CN102256990A

CN102256990A - 阴离子寡糖轭合物

Info

Publication number: CN102256990A
Application number: CN2009801488414A
Authority: CN
Inventors: W·C·克特; D·R·库姆
Original assignee: Glycan Biosciences Pty Ltd
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2029-10-02
Also published as: AU2009299119A1; US8597632B2; AU2009299119B2; ES2634454T3; US20110195025A1; EP2421878B1; CN102256990B; WO2010037180A1; EP2421878A1; EP2421878A4

Abstract

本发明涉及阴离子寡糖轭合物，其可用于模拟被称为葡糖胺聚糖(GAGs)的阴离子生物活性分子的结构和/或活性。

Description

阴离子寡糖轭合物

技术领域

本发明涉及阴离子寡糖轭合物，其可以用于模拟被称为葡糖胺聚糖(GAGs)的阴离子生物活性分子的结构和/或活性。本发明还涉及该阴离子寡糖轭合物用于探测GAGs的结合性质和研制新的改进生物活性的试剂的用途。本发明还涉及制备阴离子寡糖轭合物的方法。这种阴离子寡糖轭合物可以用于预防和/或治疗疾病特别是炎症呼吸疾病的。

背景技术

天然的和合成的阴离子基于糖的化合物一直被使用着，并被开发用作治疗。这样的化合物的一个公知例子为天然产物肝素，其已经在临床上作为抗凝剂使用超过80年。肝素经过两代的改进使得产物对靶点有更高的选择性和/或特异性。第一种为半合成方法，其生成表现出更高特异性功能的低分子量肝素。第二种方法包括合成的戊多糖，其对靶蛋白具有选择性。然而，合成方法包括大约40个化学步骤，这提高了与这些化合物合成相关的技术难度。

一种克服由肝素和更广义上的GAGs的合成所提出的挑战的方法，已经对准GAG模拟物。一种这样的模拟物为半合成的硫酸化天然同寡糖。然而，在从天然来源轻易获得的小尺寸寡糖与在许多生物系统中生成活性的更大的寡糖和多糖之间存在差异。尤其是，获得含有6个或者更多单糖的寡糖，同时保持结构多样性以及低成本是特别困难的。

仍然持续需要生产出显示更高程度选择性和/或特异性的GAG模拟物，并且其能通过简单、经济的方法生产。

发明内容

发明简述一方面，本发明提供式(Ⅰ)的阴离子寡糖轭合物：

其中：

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数。

本发明阴离子寡糖轭合物具有显著的结构多样性并能被简单和有效地制备。可以剪裁阴离子寡糖之间的典型的柔性连接子的长度来模拟和/或确定与特定分子靶点互相作用的GAGs部分之间的空间关系，并且从而相应地产生具有高度选择性和/或特异性的GAG模拟物。

在某些实施方案中，x₁和/或x₅是1或2，优选2。在某些实施方案中，x₂表示从0至4的整数。在某些实施方案中，x₃是从2至6的整数，优选2。在某些实施方案中，x₄是1。在某些实施方案中，S¹和S²独立选自麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、木四糖、木五糖、壳四糖和壳五糖，其各自包含至少一个阴离子取代基，例如硫酸盐或磷酸盐取代基。

另一方面，本发明提供制备式(Ⅰ)的阴离子寡糖的方法：

其中：

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数，

所述方法包括步骤：

a)将每个寡糖转化成阴离子寡糖；和

b)轭合寡糖；

其中步骤a)和b)可以以任一顺序进行。

另一方面，本发明提供式(Ⅰ)的阴离子寡糖在预防和/或治疗疾病，特别是炎症呼吸疾病中的用途：

其中

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数，

另一方面，本发明提供式(Ⅰ)的阴离子寡糖在分析或筛选中的用途：

其中

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数。

另一方面，本发明提供确定一个或多个阴离子寡糖轭合物的生物活性的分析或筛选，所述分析包括步骤：

a)用一个或多个独立地具有下式(Ⅰ)的阴离子寡糖接触配体、细胞或动物：

其中

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数，和

b)量化一个或多个阴离子寡糖轭合物在配体、细胞或动物上的效应。

另一方面，本发明提供调节配体活性的方法，其包括用式(Ⅰ)的阴离子寡糖接触配体：

其中

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数。

发明详述

本文使用的术语“阴离子”描述物质的净负电荷。可以理解特定的负性电荷物质可以具有一个或多个相关的正性电荷的平衡离子，或反之亦然。溶液中，负性电荷的物质可能从与在固相上相关的一个或多个正性电荷平衡离子分离。本文使用的术语“阴离子”用于描述这类物质的性质，并且不是具有一个或多个典型地给予复合物中性的平衡离子的完整复合物。可以理解某些官能团随着pH值的变化呈现负性、中性或正性。该物质是否是阴离子将由这些电荷的总数来决定。相应地，特定pH时，如果某物质具有1个正性电荷官能团和2个负性电荷官能团，那么该物质具有净负性电荷，并且是如本发明上下文中所使用的术语阴离子。在优选实施方案中本发明轭合物在pH5的水溶液中具有净负性电荷，在优选实施方案中，本发明的阴离子寡糖轭合物和一个或多个平衡离子之间形成的盐是药学上可接受的盐。

给予本发明轭合物阴离子性质的官能团的实例有：基于硫的基团，例如-SO₂OH、-OSO₂OH、-OSO₂H、-SO₂H和-OSO₂-；和基于磷的基团例如：-OPO₂OH、-OP(S)(OH)₂、-OP(O)(OR)₂、-OP(S)(OR)₂、-OP(O)OHR、-OP(S)OHR、-OP(O)OR₁R₂、-OP(S)OR₁R₂、-OP(S)(OH)(SH)和环磷酸盐。可以理解的是大量上述官能团易于去质子化并在例如pH为5的水溶液中成为阴离子。其他上述的官能团是中性的(例如-OSO₂-和-OP(O)(OR)₂)，并相应地可以用于与阴离子官能团联合以控制轭合物呈现的阴离子特征的程度。

优选的羟基阴离子衍生物包括硫酸根和磷酸根基团。特别地，可以理解的是在pH为5的水溶液中，硫酸根和磷酸根基团是本文定义的阴离子基团。

本文使用的术语寡糖指可以包含任意数目，例如从2至10个的单糖单元，通过α和/或β糖苷键连接的碳水化合物。例如寡糖可以包含2至6之间的单糖单元。

单糖例子是赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。

包含2或更多单糖的寡糖的例子是乳糖、蔗糖、直链淀粉、纤维寡糖、麦芽寡糖[例如麦芽糖、麦芽三糖(O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖)、麦芽四糖(O-α-D-吡喃葡萄糖基-{(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基}2-(1→4)-D-吡喃葡萄糖)和麦芽五糖(O-α-D-吡喃葡萄糖基-{(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基}3-(1→4)-D-吡喃葡萄糖)]、右旋寡糖、壳寡糖、木寡糖、甘露寡糖(例如通过甘露多糖包括酵母甘露多糖的水解产生的那些)和β1，3-葡寡糖。

本发明优选使用寡糖是麦芽寡糖(例如麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖))、壳寡糖(例如壳四糖和壳五糖)和木寡糖(例如木四糖和木五糖)。

一方面本发明提供式(Ⅰ)的阴离子寡糖轭合物：

其中

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数。

式(Ⅰ)的阴离子寡糖(S¹和S²)通过至少一个硫原子互相共价轭合，该硫原子构成阴离子寡糖之间的轭合物部分的部件，即本文提及的“连接子”。本发明的阴离子寡糖轭合物中，连接子部分可以同样认为是苷元部分。连接子可以影响阴离子寡糖轭合物的大小、柔韧性或刚性、亲水性和疏水性。因此，优选地选择连接子以最大化生物学效应。要模拟的GAG(或GAGs)和/或同类物之间的构效关系和/或关于配体-受体复合物的结构信息(例如，来自X-射线晶体学，NMR)的知识可能影响连接子的选择。通常连接子不与GAG受体相互作用。

优选轭合物可以下式表示：

其中S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖，x₁表示从1至4的整数，和x₅表示从1至4的整数；

其中S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖，x₁表示从1至4的整数，x₃表示0或从1至10的整数，和x₅表示从1至4的整数；和

其中S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖，x₁表示从1至4的整数，x₂表示0或从1至11的整数，和x₅表示从1至4的整数。

本发明特别优选的阴离子轭合物可以下式表示：

其中S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖，x₁和x₅等于2并且x₂表示0或从1至4的整数。

本发明一方面提供制备式(Ⅰ)的阴离子寡糖的方法：

其中：

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数，

所述方法包括步骤：

a)将各个寡糖转化成阴离子寡糖；和

b)轭合寡糖；

其中步骤a)和b)可以以任一顺序进行。

通过硫酸化和/或磷酸化一个或多个羟基将寡糖转化成阴离子寡糖的方法是本领域公知的，其包括选择性硫酸化任一伯羟基或仲羟基或氨基或其组合的方法。这种硫酸化和/或磷酸化可以是所有游离羟基的或是游离羟基的部分硫酸化和/或磷酸化。

同时本发明考虑在制备轭合物前和/或后将每个寡糖转化成阴离子寡糖，优选在生成轭合物前进行。这种优选的一个原因是有助于控制终产物的均匀性。

不希望受限于理论，确信通过连接较小的阴离子分子一起以形成较大的阴离子分子，可以达到对产物更好的控制和更好的均匀性。例如，每个残基含有3个“可硫酸化”基团的小分子寡糖(二糖至四糖)的硫酸化得以完成。另一方面，较大的寡糖的硫酸化是更为困难的过程，典型地得到未硫酸化类型的不均匀的混合物。确信在更大系统中，不均匀的程度似乎与硫酸基团的数目和密度有关，“可硫酸化”的基团越多，混合物越不均匀。作为例子，Arixtra

和硫酸麦芽五糖，两种五糖，前者含有8个硫酸根基团并容易得到纯的形式，而麦芽五糖，其有16个可硫酸化基团，得到的是混合物。进一步地，萃他丁A的硫酸化中，得到的硫酸化平均度是每亚单元(忽略还原终端)可能3的2.4个，这等于约22个硫酸根/分子。假定硫酸化是随机事件，并使用泊松分布计算设定硫酸数目的分子的分布，将显示混合物包含具有14个到27个硫酸根基团的分子。并且，除了过硫酸化分子，各种硫酸化类型具有非常多的可能的异构体-例如包含22个硫酸根基团的类型的异构体数目是81,000。可以看出，甚至中等长度的寡糖的硫酸化(九糖)可以产生复杂的混合物。

另一方面，相对过硫酸化的三糖，可能含有总数为9个“可硫酸化”基团的三糖的硫酸化产生98％纯的混合物。偶联2个这样的硫酸化的三糖一起产生96％纯的过硫酸化的十八糖(18个硫酸根基团)。进一步地，未硫酸化类型的可能的异构体的数目也被减少。

方案1显示可能采取的合成本发明阴离子寡糖轭合物的不同合成路线(路径A、B和C)。为清楚起见，省略了描述的寡糖的代表性己糖环上的取代型式。本领域技术人员将领会结构6至11中显示的质子化硫酸根基团代表本文使用的表达阴离子寡糖的例子，这归功于官能团在例如pH为5的水中易于去质子化的能力。如上文概述，从寡糖到阴离子寡糖的转化可以在寡糖的轭合前或后发生。在这方面，方案1显示优选的合成策略实例，其中寡糖的硫酸化发生在轭合之前。

可以使用方案1所示的方法达到轭合寡糖的步骤。典型地，将选择具有游离还原终端的寡糖。通过各个寡糖的还原终端的轭合可以发生在每个寡糖的还原终端初始胺化之后。通过将如此产生的葡基胺的胺基与一个或多个基于甘氨酸的部分的反应，可以提供结构9的活性中间体，例如用于与另一个官能化的寡糖偶联。两个有用的基于甘氨酸的部分是N-保护(例如Fmoc)甘氨酸和2-卤代乙酰基化合物例如2-氯乙酰氯或2-溴乙酰氯。两个衍生化寡糖部分的偶联通过含有至少一个硫原子的连接子进行。在方案1中，建筑块(Building Block)B代表二硫醇化合物。然而，可以理解的是，这样的连接子仅是代表性的，不能将式(Ⅱ)的轭合物排除在本发明范围外。可以在商业上获得的建筑块B的二硫醇与在说明书中用到的标识符一同给出如下：

本文使用的术语“轭合物”采取标准的定义并且特指两个寡糖的共价偶联。可以理解的是本文提及的结构(例如式(Ⅰ))中阴离子寡糖S¹和S²共价连接在轭合物的剩余部分。相应地将提倡S¹和S²是阴离子寡糖的单价残基。当单独考虑时，本领域技术人员将意识到是由于各个寡糖的部分的离去而典型地发生这种偶联。例如，方案1中描述的将寡糖化合物1转化成胺化合物2的胺化反应发生伴随着羟基从化合物1上的离去。但是本领域技术人员将常规地确认方案1中的化合物11的阴离子寡糖轭合物的己糖寡糖部分。同样地，本领域技术人员将常规地确认式(Ⅰ)中由S¹和S²表示的阴离子寡糖部分：

换言之，S¹和S²可以表示每个没有形成连接子部分的阴离子寡糖的残余部分。

已经发现本发明的连接子为复合阴离子寡糖轭合物的合成提供了便利的方法。特别地，连接子使本领域技术人员容易获得一系列具有不同长度和亲水性的阴离子寡糖轭合物。不希望受制于理论，相信硫的功能化的使用(例如在上述描述的二硫醇化合物中)使得复合阴离子寡糖轭合物的轭合没有不希望的副反应发生。轭合物合成的容易性允许本领域技术人员去研究连接子性质在本发明阴离子寡糖轭合物的GAGs模拟中可能起的作用。

本发明的阴离子寡糖轭合物的合成的典型的集中性质使得本领域技术人员能够相对简单地建立结构多样化合物的库。可以通过每个式(Ⅰ)的阴离子寡糖S¹和S²(可以相同或不同)的选择，以及连接子部分的长度和形式的选择引入结构多样性的程度。在某些实施方案中，这样组成的合成前体可以单独制备并以组合途径引入。例如仅使用3个阴离子寡糖和3个连接子部分，本领域技术人员可以容易地制备出多达27种不同的阴离子寡糖轭合物。

本发明提供制备大量结构多样阴离子寡糖的方法，其可以用于形成GAG模拟物库的基础。阴离子轭合物可以应用于涉及GAGs和一个或多个配体互相作用的疾病的治疗。本发明的阴离子寡糖轭合物有用于治疗炎症呼吸疾病，包括过敏症、哮喘、过敏性呼吸疾病、变应性鼻炎、气道高反应性中的上皮下纤维化、慢性窦炎、反复的变应性鼻炎、膀胱纤维化患者的过敏性支气管肺曲霉病、COPD、ARDS/ALI、嗜酸性支气管炎、支气管扩张、支气管痉挛、支气管收缩、支气管反应过度、支气管过度生长和支气管炎症。本文使用的术语“支气管痉挛”指患者呼吸管不自觉的痉挛。支气管收缩既是术语也是基于该应用目的时可与“支气管痉挛”互换的医学疾病。本文使用的术语“支气管炎症””指患者呼吸管的炎症。另外，过敏性症状，例如哮喘，可以由常见的感冒病毒特别是鼻病毒引起，而公开的化合物可以用于治疗例如感冒和流感以及来自鼻病毒和冠状病毒的上呼吸道通路的感染。支气管收缩也是过敏症的一种症状而公开的化合物可以用于治疗过敏症。

过敏症是一种严重的、发作迅速并可以致死的过敏性反应。威胁生命的上气道阻塞、支气管痉挛和/或低血压都是严重过敏症的特征。在美国每年约有100,000次发作，其中约1％导致了死亡，66％是新病例。大多数的病例可以找到具体的病因而约20％被认为是突发的。已经接受肾上腺素作为治疗的选择很多年，但其已经被描述没有充分使用而且不总是有效的(Golden，Curr.Opin.Allergy Clin.Immnunol.，7：331-336，2007)。医生偏向于用糖皮质激素和抗组胺剂进行治疗尽管它们在急性疾病中的有效性没有多少证据。抗组胺剂有助于组胺调节的病理过程，但对于由其他介质引起的是无效的，并且在阻止肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化过程中可能具有限的功效。类似抗组胺剂，糖皮质激素被建议在疾病治疗中发挥作用，尽管验证它们功效的临床实验证据很少，但是它们提示的用途是基于早期给予患有急性哮喘的患者糖皮质激素是有益的(El-Shanawany等，Clin.Exp.Immunol.153：1-9，2008)。在急性疾病过程中糖皮质激素是无效的，因为它们的作用需要蛋白质的合成从而延迟了它们的活性。

过敏症涉及肥大细胞和/嗜碱性粒细胞的活化。其最经常被昆虫毒液、食物、药物和过敏原免疫治疗注射引发，其通过涉及包括IgE和在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上对IgE有高亲和力受体的机理。响应过敏原暴露合成的IgE固定于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的IgE受体(FcεRI)。通过IgE的受体聚集引起细胞活化、预先形成的介质的释放(包括组胺、类胰蛋白酶(包括β-类胰蛋白酶))、羧肽酶A、TNF-α和胃促胰酶)以及立刻的高敏感度响应的引发。几分钟内胞吐释放预先形成的颗粒介质。包括前列腺素和白三烯以及血小板活化因子(PAF)的花生四烯酸代谢物的合成同样在几分钟之内发生，而炎症因子和趋化因子的合成与释放可能需要几个小时而这些介质有助于双相过敏反应的后相。释放的细胞因子和趋化因子包括IL-5、IL-4、IL-13、粒细胞(G)集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞(M)-CSF、GM-CSF、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16、IL-18和IL-22。通常这些介质引起其他细胞，包括嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和Th2细胞，的募集和活化(Ogawa和Grant，Immunol.Allergy Clin.N.Am.，27：249-260，2007)。某些患有自发性过敏症的患者，在缺乏IgE的情况下可以通过自身免疫机理聚集FcεRI受体(Simons，J.Allergy Clin.Immunol.121：S402-7，2008)，并且有一些涉及IgG和IgG受体的可替换路径的证据。该后一路径不引发组胺释放；而PAF是主要的早期介质(Peavy和Metcalfe，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.，8：310-314，2008)。

过敏症的早期，组胺刺激血管舒张和增加血管渗透性、心率、心脏收缩、和腺体分泌。前列腺素D2是支气管收缩剂、肺和冠状血管收缩剂和周围血管舒张剂。白细胞三烯也促进支气管收缩和增加血管渗透性，还促进气道重塑。PAF类似地引起支气管收缩和增加血管渗透性。TNF-α激活中性粒细胞、募集其他有效细胞和促进趋化因子合成，其导致进一步的炎症细胞募集。这些相互叠加和协同作用引起过敏症整个病理生理异常，所述过敏症以普遍的风疹和血管性水肿、支气管痉挛和其他呼吸症状、低血压、心血管症状(包括晕眩)和恶心以及其他胃肠道症状不同地呈现(Peavy和Metcalfe，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.，8：310-314，2008)。IL-4在过敏症后期，还在刺激和保持Th2细胞增殖以及使B细胞开始IgE合成中是关键的细胞因子，该细胞因子对过敏症最迅速和显著作用是显著促进目标细胞对血管活性介质的应答，所述介质包括组胺、5-羟色胺、PAF和半胱氨酰白细胞三烯(Ogawa和Grant，Immunol.Allergy Clin.N.Am.，27：249-260，2007)。

哮喘的特征为引起呼吸道暂时变窄的气道炎症，所述呼吸道将空气从鼻和口输送到肺。哮喘症状可由吸入肺的变应原或刺激物引起，其引起呼吸道发炎、阻塞和收缩。症状包括呼吸困难、喘息、咳嗽、胸闷。在严重的情形中，哮喘可以是致死性的。哮喘可能不是单一的疾病，而是交迭的多种单独的综合征的复合体。以下分类是基于Wenzel.Lancet；368：804-813，2006，和Green等，Curr.Opin.Allergy Immunol.7：43-50，2007的报道。

变应性哮喘：这是最大的哮喘表型。这在儿童期哮喘中尤其如此，但是在具有哮喘的成人中也很可能有高比例。呈现此表型的个体通常在儿童期经历其早期的症状，但是它可存在于任何年龄。哮喘家族史和早期暴露于过敏原对于启动变应性哮喘是重要的。除了标准的疗法之外，靶向疗法：免疫疗法或针对IgE的单克隆抗体也已成功使用。然而，不是所有具有变应性哮喘的人都响应抗-IgE-疗法。

职业性哮喘：达15％的成人发作哮喘属于此组。它具有以下亚表型：(1)对通常是高分子量试剂的致病原的免疫介导应答的发展，其通过发展IgE抗体与变应性哮喘具有相似性；(2)对低或高分子量触发物的免疫介导应答的发展，并且发现IgE应答不一致；(3)暴露于高浓度刺激性化学品后非免疫性快速攻击应答的发展。

两种免疫性表型中的呼吸道炎症相似，并与变应性哮喘的类似，如嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞的存在和网状基底膜的增厚。相反，由刺激性化学品引起的哮喘是非常不同的，其特征为支气管壁纤维化和上皮剥露和黏膜下层中的纤维蛋白出血性分泌液而没有嗜酸性炎症。此哮喘的免疫类型可在没有暴露于致病原下继续。

阿斯匹林诱导的哮喘：阿斯匹林和其他非甾族抗炎药物是引发物。它在严重哮喘群体中常见，并且没有多少证据表明其与遗传性过敏症、升高的白三烯以及组织和血液中高数量的嗜酸性粒细胞相关。其存在严重的鼻窦炎和鼻息肉以及成年发作。这一表型对糖皮质激素响应差。

月经相关的哮喘：这一表型没有得到很好的表征。它可能仅发生于一小部分妇女中，但是它可以是严重的。

锻炼诱导的哮喘：引发此哮喘的机制似乎涉及急性炎性细胞(通常是肥大细胞)、上皮和血管活性应答，但是其发病机制还不清楚。锻炼诱导的哮喘是否代表在所有患哮喘症者中响应锻炼的支气管收缩的发展或是否它仅发生于一些人中还不清楚。

虽然炎症是哮喘的特点，但不是所有哮喘表型都具有显著的嗜酸性炎症，尽管这是最常见和研究最好的。

嗜酸性哮喘：研究已通过不同严重程度哮喘的患者中的痰液或活组织检查检验定义了嗜酸性表型，并已持续地证明50％左右的患哮喘症者具有此表型。其他研究则表明嗜酸性炎症可能以比使用痰液或活组织检查检验所检测到的更高的比例存在于患者中。在一项研究中，认为是非嗜酸性的50％的严重哮喘患者实际上具有嗜酸性炎症，但在远端肺中。

嗜中性哮喘：通常见于患有严重疾病的患者。许多嗜中性炎症的患者可在组织活检中具有并发的嗜酸性炎症，而痰液评估可显示明显的嗜中性粒细胞优势。嗜中性粒细胞与严重哮喘的关联可能是由高剂量类固醇的治疗引起的，其已显示高剂量类固醇在体外减少嗜中性粒细胞凋亡。嗜中性哮喘与IL-8和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的增加有关。大约20％的患者有嗜中性哮喘，并且还有另外的8％既有嗜酸性炎症又有嗜中性炎症(来自对93名患者的研究)。

少粒细胞性哮喘：患者的痰液细胞计数在正常范围内(93名患者中的～30％具有此亚表型)。

变应性鼻炎是变应原诱导的上呼吸道疾病，特征为高反应性呼吸道黏膜和有急性恶化时期的慢性症状事件。变应性个体变得对变应原敏感并可发展针对变应原的IgE抗体，所述变应原为诸如花粉、尘螨、动物毛屑和霉菌孢子。对抗原的即时变应性应答称为早期应答。此阶段中释放的介质是组胺、激肽、中性蛋白酶和多种细胞因子。肥大细胞的活化导致白三烯和前列腺素的产生，并且这些介质一起在变应原暴露几分钟内产生水样鼻液溢、打喷嚏和发痒。这之后几个小时是晚期应答，涉及炎性细胞的浸润和介质向鼻黏膜的释放。症状与早期应答的相似，但是充血占优势(Walls等人，Med.J.Aust.；182：28-33，2005)。变应性鼻炎已被再分为“间歇性”和“持续性”疾病。间歇性疾病描述为其中症状以每周少于4天或一次少于4周存在的疾患。持续性疾病意指症状以每周多于4天和一次多于4周存在(Pawanker，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.；4：1-4，2004。)

变应性鼻炎和变应性哮喘是涉及炎性应答的疾病。它们具有相似的基本病因学，并且每种疾病的关键细胞因子都是T-细胞细胞因子的Th2亚群IL-5、IL-4和IL-13和GM-CSF。这些疾病的特征为包含嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T-淋巴细胞和单核细胞谱系的细胞的显著的炎性细胞浸润物。黏着分子、P-选择蛋白、MAC-1和PECAM-1在白细胞的外渗中起重要作用，并且很可能参与炎性过程。此外，细胞因子的趋化因子家族在这些疾病中起关键作用，因为它们是刺激嗜酸性粒细胞和CD4+T淋巴细胞浸润的主要的趋化性因子。

近来IL-17族细胞因子(特别是IL-25(IL-17E))被描述为启动或放大变应性炎症。特别注意的是IL-17(IL-17A)和IL-25。体内试验表明IL-25可能在Th2介导的变应性炎症的发展中起关键作用。转基因小鼠研究，其中检测了呼吸道中加强的IL-25表达在变态反应上的作用，其表明IL-25促进了Th-2细胞介导的变态反应性炎症。另外，气管内滴注给予IL-25导致黏液高分泌的气道高反应性以及肺组织内的嗜酸性粒细胞炎症，这些过程分别需要IL-13和IL-13信号传导以及IL-5/胞吐(Tamachi等，J.Allergy Clin.Immunol.118：606-614，2006；Sharkhuu等，Clin Exp.Allergy 36：1575-1583，2006)。来自IL-25封闭抗体的数据表明IL-25对于气道高反应的发展是很关键的。封闭IL-25活性显著降低了IL-5、IL-13的水平和IgE分泌、嗜酸性粒细胞的浸润以及变应性哮喘中的杯状细胞增生(Ballantyne，J.Allergy Clin.Immunol.120：1324-1331，2007)。

其它使用哮喘小鼠模型的研究发现IL-17主要由肺泡巨噬细胞产生，并且肥大细胞释放的介质上调IL-17的表达(Song等，J.Immunol.181：6117-6124，2008)。哮喘患者的IL-17表达在肺、痰液、BAL液、或血清中是升高的，并且呼吸道高反应性的严重程度与IL-17水平相关(Wang和Liu，Curr.Opin.Immunol.20：697-702，2008)。然而，IL-17的效应似乎主要在中性粒细胞水平上，因为IL-17的过度表达或给肺施用IL-17导致中性粒细胞流，所述流与作用于中性粒细胞的趋化因子的水平升高相关联。有力的证据表明中性粒细胞水平影响支气管收缩、非特异性AHR、黏液蛋白的高分泌和肺组织损伤，特别是严重哮喘(Linden等，Eur.Respir.J.25：159-172，2005)。

只有一种IL-17家族成员的3D结构被解决。这种披露的IL-17F是半胱氨酸扭结族蛋白的结构同源物且其二聚体类似神经生长因子(NGF)族成员。IL-17F单体核心包括2对反向平行β链(第1对：链1&2；第2对：链3&4)。2个二硫键桥连接链2和4，第3个二硫键连接一个原聚体链3和4之间的环至相邻单体的N端延长。基于氨基酸序列的排列，半胱氨酸扭结折叠并且β链的位置被认为为所有IL-17家族成员保留。特别是，IL-17应该在结构上与IL-17F相似，然而IL-25(IL-17E)可以具有不同构像的N末端(Hymowitz等，EMNO J.20：5332-5341，2001)。IL-17F结构的检测，根据静电表面电位着色，揭露陈列有许多定向排列的基本表面残留基团的蛋白质，因此氨基多糖结合是可能的。IL-17F，IL-17和IL-25的氨基酸序列比较表明碱性残留基团总体保留，但IL-25比其他两个蛋白质更为碱性。因此，阴离子寡糖轭合物结合这些细胞因子，IL-25结合的亲和力是最高的。IL-17，IL-17F和IL-25的受体结合位置还没有被确定。然而，IL-17F令人惊奇的结构特点是二聚体结合界面里有一个大的空腔。Hymowitz等，EMNO J.20：5332-5341，2001相信编码这个区域的氨基酸显示可以结合另一蛋白质(可能是一个受体域)的预想为口袋的特点，并且从氨基酸序列的分析来看这个口袋应该在包括IL-25在内的所有家族成员中得以保留。这个潜在的受体结合口袋紧靠着一列碱性残留基团簇，所述簇是阴离子寡糖轭合物结合域的指示。由于阴离子寡糖轭合物结合妨碍IL-17和IL-25结合它们的受体，紧靠着受体结合口袋的这列碱性残留基团有可能是阴离子轭合物结合IL-17和IL-25的位置。

逐渐认识到哮喘和变应性鼻炎是单一炎性呼吸道疾病的组成部分。该结论得到流行病学数据支持，其显示大于80％的患有变应性哮喘的人有变应性鼻炎，而多达50％的变应性鼻炎患者有哮喘(Gelfand，J.Allergy Clin.Immunol，114：S135-138，2004；Passalacqua等，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.4：177-183，2004)。并且，纵向和随访研究已显示鼻炎通常先于哮喘并且是哮喘的风险因素。变应性鼻炎使发展哮喘的风险增加了至少三倍，并且使用鼻内类固醇正确治疗变应性鼻炎对于支气管症状具有有利的作用，显著降低了哮喘恶化的入院和急诊率(Passalacqua等，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.4：177-183，2004)。这些疾病是病理学的复杂混合物，涉及至少上文提到的多种细胞因子、趋化因子和细胞黏着分子。

肥大细胞和组胺在初始的变应性鼻炎应答过程中起重要作用。然而，随着变应性鼻炎的进展，组胺的作用消退，使得抗组胺剂作为疗法有效性较低(Gelfand，J.Allergy Clin.Immunol 114：S135-138，2004)。在初始的变应性鼻炎应答过程中，敏化的肥大细胞在变应原暴露的几分钟内脱粒，释放已执行的和新合成的介质，包括组胺、蛋白酶、半胱氨酰白三烯、前列腺素和细胞因子。变应性鼻炎进展取决于与嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和T-淋巴细胞的浸润相关的介质(Gelfand，J.Allergy Clin.Immunol，114：S135-138，2004；Passalacqua等，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.4：177-183，2004)。意识到嗜酸性粒细胞和IL-5与变应性鼻炎的关联已有一段时间。重复的研究已发现，用变应原诱发后包括IL-5和IL-4的Th2-型细胞因子水平增加和活化的嗜酸性粒细胞的标志物嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)的量的增加(Blaiss，Allergy Asthma Proc.26：35-40，2005)。嗜酸性粒细胞的流入与症状的发展密切相关。此外，鼻炎患者的鼻黏膜中上皮完整性的损失与嗜酸性粒细胞的数量而不是肥大细胞或嗜中性粒细胞的数量相关(Borish，J.Allergy Clin Immunol.112：1021-1031，2003)。变应性鼻炎似乎是从对抗组胺剂有响应的急性、主要肥大细胞介导的过程进化至主要嗜酸性粒细胞介导的并且对抗组胺剂的响应低得多的慢性炎性疾病。这是持续性变应性鼻炎患者的情形。对于季节性患者来说，进展为抗组胺剂难治的疾病还可发生于过敏季节。对于其他轻度间歇性疾病患者，抗组胺剂确实不失为有效的疗法，反映出间歇性变应原暴露，其持续时间不足以驱动疾病进展至抗组胺剂抗性期。

哮喘的一线治疗是吸入性糖皮质激素(ICS)，其通常与β2-激动剂组合使用(Barnes，Br.J.Pharmacol.147 Suppl 1：S297-303，2006)。β2-激动剂减轻症状而不治疗潜在的炎症，并且如果在没有ICS下频繁使用，有可能使哮喘更加恶化。尽管如此，由于其作用的即时性，这看起来仍是优选的疗法(虽然它有副作用)。没有ICS的β2-激动剂疗法已由于与此疗法有关的潜在心脏问题而被FDA列入“黑框”列表。虽然副作用比用口服制剂低，但是ICS并非没有不利的局部的和全身的副作用。糖皮质激素的副作用是抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)：观察到临床相关的副作用，并且与某些药物一起要比其它更加明显。骨密度和骨折也可能成为问题：可检测到ICS对骨代谢有一定作用，但临床相关性尚不清楚。最后，儿童中的生长迟缓是可能使患者担忧的另一问题(Allen，Adv Pediatr.53：101-110，2006)。总而言之，鉴于持续性/无法控制性哮喘的严重并发症，所述副作用是可接受的。

哮喘的其他疗法包括：

(1)奥马珠单抗，一种抗-IgE抗体(Genetech)，对于标准哮喘治疗被视为不具有性价比。它主要用作ICS的附加疗法，因为它不改善气道反应性并且具有不高的效力。剂量约束和递送机制(皮下注射)是附加的缺点。此外，来自美国食品和药品管理局(FDA)的警告将奥马珠单抗注射与威胁生命的过敏性反应联系在一起，并且更令人担忧的是，在一些患者中，此过敏性反应是在注射后超过2小时至注射后超过24小时延迟发生的。

(2)抗白三烯剂(抗LT剂)，其可引起支气管扩张。它们的作用是与短效β2-受体激动剂的作用加成的，虽然它们单独具有相对不高的作用。抗LT剂主要影响早期哮喘应答(EAR)，而ICS显示对晚期哮喘应答的显著作用(Palmqvist等人，Allergy 60：65，2005)。由于这些原因，抗LT剂已联合ICS进行了试验。抗白三烯剂不具成本效益。它们几乎没有副作用，但是它们的效力低。

变应性鼻炎的通常疗法是抗组胺剂或鼻内糖皮质激素(Neilsen和Dahl，Am.J.Respir.Med.2：55-65，2003；Yanez和Rodrigo，Ann.AllergyAsthmaImmunol.89：479-84，2002)。比较早的第一代口服H1拮抗剂(抗组胺剂)具有许多不利的副作用，认识最清楚的是困倦和抗胆碱能作用。第二代药物被开发以克服这些作用。然而，最近的研究表明，从困倦角度区分第一代和第二代H1拮抗剂并不明确(Golightly和Greos，Drugs 65：341-84，2005)。FDA批准的最有效的抗组胺剂西替利嗪的标签包括对可能的嗜眠副作用警告和紧急服药后谨慎驾驶和使用重型设备的警示。此外，应避免同时饮酒或服用其他中枢神经系统(CNS)阻抑剂，因为可能造成警惕性和CNS表现的进一步降低。而且，抗组胺剂对于慢性变应性鼻炎相关的充血是无效的。变应性鼻炎进展为主要由嗜酸性粒细胞介导并且对抗组胺剂疗法不应的疾病。当这发生时，鼻内糖皮质激素(INCS)是主要的疗法。确实，对于许多医师来说，INCS是治疗所有变应性鼻炎的选择药物，因为糖皮质激素具有减轻嗜酸性粒细胞炎症的作用。虽然一般认为INCS是安全的，但是建议尽可能地降低类固醇剂量并优化类固醇节约策略(Skoner，Curr.Opin.AllergyClin.Immunol.2：7-10，2002)。

慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的基础病因学与变应性炎性疾病的不同(Sutherland和Martin，J Allergy Clin.Immunol.112：819-27，2003)。COPD包括影响外周呼吸道和肺实质的慢性炎性过程，并且在恶化过程中炎症更加严重。COPD发展的主要贡献因素是对吸烟的炎性应答。COPD的病理学指标是肺实质的破坏(肺部气肿)、小的外周呼吸道的炎症(呼吸性支气管炎)和中枢呼吸道炎症。大多数COPD患者具有展示不同炎症模式的全部三种病理学疾患(慢性阻塞性支气管炎、气肿和黏液堵塞)(Adcock和Ito，Proc.Am.Thorac.Soc.2：313-319，2005)。嗜中性粒细胞和巨噬细胞被认为是疾病的主要效应子。对来自COPD患者的痰液和支气管肺泡灌洗液的分析显示这些分泌物中嗜中性粒细胞和巨噬细胞二者的增加。此外，增加的证据表明COPD患者的显著亚组存在具有慢性呼吸道嗜酸性细胞的患者。

肺泡巨噬细胞在COPD中起关键作用。它们定位于肺泡受损位点，并且它们的数量与气肿中的疾病严重性、呼吸道阻塞和肺泡壁受损程度正相关。在恶化过程中和在严重COPD中或在感染过程中，COPD患者的大呼吸道和小呼吸道中的呼吸道组织嗜中性粒细胞增加。COPD患者还显示CD8+/CD4+T细胞比值的增加或呼吸道壁中CD8+和CD4+T细胞二者总数量的增加(MacNee，Proc.Am.Thorac.Soc.2：258-266，2005)。细支气管被纤维化阻塞，并有巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润。

COPD有三种形态形式：慢性支气管炎、阻塞性细支气管炎和气肿(Szilasi等人，2006.Pathol.Oncol.Res.12：52-60)。慢性支气管炎相关的炎症位于中枢呼吸道的表皮。炎性过程与增加的黏液产生和缺陷的黏液纤毛清除有关。在黏膜、平滑肌层和黏膜下层腺体中观察到炎症。在稳定的COPD中和慢性支气管炎恶化中，大呼吸道中涉及单核细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞和血浆细胞是常见的。CD8+T细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，一种有效的促炎性介质。嗜中性粒细胞的作用尚不清楚。嗜中性粒细胞仅在恶化过程和严重COPD中见于大呼吸道，不过它们在早期也见于呼吸道腔和痰液中。

阻塞性细支气管炎或小呼吸道阻塞是涉及小呼吸道和外周呼吸道的炎性疾患。典型特征是具有增加的黏液的瓦解的腔。巨噬细胞和CD8+T细胞控制小呼吸道炎症，尽管在COPD中炎性变化显示与气流阻塞的正相关。例如，在轻度至中度的稳定的COPD中，巨噬细胞是占优势的，而在严重的疾病中，嗜中性粒细胞是最主要的炎性组分，同时在轻度恶化过程中，发现了嗜酸性粒细胞。在阻塞性细支气管炎中，发现小呼吸道下表皮中成纤维细胞和肌成纤维细胞的数量增加和增强的胞外基质。此病理学暗示导致纤维化和疤痕组织的反复受伤和愈合机制。最终结果是呼吸道变窄。

气肿定义为由末端细支气管之外的肺组织的破坏和扩大引起的永久性气室扩大。该疾病的机制涉及失调的炎症和大量蛋白水解酶的释放。蛋白酶/抗蛋白酶不平衡是肺部气肿的推测病因。虽然炎症受CD8+T细胞支配，但是巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生过量蛋白酶，其包括白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、蛋白酶3、基质金属蛋白酶(MMP)、半胱氨酸蛋白酶和纤维蛋白溶酶原激活物。这些酶破坏弹性蛋白和肺泡壁的其他组分，而弹性蛋白酶是在此过程中牵涉最多的酶。

这些疾病过程的促炎性介质包括白三烯-B4、IL-8和其他趋化因子(如MIP-1α、MCP-1)、TNF-α、IL-13和IL-4(Barnes，Pharmacol.Rev.56：515-548，2004)。已提示TNF-α和IL-4对支气管上皮细胞产生调节性细胞因子TGF-β的抑制作用可促进炎性应答的进展。此外，已测量到痰液中IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8水平的增加以及恶化过程中的进一步增加。

COPD对社会是非常大的负担。在英国，它是第五大死亡原因。在美国，它影响5％的成人群体并且是唯一的主要死亡原因，其中发病率和死亡率在增加。到2020年，预计COPD将是世界范围的第三大死亡原因和第五大残疾原因(Halpin和Miravitlles，Proc.Am.Thorac.Soc.3：619-623，2006)。COPD的现有疗法是很不充分的。没有疗法减缓疾病进展，并且治疗响应差。COPD对糖皮质激素的抗炎作用是相对抗性的。尽管如此，当前的药理选择包括辅助停止吸烟的药物、短效和长效β₂-激动剂、短效和长效抗胆碱能剂、吸入性糖皮质激素、茶碱、N-乙酰半胱氨酸和其他黏液溶解剂和氧气(Anzueto，Am.J.Med.119：S46-S53，2006；Barnes和Stockley，Eur.Respir.J.25：1084-1106，2005)。引入短效和长效β₂-激动剂以改善支气管扩张。它们经常与抗胆碱能剂组合使用，因为它们经由不同的途径产生支气管扩张。吸入性糖皮质激素经常与β₂-激动剂组合使用，并且恶化速率的改善大于单个组分的改善。茶碱是有用的支气管扩张剂。N-乙酰半胱氨酸的作用模式尚不清楚，但它可作为黏液溶解剂或抗氧化剂起作用以改善咳嗽症状，并在一些患者中显示降低恶化频率。

尽管有这些疗法，但是在临床试验中明确显示降低死亡率的唯一干预是停止吸烟。

急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)是与高致死率相关的呼吸炎性疾患。ALI和ARDS的发病机理涉及不受控制的寄主防御反应，所述反应导致炎症、内皮损伤、增强的凝结、减少的纤溶和纤维增殖。ARDS是各种病原导致的临床综合病症。1994年，对ARDS的美国-欧洲共识会议委员会推荐了该疾病的定义；标准包括：(1)急性发作，(2)胸腔X线片上双侧浸润，(3)肺动脉楔压≤18mm Hg或者缺乏左心房高血压的临床证据，和(4)Pao₂/Fio₂比率≤300(定义为ALI)或者Pao₂/Fio₂比率≤200(定义ARDS为ALI的更严重形式)(Cepkova和Matthay，J.Intensive Care Med.，21：119-143，2006)。弥漫性肺泡损伤是ARDS的特征。导致弥漫性肺泡损伤以及接下来导致ALI或ARDS的初始事件包括肺炎、误吸、肺栓、濒临淹溺死亡、吸入性损伤、再灌注肺水肿、外伤、外科手术、烧伤、药物过量、急性胰腺炎、心肺转流术和大剂量输血，但是总的来说脓毒症与发展ALI或ARDS的最高风险相关。该疾病有三个交迭的阶段：渗出阶段(最开始的4-7天)，增殖阶段(≥7-14或21天)和纤维化阶段(≥14或21天)(MacLaren和Stringge，Pharmacotherapy，27：860-873，2007)。

开始的早期(渗出阶段)的特征是肺内皮和上皮屏障增加的渗透性，以及肺间质和肺泡内高蛋白质和高细胞水肿液的聚集。水肿液包含透明膜和各种炎性细胞但中性粒细胞占多数。因此相关病理学定义为：弥漫性肺泡损伤，包含透明膜以及至少以下一种：肺泡Ⅰ型或内皮细胞坏死、水肿、间质纤维化、或显著的肺泡细胞Ⅱ型增殖。一些病人在疾病的第一周得到恢复，其他的在该阶段死亡，但一些在发作后进展为发展了约7天的ALI/ARDS亚急性期。该亚急性期期间肺泡空间充满间叶细胞、它们的产物和新的血管。有证据表明有Ⅱ型细胞增殖的间质和肺泡纤维化和肺中微循环部分的损坏。某些病人的呼吸衰竭持续超过14天，并且该慢性阶段的特征是具有正常肺泡结构消失的广泛性肺纤维化和肺中气肿区域的渐进性发展(Cepkova和Matthay，J.Intensive Care Med.，21：119-143，2006)。

在急性阶段存在显著的中性粒细胞的聚集。中性粒细胞在从感染人群中获得的肺水肿液和肺泡灌洗液中占优势。肺泡巨噬细胞分泌细胞因子例如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α，所述因子在本地刺激中性粒细胞趋化性和激活中性粒细胞。中性粒细胞然后释放氧化剂、蛋白酶(包括中性粒细胞弹性蛋白酶))、白三烯和其他促炎性细胞介质(Ware和Mattray，New England J.Med.342：1334-1349)。这些介质以复杂的方式相互作用从而损伤和炎症化肺泡毛细血管界面。这种介质的异质性也许可以解释为什么抗介质疗法在动物模型中显示有效但在临床试验中确不能得到有效临床结果。给予ARDS糖皮质激素、布洛芬、n-乙酰基半胱氨酸、利索茶碱、前列腺素E、抗TNF-α抗体、IL-1受体拮抗剂和酮康唑在大的临床试验中均令人失望。

鉴定和治疗这种刺激性临床疾患是处理ALI/ARDS很重要的方面。很多患者中造成损伤的危害不能被治疗只能预防复发，并且在这些患者中最佳的支持性护理是尤为重要的。支持性护理的主要依靠是机械性通风，并且最近的试验表明与机械性通风的传统方法相比，针对给与较低潮气量和限制性的平稳压力的策略导致了降低的致死率(Mortelliti和Manning，Am.Family Physician 65：1823-1830，2002)。

现已发现本发明的阴离子寡糖轭合物与很多在上述讨论的疾病中部分或全部起作用的配体相互作用。尽管本发明延伸至配体可以为碳水化合物、脂类、糖蛋白或从天然产物或化学库筛选获得的分子，但优选地，配体是肽、多肽或蛋白质。适合的蛋白靶点包括那些被描述为GAG(肝素、硫酸肝素、软骨素和透明质酸盐)结合蛋白的靶点。蛋白配体的例子包括，但不限于：组胺、细胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15和包括IL-25的IL-17家族成员)、干扰素(如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素)或生长因子包括但不限于G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、KC、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH和胰岛素等、酶(例如超氧化歧化酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、类胰蛋白酶(包括β-类胰蛋白酶)、胃促胰酶、弹性蛋白酶、磷脂酶A2或前列腺素内过氧化物)、趋化因子例如嗜酸性粒细胞趋化因子(嗜酸性粒细胞趋化因子-1、-2或-3)、或可溶性或细胞或病毒结合受体(例如三磷酸肌醇受体)。

一方面本发明提供确定一个或多个阴离子寡糖轭合物的生物活性的测定或筛选，测定包括下列步骤：

a)用一个或多个每个独立地具有下式(Ⅰ)的阴离子寡糖轭合物接触配体、细胞或动物：

其中

S¹和S²各自独立地表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数，和

可通过任何方便的方法测定与配体的相互作用，所述方法例如凝胶阻滞、过滤阻滞、亲和共电泳、生物发光共振能量转移(BRET)测定法、荧光共振能量转移(FPET)测定法、荧光偏振(FP)测定法、闪烁亲近测定法或固定在生物芯片或其它表面上，包括那些与质谱检测连接的表面上。

后者可通过以下步骤完成：首先将阴离子寡糖轭合物固定于芯片上，接着加入配体。可选择地，可将配体固定于芯片上并用于筛选阴离子寡糖轭合物与其结合的能力。

而另一种选择是将GAG例如肝素固定于固体载体上并然后筛选阴离子寡糖轭合物抑制配体结合固定化肝素的能力。

相应地，特别有用的试验是混合配体和阴离子寡糖轭合物并筛选阴离子寡糖轭合物抑制配体结合固定在芯片上的GAG(例如肝素或硫酸肝素)的能力。

因此，本发明的另一方面考虑制备GAG模拟物的方法，所述模拟物与配体例如蛋白质相互作用，所述方法包括制备阴离子寡糖轭合物库然后筛选所述库的每个成员的与所述配体相互作用或抑制配体和已知的与所述配体相互作用的肝素样GAGs(HLGAGs)相互作用的能力。

在优选实施方案中，阴离子寡糖轭合物结合分泌的细胞产物，所述细胞产物可能是蛋白质，从而抑制配体和例如肝素的GAG之间的相互作用。

当然，存在可用于筛选阴离子寡糖轭合物和配体之间的相互作用或可用于筛选抑制配体和已知的结合配体的GAG之间的相互作用的任意数量的其它测定。另一种测定是过滤器结合测定。在此测定中，一种阴离子寡糖轭合物或配体用能提供可鉴别的信号的报道分子诸如荧光染料标记，并且让两种分子在溶液中相互作用。然后使所得混合物流经能够延迟所述阴离子寡糖轭合物或阴离子寡糖轭合物复合分子或所述配体或仅阴离子寡糖轭合物-配体复合体或阴离子寡糖轭合物复合分子-配体复合体中一种的过滤器。

在一实施方案中，例如，所述过滤器是延迟蛋白质的硝酸纤维素过滤器。在这种情形中，如果用报道分子标记的阴离子寡糖轭合物不能经过所述过滤器，则过滤器中报道信号的存在表明阴离子寡糖轭合物与蛋白质的结合。

在另一实施方案中，用报道分子标记肝素或硫酸肝素并在不同阴离子寡糖轭合物的存在下与蛋白反应。肝素或硫酸肝素通过过滤器的通道是阴离子寡糖轭合物已经抑制肝素/硫酸肝素和蛋白的相互作用的表征。

不同的阴离子寡糖轭合物将与不同的配体相互作用，或不同的配体将与不同的阴离子寡糖轭合物相互作用，或二者皆有。因此，另一测定涉及使用携带固定配体的亲和柱。然后使阴离子寡糖轭合物经过所述柱并确定阴离子寡糖轭合物延迟的存在。方便地使用盐梯度以洗脱结合的阴离子寡糖轭合物。一旦鉴别与柱上的配体结合的级分后，即可进一步分析所述级分以获得其中不同的结构实体数量的指示。此类分析可包括，例如，阴离子交换色谱、质谱或电泳。

其他本发明考虑的测定例子包括功能性测定，例如整个细胞测定用于评估细胞增殖(例如实施例11至13所示)，酶抑制测定(例如实施例14所示)，趋化因子测定(例如实施例15所示)，和动物测定(例如实施例16至20所示)。这些功能性测定可以提供比单纯的结合测定更多的对于检测的阴离子寡糖轭合物的作用的有用信息。

一旦鉴别与特定的配体结合的阴离子寡糖轭合物群体之后，此级分本身可用作抑制蛋白(或其他配体)和细胞表面分子GAG(诸如肝素或硫酸肝素)之间相互作用的治疗剂。所述蛋白(或其他配体)可以是游离于细胞的或与细胞或病毒相关的诸如细胞表面或病毒表面。所述阴离子寡糖轭合物还可用作治疗剂以调节分泌的细胞产物和胞外基质组分之间、或细胞表面蛋白和胞外基质组分之间、或蛋白和其配体之间的相互作用，所述蛋白和其配体二者或其中的任一个可以是细胞表面或细胞相关的。可选地，阴离子寡糖轭合物可用作鉴别天然产物或在与配体结合或抑制或促进GAG和所述配体之间相互作用方面模拟阴离子寡糖轭合物的来自化学库的产物的靶标。这些分子可以是GAG的拮抗剂或激动剂或化学类似物。因此，“类似物”扩展至并涵盖功能上等同的以相似方式结合和/或调节配体的任何结构。

“调节(modulate)”或“调节(modulation)”在本文的涵义扩展至并涵盖抑制和/或促进相互作用。

相应地，本发明另一方面指向生成用于治疗患有疾病的主体的药物的方法，所述方法包括根据本发明方法制备一系列阴离子寡糖轭合物，并筛选每个阴离子寡糖轭合物与配体相互作用或调节配体的能力。鉴定与配体相互作用或调节配体的阴离子寡糖轭合物并在所述药物的生产中使用相同的或其类似物、激动剂或拮抗剂。

在一个优选实施方案中，调节指的是抑制。

本文考虑的配体类型包括上面列出的，例如PECAM-1、亲环素A、gp120和细胞因子例如白介素(IL)-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15和17(包括IL-25)、G-CSF、GM-CSF、LIF、和M-CSF和趋化因子例如(嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2或嗜酸性粒细胞趋化因子-3)和例如弹性蛋白酶的酶类和其他化学趋化因子例如MCP1和MCP-1α。

接受治疗的主体包括人类、家畜动物(例如牛、羊、猪、马、驴)、实验室实验动物(例如兔子、豚鼠、小鼠、大鼠)和伴侣动物(例如狗、猫)。

另一方面，本发明也考虑预防和/或治疗主体中疾病的方法，所述疾病是由于所述宿主的细胞表面的GAG和配体的相互作用引起的，或由于所述宿主的细胞外基质的GAG和细胞相关或不相关的配体之间的相互作用引起的，或由于所述宿主的蛋白-配体的可以被GAG阻断的相互作用引起的，其中所述蛋白可以是细胞相关的并且配体可溶或蛋白和配体两者可以是细胞相关的，所述方法包括给予所述主体治疗有效量的阴离子寡糖轭合物，其根据本发明制备和鉴定，与所述配体相互作用。

本发明另一方面提供药物组合物，其包括本文定义的阴离子寡糖轭合物和药学上可接受的载体和/或稀释剂。

适合注射用途的药物形式包括：无菌水溶液(其中是水溶性的)、用于临时制备无菌注射液和吸入形式的无菌粉剂。这样的形式在制备和储藏的条件下优选是稳定的。所述载体可为溶剂或稀释介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可例如通过使用表面活性剂保持适当的流动性。在许多情况中，优选的是包含等渗剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶实现。

无菌注射液如下制备：将所需量的阴离子寡糖轭合物和载体/稀释剂加入合适溶剂中，随后进行灭菌或至少一种方法以减少污染性病毒、细菌或其它生物实体，以至用于给予人或动物主体的可接受的水平。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生含活性成分及任何另外的所需成分的粉剂。

当阴离子寡糖轭合物被适当地保护时，其可口服给予，例如连同惰性稀释剂或可同化的可食用载体，或其可包封在硬壳或软壳胶囊中，或其可被压制为片剂。对于口服治疗给药，活性成分可掺入赋形剂并以可摄取片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、纸囊剂(wafer)等的形式使用。这样的组合物和制剂应优选地含有至少1％重量的活性阴离子寡糖轭合物。当然组合物和制剂的百分比可变化并且可合宜地在单位重量的约5至约80％之间。此类治疗上有用的组合物中活性化合物的量为得到合适剂量的量。制备优选的本发明组合物或制剂，以使口服剂量单位形式含约0.1μg至200mg的活性阴离子寡糖轭合物。备选的剂量包括约1μg至约1000mg和约10μg至约500mg。这些剂量可按每个个体或每kg体重。给药可按每秒、每分钟、每小时、每天、每周、每月或每年。

片剂、锭剂、丸剂和胶囊等还可含有下列组分。可加入粘合剂例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式为胶囊时，除了以上类型物质之外，其还可含有液态载体。各种其它物质可作为包衣存在或改变剂量单位的物理形式。例如片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或这两者包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和矫味剂例如樱桃味或橙味剂。当然，在制备任何剂量单位形式中所用的任何物质应为药学上纯的并在所应用量中基本无毒的。此外，活性化合物可掺入缓释制品和制剂中。

药学可接受载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂是本领域公知的，任何与所述活性成分不相容的任何常规介质或试剂除外，考虑了其在治疗组合物中的用途。还可将补充性活性成分掺入组合物。

组合物还可配制用于局部给药或表面给药。配制和给药技术可参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，EastonPA.，第16版，1980，Arthur Osol编辑。因此，对于局部或表面给药，主题组合物可以任何合适的方式配制，包括但不限于霜剂、凝胶剂、油剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、粉剂、气雾剂或气溶胶。对于经粘膜给药，在制剂中使用合适的渗透屏障的渗透剂。此渗透剂通常为本领域所已知并且包括但不限于苯扎氯铵、洋地黄皂苷、二氢细胞松弛素B5和癸酸。

以洗剂、霜剂或凝胶剂形式存在的本发明组合物可含有可接受的稀释剂或载体以赋予所需的质地、稠度、粘度和外观。可接受的稀释剂和载体为本领域技术人员熟悉并且包括但不限于乙氧基化和未乙氧基化的表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、烃油(例如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、缓冲剂、纤维素衍生物、乳化剂例如非离子有机碱和无机碱、防腐剂、蜡酯、类固醇、甘油三酯、磷脂类例如卵磷脂和脑磷脂、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水的羊毛脂衍生物和亲水的蜂蜡衍生物。

在一个特定优选实施方案中，本发明考虑一种吸入药物组合物。包含一个或多个本发明阴离子寡糖轭合物的该组合物可以作为鼻吸入型气雾剂或肺吸入型气雾剂或用于雾化器的溶液，或用于吸入法的微粉粉雾剂(优选尺寸为1至10微米或更少的颗粒)施用于呼吸道，可以单独使用或联合一种惰性载体例如乳糖，或其他药学上可接受赋形剂。

气雾剂制剂包括用合适抛射剂的加压装置体提供阴离子寡糖轭合物的制剂，例如加压定量吸入剂(pMDI)。同时抛射剂可以是氟氯烷烃类化合物(CFC)例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯三氟甲烷，抛射剂更优选是非氟氯烷烃类化合物例如二氧化碳、氢氟烷烃(例如HFA-134a)或其他合适气体。气雾剂也可以方便地含有表面活性剂例如卵磷脂。阴离子寡糖轭合物的剂量可以通过量阀的提供来控制。已发现优选约2至3μm的颗粒大小用于治疗哮喘，因为小于1μm的颗粒通常被呼出而没有传输至肺，而大于10μm的颗粒大多数由于口咽沉积被挡住而不能到达至肺。HFA-134a抛射的设备输送更小的雾滴，其可以更容易穿透进入支气管呼吸道。优选地，需要输送约40％的吸入雾滴至肺，而使用上述提到的pMDI可以做到。为了治疗变应性鼻炎，通过鼻通道的药物输送的优选颗粒大小是20-80μm，因为更小的颗粒(小于10μm)进入气管支气管区域，而更大的颗粒(大于100μm)则被迅速清理出鼻通道。

还可以在鼻腔形成凝胶的药物制剂提供阴离子寡糖轭合物。阴离子寡糖轭合物还可以单位剂型形式存在的粉末组合物进行制备，例如在eg凝胶的胶囊或药筒，或者透明塑料罩中，粉末可以从其中通过吸入器给药。

本文使用的表达“药学上可接受的盐”指的是特定化合物的盐，其中所述盐适合于作为药物给予。例如，此类盐可以通过氨基或羧基分别与酸或碱的反应生成。

可以用无机和有机碱制备药学上可接受的碱加成盐。从无机碱衍生的盐包括，但不限于，钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。从有机碱衍生的盐包括，但不限于，伯、仲和叔胺盐，包括天然存在的取代胺在内的取代胺、和环胺，包括异丙胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺、乙醇胺、2-二甲基胺醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴青霉素、胆碱、甜菜碱、乙(撑)二胺、氨基葡萄糖、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶和N-乙基哌啶。还应该理解的是在本发明实践中其他羧酸衍生物也是有用的，例如羧酸酰胺，包括羧基酰胺、低级烷基羧基酰胺、二(低级烷基)羧基酰胺等。

可以从无机和有机酸制备药学上可接受的酸加成盐。从无机酸衍生的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。从有机酸衍生的盐包括乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸，水杨酸等。

术语“保护基”指当结合化合物的一个或多个羟基、硫醇基、氨基或羧基时防止这些基团发生反应的任意基团并且保护基可以通过常规化学或酶学步骤除去从而重建羟基，硫醇基，氨基或羧基。使用的特别的可除去的阻碍基团是不严格的，优选的可除去的羟基阻碍基团包括常规取代基例如烯丙基、苄基、乙酰基、氯乙酰基、硫苄基、次苄基、苯甲酰甲基、叔丁基二苯甲硅烷基和其他任意基团，其可以化学方式引入至羟基官能团然后再在符合产物性质的温和条件下，用化学或酶学方法选择性除去。保护基的更多细节披露在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，2.sup.ndEd.，1991，John Wiley和Sons，N.Y。

优选的可去除的氨基阻碍基团包括常规取代基例如叔丁氧基羰基(t-Boc)、苄氧基羰基(CBZ)、芴醇基甲氧基羰基(FMOC)、烯丙氧基羰基(ALOC)等，其可以在符合产物性质的常规条件下除去。

“选择性”和“特异性”通常是配体对两个不同受体的结合优选的度量和/或不同配体对同一受体结合优选的度量。根据相对另一受体的其目标受体的配体的选择性是由各自的K_d值(即各个配体-受体复合物的分离常数)的比率给定，或者在观察到生物学效应低于K_d时，选择性根据各自的EC₅₀值(即配体与两个不同受体相互作用产生50％的最大响应时的浓度)比率给定。

术语“治疗有效量”指的是当给予动物，优选哺乳动物，更优选需要这种治疗的人时足够产生如上述定义的治疗效果的量。治疗有效量可以根据患者和待治疗疾病状态、痛苦严重度和施用方式而不同，并且可以由本领域技术人员常规决定。

本文使用的术语“治疗”覆盖对动物，优选哺乳动物，更优选人的疾患或疾病的任何治疗，包括(i)预防主体中疾病或疾患的发生，该主体可能是易于患上该疾病但还没有被诊断出患有疾病；(ii)抑制疾病或疾患，即阻断其发展；(iii)缓解疾病或疾患，即促使疾患的衰退；或(iv)缓解疾病造成的不适，即疾病的症状。

可以理解的是本发明化合物可以存在一种或多种异构体形式(例如对映异构体、非对映异构体)。本发明包括该范围所有的立体异构体形式，可以是独立的(例如单独的对映异构体)，或联合的(包括消旋混合物)。

附图说明

图1显示使用肽(RG)₁₉R络合技术的N’-Fmoc(甲氧酰基)-1-N-甘氨酰胺麦芽三糖苷聚硫酸盐的MALDI-MS谱。主峰分子量对应复合物(5810.51)减去肽离子(4227.57)得到硫酸化糖轭合物的1582.94(10 O-硫酸盐的计算值是1583.38)。

图2显示麦芽寡糖的Fmoc衍生物(从“高麦芽麦芽五糖浆”制备)的制备HPLC纯化的洗脱图。

图3显示5mg/kg化合物对变应性鼻炎模型的豚鼠8小时后收集的鼻灌洗液中的白细胞的效应。化合物是，C1：戊聚糖，C2：(麦芽五糖)-(Et2)-(麦芽五糖)和C3：(麦芽五糖)-Et4-(麦芽五糖)。

图4显示不同剂量布地奈德(Budesonide)和阴离子寡糖轭合物对取自过敏性/哮喘性豚鼠的BAL液(mg/mL)的抗原增加总蛋白量的效应。

Bud＝布地奈德；D2＝阴离子寡糖轭合物ID 9；药物浓度0.1和2.5mg/kg。

^**显著差异性，相对阳性对照P＜0.01

^*显著差异性，相对阳性对照P＜0.05

++显著差异性，相对阴性对照

图5显示不同剂量的布地奈德和阴离子寡糖轭合物对取自过敏性/哮喘性豚鼠的BAL液(X10⁷/mL)的抗原增加总白细胞流的效应。

^**显著差异性，相对阳性对照P＜0.01

^*显著差异性，相对阳性对照P＜0.05

++显著差异性，相对阴性对照

图6显示不同剂量的布地奈德和阴离子寡糖轭合物对BAL液(X10⁷/mL)的抗原增加噬酸细胞和中性细胞流的效应。

^***显著差异性，相对阳性对照P＜0.001

相对阴性对照，+++显著差异性，P＜0.001；++显著差异性，P＜0.01和+显著差异性，P＜0.05。

具体实施方式

现在本发明将引用以下非限定性实施例说明。

实施例1

N’-Fmoc-1-N-甘氨酰胺麦芽三糖苷的合成

现有技术中存在制备糖基胺的许多例子，该方法可以用于不同范围的寡糖轭合物。

简略地，麦芽三糖(1g，～2mmol)和NH₄HCO₃(160mg，2mmol)溶于氨水(10mL)中。溶液在离心蒸发仪里蒸发至干前于40℃孵育32小时。为了除去残留的氨水，将残余物溶于最少量的水中并冷冻干燥。一部分残余物(820mg)溶于DMSO(10mL)、DMF(6mL)和DIPEA(0.6mL)的混合物中。加入Fmoc-甘氨酸(1.2g)、HOBT(0.5g)和HBTU(3g)并将溶液孵育至少4小时，然后加入等量的水并用乙酸(0.6mL)酸化以淬灭反应。冷却并过滤后，可以用制备型RP-HPLC纯化期望的产物产物。例如，将多达2mL注射入250mm x 10mm ID Exsil C18柱。用溶液A(含15％乙腈的0.1％TFA)和溶液B(85％乙腈)的二元梯度混合物洗脱该柱。所述梯度包含3分钟10％B，到15分钟增加至50％(以洗脱期望的产物)，然后到16分钟为90％并维持5分钟(以洗脱Fmoc-甘氨酰胺和多余的Fmoc-gly)。流速是2.5mL/分。在290nm监测洗脱液并用自动取样器收集馏分。汇集含有期望产物的馏分，在离心蒸发仪中浓缩除去大部分的乙腈然后冷冻干燥以提供蓬松的、白色粉末(～0.6g)。

其他寡糖的N’-Fmoc-1-N-甘氨酰胺衍生物用相似方式进行制备。

实施例2

N’-Fmoc-1-N-甘氨酰胺麦芽三糖苷多硫酸盐的合成

N’-Fmoc-1-N-甘氨酰胺麦芽三糖苷(0.5g，0.64mmol)溶于干燥DMF(10mL)并加入吡啶三氧化硫复合物(3g，19mmol)。溶液在室温下孵育48小时，并加入水淬灭反应。通过具有双重UV和ELSD的RP-IPHPLC的反应混合物的分析表明单独的宽峰，这表明没有脱保护发生。可以用制备型RP-HPLC、RP-IP HPLC或AEX色谱纯化期望的产物。例如，将多达2mL注射入250mm x 10mm ID Exsil C18柱。用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(50％乙腈)的二元梯度混合物洗脱该柱。该梯度包含3分钟的6％B，到15分钟增加至50％。流速是2.5mL/分。在290nm监测洗脱液并用自动取样器收集馏分。汇集含有期望产物的馏分，在离心蒸发仪中浓缩至干燥。通过利用离子对结晶技术的MALDIMS分析产物，显示在图1。该谱清楚地表明产物是过硫酸化的。

实施例3

用于麦芽三糖系列的氯乙酰建筑块A(方案1)的合成

在N’-Fmoc-1-N-甘氨酰胺麦芽三糖苷多硫酸盐中加入水和NaHCO₃(0.2g)并通过10M NaOH的加入调节至pH 12.5。Fmoc保护的产物随着pH的增加而完全溶解，之后形成沉淀。通过RP-IP HPLC的反应混合物的分析表明20分钟内完全脱保护。通过加入乙酸调节pH至8.5，用CHCl₃(3x 10mL)和己烷(1x 10mL)萃取水溶液。在水溶液中加入氯乙酰酐(0.5g)和NaHCO₃(1g)并且定时地通过加入NaHCO₃调节pH至8.25。1小时后，通过RP-IP HPLC的反应混合物的分析表明反应完成。首先通过加入2M HCl和5M NaCl使得最终浓度为约0.3MNaCl酸化该反应至pH 6，然后用AEX纯化产物。溶液加入5mLEcono-Q柱(Biorad，悉尼，澳大利亚)并用pH 7的10mM NaH₂PO₄/0.6M NaCl洗涤，用pH 7的10mM NaH₂PO₄/3M NaCl洗脱产物然后在4℃储存直至进一步使用。用RP-IP HPLC测定产物浓度，使用蔗糖八硫酸盐作为定量标准。

实施例4

用于麦芽三糖系列的建筑块C(方案1)的合成

通过加入NaHCO₃、以产生30％溶液的加入的异丙醇和10倍摩尔过量的选自上述的二硫醇1至5的二硫醇，将等份的氯乙酰建筑块A调节至pH 8.25。室温下搅拌溶液过夜。过量的二硫醇用CHCl₃(3x 10mL)和己烷(1x 10mL)萃取。比如，分析显示形成二硫化物时在上述的AEX纯化前1小时通过加入TCFP(固体)将其还原。用RP-IP HPLC测定纯化的产物，使用蔗糖八硫酸盐作为定量标准并在4℃储存直至进一步使用。使用这种方式，平行地合成5个二硫醇建筑块，其对应麦芽糖建筑块A与各个连接子的偶联。

实施例5

双麦芽三糖基多硫酸盐终产物的合成

将1.5摩尔过量的麦芽三糖建筑块A与每个麦芽三糖建筑块C混合，并且调节pH至9。溶液在室温下孵育2天。在这点残余的麦芽三糖建筑块C或二硫化产物都没有使用具有ELSD的RP-IP的分析进行检测。当几个小时后检测到二硫化物时，可以通过加入TCEP将其还原。如果需要，可以使用上述的AEX除去TCEP。在此情形下，将收集的馏分调节至pH 9，如果需要可以进一步加入建筑块A使得反应继续进行。

到了期望的终点，用等体积含15％乙腈的pH 6的15mM三丁基醋酸铵稀释反应并且用使用250mm x 10mm ID Exsil C18柱的RP-IPHPLC纯化产物。用溶液A(含15％乙腈的15mM三丁基醋酸铵pH 6)和溶液B(85％乙腈)的二元梯度混合物洗脱该柱。该梯度包含3分钟的10％B，到20分钟增加至50％，然后到22分钟90％其维持5分钟。流速是2.5mL/分。在254nm监测洗脱液并用自动取样器收集馏分。汇集含有期望产物的馏分，在离心蒸发仪中浓缩以除去大部分的乙腈然后冷冻干燥以提供蓬松的、白色粉末。

实施例6

各种D.P.的寡糖混合物可以作为给料。结合上疏水Fmoc保护基后通过制备型RP HPLC得到基于大小的该混合物的分馏。使用该模式，保留随着寡糖大小的增加而降低。通过糖基胺中间体结合Fmoc基。使用Py.SO₃复合物得到寡糖-Fmoc轭合物的硫酸盐化并使用制备型RP-IP HPLC从反应混合物中萃取产物。在一锅法中完成接下来的胺的脱保护和溴乙酰化并得到溴乙酰基衍生物。其与二硫醇2反应(过量)以生成终产物(X＝H或SO₃Na)：

操作过程中，在HPLC步骤使用的离子配对剂，三丁基胺是惰性的。通过制备型RP-IP HPLC纯化期望的产物。

方案2显示制备硫酸麦芽五糖-四乙烯糖基-硫酸麦芽五糖的合成路线的大纲，并描述如下。清楚起见，方案中仅描述了各个麦芽五糖链的一部分。

步骤：

1、麦芽-寡糖糖浆(如林原(Hayashibara)高麦芽五糖浆或玉米糖浆，50g)和NH₄HCO₃(6g)溶于25％氨水(375mL)中并在40℃下孵育40小时。旋转蒸发混合物至干，溶于最少量的水并再次蒸发干。将残余物溶解于最少量水中并混合加入3体积的乙醇。混合物允许放置过夜并轻轻倒出上清液。将残余物溶解于最少量水中并再次蒸发干以得到方案2中的胶状化合物2。

2、将Fmoc-gly-OH(11g)、羟基苯并三唑(HOBT，27.5g)、O-苯并三唑-N，N，N’，N’，-四甲基-脲-六氟-磷酸盐(HBTU，4.9g)和TEA(4.9mL)溶于120mL DMSO和30mL DMF的混合物中。得到的溶液加入到寡糖残余物中并搅拌混合物过夜。通过加入水(500mL)和冰醋酸(5mL)淬灭反应并允许冷却至室温。除去并丢弃形成的沉淀物。用乙酸乙酯(3x 100mL)和己烷(1x 100mL)洗涤溶液。使用旋转蒸发仪浓缩以除去水层溶液中残留的乙酸乙酯和己烷并通过加入水将溶液稀释至600mL。

3、通过重复注入使用制备型反相HPLC对混合物进行分馏。

示例性条件-

柱：配有保护柱(或合适的替代物)的Phenomenex Axia 100x 21.2mm Luna C18(2)。

洗脱剂A：0.1％甲酸。

洗脱剂B：80％乙腈。

流速：20ml/min。

检测器：270nm下的UV。

收集期望的馏分并在旋转蒸发仪中浓缩，并冻干所得溶液以得到约6g衍生自高麦芽五糖浆的麦芽五糖Fmoc衍生物(M₅gly-Fmoc)的白色粉末。图2显示HPLC洗脱情况。

4、将M₅gly-Fmoc(6g)溶于DMF(100ml)，加入Py.SO₃复合物(42g)并将所述溶液室温下搅拌过夜。通过加入水(500ml)淬灭反应并通过加入三丁胺调节至pH 6。通过重复注入使用制备型反相离子配对HPLC萃取硫酸化的M₅gly-Fmoc。

示例性条件-

洗脱剂A：于20％乙腈中的8mM三丁胺，用乙酸调节至pH 5.8。

洗脱剂B：80％乙腈。

流速：20ml/min。

检测器：270nm下的UV。

在旋转蒸发仪中浓缩期望的馏分以得到方案2的硫酸化化合物4的溶液(SM₅gly-Fmoc)。

5、使用NaOH调节pH＞13将SM₅gly-Fmoc脱保护并在室温下孵育15分钟。用2x 50mL己烷萃取ppt/油并丢弃。调节pH至8.25后在同一锅中将得到的胺溴乙酰化。以15分钟的间隔向该溶液加入3x 1.2g的等份的溴乙酰氯，并伴有持续的pH监测和Na₂CO₃的加入以维持pH 8-8.25。

反应的进程用分析型RP-IP HPLC进行监测

示例性条件-

柱：配有保护柱的Phenomenex Luna 30x 4.6mm C18(2)。

洗脱剂A：于20％乙腈中的8mM三丁胺，用乙酸调节至pH 5.8。

洗脱剂B：80％乙腈。

流速：1ml/min。

检测器：270nm下的UV和ELSD。

通过加入3体积的乙醇沉淀期望的溴乙酰衍生物并将混合物冷却至4℃。分离沉淀并重溶解于0.4M pH 7的AcONa并通过加入3体积的乙醇重新沉淀，并将混合物冷却至4℃。将对应方案2中化合物5的固体溶于最少量的水中并用上述的SEC进行测定，使用β-环糊精硫酸盐作为标准。

向含有来自方案2的约450mg化合物5的溶液中加入0.2MEDTA(200μl)、1M NaHCO₃(2ml)并调节至pH 8.75。加入异丙醇(3ml)和2，2’-氧联二乙硫醇(17μl)并在室温下搅拌混合物。30分钟后，再次加入17μl 2，2’-氧联二乙硫醇并搅拌溶液过夜。通过上述的RP-IP HPLC监测反应。用上述的分析型RP-IP HPLC进行监测反应。使用该技术还观察到一个溴乙酰轭合物与四乙基乙二醇的单个巯基缩合得到的瞬时中间体。

6、通过上述的制备型RP-IP HPLC纯化方案2的化合物7。通过旋转蒸发仪浓缩和冻干合适的馏分以除去过量的三丁基胺乙酸酯。

7、将残余物溶于水，用乙酸将得到的溶液调节至pH 5.5。将此溶液应用于Dowex 50WX8(Na⁺形式)2x 4cm的4x 2cm柱，并用三柱体积的水洗涤。收集流出物和洗液并汇集。

8、将汇集的洗液调节至pH 7，并通过用1kDa MWCO膜重复超滤来透析。

9、将浓缩的溶液冻干以得到白色粉末。

实施例7

通过选择上述实施例6中步骤3的合适馏分以相似方式制备不同D.P.的麦芽寡糖轭合物。

实施例8

通过选择上述实施例6步骤1中寡糖混合物的合适的纯寡糖馏分以及随后选择步骤3的合适馏分以相似方式制备其他寡糖轭合物。

实施例9

通过取代实施例6中步骤5的不同二硫醇化合物制备具有不同连接子的寡糖轭合物。

以相似方式，在实施例7和8的步骤中可以多样化二硫醇化合物。

实施例10

BIAcore筛选实验

使用表面等离子体共振的光学现象来监测分子之间的物理相互作用。使潜在蛋白配体(如IL-4、IL-5、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、IL-8、或MCP-1)的溶液经过偶联靶标(如肝素)的传感器表面监测蛋白配体与固定的靶标的实时结合。通过测量非常接近传感器表面的折射率变化来实现检测。当折射率改变时，等离子体共振的角度发生变化，并且此变化和与表面相互作用的蛋白的量直接相关。可以方便地使用BIAcore 2000。它非常灵敏，并且其微流体确保了仅需用少量材料。

将生物素化的肝素固定在生物传感器芯片上。生物素化是使用硫代-NHS-生物素，经由氨基或用氨通过还原性胺化修饰的还原性末端而发生的。将含有感兴趣的潜在蛋白配体的溶液注射到传感器芯片表面，并实时测量结合(Fernig，In：Proteoglycan protocols，Ed.R.V.Iozzo，Humana Press，Totowa，NJ，USA，2001)。杆状病毒表达重组人类IL-4(rhIL-4)和杆状病毒表达重组人类IL-5(rhIL-5)容易通过此方法结合于肝素(见PCT/AU2005/000551)。结合是特异性的，因为极少有缺乏肝素的传感器芯片与IL-4或IL-5相互作用。相似地，大肠杆菌中表达的重组人类嗜酸性粒细胞趋化因子-1(CCL11)容易结合于固定的肝素，并且结合是特异性的，因为极少有嗜酸性粒细胞趋化因子结合于缺乏肝素的传感器芯片(见30544601 PCT glycan151)。相似地，大肠杆菌中表达的重组人类IL-8(CXCL8)、MCP-1(CCL2)和嗜酸性粒细胞趋化因子-2(CCL24)容易结合于固定的肝素，并且结合是特异性的，因为极少有嗜酸性粒细胞趋化因子结合于缺乏肝素的传感器芯片。

各种硫酸化寡糖的阴离子寡糖轭合物的制备抑制IL-4、IL-5、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、IL-8与MCP-1同固定在BIAcore芯片上的肝素结合(表1和表2)。

下表显示的各个阴离子寡糖轭合物中，2个寡糖是相同的。这些化合物决不意味着将本发明的阴离子寡糖轭合物限制于那些具有等同寡糖成分S¹和S²的轭合物。在某些实施方案中，S¹和S²是不同的寡糖。类似地，事实是下表显示的寡糖的过硫酸化，决不意味着将本发明的阴离子寡糖轭合物限制于含有过硫酸化的那些寡糖。在某些实施方案中寡糖是部分硫酸化的，和/或含有磷酸官能团等。

下表中由Et1、Et2、Et3、Et4和Et5表示的连接子描述如下：

优选使用二硫醇1可形成连接子Et1，使用二硫醇2可形成连接子Et2，使用二硫醇3可形成连接子Et3，使用二硫醇4可形成连接子Et4以及使用二硫醇5可形成连接子Et5。

一些阴离子寡糖轭合物具有比其它更好的活性。从这些数据来看，具有最高活性的阴离子寡糖轭合物是那些连接的硫酸化麦芽糖系列，并且特别是连接的硫酸化麦芽五糖轭合物。虽然依赖于测试蛋白的结合活性也见于连接的硫酸化麦芽五糖，但是这种结合活性没有硫酸化麦芽五糖阴离子寡糖轭合物系列的大。包含硫酸化麦芽五糖结构的阴离子寡糖轭合物结合IL-8更好，因此抑制IL-8结合肝素要比包含硫酸化四糖结构的阴离子寡糖轭合物好。结合MCP-1的结构要求没有那么严格，因为含有阴离子寡糖轭合物的麦芽五糖和麦芽四糖两者结合大约相同。MCP-1还可以基于不同的糖类骨架结合轭合物，但比麦芽五糖系列差。MCP-1结合连接的硫酸化木聚糖比结合肝素稍好，并且显示在该系列中硫酸化木五糖阴离子寡糖轭合物通过更小连接子连接，例如Et1或Et3是优选的。

标记了嗜酸性粒细胞趋化因子-1和嗜酸性粒细胞趋化因子-2结合各种阴离子寡糖轭合物的能力。嗜酸性粒细胞趋化因子-1仅结合硫酸化的麦芽五糖系列，对于具有Et2和Et5连接子的阴离子寡糖轭合物其结合程度与肝素相同，但当阴离子寡糖轭合物含有Et4连接子(化合物ID 9)时结合比肝素好。相反，嗜酸性粒细胞趋化因子-2结合硫酸化的麦芽五糖系列显著好于具有Et5连接子的肝素其是稍微优选的。嗜酸性粒细胞趋化因子-2结合硫酸化的麦芽五糖系列也比肝素好，但在该系列中，对于具有短连接子(Et2连接子，化合物ID 12)的阴离子寡糖轭合物的结合比含长连接子的好(Et5连接子，化合物ID 15)。嗜酸性粒细胞趋化因子-2的确显示某些结合硫酸化连接的木聚糖系列的活性但其比结合肝素的程度要弱。

各个蛋白对于结合所需连接子长度的重要程度是不一样的。对于嗜酸性粒细胞趋化因子-2、MCP-1和IL-8，优选具有Et5连接子的硫酸化麦芽五糖(化合物ID 10)以获得最佳结合，而对于嗜酸性粒细胞趋化因子-1，优选具有Et4连接子的硫酸化麦芽五糖(化合物ID 9)。IL-4结合数据提示连接子的长度不是很重要，只要连接子不是太长，因为具有Et2连接子的硫酸化麦芽五糖(化合物ID 7)和具有Et4连接子的硫酸化麦芽五糖(化合物ID 9)之间没有差别，但是具有Et5连接子的硫酸化麦芽五糖具有降低的结合能力。相反，IL-5似乎需要具有Et4连接子的硫酸化麦芽五糖(化合物ID 9)以获得最佳结合。因此，化合物的效应根据其基本结构和涉及肝素结合的蛋白质而不同，并且筛选前哪一种阴离子寡糖轭合物将最有效是不明显的。

这些数据同样表明阴离子寡糖轭合物在肝素结合的位置结合IL-4，并且此阴离子寡糖轭合物对该区域的结合比肝素结合更稳定。这些数据同样表明阴离子寡糖轭合物在肝素结合的位置结合IL-5，并且此阴离子寡糖轭合物对该区域的结合比肝素结合更稳定。

表1：各种阴离子寡糖轭合物抑制趋化因子结合固定在BIAcore生物感应器表面的肝素的能力

阴离子寡糖轭合物数据用相对抑制50％趋化因子结合所需要的肝素浓度的a％来表示。肝素的百分数设定为100％。低于100％的值表明在结合趋化因子并且拮抗其与芯片上肝素的结合方面阴离子寡糖轭合物比肝素更好。相反地，高于100％的值表明抑制剂在拮抗趋化因子与芯片上肝素的结合方面比肝素差。

表2：各种阴离子寡糖轭合物抑制IL-4和IL-5结合固定在BIAcore生物感应器表面的肝素的能力

数据根据两种肝素的固定方法显示：生物素-肝素＝标记氨基的生物素；终点肝素＝还原终端的生物素酰化。^*计算相对于不存在阴离子寡糖轭合物时所得结合水平的存在各种阴离子寡糖轭合物时细胞因子结合的％，其具有对于ID1-15浓度为5μM、对于ID 66-74浓度为8μM、对于ID 75-84浓度为10μM的阴离子寡糖轭合物。

实施例11

阴离子寡糖轭合物在哮喘和变应性鼻炎蛋白靶标，IL-5上的功能分析

各种阴离子寡糖轭合物不同程度地抑制IL-5响应细胞系的增殖。这在非常低的剂量下发生，并且不是由于阴离子寡糖轭合物的毒性效应，因为其他相似的硫酸化多糖在此测试中没有效应。用IL-5响应细胞Ba/F-IL-5进行这些实验。所述Ba/F-IL-5细胞衍生自Ba/F3细胞系。

通过用pGL3对照载体(Promega，USA)和pEE6hcmv-IL-5Rα共转染Ba/F3细胞系，将其转化为IL-5依赖性同时表达萤光素酶。对照载体，pGL3在SV40启动子和增强子的直接控制下表达修饰的萤光素酶，但不含选择标记。为了制备pEE6hcmv-hIL-5Rα，通过RT PCR从HL60细胞克隆全长人类IL-5受体α链(hIL-5R-α)。Ba/F-IL-5细胞的制备已由Coombe等人，Journal of Immunological Methods 215：145-150，1998描述。Ba/F-IL-5细胞可通过用pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶共转染而进一步修饰，pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶是处于含有选择标记嘌呤霉素的SV40启动子控制之下的萤光素酶载体。

转染后，在3μg/mL嘌呤霉素中选择阳性转染子。然后克隆阳性转染子以产生具有可检测的萤光素酶表达的系。增殖测定在适合此类测定的96-孔微平板(Falcon)中进行。孔是平底的，具有白色侧面和透明的底部。清洗细胞以除去生长培养基中的任何细胞因子，然后将细胞重悬于RPMI/5％w/v FCS。用Coulter Z2颗粒计数器(Coulter Z2 ParticleCounter)和大小分析器(Size Analyzer)(Coulter Electronics，英国)对细胞进行计数，常规地向不含IL-5(阴性对照)或含有IL-5的不同稀释液的微平板孔中加入1.6x10⁴个细胞。当测量阴离子寡糖轭合物或其他硫酸化多糖的效应时，孔中还含有不同浓度的这些分子。

细胞在37℃下于湿润空气中增殖24小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 7.8、15mM MgSO₄、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM萤光素钠、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％v/v Triton X-100)测量萤光素酶活性。加入萤光素酶缓冲液之后，立即对平板进行萤光素酶活性测定。在Victor 1420多标记计数器(Multi-label counter)(Wallac，Turku，芬兰)上检测光的发射。使用此测定，已证明某些阴离子寡糖轭合物是IL-5依赖性Ba/F-IL-5细胞增殖的有效抑制剂而其他是差的有效性(表3)。

阴离子寡糖轭合物的多糖组分似乎对活性很重要。寡糖的大小和其基本构成似乎都重要。连接的五糖比连接的四糖是更有效的抑制剂，并且连接的五糖中，连接的硫酸化麦芽糖系列是最有效的但连接的硫酸化木聚五糖同样显示可观的活性，特别是在10μg/mL。在此测定中连接子的长度似乎没那么重要虽然可能连接子Et4和Et5是优选的。因此，最佳的连接的硫酸化麦芽五糖系列是ID 7-10以及最佳的连接的硫酸化木五糖系列是ID83和84，同时连接的硫酸化壳聚糖几乎没有活性。

表3：阴离子寡糖轭合物抑制IL-5依赖性细胞增殖的能力

实施例12

阴离子寡糖轭合物在哮喘靶标蛋白，IL-4上的功能分析

多种阴离子寡糖轭合物不同程度地抑制IL-4响应细胞系的增殖。这在非常低的剂量下发生，并且不是由于阴离子寡糖轭合物的毒性效应，因为其他相似的硫酸化多糖在相同浓度的IL-4和多糖下没有效应。这些实验利用TF-1.8细胞。TF-1.8细胞是TF-1细胞的亚克隆，其已进行了在IL-4或IL-5中生长的选择。TF-1细胞最初是从具有严重全血细胞减少症的雄性的骨髓样品确定的。这些细胞依赖于IL-3或GM-CSF进行长期生长，并且响应包括IL-4的多种细胞因子。

已用包含在表达载体，pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶中的萤火虫萤光素酶基因转染TF-1.8细胞(Coombe等，1998，同上)。克隆阳性转染子以产生具有良好萤光素酶表达的系。增殖测定在适合此类测定的96-孔微平板(Falcon)中进行。孔是平底的，具有白色侧面和透明的底部。洗涤细胞以除去生长培养基中的任何细胞因子，然后将细胞重悬于RPMI/5％w/v FCS。用Coulter Z2颗粒计数器和大小分析器(Coulter Electronics，英国)对细胞进行计数，常规地向不含IL-4(阴性对照)或含有IL-4的不同稀释液的微平板孔中加入2.5x10⁴个细胞。当测量阴离子寡糖轭合物或其他硫酸化多糖的效应时，孔中还含有不同浓度的这些分子。

细胞在37℃下于湿润空气中增殖48小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 7.8、15mM MgSO₄、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM萤光素钠、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％v/v Triton X-100)测量萤光素酶活性。加入萤光素酶缓冲液之后，立即对平板进行萤光素酶活性测定。在Victor 1420多标记计数器(Wallac，Turku，芬兰)上检测光的发射。

使用此测定，发明人证明某些阴离子寡糖轭合物显著地抑制IL-4依赖性TF-1.8细胞增殖而其他的活性较小(表4)。

阴离子寡糖轭合物的多糖组分似乎对活性是重要的。寡糖的大小和其基本构成似乎都重要。连接的五糖比连接的四糖是更有效的抑制剂，并且连接的五糖中，连接的硫酸化麦芽糖系列是最有效的但连接的硫酸化木聚五糖同样显示可观的活性。有趣的是，一些用小连接子(Et1和Et2)连接的硫酸化麦芽四糖阴离子寡糖轭合物显示与连接的硫酸化麦芽五糖相似的活性，但含更长连接子的连接的硫酸化麦芽四糖具有降低的活性。因此，显示优选麦芽糖骨架上存在连续的硫酸化残基，而不是陈列在被非硫酸化、非糖区域分隔的麦芽五糖骨架上的硫酸化的残基。具有最佳活性的阴离子寡糖轭合物是有化合物ID 6-10的那些。硫酸化连接的木聚糖系列中连接的五糖结构比连接的四糖更有活性，总之优选具有Et2和Et3大小连接子的那些连接的硫酸化五糖。

表4：阴离子寡糖轭合物抑制IL-4依赖性细胞增殖的能力

实施例13

阴离子寡糖轭合物在靶向GM-CSF或IL-2的细胞增殖上的功能分析

TF-1.8细胞衍生自响应于人类GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的TF-1细胞。TF-1.8细胞保留了TF-1细胞对GM-CSF的反应性。常规地向不含GM-CSF(阴性对照)或含有GM-CSF的不同稀释液的微平板孔中加入2.5x10⁴个细胞。将细胞在37℃下于湿润空气中培养48小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 7.8、15mMMgSO₄、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM萤光素钠、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％v/v Triton X-100)测量萤光素酶活性。加入萤光素酶缓冲液之后，立即对平板进行萤光素酶活性测定。在Victor 1420多标记计数器(Wallac，Turku，芬兰)上检测光的发射。当测量阴离子寡糖轭合物或其他硫酸化多糖的效应时，孔中还含有不同浓度的这些分子以及GM-CSF。这些实验表明，10μg/ml和1μg/ml浓度的阴离子寡糖轭合物可重现地对用0.025ng/ml GM-CSF获得的TF-1.8细胞增殖没有效应(表5)。

鼠细胞毒性T淋巴细胞系(CTLL)是衍生自C57bl/6小鼠的T细胞的亚克隆。这些细胞需要白介素-2(IL-2)用于生长，并用于测定IL-2在条件培养基中的存在。这些细胞响应鼠和人类两种IL-2。已用包含在表达载体，pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶中的萤火虫萤光素酶基因转染CTLL细胞(Coombe等，1998，同上)。克隆阳性转染子以产生具有良好萤光素酶表达的系，并将这些细胞称为CTL-Luc。增殖测定在适合此类测定的96-孔微平板(Falcon)中进行。孔是平底的，具有白色侧面和透明的底部。洗涤细胞以除去生长培养基中的任何细胞因子，然后将细胞重悬于RPMI/5％w/vFCS。用Coulter Z2颗粒计数器和大小分析器(Coulter Electronics，英国)对细胞进行计数，并常规地向不含重组人类IL-2(rhIL-2)(阴性对照)或含有rhIL-2的不同稀释液的微平板孔中加入1.6x10⁴个细胞。当测量阴离子寡糖轭合物或其他硫酸化多糖的效应时，孔中还含有不同浓度的这些分子。

CTL-Luc细胞在37℃下于湿润空气中增殖24小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 7.8、15mM MgSO₄、33.3mMDTT、0.1mM EDTA、0.5mM萤光素钠、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％v/v Triton X-100)测量萤光素酶活性。加入萤光素酶缓冲液之后，立即对平板进行萤光素酶活性测定。在Victor 1420多标记计数器(Wallac，Turku，芬兰)上检测光的发射。其中CTL-Luc细胞在10μg/ml或1μg/ml阴离子寡糖轭合物存在下培养的实验对用1.25ng/ml rhIL-2获得的CTL-Luc细胞增殖没有效应(表5)。用IL-2和GM-CSF响应细胞系进行的这些实验结果表明没有受试阴离子寡糖轭合物以影响这些细胞因子的增殖活性的方式与它们相互作用。实验结果还表明受试阴离子寡糖轭合物对细胞因子依赖性淋巴细胞系没有毒性。这些实验表明虽然本发明受试阴离子寡糖轭合物结合细胞因子，但这并不必须要求这些测试的阴离子寡糖轭合物具有任何的治疗潜能。相反地，与其它实施例中描述的靶蛋白的结合意味着本发明阴离子寡糖轭合物具有治疗潜能。

表5：各种阴离子寡糖轭合物抑制依赖人类GM-CSF或人类IL-2的细胞增殖的能力

明显的细胞增殖的微小刺激用负值表示。

实施例14

阴离子寡糖轭合物对COPD靶蛋白，人类白细胞弹性蛋白酶的功能分析

弹性蛋白酶是用于COPD治疗的潜在靶标的蛋白。弹性蛋白酶测定在96-孔塑料微平板中进行，以便于通过荧光平板读取仪定量。在存在或不存在硫酸化多糖下，将人类白细胞弹性蛋白酶(5nM/孔)与荧光底物MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-酰氨基-甲基香豆素(20μM/孔)在pH 7.4磷酸钠缓冲液中孵育。在通过加入10μl/孔250nM乙酸终止反应并将混合物转移至96-孔微平板、用355nm的激发波长和460nm的发射波长测量荧光之前，使混合物在37℃下孵育60分钟。使用各种浓度的抑制剂以允许计算抑制酶活性达50％所需的阴离子寡糖轭合物浓度(IC₅₀)。这些数据表明各种阴离子寡糖轭合物不同程度地抑制弹性蛋白酶活性，但含有用各种大小Et连接子连接的硫酸化壳五糖的结构是最有效的，其具有在此测定中IC₅₀在约32-70nM之间，其中含有最小连接子Et1和Et2的结构具有最好活性。因此，Et1连接的硫酸化壳五糖和Et2连接的硫酸化壳五糖具有32和34nM的IC₅₀。最好的连接的硫酸化麦芽五糖是ID 10，其具有48nM的IC₅₀。连接的木五糖系列不是特别有效地弹性蛋白酶活性抑制剂。在此测定中肝素具有约200nM的IC₅₀(表6)。

表6各种阴离子寡糖轭合物抑制人类白细胞弹性蛋白酶活性的能力

实施例15

阴离子寡糖轭合物对涉及与COPD相关炎症的趋化因子的功能分析

已知在介导与COPD相关的炎症中起重要作用的趋化因子包括IL-8、MCP-1和MIP-1α(Barnes 2004，同上)。各种阴离子寡糖轭合物显示阻断IL-8触发的细胞迁移。使用DMSO处理的人类早幼粒细胞HL-60细胞进行这些实验。这些细胞是衍生自具有急性早幼粒细胞性白血病的患者。在用于实验之前，将这些细胞用DMSO(1.2％)处理4天。趋化性测定在由底室组成的96-孔Costar趋化板中进行，向底室中加入人类IL-8(+/-抑制剂)，然后向顶室中加入在RPMI和1％v/v FCS中的细胞，并将平板在37℃孵育1小时，以让细胞从顶室运动至底部。在读取490nm下的吸光度之前，通过用AQUEOUS ONE(20μl/孔)标记1.75小时来定量迁移入底室的细胞的数量。IL-8以20ng/ml的终浓度使用，阴离子寡糖轭合物抑制剂使用的是10或50μg/mL，显示的％抑制数据是针对50μg/mL(表7)。

为了检查多种阴离子寡糖轭合物是否是趋化因子MCP-1的有效抑制剂，使用了人类单核细胞细胞系THP-1。这些细胞最初衍生自具有急性单核细胞的白血病的患者的外周血。测定与上文描述的非常相似，除了细胞在测定开始前，置于1％胎牛血清中20小时。趋化性测定在96-孔Costar趋化板中进行，向底室中加入人类MCP-1(+/-抑制剂)，然后向顶室中加入在RPMI/1％FCS中的THP-1细胞，并将平板在37℃孵育2.5小时，以让细胞从顶室运动至底部。在读取490nm下的吸光度之前，通过用AQUEOUS ONE(30μl/孔)标记3.5小时来定量迁移入底室的细胞的数量。MCP-1以10ng/mL的终浓度使用，各种阴离子寡糖轭合物抑制剂使用的是10或50μg/mL，显示的％抑制数据是针对50μg/mL(表7)。

使用DMSO处理的U937细胞检查响应MIP-1α的细胞迁移。U937细胞是最初衍生自具有组织细胞淋巴瘤的患者的胸腔积液的幼单核细胞人类细胞系。在用于趋化性实验之前，将这些细胞用DMSO(1.2％)处理4天。趋化性测定在96-孔Costar趋化板中进行，向底室中加入人类MIP-1α(+/-抑制剂)，向顶室中加入在RPMI/HEPES中的DMSO处理的U937细胞，并将平板在37℃孵育1.5小时，以让细胞从顶室运动至底部。在读取490nm下的吸光度之前，通过用AQUEOUS ONE(30μl/孔)标记1小时来定量迁移入底室的细胞的数量。MIP-1α以40ng/ml的终浓度使用，各种阴离子寡糖轭合物抑制剂使用的是10或50μg/mL，显示的％抑制数据是针对50μg/mL(表7)。

数据表明一组不同的阴离子寡糖轭合物抑制测试的各个趋化因子，并且不能明显推断哪些阴离子寡糖轭合物可以拮抗趋化因子的功能。MCP-1是能被阴离子寡糖轭合物拮抗其功能的最佳趋化因子，并且在这方面连接的硫酸化麦芽五糖系列特别有效。连接子的大小显示出没有轭合物中寡糖长度重要，因为连接的硫酸化麦芽三糖和各种连接的硫酸化麦芽四糖都是比寡糖是硫酸化麦芽五糖的相当的阴离子寡糖轭合物效果要差的抑制剂。其他具有良好抑制活性的阴离子寡糖轭合物是由短连接子(Et1)组成的连接的硫酸化木聚糖。显示木聚糖骨架上连续的硫酸盐的存在而没有硫酸盐中缺乏的延展对于活性是必需的，因此轭合物中各个单独寡糖的大小是次要的。

与MCP-1的情况相反，IL-8没有被连接的硫酸化麦芽糖系列有任何程度的抑制，但被连接的硫酸化木聚糖系列的阴离子寡糖轭合物拮抗(表7)。与MCP-1的情况类似，那些由短连接子(Et1)组成的连接的硫酸化木聚糖是最有效的抑制IL-8活性的抑制剂。因此，木聚糖骨架上连续的硫酸盐的存在而没有硫酸盐中缺乏的延展对于活性是必需的，并且轭合物中各个单独寡糖的大小是次要的。

很少的阴离子寡糖轭合物抑制MIP-1α的功能活性而那些抑制的轭合物活性非常的弱。最有效的阴离子寡糖轭合物由连接的硫酸化麦芽五糖组成。连接子的长度的重要性似乎比寡糖的长度要小(表7)。

表7：各种阴离子寡糖轭合物抑制参与COPD的细胞因子诱导的细胞迁移的能力

明显的细胞增殖的微小刺激用负值表示。

实施例16

两个阴离子寡糖轭合物在抑制变应性鼻炎动物模型的白细胞浸润中的功能分析

使用豚鼠的变应性鼻炎模型。豚鼠通过腹膜内注射含有100mgAl(OH)₃和2μg OVA的0.5ml盐水进行两次卵清蛋白(OVA)敏化(第0和7天)。最后一次敏化后三周，麻醉动物，通过向两侧鼻腔滴入20mg/ml的OVA溶液将鼻腔暴露于变应原。对于阴性对照，动物接受盐水敏化和攻击。在鼻内灌输OVA之前30min，用载体或药(阴离子寡糖轭合物或布地奈德)预处理动物。载体或药以25μl-50μl/鼻孔施用。包括了阴离子寡糖轭合物与作为参考化合物的布地奈德的比较。处死动物，并在诱发后八小时测量所有参数。

通过测量富含蛋白并且未筛分的血浆向鼻腔的渗漏来评估鼻黏膜屏障渗透性。血浆溢出量表示为总蛋白或清蛋白的鼻灌洗液水平。通过用磷酸盐缓冲盐水轻轻漂洗鼻腔来收集鼻灌洗液。将此液体中的细胞离心，重悬于磷酸盐缓冲盐水，并使用半自动血液学分析仪计数。细胞离心(cytospin)和用May Grynwald Giemsa染色之后，确定鼻灌洗液的细胞组成。

数据表明鼻腔的血浆溢出水平在用OVA鼻内攻击后8小时显著增加。两个阴离子寡糖轭合物显著降低了鼻灌洗液的蛋白含量，其表明用此药时血浆溢出的降低。测试的是Et2连接的硫酸化麦芽五糖(ID 7)和Et4连接的硫酸化麦芽五糖(ID 9)，这两者中前者最有效；当以5mg/kg浓度使用时，得到的抑制百分比分别是91.4％和51.5％。进入鼻灌洗液的白细胞浸润评估表明白细胞计数比用盐水敏化的动物观察到的增加，然而在测试的浓度下，该两个阴离子寡糖轭合物抑制白细胞浸润一个比另一个更有效(图3)。鼻灌洗液中最显著的白细胞是嗜酸性粒细胞，并有嗜中性粒细胞浸润的一些证据，其他细胞类型：嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和鼻上皮细胞的水平低，并且与用盐水敏化的动物所观察到的相比没有显著不同。接受糖皮质激素布地奈德的动物的鼻灌洗液中的血浆溢出显著降低，并且鼻灌洗液中总白细胞数量显著降低，降低最显著的是嗜酸性粒细胞的数量。阴离子寡糖轭合物相似地显著降低进入鼻灌洗液中的细胞浸润物。值得注意地，一个阴离子寡糖轭合物，ID 9(Et4连接的硫酸化麦芽五糖)特别有效，其不仅阻止嗜酸性粒细胞的浸润还阻止嗜中性粒细胞的浸润，而其他具有短的连接子的阴离子寡糖轭合物(Et2连接的麦芽五糖，ID 7)作用和糖皮质激素类似，只阻止嗜酸性粒细胞(图3)。

实施例17

阴离子寡糖轭合物在哮喘动物模型中的功能分析

使用哮喘的豚鼠模型。通过两次腹膜内注射含有20mg Al(OH)₃和20μg OVA的0.5ml盐水对豚鼠(9-10只/组)进行OVA敏化。在第0和7天进行敏化。最后一次敏化后三周，在吸入OVA(10mg/mL)6分钟前(变应原攻击)，动物用载体或药物预处理30分钟。对于阴性对照，动物接受盐水敏化和攻击或盐水敏化和OVA攻击。在刺激之后8小时处死动物并测定所有参数。以1mL/kg体重在OVA气管内攻击前30min气管内给予载体或药物。药物(阴离子寡糖轭合物和布地奈德)的载体是盐水。作为参考化合物的布地奈德以1mg/mL浓度溶解于载体。用气溶胶化的醋甲胆碱(3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL)引发支气管收缩来测量气道阻力(R_L)和肺顺应性(C_dyn)。使用基线读数和醋甲胆碱后获得的读数之间的差异计算C_dyn和R_L。测量肺功能之后立即进行支气管肺泡灌洗(BAL)。分析BAL的蛋白含量(作为渗漏量度)和白细胞数量，进行差异细胞计数以指示白细胞的何种亚群受药物的影响最大。

肺功能测量(表8)清楚表明阴离子寡糖轭合物ID 9(Et4连接的硫酸化麦芽五糖)抑制C_dyn和R_L两者的进展。阴离子寡糖轭合物ID 9在最高浓度将C_dyn和R_L恢复至接近阴性对照中观察到的水平，并且有证据显示阴离子寡糖轭合物ID 9存在剂量效应。阴离子寡糖轭合物的效应至少相当于参考化合物，糖皮质激素布地奈德(不考虑布地奈德2.5mg/kg 10MCh，因为该组的一只动物的读数超过10倍，这导致均值发生偏差)。因此，阴离子寡糖轭合物ID 9甚至在低浓度下使用时对豚鼠模型的肺功能测量依然显示有效。

表8：气道高反应性(AHR)总结-AHR数据表示为R_L从阳性对照的抑制％和C_dyn从阳性对照的增加％

数据针对两种不同醋甲胆碱浓度(10mg/mL和30mg/mL)进行显示。包括阳性对照的任意测试组在3mg/kg浓度的醋甲胆碱得到的数据相对于基线水平都没有显著性差异。变应性反应时R_L增加而弹性或C_dyn下降，因此表中给出的值中R_L是从阳性对照的降低％但C_dyn是从阳性对照的增加％。

^**在P＜0.01显著差异

^*在P＜0.05显著差异

甚至在0.1mg/kg，阴离子寡糖轭合物ID 9显著抑制源于抗原诱导的蛋白渗漏的升高的BAL中的蛋白含量(图4)。阴离子寡糖轭合物的效应与用布地奈德观察到的具有可比性。同样地，在0.1mg/kg阴离子寡糖轭合物ID 9或布地奈德预处理抑制了OVA诱导的白细胞流(分别为62％和76％的抑制)。用2.5mg/kg的阴离子寡糖轭合物ID 9预处理更有效地抑制了白细胞流(85％的抑制)，而2.5mg/kg的布地奈德没有显著地抑制白细胞流(图5)。BAL中白细胞的差异性细胞计数揭示相比阴性对照动物，OVA敏化和攻击的动物的嗜酸性粒细胞的数量明显更高，并且嗜酸性粒细胞是被抑制的主要的细胞类型(图6)。布地奈德和阴离子寡糖轭合物ID 9两者均显著抑制嗜酸性粒细胞流，抑制效应在80％至90％之间。阳性对照和阴性对照之间的嗜中性粒细胞数量没有明显差异，并且用任一种药物预处理都没有差别。同样地，阳性对照和阴性对照之间的嗜碱性粒细胞数量没有明显差异，并且用任一种药物预处理都没有差别(数据未显示)。对比阴性对照动物，OVA敏化和攻击的动物的BAL液中的巨噬细胞的数量明显更高。药物的预处理没有显著性降低巨噬细胞的水平，尽管某些处理趋向于产生降低的水平(数据未显示)。

总之，在变应性哮喘的豚鼠模型中，测试浓度的阴离子寡糖轭合物ID 9在抑制以下几方面至少具有与参考糖皮质激素布地奈德相同的有效性(1)BAL的蛋白含量，(2)气道高反应性，和(3)进入BAL的白细胞特别是嗜酸性粒细胞流。

实施例18

阴离子寡糖轭合物在COPD动物模型中的功能性分析

使用气肿的小鼠模型。小鼠急性和慢性暴露于香烟烟雾导致部分模拟COPD中观察到的炎性和结构变化的肺应答。在此模型中，雄性C57Bl/6J小鼠经受急性和慢性烟雾暴露，以正常室内空气为对照情形。在急性研究中，小鼠暴露于室内空气或五支香烟的烟雾(大约12mg焦油和0.9mg尼古丁)20分钟。在慢性研究中，小鼠暴露于室内空气或三支香烟的烟雾/天，5天/周，持续6个月。然后对4组小鼠进行进一步划分，以使每组内的小鼠也接受经吸入性路径的不同的阴离子寡糖轭合物。

在小鼠的急性暴露组中，在暴露于香烟烟雾之前30分钟给予阴离子寡糖轭合物。药物对急性暴露组中的小鼠的效力的评估包括评估烟雾暴露结束时支气管肺泡灌洗液(BALF)的trolox等效抗氧化能力。还检查了BALF的与炎性应答相关的细胞因子和趋化因子。在暴露4小时后和香烟烟雾暴露24小时后确定这些试剂的水平。测量了一系列细胞因子和趋化因子。这些包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、RANTES、MIP-1α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子(KC)、TNF-α和IFN-γ。还确定了BALF中细胞的差异细胞计数。此研究的结果表明，阴离子寡糖轭合物(ID 9)降低进入暴露于香烟烟雾动物的BALF中的细胞浸润物，特别是暴露于香烟烟雾并还接受阴离子寡糖轭合物的那些动物中嗜中性粒细胞的数量显著减少。

在实验过程中，慢性研究中的动物接受每天一次的阴离子寡糖轭合物(包括ID 9)。实验结束时，处死动物，用福尔马林(5％)气管内固定肺，并通过水置换测量肺体积。制备用于组织化学和免疫组织化学的肺组织，肺组织进行苏木精-伊红和/或高碘酸-Schiff染色或用巨噬细胞标志物Mac-3的抗体染色。还确定了肺组织中的锁链素水平。锁链素是弹性蛋白特异性亚氨基酸；用肺中锁链素的评估作为肺弹性蛋白含量的指标。锁链素含量的下降表明气肿性变化与蛋白水解和基质分解相关。此研究结果共同地表明阴离子寡糖轭合物特别是ID 9在此COPD模型中充当抗炎剂。

实施例19

阴离子寡糖轭合物在ARDS动物模型中的功能性分析

使用急性肺损伤和ARDS大鼠模型(Jansson，Lung，182：1-9，2004)。模型是基于这样的认识：共同病原体(例如细菌)中发现的内毒素可以导致临床上的ARDS、脓毒性休克和多器官功能障碍的发展。脂多糖(LPS)，一种革兰阴性菌的外细胞壁的成分，是内毒素的典型实例，并且将大鼠的呼吸道暴露于LPS可以作为急性肺部炎症和ARDS的模型。在该大鼠模型中LPS造成炎性细胞浸润的增加、炎性介质的生成和组织水肿，这些都是急性肺部炎症和ARDS的特征。

在该模型中麻醉Wister雌性大鼠并使用修饰过的套管气管内给予以包括5、50和500μg/mL浓度范围的溶解于盐水的LPS，体积为1mL/kg体重。动物接受和对照一样体积的盐水和操作。给予LPS 4和8小时后处死动物。接受阴离子寡糖轭合物的动物在给予LPS30分钟前气管滴注阴离子寡糖轭合物或盐水。使用的浓度是0.5mg/kg和2.5mg/kg。

通过Archimedes的原则测量离体肺气体容积(ELGV)，其是基于0cmH₂O的跨肺压的离体肺中捕获气体的稳定的量。用于ELGV测量的动物腹腔内注射0.1-0.2mL的戊巴比妥钠(50mg/kg)。打开胸腔并除去心脏后，暴露气管，用0-3缝合线结扎。得到肺并小心削减非肺组织。使用密度测定试剂盒(P3000，Mettler-Toledo GmbH，瑞典)以及任选的用于平衡的密度测定软件，其是基于每个浸于液体的固体失去重量的原理，并用g/cm³表示。系统设置为零以除去液体密度并平衡托座的重量、烧杯外组织重量和液体中的组织浮力。通过托座重量和液体中的肺浮力的差异测定ELGV。肺重量的增加意味着肺组织水肿。通过计算烧杯外肺组织重量和平衡托座重量的差异计算肺组织水肿的指征。通过肺重量(烧杯外肺组织重量和固定器重量的差异)和肺中的气体容积(ELGV)的比率来测定肺组织密度。

同样收集BAL液。测量ELGV后，左肺气管内灌洗2次3mLPBS的注射液。BAL液收集入冰上的塑料管中，1,000rpm，4℃离心10分钟。于-80℃储存上清液直至进一步的分析。重悬细胞颗粒状物于PBS中，以用于使用15-参数、半自动血液学分析仪(Sysmex F820，TOAMedical Eletronics Co.Kobe，日本)计数总的白细胞数。基于MayGrunwald Giemsa染色的细胞离心制备物计算细胞分化。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定BAL液中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1水平。

在该模型的阳性对照动物中，存在确切的证据表明随着LPS浓度的增加肺的重量增加。还存在证据表明促炎性细胞因子和趋化因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1)的产生和释放后有迅速的嗜中性粒细胞的募集。施用阴离子寡糖轭合物的动物的肺重量恢复至阴性对照的水平，嗜中性粒细胞的浸润水平显著下降，其是各种炎性介质的浓度。虽然炎性介质水平没有完全恢复至阴性对照的水平，显示阴离子寡糖轭合物特别是阴离子寡糖轭合物ID 9抑制嗜中性粒细胞的浸润。有可能LPS激活了肺黏膜和肺泡的固有巨噬细胞，使得它们分泌一部分这些炎性介质。然而，由于我们早期数据显示阴离子寡糖轭合物是这些介质生物学活性的有效抑制剂，有可能是拮抗这些趋化因子的生物学活性减少了嗜中性粒细胞的浸润以及进一步地这些细胞的介质释放。而且，当用阴离子寡糖轭合物处理动物时肺重量表明这些化合物是非常有效的水肿抑制剂。

实施例20

阴离子寡糖轭合物在过敏性反应动物模型中的功能性分析

豚鼠过敏性多年来一直被认为是经典的过敏性反应的实例，与其他种类(例如小鼠)相反，在吸入过敏原后完全缺乏过敏性应答。过敏性休克被认为是由于在吸入抗原至气道和肺后组胺的释放以及随后平滑肌的收缩。支气管肌肉组织的收缩完全关闭了肺泡并阻止气体的呼出，从而动物死于窒息。给予豚鼠足够高的以产生显著的晚期应答(即细胞嗜酸性粒细胞增多，晚期渗出)的过敏原剂量不可避免地同样产生前期强烈急性反应，所述反应非常强烈以致于某些动物可能死于急性气道收缩。

该模型中，通过腹膜内注射两次(第0和7天)含有100mg Al(OH)₃和2μg OVA的0.5ml盐水对豚鼠进行卵清蛋白(OVA)敏化。最后一次敏化后三周，麻醉动物，通过向两侧鼻腔(每鼻腔20μl)滴入2mg/ml的OVA溶液将鼻腔暴露于变应原。对于阴性对照，动物接受盐水敏化和攻击。在鼻内灌输OVA之前30min，用载体或药物(阴离子寡糖轭合物或布地奈德)预处理动物。载体或药以25μl-50μl/鼻孔施用。包括了阴离子寡糖轭合物与作为参考化合物的布地奈德的比较。在该研究中，0.65mg/kg的布地奈德在防止过敏性反应方面是无效的，70％的该组动物死于急性气道收缩。相反，阴离子寡糖轭合物，ID 9，以5mg/kg使用时在抑制过敏性反应方面比布地奈德(0.65mg/kg)有效两倍，只有35％的动物死亡(3/8)；类似地，当以5mg/kg使用时，阴离子寡糖轭合物，ID 7，也抑制过敏性反应，只有27％的动物死亡(3/11)，而相对于布地奈德70％的动物死亡。

还使用过敏性反应小鼠模型。使用新鲜的地面整粒花生作为抗原。通过在第0和第7天给每只小鼠灌胃5mg(等同于1mg花生蛋白)或25mg(等同于5mg花生蛋白)以及10μg霍乱毒素的方式对小鼠进行敏化。初期敏化三星期后，小鼠空腹过夜并给每只小鼠灌胃10mg花生粗提物，在30和40分钟间隔给药两次，对小鼠进行攻击。第一次攻击幸存的小鼠在第5周经受再攻击。第二次攻击前15分钟将溶解于PBS的药物(阴离子寡糖轭合物)静脉注射至尾静脉。霍乱毒素伪敏化小鼠和新生小鼠以相同方式攻击。为了监测血清IgE抗体应答，初始敏化后每周取一次尾静脉血液。使用ELISA测量花生特异性IgE的水平。使用下列评分系统评价第二次攻击给药后30至40分钟的过敏性症状：0，没有症状；1，瘙痒和揉搓鼻子和头部；2，眼睛和嘴巴周围肿胀、腹泻、毛发直立、减弱的活力，和/或呼吸频率增加的减弱活力；3，哮喘、吃力的呼吸、和嘴巴和尾部周围苍白；4，针刺或震动后无活力和痉挛；5，死亡。为了确定血浆组胺水平，第二次灌胃攻击后30分钟收集血液。使用酶学免疫试剂盒确定组胺水平。立即收集来自过敏性死亡后或攻击后40分钟幸存小鼠的耳朵样品，并进行检查，来评估系统性过敏性反应期间的肥大细胞脱粒。组织固定于10％中性缓冲的福尔马林，石蜡部分用甲苯胺蓝或Giemsa染色。脱粒的肥大细胞被定义为甲苯胺蓝或Giemsa阳性细胞，其于细胞外具有5或更多明显的染色颗粒。通过症状评分系统的评估，通过给予阴离子寡糖轭合物药物显著抑制了过敏性应答的严重程度，尽管花生特异性IgE水平表明动物对花生过敏原敏感。另外，接受阴离子寡糖轭合物药物的动物中组胺水平更低，提示这些药物清除组胺。

还使用非变应性过敏性反应(即不通过IgE调节，以前称为过敏性休克)猪模型。当肥大细胞和嗜碱性粒细胞通过不需要FcεRI的跨膜连接的过程直接激活时，发生非变应性过敏性反应(EI-Shanawany等，Clin.Exp.Immunol.153：1-9，2008)。实验学上，其可以通过静脉注射钙离子载体A23187诱导(Heflin等，Ann.Emergency Med.48：190-193，2006)。这种钙离子载体已知可以体外引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞的迅速脱粒。此模型中猪接受静脉注射A23187(5mg/kg)。给动物服用镇静药物然后进行麻醉并安置好动脉管路以便检测平均动脉压和放血。一开始，注射前，测量基线动脉压和脉搏并提取血样以获得基线组胺和类胰蛋白酶水平。低压和皮肤潮红的存在用于作为休克的临床决定因素，这些发生在注射后约1分钟。休克发作时(＞20％的平均动脉压下降)动物接受静脉注射生理盐水(40ml/kg)，或静脉注射苯海拉明(1mg/kg)加肾上腺素(0.01mg/kg)，或者阴离子寡糖轭合物药物ID 9或ID 7。监测到休克的逆转，确定转向基线花费的时间。使用ELISA方法确定组胺和类胰蛋白酶水平。数据表明注射A23187后组胺和类胰蛋白酶水平显著升高，平均动脉压显著降低。用阴离子寡糖轭合物药物治疗升高了动脉压，方式和苯海拉明和肾上腺素标准治疗大概相同，并且在所有治疗组中过敏性休克的逆转得到维持。

实施例21

阴离子寡糖轭合物对哮喘靶蛋白IL-13的功能性分析

各种阴离子寡糖轭合物不同程度地抑制IL-13应答细胞系的增殖。这在非常低的剂量下发生，并且不是由于阴离子寡糖轭合物的毒性效应，因为其他相似的硫酸化多糖在相同浓度的IL-13和多糖下没有效应。这些实验利用在GM-CSF下生长的TF-1细胞。TF-1最初是从具有严重全血细胞减少症的雄性的骨髓样品建立的。这些细胞依赖于IL-3或GM-CSF进行长期生长，并且响应多种细胞因子包括IL-13。

简要地，增殖试验在适合此类试验的96-孔微平板中进行。洗涤细胞以除去生长培养基中的任何细胞因子，然后将细胞重悬于RPMI/5％w/v FCS，并常规地向不含IL-13(阴性对照)或含有IL-13的不同稀释液的微平板孔中加入2.5x10⁴个细胞。当测量不同大小的硫酸化木聚糖的效应时，孔中还含有不同浓度的此分子并且IL-13的浓度保持在2.5ng/ml。细胞增殖48小时，之后通过用AQUEOUS ONE染料，20μl每孔染色3小时然后在490nm下读取吸光度来定量存在的细胞数。

阴离子寡糖轭合物的多糖组分似乎对活性很重要。寡糖的大小和其基本构成似乎都重要。连接的五糖比连接的四糖是更有效的抑制剂，并且连接的五糖中，连接的硫酸化麦芽糖系列是最有效的但连接的硫酸化木聚五糖同样显示一定活性。壳多糖系列的所有轭合物活性低，这表明这类骨架对于构建抑制IL-13的阴离子轭合物是无效的。有趣的是，用最小连接子(Et1)连接的硫酸化麦芽四糖阴离子寡糖轭合物显示与含Et1连接子的连接的硫酸化麦芽五糖相似的活性，但含更长连接子的连接的硫酸化的麦芽四糖活性降低。因此，看起来麦芽糖系列的紧密连接的硫酸化四糖对于活性是足够的，但紧密连接的三糖几乎没有活性。最佳的阴离子寡糖轭合物是含Et4连接子的麦芽糖系列，提示优选陈列在被非硫酸化、非糖区域分隔的麦芽五糖骨架上的硫酸化的残基。

表9：阴离子寡糖轭合物抑制IL-13依赖的细胞增殖的能力

整个说明书和下面的权利要求，除非上下文有其他要求，词语“包含”以及变化例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为暗示着包含所述整数或步骤或整数群或多个步骤，但不排除其他整数或步骤或整数群或多个步骤。

在本说明书中参考的任意前期公开出版物(或其衍生的信息)，或任意已知的事情，不是，并且不应当被看作是这样的承认或允许或任意形式的暗示：前期公开出版物(或其衍生的信息)、或已知的事情是该说明书相关领域的公知常识的一部分。

Claims

1.一种式(Ⅰ)的阴离子寡糖轭合物：

其中：

S¹和S²各自独立表示阴离子寡糖；

x₁表示从1至4的整数；

x₂表示从0至11的整数；

x₃表示从0至10的整数；

x₄表示0或1；和

x₅表示从1至4的整数。

2.根据权利要求1或权利要求2所述的阴离子寡糖轭合物，其中x₁和/或x₅是1或2。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的阴离子寡糖轭合物，其中x₁和/或x₅是2。

4.根据权利要求1至3任意一项所述的阴离子寡糖轭合物，其中x₂表示从0至4的整数。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的阴离子寡糖轭合物，其中x₃表示从2至6的整数。

6.根据权利要求1至5任意一项所述的阴离子寡糖轭合物，其中x₃是2。

7.根据权利要求1至6任意一项所述的阴离子寡糖轭合物，其中x₄是1。

8.根据权利要求1至7任意一项所述的阴离子寡糖轭合物，其中S¹和S²独立选自麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、木四糖、木五糖、壳四糖和壳五糖，其各自包含至少一个阴离子取代基。

9.制备根据权利要求1至8任意一项所述的式(Ⅰ)的阴离子寡糖的方法：

所述方法包括步骤：

a)将各个寡糖转化成阴离子寡糖；和

b)轭合寡糖；

其中步骤a)和b)可以以任一顺序进行。

10.根据权利要求1至8任意一项所述的式(Ⅰ)的阴离子寡糖在制备预防和/或治疗炎性呼吸疾病的药物中的用途，

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述炎症呼吸疾病选自以过敏性反应、哮喘、过敏性呼吸疾病、变应性鼻炎、气道高反应中的上皮下纤维化、慢性窦炎、反复的变应性鼻炎、囊性纤维变性患者的过敏性支气管肺曲霉病、COPD、ARDS/ALI、嗜酸性支气管炎、支气管扩张、支气管痉挛、支气管收缩、支气管高反应性、支气管过度生长和支气管炎症。

12.一种预防和/或治疗炎性呼吸疾病的方法，其包括给予需要其的主体治疗有效量的根据权利要求1至8任意一项所述的式(Ⅰ)的阴离子寡糖：

13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至8任意一项所述的阴离子寡糖以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

14.根据权利要求1至8任意一项所述的阴离子寡糖轭合物在测定或筛选中的用途。

15.确定一个或多个阴离子寡糖轭合物的生物活性的测定或筛选，所述测定包括步骤：

a)用一个或多个各自独立具有根据权利要求1至8任意一项所述的下式(Ⅰ)的阴离子寡糖轭合物接触配体、细胞或动物：

16.调节配体活性的方法，其包括用根据权利要求1至8任意一项所述的式(Ⅰ)的阴离子寡糖轭合物接触配体，

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述配体是肽、多肽或蛋白质、碳水化合物、脂类、糖蛋白或从天然产物或化学库筛选获得的分子。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中配体是结合于选自肝素、硫酸肝素、软骨素和透明质酸盐的葡萄糖胺聚糖的蛋白。

19.根据权利要求16至18任意一项所述的方法，其中所述蛋白选自组胺、细胞因子、干扰素、生长因子、酶、趋化因子或可溶性或细胞或病毒结合受体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞因子是白介素，其选自：如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15或包括IL-25的IL-17家族成员。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述干扰素选自α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述生长因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、KC、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH和胰岛素。

23.根据权利要求19所述的方法，其中所述酶选自超氧化歧化酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、类胰蛋白酶(包括β-类胰蛋白酶)、胃促胰酶、弹性蛋白酶、磷脂酶A2或前列腺素内过氧化物。

24.根据权利要求19所述的方法，其中所述趋化因子选自嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2或嗜酸性粒细胞趋化因子-3。

25.根据权利要求19所述的方法，其中所述可溶性或细胞或病毒结合受体是三磷酸肌醇受体。

26.根据权利要求16至25任意一项所述的方法，其中所述调节是抑制。