ES2627306T3 - Análogos de péptido y conjugados de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I), ENPVVHFFK91NIVTP96RTP (I) en la que K91 está sustituido con un aminoácido seleccionado de A, R, E, F e Y y P96 está sustituido con el aminoácido A, en la que dicho péptido está en forma lineal o cíclica.
Description
VIH-1 en células humanas [Tamilarasu et al., 2000], de α-amilasa, tripsina pancreática y como estabilizador de proteínas [Iwai, et al., 1999].
Además, ventajas de los análogos cíclicos con respecto a sus homólogos lineales incluyen: 5
- (i)
- los análogos cíclicos son moléculas más estables y así más resistentes a la degradación enzimática, una calidad que los hace candidatos atractivos como cabezas de serie de fármacos;
- (ii)
- es una etapa intermedia hacia el diseño racional y desarrollo de un fármaco no peptídico para administración por vía oral, que es el objetivo definitivo de este trabajo y tecnología; y
10 (iii) la conformación de los análogos cíclicos se fija en comparación con la flexibilidad conformacional que caracteriza a los homólogos lineales. La conformación activa de los potentes péptidos lineales, que son muy importantes para el desarrollo de fármacos adicionales, se ha identificado mediante SAR, RMN y estudios dinámicos combinados.
15 Hasta la fecha, esta es la primera vez que los análogos cíclicos de epítopes de MBP han sido sintetizados y se mostró que prevenían el desarrollo de EAE.
En una realización particularmente preferida de la invención, el péptido es de fórmula A, en la que los análogos de ciclo(83-99)MBP83-99 de extremo N a C (o cabeza a cola) están sustituidos en las posiciones 91 y/o 96 según la 20 fórmula (I) o (Ib), como se ha descrito anteriormente, que son los sitios de contacto de TCR.
Fórmula A
25 Análogos cíclicos de epítope de MBP83-99 humano que inducen y suprimen el desarrollo de EAE por MBP en ratas Lewis
El péptido MBP72-85 (25 µg) indujo una enfermedad monofásica aguda con una puntuación clínica pico en el día 13 después de la inyección inicial, seguido de recuperación completa en todos los animales en el día 18. La co30 inyección de [Arg91, Ala96]MBP87-99 (500 µg) con el potente péptido agonista MBP72-85 (25 µg) previno completamente el desarrollo de EAE. La modificación y ciclación adicionales produjeron dos péptidos cíclicos antagonistas. La cadena lateral de Lys y el análogo cíclico unido a la amida del extremo C, ciclo(91-99)[Ala96]MBP87-99 (Val-His-PhePhe-Lys91-Asn-Ile-Val-Thr-Ala96-Arg-Thr-Pro99) tuvieron baja actividad inhibitoria en el sistema de EAE, mientras que el análogo cíclico unido a la amida, ciclo(87-99)[Arg91, Ala96]MBP87-99 fue un fuerte inhibidor de EAE cuando se co
35 administró con MBP72-85. La co-inyección de cualquier análogo cíclico (500 µg) con MBP72-85 (25 µg) no inhibió la actividad de EAE. Sin embargo, todos los análogos cíclicos, excepto ciclo(1-5)Phe1-Ala-Arg-Gln-Acp5, produjeron el retraso de la aparición de EAE (del día 13 al día 15), pero no su gravedad.
Análogos cíclicos del epítope de MBP83-99 humano como tratamiento preventivo experimental en EAE por MOG en 40 ratones C57BL/6.
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La inyección de MOG35-55 lineal en ratones C57BL/6 produce una enfermedad crónica con una única recaída al principio de la enfermedad (fase aguda), seguida de una remisión incompleta que conduce a fase crónica con una enfermedad residual. Esta EAE crónica se produce mediante la inyección de 600 µg de MOG35-55, administrada en 2 dosis de 300 µg cada una y separada 2 días. La co-inyección del péptido MBP83-99 cíclico en la inducción de enfermedad a la relación 1:1 parece ofrecer un leve beneficio preventivo, que no siempre es constante y depende del tamaño de muestra estadístico y la varianza. Por otra parte, la histopatología revela que MBP83-99 cíclico está reduciendo algunos de los efectos histopatológicos básicos que son responsables del cuadro clínico de los animales.
Análogos de MBP87-99
Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de fórmula (IIb)
VHFFK91NIVTP96RTP (IIa)
en la que K91 está sustituido con el aminoácido A y P96 está sustituido con el aminoácido A, en la que dicho péptido está ciclado cabeza a cola.
En una realización altamente preferida, el péptido de fórmula (IIa) consiste en la secuencia VHFFANIVTARTP ciclada cabeza a cola, es decir, ciclación entre los restos 87-99.
CONJUGADOS
Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado que comprende un péptido como se ha descrito anteriormente y manano. El manano (oxidado o reducido) puede unirse en cualquier sitio adecuado sobre el péptido. El conjugado puede contener más de un resto de manano y más de un péptido según la invención (cada uno de los cuales puede ser igual o diferente).
Preferentemente, el manano es manano reducido.
Así, en una realización preferida, la invención se refiere a un péptido como se ha descrito anteriormente conjugado con manano reducido.
Se ha usado manano como un vehículo satisfactorio para dirigir péptidos al receptor de manosa de macrófagos/células dendríticas. Tras la unión, se genera la presentación de clase I de MHC o de clase II de MHC de péptidos, estimulando tanto respuestas inmunitarias CTL/Ab como Th1/Th2. Resultados preliminares sugieren que las conjugaciones de manano reducido con péptidos antagonistas/agonistas cíclicos son más potentes que los análogos cíclicos solos. Están haciéndose investigaciones adicionales para medir citocinas y linfocitos T después de la inmunización de conjugados de manano oxidado/reducido con análogos de MBP cíclicos.
Las citocinas Th1 liberadas después de la administración terapéutica están asociadas a exacerbación de EM. Sin embargo, las citocinas Th2 (tales como IL-4 e IL-10) tienen propiedades antiinflamatorias y regulan por disminución respuestas Th1. Se ha investigado ampliamente el manano para su capacidad para generar respuestas en varios sistemas modelo. Se ha mostrado que su función de adyuvante procede de su capacidad para dirigir el receptor de manosa sobre células presentadoras de antígenos. Ratones inmunizados con la proteína MUC1 de manano se protegen contra una exposición a tumor que expresa MUC1, además de revertir tumores establecidos en ratones. Se observaron resultados similares en ratones transgénicos MUC1. Tanto una respuesta Th1 (IL-2, IFN-γ, IL-12, TNF- y anticuerpos IgG2a) como respuesta Th2 (no IFN-γ o IL-12, pero cantidades significativas de IL-4, IL-10 y TGF- y anticuerpos IgG1), dependiendo del modo de conjugación, y el manano oxidado/reducido respectivamente. Otras citocinas, IL-5, IL-6, IL-13, IL-15 e IL-18 también han sido medidas con tanto inmunógenos de manano oxidado como reducido. Además de respuestas de tipo Th1/Th2 a MUC1 en ratones, se han demostrado respuestas similares en seres humanos y monos con proteína MUC1 y a un péptido MSP-1 de Anaplasma marginale en vacas. El uso de manano reducido para desviar además respuestas inmunitarias a Th2 cuando se conjuga con péptidos MBP constituye una estrategia novedosa para la inmunoterapia de la enfermedad.
Los presentes solicitantes han demostrado que los análogos de péptido MBP83-99 mutados conjugados con manano reducido desvían las respuestas inmunitarias de Th1 a Th2 en ratones SJL/J y generan anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con la proteína MBP nativa. Los péptidos [A91]MBP83-99, [E91]MBP83-99 y [Y91]MBP83-99 dieron el mejor perfil de reactividad de citocinas y anticuerpos, siendo [Y91]MBP83-99 el más prometedor como péptido terapéutico contra EM.
Como se usa en el presente documento, "desviar respuestas inmunitarias de Th1 a Th2" significa un aumento de la producción de al menos una de las citocinas de tipo Th2, que incluyen, sin limitación, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL13 y/o una disminución de la producción de al menos una de las citocinas de tipo Th1, que incluyen, sin limitación, IL-2, TNFα e IFNγ, en comparación con los niveles de estas citocinas antes de la administración de péptido/conjugado, es decir, en ausencia del tratamiento.
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Fórmula C
En una realización particularmente preferida de la invención, el conjugado es de fórmula D, en la que un péptido ciclo(83-99)N4BP83-99 está opcionalmente sustituido en las posiciones 91 y/o 96 y se conjuga con manano en su forma oxidada.
10 Fórmula D
APLICACIONES TERAPÉUTICAS
Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido o conjugado como se ha descrito anteriormente para su uso en
15 medicina.
Otro aspecto más se refiere al uso de un péptido o conjugado de la invención en la preparación de un medicamento
para tratar un trastorno inmunitario.
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En una realización preferida, el trastorno inmunitario es una enfermedad autoinmunitaria.
En una realización particularmente preferida, el trastorno es esclerosis múltiple (EM).
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante autoinmunitaria mediada principalmente por linfocitos T CD4+ del subconjunto Th1. Autoantígenos candidatos incluyen constituyentes de la vaina de mielina proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) y glucoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG). Modernos enfoques hacia el tratamiento terapéutico de EM implican el diseño y uso de análogos de péptido de epítopes de mielina asociados a enfermedad para inducir la tolerancia de linfocitos T periféricos. La presente invención proporciona varios ligandos de péptido alterados mutando los restos de contacto de TCR principales basados en el epítope de MBP83-99. Experimentos por el solicitante han demostrado que los análogos de péptido MBP83-99 mutados conjugados con manano reducido desvían inesperadamente las respuestas inmunitarias de Th1 a Th2 en ratones SJL/J y generan anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con la proteína MBP nativa. Los péptidos [A91]MBP83-99, [E91]MBP83-99 y [Y91]MBP83-99 dieron el mejor perfil de reactividad de citocinas y anticuerpos, siendo [Y91]MBP83-99 el más prometedor como péptido terapéutico contra EM.
Además, análogos de MBP83-99 cíclicos suprimieron EAE crónica inducida por el MOG35-55 lineal y también la inmunización con conjugados de MBP83-99 lineal-KLH-manano reducido previno la inducción de EAE.
En otra realización preferida, el trastorno es encefalomielitis autoinmune experimental (EAE).
Los estudios de estructura-actividad basados en el epítope MBP83-99 humano [Vergeli, et al 1996, Brocke, et al. 1996] (Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro) produjeron análogos lineales y cíclicos, concretamente [Arg91,Ala96]MBP87-99 (Val-His-Phe-Phe-Arg91-Asn-Ile-Val-Thr-Ala96-Arg-Thr-Pro) y ciclo(8799)[Arg91,Ala96]MBP87-99 (Val87-His-Phe-Phe-Arg91-Asn-Ile-Val-Thr-Ala96-Arg-Thr-Pro99) que previnieron completamente la inducción de EAE cuando se co-inyectaron a ratas Lewis junto con el agonista encefalitogénico MBP72-85. El bloqueo de EAE inducida por MBP72-85 por los péptidos no relacionados previos podría indicar que el mecanismo de inhibición no es debido a la competición por unión, sino debido a la administración de una señal negativa por el antagonista que vence la respuesta del agonista posiblemente mediante la activación de linfocitos T reguladores específicos de antígeno.
Preferentemente, el péptido o conjugado va a administrarse en una cantidad suficiente para producir la supresión de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) crónica inducida por MOG35-55.
Preferentemente, el péptido o conjugado va a administrarse en una cantidad suficiente para modular inversamente las respuestas Th1 y Th2 de linfocitos en un sujeto para aumentar la respuesta Th2 y disminuir la respuesta Th1, respectivamente, por encima y por debajo de los niveles que prevalecen sin dicho tratamiento.
Ensayos inmunológicos para medir respuestas de linfocitos T específicas a antígenos pueden llevarse a cabo por análisis ELISpot para detectar la secreción de citocinas específicas tales como IFN-γ, IL-4 o IL-10. Más detalles de estos ensayos pueden encontrarse en la sección de Ejemplos adjunta.
Preferentemente, el péptido o conjugado va a administrarse en una cantidad suficiente para potenciar/inducir la respuesta de tipo Th2 en un sujeto, en comparación con la respuesta de tipo Th2 antes de la administración de péptido/conjugado (es decir, en ausencia de tratamiento) y reducir la respuesta de tipo Th1 en comparación con la respuesta de tipo Th1 antes de la administración de péptido/conjugado.
Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido o conjugado como se ha descrito anteriormente para su uso en desviar la respuesta inmunitaria en un sujeto de una respuesta Th1 a una respuesta Th2.
En una realización, el péptido o conjugado inhibe selectivamente la respuesta inmunitaria Th1 con respecto a la respuesta inmunitaria Th2 en un sujeto.
En una realización, el péptido o conjugado aumenta selectivamente la respuesta inmunitaria Th2 en un sujeto con respecto a la respuesta inmunitaria Th1.
En una realización, el péptido o conjugado reduce selectivamente la respuesta Th1 de linfocitos en un sujeto con respecto a la respuesta Th2 de linfocitos.
Otro aspecto más se refiere a un péptido o conjugado como se ha descrito anteriormente para su uso en inducir una respuesta inmunitaria específica de Th2 en un sujeto.
En una realización, el péptido o conjugado reduce el nivel de IFNγ en un sujeto.
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de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
SALES/ÉSTERES
Los péptidos/conjugados de la invención pueden estar presentes como sales o ésteres, en particular sales o ésteres farmacéuticamente aceptables.
Sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos/conjugados de la invención incluyen sales de adición de ácido
o de base adecuadas de los mismos. Una revisión de sales farmacéuticas adecuadas puede encontrarse en Berge et al., J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Las sales se forman, por ejemplo con ácidos inorgánicos fuertes tales como ácidos minerales, por ejemplo ácido sulfúrico, ácido fosfórico o hidrácidos; con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con halógeno), tales como ácido acético; con ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, por ejemplo oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tetraftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos alquil (C1-C4)-o aril-sulfónicos que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con un halógeno) tales como ácido metano-o p-toluenosulfónico.
Los ésteres se forman tanto usando ácidos orgánicos como alcoholes/hidróxidos, dependiendo del grupo funcional que se esterifique. Ácidos orgánicos incluyen ácidos carboxílicos, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 12 átomos de carbono que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con halógeno), tales como ácido acético; con ácido dicarboxílico saturado o insaturado, por ejemplo oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tetraftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos alquil (C1-C4)-o aril-sulfónicos que están sin sustituir o sustituidos (por ejemplo, con un halógeno) tales como ácido metano-o p-toluenosulfónico. Hidróxidos adecuados incluyen hidróxidos inorgánicos, tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio. Alcoholes incluyen alcanoalcoholes de 1-12 átomos de carbono que pueden estar sin sustituir o sustituidos, por ejemplo con un halógeno).
ENANTIÓMEROS/TAUTÓMEROS
En todos los aspectos de la presente invención previamente tratados, la invención incluye, cuando corresponda, todos los enantiómeros y tautómeros de los péptidos/conjugados. El experto en la materia reconocerá compuestos que poseen propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales) o características tautoméricas. Los enantiómeros y/o tautómeros correspondientes pueden aislarse/prepararse por métodos conocidos en la técnica.
ESTEREOISÓMEROS E ISÓMEROS GEOMÉTRICOS
Algunos de los péptidos/conjugados de la invención pueden existir como estereoisómeros y/o isómeros geométricos -por ejemplo, pueden poseer uno o más centros asimétricos y/o geométricos y así pueden existir en dos o más formas estereoisoméricas y/o geométricas. La presente invención contempla el uso de todos los estereoisómeros e isómeros geométricos individuales, y mezclas de los mismos. Los términos usados en las reivindicaciones engloban estas formas, siempre que dichas formas retengan la actividad funcional apropiada (aunque no necesariamente al mismo grado).
La presente invención también incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas de los péptidos/conjugados o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Una variación isotópica se define como una en la que al menos un átomo está sustituido con un átomo que tiene el mismo número atómico, pero una masa atómica diferente de la masa atómica normalmente encontrada en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los péptidos/conjugados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. Ciertas variaciones isotópicas de los péptidos/conjugados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, por ejemplo, aquellas en las que se incorpora un isótopo radiactivo tal como 3H o 14C, son útiles en los estudios de distribución en tejido de fármaco y/o sustrato. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y carbon-14, es decir, 14C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos tales como deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de la mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, elevada semivida in vivo o requisitos de dosificación reducidos y, por tanto, puede preferirse en algunas circunstancias. Las variaciones isotópicas de los péptidos/conjugados de la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos de la presente invención pueden generalmente prepararse mediante procedimientos convencionales usando variaciones isotópicas apropiadas de reactivos adecuadas.
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inducción de enfermedad y el segundo experimento evaluó la evolución clínica crónica de la enfermedad y así los animales se sacrificaron en el día 46 después de la inducción de la enfermedad.
Recogida de tejido -Histopatología
5 En el día 17 (fase aguda de EAE) y día 46 después de la inducción de EAE (fase crónica de EAE), los animales se sometieron a perfusión transcardíaca con 4 % de paraformaldehído en PBS. Se extrajeron los cerebros y médulas espinales, posteriormente se fijaron en el mismo fijador durante aproximadamente 20 horas, se procesaron rutinariamente para la incorporación de parafina y se seccionaron a 6 µm. Entonces se tiñeron secciones de animales de fases agudas y crónicas de la enfermedad usando los siguientes métodos: a) un método de tinción de la impregnación de plata de Bielschowsky modificado combinado con hematoxilina, para la evaluación simultánea de lesión axónica, pérdida axónica y procesos inflamatorios en EAE como se ha descrito previamente en detalle [Lourbopoulos et, al., 2007]; b) la tinción con Luxol fast blue se contratiñó con Nuclear fast Red para la detección de áreas desmielinizantes dentro del SNC de animales, usando protocolos histopatológicos rutinarios.
15 Se realizó evaluación patológica bajo un microscopio óptico (Olympus Axioplan-2) por dos investigadores cegados y se tomaron fotos usando una cámara CCD (Nikon). Se evaluaron cinco secciones longitudinales aleatoriamente seleccionadas por tejido (cerebros y médulas espinales) del siguiente modo: para cada animal, cada sección se evaluó bajo campos ópticos 20x o 40x (dependiendo del objeto del estudio) de manera que cubriera el área entera de la sección. El estudio inicial de patología reveló que las médulas espinales tenían la mayoría de las lesiones (en comparación con los cerebros) y así el estudio detallado adicional se centró en las secciones de médula espinal de los animales.
Dependiendo del objeto de interés se usaron las siguientes escalas para realizar la evaluación: (a) Para lesión
25 axónica (AI), se usó la siguiente escala: 0 = son AI, 1+ = axones lesionados distróficos dispersados sin ningún esferoide u ovoide, 2+ = AI leve con presencia de al menos un esferoide u ovoide, 3+ = AI moderada, 4+ = AI grave; generalmente se definieron axones lesionados y se identificaron con esferoides y ovoides (que representan axonotmesis) y axones dilatados (distróficos) que representan axones lesionados que todavía no están cortados. (b) Para pérdida axónica (AL): 0 = densidad axónica normal, 1+ = <25 de % AL, 2+ = AL leve (26-50 %), 3+ = AL de moderada a grave (51-75 %), 4+ = AL grave (>75 %); se atribuyeron diversos grados de densidad reducida de axones a pérdida axónica y se evaluaron por consiguiente. (c) Para infiltraciones: número de células infiltrantes por campo óptico y número de células infiltrantes por infiltración. (d) Se evaluó la desmielinización bajo campos ópticos 40x; usando una rejilla prefrontal, los presentes inventores midieron el área de desmielinización y el área total de la materia blanca en cada campo óptico y entonces se restó el % de desmielinización presente en cada campo óptico.
35 Análisis estadístico
Se realizó el análisis estadístico de los datos usando el software SPSS 11.5. Para modificar la escala de datos clínicos, histopatológicos y de proliferación in vitro los presentes inventores probaron inicialmente su normalidad usando pruebas de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov con el fin de evaluar su validez para la aplicación de la prueba de la t de Student. Dondequiera que se encontraran datos que violaban la suposición de normalidad y no pudiera aplicarse una transformación logarítmica, los presentes inventores usaron la prueba de la U de Mann-Whitney equivalente no paramétrica para la comparación de los dos grupos (tratado y control en cada EAE). Los valores dentro del texto se expresan como media ± DE. Para datos nominales u ordinales se usó una prueba de la
45 chi al cuadrado de Pearson o exacta de Fisher para la comparación de los dos grupos, dependiendo de las propiedades de las tablas. Se realizó análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en la evolución clínica de EAE con "aparición de enfermedad" como el criterio de valoración del análisis; la aparición de enfermedad se definió como el primer día con puntuación clínica de "1". Se calculó la puntuación máxima media (MMS) para cada grupo usando las puntuaciones máximas de cada animal de cada grupo. Se calculó el área bajo la curva (ABC) para cada animal usando la fórmula:
k1 i
puntuación1
puntuación1 puntuaciónk
imagen17 imagen18 imagen19 imagen20
ABC
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2
[Fleming, et. al., 2005]
55 Resultados
Respuestas de linfocitos T a péptidos MBP83-99 lineales y cíclicos conjugados con manano reducido
Se midió la capacidad de péptidos MBP83-99, [A91]MBP83-99, [E91]MBP83-99, [F91]MBP83-99, [Y91]MBP83-99, [R91,A96]MBP83-99 lineales, ciclo(83-99)MBP83-99 y ciclo(83-99)[A91]MBP83-99 conjugados con manano reducido, para inducir respuestas de linfocitos T después de 2 inyecciones usando secreción de citocinas IFN-γ e IL-4 por análisis de ELISpot. Ratones inmunizados con lineal y ciclo(83-99)MBP83-99 y [F91]MBP83-99 lineal generaron linfocitos T que secretan IFN-γ débiles; todos los otros péptidos fueron negativos (Figura 3). Sin embargo, se indujeron altos niveles
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Claims (1)
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