactuan en formas complejas para danar e inflamar la superficie de contacto de los capilares alveolares. Esta heterogeneidad de mediadores puede explicar por que las terapias anti-mediador que parecen prometedoras en modelos animales no se han traducido en un resultado clmico beneficioso cuando se administran en ensayos clmicos. El tratamiento del ARDS con corticosteroides, ibuprofeno, n-acetil cistema, lisofilina, prostaglandina E, anticuerpo anti-TNF-a, antagonista del receptor de IL-1 y ketoconazol ha sido decepcionante con todos en grandes ensayos clmicos.

La identificacion y tratamiento del trastorno clmico inductivo es un aspecto importante de la gestion de ALI/ARDS. En muchos pacientes el traumatismo que causo la lesion no se puede tratar excepto para prevenir la recurrencia y en estos pacientes los cuidados de apoyo optimos son primordiales. El pilar del cuidado de apoyo es la ventilacion mecanica y los ensayos recientes han mostrado que, en comparacion con un enfoque tradicional con respecto a la ventilacion mecanica, una estrategia dirigida a la administracion volumenes de corrientes menores y limitar la presion de la meseta daba como resultado una reduccion de la mortalidad (Mortelliti y Manning, Am. Family Physician 65: 1823-1830, 2002).

En la actualidad se ha encontrado que los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion interactuan con una serie de ligandos que son responsables, en parte o totalmente, de las afecciones discutidas anteriormente. Preferentemente el ligando es un peptido, polipeptido o protema aunque la presente invencion se extiende al ligando que es un carbohidrato, lfpido, glicoprotema o una molecula obtenida a partir de la identificacion sistematica de producto natural o a partir de una biblioteca qmmica. Las dianas de protema adecuadas incluyen las que se han descrito como protemas de union a GAG (heparina, sulfato de heparina, condroitina e hialuronano). Los ejemplos de ligandos de protema incluyen, pero no se limitan a: histamina, una citoquina incluyendo una interleuquina (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, y miembros de la familia IL-17 incluyendo IL-25), interferon (por ejemplo, a-interferon, p-interferon, Y-interferon) o un factor de crecimiento que incluye, pero no se limita a G-cSf, M-CSF, GM-CSF, BDNF, CNtF, EGF, ePo, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF 19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, LIF, MCP 1, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, M-CSF, MIP1, MIP2, KC, NGF, NT 3, NT4, NT5, NT6, NT7, OSM, PBP, PBSF, PDGF, PECAM-1, PF4, RANTES, SCF, TGFa, TGFp1, TGFp2, TGFp3, TNFa, TNFp, TPO, VEGF, GH, insulina y similares; una enzima (por ejemplo, superoxido dismutasa, protema cationica eosinofflica, triptasas (incluyendo p-triptasa), quimasas, elastasas, fosfolipasa A2 o prostaglandina endoperoxido); quimioquinas tales como eotaxina (eotaxina-1, -2 o -3); o un receptor soluble o unido a celula o virus (por ejemplo, receptor de trifosfato de inositol).

En un aspecto la invencion proporciona un ensayo o identificacion sistematica para determinar el efecto biologico de uno o mas conjugados de oligosacarido anionico, ensayo que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un ligando, celula o animal con uno o mas conjugados de oligosacarido anionico teniendo

cada uno independientemente la siguiente formula (I):

imagen16

en la que:

S1 yS2 cada uno representa independientemente oligosacaridos anionicos;

x1 representa un numero entero de 1 a 4;

x2 representa un numero entero de 0 a 11;

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X3 representa un numero entero de 0 a 10;

X4 representa 0 o 1; y

X5 representa un numero entero de 1 a 4;

y

b) cuantificar un efecto del uno o mas conjugados de oligosacarido anionico en el ligando, celula o animal.

La interaccion con un ligando se puede detectar mediante cualquier medio conveniente tales como retraso en gel, retraso en filtro, co-electroforesis por afinidad, ensayos de transferencia de energfa por resonancia de bioluminiscente (BRET), ensayos de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET), ensayos de polarizacion por fluorescencia (FP), ensayos de proximidad por centelleo o inmovilizacion en biochips u otras superficies incluyendo las acopladas con deteccion mediante espectrometna de masas.

Lo ultimo se puede conseguir inmovilizando primero el conjugado de oligosacarido anionico en un chip y a continuacion anadiendo el ligando. Como alternativa, el ligando se puede inmovilizar en un chip y usar para identificar sistematicamente la capacidad de un conjugado de oligosacarido anionico para unirse al mismo.

Ademas otra alternativa es inmovilizar un GAG, tal como heparina, en un soporte solido y a continuacion identificar sistematicamente la capacidad de un conjugado de oligosacarido anionico para inhibir la union de un ligando a la heparina inmovilizada.

Por consiguiente, un ensayo particularmente util es mezclar el ligando y el conjugado de oligosacarido anionico e identificar sistematicamente la capacidad del conjugado de oligosacarido anionico para inhibir la union del ligando a un GAG (por ejemplo, heparina o sulfato de heparano) unido a un chip.

Otro aspecto de la presente invencion contempla, por lo tanto, un metodo para producir un mimetico de GAG que interactue con un ligando tal como una protema, comprendiendo dicho metodo la produccion de una biblioteca de conjugados de oligosacarido anionico y a continuacion la identificacion sistematica de cada miembro de dicha biblioteca para una capacidad para interactuar con dicho ligando o para inhibir la interaccion entre el ligando y los GAG similares a Heparina (HLGAG) conocidos porque interactuan con dicho ligando.

En una realizacion preferente, el conjugado de oligosacarido anionico se une a un producto celular secretado que puede ser una protema, al hacerlo de este modo, inhibe la interaccion entre el ligando y un GAG tal como heparina.

Por supuesto, existe una serie de otros ensayos, que se pueden usar para identificar sistematicamente la interaccion entre un conjugado de oligosacarido anionico y un ligando o se pueden usar para identificar sistematicamente la inhibicion de la interaccion entre un ligando y un GAG del que se sabe que se une al ligando. Otro ensayo es un ensayo de union en filtro. En este ensayo, uno de un conjugado de oligosacarido anionico, o un ligando se etiqueta con una molecula indicadora capaz de proporcionar una senal identificable tan como un colorante fluorescente y se permite que ambas moleculas interactuen en solucion. A continuacion la mezcla resultante se pasa a traves de un filtro capaz de retrasar uno del conjugado de oligosacarido anionico o molecula compuesta de conjugado de oligosacarido anionico o el ligando o solamente un complejo de conjugado de oligosacarido anionico-ligando o complejo de molecula compuesta de conjugado de oligosacarido anionico-ligando.

En una realizacion, por ejemplo, el filtro es un filtro de nitrocelulosa que retrasa las protemas. En este caso I, si el conjugado de oligosacarido anionico, etiquetado con una molecula indicadora, fracasa al pasar a traves del filtro, entonces la presencia de la senal indicadora en el filtro indica la union del conjugado de oligosacarido anionico a la protema.

En otra realizacion, la heparina o el sulfato de heparano se etiqueta con la molecula indicadora y reacciona con la protema en presencia de diferentes conjugados de oligosacarido anionico. El paso de la heparina o el sulfato de heparano a traves del filtro es indicativo de que un conjugado de oligosacarido anionico ha inhibido la interaccion entre la heparina/sulfato de heparano y la protema.

Diferentes conjugados de oligosacarido anionico interactuaran con diferentes ligandos, o diferentes ligandos interactuaran con diferentes conjugados de oligosacarido anionico o ambos. Por consiguiente, otro ensayo implica el uso de columnas de afinidad que portan ligandos inmovilizados. A continuacion los conjugados de oligosacarido anionico se pasan a traves de la columna y se determina la presencia de retraso de los conjugados de oligosacarido anionico. De forma conveniente se usa un gradiente salino para eluir los conjugados de oligosacarido anionico unidos. Una vez que se identifica una fraccion que se une a un ligando en una columna, la fraccion se puede analizar adicionalmente para obtener una indicacion del numero de diferentes entidades estructurales en la misma. Los analisis de este tipo pueden comprender, por ejemplo, cromatograffa de intercambio anionico, espectrometna de masas o electroforesis.

Otros ejemplos de ensayos contemplados en la presente invencion incluyen ensayos funcionales tales como ensayos de celulas completas para evaluar la proliferacion celular (tal como se muestra en los Ejemplos 11 a 13),

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ensayos de inhibicion enzimatica (tal como se muestra en el Ejemplo 14), ensayos de quimiotaxis (tal como se muestra en el Ejemplo 15) ensayos en animales (tal como se muestra en los Ejemplos 16 a 20). Los ensayos funcionales de este tipo pueden proporcionar una informacion mas util sobre el efecto del conjugado de oligosacarido anionico(s) sometido a ensayo que los ensayos de union pura.

Una vez que se han identificado los conjugados de oligosacarido anionico que se unen a un ligando en particular, esta fraccion por sf misma puede ser util como un agente terapeutico para inhibir la interaccion entre una protema (u otro ligando) y un GAG de superficie celular (por ejemplo, heparina o sulfato de heparano). La protema (u otro ligando) puede ser sin celulas puede estar asociada con una celula o virus tal como una superficie celular o superficie viral. El conjugado de oligosacarido anionico mencionado tambien puede ser util como un agente terapeutico para modular la interaccion entre un producto celular secretado y componentes de la matriz extracelular o entre una protema de la superficie celular o componentes de la matriz extracelular, o entre una protema y su ligando, ambos o cualquiera de los cuales pueden estar asociados a la superficie celular o a celula. Como alternativa, el conjugado de oligosacarido anionico se puede usar como una diana para identificar productos naturales o productos de una biblioteca qmmica que imite al conjugado de oligosacarido anionico en terminos de union a un ligando o que inhiba o estimule la interaccion entre el GAG y el ligando. Estas moleculas pueden ser antagonistas o agonistas o analogos qmmicos del GAG. Por lo tanto, un "analogo" se extiende a, e incluye cualquier estructura que sea funcionalmente equivalente en la union y/o modulacion de un ligando de una manera analoga.

En el presente documento la referencia a "modular" o "poblacion" se extiende a, e incluye inhibir y/o estimular una interaccion.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para generar un medicamento para tratar una patologfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la produccion de una gama de conjugados de oligosacarido anionico de acuerdo con el metodo de la invencion, y la identificacion sistematica de cada conjugado de oligosacarido anionico para una capacidad para interactuar con o modular el ligando. El conjugado de oligosacarido anionico interactua con o que modula el ligando se identifica y el mismo o un analogo, agonista o antagonista del mismo se usa en la preparacion de dicho medicamento.

En una realizacion preferente, la modulacion es una inhibicion.

Los tipos de ligandos contemplados en el presente documento incluyen los enumerados anteriormente tales como PECAM-1, Ciclofilina A, gp120 y citoquinas tales como interleuquina (IL)-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 17 (incluyendo IL-25), G-CSF, GM-CSF, LIF y M-CSF y quimioquinas tales como eotaxina-1, eotaxina-2 y eotaxina-3 y enzimas tales como elastasa y otros agentes quimioatractores tales como MCP-1 y MIP-1a.

Los sujetos a tratar incluyen seres humanos, animales de ganado (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos, asnos), animales de laboratorio de ensayo (por ejemplo, conejos, cobayas, ratones, ratas) y animales de compama (por ejemplo, perros, gatos).

Ademas otro aspecto de la presente invencion contempla un metodo de profilaxis y/o tratamiento de una patologfa en un sujeto, resultando dicha patologfa de la interaccion entre un GAG sobre una superficie de una celula en dicho hospedador y un ligando, o un GAG en la matriz extracelular en dicho hospedador y un ligando que puede estar o no asociado a celulas, o una interaccion de protema-ligando en dicho hospedador que se puede interrumpir con un GAG en la que la protema puede estar asociada a celulas y el ligando soluble o tanto protemas como ligandos pueden estar asociados a celulas, comprendiendo dicho metodo la administracion a dicho sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un conjugado de oligosacarido anionico, producido e identificado de acuerdo con la invencion, que interactua con dicho ligando.

Otro aspecto de la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un conjugado de oligosacarido anionico como se definen en el presente documento y un vehmulo y/o diluyente farmaceuticamente aceptable.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (que son solubles en agua), polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones inyectables esteriles y formas inhalables. Tales formas son preferentemente estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. El vehmulo puede ser un disolvente o medio de dilucion que comprende, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferente incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan mediante la incorporacion del conjugado de oligosacarido anionico y vehmulo/diluyente en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado seguido de esterilizacion o al menos un metodo para reducir virus contaminantes, bacterias u otras entidades biologicas a niveles aceptables para

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administracion a un ser humano o sujeto animal. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion adecuados incluyen secado al vado y la tecnica de liofilizacion que produce un polvo de principio activo mas cualquier ingrediente adicional deseado.

Cuando el conjugado de oligosacarido anionico esta protegido de forma adecuada, este se puede administrar por v^a oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vetnculo comestible asimilable, o puede estar encerrado en capsula de gelatina dura o blanda, o se pueden formar comprimidos mediante compresion. Para la administracion terapeutica oral, el principio activo se puede incorporar con excipientes y se puede usar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener preferentemente al menos un 1 % en peso de conjugado de oligosacarido anionico activo. Por supuesto, el porcentaje de las composiciones y preparaciones se puede variar y de forma conveniente puede estar entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 80 % del peso de la unidad. La cantidad de conjugado de oligosacarido anionico activo en tales composiciones terapeuticamente utiles es tal que se obtendra una dosificacion adecuada. Las composiciones o preparaciones preferentes de acuerdo con la presente invencion se preparan de modo que una forma unitaria de dosificacion oral contenga entre aproximadamente 0,1 pg y 200 mg de conjugado de oligosacarido anionico activo. Las cantidades de dosificacion alternativas incluyen de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 1000 mg y de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 500 mg. Estas dosificaciones pueden ser por individuo o por kg de peso corporal. La administracion puede ser por segundo, minuto, hora, dfa, semana, mes o ano.

Los comprimidos, trociscos, pfldoras y capsulas y similares tambien pueden contener los componentes que se enumeran en lo sucesivo en el presente documento. Se puede anadir un aglutinante tal como goma, goma arabiga, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicalcico; uno agente desintegrante tal como almidon de mafz, almidon de patata, acido algmico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina. Cuando la forma unitaria de dosificacion es una capsula, esta puede contener, ademas de materiales del tipo mencionado anteriormente, un vetnculo lfquido. Otros materiales diversos pueden estar presentes como revestimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la unidad de dosificacion. Por ejemplo, comprimidos, pfldoras o capsulas se pueden revestir con goma laca, azucar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparacion de cualquier forma de dosificacion unitaria debena ser farmaceuticamente puro y sustancialmente no toxico en las cantidades usadas. Ademas, el compuesto o compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberacion sostenida.

Los vehnculos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de disolventes, medios de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de absorcion. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas se conoce bien en la tecnica y excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo su uso, se contempla en las composiciones terapeuticas. En las composiciones tambien se pueden incorporar principios activos suplementarios.

La composicion tambien se puede formular para administracion local o topica. Las tecnicas de formulacion y administracion se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton PA., 16a edicion, 1980, Ed. por Arthur Osol. Por lo tanto, para administracion local o topica, las composiciones objeto se pueden formular de cualquier manera adecuada, que incluyen, pero no se limitan a, cremas, geles, aceites, pomadas, soluciones, suspensiones, polvos, nebulizaciones o aerosoles. Para administracion transmucosal, en la formulacion se usan agentes penetrantes apropiados para la barrera a permear. Los agentes penetrantes de este tipo por lo general se conocen en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, digitonina, dihidrocitocalasina B5 y acido caprico.

Las composiciones de la invencion objeto en forma de lociones, cremas o geles pueden contener diluyentes o vehnculos aceptables para impartir la textura, consistencia, viscosidad y aspecto deseados. Los diluyentes y vehnculos aceptables son familiares para los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos etoxilados y no etoxilados, alcoholes grasos, acidos grasos, aceites de hidrocarburos (tales como aceite de palma, aceite de coco y aceite mineral), ceras de manteca de cacao, aceites de silicio, agentes tamponantes, derivados de celulosa, agentes emulsionantes tales como bases organicas e inorganicas no ionicas, agentes conservantes, esteres de cera, alcoholes de esteroides, esteres de triglicerido, fosfolfpidos tales como lecitina y cefalina, esteres de alcohol polihndrico, esteres de alcohol graso, derivados hidrofilos de lanolina y derivados hidrofilos de cera de abejas.

En una realizacion particularmente preferente, la presente invencion contempla una composicion farmaceutica para su inhalacion. Las composiciones que comprenden uno o mas conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion se pueden administrar al tracto respiratorio como un aerosol de inhalacion nasal o pulmonar o solucion para un nebulizador, o como un polvo microfino (preferentemente con partfculas con un tamano del orden de 1 a 10 micrometros o inferior) para insuflacion, solo o en combinacion con un vetnculo inerte tal como lactosa, o con otros excipientes farmaceuticamente aceptables.

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Las formulaciones de aerosol incluyen aquellas en las que el conjugado de oligosacarido anionico se proporciona en un envase presurizado con un agente propulsor adecuado tal como un inhalador de dosis medida presurizado (pMDI). Si bien el propulsor puede ser un clorofluorocarbono (CFC) tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, el agente propulsor es mas preferentemente un agente propulsor no clorofluorocarbonado tal como dioxido de carbono, hidrofluoroalcanos (tales como HFA-134a) u otro gas adecuado. De forma conveniente el aerosol tambien puede contener un tensioactivo tal como lecitina. La dosis del conjugado de oligosacarido anionico se puede controlar mediante el suministro de una valvula de dosificacion. Se ha encontrado que un tamano de partfcula de aproximadamente 2 a 3 pm es preferente para el tratamiento de asma, ya que las partfculas con un tamano inferior a 1 pm por lo general se exhalan sin suministro al pulmon y las partfculas con un tamano superior a 10 pm estan atrapadas en su mayor parte por deposicion orofarmgea y no alcanzan el pulmon. Los dispositivos impulsados por HFA-134a suministran gotitas mas pequenas que penetran mas facilmente en las vfas respiratorias bronquiales. Preferentemente la administracion de aproximadamente un 40 % de las gotitas inhaladas en el pulmon es deseable y se puede conseguir usando un pMDI como se ha indicado anteriormente. Para el tratamiento de rinitis alergica el tamano de partfcula preferente para la administracion del farmaco a traves del conducto nasal es de 20-80 pm, ya que las partfculas mas pequenas (tamano inferior a 10 pm) se transportan a la region traqueobraquial, mientras que las partfculas mas grandes (tamano superior a 100 pm) se eliminan rapidamente del conducto nasal.

El conjugado de oligosacarido anionico tambien se puede proporcionar en una formulacion farmaceutica que forma un gel en la cavidad nasal. El conjugado de oligosacarido anionico tambien se puede formular en una composicion en polvo que se puede presentar en forma de dosis unitaria por ejemplo en capsulas o cartuchos por ejemplo de gelatina, o envases de tipo blister a partir de los cuales se puede administrar el polvo por medio de un inhalador.

Como se usa en el presente documento la expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a la sal de un compuesto dado, en el que la sal es adecuada para administracion como un producto farmaceutico. Por ejemplo, las sales de este tipo se pueden formar por la reaccion de un acido o una base con un grupo amino o un grupo carboxilo respectivamente.

Las sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables se pueden preparar a partir de bases inorganicas y organicas. Las sales obtenidas a partir de bases inorganicas incluyen, pero no se limitan a, las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, y magnesio. Las sales obtenidas a partir de bases organicas incluyen, pero no se limitan a, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas de origen natural, y aminas dclicas, incluyendo isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, lisina, arginina, histidina, cafema, procama, hidrabamina, colina, betama, etilendiamina, glucosamina, N-alquilglucaminas, teobromo, purinas, piperazina, piperidina, y N-etilpiperidina. Tambien se debena entender que otros derivados de acido carboxflico podnan ser utiles en la practica de la presente invencion, por ejemplo amidas de acido carboxflico, incluyendo carboxamidas, carboxamidas de alquilo inferior, carboxamidas de di(alquilo inferior), y similares.

Las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables se pueden preparar a partir de acidos inorganicos y organicos. Las sales obtenidas a partir de acidos inorganicos incluyen acido clortndrico, acido bromhfdrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares. Las sales obtenidas a partir de acidos organicos incluyen acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido succmico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido salidlico y similares.

La expresion "grupo protector" se refiere a cualquier grupo que cuando se une a uno o mas grupos hidroxilo, tiol, amino o carboxilo de los compuestos evita que se produzcan reacciones en estos grupos y cuyo grupo protector se puede retirar mediante etapas qrnmicas o enzimaticas convencionales para reestablecer el grupo hidroxilo, tio, amino o carboxilo. El grupo de bloqueo que se puede retirar en particular usado no es cntico y los grupos de bloqueo de hidroxilo que se pueden retirar preferentes incluyen sustituyentes convencionales tales como alilo, bencilo, acetilo, cloroacetilo, tiobencilo, bencilidina, fenacilo, t-butildifenilsililo y cualquier otro grupo que se pueda introducir por via qrnmica sobre un grupo funcional hidroxilo y posteriormente se puede retirar de forma selectiva ya sea mediante metodos qrnmicos o enzimaticos en condiciones suaves compatibles con la naturaleza del producto. Los grupos protectores se desvelan con mas detalle en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" 2. sup.nd Ed., 1991, John Wiley and Sons, N.Y.

Los grupos de bloqueo de amino que se pueden retirar preferentes incluyen sustituyentes convencionales tales como t-butioxicarbonilo (t-BOC), benciloxicarbonilo (CBZ), fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC), aliloxicarbonilo (ALOC) y similares, que se pueden retirar mediante condiciones convencionales compatibles con la naturaleza del producto.

"Selectividad" o "especificidad" en general es una medida de las preferencias de union de un ligando con respecto a diferentes receptores y/o una medida de las preferencias de union de diferentes ligandos con respecto a un receptor. La selectividad de un ligando con respecto a su receptor diana en relacion con otro receptor viene dada por la proporcion de los respectivos valores de Kd (es decir, las constantes de disociacion para cada complejo de ligando- receptor), o en los casos en los que se observa un efecto biologico por debajo de la Kd, la selectividad se da por la

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proporcion de los valores de CE50 respectivos (es dedr, las concentraciones que producen un 50 % de la respuesta maxima para el ligando que interactua con los dos receptores distintos).

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que es suficiente para efectuar el tratamiento, como se ha definido anteriormente, cuando se administra a un animal, preferentemente un mai^ero, mas preferentemente un ser humano que necesita un tratamiento de ese tipo. La cantidad terapeuticamente eficaz variara dependiendo del sujeto y la patologfa que se esta tratando, la gravedad de la afliccion y la forma de administracion, y alguien con una experiencia habitual en la materia lo puede determinar de forma rutinaria.

El termino "tratamiento", como se usa en el presente documento abarca cualquier tratamiento de una afeccion o enfermedad en un animal, preferentemente un mairnfero, mas preferentemente un ser humano, e incluye: (i) evitar que la enfermedad o afeccion se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aun no se ha diagnosticado que la padece; (ii) inhibir la enfermedad o afeccion, es decir detener su desarrollo; (iii) aliviar la enfermedad o afeccion, es decir causar la regresion de la afeccion; o (iv) aliviar las afecciones causadas por la enfermedad, es decir smtomas de la enfermedad.

Se entiende que los compuestos de la presente invencion pueden existir en una o mas formas estereoisomericas (por ejemplo enantiomeros, diastereomeros). La presente invencion incluye dentro de su alcance todas estas formas estereoisomericas ya sea aisladas (por ejemplo en aislamiento enantiomerico), o en combinacion (incluyendo mezclas racemicas).

La invencion se describira a continuacion con referencia a los siguientes ejemplos mas limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1

Smtesis de W-Fmoc-1-W-glicinamidomaltotriosido.

En la tecnica anterior existen numerosos ejemplos para la formacion de glicosilaminas, cuyos metodos se pueden aplicar a una gama diversa de conjugados de oligosacarido.

En resumen, se disolvieron maltotriosa (1 g, ~2 mmol) y NH4HCO3 (160 mg, 2 mmol) en amoniaco (10 ml). La solucion se incubo durante 32 horas a 40 °C antes de evaporacion a sequedad en un evaporador centnfugo. Para retirar el amoniaco residual, el residuo se disolvio en la cantidad minima de agua y se liofilizo. Una porcion del residuo (820 mg) se disolvio en una mezcla de DMSO (10 ml), DMF (6 ml) y DIPEA (0,6 ml). Se anadieron Fmoc- glicina (1,2 g), HOBT (0,5 g) y HBTU (3 g) y la solucion se incubo durante al menos 4 h antes de la adicion de un volumen igual de agua y se acidifico con acido acetico (0,6 ml) para interrumpir la reaccion. Despues de enfriar y filtrar, el producto deseado se puede purificar mediante RP-HPLC preparativa. Por ejemplo, se inyectaron hasta 2 ml en una columna Exsil C18 de 250 mm x 10 mm de ID. La columna se eluyo con una mezcla de gradiente binario de disolvente A (TFA al 0,1 % que contiene acetonitrilo al 15%) y disolvente B (acetonitrilo al 85%). El gradiente comprendfa B al 10 % durante 3 minutos, aumentado a un 50 % a los 15 minutos (para eluir el producto deseado), y a continuacion un 90 % a los 16 minutos que se mantuvo durante 5 minutos (para eluir Fmoc-glicinamida y el exceso de Fmoc-gly). El caudal era de 2,5 ml/min. El eluyente se controlo a 290 nm y las fracciones se recogieron con un automuestreador. Las fracciones que conteman el producto deseado se combinaron, se concentraron en un evaporador centnfugo para retirar la mayor parte del acetonitrilo y a continuacion se liofilizaron para proporcionar a polvo de color blanco, esponjoso(-0,6 g).

Los derivados de W-Fmoc-1-W-glicinamida de otros oligosacaridos se prepararon de una manera similar.

Eiemplo 2

Smtesis de polisulfato de W-Fmoc-1-W-glicinamidomaltotriosido.

El W-Fmoc-1-W-glicinamidomaltotriosido (0,5 g, 0,64 mmol) se disolvio en DMF seca (10 ml) y se anadio complejo de piridina y trioxido de azufre (3 g, 19 mmol). La solucion se incubo a temperatura ambiente durante 48 h y se interrumpio mediante la adicion de agua. El analisis de la mezcla de reaccion por RP-IP HPLC con UV doble y ELSD indicaba un solo pico ancho, lo que indica que no se produda desproteccion. El producto deseado se puede purificar mediante RP-HPLC preparativa, RP-IP HPLC o cromatograffa AEX. Por ejemplo, se inyectaron hasta 2 ml en una columna Exsil C18 de 250 mm x 10 mm de ID. La columna se eluyo con una mezcla de gradiente binario de disolvente A (TFA al 0,1 %) y disolvente B (acetonitrilo al 50%). El gradiente comprendfa B al 6% durante 3 minutos, aumentado a un 50 % a los 15 minutos. El caudal era de 2,5 ml/min. El eluyente se controlo a 290 nm y las fracciones se recogieron con un automuestreador. Las fracciones que conteman el producto deseado se combinaron y se concentraron a sequedad en un evaporador centnfugo. El producto se analizo por MALDI MS usando la tecnica de cristalizacion de par ionico ion que se muestra en la Figura 1. El espectro indica claramente que el producto esta persulfatado.

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Ejemplo 3

Smtesis del Componente Basico A de Cloroacetilo (Esquema 1) para serie de maltotriosa.

Se anadieron agua y NaHCO3 (0,2 g) polisulfato de W-Fmoc-1-A/-glicinamidomaltotri6sido y el pH se ajusto a 12,5 mediante la adicion de NaOH 10 M. El producto protegido con Fmoc se disolvfa totalmente a medida que el pH aumentaba, tras lo cual se formo un precipitado. El analisis de la mezcla de reaccion por RP-IP HPLC indicaba la desproteccion completa en 20 minutos. El pH se ajusto a 8,5 mediante la adicion de acido acetico y la solucion acuosa se extrajo con CHCh (3 x 10 ml) y hexano (1x10 ml). Se anadieron anlmdrido cloroacetico (0,5 g) y NaHCO3 (1 g) a la solucion acuosa y, de forma periodica, el pH se ajustaba a 8,25 mediante la adicion de NaHCO3. Despues de 1 h, el analisis de la mezcla de reaccion por RP-IP HPLc indicaba la reaccion completa. El producto se purifico por AEX despues de acidificar primero la reaccion a pH 6 mediante la adicion de HCl 2 M y NaCl 5 M anadidos para proporcionar una concentracion final de aproximadamente NaCl 0,3 M. La solucion se aplico a un cartucho Econo-Q de 5 ml (Biorad, Sydney, Australia) y se lavo con NaH2PO4 10 mM/ NaCl 0,6 M a pH 7 y el producto se eluyo con NaH2PO4 10 mM/ NaCl 3 M a pH 7 y se almaceno a 4 °C hasta su uso posterior. La concentracion del producto se sometio a ensayo por RP-IP HPLC usando octasulfato de sacarosa como un patron cuantitativo.

Ejemplo 4

Smtesis del Componente Basico C (Esquema 1) para serie de maltotriosa.

Las almuotas del Componente Basico A de cloroacetilo se ajustaron a pH 8,25 mediante la adicion de NaHCO3, isopropanol anadido para generar una solucion al 30 % y un exceso molar de 10 veces de un ditiol elegido entre los Ditioles 1 a 5 mostrados anteriormente. La solucion se agito a temperatura ambiente durante una noche. El exceso de ditiol se extrajo con CHCh (3 x10 ml) y hexano (1 x 10 ml). En los casos en los que el analisis indicaba la formacion de disulfuros estos se redudan mediante la adicion de TCEP (solido) 1 h antes de su purificacion por AEX como se ha descrito anteriormente. Los productos purificados se sometieron a ensayo por RP-IP HPLC usando octasulfato de sacarosa como un patron cuantitativo y se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior. De esta manera, cada uno de los 5 componentes basicos de ditiol, correspondientes al acoplamiento del Componente Basico A de maltriosa con cada uno de los conectores, se sintetizaron en paralelo.

Ejemplo 5

Smtesis de productos finales de polisulfato de 6/smaltotriosilo.

Un exceso de 1,5 molar del Componente Basico A de maltotriosa se mezclo con cada uno de los Componentes Basicos C de maltotriosa y el pH se ajusto a 9. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 2 dfas. En este momento no se detectaron productos ni de Componente Basico C de maltotriosa residual ni de disulfuro usando analisis por RP-IP con ELSD. Cuando los productos de disulfuro se detectaron despues de unas pocas horas, estos se podfan reducir mediante la adicion de TCEP. Si se desea, el TCEP se puede retirar por AEX como se ha descrito anteriormente. En cuyo caso, las fracciones recogidas se ajustan a pH 9 y se permite que la reaccion evolucione adicionalmente, si era necesario, con una adicion adicional de Componente Basico A.

Con el criterio de valoracion deseado, las reacciones se diluyeron con un volumen igual de tributilacetato amonico 15 mM a pH 6 que contema acetonitrilo al 15 % y los productos se purificaron por RP-IP HPLC usando una columna Exsil C18 de 250 mm x 10 mm de ID. La columna se eluyo con una mezcla de gradiente binario de disolvente A (tributilacetato amonico 15 mM a pH 6 que contema acetonitrilo al 15%) y disolvente B (acetonitrilo al 85%). El gradiente comprendfa B al 10 % durante 3 minutos, aumentado a un 50 % a los 20 minutos, y a continuacion a un 90 % a los 22 minutos que se mantuvo durante 5 minutos. El caudal era de 2,5 ml/min. El eluyente se controlo a 254 nm y las fracciones se recogieron con un automuestreador. Las fracciones que conteman el producto deseado se combinaron, se concentraron en un evaporador centnfugo para retirar la mayor parte del acetonitrilo y a continuacion se liofilizaron para proporcionar un polvo de color blanco, esponjoso.

Ejemplo 6

Como materia prima se puede usar una mezcla de oligosacaridos de D.P. variable. El fraccionamiento de esta mezcla basandose en el tamano se consigue por RP HPLC preparativa despues de unir un grupo protector Fmoc hidrofobo. Con este modo, la retencion disminuye a medida que el tamano del oligosacarido aumenta. El grupo Fmoc se une a traves de un compuesto intermedio de glicosilamina. La sulfatacion del conjugado de oligosacarido- Fmoc se consigue con el complejo Py.SO3 y el producto extrafdo de la mezcla de reaccion usando RP-IP HPLC preparativa. La posterior desproteccion y bromoacetilacion de la amina se realiza en el mismo recipiente y proporciona un derivado de bromoacetilo. Esto se hace reaccionar (en exceso) con el Ditiol 2 para generar el producto final (X = H o SOaNa):

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El agente de emparejamiento ionico usado durante las etapas de HPLC, tributilamina, es inerte durante estas manipulaciones. El producto deseado se purifica por RP-IP HPLC preparativa.

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En el Esquema 2 se muestra un resumen de la ruta de smtesis para la preparaciOn de sulfomaltopentaosa- tetraetilenglicol-sulfomaltopentaosa y se describe a continuaciOn. Con fines de claridad, en el esquema se representa solamente una porciOn de cada una de las cadenas de maltopentaosa.

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1. Se disolvieron jarabe de malto-oligosacarido (por ejemplo, jarabe pentrup de Hayashibara o jarabe de mafz, 15 50 g) y NH4HCO3 (6 g) en amoniaco al 25 % (375 ml) y se incubO a 40 °C durante 40 h. La mezcla se evaporO en

evaporador rotatorio a sequedad, se disolviO en la cantidad mmima de agua y de nuevo se evaporO a sequedad. El residuo se disolviO en la cantidad mmima de agua y se anadieron 3 volumenes de etanol con mezcla. Se permitiO que la mezcla sedimentara durante una noche y el sobrenadante se decantO. El residuo se disolviO en una cantidad minima de agua y de nuevo se evaporO a sequedad para producir el compuesto 2 del Esquema 2 20 en forma de una goma.

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2. Se disolvieron Fmoc-gly-OH (11 g), hidroxibenzotriazol (HOBT, 27,5 g), hexafluoro-fosfato de O-benzotriazol- N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBtU, 4,9 g) y TEA (4,9 ml) en una mezcla de 120 ml de DMSO y 30 ml de DMF. La solucion resultante se anadio al resto de oligosacarido y la mezcla se agito durante una noche. La reaccion se interrumpio mediante la adicion de agua (500 ml) y acido acetico glacial (5 ml) y se permitio que se enfriara a temperatura ambiente. El precipitado formado se retiro y se descarto. El agua madre se lavo con acetato de etilo (3 x 100 ml) y hexano (1 x 100 ml). El acetato de etilo residual y hexano en la fase acuosa se retiraron mediante concentracion en un evaporador rotatorio y la solucion se diluyo a 600 ml mediante la adicion de agua.

3. La mezcla se fracciono mediante HPLC en fase inversa preparativa mediante inyeccion repetida.

Condiciones del ejemplo -

Columna: Phenomenex Axia 100 x21,2 mm Luna C18 (2) equipada con un cartucho protector de seguridad (o sustituto adecuado).

Eluyente A: acido formico al 0,1 %.

Eluyente B: acetonitrilo al 80 %.

Flujo: 20 ml/min.

Detector: UV a 270 nm.

La fraccion deseada se recogio y se concentro en un evaporador rotatorio y la solucion resultante se liofilizo para producir aproximadamente 6 g de polvo de color blanco del derivado de Fmoc de maltopentaosa (Msgly-Fmoc) obtenido a partir de jarabe pentrup. El perfil de elucion de HPLC se muestra en la Figura 2.

4. Se disolvio M5gly-Fmoc (6 g) en dMf (100 ml), se anadio complejo de Py.SO3 (42 g) y la solucion se agito a temperatura ambiente durante una noche. La reaccion se interrumpio mediante la adicion de agua (500 ml) y el pH se ajusto a 6 mediante la adicion de tributilamina. El M5gly-Fmoc sulfatado se extrajo usando HPLC de emparejamiento ionico en fase inversa preparativa mediante inyeccion repetida.

Condiciones del ejemplo -

Columna: Phenomenex Axia 100 x21,2 mm Luna C18 (2) equipada con un cartucho protector de seguridad (o sustituto adecuado).

Eluyente A: tributilamina 8 mM en acetonitrilo al 20 % con el pH ajustado a 5,8 con acido acetico.

Eluyente B: acetonitrilo al 80 %.

Flujo: 20 ml/min.

Detector: UV a 270 nM.

La fraccion o fracciones deseadas se concentran en un evaporador rotatorio para producir una solucion del compuesto sulfatado 4 del Esquema 2 (SM5gly-Fmoc).

5. El SM5gly-Fmoc se desprotegio ajustando a > pH 13 con NaOH y se incubo a temperatura ambiente durante 15 minutos. El ppt/aceite se extrajo con 2 x 50 ml hexano y se descarto. La amina resultante se bromoacetilo en el mismo recipiente despues de ajustar el pH a 8,25. Se anadieron alfcuotas de 3x1,2 g de cloruro de bromoacetilo a intervalos de 15 minuto a la solucion con un control constante del pH y adicion de Na2CO3 para mantener el pH en 8-8,25.

La evolucion de esta reaccion se controlo por RP-IP HPLC analftica. Condiciones del ejemplo -

Columna: Phenomenex Luna 30 x 4,6 mm C18 (2) equipada con un cartucho protector de seguridad.

Eluyente A: tributilamina 8 mM en acetonitrilo al 20 % ajustado a pH 5,8 con acido acetico.

Eluyente B: acetonitrilo al 80 %.

Flujo: 1 ml/min.

Detector: UV a 270 nM y ELSD.

El derivado bromoacetilado deseado se precipito mediante la adicion de 3 volumenes de etanol y la mezcla se enfrio a 4 °C. El precipitado se separo y se volvio a disolver en AcONa 0,4 M a pH 7 y se volvio a precipitar mediante la adicion de 3 volumenes de etanol y la mezcla se enfrio a 4 °C. El solido, que corresponde al compuesto 5 del Esquema 2, se disolvio en la cantidad minima de agua y se sometio al ensayo mediante SEC como se ha descrito anteriormente usando sulfato de p-ciclodextrina como patron. A una solucion que contema aproximadamente 450 mg de compuesto 5 del Esquema 2 se anadio EDTA 0,2 M (200 pl), NaHCO31 M (2 ml) y se ajusto a pH 8,75. Se anadieron isopropanol (3 ml) y 2,2'-oxidietanotiol (17 pl) y la mezcla se agito a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, se anade una cantidad adicional de 17 pl de 2,2'-oxidietanotiol y la solucion se agita durante una noche. La reaccion se controlo por RP-IP HPLC como se ha descrito anteriormente. La reaccion se controlo por RP-IP HPLC analftica como se ha descrito anteriormente. En esta tecnica tambien se observa el compuesto intermedio transitorio resultante de la condensacion de un conjugado de bromoacetilo con un solo tiol del tetraetilenglicol.

6. Un compuesto 7 del Esquema 2 se purifico por RP-IP HPLC preparativa como se ha descrito anteriormente. La fraccion apropiada se concentra por evaporacion rotatoria y se liofiliza para retirar el exceso de acetato de tributilamina.

7. El residuo se disolvio en agua y la solucion resultante se ajusto a pH 5,5 con acido acetico. Esta solucion se aplica a una columna de 4x2 cm de Dowex 50WX8 (forma de Na+) 2x4 cm y se lavo con 3 volumenes de columna de agua. El flujo continuo y los lavados se recogen y se combinan.

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8. Los lavados combinados se ajustaron a pH 7 y se dializaron mediante ultrafiltracion repetida con una membrana de MWCO de 1 kDa.

9. La solucion concentrada se liofilizo para producir un polvo de color blanco.

Ejemplo 7

Los conjugados de maltooligosacaridos de D.P. diferente se preparan de una manera similar mediante seleccion de la fraccion apropiada en la etapa 3 en el ejemplo 6 mencionado anteriormente.

Ejemplo 8

Los conjugados de otros oligosacaridos se preparan de una manera similar seleccionando la fraccion de oligosacarido puro apropiado de la mezcla de oligosacaridos en la etapa 1 en el ejemplo 6 y seleccionando posteriormente la fraccion apropiada en la etapa 3.

Ejemplo 9

Los conjugados de oligosacaridos con un conector diferente se preparan por sustitucion de un compuesto de ditiol diferente en la etapa 5 en el ejemplo 6.

De una manera similar, el compuesto de ditiol se puede variar en los metodos de los ejemplos 7 y 8.

Ejemplo 10

Ensayo de Identificacion Sistematica con BIAcore

El fenomeno optico de resonancia de plasmones superficiales se usa para controlar las interacciones ffsicas entre moleculas. El paso de una solucion de un ligando de protema potencial (por ejemplo, IL-4, IL-5, eotaxina-1, eotaxina- 2, IL-8 o MCP-1) sobre una superficie de sensor a la que se acopla una diana (por ejemplo, heparina) controla la union en tiempo real de ligandos de protema a la diana inmovilizada. La deteccion se consiguen midiendo cambios de mdice de refraccion muy proximos a la superficie del sensor. Cuando el mdice de refraccion se altera, el angulo en el que se produce la resonancia de plasmones cambia y este cambio se correlaciona directamente con la cantidad de protema que interactua con la superficie. De forma conveniente se usa un A BIAcore 2000. Es muy sensible y su microfluidez asegura que solamente se necesitan pequenas cantidades de material.

La heparina biotinilada se inmoviliza en el chip de biosensor. La biotinilacion se produce a traves de grupos amino, o extremos reductores modificados con amoniaco mediante aminacion reductora, usando sulfo-NHS-biotina. Las soluciones que contienen ligandos de protema potencial es de interes se inyectaron sobre la superficie del chip sensor, y la union se mide en tiempo real (Fernig, En: Proteoglycan protocols, Ed. R.V. lozzo, Humana Press, Totowa, NJ, USA, 2001). Con este metodo el baculovirus que expresa IL-4 humana recombinante (rhIL-4) y el baculovirus que expresa IL-5 humana recombinante (rhIL-5) se unen rapidamente a la heparina inmovilizada (vease el documento PCT/AU2005/000551). La union espedfica, ya que hay poca interaccion de cualquiera de IL-4 o IL-5 con chips sensores que carecen de heparina. De forma analoga, la eotaxina-1 humana recombinante (CCL11) expresada en E. coli se une rapidamente a la heparina inmovilizada y la union espedfica ya que existe poca union de la eotaxina a los chips sensores que carecen de heparina (vease el documento 30544601 PCT glIcan151). De forma analoga la IL-8 recombinante humana (CXCL8), MCP-1 (CCL2) y eotaxina-2 (CCL24) expresadas en E. coli se unen rapidamente a la heparina inmovilizada y la union es espedfica ya que existe poca union a chips sensores que carecen de heparina.

Las preparaciones de los diversos conjugados de oligosacarido anionico de oligosacaridos sulfatados inhiben la union de IL-4, IL-5, eotaxina-1, eotaxina-2, IL-8 y MCP-1 a la heparina inmovilizada en el chip de BIAcore (Tabla 1 y Tabla 2).

Dentro de cada uno de los conjugados de oligosacarido anionico que se muestran en las Tablas que siguen a continuacion, los dos oligosacaridos son los mismos. Los compuestos de este tipo en modo alguno pretende limitar los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion a los conjugados que portan componentes identicos de oligosacarido S1 y S2. En algunas realizaciones S1 y S2 son oligosacaridos diferentes. De forma analoga, el hecho de que los oligosacaridos mostrados en las tablas que siguen a continuacion esten persulfatados no limita en modo alguno que los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion contengan esos oligosacaridos que estan persulfatados. En algunas realizaciones los oligosacaridos estan parcialmente sulfatados, y/o contienen grupo funcional fosfato, etc.

En las Tablas que siguen a continuacion los conectores indicados por Et1, Et2, Et3, Et4 y Et5 son como se representan a continuacion:

5

10

15

20

25

30

35

40

imagen19

Se observara que el conector Et1 se puede formar usando el Ditiol 1, Et2 se puede formar usando el Ditiol 2, Et3 se puede formar usando el Ditiol 3, Et4 se puede formar usando el Ditiol 4 y Et5 se puede formar usando el Ditiol 5.

Algunos conjugados de oligosacarido anionico tienen una actividad mucho mayor que otros. A partir de estos datos, los conjugados de oligosacarido anionico con la actividad mas elevada son los de la serie con maltosa sulfatada unida y en particular los conjugados de maltopentaosa sulfatada unida. Aunque dependiendo de la protema sometida a ensayo tambien se observa una actividad de union con maltotetraosas sulfatadas unidas, esta actividad de union no es tan grande como la de la serie de conjugado de oligosacarido anionico con maltopentaosa sulfatada. Los conjugados de oligosacarido anionico que comprenden las estructuras de maltopentaosa sulfatada se unen mucho mejor a IL-8 y de ese modo inhiben la union de IL-8 a la heparina mejor que los conjugados de oligosacarido anionico que comprenden las estructuras de tetraosa sulfatada. Los requisitos estructurales para la union a MCP-1 son menos rigurosos ya que tanto la maltopentaosa como la maltotetraosa que contienen conjugados de oligosacarido anionico unidos son aproximadamente las mismas. MCP-1 tambien se puede unir a conjugados basandose en una estructura principal de sacarido diferente, pero menos bien que la serie de maltopentaosa. MCP-1 se une a los xilanos sulfatados unidos ligeramente mejor de lo que se une a la heparina y parece que dentro de esta serie, los conjugados de oligosacarido anionico con xilopentaosa sulfatada unidos por los mismos conectores, por ejemplo Et1 o Et3 son preferentes.

Las diferencias en la capacidad de Eotaxina-1 y Eotaxina-2 para unirse a los diversos conjugados de oligosacarido anionico son notables. La Eotaxina-1 solamente se une a la serie de maltopentaosa sulfatada, uniendose en aproximadamente la misma extension que la heparina para conjugados de oligosacarido anionico con el conector Et2 y el conector Et5, pero la union es mejor que la heparina cuando el conjugado de oligosacarido anionico contiene el conector Et4 (Compuesto ID 9). Por el contrario, la Eotaxina-2 se une a la serie de maltopentaosa sulfatada de una manera significativamente mejor que la heparina con el conector Et5 siendo ligeramente preferente. La Eotaxina-2 tambien se une a la serie de la maltotetraosa sulfatada mejor que la heparina, pero dentro de esta serie la union era mejor a un conjugado de oligosacarido anionico con un conector corto (conector Et2, Compuesto ID 12) en lugar de con el conector largo (conector Et5, Compuesto ID 15). La Eotaxina-2 mostraba una cierta actividad de union con la serie de xilano unido sulfatado pero esta era mas debil que la del alcance de la Eotaxina-2 unida a heparina.

La importancia de la longitud del conector para su union vana de protema. Para Eotaxina-2, MCP-1 y IL-8 es preferente una maltopentaosa sulfatada con un conector Et5 (Compuesto ID 10) para una union mas elevada, mientras que para la Eotaxina-1 es preferente una maltopentaosa sulfatada con un conector Et4 (Compuesto ID 9). Los datos de union a IL-4 sugieren que la longitud del conector tiene menos importancia siempre y cuando el conector no se haga demasiado largo, ya que habfa poca diferencia entre la maltopentaosa sulfatada con un

conector Et2 (Compuesto ID 7) y una maltopentaosa sulfatada con un conector Et4 (Compuesto ID 9), pero una maltopentaosa sulfatada con un conector Et5 presenta una reduccion de la capacidad de union. Por el contrario, parece que IL-5 necesita una maltopentaosa sulfatada con un conector Et4 (Compuesto ID 9) para una union mejor. Por lo tanto, la eficacia de los compuestos vana de acuerdo con su estructura subyacente y de acuerdo con la 5 protema implicada en la union a heparina y no es evidente antes de identificar de forma sistematica cual de los conjugados de oligosacarido anionico sera mas eficaz.

Estos datos tambien indican que los conjugados de oligosacarido anionico se unen a IL-4 en el sitio en el que se une la heparina y que la union de los conjugados de oligosacarido anionico a esta region es mas estable que la de la 10 union a heparina. Estos datos indican del mismo modo que los conjugados de oligosacarido anionico se unen a IL-5 en el sitio en el que se une la heparina y que su union a esta region es mas estable que la de la union a heparina.

Tabla 1: Capacidad de diversos conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la union de quimioquinas a ________________heparina inmovilizada sobre una superficie de biosensor de BIAcore________________

% de inhibicion de la union de quimioquina a chip de heparina

Eotaxina-1 Eotaxina-2 IL-8 MCP-1

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

1

Maltotriosa Et1

2

Maltotriosa Et2

3

Maltotriosa Et3

4

Maltotriosa Et4

5

Maltotriosa Et5 166,7 30,0

6

Maltopentaosa Et1

7

Maltopentaosa Et2 108 16,7 19 5,6

8

Maltopentaosa Et3

9

Maltopentaosa Et4 71,4 15 14,6 6,4

10

Maltopentaosa Et5 107,1 9,2 7,3 2,4

11

Maltotetraosa Et1

12

Maltotetraosa Et2 > 200 33,3 116,7 7,5

13

Maltotetraosa Et3 187,5

14

Maltotetraosa Et4 125,0

15

Maltotetraosa Et5 66,7 > 200

15

66

Quitotetraosa Et1

67

Quitotetraosa Et2 > 200 > 200 > 200 > 200

68

Quitotetraosa Et3

69

Quitotetraosa Et5

70

Quitopentaosa Et1 > 200

71

Quitopentaosa Et2

72

Quitopentaosa Et3

73

Quitopentaosa Et4

74

Quitopentaosa Et5

75

Xilotetraosa Et1 > 200 83,3 82,5

76

Xilotetraosa Et2

77

Xilotetraosa Et3 166,7

78

Xilotetraosa Et4

79

Xilotetraosa Et5 166,7

% de inhibicion de la union de quimioquina a chip de heparina

Eotaxina-1 Eotaxina-2 IL-8 MCP-1

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

80

Xilopentaosa Et1 > 200 125 > 200 61,9

81

Xilopentaosa Et2

82

Xilopentaosa Et3 > 200 > 200 75

83

Xilopentaosa Et4

84

Xilopentaosa Et5 125 > 200 84,4

Heparina 100 100 100 100

Los datos de conjugado de oligosacarido anionico se expresan como un % con respecto a la concentracion de heparina necesaria para inhibir la union de quimioquina en un 50 %. El porcentaje se establece como un 100 % para la heparina. Los valores inferiores a un 100% indican que los conjugados de oligosacarido anionico son mejores que la heparina para la union a la quimioquina y bloqueando su union a la heparina en el chip. Por el contrario, los valores superiores a un 100 % indican que los inhibidores son peores que la heparina para bloquear las quimioquinas a partir de la union a heparina en el chip.

Tabla 2: Capacidad de diversos conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la union de IL-4 e IL-5 a heparina ______________________inmovilizada sobre una superficie de biosensor de BIAcore______________________

Union de IL-4 a chip de heparina Union de IL-5 a chip de heparina

% de union de IL-4* CI50, nM % de union de IL-5* CI50, nM

ID

Oligosacarido persulfatado Conector Criterio de valoracion de heparina Biotina- heparina Criterio de valoracion de heparina Criterio de valoracion de heparina Biotina- heparina Biotina- heparina

1

Maltotriosa Et1 31 %

2

Maltotriosa Et2 33 % 12000 > 20000

3

Maltotriosa Et3 39 %

4

Maltotriosa Et4 38 %

5

Maltotriosa Et5 37 %

6

Maltopentaosa Et1 0 %

7

Maltopentaosa Et2 0 % 33 350

8

Maltopentaosa Et3 0 % 200

9

Maltopentaosa Et4 25 50

10

Maltopentaosa Et5 0 % 120

11

Maltotetraosa Et1 0 %

12

Maltotetraosa Et2 0 % 800

13

Maltotetraosa Et3 5 %

14

Maltotetraosa Et4 23 %

15

Maltotetraosa Et5 0 %

66

Quitotetraosa Et1 62 % 30 % 95 % 89 %

67

Quitotetraosa Et2 13 % 4 % 1250 4 % 3 % 950

68

Quitotetraosa Et3 99 % 68 % 99 % 98 %

69

Quitotetraosa Et5 83 % 54 % 92 % 89 %

70

Quitopentaosa Et1 100 % 60 % 97 % 95 %

71

Quitopentaosa Et2 88 % 48 % 95 % 90 %

5

10

15

20

25

30

35

Union de IL-4 a chip de heparina Union de IL-5 a chip de heparina

% de union de IL-4* CI50, nM % de union de IL-5* CI50, nM

ID

Oligosacarido persulfatado Conector Criterio de valoracion de heparina Biotina- heparina Criterio de valoracion de heparina Criterio de valoracion de heparina Biotina- heparina Biotina- heparina

72

Quitopentaosa Et3 100 % 69 % 100 % 98 %

73

Quitopentaosa Et4 100 % 72 % 100 % 99 %

74

Quitopentaosa Et5 83 % 46 % 93 % 89 %

75

Xilotetraosa Et1 30 % 11 % 2500 73 % 60 %

76

Xilotetraosa Et2 54 % 27 % 95 % 90 %

77

Xilotetraosa Et3 50 % 23 % 94 % 87 %

78

Xilotetraosa Et4 57 % 30 % 92 % 87 %

79

Xilotetraosa Et5 56 % 30 % 94 % 90 %

80

Xilopentaosa Et1 25 % 8 % 1450 67 % 52 % 1000

81

Xilopentaosa Et2 33 % 13 % 77 % 65 %

82

Xilopentaosa Et3 31 % 12 % 2000 79 % 67 %

83

Xilopentaosa Et4 32 % 13 % 83 % 72 %

84

Xilopentaosa Et5 26 % 10 % 2500 70 % 58 %

Heparina 3300 37

Se muestran los datos para dos metodos de inmovilizacion de heparina: Biotina-heparina = etiquetado con biotina de grupos amino; Criterio de valoracion de heparina = biotinilacion de extremos reductores. *El % de union de citoquina en presencia de los diversos conjugados de oligosacarido anionico con respecto a nivel de union obtenida en ausencia de conjugado de oligosacarido anionico se calculo con una concentracion de conjugado de oligosacarido anionico de 5 pM para ID 1-15; 8 pM para ID 66-74 y 10 pM para ID 75-84.

Ejemplo 11

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico con respecto a la diana de protema de asma y rinitis alergica, IL-5

Los diversos conjugados de oligosacarido anionico inhibfan la proliferacion de una lmea celular sensible a IL-5 en grados diferentes. Esto se produce a dosis muy bajas y no se debe a un efecto toxico del conjugado de oligosacarido anionico, ya que otros polisacaridos sulfatados del mismo modo no tienen efecto en este ensayo. Estos experimentos se realizan con las celulas sensibles a IL-5, Ba/F-IL-5. Las celulas Ba/F-IL-5 se obtuvieron a partir de la lmea celular Ba/F3.

La lmea celular Ba/F3 se transformo para que fuera tanto dependiente de IL-5 como para expresar a luciferasa por cotransfeccion de las celulas con el vector de control pGL3 (Promega, USA) y pEE6hcmv-IL-5Ra. El vector de control, pGL3, expresa una luciferasa modificada bajo el control directo del promotor y potenciador SV40, pero no contiene marcador seleccionable. Para preparar pEE6hcmv-hIL-5Ra, se clono una cadena a de receptor de IL-5 humana de longitud completa (hIL-5R-a) mediante RT PCR a partir de celulas HL60. La preparacion de las celulas Ba/F-IL-5 ha sido descrita por Coombe et al, Journal of Immunological Methods 215: 145-150, 1998. Las celulas Ba/F-IL-5 se pueden modificar adicionalmente por cotransfeccion con PPGK-puromicina-luciferasa, un vector que contiene luciferasa bajo el control del promotor SV40 con el marcador seleccionable puromicina.

Despues de la transfeccion, los transfectantes positivos se seleccionan en 3 pg/ml de puromicina. Los transfectantes positivos se clonan a continuacion para producir una lmea con expresion de luciferasa detectable. Los ensayos de proliferacion se llevan a cabo en microplacas de 96 pocillos adecuadas para los ensayos de este tipo (Falcon). Los pocillos son de fondo plano, con lados blancos y un fondo transparente. Las celulas se lavan para retirar cualquier citoquina en el medio de crecimiento y a continuacion se vuelven a suspender en RPMI/FCS al 5% en p/v. El recuento de las celulas se realiza con un Analizador de Recuento y Tamano de Partmulas Coulter Z2 (Coulter Electronics, Inglaterra) y de forma rutinaria se anaden 1,6 x 104 celulas a pocillos de microplacas que no contienen ni IL-5 (control negativo) o diversas diluciones de IL-5. Cuando se va a medir el efecto de los conjugados de oligosacarido anionico, o de otros polisacaridos sulfatados, los pocillos tambien contienen diversas concentraciones de estas moleculas.

Las celulas proliferan durante 24 horas a 37 °C en una atmosfera humidificada, tras lo cual la actividad de luciferasa se mide mediante la adicion de 50 pl de tampon de sustrato de luciferasa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, MgSO4 15 mM, DTT 33,3 mM, EDTA 0,1 mM, Na-luciferina 0,5 mM, ATP 0,5 mM, litio Co A 0,25 mM y Triton X-100 al 0,5 % en v/v). Inmediatamente despues de la adicion del tampon de luciferasa la placa se somete a ensayo para determinar la 5 actividad de luciferasa. Las emisiones de luz se detectan en un aparato de recuento de Multiples etiquetas Victor 1420 (Wallac, Turku, Finlandia). Usando este ensayo se ha demostrado que algunos de los conjugados de oligosacarido anionico son inhibidores muy eficaces de la proliferacion de celulas Ba/F-IL-5 dependiente de IL-5 mientras que otros son menos eficaces (Tabla 3).

10 Parece que el componente sacarido del conjugado de oligosacarido anionico es importante para la actividad. Parece que es importante tanto el tamano del oligosacarido como la composicion subyacente. Los pentasacaridos unidos son inhibidores mas eficaces que los tetrasacaridos unidos y de los pentasacaridos unidos la serie de maltosa sulfatada unida era la mas eficaz pero los pentasacaridos de xilano sulfatados unidos tambien presentaban una actividad considerable, en particular a 10 pg/ml. En este ensayo no parece que la longitud del conector sea tan 15 importante aunque posiblemente son preferentes los conectores Et4 y Et5. Por lo tanto, las mejores de la serie de maltopentaosa sulfatada unida eran las ID 7 -10 y las mejores de la serie de xilopentaosa sulfatada unida eran ID 83 y 84, con la serie de quitosano sulfatado unido teniendo poca actividad.

Tabla 3: La capacidad de los conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la proliferacion celular dependiente 20 de IL-5

% de Inhibicion de la proliferacion de celulas Ba/F-IL-5 estimulada por IL-5

Conjugado de oligosacarido anionico (1 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (10 pg/ml)

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

1

Maltotriosa Et1 0 39,6 ± 7,6

2

Maltotriosa Et2 0 45,2 ± 7,6

3

Maltotriosa Et3 1 ± 0,2 31,1 ± 4,9

4

Maltotriosa Et4 1,1 ± 0,2 30,7 ±4,5

5

Maltotriosa Et5 7,1 ± 1,3 26,4 ± 3,3

6

Maltopentaosa Et1 52,3 ±6,8 63,5 ± 7,1

7

Maltopentaosa Et2 41,5± 3,7 59,5 ± 7,4

8

Maltopentaosa Et3 49,9 ± 5 62,3 ± 9,5

9

Maltopentaosa Et4 45,3 ±6,5 62,7 ± 8,8

10

Maltopentaosa Et5 51,2± 5,2 59,7 ±4,4

11

Maltotetraosa Et1 15,1 ± 1,8 53,8 ±6,3

12

Maltotetraosa Et2 8,4 ± 1,1 46,1 ± 4,4

13

Maltotetraosa Et3 4,7 ± 0,4 40 ± 5,1

14

Maltotetraosa Et4 9,0 ± 1 39,8 ±2,9

15

Maltotetraosa Et5 6,2 ± 1,1 46,3 ± 7,5

66

Quitotetraosa Et1 8,6 ± 1 16,1 ± 2,1

67

Quitotetraosa Et2 8,2 ± 1,1 28,8 ±4,8

68

Quitotetraosa Et3 0 23,7 ±4,5

69

Quitotetraosa Et5 15,9 ±2,4 33,8 ± 5,0

70

Quitopentaosa Et1 12,6 ± 1,4 31,5 ± 3,2

71

Quitopentaosa Et2 13,4 ± 1,4 29,8 ±4,9

72

Quitopentaosa Et3 7,8 ± 0,9 22,0 ± 3,3

73

Quitopentaosa Et4 17,3 ± 1,9 34,4 ± 5,3

74

Quitopentaosa Et5 22,4 ±4,4 34 ± 3,4

5

10

15

20

25

30

35

40

% de Inhibicion de la proliferacion de celulas Ba/F-IL-5 estimulada por IL-5

Conjugado de oligosacarido anionico (1 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (10 pg/ml)

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

75

Xilotetraosa Et1 0 27,9 ± 3,5

76

Xilotetraosa Et2 5,2 ± 0,5 33,1 ± 3,4

77

Xilotetraosa Et3 2,7 ± 0,2 37,2 ±2,4

78

Xilotetraosa Et4 6,4 ± 0,6 35,3 ±2,0

79

Xilotetraosa Et5 8,8 ± 0,8 30,3 ± 1,6

80

Xilopentaosa Et1 16,9 ± 1,3 54,7 ±4,7

81

Xilopentaosa Et2 14,7 ± 1,2 57,1 ± 8,4

82

Xilopentaosa Et3 14,4 ± 1,8 53,5 ± 5,9

83

Xilopentaosa Et4 20,6 ± 1,9 57,1 ± 6,7

84

Xilopentaosa Et5 21,1 ± 2 57,7 ±6,2

Ejemplo 12

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico con respecto a la protema diana de asma, IL-4

Los diversos conjugados de oligosacarido anionico inhibfan la proliferacion de una lmea de celulas sensibles a IL-4 en grados diferentes. Esto se produce a dosis muy bajas y no se debe a un efecto toxico del conjugado de oligosacarido anionico porque otros, polisacaridos sulfatados del mismo modo, en las mismas concentraciones de IL-4 y polisacarido no tienen efecto. Estos experimented utilizan las celulas TF-1.8. Las celulas TF-1.8 son un subclon de las celulas TF-1 que se han seleccionado para su crecimiento en IL-4 o IL-5. Las celulas TF-1 se establecieron originalmente a partir de una muestra de medula osea de un macho con pantocitopenia severa. Estas celulas son dependientes de IL-3 o GM-CSF para crecimiento a largo plazo y son sensibles a una diversidad de citoquinas incluyendo IL-4.

Las celulas TF-1.8 se transfectaron con el gen de luciferasa de luciernaga contenido en el vector de expresion, pPGK-puromicina-luciferasa (Coombe et al, 1998, mencionado anteriormente). Los transfectantes positivos se clonan para producir una lmea con buena expresion de luciferasa. Los ensayos de proliferacion se llevan a cabo en microplacas de 96 pocillos adecuadas para los ensayos de este tipo (Falcon). Los pocillos son de fondo plano, con lados blancos y un fondo transparente. Las celulas se lavan para retirar cualquier citoquina en el medio de crecimiento y a continuacion se vuelven a suspender en RPMI/FCS al 5% en p/v. El recuento de las celulas se realiza con un Analizador de Recuento y Tamano de Partteulas Coulter Z2 (Coulter Electronics, Inglaterra) y de forma rutinaria se anaden 2,5 x 104 celulas a pocillos de microplacas que no contienen ni IL-4 (control negativo) o diversas diluciones de IL-4. Cuando se va a medir el efecto de los conjugados de oligosacarido anionico, o de otros polisacaridos sulfatados, los pocillos tambien contienen diversas concentraciones de estas moleculas.

Las celulas proliferan durante 48 horas a 37 °C en una atmosfera humidificada, tras lo cual la actividad de luciferasa se mide mediante la adicion de 50 pl de tampon de sustrato de luciferasa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, MgSO4 15 mM, DTT 33,3 mM, EDTA 0,1 mM, Na-luciferina 0,5 mM, ATP 0,5 mM, 0,25 mM litio Co A y Triton X-100 al 0,5 % en v/v). Inmediatamente despues de la adicion del tampon de luciferasa la placa se somete a ensayo para determinar la actividad de luciferasa. Las emisiones de luz se detectan en un aparato de recuento de Multiples etiquetas Victor 1420 (Wallac, Turku, Finlandia).

Usando este ensayo, los inventores demostraron que algunos conjugados de oligosacarido anionico inhibfan de forma muy notable la proliferacion de celulas TF-1.8 dependiente de IL-4 mientras que otros eran menos activos (Tabla 4).

Parece que el componente sacarido del conjugado de oligosacarido anionico es importante para la actividad. Parece que es importante tanto el tamano del oligosacarido como la composicion subyacente. Los pentasacaridos unidos son inhibidores mas eficaces que los tetrasacaridos unidos y de los pentasacaridos unidos la serie de maltosa sulfatada unida era la mas eficaz pero los pentasacaridos de xilano sulfatados unidos tambien presentaban una actividad considerable. De forma interesante algunos de los conectores de conjugados de oligosacarido anionico de maltotetraosa sulfatada unida con conectores pequenos (Et1 y Et2) presentaban una actividad similar a la de las maltopentaosas sulfatadas unidas, pero las maltotetraosas sulfatadas unidas con conectores mas largos

presentaban una reduccion de la actividad. Por lo tanto, parece que es preferente una presentacion continua de restos sulfatados en una estructura principal de maltosa en lugar de grupos de restos sulfatados presentados en una estructura principal de maltosa separada por una region no sacarida, sulfatada. Los conjugados de oligosacarido anionico con la mejor actividad fueron los que presentan las ID del Compuesto 6-10. De la serie de xilano unido 5 sulfatado, las estructuras de pentasacarido unido eran mas activas que los tetrasacaridos unidos y en el equilibrio de estos pentasacaridos sulfatados unidos eran preferentes las que presentaban un conector de tamano Et2 y Et3.

Tabla 4: La capacidad de los conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la proliferacion celular dependiente

de IL-4

% de Inhibicion de la proliferacion de celulas TF1.8 estimulada por IL-4

Conjugado de oligosacarido anionico (2,5 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (5 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (10 pg/ml)

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

1

Maltotriosa Et1 0 34,4 ± 1,2

2

Maltotriosa Et2 24,9 ± 1,7 27,1 ± 3,4

3

Maltotriosa Et3 0 22,6 ± 1,8

4

Maltotriosa Et4 0 12 ± 0,7

5

Maltotriosa Et5 22,8 ± 7,2 10,3 ± 12,7

6

Maltopentaosa Et1 59 ± 6,6 74,5 ± 8,5 82,8 ± 0,8

7

Maltopentaosa Et2 37,8 ±4,1 92,9 ± 16,7 90,5 ± 1,6

8

Maltopentaosa Et3 44,9 ± 7,7 58,7 ± 11,8

9

Maltopentaosa Et4 45,2 ± 3,4 59,3 ± 1,1 84,1 ± 0,8

10

Maltopentaosa Et5 46,5 ±2,4 57,9 ± 8,9 81,9 ± 1,9

11

Maltotetraosa Et1 40,3 ± 7,4 65,6 ± 3,3

12

Maltotetraosa Et2 38,1 ± 3,3 63,3 ± 3,2 67,5 ± 0,6

13

Maltotetraosa Et3 23,4 ± 3,7 44,4 ± 3

14

Maltotetraosa Et4 18,2 ±6,4 42,0 ± 5,1

15

Maltotetraosa Et5 32,7 ± 3,9 41,4 ± 5,4

66

Quitotetraosa Et1 5,7 ± 11,9 23,2 ± 3

67

Quitotetraosa Et2 0 34,4 ±2,4

68

Quitotetraosa Et3 0 27,1 ± 6,6

69

Quitotetraosa Et5 13,9 ± 4,8 29 ± 4,8

70

Quitopentaosa Et1 23 ± 11,2 25,1 ± 2,1

71

Quitopentaosa Et2 21,5 ± 2,8 30,1 ± 4,8

72

Quitopentaosa Et3 9,1 ± 3,8 29,2 ±2,7

73

Quitopentaosa Et4 11,8 ± 7,2 28,5 ±4,1

74

Quitopentaosa Et5 4,4 ± 1,1 34,2 ±2,3

75

Xilotetraosa Et1 24,9 ± 5,1 41,3 ± 1

76

Xilotetraosa Et2 19,1 ± 1,6 43,4 ± 5,1

77

Xilotetraosa Et3 25,7 ± 8,2 50,4 ± 3,1

78

Xilotetraosa Et4 26,7 ± 5,6 36,3 ± 3,6

79

Xilotetraosa Et5 21,3 ± 2,7 39,6 ±4,1

80

Xilopentaosa Et1 32,7 ±2,8 56,6 ± 3,2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

% de Inhibicion de la proliferacion de celulas TF1.8 estimulada por IL-4

Conjugado de oligosacarido anionico (2,5 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (5 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (10 pg/ml)

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

81

Xilopentaosa Et2 32,3 ±4,8 59,2 ± 3,1

82

Xilopentaosa Et3 29,2 ±4 40,3 ± 3 58,4 ±2,4

83

Xilopentaosa Et4 38,2 ± 7,3 42,5 ±4 53,6 ±4,3

84

Xilopentaosa Et5 30,9 ± 3,1 32,6 ±4,8 52,8 ± 3,5

Ejemplo 13

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico con respecto a dianas de proliferacion celular GM-CSF e IL-2

Las celulas TF-1.8 se obtuvieron a partir de las celulas TF-1 que responden al GM-CSF humano (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos). Las celulas TF-1.8 manteman su capacidad de respuesta a GM-CSF. De forma rutinaria, se anaden 2,5 x 104 celulas a pocillos de microplacas que no contienen ni GM-CSF (control negativo) o diversas diluciones de GM-CSF. Las celulas se cultivan durante 48 horas a 37 °C en una atmosfera humidificada, tras lo cual la actividad de luciferasa se mide mediante la adicion de 50 pl de tampon de sustrato de luciferasa (Tris- HCl 50 mM, pH 7,8, MgSO4 15 mM, DTT 33,3 mM, EDTA 0,1 mM, Na-luciferina 0,5 mM, ATP 0,5 mM, 0,25 mM litio Co A y Triton X-100 al 0,5 % en v/v). Inmediatamente despues de la adicion del tampon de luciferasa la placa se somete a ensayo para determinar la actividad de luciferasa. Las emisiones de luz se detectan en un aparato de recuento de Multiples etiquetas Victor 1420 (Wallac, Turku, Finlandia). Cuando se va a medir el efecto de los conjugados de oligosacarido anionico, o de otros polisacaridos sulfatados, los pocillos tambien contienen diversas concentraciones de estas moleculas asf como del GM-CSF. Estos experimentos indicaban que las concentraciones de 10 pg/ml y 1 pg/ml de los conjugados de oligosacarido anionico de forma reproducible no tienen efecto en la proliferacion de las celulas TF-1.8 obtenidas con 0,025 ng/ml de GM-CSF (Tabla 5).

La lmea de linfocitos T citotoxicos de murino (CTLL) es un subclon de linfocitos T obtenidos a partir de un raton C57b1/6. Las celulas necesitan interleuquina-2 (IL-2) para su crecimiento y se usan para someter a ensayo su presencia en medios acondicionados. Las celulas son sensibles a IL-2 tanto de murino como humana. Las celulas CTLL se transfectaron con el gen de luciferasa de luciernaga contenido en el vector de expresion, pPGK-puromicina- luciferasa (Coombe et al, 1998, mencionado anteriormente). Los transfectantes positivos se clonan para producir una lmea con buena expresion de luciferasa y estas celulas se denominan CTL-Luc. Los ensayos de proliferacion se llevan a cabo en microplacas de 96 pocillos adecuadas para los ensayos de este tipo (Falcon). Los pocillos son de fondo plano, con lados blancos y un fondo transparente. Las celulas se lavan para retirar cualquier citoquina en el medio de crecimiento y a continuacion se vuelven a suspender en RPMI/FCS al 5% en p/v. El recuento de las celulas se realiza con un Analizador de Recuento y Tamano de Partmulas Coulter Z2 (Coulter Electronics, Inglaterra) y de forma rutinaria se anaden 1,6 x104 celulas a pocillos de microplacas que no contienen ni IL-2 humana recombinante (rhIL-2) (control negativo) o diversas diluciones de rhIL-2. Cuando se va a medir el efecto de los conjugados de oligosacarido anionico, o de otros polisacaridos sulfatados, los pocillos tambien contienen diversas concentraciones de estas moleculas.

Las celulas CTL-Luc proliferan durante 24 horas a 37 °C en una atmosfera humidificada, tras lo cual la actividad de luciferasa se mide mediante la adicion de 50 pl de tampon de sustrato de luciferasa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, MgSO4 15 mM, DTT 33,3 mM, EDTA 0,1 mM, Na-luciferina 0,5 mM, ATP 0,5 mM, 0,25 mM litio Co A y Triton X-100 al 0,5 % en v/v). Inmediatamente despues de la adicion del tampon de luciferasa la placa se somete a ensayo para determinar la actividad de luciferasa. Las emisiones de luz se detectan en un aparato de recuento de Multiples etiquetas Victor 1420 (Wallac, Turku, Finlandia). Los experimentos en los que las celulas CTL-Luc se cultivan en presencia de cualquiera de 10 pg/ml o 1 pg/ml de conjugados de oligosacarido anionico de forma reproducible no tienen efecto en la proliferacion de las celulas CTL-Luc obtenidas con 1,25 ng/ml de rhIL-2. (Tabla 5). Los resultados de estos experimentos con las lmeas celulares sensibles a IL-2 y GM-CSF sugieren que ninguno de los conjugados de oligosacarido anionico sometidos a ensayo interactuan con estas citoquina de una manera que influya en su actividad proliferativa. Los resultados de estos experimentos tambien sugieren que los conjugados de oligosacarido anionico sometidos a ensayo no son toxicos para las lmeas de celulas linfocfticas dependientes de citoquina. Estos ejemplos muestran que aunque los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion sometidos a ensayo se unen una citoquinas, esto no invoca necesariamente ningun potencial terapeutico para los conjugados de oligosacarido anionico sometidos a ensayo. Por el contrario, la union a las protemas diana que se describen en los otros ejemplos significa que los conjugados de oligosacarido anionico de la presente invencion tienen un potencial terapeutico.

Tabla 5: La capacidad de los diversos conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la proliferacion celular ________________________dependiente de GM-CSF humano o IL-2 humano________________________

% de Inhibicion de la proliferacion de celulas estimulada por citoquinas

10 pg/ml de GM-CSF (celulas TF1.8) 10 pg/ml de IL-2 (celulas CTL-luc)

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

5

Maltotriosa Et5

6

Maltopentaosa Et1 -5,7 ± 1,4 -0,1 ± 4,2

7

Maltopentaosa Et2 -6,7 ±6 -0,2 ±6,4

8

Maltopentaosa Et3 8,7 ± 3,5 -1,7 ±4,4

9

Maltopentaosa Et4 3,6 ± 1,7 1,3 ± 2,5

10

Maltopentaosa Et5 -1,9 ± 2 0,4 ± 5,8

15

Maltotetraosa Et5

69

Quitotetraosa Et5

70

Quitopentaosa Et1 -10,9 ± 7,5

71

Quitopentaosa Et2 -2,4 ±6,1

72

Quitopentaosa Et3 -2 ± 5,5

73

Quitopentaosa Et4 -11,8 ± 5,8

74

Quitopentaosa Et5 -9,1 ± 1,1

75

Xilotetraosa Et1

79

Xilotetraosa Et5

80

Xilopentaosa Et1 5,2 ±6,8

81

Xilopentaosa Et2 7,4 ± 10,3

82

Xilopentaosa Et3 -0,4 ± 0,1

83

Xilopentaosa Et4 -2,2 ±2,6

84

Xilopentaosa Et5 0,3 ± 5,2

La estimulacion ligera aparente de la proliferacion celular se indica con un valor negativo.

Ejemplo 14 5

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico con respecto a la protema diana de EPOC, elastasa leucocitaria humana.

La elastasa es una protema que es una diana potencial para el tratamiento de la EPOC. Los ensayos de elastasa se 10 realizaron en microplacas de plastico de 96 pocillos para una facil cuantificacion con el lector de placas fluorescente. La elastasa leucocitaria humana (5 nM/pocillo) se incubo en presencia o ausencia de polisacaridos sulfatados, con el sustrato fluorogenico MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-amido-metilcumarina (20 pM/pocillo) en un tampon de fosfato sodico, pH 7,4. La mezcla se incubo a 37 °C durante 60 minutos antes de detener la reaccion mediante la adicion de 10 pl/pocillo de acido acetico 250 nM y la mezcla se transfirio a una microplacas de 96 pocillos midiendo la 15 fluorescencia usando una longitud de onda de excitacion de 355 nm y una longitud de onda de emision de 460 nm. Se usaron diversas concentraciones de inhibidores para permitir el calculo de la concentracion de conjugado de oligosacarido anionico necesaria para inhibir la actividad enzimatica en un 50 % (CI50). Estos datos indicaban que los diferentes conjugados de oligosacarido anionico inhibfan la actividad de elastasa en grados diferentes, pero la estructura que comprendfa la quitopentaosa sulfatada unida por los conectores Et de diversos tamanos era la mas 20 eficaz con una CI50 en este ensayo de aproximadamente entre 32 - 70 nM, con las estructuras que comprenden los conectores Et1 y Et2 mas pequenos teniendo la mejor actividad. Por lo tanto, la quitopentaosa sulfatada unida a Et1 la quitopentaosa sulfatada unida a Et2 presentaban una CI50 de 32 y 34 nM. La mejor de las maltopentaosas sulfatadas unidas era la ID 10 con una CI50 de 48 nM. Las series de xilopentaosa unida no eran inhibidores muy

eficaces de la actividad de elastasa. En este ensayo la heparina tiene una CI50 de aproximadamente 200 nM (Tabla 6).

Tabla 6: La capacidad de los diversos conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la actividad de la elastasa 5 leucocitaria humana

Inhibicion de la actividad de Elastasa

CI50 nM

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

1

Maltotriosa Et1 2200

2

Maltotriosa Et2

3

Maltotriosa Et3 667

4

Maltotriosa Et4

5

Maltotriosa Et5

6

Maltopentaosa Et1

7

Maltopentaosa Et2 100

8

Maltopentaosa Et3 222

9

Maltopentaosa Et4 223

10

Maltopentaosa Et5 48

11

Maltotetraosa Et1 480

12

Maltotetraosa Et2 500

13

Maltotetraosa Et3 520

14

Maltotetraosa Et4 1100

15

Maltotetraosa Et5 1250

66

Quitotetraosa Et1 140

67

Quitotetraosa Et2

68

Quitotetraosa Et3 240

69

Quitotetraosa Et5 180

70

Quitopentaosa Et1 32

71

Quitopentaosa Et2 34

72

Quitopentaosa Et3 70

73

Quitopentaosa Et4 55

74

Quitopentaosa Et5 70

75

Xilotetraosa Et1 290

76

Xilotetraosa Et2 460

77

Xilotetraosa Et3 540

78

Xilotetraosa Et4 450

79

Xilotetraosa Et5 280

80

Xilopentaosa Et1 480

81

Xilopentaosa Et2 470

82

Xilopentaosa Et3 410

83

Xilopentaosa Et4 420

84

Xilopentaosa Et5 300

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplo 15

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico con respecto a quimioquinas implicadas en inflamacion asociada con EPOC.

Las quimioquinas conocidas por desempenar un papel importante en la mediacion de la inflamacion asociada con EPOC incluyen IL-8, MCP-1 y MIP-1a (Barnes 2004, mencionado anteriormente). Se mostro que diversos conjugados de oligosacarido anionico bloqueaban la migracion celular desencadenada por IL-8. Estos experimented se realizaron usando HL-60 promielodticas humanas tratadas con DMSO. Estas celulas se obtuvieron a partir de un paciente con leucemia promielodtica aguda. Las celulas se trataron con DMSO (1,2 %) durante 4 dfas antes de su uso en los experimentos. Los ensayos de quimiotaxis se realizaron en placas para quimiotaxis Costar de 96 pocillos que constaban de una camara inferior a la que se anadio la IL-8 humana (+/- inhibidor) y a continuacion las celulas en RPMI y FCS al 1 % en v/v se anadieron a una camara superior y la placa se incubo a 37 °C durante 1 hora para permitir que las celulas se movieran desde la camara superior en la parte inferior. El numero de celulas que migran en la camara inferior se cuantifico mediante etiquetado con AQUEOUS ONE (20 pl/pocillo) durante 1,75 horas antes de leer la absorbancia a 490 nm. La IL-8 se uso a una concentracion final de 20 ng/ml y los diversos inhibidores de conjugado de oligosacarido anionico se usaron a cualquiera de 10 o 50 pg/ml, los datos de % de inhibicion se muestran para 50 pg/ml (Tabla 7).

Para examinar si los diversos conjugados de oligosacarido anionico eran inhibidores eficaces de la quimioquina MCP-1, se uso la lmea de celulas monodticas humanas THP-1. Estas celulas se obtuvieron originalmente a partir de la sangre periferica de un paciente con leucemia monodtica aguda. El ensayo era muy similar al que se ha descrito anteriormente, excepto porque las celulas se colocaron en suero bovino fetal al 1 % durante 20 horas antes de comenzar el ensayo. Los ensayos de quimiotaxis se realizaron en placas para quimiotaxis Costar de 96 pocillos y MCP-1 humano (+/- inhibidor) se anadio a la camara inferior y las celulas THP-1 en RPMI/FCS al 1 % se anadieron a la camara superior y la placa se incubo a 37 °C durante 2,5 horas para permitir que las celulas se movieran desde la camara superior en la parte inferior. El numero de celulas que migran en la camara inferior se cuantifico mediante etiquetado con AQUEOUS ONE (30 pl/pocillo) durante 3,5 horas antes de leer la absorbancia a 490 nm. MCP-1 se uso a una concentracion final de 10 ng/ml y los diversos inhibidores de conjugado de oligosacarido anionico se usaron a cualquiera de 10 o 50 pg/ml; los datos de % de inhibicion se muestran para 50 pg/ml (Tabla 7).

Las celulas U937 tratadas con DMSO se usaron para examinar la migracion celular como respuesta a MIP-1a. Las celulas U937 son una lmea de celulas humanas promonodticas obtenidas a partir de la efusion pleural de un paciente con linfoma histiodtico. Estas celulas se trataron con DMSO (1,2 %) durante 4 dfas antes de su uso en los experimentos de quimiotaxis. Los ensayos de quimiotaxis se realizaron en placas para quimiotaxis Costar de 96 pocillos y MIP-1a humano (+/- inhibidor) se anadio a la camara inferior y las celulas U937 tratadas con DMSO en RPMI/HEPES se anadieron a la camara superior y la placa se incubo a 37 °C durante 1,5 horas para permitir que las celulas se movieran desde la camara superior en la parte inferior. El numero de celulas que migran en la camara inferior se cuantifico mediante etiquetado con AQUEOUS ONE (30 pl/pocillo) durante 1 hora antes de leer la absorbancia a 490 nm. MIP-1a se uso a una concentracion final de 40 ng/ml y los diversos inhibidores de conjugado de oligosacarido anionico se usaron a 10 y 50 pg/ml; los datos de % de inhibicion se muestran para 50 pg/ml (Tabla 7). Los datos indican que una serie diferente de conjugados de oligosacarido anionico inhibe cada una de las quimioquinas sometidas a ensayo y a priori no era evidente que conjugados de oligosacarido anionico podnan bloquear la funcion de quimioquina. MCP-1 ex la quimioquina cuya funcion se bloquea de la mejor manera por los conjugados de oligosacarido anionico y las series de maltopentaosa sulfatada unida son particularmente eficaces en este sentido. Parece que el tamano del conector es menos importante que la longitud del oligosacarido en el conjugado, ya que tanto una maltotriosa sulfatada unida como diversas maltotetraosas sulfatadas unidas son inhibidores menos eficaces que el conjugado de oligosacarido anionico equivalente para el que el oligosacarido es una maltopentaosa sulfatada. Otros conjugados de oligosacarido anionico que muestran una buena actividad inhibitoria son los xilanos sulfatados unidos estan formados por un conector corto (Et1). Aqrn parece que lo que se necesita para la actividad es una presentacion continua de sulfatos en la estructura principal de xilano sin una falta de estiramiento en el sulfato, por lo tanto el tamano de cada oligosacarido individual en el conjugado es de menor importancia.

A diferencia de la situacion con MCP-1, IL-8 no se inhibe en grado alguno por la serie de maltosa sulfatada unida, pero se bloquea con conjugados de oligosacarido anionico de la serie de xilano sulfatado unido (Tabla 7). Al igual que con la situacion para MCP-1, esos xilanos sulfatados unidos formados por un conector corto (Et1) son los inhibidores mas eficaces de la actividad de IL-8. Por lo tanto, una presentacion continua de sulfatos en la estructura principal de xilano sin una falta de estiramiento en el sulfato es lo que se necesita para la actividad y el tamano de cada oligosacarido individual en el conjugado es de menor importancia.

Muy pocos de los conjugados de oligosacarido anionico inhidan la actividad funcional de MIP-1a y los que la inhidan lo hadan de forma muy debil. Los conjugados de oligosacarido anionico que eran los mas eficaces comprendfan las maltopentaosas sulfatadas unidas. Parece que la longitud del conector es de menor importancia que la longitud del oligosacarido (Tabla 7).

Tabla 7: La capacidad de los diversos conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la migracion celular inducida ______________________________por quimioquinas con un papel en EPOC______________________________

% de Inhibicion de la migracion celular estimulada por quimioquinas con 50 jg/ml de conjugados de oligosacarido anionico

MCP-1 IL-8 MIP-1a

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

5

Maltotriosa Et5 72,6 ± 1 52,3 ± 3,5 -10 ± 0,5

6

Maltopentaosa Et1

7

Maltopentaosa Et2 105 ± 3,4 32,9 ±2,3 23,5 ± 7,1

8

Maltopentaosa Et3

9

Maltopentaosa Et4 107,9 ±2,8 26,6 ±4,7 26,5 ±6,6

10

Maltopentaosa Et5 92,6 ± 0,3 26,6 ±4,7 26,1 ± 2,5

11

Maltotetraosa Et1

12

Maltotetraosa Et2

13

Maltotetraosa Et3 77,6 ± 1 36,7 ±6 -33 ±6,7

14

Maltotetraosa Et4 71,7 ± 4,2 23,9 ± 1,3 -6,8 ± 0,8

15

Maltotetraosa Et5 85,7 ± 1,7 30,2 ± 10,3

66

Quitotetraosa Et1

67

Quitotetraosa Et2 19,4 ± 0,4 26,2 ±6,1 -8,5 ± 11,1

68

Quitotetraosa Et3

69

Quitotetraosa Et5

70

Quitopentaosa Et1 14,1 ± 1,8 31 ± 1,3 5,9 ± 5,1

74

Quitopentaosa Et5

75

Xilotetraosa Et1 66,6 ± 1,6 89,6 ± 9,5 1,3 ± 2,2

79

Xilotetraosa Et5

80

Xilopentaosa Et1 62,4 ± 1,1 94,5± 11,8 -11,4 ± 6

81

Xilopentaosa Et2

82

Xilopentaosa Et3 57 ± 0,2 30,5 ±2,7 -31,2 ± 4,9

83

Xilopentaosa Et4

84

Xilopentaosa Et5 57,5 ± 1,7 52,2 ± 3,7 -38,2 ± 1,1

La estimulacion ligera aparente de la migracion celular se indica con un valor negativo.

Ejemplo 16 5

Analisis funcionales de dos conjugados de oligosacarido anionico con respecto a la inhibicion de infiltracion leucocitaria en un modelo animal de rinitis alergica

Se uso un modelo de rinitis alergica en cobayas. Los cobayas se sensibilizan a la ovoalbumina (OVA) dos veces (los 10 dfas 0 y 7) con una inyeccion intraperitoneal de 0,5 ml de solucion salina que contiene 100 mg de Al(OH)3 y 2 |jg de OVA. Tres semanas despues de la ultima sensibilizacion, los animales se anestesian y la exposicion de la cavidad nasal al alergeno se realiza mediante goteo de la solucion de OVA a 20 mg/ml en cavidades nasales bilaterales. Para el control negativo los animales reciben sensibilizacion y estimulacion con solucion salina. Los animales se tratan previamente con cualquiera de vehteulo o farmaco (conjugados de oligosacarido anionico o budesonida) 30 15 min antes de la instilacion intranasal de OVA. El vehfculo o los farmacos se administran a 25 jl - 50 jl/fosa nasal. Se incluye una comparacion de los conjugados de oligosacarido anionico con budesonida, como el compuesto de referencia. Los animales se sacrifican y todos los parametros se miden ocho horas despues de la provocacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La permeabilidad de la barrera de la mucosa nasal se evalua midiendo la filtracion de plasma rico en protema y no tamizado en las cavidades nasales. La cantidad de plasma extravasado se indica como niveles de lavado nasal de protema o albumina total. El fluido de lavado nasal se recoge aclarando suavemente las cavidades nasales con solucion salina tamponada con fosfato. Las celulas en este fluido se centrifugan y se vuelven a suspender en solucion salina tamponada con fosfato y el recuento se hace usando un analizador de hematologfa semiautomatizado. La composicion celular del lavado nasal se determina despues de citocentrifugacion y tincion con May Grynwald Giemsa.

Los datos indican que los niveles de exudado de plasma a la cavidad nasal aumentaban de forma significativa 8 horas despues de la estimulacion intranasal con OVA. Los dos conjugados de oligosacarido anionicos redudan de forma significativa el contenido de protema del fluido de lavado nasal lo que indica una reduccion del exudado de plasma con este farmaco. La maltopentaosa sulfatada unida a Et2 (ID 7) y la maltopentaosa sulfatada unida a Et4 (ID 9) se sometieron a ensayo y de estas la primera era la mas eficaz; los % de inhibiciones obtenidas fueron respectivamente de un 91,4 % y un 51,5 % cuando se usaron a una concentracion de 5 mg/kg. Una evaluacion de la infiltracion de leucocitos en el fluido de lavado nasal indico un aumento del recuento de leucocitos con respecto al observado en animales sensibilizados con solucion salina, sin embargo los dos conjugados de oligosacarido anionico inhidan la infiltracion de leucocitos a la concentracion sometida a ensayo siendo uno mas eficaz que el otro (Figura 3). Los leucocitos mas marcados en el lavado nasal son eosinofilos con alguna evidencia de infiltracion de neutrofilos, los niveles de otros tipos celulares: basofilos, linfocitos, monocitos y celulas epiteliales nasales son bajos y no significativamente diferentes de los observados en animales sensibilizados con solucion salina. Los animales que reciben el corticosteroide budesonida presentaban una marcada disminucion de la exudacion plasmatica en el lavado nasal y tambien una marcada disminucion en los recuentos totales total de globulos blancos en el fluido de lavado nasal, siendo la disminucion mas pronunciada en los recuentos de eosinofilos. Del mismo modo los conjugados de oligosacarido anionico reduccion de forma notable el infiltrado celular en el fluido de lavado nasal. En particular uno de los conjugados de oligosacarido anionico, ID 9 (maltopentaosa unida a Et4) era particularmente eficaz para bloquear no solo la infiltracion de eosinofilos, sino tambien la infiltracion de neutrofilos, mientras que el otro conjugado de oligosacarido anionico con un conector mas corto (maltopentaosa unida a Et2, ID 7) se comportaba del mismo modo que el corticosteroide y solamente los eosinofilos bloqueados (Figura 3).

Ejemplo 17

Analisis funcional de un conjugado de oligosacarido anionico en un modelo animal de asma

Se uso un modelo de asma en cobayas. En este modelo los cobayas (9-10 por grupo) se sensibilizaron a la OVA mediante dos inyecciones intraperitoneales de 0,5 ml de solucion salina que contema 20 mg de Al(OH)3 y 20 |jg de OVA. Las sensibilizaciones se realizan los dfas 0 y 7. Tres semanas despues de la ultima sensibilizacion, los animales se trataron previamente con cualquiera de vehnculo o farmacos 30 min antes de la inhalacion de OVA (a 10 mg/ml) durante 6 min (estimulacion con alergeno). Para el control negativo, los animales recibieron cualquiera de sensibilizacion y estimulacion con solucion salina o sensibilizacion con solucion salina y estimulacion con OVA. Los animales se sacrificaron y todos los parametros se midieron 8 horas despues de la provocacion. El vehnculo o farmacos se administraron por via intratraqueal, 1 ml/kg de peso corporal, 30 min antes de la estimulacion intratraqueal con OVA. El vehnculo para los farmacos (conjugados de oligosacarido anionico y budesonida) era solucion salina. La budesonida como el compuesto de referencia se disolvio en el vehnculo a concentraciones de 1 mg/ml. Para medir la resistencia de las vfas respiratorias (Rl.) y el cumplimiento pulmonar (Cdin) se evoco broncoconstriccion con metacolina aerosolizada (3 mg/ml, 10 mg/ml y 30 mg/ml). La diferencia entre las lecturas de referencia y la obtenida despues de la metacolina se usaron para calcular Cdin y Rl. El lavado broncoalveolar (BAL) se realizo inmediatamente despues de las mediciones de la funcion pulmonar. El BAL se analizo para contenido de protema (como medida de filtracion) y recuento de leucocitos, y se realizaron recuentos celulares diferenciales para indicar a que subconjuntos de leucocitos afectaban mejor los farmacos.

Las mediciones de la funcion pulmonar (Tabla 8) indican claramente que el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 (maltopentaosa sulfatada unida a Et4) inhida el desarrollo tanto de Cdin como de Rl. El conjugado de oligosacarido anionico ID 9 a la concentracion mas elevada restableda Cdin y Rl cerca de la observada con el control negativo, y hay evidencia de una respuesta a la dosis para el conjugado de oligosacarido anionico ID 9. La eficacia del conjugado de oligosacarido anionico era al menos la del compuesto de referencia, el corticosteroide budesonida (ignorando la budesonida 2,5 mg/kg 10 MCh, ya que un animal de este grupo dio una lectura de 10 veces, lo que sesgada la media). Por lo tanto, el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 mostraba eficacia en las mediciones de la funcion pulmonar en este modelo de cobayas incluso cuando se usaba a concentraciones bajas.

Tabla 8: Sumario de Hiperreactividad de las Vfas Respiratorias (AHR) - Datos de AHR expresados como % de inhibicion a partir de los del control positivo para Rl y % de aumento a partir de los del control positivo para Cdin

Compuesto

Rl Cdin

MCh (10 mg/ml) MCh (30 mg/ml) MCh (10 mg/ml) MCh (30 mg/ml)

Budesonida 0,1

86,5 %** 105 %** 97,2 %** 116,2 %**

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Compuesto

Rl Cdin

MCh (10 mg/ml) MCh (30 mg/ml) MCh (10 mg/ml) MCh (30 mg/ml)

mg/kg

Budesonida 2,5 mg/kg

-89,4 % 98,9 %** 19,7 % 70,9 %**

ID9 0,1 mg/kg

75,3 %* 84,4 %** 76,6 %** 90 %**

ID9 2,5 mg/kg

80,5 %** 99,5 %** 68,7 %* 128,4 %**

Los datos se muestran para dos concentraciones de metacolina diferentes, 10 mg/kg y 30 mg/kg. Los datos obtenidos con metacolina a 3 mg/kg no eran significativamente diferentes a los niveles de la medida inicial en ninguno de los grupos sometidos a ensayo incluyendo el control positivo. La Rl aumenta con una reaccion alergica mientras que la elasticidad o Cdin disminuye, por lo tanto los valores dados en la tabla son % de disminucion a partir del control positivo para Rl pero % de aumento a partir del control positivo para Cdin. * significativamente diferente a P < 0,01 * significativamente diferente a P < 0,05

El conjugado de oligosacarido anionico ID 9 inhibe de forma muy eficaz el contenido elevado de protema de BAL como resultado de filtracion de protema inducida por antigeno, incluso a 0,1 mg/kg (Figura 4). La eficacia del conjugado de oligosacarido anionico era comparable con la observada con budesonida. De forma analoga, el tratamiento previo con el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 o budesonida a 0,1 mg/kg inhibfa de forma significativa el influjo de leucocitos inducido por OVA (inhibicion de un 62 % y un 76 % respectivamente). El tratamiento previo con el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 a 2,5 mg/kg era mas eficaz para inhibir el influjo de leucocitos (inhibicion de un 85 %), mientras que la budesonida a 2,5 mg/kg no inhibfa de forma significativa el influjo de leucocitos (Figura 5). Un recuento celular diferencial de los leucocitos en el BAL revelaba que el recuento de eosinofilos era significativamente mas elevado en animales sensibilizados y estimulados con OVA en comparacion con los animales de control negativo y que los eosinofilos eran principalmente el tipo celular que se inhibfa (Figura 6). Tanto la budesonida como el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 inhibfan de forma significativa el influjo de eosinofilos, con efectos inhibitorio dos entre un 80 % y un 90 %. No se observaban diferencias significativas en el recuento de neutrofilos entre los controles positivo y negativo y no se observaba diferencia cuando se trataban previamente con cualquiera de los farmacos. De forma analoga, no se observaban diferencias significativas en el recuento de basofilos entre los controles positivo y negativo y no se observa diferencia cuando se trataban previamente con cualquiera de los farmacos (los datos no se muestran). El recuento de macrofagos en el fluido de BAL era significativamente mas elevado en animales sensibilizados y estimulados con OVA en comparacion con los animales de control negativo. El tratamiento previo con los farmacos no reducfa de forma significativa el nivel de macrofagos aunque algunos de los tratamientos tendfan a producir una reduccion de los niveles (los datos no se muestran).

En conclusion, a las concentraciones sometidas a ensayo, el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 era la menos eficaz para inhibir (1) el contenido de protema del BAL, (2) hiperreactividad de las vfas respiratorias, y (3) los leucocitos, y en particular el influjo de eosinofilos en el BAL, como el corticosteroide de referencia, budesonida, en este modelo de asma alergica en cobayas.

Ejemplo 18

Analisis funcional de un conjugado de oligosacarido anionico en un modelo animal de EPOC

Se uso un modelo de enfisema en raton. La exposicion aguda o cronica de los ratones al humo de cigarrillo conduce a respuestas pulmonares que imitan en parte los cambios inflamatorios y estructurales observados en la EPOC. En este modelo, los ratones C57B1/6J machos se someten a exposicion al humo aguda o cronica, con el aire de la habitacion normal siendo la situacion de control. En el estudio agudo, los ratones se expusieron a cualquiera de aire normal o al humo de cinco cigarrillos (aproximadamente 12 mg de alquitran y 0,9 mg de nicotina) durante 20 minutos. En el estudio cronico, los ratones se expusieron a cualquiera de aire normal o al humo de tres cigarrillos/dfa durante 5 dfas/semana durante 6 meses. Los 4 grupos de ratones a continuacion se dividieron adicionalmente de modo que los ratones dentro de cada grupo tambien recibieron diversos conjugados de oligosacarido anionico a traves de una via inhalada.

En los grupos de ratones de exposicion aguda, los conjugados de oligosacarido anionico se administraron 30 minutos antes de la exposicion al humo del cigarrillo. La evaluacion de la eficacia del farmaco para ratones en los grupos de exposicion aguda implicaban una evaluacion de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox del fluido de lavado broncoalveolar (BALF) al final de la exposicion al humo. El BALF se examino para citoquinas y quimioquinas que estan asociadas con una respuesta inflamatoria. Los niveles de estos agentes se determinaron a las 4 horas despues de la exposicion y a las 24 horas despues de la exposicion al humo del cigarrillo. Se midio una gama de citoquinas y quimioquinas. Estas inclman: IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, RANTES,

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MIP-1a, quimioatractor de neutrofilos inducido por citoquina (KC), TNF-a e IFN-y). Tambien se determino un recuento celular diferencial de las celulas en el BALF. Los resultados de este estudio indicaban que un conjugado de oligosacarido anionico (ID 9) disminma el infiltrado celular en BALF de animales expuestos al humo de cigarrillo, en particular los recuentos de neutrofilos se vefan atenuados de forma significativa en esos animales expuestos al humo de cigarrillo y que tambien recibieron el conjugado de oligosacarido anionico.

Los animales en el estudio cronico recibieron los conjugados de oligosacarido anionico (incluyendo ID 9) una vez al dfa durante el periodo de duracion del experimento. Al finalizar el experimento, los animales se sacrificaron y los pulmones se fijaron por via intratraqueal con formalina (5 %) y el volumen pulmonar se midio mediante desplazamiento de agua. El tejido pulmonar se preparo para histoqmmica e inmunohistoqmmica, siendo los tejidos pulmonares tenidos con hematoxilina-eosina y/o acido peryodico-Schiff o con anticuerpos con respecto al marcador de macrofagos Mac-3. Tambien se determino el nivel de desmosina en el tejido pulmonar. La desmosina es un imino acido espedfico de la elastina; la evaluacion de la desmosina en el pulmon se toma como un indicador del contenido de elastina pulmonar. Una disminucion en el contenido de desmosina es una evidencia de que los cambios enfisematosos estan asociados con la proteolisis y degradacion de la matriz. De forma colectiva los resultados de este estudio indicaban que los conjugados de oligosacarido anionico, y en particular ID 9, podfan actuar como agentes antiinflamatorios en este modelo de EPOC.

Ejemplo 19

Analisis funcional de un conjugado de oligosacarido anionico en un modelo animal de ARDS

Se uso un modelo de lesion pulmonar aguda en rata y ADRS (Jansson, Lung 182: 1-9, 2004). El modelo se basa en la comprension de que la endotoxina encontrada en agentes patogenos comunes (por ejemplo, bacterias) debe conducir al desarrollo de ARDS, shock septico y smdrome de disfuncion de multiples organos en la situacion clmica. El lipopolisacarido (LPS), un componente de la membrana externa de bacterias gram-negativas es el ejemplo prototfpico de que la endotoxina y la exposicion del tracto respiratorio de ratas a LPS se pueden usar como un modelo de inflamacion pulmonar aguda y ARDS. En este modelo de rata, el LPS causa un aumento de infiltracion de celulas inflamatorias, produccion de mediadores inflamatorios y edema tisular, todos los cuales son caractensticos de la inflamacion pulmonar aguda y de ARDS.

En este modelo, se anestesiaron ratas Wister hembras y el LPS se disolvio en solucion salina a un intervalo de concentraciones que inclrna 5, 50 y 500 pg/ml que se administro por via intratraqueal a un volumen de 1 ml/kg de peso corporal usando una canula modificada. Los animales recibieron el mismo volumen de solucion salina y manipulaciones como controles. Los animales se sacrificaron a las 4 y 8 horas despues de la administracion de LPS. Los animales que recibieron los conjugados de oligosacarido anionico se instigaron por via intratraqueal con los conjugados de oligosacarido anionico o con solucion salina 30 minutos antes de la administracion de LPS. Las concentraciones usadas fueron 0,5 mg/kg y 2,5 mg/kg.

El volumen de gas pulmonar extrafdo (ELGV) se mide con el principio de Arqmmedes y se basa en la cantidad estable de aire atrapado dentro de los pulmones extirpados a una presion transpulmonar de 0 cm de H2O. Los animales para las mediciones de ELGV se inyectaron por via intraperitoneal con 0,1-0,2 ml de pentobarbitona sodica (50 mg/kg). Despues de abrir el hecho y extraer el corazon, la traquea se expuso y se ligo con una sutura de 3-0. Los pulmones se extrajeron y el tejido no pulmonar se recordo con cuidado. Se usaron un kit de determinacion de la densidad (P3000, Mettler-Toledo GmbH, Suecia) y un software opcional de determinacion de la densidad para el equilibrio basandose en el principio de que cada cuerpo solido sumergido en lfquido pierde peso, y se expresa como g/cm3. El sistema se ajusto a cero para excluir la densidad del lfquido y para equilibrar los pesos del soporte, los pesos de los tejidos fuera del vaso de precipitados y la flotabilidad del tejido dentro del lfquido. El ELGV se determina mediante la diferencia entre el peso del soporte y la flotabilidad pulmonar en el lfquido. El edema del tejido pulmonar se indico por el aumento del peso pulmonar. La indicacion de edema del tejido pulmonar se calculo mediante la diferencia entre el peso del tejido pulmonar fuera del vaso de precipitados y el peso del soporte. La densidad del tejido pulmonar se determino mediante la proporcion del peso del pulmon (diferencia entre el peso del tejido pulmonar fuera del vaso de precipitados y el peso del soporte) y el volumen de aire dentro del pulmon (ELGV).

El fluido de BAL tambien se recogio. El pulmon izquierdo se lavo por via intratraqueal con dos inyecciones de 3 ml de PBS despues de la medicion del ELGV. El fluido de BAL, recogido en tubos de plastico sobre hielo, se centrifugo a 1.000 rpm, 4 °C durante 10 min. El sobrenadante se almaceno a -80 °C hasta su analisis posterior. El sedimento celular se volvio a suspender en PBS para hacer el recuento del mdice de leucocitos totales usando un analizador hematologico semiautomatico de 15 parametros (Sysmex F820, TOA Medical Electronics Co. Kobe, Japon). Se hizo el recuento de la diferenciacion celular con preparaciones de citocentrifugacion tenidas con May Grunwald Giemsa. Los niveles de IL-1p, IL-6, TNF-a IL-8 y MCP-1 en el fluido de BAL se determinaron usando kits de ensayo de inmunoadsorcion unidos a enzimas (ELISA).

En este modelo, en los animales de control positivo habfa claras evidencias de aumento de pesos pulmonar con aumento de la concentracion de LPS. Tambien hay evidencia de un reclutamiento rapido de neutrofilos seguido de la produccion y liberacion de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (IL-1p, IL-6, TNF-a IL-8 y MCP-1). En los

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animales a los que se les administran los conjugados de oligosacarido anionico, los pesos pulmonares se restablecieron con respecto a los de los controles negativos, el nivel de infiltracion de neutrofilos disminuyo de forma notable, al igual que la concentracion de los diversos mediadores inflamatorios. Aunque los niveles de los mediadores inflamatorios no se restablecieron totalmente con respecto a los del control negativo, la inhibicion de una infiltracion de neutrofilos por los conjugados de oligosacarido anionico y en particular por el conjugado de oligosacarido anionico ID 9 era notable. Es probable que el LPS activara los macrofagos residentes en la mucosa pulmonar y los alveolos haciendo que segregaran una proporcion de estos mediadores inflamatorios. Sin embargo, ya que los datos anteriores de los inventores indicaban que los conjugados de oligosacarido anionico son inhibidores efectivos de la actividad biologica de estos mediadores, es probable que el bloqueo de la actividad biologica de estas quimioquinas redujera la infiltracion de neutrofilos y la liberacion de mediadores adicionales por estas celulas. Ademas, los pesos de los pulmones cuando los animales se trataron con los conjugados de oligosacarido anionico indican que estos compuestos eran inhibidores muy eficaces del edema.

Ejemplo 20

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico en un modelo de anafilaxia animal Durante muchos anos la anafilaxia de cobayas sea considerado el ejemplo clasico de anafilaxia, a diferencia de otras especies (por ejemplo, ratones) que carecen completamente de respuestas anafilacticas despues de la inhalacion de alergenos. Se cree que el shock anafilactico se debe a la liberacion de histamina con posterior contraccion del musculo liso despues de la inhalacion del antfgeno en las vfas respiratorias y los pulmones. La contraccion de la musculatura bronquial cierra completamente los alveolos y evita la exhalacion del aire, y los animales mueren por asfixia. En cobayas, las dosis de alergenos que son lo suficientemente elevadas como para producir respuestas significativas en fase tardfa (es decir, eosinofilia celular, exudacion de fase tardfa) tambien dan lugar inevitablemente a fuertes reacciones agudas fuertes que son tan intensas que algunos animales pueden morir por una obstruccion aguda de vfas respiratorias.

En este modelo los cobayas se sensibilizaron a la ovoalbumina (OVA) dos veces (los dfas 0 y 7) mediante una inyeccion intraperitoneal de 0,5 ml de solucion salina que contema 100 mg de Al(OH)3 y 2 |jg de OVA. Tres semanas despues de la ultima sensibilizacion, los animales se anestesiaron y la exposicion de la cavidad nasal al alergeno se realizo goteo de la solucion de OVA a 2 mg/ml en cavidades nasales bilaterales (20 jl por cavidad nasal). Para el control negativo, los animales recibieron sensibilizacion y estimulacion con solucion salina. Los animales se trataron previamente con cualquiera de vehmulo o farmaco (conjugados de oligosacarido anionico o budesonida) 30 min antes de la instilacion intranasal de OVA. El vehmulo o farmacos se administran, 25 jl - 50 jl/fosa nasal. Se incluye una comparacion de los conjugados de oligosacarido anionico con budesonida, como el compuesto de referencia. En este estudio la budesonida a 0,65 mg/kg no era eficaz para prevenir la anafilaxia ya que un 70 % de los animales en este grupo murieron por la obstruccion aguda de las vfas respiratorias. Por el contrario, el conjugado de oligosacarido anionico, iD 9, cuando se usaba a 5 mg/kg era dos veces tan eficaz como la budesonida (a 0,65 mg/kg) para inhibir la anafilaxia ya que murio solamente un 35 % de los animales (3/8); del mismo modo, el conjugado de oligosacarido anionico, ID 7, cuando se usa a 5 mg/kg tambien inhibfa a la anafilaxia ya que solamente murio un 27 % de los animales (3/11), mientras que con la budesonida murio un 70 % (7/10) de los animales.

Tambien se uso un modelo de anafilaxia de raton. Como antfgeno se uso cacahuete entero recien molido. Los ratones se sensibilizaron por medio de sonda intragastrica con 5 mg (equivalente a 1 mg de protema de cacahuete) o 25 mg (equivalente a 5 mg de protema de cacahuete) por raton de cacahuete entero molido junto con 10 jg por raton de toxina del colera en el dfa 0 y de nuevo en el dfa 7. Tres semanas despues de la sensibilizacion inicial, los ratones se mantuvieron en ayunas durante una noche y se estimularon con sonda intragastrica con extracto de cacahuete crudo de 10 mg por raton en dos dosis a intervalos de 30 a 40 minutos. Los ratones que sobrevivieron a la primera estimulacion se volvieron a estimular a la semana 5. Los farmacos (conjugados de oligosacarido anionico) disueltos en PBS se administraron mediante inyeccion intravenosa en la vena de la cola 15 min antes de la segunda estimulacion. Los ratones sensibilizados de forma simulada con toxina del colera y los ratones sin estimulacion previa se estimularon de la misma manera. Para controlar las respuestas de los anticuerpos IgE en suero, la sangre de la vena de la cola se extrajo a intervalos semanales despues de la sensibilizacion inicial. Los niveles de IgE espedfica de cacahuete se midieron usando ELISA. Los smtomas anafilacticos se evaluaron de 30 a 40 minutos despues de la segunda dosis de estimulacion usando el siguiente sistema de puntuacion: 0, sin smtomas; 1, rascado y frotamiento alrededor de la nariz y la cabeza; 2, hinchazon alrededor de los ojos y boca, diarrea, columna erecta, actividad reducida, y/o disminucion de la actividad con aumento de la frecuencia respiratoria; 3, sibilancias, respiracion dificultosa, y cianosis alrededor de la boca y la cola; 4, ninguna actividad despues de estfmulo o temblor y convulsion; 5, muerte. Para determinar los niveles de histamina en plasma, la sangre se extrajo 30 minutos despues de la segunda estimulacion mediante sonda intragastrica. Los niveles de histamina se determinaron usando un kit de inmunoensayo enzimatico. La desgranulacion de los mastocitos durante la anafilaxia sistemica se evaluo mediante el examen de muestras de ofdo recogidas inmediatamente despues de la muerte anafilactica o 40 minutos despues de la estimulacion de ratones supervivientes. Los tejidos se fijaron en formalina al 10 % tamponada neutra, y las secciones de parafina se tineron con azul de toluidina o tincion de Giemsa. Un mastocito desgranulado se definio como una celula positiva para azul de toluidina o Giemsa con 5 o mas granulos claramente tenidos completamente fuera de la celula. La gravedad de la respuesta anafilactica se inhibfa de forma significativa mediante la administracion de los medicamentos conjugados de oligosacaridos anionicos, evaluados por el sistema de

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puntuacion de los smtomas, a pesar de los niveles de IgE espedfica de cacahuete, lo que indica que los animales eran alergicos al alergeno del cacahuete. Ademas, los niveles de histamina eran menores en los animales que recidan los farmacos de conjugado de oligosacarido anionico, lo que sugiere que estos farmacos neutralizan la histamina.

Tambien se uso un modelo porcino de anafilaxia no alergica (es decir, no media la por IgE y anteriormente denominada shock anafilactoide). La anafilaxia no alergica se produce cuando los mastocitos y los basofilos se activan directamente mediante un metodo que no requiere reticulacion de la membrana de FceRI (El-Shanawany et al., Clin. Exp. Immunol. 153: 1-9, 2008). De forma experimental esto se puede inducir mediante el ionoforo de calcio intravenoso A23187 (Heflin et al., Ann. Emergency Med. 48: 190-193, 2006). Este ionoforo de calcio se conoce porque desencadena la desgranulacion rapida de mastocitos y basofilos in vitro. En este modelo, los cerdos recibieron una inyeccion intravenosa de A23187 (5 mg/kg). Los animales se sedaron y a continuacion se anestesiaron y se colocaron lmeas arteriales para permitir el control de la presion arterial media y para flebotoirna. Inicialmente, antes de la inyeccion, se midieron la presion arterial basal y el pulso y se extrajo una muestra de sangre para obtener niveles basales de histamina y triptasa. La presencia de hipotension y enrojecimiento cutaneo se tomaron como los determinantes clmicos del shock y esto se produjo aproximadamente 1 minuto despues de la inyeccion. Al inicio del shock (> 20 % de disminucion en la presion sangumea arterial media) los animales recibieron cualquiera de solucion salina oral intravenosa (40 ml/kg), difenhidramina intravenosa (1 mg/kg) mas epinefrina (0,01 mg/kg), o los farmacos de conjugado de oligosacarido anionico ID 9 o ID 7. La reversion del shock se superviso y se determino el tiempo necesario para volver a una medida basal. Los niveles de histamina y triptasa se determinaron usando un metodo de ELISA. Los datos indicaban que los niveles de histamina y triptasa aumentan de forma significativa despues de la inyeccion de A23187 y la presion arterial media bajaba de forma notable. El tratamiento con los farmacos de conjugado de oligosacarido anionico aumentaba la presion sangumea arterial de una manera muy similar a la de la terapia convencional con difenhidramina y epinefrina y en todos estos grupos de tratamiento se mantuvo la reversion del shock anafilactico.

Ejemplo 21

Analisis funcionales de conjugados de oligosacarido anionico respecto a la protema diana de asma, IL-13.

Los diversos conjugados de oligosacarido anionico inhidan la proliferacion de una lmea de celulas sensibles a IL-13 en grados diferentes. Esto se produce a dosis muy bajas y se cree que no se debe a un efecto toxico del conjugado de oligosacarido anionico porque otros, polisacaridos sulfatados del mismo modo, en las mismas concentraciones de IL-13 y polisacarido no tienen efecto. Estos experimentos utilizan las celulas TF-1 que se cultivan en GM-CSF. Las celulas TF-1 se establecieron originalmente a partir de una muestra de medula osea de un macho con pantocitopenia severa. Estas celulas son dependientes de IL-3 o GM-CSF para crecimiento a largo plazo y son sensibles a una diversidad de citoquinas incluyendo IL-13.

En resumen, los ensayos de proliferacion se realizaron en microplacas de 96 pocillos adecuadas para los ensayos de este tipo. Las celulas se lavaron para retirar cualquier citoquina en el medio de crecimiento y a continuacion se volvieron a suspender en RPMI/FCS al 5 % en p/v y de forma rutinaria se anadieron 2,5 x 104 celulas a los pocillos la microplaca que no conteman ni IL-13 (control negativo) o diversas diluciones de IL-13. Cuando se midio el efecto de los xilanos sulfatados con diferentes tamanos, los pocillos estan en conteman diversas concentraciones de estas moleculas y la concentracion de IL-13 se mantuvo constante a 2,5 ng/ml. Las celulas proliferaron durante 48 horas, tras lo cual el numero de celulas presentes se cuantifico mediante tincion con 20 pl por pocillo del colorante AQUEOUS ONE durante 3 horas y a continuacion la absorbancia se leyo a 490 nm.

Parece que el componente sacarido del conjugado de oligosacarido anionico es importante para la actividad. Parece que es importante tanto el tamano del oligosacarido como la composicion subyacente. Los pentasacaridos unidos son inhibidores mas eficaces que los tetrasacaridos unidos y, de los pentasacaridos unidos, la serie de maltosa sulfatada unida era la mas eficaz pero los pentasacaridos de xilano sulfatados unidos tambien presentaban una cierta actividad. Todos los conjugados de la serie de quitosano presentaban una baja actividad lo que indica que esta estructura principal no es eficaz para la construccion de conjugados ammicos que inhiban a IL-13. De forma interesante, un conjugado de oligosacarido anionico de maltotetraosa sulfatada unida con el conector mas pequeno (Et1) presentaban una actividad similar a la de la maltopentaosa sulfatada unida con un conector Et1, pero las maltotetraosas sulfatadas unidas con conectores mas largos presentaban una reduccion de la actividad. Por lo tanto, parece que los tetrasacaridos sulfatados estrechamente relacionados de la serie de maltosa son suficientes para la actividad, pero los trisacaridos estrechamente relacionados presentaban poca actividad. El mejor conjugado de oligosacarido anionico era el de la serie de maltosa con un conector Et4 lo que sugiere que son preferentes grupos de restos sulfatados presentados en una estructura principal de pentasacarido de maltosa separada por una region no sacarida, no sulfatada.

Tabla 9: La capacidad de los conjugados de oligosacarido anionico para inhibir la proliferacion celular dependiente

de IL-13

% de Inhibicion de la proliferacion de celulas TF1 estimulada por IL-13

Conjugado de oligosacarido anionico (2,5 pg/ml) Conjugado de oligosacarido anionico (10 pg/ml)

ID

Oligosacarido persulfatado Conector

1

Maltotriosa Et1 29 ± 2,2 43,8 ±4,2

2

Maltotriosa Et2

3

Maltotriosa Et3 26 ± 3,5 26,4 ± 9,5

4

Maltotriosa Et4 31,5 ± 4,9 46 ± 1,9

5

Maltotriosa Et5 25,5 ± 1,9 45,4 ±6,2

6

Maltopentaosa Et1 48,1 ± 8,7 105 ± 3,4

7

Maltopentaosa Et2 39,8 ±4,5 88,7 ± 1

8

Maltopentaosa Et3 44,2 ±4,6 89 ± 2,1

9

Maltopentaosa Et4 49,6 ±6,4 94,1 ± 3,7

10

Maltopentaosa Et5 47,7 ± 0,9 83 ± 1,2

11

Maltotetraosa Et1 52,5 ± 1,6 80,7 ± 3

12

Maltotetraosa Et2 29,6 ± 5,8 63,1 ± 4,6

13

Maltotetraosa Et3 39,5 ± 1,9 37,4 ± 9,5

14

Maltotetraosa Et4 32 ± 7 52,9 ± 5,5

15

Maltotetraosa Et5

66

Quitotetraosa Et1 11,9 ± 6,1 31,4 ± 0,8

67

Quitotetraosa Et2 4,8 ± 1,8 29 ± 6,8

68

Quitotetraosa Et3 -4,3 ±4,8 83 ± 14,6

69

Quitotetraosa Et5 4,3 ± 7,8 25,7 ± 9,9

70

Quitopentaosa Et1 4,7 ± 7,2 34,7 ± 17,5

71

Quitopentaosa Et2 4 ± 3,3 22 ± 2,2

72

Quitopentaosa Et3 7 ± 4,4 20,6 ± 3,5

73

Quitopentaosa Et4 83 ± 1,8 25 ± 7

74

Quitopentaosa Et5 5,6 ± 3,2 20,5 ±6,1

75

Xilotetraosa Et1 35,8 ±4,2 61,1 ± 2,2

76

Xilotetraosa Et2 30,5 ±2,7 56,5 ± 8,2

77

Xilotetraosa Et3 83 ± 1,8 55 ± 2,5

78

Xilotetraosa Et4 38,2 ±2,3 53,2 ± 0,8

79

Xilotetraosa Et5 22,9 ±4,1 41,1 ± 5,8

80

Xilopentaosa Et1 42,8 ± 3 61,3 ± 5

81

Xilopentaosa Et2 89,6 ± 9,5 89,6 ± 9,5

82

Xilopentaosa Et3 32,5 ±4,2 65,7 ±2,6

83

Xilopentaosa Et4 37,2 ± 0,8 105 ± 3,4

84

Xilopentaosa Et5 35,8 ± 7,7 69,8 ± 3,8

A traves de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen a continuacion, a menos que el 5 contexto lo requiera de otro modo, se entendera que el termino "comprender", y variaciones tales como "comprende"

y "que comprende", implica la inclusion de un numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas indicados pero no la exclusion de cualquier otro numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas.

En la presente memoria descriptiva la referencia a cualquier publicacion anterior (o informacion obtenida a partir de 5 la misma), o a cualquier materia que se conozca, no se debe, y no se debena tomar como un conocimiento o admision o cualquier forma de sugerencia de que la publicacion anterior (o informacion obtenida a partir de la misma) o materia conocida forma parte del conocimiento general comun en el campo del conocimiento al que se refiere la presente memoria descriptiva.

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

   imagen1

   en la que:

   51 y S2 cada uno representa independientemente un resto de un oligosacarido persulfatado anionico; xi representa un numero entero de 1 a 4;

   X2 representa un numero entero de 0 a 11;

   X3 representa un numero entero de 0 a 10;

   X4 representa 0 o 1; y

   X5 representa un numero entero de 1 a 4,

   en el que dicho resto es la parte de dicho oligosacarido persulfatado anionico que permanece en dicho conjugado cuando dicho oligosacarido persulfatado anionico se une al resto de dicho conjugado y en el que S1 y S2 estan unidos de forma covalente al resto del conjugado mediante la union de cada uno de dichos oligosacaridos persulfatados anionicos al resto del conjugado a traves de sus extremos reductores.
2. 2. El conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que X1 y/o X5 son 1 o 2, y/o X5 son
3. 2. y/o en el que X2 representa un numero entero de 0 a 4, y/o en el que X3 representa un numero entero de 2 a 6, y/o en la que X4 es 1.
4. 3. El conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 en el que X1 y/o X5 son 2.
5. 4. El conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que X3 es 2.
6. 5. El conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que S1 y

   52 se seleccionan independientemente entre un resto de maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, xilotetraosa, xilopentaosa, quitotetraosa y quitopentaosa persulfatadas.
7. 6. El conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con la reivindicacion 1 en la que dicho conjugado se selecciona entre:

   i) maltotriosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5,

   ii) maltopentaosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5,

   iii) maltotetraosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5,

   iv) quitotetraosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5,

   v) quitopentaosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5,

   vi) xilotetraosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5 y

   vii) xilopentaosa persulfatada unida a Et1, Et2, Et3, Et4 o Et5,

   en el que los conectores Et1, Et2, Et3, Et4 y Et5 tienen la estructura:

   imagen2

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   imagen3
8. 7. Un metodo para preparar un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

   imagen4

   de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el metodo las etapas de:

   a) transformar cada uno de los oligosacaridos en oligosacaridos persulfatados anionicos; y

   b) conjugar los oligosacaridos;

   en el que las etapas a) y b) se pueden realizar en cualquier orden.
9. 8. El uso de un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

   imagen5

   de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparacion de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de un trastorno respiratorio inflamatorio.
10. 9. El conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

    imagen6

    de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la prevencion y/o tratamiento de un trastorno respiratorio inflamatorio.
11. 10. El uso de acuerdo con la reivindicacion 8 o el oligosacarido anionico de la reivindicacion 9 en los que el trastorno respiratorio inflamatorio se selecciona entre anafilaxia, asma, enfermedad respiratoria alergica, rinitis alergica, fibrosis subepitelial en hiperreactividad de las vfas respiratorias, sinusitis cronica, rinitis alergica perenne, aspergilosis broncopulmonar alergica en pacientes con fibrosis qmstica, EPOC, ARDS/ALI, bronquitis eosinofflica, bronquiectasia, broncoespasmo, constriccion bronquial, hiperreactividad bronquial, hipertrofia bronquial e inflamacion bronquial.
12. 11. Una composicion farmaceutica que comprende un conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 junto con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40
13. 12. El uso de un conjugado de oligosacarido anionico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un ensayo o identificacion sistematica excluyendo el cuerpo humano y animal.
14. 13. Un ensayo o identificacion sistematica excluyendo el cuerpo humano y animal para determinar el efecto biologico de uno o mas conjugados de oligosacarido anionico, comprendiendo el ensayo las etapas de:

    a) poner en contacto un ligando o celula con uno o mas conjugados de oligosacarido anionico teniendo cada uno independientemente la siguiente formula (I):

    imagen7

    de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

    b) cuantificar un efecto del uno o mas conjugados de oligosacarido anionico en el ligando o celula.
15. 14. Metodo para modular la actividad de un ligando, excluyendo el cuerpo humano y animal, que comprende poner en contacto el ligando con un conjugado de oligosacarido anionico de formula (I):

    imagen8

    de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
16. 15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 14 en el que el ligando es un peptido, polipeptido, protema, carbohidrato, lfpido, glicoprotema o una molecula obtenida a partir de la identificacion sistematica de producto natural o a partir de una biblioteca qmmica, y/o en el que el ligando es una protema que se une a un glucosaminoglucano seleccionado entre heparina, sulfato de heparina, condroitina e hialuronano.
17. 16. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 14 o 15 en el que la protema se selecciona entre histamina, una citoquina, un interferon, un factor de crecimiento, una enzima, una quimioquina o un receptor soluble o unido a celula o virus.
18. 17. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 16 en el que la citoquina es una interleuquina seleccionada entre IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, o un miembro de la familia IL-17 incluyendo a IL-25, o en el que el interferon se selecciona entre a-interferon, p-interferon e Y-interferon, o en el que el factor de crecimiento se selecciona entre G-CSF, M-CSF, GM-CSF, BDNF, CNTF, EGF, EPO, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, LIF, MCP1, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, M-CSF, MIP1, MIP2, KC, NGF, NT 3, NT4, NT5, NT6, NT7, OSM, PBP, PBSF, PDGF, PECAM-1, PF4, RANTES, SCF, TGFa, TGFp1, TGFp2, TGFp3, TNFa, TNFp, TPO, VEGF, GH e insulina, o en el que la enzima se selecciona entre superoxido dismutasa, protema cationica eosinofflica, una triptasa (incluyendo p-triptasa), una quimasa, una elastasa, fosfolipasa A2 o prostaglandina endoperoxido, o en el que la quimioquina se selecciona entre eotaxina-1, eotaxina-2 o eotaxina-3, o en el que el receptor soluble o unido a celula o virus es un receptor de trifosfato de inositol.
19. 18. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en el que la modulacion es inhibicion.