KR20220126655A

KR20220126655A - 저용량 날트렉손을 함유하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR20220126655A
Application number: KR1020220028995A
Authority: KR
Inventors: 김주희; 이마세; 김동훈
Original assignee: (주)인벤티지랩
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2022-09-16

Abstract

날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 이에 따르면, 자가면역질환을 1회 투여로 장기지속적으로 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

Description

저용량 날트렉손을 함유하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제 및 이를 이용한 방법{Sustained formulation for prevention or treatment of autoimmune disease containing low-dose naltrexone and method using the same}

저용량 날트렉손을 함유하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제 및 이를 이용한 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

날트렉손(naltrexone)은 오피오이드 수용체(opioid receptor)의 경쟁적 저해제로서, 모르핀과 유사한 화학구조를 가지고 있다. 날트렉손은 1984년에 미국 FDA에서 승인된 이래 알콜 중독 또는 오피오이드 중독 치료용으로 사용되고 있고, 날트렉손과 부프로피온의 복합체는 비만 치료용으로 사용되고 있다. 최근에는 저용량 날트렉손(low dose naltrexone; LDN)이 다른 질병에 대해서도 유용한 효과를 가진다는 점이 제안되고 있으나 명확한 치료 효과는 확인되지 않았으며, 이를 확인할 수 있는 제제적 수단도 알려진 바가 없다.

날트렉손 제제는 주로 경구투여용 정제이고, 근육주사용 주사제 또는 피하 임플란트로도 제공된다. 최근에는 다양한 약물을 포함하는 지속 방출형 마이크로입자 및 이의 제조방법에 대해 개발된 바 있다(한국특허공개 10-2020-0044977(2020.04.29)). 그러나, 저용량 날트렉손을 3주에서 1년 이상 장기적으로 방출하는 제형은 개발된 바 없고, 저용량 날트렉손 비경구 서방성 제제가 자가면역질환과 같은 질병의 치료에 효과가 있는지도 확인된 바가 없다.

따라서, 환자의 편의를 향상시키기 위해, 날트렉손의 약효를 장기지속시킬 수 있는 저용량 날트렉손 서방성 제제를 개발하고, 저용량 날트렉손 서방성 제제의 질병 치료 효능을 확인할 필요가 있다.

저용량 날트렉손(naltrexone)을 함유하는 자가면역질환 예방 및 치료용 서방성 제제를 제공한다.

저용량 날트렉손을 함유하는 서방성 제제를 사용하여 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제를 제공한다.

본 발명은 날트렉손을 함유하는 비경구 서방성 제제가 자가면역질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다는 점을 실험을 통해 최초로 확인하였으며, 날트렉손을 함유하는 비경구 서방성 제제가 날트렉손을 함유하는 경구제에 비해 현저하게 우수한 자가면역질환 예방 또는 치료 효과를 나타낸다는 점을 확인하였다.

본 발명의 날트렉손(naltrexone)은 N-시클로프로필-메틸노르옥시모르폰(N-Cyclopropyl-methylnoroxymorphone), N-시클로프로필메틸-14-히드록시디히드로-모르피논(N-Cyclopropylmethyl-14-hydroxydihydro-morphinone), 17-(시클로프로필메틸)-4,5알파-에폭시-3,14-디히드록시모르피난-6-온(17-(Cyclopropylmethyl)-4,5α-epoxy-3,14-dihydroxymorphinan-6-one), EN-1639A, 또는 UM-792로도 불릴 수 있다.

본 발명에서 날트렉손은 하기 화학식으로 나타내는 화합물일 수 있다:

.

본 발명에서 날트렉손은 날트렉손의 용매화물, 입체이성질체, 프로드러그(prodrug), 대사체(예, 6β-naltrexol), 또는 유도체(예, naloxone)일 수 있다. 상기 입체이성질체(stereoisomer)는 분자식 및 구성원자의 연결 방법도 같으나 원자 사이의 공간적 배치가 다른 것을 말한다. 상기 용매화물(solvate)는 유기 또는 무기 용매에 용매화된 화합물을 말한다. 상기 용매화물은 예를 들어, 수화물이다. 상기 입체이성질체는 부분입체 이성질체(diastereomer) 또는 거울상 이성질체(enantiomer)일 수 있다. 상기 프로드러그는 화합물을 투여한 후 생체 내에서 표적 화합물로 변화되는 화합물일 수 있다. 상기 대사체는 화합물이 생체 내 대사과정을 통해 생성된 화합물일 수 있다. 상기 유도체(derivative)는 날트렉손의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.

본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 염"의 용어 "염"은 화합물의 무기산염, 유기산염, 또는 금속염의 부가염을 말한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 또는 이황산염일 수 있다. 상기 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 아스파르트산염일 수 있다. 상기 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 또는 칼륨염일 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 아세트산염 또는 염산염이다.

본 발명에서 생분해성 고분자는 폴리락티드, 폴리락트산, 폴리락티드-코-글리코리드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리포스파진, 폴리이미노카르보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리히드록시발레이트, 폴리히드록시부티레이트, 및 폴리아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 폴리락티드-코-글리코리드에서 락티드에 대한 글리콜리드의 몰비는 약 50:50 내지 약 90:10, 약 60:40 내지 약 90:10, 약 60:40 내지 약 85:15, 약 60:40 내지 약 80:20, 약 60:40 내지 약 75:25, 약 65:35 내지 약 90:10, 약 70:30 내지 약 90:10, 약 75:25 내지 약 90:10, 약 65:35 내지 약 85:15, 또는 약 70:30 내지 약 80:20일 수 있다. 상기 폴리락티드-코-글리코리드에서 락티드에 대한 글리콜리드의 몰비는 약 75:25일 수 있다.

본 발명에서 생분해성 고분자는 1종 이상의 폴리락티드와 1종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드 중에서 2종 이상을 포함할 수 있다. 본 발명에서 생분해성 고분자는 예를 들어, 폴리락티드 2종, 폴리락티드 1종과 폴리락티드-코-글리코리드 1종, 폴리락티드-코-글리코리드 2종, 폴리락티드 3종, 폴리락티드 2종과 폴리락티드-코-글리코리드 1종, 폴리락티드 1종과 폴리락티드-코-글리코리드 2종, 등의 조합을 포함할 수 있고, 특히, 폴리락티드 1종과 폴리락티드-코-글리코리드 1종, 또는 폴리락티드-코-글리코리드 2종을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생분해성 고분자는 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드를 포함할 수 있다. 상기 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드의 중량비는 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:9 내지 약 9:1, 약 1:8 내지 약 8:1, 약 1:7 내지 약 7:1, 약 1:6 내지 약 6:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 약 1:4 내지 약 4:1, 약 1:3 내지 약 3:1, 약 1:2 내지 약 2:1, 또는 약 1:1 내지 약 2:1일 수 있다. 상기 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드의 중량비는 약 1:1일 수 있다.

본 발명에서 생분해성 고분자는 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드를 포함할 수 있다.

상기 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드가 2종의 폴리락티드-코-글리코리드의 조합인 경우에 각각의 폴리락티드-코-글리코리드가 중량비로 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:9 내지 약 9:1, 약 1:8 내지 약 8:1, 약 1:7 내지 약 7:1, 약 1:6 내지 약 6:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 약 1:4 내지 약 4:1, 약 1:3 내지 약 3:1, 약 1:2 내지 약 2:1, 또는 약 1:1 내지 약 2:1일 수 있다. 상기 2종의 폴리락티드-코-글리코리드의 중량비는 약 1:1일 수 있다.

용어 "고유 점도(intrinsic viscosity: IV)"는 고분자 묽은 용액의 환원 점도 혹은 인히런트 점도를 고분자 농도 0에 외삽하여 얻어지는 값을 말한다. 고유 점도는 용질 입자 사이의 상호 작용을 없앴을 때의 점성 계수일 수 있다.

본 발명에서 폴리락티드의 고유 점도(intrinsic viscosity: IV)는 약 0.1 dl/g 내지 약 0.5 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.4 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.3 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.2 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.5 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.4 dl/g, 또는 약 0.2 dl/g 내지 약 0.3 dl/g일 수 있다.

본 발명에서 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 약 0.1 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 1.0 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 0.8 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 0.6 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 0.4 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 0.2 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 1.0 dl/g, 약 0.4 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.6 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.8 dl/g 내지 1.5 dl/g, 또는 약 1.0 dl/g 내지 1.5 dl/g 일 수 있다.

본 발명에서 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 생분해성 고분자에서, 상기 폴리락티드의 고유 점도는 약 0.1 dl/g 내지 약 0.5 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.4 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.3 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.2 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.5 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.4 dl/g, 또는 약 0.2 dl/g 내지 약 0.3 dl/g일 수 있다. 상기 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 생분해성 고분자에서, 상기 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 약 0.1 dl/g 내지 약 0.5 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.4 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.3 dl/g, 약 0.1 dl/g 내지 약 0.2 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.5 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.4 dl/g, 또는 약 0.2 dl/g 내지 약 0.3 dl/g일 수 있다. 상기 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 생분해성 고분자에서, 폴리락티드의 고유 점도는 약 0.2 dl/g이고 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 약 0.2 dl/g 또는 약 0.4 dl/g일 수 있다.

상기 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 생분해성 고분자에서, 1종의 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 약 0.1 dl/g 내지 약 0.3 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 약 0.3 dl/g, 또는 약 0.1 dl/g 내지 약 0.2 dl/g일 수 있다. 상기 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 생분해성 고분자에서, 다른 1종의 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 약 0.1 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.2 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.4 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.6 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.8 dl/g 내지 1.5 dl/g, 약 0.8 dl/g 내지 1.2 dl/g, 또는 약 0.8 dl/g 내지 1.0 dl/g일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 예를 들어, 2종의 고유 점도 약 0.2 dl/g의 폴리락티드-코-글리코리드와 고유 점도 약 1.0 dl/g의 폴리락티드-코-글리코리드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 생분해성 고분자는 고분자의 말단이 캡핑되거나 비캡핑(즉, 캡핑되지 않은 것)된 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자의 말단은 산(acid)으로 캡핑된 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자의 말단은 카르복시기(carboxylic) 또는 에스터기(ester)로 캡핑된 것일 수 있다.

상기 폴리락티드는 말단이 산으로 캡핑된 것일 수 있다.

상기 폴리락티드-코-글리코리드는 말단이 산으로 캡핑된 것일 수 있다.

상기 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드는 말단이 산으로 캡핑된 폴리락티드-코-글리코리드와 비캡핑된 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 생분해성 고분자에서 용매의 잔류량은 약 1000 ppm 이하, 약 900 ppm 이하, 약 800 ppm 이하, 약 700 ppm 이하, 약 600 ppm 이하, 약 500 ppm 이하, 약 400 ppm 이하, 약 300 ppm 이하, 약 200 ppm 이하, 약 100 ppm 이하, 약 10 ppm 이하, 또는 약 1 ppm 이하일 수 있다. 상기 생분해성 고분자 중 용매의 잔류량은 약 800 ppm 내지 약 100 ppm, 약 750 ppm 내지 약 100 ppm, 약 700 ppm 내지 약 100 ppm, 약 650 ppm 내지 약 100 ppm, 약 800 ppm 내지 약 150 ppm, 약 800 ppm 내지 약 200 ppm, 약 800 ppm 내지 약 250 ppm, 약 800 ppm 내지 약 300 ppm, 약 800 ppm 내지 약 350 ppm, 약 800 ppm 내지 약 400 ppm, 약 800 ppm 내지 약 450 ppm, 약 800 ppm 내지 약 500 ppm, 약 800 ppm 내지 약 550 ppm, 약 800 ppm 내지 약 600 ppm, 약 750 ppm 내지 약 600 ppm, 약 700 ppm 내지 약 600 ppm, 또는 약 650 ppm 내지 약 600 ppm일 수 있다.

상기 용매는 디클로로메탄(dichloromethane)일 수 있다.

본 발명에서 생분해성 고분자는 약 10℃ 내지 약 20℃에서 약 200 내지 약 400 rpm으로 약 30분 내지 약 2시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 약 25℃내지 약 35℃에서 약 200 내지 약 400 rpm으로 약 30분 내지 약 2시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 약 35℃ 내지 45℃에서 약 200 내지 약 400 rpm으로 약 30분 내지 약 4시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 약 15℃에서 약 300 rpm으로 약 1시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 약 30℃에서 약 300 rpm으로 약 2시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 약 40℃에서 약 300 rpm으로 약 3시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것일 수 있다.

본 발명에서 마이크로입자는 미립구 또는 마이크로스피어로도 지칭될 수 있다.

상기 마이크로입자는 생분해성 고분자와, 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 약 1:1 내지 약 10:1, 약 2:1 내지 약 10:1, 약 2:1 내지 약 5:1, 또는 약 1:1 내지 약 2:1의 중량비로 포함할 수 있다.

상기 마이크로입자에서 날트렉손의 함량은 마이크로입자의 총 중량에 대하여 약 10%(w/w) 내지 약 50%(w/w), 약 15%(w/w) 내지 약 50%(w/w), 약 50%(w/w) 내지 약 50%(w/w), 약 25%(w/w) 내지 약 50%(w/w), 약 30%(w/w) 내지 약 50%(w/w), 약 10%(w/w) 내지 약 45%(w/w), 약 10%(w/w) 내지 약 40%(w/w), 약 10%(w/w) 내지 약 35%(w/w), 약 15%(w/w) 내지 약 45%(w/w), 약 20%(w/w) 내지 약 40%(w/w), 약 25%(w/w) 내지 약 35%(w/w), 또는 약 30%(w/w) 내지 약 35%(w/w)일 수 있다.

상기 마이크로입자의 중간 입자 크기(D50)은 약 25 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 95 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 90 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 80 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 70 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 65 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 60 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 55 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 35 ㎛ 내지 약 65 ㎛, 약 40 ㎛ 내지 약 65 ㎛, 약 45 ㎛ 내지 약 65 ㎛, 약 35 ㎛ 내지 약 60 ㎛, 약 40 ㎛ 내지 약 55 ㎛, 또는 약 45 ㎛ 내지 약 50 ㎛일 수 있다.

마이크로입자는 중간 입자 크기(D50)를 기준으로 ±5μm, ±7μm, ±10μm, ±12μm, 또는 ±15μm의 범위에서 입도 분포를 가지는 것일 수 있다. 또한 마이크로입자는 이러한 입도 분포 범위 내에 전체 마이크로입자를 기준으로 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상, 75 중량% 이상, 80 중량% 이상, 85 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상, 또는 99 중량% 이상의 마이크로입자가 존재하는 것일 수 있다.

종래 마이크로입자를 이용한 고용량 서방성 제제(예: 비비트롤)는 마이크로입자 크기의 범위를 조절하기 어려웠고, 이에 따라 넓은 입도 분포(즉 불균일한 입도 분포)를 가지게 되어 중간 입자 크기(D50)을 기준으로 입자 크기의 편차가 심하게 나타나는 문제가 있었다. 이렇게 넓은 입도 분포를 가지는 경우, 마이크로입자 각각이 크기가 달라 약물의 일정한 방출을 담보하기 어렵고, 특히 약물 투여 초반에 마이크로입자로부터 약물이 한꺼번에 방출되는 현상(burst effect)이 발생하여, 혈중 내 약물의 농도가 급격히 상승함에 따라 부작용이 발생할 가능성이 높아진다. 이와 달리 본 발명의 마이크로입자는 좁은 입도 분포(즉 균일한 입도 분포)를 가지는 것이며, 이에 따라 일정한 약동학적 특성을 나타내어 약물이 체내에서 일정하게 방출될 수 있도록 하고 혈중 약물 농도가 유지되는 특성 및 효과를 나타낸다. 또한 본 발명은 이러한 특성이 현저하고 우수한 자가면역질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는데 기여함을 발견하였다. 상기 마이크로입자에는 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 균질하게 분포될 수 있다. 상기 마이크로입자에는 생분해성 고분자가 균질하게 분포될 수 있다.

상기 마이크로입자는 타원형 내지 구형일 수 있다.

용어 "자가면역질환(autoimmune disease)"은 면역기능에 이상이 발생하여, 몸 안의 면역세포들이 신체의 장기나 조직을 공격하여 발생하는 질환을 말한다. 상기 자가면역질환은 장기 특이적 자가항체와 관련된 질환과 장기 비특이적(전신적) 질환으로 구별될 수 있다. 본 발명에서 자가면역질환은 톨-유사 수용체(toll-like receptor; TLR) 단백질과 관련된 질환일 수 있고, 특히나 톨-유사 수용체 2/4 (TLR2/4) 신호전달과 관련된 질환일 수 있다. 상기 자가면역질환은 예를 들어, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 혈구탐식성 림프조직구증(Hemophagocytic lymphohistiocytosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 기쿠치(Kikuchi) 병, 혈관염(vasculitis), 성인 스틸 병(Adult onset Still's disease), 염증성 근육염(Inflammatory Myositis), 베체트 병(Behcet disease), IgG4-연관성 질환, 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 거대세포 동맥염(Giant cell arteritis), 측두 동맥염(Temporal arteritis), 제1형 당뇨병, 아토피 피부염, 크론병(Crohn's disease), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 건선, 그레이브스 갑상선 항진증(Grave's hyperthyroidism), 하시모토병(Hashimoto's disease), 악성 빈혈(Pernicious anemia), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 근무력증(Myasthenia), 백반증(Vitiligo), 길리안바레증후군(guilian-Barre syndrome), 사구체신염(Glomerulonephritis), ANCA-혈관염(ANCA-associated vasculitis;AAV), 항인지질증후군 (antiphospholipid syndrome), 천포창 (Pemphigus), 암(Cancer), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 뇌척수염 (Encephalomyelitis), 섬유근통(fibromyalgia), 및 건선 관절염(psoriatic arthritis)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "예방"은 상기 제제의 투여에 의해 자가면역질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 용어 "치료"는 상기 제제의 투여에 의해 자가면역질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

용어 "서방성(sustained)"는 약물의 유효 성분이 천천히 방출되는 성질을 말한다. 용어 "서방성"은 "장기지속성(long-acting)" 또는 "연장(extended)"의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 제제는 약물을 투여하기에 적합한 형체와 성상으로 제조한 약학적 조성물을 의미한다.

상기 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 제제는 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 제제는 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 제제는 예를 들면, 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제, 패치제, 또는 임플란트제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 제제는 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 상기 제제는 피하투여, 또는 근육투여를 위한 주사제일 수 있다. 상기 제제는 피하투여를 위한 패치제 또는 임플란트제일 수 있다.

상기 제제는 유효 성분으로서 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 제제 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.

상기 제제는 유효 성분으로서 저용량 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 용어 "저용량"은 날트렉손을 주사제로 투여하는 경우 저용량 날트렉손의 투여에 따른 효과가 나타나는 범위의 용량을 의미하는 것일 수 있다. 기존 경구 투여 제제에서 저용량 날트렉손(LDN)은 단위제형 당 1 mg 내지 7.5 mg의 용량 또는 5 mg 이하의 용량을 의미하는 것이나, 날트렉손을 주사제로 투여할 경우 이러한 정의에 따르지 않으며 본 발명의 효과를 달성하기에 충분한 용량을 의미할 수 있다. 예를 들어, 저용량 날트렉손은 (i) 실시예 6에서 설명한 것처럼 환자의 급격한 면역력 저하를 초래하지 않고, 환자에서 정상적인 면역 반응과 면역 체계를 유지하면서 체내 TLR4 수용체를 효과적으로 억제하는 용량을 의미하거나 (ii) 휴미라 보다 더 적은 용량 및 더 적은 빈도로 투여되었음에도 휴미라와 동등하거나 더 우수한 자가면역질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 용량을 의미할 수 있다. 예를 들어, 날트렉손 서방형 주사제에 있어서 저용량은, 예를 들어, 약 160 mg 미만, 약 150 mg 이하, 약 140 mg 이하, 약 120 mg 이하, 약 100 mg 이하, 약 80 mg 이하, 약 60 mg 이하, 약 40 mg 이하, 약 20 mg 이하, 약 10 mg 이하, 약 5 mg 이하, 약 1 mg 이하의 범위일 수 있다.

상기 제제는 단위 투여 제형 당 약 0.1 mg 내지 약 1 g, 약 0.5 mg 내지 약 500 mg, 약 1 mg 내지 약 400 mg, 약 1 mg 내지 약 300 mg, 약 1 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 100 mg, 약 1 mg 내지 약 80 mg, 약 1 mg 내지 약 60 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 1 mg 내지 약 30 mg, 약 5 mg 내지 약 50 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 30 mg, 약 25 mg 내지 약 40 mg, 또는 약 55 mg 내지 약 50 mg의 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.

상기 제제는 피하, 근육내, 또는 피내로 투여될 수 있다. 상기 제제는 약 1주 내지 약 2년, 약 1주 내지 약 1년 6개월, 약 1주 내지 약 1년, 약 1주 내지 약 11개월, 약 1주 내지 약 10개월, 약 1주 내지 약 9개월, 약 1주 내지 약 8개월, 약 1주 내지 약 7개월, 약 1주 내지 약 6개월, 약 1주 내지 약 5개월, 약 1주 내지 약 4개월, 약 1주 내지 약 3개월, 약 1주 내지 약 2개월, 약 1주 내지 약 1개월, 약 2주 내지 약 1개월, 또는 약 3주 내지 약 1개월에 1회 투여할 수 있다. 상기 제제는 약 25일 내지 약 30일, 약 26일 내지 약 30일, 약 27일 내지 약 30일, 약 28일 내지 약 30일, 약 25일 내지 약 29일, 또는 약 25일 내지 약 28일에 1회 투여할 수 있다.

상기 제제의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 g/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 1 g/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 1 g/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1 g/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 900 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 800 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 700 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 600 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 400 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 제제는 하나 이상의 자가면역질환 치료제와 함께 투여될 수 있다. 날트렉손과 상기 하나 이상의 자가면역질환 치료제의 표준 투여 방법에 따라, 본 발명의 제제와 동시에, 순차적으로, 혹은 별도의 투여 간격과 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 날트렉손 제제와 함께 투여될 수 있는 자가면역질환 치료제는 메토트렉세이트(Methotrexate), 하이드록시클로로퀸(Hydroxychloroquine), 설파살라진(Sulfasalazine), 레플루노미드(Leflunomide), 아달리무맙(Adalimumab), 에타너셉트(Etanercept), 인플릭시맙(Infliximab), 골리무맙(Golimumab), 토실리주맙(Tocilizumab), 아바타셉트(Abatacept), 리툭시맙(Rituximab), 토파시티닙(Tofacitinib), 바리시티닙(Baricitinib), 페피시티닙(Peficitinib), 유파다시티닙(Upadacitinib), 글라티라머 아세테이트(Glatiramer acetate), 디메틸 푸마레이트(Dimethyl fumarate), 인터페론 베타-1a(Interferon β-1a), 인터페론 베타-1b(Interferon β-1b), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 핀골리모드(fingolimod), 나탈리주맙(natalizumab), 오자니모드(ozanimod), 시포니모드(Siponimod), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 테리플루노미드(Teriflunomide), 클라드리빈(Cladribine), 미토산트론(Mitoxantrone), 및 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 류마티스 관절염 환자의 임상적 상태 또는 방사선학적 상태를 개선하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 류마티스 관절염 환자에서 관절염의 염증을 치료하거나 또는 관절 파괴의 진행을 억제하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 자가면역질환을 가지는 환자에서 염증매개물질을 감소시키기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 여기서 자가면역질환은 류마티스 관절염일 수 있으며, 염증매개물질은 염증 촉진 사이토카인 A군(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α) 및 케모카인 B 군(MCP-1 및 MIP-2) 중 하나 이상일 수 있다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 다발성 경화증 환자의 임상적 상태를 개선하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 척수 조직에서의 세포성 침윤을 감소시키기 위한 또는 척수의 염증을 억제하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 척수 조직에서의 수초 탈락을 감소시키기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 수초염기성 단백질(MBP)의 발현을 억제하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, TLR4 신호전달을 억제하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 여기서 TLR4 신호전달의 억제는 날트렉손이 TLR4 수용체에 존재하는 MD2 단백질에 결합하여 억제되는 것일 수 있다. 또한 여기서 상기 서방성 제제는 자가면역질환을 가지는 환자에서 TLR4 신호전달을 억제하기 위한 서방성 제제일 수 있다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 여기서, 전염증성 사이토카인의 발현 억제는 TLR4 수용체를 매개한 기전에서 전염증성 사이토카인의 발현 억제일 수 있다. 또한 여기서 상기 서방성 제제는 자가면역질환을 가지는 환자에서 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하기 위한 서방성 제제일 수 있다. 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α. IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, 및 iNOS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 양상은 날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는, NF-κB의 활성을 억제하기 위한 서방성 제제에 관한 것일 수 있다. 여기서, NF-κB 활성 억제는 TLR4 수용체를 매개한 기전에서 NF-κB의 활성 억제일 수 있다. 또한 여기서 상기 서방성 제제는 자가면역질환을 가지는 환자에서 NF-κB의 활성을 억제하기 위한 서방성 제제일 수 있다.

본 발명의 일 양상으로, 1) 날트렉손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제1용매에 용해시켜 약물 용액을 제조하는 단계; 2) 생분해성 고분자를 제2용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조하는 단계; 3) 상기 1) 단계 및 2) 단계에서 제조한 약물 용액과 고분자 용액을 혼합 교반하여 유상 용액을 제조하는 단계; 4) 상기 3) 단계에서 제조한 유상 용액과 수상 용액을 마이크로입자(마이크로스피어) 제조 모듈에 적용하여 마이크로입자를 제조하는 단계; 5) 상기 4) 단계에서 제조된 마이크로입자를 교반하여 용매를 제거하는 단계를 포함하는 날트렉손 마이크로입자 제조 방법을 제공한다.

본 양상에서 날트렉손, 약학적으로 허용가능한 염, 생분해성 고분자, 및 마이크로입자(마이크로스피어)는 전술한 바와 같다.

상기 1) 단계에서 제1용매는 디클로로메탄, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르, 벤질 알코올, 또는 이들의 조합일 수 있고, 상기 2) 단계에서 제2용매는 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 상기 1) 단계와 2) 단계는 순차적으로, 동시에, 혹은 역순으로 진행될 수 있다.

상기 3) 단계에서, 약물 용액과 고분자 용액은 약물과 고분자 비율이 1: 0.5 내지 1:10이 되도록 혼합될 수 있고, 구체적으로, 약물과 고분자 비율이 1:0.5 (2: 1) 내지 1:5, 더 구체적으로 1:2 내지 1:5 가 되도록 혼합될 수 있으며, 특히 약물과 고분자 비율이 1:2가 되도록 혼합될 수 있다.

상기 4) 단계에서, 수상 용액은 폴리에틸렌글리콜 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 올레이트, 소듐라우릴설페이트 또는 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol; PVA) 용액일 수 있고, 구체적으로, 0.5%(w/v)의 PVA 용액일 수 있다.

상기 5) 단계에서, 상기 교반은 10℃ 내지 20℃에서 200 내지 400 rpm으로 30분 내지 2시간, 25℃ 내지 35℃에서 200 내지 400 rpm으로 30분 내지 3시간, 및 35℃ 내지 45℃에서 200 내지 400 rpm으로 30분 내지 4시간 동안 진행될 수 있고, 구체적으로, 13℃ 내지 17℃에서 250 내지 350 rpm으로 30분 내지 2시간, 28℃ 내지 32℃에서 250 내지 350 rpm으로 1시간 내지 3시간, 및 38℃ 내지 42℃에서 250 내지 350 rpm으로 2시간 내지 4시간 동안 진행될 수 있으며, 더 구체적으로는 15℃에서 300 rpm으로 1 시간, 30℃에서 300 rpm으로 2 시간, 및 40℃에서 300 rpm으로 3 시간 동안 진행될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 적절한 시간 동안 최대한 용매를 휘발시킬 수 있는 조건으로 진행될 수 있다.

상기 제조 방법에 따라 제조된 날트렉손 마이크로입자에서의 용매 잔류량은 약 1000 ppm 이하, 약 900 ppm 이하, 약 800 ppm 이하, 약 700 ppm 이하, 약 600 ppm 이하, 약 500 ppm 이하, 약 400 ppm 이하, 약 300 ppm 이하, 약 200 ppm 이하, 약 100 ppm 이하, 약 10 ppm 이하, 또는 약 1 ppm 이하일 수 있다. 또는, 상기 제조 방법에 따라 제조된 날트렉손 마이크로입자에서의 용매 잔류량은 약 800 ppm 내지 약 100 ppm, 약 750 ppm 내지 약 100 ppm, 약 700 ppm 내지 약 100 ppm, 약 650 ppm 내지 약 100 ppm, 약 800 ppm 내지 약 150 ppm, 약 800 ppm 내지 약 200 ppm, 약 800 ppm 내지 약 250 ppm, 약 800 ppm 내지 약 300 ppm, 약 800 ppm 내지 약 350 ppm, 약 800 ppm 내지 약 400 ppm, 약 800 ppm 내지 약 450 ppm, 약 800 ppm 내지 약 500 ppm, 약 800 ppm 내지 약 550 ppm, 약 800 ppm 내지 약 600 ppm, 약 750 ppm 내지 약 600 ppm, 약 700 ppm 내지 약 600 ppm, 또는 약 650 ppm 내지 약 600 ppm일 수 있다.

상기 제조 방법은 추가로 6) 마이크로입자를 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 양상은 본 발명의 날트렉손 마이크로입자 제조 방법에 의해 제조된 마이크로입자를 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제를 개체에 1주 내지 2년에 1회 주사 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

날트렉손, 약학적으로 허용가능한 염, 생분해성 고분자, 마이크로입자, 자가면역질환, 예방, 치료, 서방성, 및 제제는 전술한 바와 같다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 개, 마우스, 래트, 기니 피그, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 또는 유인원일 수 있으며, 특히, 인간을 포함한 포유동물, 또는 인간을 제외한 포유동물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 개체는 자가면역질환을 앓거나 앓을 위험이 있는 것일 수 있다.

투여 방법은 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내, 또는 피내 경로로 투여될 수 있다. 상기 제제는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다.

통상 날트렉손은 경구투여시 25 mg 내지 50 mg의 용량으로 1일 당 1회 투여하고, 근육주사 투여시 380 mg의 용량으로 1개월에 1회 투여한다. 날트렉손은 권장 용량에 비해 고용량을 투여했을때 간 손상이 유발될 수 있다. 일 양상에 따른 서방성 제제는 저용량 날트렉손을 함유하고, 약 1주 내지 약 1년, 약 2주 내지 약 1년, 또는 약 3주 내지 약 1년에 1회 투여할 수 있다. 상기 서방성 제제는 약 28일에 1회 투여할 수 있다. 상기 서방성 제제는 약 3주 내지 약 1년에 1회 투여로도 1주 1회 투여하는 메토트렉세이트 주사제와 동등한 효과를 나타내고, 1일 1회 투여하는 날트렉손 경구 제제에 비해 현저히 우수한 효과를 달성할 수 있다.

다른 양상은 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 약학 조성물은 비경구 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 피하투여, 또는 근육 투여를 위한 주사제일 수 있다. 상기 주사제는 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며, 주사용수가 추가로 포함될 수 있다. 상기 주사용수는 주사제의 제조 시 사용되는 용액으로 상기 예시에 국한되지 않고, 통상의 기술자에 의해 쉽게 이용 가능한 주사용수는 제한 없이 모두 사용 가능하다. 상기 약학 조성물은 단위 투여 제형 당 0.1 mg 내지 1 g의 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물은 저용량 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하며, 0.1 mg/kg 체중 내지 1 g/kg 체중의 용량으로 투여하며, 10 mg/kg 체중 내지 500 mg/kg 체중의 용량으로 투여할 수 있으나, 상기 예시에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 서방성 제제에 관하여 기재 또는 정의된 사항은 상기 약학 조성물에도 마찬가지로 적용될 수 있다. 일 양상에서 상기 제제는 약학 조성물일 수 있다.

날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제 및 이를 이용한 방법에 따르면, 자가면역질환을 1회 투여로 장기지속적으로 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

도 1a 내지 도 1f는 마이크로스피어의 락티드 비율 및 고유점도를 달리한 경우에 제조된 마이크로스피어의 약물동역학적 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 2a 내지 도 2c는 제조예 1에 따라 제조된 마이크로스피어의 주사전자현미경 이미지이고, 도 2d는 마이크로스피어의 입자 크기 분포를 나타낸 그래프이다. 도 2e 내지 도 2h는 제조예 4에 따라 제조된 마이크로스피어의 주사전자현미경 이미지이고, 도 2i는 마이크로스피어의 입자 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 제조예 1에 따라 제조된 마이크로스피어를 개에 각각 피하 주사 및 근육 주사로 투여한 경우, 투여시간(시간)에 따른 혈액 중 날트렉손의 농도(ng/mL)를 나타낸 그래프이다. 도 3c는 제조예 4에 따라 제조된 마이크로스피어를 개에 근육 주사로 투여한 경우, 투여시간(시간)에 따른 혈액 중 날트렉손의 농도(ng/mL)를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 실험동물모델 제작 및 투여 일정의 모식도이고, 도 4b는 시험물질 투여군별 마우스의 발가락 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Naltrexone: 날트렉손 투여군, Naltrexone DDS: 날트렉손 DDS 투여군), 도 4c는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 임상 관절염 지수를 나타낸 그래프이고, 도 4d는 임상 관절염 지수의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프이고, 도 4e는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 관절염 발생 빈도(%)를 나타낸 그래프이고, 도 4f는 발생 빈도의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프이다(평균±SEM, **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001).
도 5a 및 도 5c는 각각 헤마톡실린/에오신 및 톨루이딘 블루로 염색한 조직의 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Naltrexone: 날트렉손 투여군, Naltrexone DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛), 도 5b 및 도 5d는 각각 헤마톡실린/에오신 염색 조직 및 톨루이딘 염색 조직에서 투여군별 조직형태학적 점수를 나타낸 그래프이다(평균±SEM, **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001).
도 6은 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 시험물질 투여군별 마우스의 발가락 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군), 도 7b는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 임상 관절염 지수를 나타낸 그래프이고, 도 7c는 임상 관절염 지수의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프이고, 도 7d는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 관절염 발생 빈도(%)를 나타낸 그래프이고, 도 7e는 관절염 발생 빈도의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프이다(평균±SEM, **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001).
도 8a는 헤마톡실린/에오신으로 염색한 조직의 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛), 도 8b는 헤마톡실린/에오신 염색 조직에서 투여군별 조직형태학적 점수를 나타낸 그래프이다(평균±SEM, **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001).
도 9a는 톨루이딘 블루로 염색한 조직의 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛), 도 9b는 톨루이딘 염색 조직에서 투여군별 조직형태학적 점수를 나타낸 그래프이다(평균±SEM, **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001).
도 10은 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 나타낸 그래프이다.
도 11a는 마이크로-CT로 촬영한 각 군별 대표 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛), 도 11b는 특히 관절 부분을 확대한 이미지이다. 도 11c는 방사선학적 점수를 나타낸 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 투여군별 관절염 조직의 염증매개인자 단백질 농도 분석한 결과로, Luminex technology 기반의 다중-분석물-ELISA(multi-analyte-ELISA) 방법을 통해 각각 염증 촉진 사이토카인 A군(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α)(도 12a) 및 염증매개물질 중 케모카인 B 군(MCP-1 및 MIP-2)(도 12b)의 단백질량을 측정한 결과이다.
도 13은 투여군별 혈액의 염증매개인자 단백질 농도 분석한 결과로, Luminex technology 기반의 다중-분석물-ELISA(multi-analyte-ELISA) 방법을 통해 IL-6 단백질량을 측정한 결과이다.
도 14a는 시험물질 투여군별 마우스의 발가락 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, Humira: 휴미라 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 10mg/마우스 투여군), 도 14b는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 임상 관절염 지수를 나타낸 그래프이고, 도 14c는 임상 관절염 지수의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프이고, 도 14d는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 관절염 발생 빈도(%)를 나타낸 그래프이고, 및 도 14e는 발생 빈도의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프이다(평균±SEM, **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001).
도 15a 및 도 15c는 각각 헤마톡실린/에오신 및 톨루이딘 블루로 염색한 조직의 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, Humira: 휴미라 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 10mg/마우스 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛), 도 15b 및 도 15d는 각각 헤마톡실린/에오신 염색 조직 및 톨루이딘 염색 조직에서 투여군별 조직형태학적 점수를 나타낸 그래프이다(평균±SEM, ***: p-값 < 0.001).
도 16a는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 나타낸 그래프이고, 도 16b는 제41일째의 체중(% vs 23일째)을 나타내는 그래프이다.
도 17a는 마이크로-CT로 촬영한 각 군별 대표 이미지이고(Vehicle DDS: 음성 대조군, Humira: 휴미라 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 10mg/마우스 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛), 도 17b는 특히 관절 부분을 확대한 이미지이다. 도 17c는 방사선학적 점수를 나타낸 그래프이다.
도 18a 및 도 18b는 투여군별 관절염 조직의 염증매개인자 단백질 농도 분석한 결과로, Luminex technology 기반의 다중-분석물-ELISA(multi-analyte-ELISA) 방법을 통해 각각 염증 촉진 사이토카인 A군(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α)(도 18a) 및 염증매개물질 중 케모카인 B 군(MCP-1 및 MIP-2, + IL-2)(도 18b)의 단백질량을 측정한 결과이다.
도 19는 투여군별 혈액의 염증매개인자 단백질 농도 분석한 결과로, Luminex technology 기반의 다중-분석물-ELISA(multi-analyte-ELISA) 방법을 통해 IL-6 단백질량을 측정한 결과이다.
도 20a, 도 20b, 및 도 20c는 관절염 조직 내 NK 세포 면역 염색(CD56+)하여 배율별로 촬영한 이미지이다(x200, x200, x400). 도 20d는 NK 세포의 수를 정량 평가한 그래프이다.
도 21a는 다발성 경화증 동물 모델인 실험적 자가면역성 뇌척수염 마우스 모델(Mouse Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: EAE)의 제작 및 투여 물질 투여 일정을 정리한 도식표이다.
도 21b는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 EAE 임상 점수를 나타낸 그래프이고, 도 21c는 임상 점수의 곡선하면적을 나타내는 그래프이다(평균±표준오차(SEM), ***: p-값 < 0.001).
도 21d는 헤마톡실린/에오신으로 염색한 조직의 이미지이고(Vehicle: 음성 대조군, Fytarex: 피타렉스 투여군, Revia: 레비아 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 50배 및 200배 확대), 도 21e는 헤마톡실린/에오신 염색 조직에서 투여군별 조직형태학적 점수를 나타낸 그래프이다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).
도 21f는 룩솔 패스트 블루 염색한 조직의 이미지이고(Vehicle: 음성 대조군, Fytarex: 피타렉스 투여군, Revia: 레비아 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 50배 및 200배 확대), 도 21g는 룩솔 패스트 블루 염색 조직에서 투여군별 조직형태학적 점수를 나타낸 그래프이다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).
도 21h는 면역조직화학 염색을 수행한 조직의 이미지이고(Vehicle: 음성 대조군, Fytarex: 피타렉스 투여군, Revia: 레비아 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 50배 및 200배 확대), 도 21i는 이러한 염색 조직에서 각 투여군별로 염색된 면적을 전체 척수 단면적을 기준으로 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).
도 22는 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 나타낸 그래프이다.
도 23은 표면 플라즈몬 공명 분석을 통해 날트렉손이 TLR4 신호전달 상 MD2 단백질과 농도-의존적으로 결합하는 것을 확인한 결과이다.
도 24는 사람 활막세포주 SW982 세포에서 날트렉손이 TLR4 신호전달에 영향을 미치는 기작에 대한 모식도이다.
도 25는 사람 활막세포주 SW982 세포에 LDN(도면에서 "Q"로 표기함)을 처리한 후 지질다당류(Lipopolysaccharide; "LPS")를 처리한 경우 전염증성 사이토카인의 발현이 억제됨을 RT-qPCR로 확인한 결과이다.
도 26은 사람 활막세포주 SW982 세포에 LDN(도면에서 "Q"로 표기함)을 처리한 후 LPS를 처리한 경우 NF-κB의 활성을 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 통해 확인한 결과이다.
도 27은 사람 활막세포주 SW982 세포에 LDN(도면에서 "Q"로 표기함)을 처리한 후 LPS를 처리한 경우 MAPK의 활성을 알아보기 위해 ERK, JNK, p38의 인산화된 정도를 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다.
도 28은 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에 LDN(도면에서 "Q"로 표기함)을 처리한 후 지질다당류(Lipopolysaccharide; "LPS")를 처리한 경우 전염증성 사이토카인의 발현이 억제됨을 RT-qPCR로 확인한 결과이다.
도 29는 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에 LDN(도면에서 "Q"로 표기함)을 처리한 후 LPS를 처리한 경우 NF-κB의 활성을 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 통해 확인한 결과이다.
도 30은 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에 LDN(도면에서 "Q"로 표기함)을 처리한 후 LPS를 처리한 경우 MAPK의 활성을 알아보기 위해 ERK, JNK, p38의 인산화된 정도를 Western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 31은 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에서 날트렉손이 TLR4 신호전달에 영향을 미치는 기작에 대한 모식도이다.
도 32는 세포 내에서 TLR4의 신호 전달 또는 활성 기전을 나타낸 모식도이다.
도 33은 사람 활막세포주 SW982 세포에 날트렉손(도면에서 "Q"로 표기함)과 6β-날트렉솔(도면에서 "6β-Q"로 표기함)을 처리한 후 지질다당류(Lipopolysaccharide; "LPS")를 처리한 경우 전염증성 사이토카인의 발현이 억제됨을 RT-qPCR로 확인한 결과이다. 도면에서 *는 p<0.05을 의미한다.
도 34는 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에 날트렉손(도면에서 "Q"로 표기함)과 6β-날트렉솔(도면에서 "6β-Q"로 표기함)을 처리한 후 지질다당류(Lipopolysaccharide; "LPS")를 처리한 경우 전염증성 사이토카인의 발현이 억제됨을 RT-qPCR로 확인한 결과이다. 도면에서 *는 p<0.05을 의미한다.
도 35는 사람 활막세포주 SW982 세포에 날트렉손(도면에서 "Q"로 표기함)과 6β-날트렉솔(도면에서 "6β-Q"로 표기함)을 처리한 후 LPS를 처리한 경우, TLR4의 신호전달인자(NF-κB 또는 MAPKs)의 활성을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다.
도 36은 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에서 날트렉손(도면에서 "Q"로 표기함)과 6β-날트렉솔(도면에서 "6β-Q "로 표기함)을 처리한 후 LPS를 처리한 경우, TLR4의 신호전달인자(NF-κB 또는 MAPKs)의 활성을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 저용량의 서방형 날트렉손을 함유한 주사용 조성물의 제조

1. 날트렉손 함유 마이크로스피어의 제조

(1) 락티드 비율 및 고유점도에 따른 약물동역학적 프로파일의 확인

마이크로스피어를 제조할 때 고분자 종류, 폴리락티드와 폴리락티드/글리코리드 공중합체의 조성, 및 고분자의 고유점도(intrinsic viscosity: IV)에 따라 마이크로스피어에 함유된 유효 성분의 방출에 차이가 있는지 여부를 약동학적 프로파일로 확인하였다.

유상 용액의 준비를 위해, 날트렉손 베이스(Naltrexone Base Anhydrous)(Mallinckrodt사 제조, 이하 동일)와 고분자를 준비하였다. 고분자로는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, PDL02A, PDLG7510, PDLG7504A, PDLG7502A, 및 이들의 조합을 사용하였다.

고분자		고유점도(dl/g)	분자량(kg/mol)
폴리(DL-락티드)	PDL02A	0.2	17
75/25 DL-락티드/글리코리드 공중합체	PDLG7510	1.0	153
	PDLG7504A	0.4	44
	PDLG7502A	0.2	17

상기 표 1에 정리된 단일 고분자(Corbion) 또는 이들의 혼합물을 디클로로메탄에 용해시켜 18.29%(w/w)의 고분자 용액을 준비하였다. 고분자 혼합물의 경우 PDLG7510+PDLG7502A(중량비 5:5), PDL02A+PDLG7502A(중량비 5:5), 및 PDL02A+PDLG7504A(중량비 5:5)의 혼합물을 사용하였다. 날트렉손 베이스를 벤질 알콜에 용해시켜 29.41%(w/w)의 약물 용액을 준비하였다. 약물과 고분자의 비율은 1:2이며 고분자 용액과 약물 용액을 혼합 교반하여 최종 유상 용액을 준비하였다.

수상 용액으로, 0.5%(w/v)의 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol: PVA) 용액을 준비하였다.

마이크로스피어 제조 모듈에 100 ㎛ 마이크로채널을 조립하고, 유상 라인과 수상 라인에 각각 유상 용액 및 수상 용액을 연결하였다. 유상 용액에는 400 mbar 및 수상 용액에는 2500 mbar의 압력을 가하고, 17℃의 온도에서 유상 용액과 수상 용액을 흐르게 하였다. 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 만나는 지점에서 마이크로스피어가 제조될 수 있도록 하였다. 마이크로스피어의 제조가 완료된 후, 생성물을 15℃에서 1 시간 동안 300 rpm, 30℃에서 2 시간 동안 300 rpm, 및 40℃에서 3 시간 동안 300 rpm으로 교반하여 용매를 제거하였다. 25 ㎛ 및 63 ㎛의 체(sieve)에 여과하여 직경 25 ㎛ 내지 63 ㎛의 마이크로스피어를 수득하였다. 수득된 마이크로스피어는 동결건조시켜 사용 전까지 보관하였다.

제조된 마이크로스피어를 희석액에 분산시켜 주사용 제형으로 준비하였다. 비글견에 주사용 제형의 마이크로스피어를 190 mg/2 mL(날트렉손 베이스)의 용량(마이크로스피어, 570 mg)으로 피하 주사로 단회 투여하였다. 투여 시간(시간)에 따른 혈액 중 날트렉손의 농도(ng/mL)를 측정하고, 그 결과를 도 1a 내지 도 1f에 나타내었다.

일반적으로 PDL02A-기반 마이크로스피어의 분해 속도는 약 6개월 내지 약 9개월이고, PDLG7502A-기반 마이크로스피어의 분해 속도는 약 2개월 내지 약 3개월이다. 이는 폴리 락티드가 폴리 락티드-글리코리드 공중합체에 비하여, 마이크로스피어의 분해 속도가 감소하고 마이크로스피어의 유지 기간이 길어진다는 것을 의미한다.

도 1a 내지 도 1c의 결과에 따르면 락티드의 비율 및 고유점도가 높을수록 마이크로스피어의 분해 속도가 감소하고, 마이크로스피어의 유지 기간이 길어졌다(도 1a 내지 도 1c 참조).

도 1a 내지 도 1f의 결과에 따른 마이크로스피어의 날트렉손 방출 패턴, 초기 방출 및 유지 기간을 고려하여, 날트렉손 서방성 주사제에 적합한 마이크로스피어의 고분자로 PDLG7510+PDLG7502A(중량비 5:5)(도 1d) 및 PDL02A+PDLG7502A(중량비 5:5)(도 1e)를 선택하여 사용하였다.

(2) 교반 조건에 따른 디클로로메탄 잔류량의 변화

마이크로스피어의 제조 과정에서 교반 조건에 따른 디클로로메탄(DCM) 잔류량의 변화를 확인하였다.

실시예 1.1(2)에 기재된 바와 같은 방법으로, PDLG7510+PDLG7502A(중량비 5:5) 및 PDL02A+PDLG7502A(중량비 5:5)-기반 마이크로스피어를 제조하였다. 교반 조건에 따른 디클로로메탄 잔류량을 하기 표 2에 나타내었다.

조건	PDLG7510+PDLG7502A(5:5)		PDL02A+PDLG7502A(5:5)
입자 크기 (㎛)(X50)	46.92	109.5	50.25	51.38
수상용량 (Reservoir, mL)	5000	5000	5000	5000
15℃ / rpm	1 H / 150	1 H / 300	1 H / 300	1 H / 300
30℃ / rpm	2 H / 300	3 H / 600	2 H / 300	2 H / 300
40℃ / rpm	3 H / 600	-	1 H / 300	3 H / 300
DCM 잔류량(ppm)	644.6	530,027.1	7,596.3	619.0

표 2에 나타난 바와 같이, PDL02A+PDLG7502A(5:5) 기반 마이크로스피어를 15℃에서 1 시간 동안 300 rpm, 30℃에서 2 시간 동안 300 rpm, 및 40℃에서 3 시간 동안 300 rpm으로 교반한 경우, 디클로로메탄 잔류량이 가장 적었다.

2. 마이크로스피어 기반 저용량 날트렉손 주사용 조성물의 제조 및 입도 분포 확인

2-1. 마이크로스피어 기반 저용량 날트렉손 주사용 조성물의 제조(제조예 1)

실시예 1.1에 기재된 방법에 따라, 저용량 날트렉손 함유 마이크로스피어를 제조하였다.

구체적으로, 유상 용액의 준비를 위해, 중량비 5:5의 PDL02A 및 PDLG7502A를 디클로로메탄에 용해시켜 18.29%(w/w)의 고분자 용액을 준비하였다. 날트렉손 베이스를 벤질 알콜에 용해시켜 29.41%(w/w)의 약물 용액을 준비하였다. 약물과 고분자 비율이 1:2가 되도록 고분자 용액과 약물 용액을 혼합 교반하여 최종 유상 용액을 준비하였다.

제조된 마이크로스피어는 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM)으로 확인하였고, 그 이미지를 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다. 마이크로스피어의 입자 크기 분포를 측정하고, 그 결과를 도 2d에 나타내었다. 도 2a 내지 도 2d에 나타난 바와 같이, 마이크로스피어가 잘 제조된 것을 확인하였다. 그 결과, 마이크로스피어의 중간 입자 크기(D50)는 42.0 ㎛이고 폭(Width)은 8.82 ㎛이고 활성성분의 봉입률은 91.36%이고 디클로로메탄의 잔류량은 19.5 ppm이었다. 날트렉손에 대한 폴리머의 비율은 약 1:2였다. 여기서 중간 입자 크기는 평균 입자 크기를 의미하고 폭은 편차를 의미할 수 있다.

2-2. 마이크로스피어 기반 저용량 날트렉손 주사용 조성물의 제조(제조예 2)

구체적으로, 유상 용액의 준비를 위해, PDLG7504를 에틸 아세테이트와 벤질 알코올에 용해시키고 날트렉손 베이스를 용해하여 약물 용액을 준비하였다. 약물과 고분자 비율이 1:2가 되도록 고분자 용액과 약물 용액을 혼합 교반하여 최종 유상 용액을 준비하였다.

수상 용액으로, 1.0%(w/v)의 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol: PVA) 용액을 준비하였다.

마이크로스피어 제조 모듈에 100 ㎛ 마이크로채널을 조립하고, 유상 라인과 수상 라인에 각각 유상 용액 및 수상 용액을 연결하였다. 유상 용액에는 400 mbar 및 수상 용액에는 2500 mbar의 압력을 가하고, 7℃의 온도에서 유상 용액과 수상 용액을 흐르게 하였다. 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 만나는 지점에서 마이크로스피어가 제조될 수 있도록 하였다. 마이크로스피어의 제조가 완료된 후, 에탄올 수용액에서 10℃에서 10 시간 동안 용매를 추출하여 용매를 제거하였다. 25 ㎛ 및 63 ㎛의 체(sieve)에 여과하여 직경 25 ㎛ 내지 63 ㎛의 마이크로스피어를 수득하였다. 수득된 마이크로스피어는 동결건조시켜 사용 전까지 보관하였다.

2-3. 마이크로스피어 기반 저용량 날트렉손 주사용 조성물의 제조(제조예 3)

구체적으로, 유상 용액의 준비를 위해, PDLG7504를 디클로로메탄에 용해시키고 날트렉손 베이스를 용해하여 약물 용액을 준비하였다. 약물과 고분자 비율이 1:2가 되도록 고분자 용액과 약물 용액을 혼합 교반하여 최종 유상 용액을 준비하였다.

마이크로스피어 제조 모듈에 100 ㎛ 마이크로채널을 조립하고, 유상 라인과 수상 라인에 각각 유상 용액 및 수상 용액을 연결하였다. 유상 용액에는 600 mbar 및 수상 용액에는 3000 mbar의 압력을 가하고, 10℃의 온도에서 유상 용액과 수상 용액을 흐르게 하였다. 유상 용액의 흐름과 수상 용액의 흐름이 만나는 지점에서 마이크로스피어가 제조될 수 있도록 하였다. 생성물을 10℃에서 1 시간 동안 300 rpm, 30℃에서 2 시간 동안 300 rpm, 및 40℃에서 3 시간 동안 300 rpm으로 교반하여 용매를 제거하였다. 25 ㎛ 및 63 ㎛의 체(sieve)에 여과하여 직경 25 ㎛ 내지 63 ㎛의 마이크로스피어를 수득하였다. 수득된 마이크로스피어는 동결건조시켜 사용 전까지 보관하였다.

2-4. 마이크로스피어 기반 저용량 날트렉손 주사용 조성물의 제조(제조예 4)

구체적으로, 유상 용액의 준비를 위해, PDLG7504를 디클로로메탄 및 디에틸에테르에 용해시키고 날트렉손 베이스를 용해하여 약물 용액을 준비하였다. 약물과 고분자 비율이 1:2가 되도록 고분자 용액과 약물 용액을 혼합 교반하여 최종 유상 용액을 준비하였다.

제조된 마이크로스피어는 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM)으로 확인하였고, 그 이미지를 도 2e 내지 도 2h에 나타내었다. 마이크로스피어의 입자 크기 분포를 측정하고, 그 결과를 도 2i에 나타내었다. 도 2e 내지 도 2h에 나타난 바와 같이, 마이크로스피어가 잘 제조된 것을 확인하였다. 그 결과, 마이크로스피어의 중간 입자 크기(D50)는 38.34 ㎛이고 폭(Width)은 8.08 ㎛이고 활성성분의 봉입률은 98.03%이고 디클로로메탄의 잔류량은 105.7 ppm이고 디에틸에테르의 잔류량은 89.3 ppm이었다. 날트렉손에 대한 폴리머의 비율은 약 1:2였다. 여기서 중간 입자 크기는 평균 입자 크기를 의미하고 폭은 편차를 의미할 수 있다.

3. 날트렉손 함유 마이크로스피어의 약동학적 특성

실시예 1.2-1.(제조예 1)에 기재된 바와 같이 제조된 마이크로스피어를 희석액에 분산시켜 주사용 제형으로 준비하였다. 비글견에 주사용 제형의 마이크로스피어를 190 mg/2 mL(날트렉손 베이스)의 용량(마이크로스피어, 570 mg)으로 피하 주사로 단회 투여하였다. 투여 시간(시간)에 따른 혈액 중 날트렉손의 농도(ng/mL)를 측정하고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

또한, 상기 주사용 제형의 마이크로스피어를 300 mg/4 mL(날트렉손 베이스)의 용량(마이크로스피어, 900 mg)으로 근육 주사로 단회 투여하였다. 투여 후 31일까지 정기적으로 비글견의 혈액을 수득하였다. 투여 시간(시간)에 따른 혈액 중 날트렉손의 농도(ng/mL)를 측정하고, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 피하주사 또는 근육주사로 단회 투여한 경우에도 28일까지 시험물질의 지속 효과가 나타났다. 따라서, 제조된 마이크로스피어는 고분자성 약물 전달 시스템(drug delivery system: DDS)으로서 장기 지속형 및 서방성 주사제로 이용가능함을 확인하였다.

추가로 실시예 1.2-4.(제조예 4)에 기재된 바와 같이 제조된 마이크로스피어를 희석액에 분산시켜 주사용 제형으로 준비하였다. 비글견에 주사용 제형의 마이크로스피어를 300 mg/head(날트렉손 베이스)의 용량(마이크로스피어, 900mg)으로 근육주사로 단회 투여하였다. 투여 시간(시간)에 따른 혈액 중 날트렉손의 농도(ng/mL)를 측정하고, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.

도 3c에 나타난 바와 같이, 근육주사로 단회 투여한 경우에도 28일까지 시험물질의 지속 효과가 나타났다. 따라서, 제조된 마이크로스피어는 고분자성 약물 전달 시스템(drug delivery system: DDS)으로서 장기 지속형 및 서방성 주사제로 이용가능함을 확인하였다.

실시예 2. 류마티스 관절염에 대한 날트렉손 함유 마이크로스피어의 유효성 평가 (1차)

1. 류마티스 관절염에 대한 날트렉손 함유 마이크로스피어의 생체 내 시험 방법

날트렉손 함유 마이크로스피어, 즉 날트렉손 약물 전달 시스템이 류마티스 관절염에 대해 치료 효능이 있는지 여부를 확인하기 위해 생체 내 유효성을 평가하였다.

콜라겐-유도 관절염 마우스 모델(murine collagen-induced arthritis: CIA)로서, 6 내지 10 주령의 DBA/1J 계통의 수컷 마우스를 준비하였다. 마우스는 specific pathogen free (SPF) 실험동물실에서 21℃ 내지 23℃의 온도 및 40% 내지 45%의 상대습도의 환경에서 사육 및 실험하였다. 케이지 별 실험동물 개체수는 6 이하로 수용하고, 주 2회 케이지 교환 및 사료 급이하였다.

10 mM 아세트산에 소 제2형 콜라겐을 녹여 2 mg/mL 콜라겐 용액을 준비하였다. 2 mg/mL의 Complete Freund's adjuvant와 콜라겐 용액을 1:1(v/v)로 섞어 에멀전화 한 후, 마우스 꼬리에 100 ㎕/마리의 용량으로 피내주사하였다(1차 면역화, 제0일). 제21일에 incomplete Freund's adjuvant(IFA)와 콜라겐 용액을 1:1(v/v)로 섞어 에멀전화한 후, 마우스 꼬리에 100 ㎕/마리의 용량으로 피내주사하였다(2차 면역화, 제21일). 그 후 마우스를 무작위로 군 분리하여 실험군을 배정하였다.

피검 물질로서, 제조예 1에 기재된 바와 같이 준비된 날트렉손 DDS를 준비하였다. 날트렉손 DDS에서 유효성분에 대한 고분자의 비율은 약 1:2이므로, 마이크로스피어 9 mg에는 유효성분으로서 날트렉손 약 3 mg이 함유되어 있다. 음성 대조군으로서 날트렉손 대신 담체를 함유한 DDS를 사용하였고, 양성 대조군으로서 메토트렉세이트(methotrexate: MTX, 엠티엑스 주, 50 mg/2 mL, 중외제약)와 날트렉손(레비아정)을 사용하였다. 냉장 보관된 시험물질은 투약 1시간 전에 상온에 보관하고 주사용수 0.15 mL에 용해시켰다. 21 G 니들의 주사기를 사용하여 0.15 mL의 시험물질을 충진하였다. 충진 후 2분 이내에 바늘을 23 G로 변경하고 마우스에 주사하였다.

투여군별 투여 정보는 하기 표 3에 기재된 바와 같다

투여군 (각 군별, n=6)	투여 약물	투여 경로	투여 용법 및 용량 (유효성분 기준)	투여 부피(㎕)
1(음성 대조군)	담체 함유 DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, N/A	150
2(양성 대조군)	메토트렉세이트	복강 주사	2회/주, 1 mg/kg 체중/회	100
3(양성 대조군)	날트렉손	경구	1회/일, 10 mg/kg 체중/회	200
4(시험군)	날트렉손 DDS	피하	제23일에 1회 투여, 3 mg/마우스	150

각각의 평가 지표에 대한 암맹평가 자료를 기반으로 음성 대조군과 시험군 또는 두 시험군 간의 통계분석을 SPSS를 통해 수행하였다. 양 군 간의 비교를 위해 Student's t-test를 이용하였다. 여러 시점에서의 치료군 간의 차이를 비교할 때는 repeated measures ANOVA with Turkey's post-hoc test를 이용하였다. 유의 수준은 p-값이 0.05 이하로 하였다.

2. 관절염 활성도의 임상학적 평가

콜라겐-유도 관절염 마우스 모델에 시험물질을 투여한 후, 군 분리일로부터 실험 종료일(제41일)까지 정기적으로 염증 발생 및 그 수준을 관찰하였다. 염증 수준은 하기 표 4의 기준에 따라 각 발에 대해 0 내지 4점의 점수를 부여하고 그 합계를 임상 관절염 지수(clinical arthritis index: CAI)로 사용하였다.

점수	증상
0	증상 없음
1	1개 발가락 염증
2	2개 발가락 염증
3	3개 이상 발가락 및 발바닥 염증
4	모든 발가락 및 발바닥 염증

각 발의 임상지표가 2점 이상인 경우 관절염이 발생하였다고 판단하였고, 발생빈도(incidence)는 네 발가락에 관절염이 발생하였을 때 100% 발병으로 정의하였다.

시험물질을 투여하지 않은 정상 마우스와 각 투여군의 발가락 이미지를 도 4b에 나타내었다(Normal: 정상군, Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Naltrexone: 날트렉손 투여군, Naltrexone DDS: 날트렉손 DDS 투여군). 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 임상 관절염 지수(CAI)를 도 4c에 나타내고, 임상 관절염 지수의 곡선하면적(area under the curve: AUC)을 나타내는 그래프를 도 4d에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001). 임상 관절염 지수 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 5에 정리하였다.

군	CAI			CAI-AUC
군	평균	SAM	p-값	평균	평균의 표준오차	p-값
담체 함유 DDS	10.75	2.73	-	120.3	27.9	-
메토트렉세이트(1 mg/kg)	5.92	2.15	0.0057	46.6	13.8	0.0002
날트렉손(10 mg/kg)	8.25	4.06	0.0572	59.0	32.5	0.0057
날트렉손 DDS(3 mg/마우스)	6.25	2.46	0.0064	46.8	16.5	0.0002

도 4c, 도 4d, 및 표 5에 나타난 바와 같이, 날트렉손 DDS 투여군(시험군)은 담체 함유 DDS 투여군(음성 대조군)과 비교하였을 때 임상 관절염 지수의 감소를 보였고, 메토트렉세이트 투여군(양성 대조군)과 비슷한 수준의 감소를 나타내었다. 임상 관절염 지수에 대한 곡선하면적도 담체 함유 DDS 투여군에 비해 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서 모두 감소를 보였다. 특히, 날트렉손 DDS 투여군에서 경구 날트렉손(10 mg/kg) 투여군에 비해 임상 관절염 지수가 더 낮게 나타났으며 그 차이는 관절염 진행 기간 동안 일관되게 유지되었다.

시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 관절염 발생 빈도(%)를 도 4e에 나타내고, 발생 빈도의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프를 도 4f에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001). 발생 빈도 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 6에 정리하였다.

군	발생 빈도(%)			발생 빈도-AUC
군	평균	SEM	p-값	평균	SEM	p-값
담체 함유 DDS	70.83	24.58	-	714.6	28.3	-
메토트렉세이트(1 mg/kg)	20.83	18.82	0.0120	185.4	169.8	0.0013
날트렉손(10 mg/kg)	41.67	34.16	0.0813	320.8	377.5	0.0561
날트렉손 DDS(3 mg/마우스)	25.00	22.36	0.0159	204.2	229.8	0.0036

도 4e, 도 4f, 및 표 6에 나타난 바와 같이, 날트렉손 DDS 투여군은 담체 함유 DDS 투여군과 비교하였을 때 관절염 발생 빈도의 감소를 보였고, 메토트렉세이트 투여군과 비슷한 수준의 감소를 나타내었다. 관절염 발생 빈도에 대한 곡선하면적도 날트렉손 DDS 투여군은 담체 함유 DDS 투여군에 비해 감소를 나타내었고, 메토트렉세이트 투여군과 유사한 수준의 감소를 나타내었다.

따라서, 날트렉손 DDS는 경구투여용 날트렉손에 비해 우수한 치료 효능을 나타내고, 임상에서 사용되는 표준 치료제인 메토트렉세이트와 유사한 수준의 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

3. 조직형태학적 평가

실험종료일인 제41일에 마우스를 희생시키고, 뒷발의 조직을 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 헤마톡실린/에오신 염색으로 관절염 조직의 염증의 활동성을 평가하고, 톨루이딘 블루로 염색하여 연골 파괴에 대한 조직학적 치료 효과를 확인하였다.

(1) 헤마톡실린/에오신 염색

마우스의 뒷발 조직을 헤마톡실린/에오신으로 염색하고, 각 조직별 4 부위(100 배율)를 촬영하였다. 두 명 이상의 연구자가 헤마톡실린/에오신 염색에 대해 윤활막 비대증(synovial hyperplasia), 판누스 형성(pannus formation), 연골 파괴(cartilage destruction), 및 골 침식(bone erosion)의 항목을 평가하였다. 각 항목별 점수 부여 기준은 표 7에 기재하였고, 4 부위의 점수 평균을 각 조직의 점수로 계산하였다.

점수	윤활막 비대증	판누스 형성	연골 파괴	골 침식
0	없음	없음	없음	없음
1	극소수의 염증 세포가 윤활막에서 발견됨. 경증 윤활막 비대증	판누스 형성이 명확하지 않음	연골 표면이 매끄럽지 않음. 연골 표면 부위의 국소 침식	뼈 표면이 매끄럽지 않음
2	염증성 세포증식이 잘 나타나 윤활막이 두꺼워짐	판누스가 뼈에 약하게 침입함	연골 표면이 주름진 형태임	뼈에서 세포 침입이 발견됨. 골 표면 완전성의 현저한 손실
3	염증 세포의 광범위한 증식과 함께 윤활막이 심하게 두꺼워짐	판누스가 뼈에 많이 침입함	양쪽 관절 연골의 50% 이상이 파괴됨	뼈 형태가 거의 파괴됨

헤마톡실린/에오신으로 염색한 조직의 이미지를 도 5a에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Naltrexone: 날트렉손 투여군, Naltrexone DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 조직학적 점수를 도 5b에 나타내고 그 결과를 하기 표 8에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

조직염색학적 파라미터		음성 대조군 (담체 함유 DDS)	메토트렉세이트 (1 mg/kg)	날트렉손 (10 mg/kg)	날트렉손 DDS (3 mg/마우스)
윤활막 비대증	평균	3.00	0.91	1.27	0.98
	SEM	0.00	0.28	0.74	0.29
	p-값	-	< 0.0001	0.0045	< 0.0001
판누스 형성	평균	2.89	0.14	0.58	0.30
	SEM	0.10	0.21	0.77	0.49
	p-값	-	< 0.0001	0.0014	0.0001
연골 파괴	평균	2.61	0.50	0.98	0.66
	SEM	0.34	0.18	0.72	0.31
	p-값	-	< 0.0001	0.0052	< 0.0001
골 침식	평균	2.89	0.08	0.58	0.28
	SEM	0.10	0.11	0.77	0.49
	p-값	-	< 0.0001	0.0014	0.0001

도 5a, 도 5b, 및 표 8에 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서는 윤활막 세포의 과증식과 함께 판누스 조직의 증가로 연골 파괴 및 골 침식이 뚜렷하게 나타났다. 메토트렉세이트 투여군에서는 윤활막 조직의 증식이 관찰되었으나, 음성 대조군에 비해 뚜렷하게 감소하는 양상을 보였고, 연골과 뼈의 파괴 수준 역시 감소하였다. 날트렉손 DDS 투여군은 4개 파라미터 모두에서 음성 대조군보다 감소를 나타내었고, 메토트렉세이트 투여군과 비슷한 수준의 감소를 보였다.

(2) 톨루이딘 블루 염색

마우스의 뒷발 조직을 톨루이딘 블루로 염색하고, 각 조직별 4 부위(100 배율)를 촬영하였다. 두 명 이상의 연구자가 기질(matrix) 염색, 표면 규칙성, 및 연골 두께의 항목을 평가하였다. 각 항목별 점수 부여 기준은 표 9에 기재하였고, 4 부위의 점수 평균을 각 조직의 점수로 계산하였다.

점수	기질 염색	표면 규칙성	연골 두께
0	정상	매끄러움; 75% 내지 100%	정상군의 평균 깊이에 대해 > 2/3 깊이
1	약간 감소	중간; 50% 내지 75%	정상군의 평균 깊이에 대해 1/2 내지 2/3 깊이
2	현저한 감소	불규칙적; < 50%	정상군의 평균 깊이에 대해 < 1/2 깊이
3	염색되지 않음	심하게 불규칙적

톨루이딘 블루로 염색한 조직의 이미지를 도 5c에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Naltrexone: 날트렉손 투여군, Naltrexone DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 조직학적 점수를 도 5d에 나타내고 그 결과를 하기 표 10에 정리하였다(평균±SEM, **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

조직염색학적 파라미터		음성 대조군 (담체 함유 DDS)	메토트렉세이트 (1 mg/kg)	날트렉손 (10 mg/kg)	날트렉손 DDS (3 mg/마우스)
기질 염색	평균	2.97	0.61	0.92	0.59
	SEM	0.09	0.39	0.70	0.65
	p-값	-	< 0.0001	0.0015	0.0003
표면 규칙성	평균	2.78	0.34	0.80	0.44
	SEM	0.13	0.13	0.74	0.38
	p-값	-	< 0.0001	0.0024	< 0.0001
연골 두께	평균	1.78	0.11	0.39	0.16
	SEM	0.11	0.12	0.51	0.20
	p-값	-	< 0.0001	0.0024	< 0.0001

도 5c, 도 5d, 및 표 10에 나타난 바와 같이, 날트렉손 DDS 투여군은 3개 파라미터 모두에서 음성 대조군보다 감소를 나타내었고, 메토트렉세이트 투여군과 비슷한 수준의 감소를 보였다.

조직형태학적 평가 결과를 종합하면, 관절염 조직의 염증의 활동성 및 관절 손상의 중증도 평가에서 날트렉손 DDS 투여군은 양성 대조군인 메토트렉세이트 투여군과 비슷한 수준의 억제 효과를 보였을 뿐만 아니라, 날트렉손 경구투여군에 비해서도 좀 더 일관된 억제 효과를 보였다. 따라서, 날트렉손 DDS는 조직학적으로 관절염 치료 효과가 있음을 확인하였다.

4. 생체 내 안전성 평가

실시예 2.1의 각 투여군에서 마우스의 체중을 측정하여 시험물질의 생체 내 안전성을 평가하였다.

시험물질의 안전성 평가를 위해 투여 시작 전(제21일)부터 투여 종료 직전(제41일)까지 매일 마우스 체중을 측정하고, 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 시험기간동안 관절염 발생에 따라 전반적으로 마우스의 체중이 감소하는 경향이 나타났다. 날트렉손 DDS 투여군은 투여 초기에 약간의 체중 감소가 있었으나 이후 회복하였고 다른 투여군에 비해 체중의 감소가 가장 적었다. 따라서, 날트렉손 DDS는 생체 내 안전성이 있음을 확인하였다.

실시예 3. 류마티스 관절염에 대한 날트렉손 함유 마이크로스피어의 유효성 평가 (2차)

상기 실시예 2에서 실시된 날트렉손 함유 마이크로스피어의 류마티스 관절염에 대한 생체 내 유효성 평가에 이어, 투여량과 메토트렉세이트와의 병용 투여 및 대조군에 차이를 주어 추가적인 유효성 실험을 진행하였다.

상기 실시예 2와 동일하게 제조된 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델(6-10주령의 DBA/1J 계통의 수컷 마우스; 0일째 1차 면역화 및 21일째 2차 면역화)를 이용하였다.

피검 물질로서, 제조예 1에 기재된 바와 같이 준비된 날트렉손 DDS("Q-DDS")를 준비하였다. 음성 대조군으로서 날트렉손 대신 담체를 함유한 DDS를 사용하였고, 양성 대조군으로서 메토트렉세이트(methotrexate: MTX, 엠티엑스 주, 50 mg/2 mL, 중외제약)와 토파시티닙(젤잔즈®정, 5mg, 한국화이자)을 사용하였다.

투여군별 투여 정보는 하기 표 11에 기재된 바와 같다

투여군 (각 군별, n=6)	투여 약물	투여 경로	투여 용법 및 용량 (유효성분 기준)	투여 부피(㎕)
1(음성 대조군)	담체 함유 DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, N/A	140
2(양성 대조군)	메토트렉세이트(MTX)	복강 주사	2회/주, 1 mg/kg 체중/회	100
3(양성 대조군)	토파시티닙(젤잔즈®)	경구	1회/일, 10 mg/kg 체중/회	200
4(시험군)	Q-DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 1 mg/마우스	50
5(시험군)	Q-DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 3 mg/마우스	160
6(시험군)	Q-DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 5 mg/마우스	260
7(시험군)	Q-DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 10 mg/마우스	500
8(시험군)	Q-DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 20 mg/마우스	1000
9(시험군)	MTX +Q-DDS	복강 + 피하 주사	MTX : 2회/주, 1 mg/kg 체중/회 Q-DDS : 제23일에 1회 투여, 3 mg/마우스	160

각각의 평가 지표에 대한 암맹평가 자료를 기반으로 음성 대조군과 시험군 또는 두 시험군 간의 통계분석을 SPSS를 통해 수행하였다. 양 군 간의 비교를 위해 Student's t-test 또는 Mann Whitney U test를 이용하였다. 여러 시점에서의 치료군 간의 차이를 비교할 때는 repeated measures ANOVA with Turkey's post-hoc test를 이용하였다. 유의 수준은 p-값이 0.05 이하로 하였다.

2. 관절염 활성도의 임상학적 평가

콜라겐-유도 관절염 마우스 모델에 시험물질을 투여한 후, 군 분리일로부터 실험 종료일(제41일)까지 정기적으로 염증 발생 및 그 수준을 관찰하였다. 염증 수준은 상기 표 4의 기준에 따라 각 발에 대해 0 내지 4점의 점수를 부여하고 그 합계를 임상 관절염 지수(clinical arthritis index: CAI)로 사용하였다.

각 투여군의 발가락 이미지를 도 7a에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군). 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 임상 관절염 지수(CAI)를 도 7b에 나타내고, 임상 관절염 지수의 곡선하면적(area under the curve: AUC)을 나타내는 그래프를 도 7c에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), **: p-값 < 0.01, ***: p-값 < 0.001). 임상 관절염 지수 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 12에 정리하였다.

군	CAI			CAI-AUC
군	평균	평균의 표준오차	p-값	평균	평균의 표준오차	p-값
담체 함유 DDS	11.75	1.20	-	150.65	12.03	-
메토트렉세이트(1 mg/kg)	6.35	1.05	<0.0001	71.20	8.19	<0.0001
젤잔즈® (10 mg/kg)	6.25	0.75	<0.0001	74.50	9.63	<0.0001
Q-DDS (1 mg/마우스)	7.30	1.28	<0.0001	91.13	16.43	<0.0001
Q-DDS (3 mg/마우스)	7.60	1.69	<0.0001	88.05	14.86	<0.0001
Q-DDS (5 mg/마우스)	6.30	1.32	<0.0001	73.30	10.77	<0.0001
Q-DDS (10 mg/마우스)	5.25	0.69	<0.0001	66.08	8.09	<0.0001
Q-DDS (20 mg/마우스)	6.85	1.30	<0.0001	78.63	11.93	<0.0001
메토트렉세이트(1 mg/kg) + Q-DDS (3 mg/마우스)	5.95	1.30	<0.0001	63.60	10.75	<0.0001

도 7b, 도 7c, 및 표 12에 나타난 바와 같이, 양성 대조군, 날트렉손 DDS 투여군(시험군) 및 MTX+날트렉손 DDS 투여군(병용 시험군)은 담체 함유 DDS 투여군(음성 대조군)과 비교하였을 때 임상 관절염 지수의 감소를 보였다. 특히, 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군과 병용 투여군이 가장 낮은 임상 관절염 지수를 나타내었으며 이는 메토트렉세이트 투여군 및 젤잔즈® 투여군(토파시티닙 투여군; 양성 대조군)보다 낮은 수치를 보였다. 임상 관절염 지수에 대한 곡선하면적도 담체 함유 DDS 투여군에 비해 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군, 및 병용 투여군에서 모두 감소를 보였다. 날트렉손 DDS 1 mg/마우스 내지 10 mg/마우스 투여 용량 사이에서는 투여 용량이 증가함에 따라 임상 관절염 지수가 더 낮아지는 농도-의존성 효과가 확인되었으나, 날트렉손 DDS 20 mg/마우스 투여군에서는 투여 용량 대비 관절염 치료 효과가 감소하는 것으로 나타났다. 아울러, 메토트렉세이트와 날트렉손 DDS 3 mg/마우스 투여군(병용 시험군)은 메토트렉세이트 단독 투여군이나 날트렉손 DDS 3 mg/마우스 투여군에 비해 임상 관절염 지수가 더 낮게 나타나고, 임상 관절염 지수에 대한 곡선하면적이 최저의 수치를 보여, 이의 상승효과를 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 통해 본 발명의 날트렉손 DDS가 임상에서 사용되고 있는 표준 치료제와 유사한 정도의 임상 관절염 지수 감소 효과를 보이는 것을 확인하였으며, 날트렉손 DDS 1 mg/마우스 내지 10 mg/마우스 투여 용량 사이에서 치료 용량에 따른 농도-의존성과, 날트렉손과 메토트렉세이트 간에 상승 효과가 있음을 확인하였다.

시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 관절염 발생 빈도(%)를 도 7d에 나타내고, 발생 빈도의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프를 도 7e에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001). 발생 빈도 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 13에 정리하였다.

군	발생 빈도(%)			발생 빈도-AUC
군	평균	평균의 표준오차	p-값	평균	평균의 표준오차	p-값
담체 함유 DDS	70.0	9.9	-	835.0	89.2	-
메토트렉세이트(1 mg/kg)	30.0	11.5	<0.0001	170.0	77.1	<0.0001
젤잔즈® (10 mg/kg)	27.5	9.2	<0.0001	263.8	122.7	<0.0001
Q-DDS (1 mg/마우스)	35.0	12.1	0.0002	337.5	185.4	0.0012
Q-DDS (3 mg/마우스)	35.0	14.7	0.0001	307.5	103.3	<0.0001
Q-DDS (5 mg/마우스)	22.5	12.4	<0.0001	196.3	121.3	<0.0001
Q-DDS (10 mg/마우스)	12.5	6.6	<0.0001	131.3	71.9	<0.0001
Q-DDS (20 mg/마우스)	22.5	12.4	<0.0001	216.3	112.1	<0.0001
메토트렉세이트(1 mg/kg) + Q-DDS (3 mg/마우스)	25.0	11.8	<0.0001	167.5	90.9	<0.0001

도 7d, 도 7e, 및 표 13에 나타난 바와 같이, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군(시험군) 및 MTX+날트렉손 DDS 투여군(병용 투여군)은 담체 함유 DDS 투여군과 비교하였을 때 관절염 발생 빈도의 감소를 보였다. 나아가, 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군과 병용 투여군의 경우 메토트렉세이트 투여군보다 관절염 발생빈도가 감소하였다. 관절염 발생 빈도에 대한 곡선하면적에서 날트렉손 DDS 1 mg/마우스 내지 10 mg/마우스 투여용량 사이에서는 투여 용량에 따른 농도-의존성 효과가 확인되었다. 특히, 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군은 가장 뚜렷한 감소 소견을 나타내었으며, 메토트렉세이트 투여군 및 젤잔즈® 투여군보다도 뚜렷한 감소 소견을 보였다.

아울러, 메토트렉세이트와 날트렉손 DDS 3 mg/마우스 투여군(병용 시험군)은 메토트렉세이트 단독 투여군이나 날트렉손 DDS 3 mg/마우스 투여군에 비해 관절염 발생 빈도가 더 낮게 나타나 이의 상승효과를 확인할 수 있었다.

3. 조직형태학적 평가

(1) 헤마톡실린/에오신 염색

상기 실시예 2. 3. (1)과 동일한 방법으로 헤마톡실린/에오신 염색을 수행 및 평가하였고, 윤활막 비대증(synovial hyperplasia), 판누스 형성(pannus formation), 연골 파괴(cartilage destruction), 및 골 침식(bone erosion)의 항목에 대한 점수는 상기 표 7을 기준으로, 4 부위의 점수 평균을 각 조직의 점수로 계산하였다.

헤마톡실린/에오신으로 염색한 조직의 이미지를 도 8a에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 조직학적 점수를 도 8b에 나타내고 그 결과를 하기 표 14에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	p-값
조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX	vs Xeljanz®
윤활막 비대증	음성 대조군 (담체)	3.00	0.00	-	< 0.0001	0.0012
	MTX	1.38	0.29	< 0.0001	-	0.6489
	Xeljanz®	1.56	0.39	0.0012	0.6489	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.98	0.54	0.0441	0.2564	0.4634
	Q-DDS (3 mg/마우스)	2.00	0.43	0.0183	0.1737	0.3825
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.98	0.27	< 0.0001	0.2485	0.1658
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.63	0.10	< 0.0001	0.0127	0.0175
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.58	0.56	0.0108	0.6942	0.9720
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.79	0.18	< 0.0001	0.0599	0.0529
판누스 형성	음성 대조군 (담체)	3.00	0.00	-	< 0.0001	0.0004
	MTX	0.92	0.36	< 0.0001	-	0.6608
	Xeljanz®	1.13	0.44	0.0004	0.6608	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.58	0.67	0.0273	0.3075	0.5004
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1.58	0.59	0.0147	0.2627	0.4629
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.21	0.14	< 0.0001	0.0489	0.0358
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.06	0.05	< 0.0001	0.0165	0.0150
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.17	0.68	0.0079	0.6985	0.9529
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.06	0.08	< 0.0001	0.0175	0.0156
연골 파괴	음성 대조군 (담체)	2.98	0.03	-	< 0.0001	0.0004
	MTX	1.02	0.30	< 0.0001	-	0.3907
	Xeljanz®	1.38	0.38	0.0004	0.3907	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.71	0.56	0.0199	0.2157	0.5592
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1.75	0.45	0.0071	0.1294	0.4519
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.65	0.20	< 0.0001	0.2356	0.0627
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.42	0.06	< 0.0001	0.0380	0.0117
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.38	0.51	0.0033	0.4839	0.9975
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.46	0.14	< 0.0001	0.0654	0.0187
골 침식	음성 대조군 (담체)	3.00	0.00	-	< 0.0001	0.0004
	MTX	0.92	0.36	< 0.0001	-	0.6608
	Xeljanz®	1.13	0.44	0.0004	0.6608	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.58	0.678	0.0273	0.3075	0.5004
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1.58	0.59	0.0147	0.2627	0.4629
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.19	0.15	< 0.0001	0.0445	0.0330
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.04	0.05	< 0.0001	0.0145	0.135
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.17	0.68	0.079	0.6985	0.9529
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.06	0.08	< 0.0001	0.0175	0.0156

도 8a, 도 8b, 및 표 14에 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서는 활막세포의 과증식과 함께 파누스 조직의 증가로 연골파괴 및 뼈 미란이 뚜렷하게 나타났으며, 양성 대조군인 MTX 또는 Xeljanz® 투여군에서는 일부 활막조직의 증식소견을 제외하고 다른 parameter 에서 음성 대조군에 비해 뚜렷하게 감소된 양상을 보였다. 날트렉손 DDS 투여군의 경우 1, 3, 그리고 20 mg/마우스 투여군에서는 활막조직의 증식소견이 관찰되었고 일부 연골파괴와 뼈 미란현상이 시작되는 것이 관찰되었다. 날트렉손 DDS 5 mg/마우스와 10 mg/ 마우스 투여군, 그리고 병용 투여군의 경우 4 가지 지표에 있어 모두 음성 대조군보다 감소를 나타내었을 뿐 아니라, 양성 대조군인 MTX 및 Xeljanz ® 투여군과 비교하였을 때에도 감소 소견을 보였다.

(2) 톨루이딘 블루 염색

상기 실시예 2. 3. (2)와 동일한 방법으로 마우스의 뒷발 조직을 톨루이딘 블루로 염색하고, 촬영 및 기질(matrix) 염색, 표면 규칙성, 및 연골 두께의 항목을 평가하였다. 각 항목별 점수 부여 기준은 상기 표 9에 기재하였고, 4 부위의 점수 평균을 각 조직의 점수로 계산하였다.

톨루이딘 블루로 염색한 조직의 이미지를 도 9a에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 조직학적 점수를 도 9b에 나타내고 그 결과를 하기 표 15에 정리하였다(평균±SEM, **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	p-값
조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX	vs Xeljanz®
기질 염색	음성 대조군 (담체)	3.00	0.00	-	< 0.0001	< 0.0001
	MTX	1.15	0.16	< 0.0001	-	0.2676
	Xeljanz®	1.42	0.23	< 0.0001	0.2676	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.92	0.36	0.0040	0.0366	0.1814
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1.96	0.45	0.0177	0.0639	0.2198
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.92	0.18	< 0.0001	0.2767	0.0659
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.63	0.06	< 0.0001	0.0037	0.0023
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.46	0.60	0.0104	0.5517	0.9384
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.83	0.09	< 0.0001	0.0612	0.0163
표면 규칙성	음성 대조군 (담체)	3.00	0.00	-	< 0.0001	< 0.0001
	MTX	1.02	0.19	< 0.0001	-	0.6652
	Xeljanz®	1.13	0.22	< 0.0001	0.6652	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.75	0.34	0.0011	0.0442	0.0868
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1.83	0.49	0.0159	0.0886	0.1383
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.56	0.24	< 0.0001	0.0946	0.0587
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.35	0.10	< 0.0001	0.0032	0.0027
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.15	0.68	0.0074	0.8321	0.9721
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.46	0.14	< 0.0001	0.0147	0.0101
연골 두께	음성 대조군 (담체)	1.96	0.05	-	< 0.0001	< 0.0001
	MTX	0.38	0.15	< 0.0001	-	0.3341
	Xeljanz®	0.56	0.17	< 0.0001	0.3341	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	1.04	0.24	0.0009	0.0150	0.0719
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1.10	0.39	0.0245	0.0589	0.1521
	Q-DDS (5 mg/마우스)	0.21	0.12	< 0.0001	0.3035	0.0625
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.10	0.06	< 0.0001	0.0652	0.0115
	Q-DDS (20 mg/마우스)	0.67	0.47	0.0075	0.4855	0.8040
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	0.19	0.09	< 0.0001	0.2094	0.0375

도 9a, 도 9b, 및 표 15에 나타난 바와 같이, 날트렉손 DDS 투여군은 3개 파라미터 모두에서 음성 대조군보다 조직학적 점수의 감소를 나타내었고, 특히 5 mg/마우스와 10 mg/마우스 투여군, 그리고 병용 투여군에서 MTX 및 Xeljanz ® 투여군 보다도 낮은 수준의 조직학적 점수를 보였다.

조직형태학적 평가 결과를 종합하면, 관절염 조직의 염증의 활동성 및 관절 손상의 중증도 평가에서 날트렉손 DDS 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군 그리고 병용 투여군에서 음성 대조군에 비해 염증 치료효과가 있었을 뿐 아니라 표준 항류마티스제인 메토트렉세이트나 젤잔즈® 투여군과 같은 양성 대조군에 비해서도 더 효과적인 관절염 억제효과를 나타내었다. 따라서, 날트렉손 DDS는 조직학적으로 관절염 치료 효과가 있으며, 적정량 투여시 기존의 표준 항류마티스제보다도 더 우수한 효과를 지님을 확인하였다.

4. 생체 내 안전성 평가

실시예 3.1.의 각 투여군에서 마우스의 체중을 측정하여 시험물질의 생체 내 안전성을 평가하였다.

시험물질의 안전성 평가를 위해 투여 시작 전(제21일)부터 투여 종료 직전(제41일)까지 매일 마우스 체중을 측정하고, 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 도 10 및 표 16에 나타내었다.

체중 변화	D23 체중		D41 체중		체중 변화 (%, D23 체중을 100%)
체중 변화	평균	표준오차	평균	표준오차	평균	표준오차
음성 대조군 (담체)	22.6	0.3	20.5	1.0	90.8	3.7
MTX	22.7	0.5	23.8	1.2	104.7	3.5
Xeljanz®	21.7	0.5	21.6	0.8	99.6	2.5
Q-DDS (1 mg/마우스)	21.4	0.6	20.7	0.9	96.9	3.6
Q-DDS (3 mg/마우스)	22.2	0.9	21.7	0.6	98.2	4.0
Q-DDS (5 mg/마우스)	22.8	0.6	22.5	1.3	98.5	4.3
Q-DDS (10 mg/마우스)	22.6	0.5	22.5	0.8	99.6	2.0
Q-DDS (20 mg/마우스)	22.7	0.7	23.4	1.1	103.2	4.3
MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	22.2	0.5	22.3	1.0	100.3	2.8

도 10 및 표 16에 나타난 바와 같이, 시험기간동안 관절염 중증도가 높을 경우 마우스의 체중이 감소하는 경향이 나타났다. 음성 대조군에서 9.2% 체중 감소가 일어난데 비해, 날트렉손 DDS 투여군은 체중 감소가 거의 일어나지 않았다. 따라서, 날트렉손 DDS는 생체 내 안전성이 있음을 확인하였다.

5. 마이크로-CT를 이용한 관절염의 영상학적 평가

상기 실시예 3.1.에서 시험물질 치료하고, 각 군별 결과를 대표하는 발조직을 고정한 후 micro-CT scanner(Quantum FX, Perkin Elmer, MA)를 이용하여 촬영하였다. 방사선 사진은 Quantum FX μCT 이미징 시스템 (Perkin Elmer, MA)를 이용하여 3D 렌더링한 후, 방사선학적 점수(radiological score)를 평가하고, 골 부피 비율(골 부피[Bone volume; BV]/조직 부피[Tissue volume; TV])과 골 표면 밀도(bone surface density; Bone surface area(BS)/Bone volume(BV))도 측정하였다. 두 명 이상의 연구자가 관절 파괴에 대해 암맹 평가를 수행하였고, 하기 표 17의 지표를 점수 부여 기준으로 하였다. 연구자들의 암맹평가 자료를 평균한 값을 점수로 하고, 발조직의 점수 평균을 각 그룹의 점수로 계산하였다.

점수	관절 파괴
0	손상 없음
1	확인된 한 지점에서 미소한 골 파괴가 관찰됨
2	한 영역 내 2-4 지점, 다소의 변화
3	하나 이상의 영역 내 2-4 지점, 확연한 변화
4	관절에 피해를 입히는 심각한 침식
5	관절의 완벽한 파괴

마이크로-CT로 촬영한 각 군별 대표 이미지를 도 11a에 나타내고, 특히 관절 부분을 확대한 이미지를 도 11b에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 방사선학적 점수를 도 11c에 나타내고 그 결과를 하기 표 18에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), *: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.05, **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001, #: MTX 투여군 대비 p-값 < 0.05, †: MTX 투여군 대비 p-값 < 0.05).

방사선학적 분석 수치		평균	평균의 표준오차	p-값
방사선학적 분석 수치		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX	vs Xeljanz®
골 부피/조직 부피 (%)	음성 대조군 (담체)	13.50	1.06	-	0.0002	0.0097
	MTX	31.25	0.62	0.0002	-	0.0624
	Xeljanz®	25.27	1.92	0.0097	0.0624	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	28.46	2.92	0.0141	0.4652	0.4730
	Q-DDS (3 mg/마우스)	23.57	4.18	0.1131	0.1906	0.7653
	Q-DDS (5 mg/마우스)	32.24	0.27	0.0001	0.2726	0.0358
	Q-DDS (10 mg/마우스)	35.82	1.09	0.0002	0.0341	0.0144
	Q-DDS (20 mg/마우스)	26.81	6.10	0.1363	0.5654	0.8444
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	31.93	0.16	0.0001	0.4119	0.0403
골 표면 넓이/골 부피 (mm^-1)	음성 대조군 (담체)	9.00	0.23	-	0.0004	0.0011
	MTX	6.12	0.06	0.0004	-	0.0703
	Xeljanz®	6.52	0.13	0.0011	0.0703	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	6.23	0.14	0.0008	0.5389	0.2600
	Q-DDS (3 mg/마우스)	6.84	0.47	0.0233	0.2578	0.5947
	Q-DDS (5 mg/마우스)	6.09	0.06	0.0004	0.8030	0.0587
	Q-DDS (10 mg/마우스)	6.12	0.04	0.0004	0.9423	0.0639
	Q-DDS (20 mg/마우스)	6.75	0.45	0.0180	0.2981	0.6934
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	6.14	0.03	0.0004	0.7847	0.0673
방사선학적 점수	음성 대조군 (담체)	4.67	0.41	-	0.0002	0.0010
	MTX	1.67	0.49	0.0002	-	0.5078
	Xeljanz®	2.08	0.56	0.0010	0.5078	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	2.33	0.66	0.0044	0.3466	0.7314
	Q-DDS (3 mg/마우스)	2.33	0.72	0.0062	0.3705	0.7433
	Q-DDS (5 mg/마우스)	1.42	0.33	< 0.0001	0.6171	0.2368
	Q-DDS (10 mg/마우스)	1.08	0.40	< 0.0001	0.2862	0.1046
	Q-DDS (20 mg/마우스)	1.83	0.61	0.0008	0.7989	0.7176
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	1.08	0.33	< 0.0001	0.2563	0.0884

도 11a, 및 도 11b에서 확인되듯이, 마이크로-CT 스캔 결과 음성 대조군의 경우 뼈의 부피가 감소하였고 발 관절의 뼈 미란이 여러 관절에서 뚜렷이 관찰되었으며, 양성 대조군인 MTX 투여군 및 젤잔즈® 투여군에서는 일부 관절 부분에서 부피가 감소한 것이 관찰되었으나, 음성 대조군에 비해 감소의 폭이 적었다. 날트렉손 DDS 투여군에서는 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군 그리고 병용 투여군에서 거의 정상 발조직과 유사한 수준의 관절형태를 유지하고 있었으며 뼈 미란도 관찰되지 않았다.

골 부피 비율 측정 결과, 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군에서 음성 대조군 대비 높은 값을 보였으며(Vehicle DDS vs Q-DDS 10 mg/mouse, 13.50 % ± 1.06 % vs 35.82 % ± 1.09 %, p < 0.001), 양성 대조군에 비해서도 증가된 값을 보였다(MTX vs Xeljanz® vs Q-DDS 10 mg/마우스, 31.25 % ± 0.62 % vs 25.27 % ± 1.92 % vs 35.82 % ± 1.09 %, p < 0.05). 골 표면 밀도 측정 결과, 음성 대조군 대비 모든 치료군에서 낮게 나타났으며, 특히, 날트렉손 DDS 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군, 그리고 병용 투여군에서 양성 대조군 중 MTX 투여군과 비슷한 수준으로 정상 관절과 유사한 소견을 보였을 뿐 아니라(Vehicle DDS vs Q-DDS 5 mg/마우스 vs Q-DDS 10 mg/마우스 vs MTX+Q-DDS, 9.00 mm^-1 ± 0.23 mm^-1 vs 6.09 mm^-1 ± 0.06 mm^-1 vs 6.12 mm^-1 ± 0.04 mm^-1 vs 6. 14 mm^-1 ± 0.03 mm^-1, p < 0.001), 젤잔즈® 투여군과 비교하였을 때에서는 더 낮은 수준으로 나타났다. 관절 파괴에 대한 방사선학적 점수 결과, 음성 대조군과 비교할 때, 양성 대조군을 포함한 날트렉손 DDS 투여군에서 방사선학적 점수가 감소하였으며, 특히, 날트렉손 DDS 투여군에서는 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군 그리고 병용 투여군에서는 양성 대조군보다도 방사선학적 점수의 감소를 나타내었다. 결국, 날트렉손 DDS는 관절염의 염증을 치료할 뿐 아니라, 그 결과로 관절 파괴의 진행을 억제하는 것을 확인하였다.

6. 관절염 조직 및 혈액에서의 복합 단백질 면역측정(Multiplex Protein Immunoassay)

마우스 관절염 조직 및 혈액 내 염증 물질의 정량적 분석을 통해 염증 활성도 평가와 시험물질의 활성 기작(mode of action)을 확인하기 위해 염증 매개 인자를 단백질 수준에서 조사하였다. 단백질 분석을 위한 추출할 수 있는 샘플의 양의 한계를 극복하기 위해, 소량의 샘플에서 가장 많은 단백질을 분석할 수 있는 Luminex technology 기반의 다중-분석물-ELISA(multi-analyte-ELISA) 방법을 사용하였다.

(1) 관절염 조직의 염증매개인자 단백질 농도 분석을 통한 바이오마커 평가

상기 실시예 3. 1.의 방법으로 시험물질 치료 후 얻은 마우스 관절조직을 세라믹 비드를 통해 분쇄하고 용해 완충액(lysis buffer, Cat. 1713040111, Bio-Rad)를 사용하여 전 단백질을 추출하였다. Pro-reagent kit V를 사용하여 투여군별로 동일량의 단백질(2.7mg/mL)을 1/4로 희석하여 표적-결합 비드와 30분 동안 배양 접시에서 반응시켰다. 세척 완충액으로 씻어낸 후, 표적-측정 항체와 30분 동안 반응시키고, 다시 세척 완충액으로 세척한 후 streptavidin-PE로 10분동안 반응시킨다. 이후 Bio-Plex® 200 시스템(Bio-Rad)를 이용하여 투여군 별로 표적 단백질을 정량적으로 측정한다. 상기 표적-결합 비드는 Bio-Plex Mouse cytokine 4-plex (IL-1β, IL-6, IL-17A, TNF-α; Cat. 171G5002M), Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 1-plex (MCP1; Cat. 171G5019M), Bio-Plex Pro Mouse Cytokine II 1-plex (MIP2 ; Cat. 171G6006M), Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 1-plex (IL-6; Cat. 171G5007M)(상기 제품은 모두 Bio Rad 사) 등으로부터 필요에 따라 조합이 가능한 set로 구성하여 측정에 사용하였다.

측정 결과는 정량된 표적 단백질에 마우스 발조직 무게를 보정하였다. 각 대상 관절은 뒷발을 주로 사용하였으며 관절조직에서 추출한 단백질량의 한계를 극복하기 위해, 한 개의 웰(well)에 최대 4개까지의 염증매개물질을 측정하였다.

한편, 측정하는 표적 단백질을 염증매개물질 중 대표적인 염증 촉진 사이토카인 A군(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α) 및 염증매개물질 중 케모카인 B 군(MCP-1 및 MIP-2)으로 선정하여 실험을 진행하였다. 측정한 결과는 도 12a 및 도 12b, 및 하기 표 19 및 표 20에 정리하였다.

관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	p-값
관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX	vs Xeljanz®
IL-1β	음성 대조군 (담체)	26.77	12.21	-	0.0276	0.1321
	MTX	1.05	0.31	0.0276	-	0.0069
	Xeljanz®	12.68	4.38	0.1321	0.0069	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	3.44	0.79	0.0122	0.0034	0.0067
	Q-DDS (3 mg/마우스)	15.98	2.27	0.2112	< 0.0001	0.3297
	Q-DDS (5 mg/마우스)	5.52	0.94	0.0201	0.0001	0.0289
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.83	0.25	0.0064	0.4583	0.0009
	Q-DDS (20 mg/마우스)	7.64	4.29	0.0473	0.0867	0.2340
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	3.28	0.31	0.0034	< 0.0001	0.0014
IL-6	음성 대조군 (담체)	250.8	187.0	-	0.1341	0.2264
	MTX	1.8	0.7	0.1341	-	0.0359
	Xeljanz®	88.6	44.8	0.2264	0.0359	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	14.0	4.4	0.0750	0.0057	0.0246
	Q-DDS (3 mg/마우스)	35.3	10.3	0.1023	0.0017	0.1019
	Q-DDS (5 mg/마우스)	14.1	2.0	0.0749	< 0.0001	0.0242
	Q-DDS (10 mg/마우스)	1.5	0.5	0.0623	0.6586	0.0102
	Q-DDS (20 mg/마우스)	15.5	10.1	0.0771	0.1247	0.0298
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	6.1	2.4	0.0326	0.0505	0.0046
IL-17	음성 대조군 (담체)	8.70	1.11	-	< 0.0001	0.0022
	MTX	2.269	0.29	< 0.0001	-	0.0179
	Xeljanz®	4.57	0.99	0.0022	0.0179	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	3.06	0.35	< 0.0001	0.0459	0.0465
	Q-DDS (3 mg/마우스)	7.11	0.99	0.1690	0.0001	0.0150
	Q-DDS (5 mg/마우스)	3.21	0.45	< 0.0001	0.0419	0.0877
	Q-DDS (10 mg/마우스)	1.78	0.50	< 0.0001	0.2862	0.0018
	Q-DDS (20 mg/마우스)	4.87	2.29	0.0824	0.1964	0.8487
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	3.40	0.71	< 0.0001	0.0881	0.1346
TNF-α	음성 대조군 (담체)	45.61	7.21	-	0.0001	0.0129
	MTX	6.54	1.60	0.0001	-	0.0077
	Xeljanz®	24.52	6.78	0.0129	0.0077	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	10.14	2.15	< 0.0001	0.1037	0.0080
	Q-DDS (3 mg/마우스)	42.60	6.97	0.6925	< 0.0001	0.0131
	Q-DDS (5 mg/마우스)	10.42	1.28	< 0.0001	0.0213	0.0075
	Q-DDS (10 mg/마우스)	3.54	1.10	< 0.0001	0.0504	0.0003
	Q-DDS (20 mg/마우스)	45.37	24.23	0.9915	0.0748	0.2310
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	29.01	3.11	0.0032	< 0.0001	0.3208

관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	p-값
관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX	vs Xeljanz®
MCP-1	음성 대조군 (담체)	3371.1	2096.6	-	0.0831	0.4044
	MTX	76.1	11.5	0.0831	-	0.0294
	Xeljanz®	207.9	954.6	0.4044	0.0294	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	281.8	22.6	0.0421	< 0.0001	0.0154
	Q-DDS (3 mg/마우스)	1062.6	120.1	0.1168	< 0.0001	0.1599
	Q-DDS (5 mg/마우스)	366.9	57.0	0.0473	< 0.0001	0.0204
	Q-DDS (10 mg/마우스)	69.8	9.4	0.0316	0.5709	0.0077
	Q-DDS (20 mg/마우스)	398.3	247.0	0.0514	0.1389	0.0262
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	111.8	12.9	0.0134	0.0112	0.0026
MIP-2	음성 대조군 (담체)	519.3	249.7	-	0.0301	0.0359
	MTX	4.4	1.7	0.0301	-	0.0077
	Xeljanz®	126.8	46.9	0.0359	0.0077	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	53.9	18.0	0.0139	0.0055	0.0452
	Q-DDS (3 mg/마우스)	251.5	13.3	0.1257	< 0.0001	0.0015
	Q-DDS (5 mg/마우스)	98.1	23.2	0.0236	0.000.	0.4237
	Q-DDS (10 mg/마우스)	17.4	8.5	0.0089	0.0908	0.0034
	Q-DDS (20 mg/마우스)	139.2	92.7	0.0550	0.1021	0.8596
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	28.2	12.9	0.0029	0.0423	0.0024

상기 과정을 통해 관절염 조직에서 대표적인 염증 촉진 사이토카인 4종(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α)의 단백질량 측정 결과, IL-1β과 IL-6는 유사한 패턴을 보였으며, 날트렉손 DDS 투여군에서는 대체로 관절염의 활성도 임상 지표인 CAI와 비슷한 결과를 보였다. 특히, 날트렉손 DDS 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군 그리고 병용 투여군에서는 음성 대조군에 비해 염층 촉진 사이토카인의 감소가 나타났고, 양성 대조군인 젤잔즈® 투여군과 비교하였을 때에도 감소를 나타내었다(도 12a 및 표 19).

IL-17 및 TNF-α의 경우도 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군에 비해 감소 소견을 보였으며, 특히 날트렉손 DDS 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군에서는 음성 대조군에 비해 감소를 나타내었을 뿐 아니라, 양성 대조군인 젤잔즈® 투여군과 비교하였을 때에도 감소를 나타내었다(IL 17: Xeljanz® vs 10 mg/mouse, 4.57 pg/ml ± 0.99 pg/ml vs 1.78 pg/ml ± 0.50 pg/ml, p < 0.01; TNF-α: Xeljanz® vs 5 mg/mouse vs 10 mg/mouse, 24.52 pg/ml ± 6.78 pg/ml vs 10.42 pg/ml ± 1.28 pg/ml vs 3.54 pg/ml ± 1.10 pg/ml, p < 0.01).

아울러, 케모카인 MCP-1 및 MIP-2의 측정 결과, 두 가지 모두 날트렉손 DDS 5 mg/마우스 투여군과 10 mg/마우스 투여군 그리고 병용 투여군에서는 음성 대조군에 비해 감소를 나타내었고(Vehicle DDS vs 5 mg/mouse vs 10 mg/mouse vs MTX+Q-DDS, MCP 1: 3371.1 pg/ml ± 2096.6 pg/ml vs 366.9 pg/ml ± 57.0 pg/ml ml vs 69.8 pg/ml ± 9.4 pg/ml vs 111.8 pg/ml ± 12.9 pg/ml, p < 0.05; MIP-2: 519.3 pg/ml ± 249.7 pg/ml vs 98.1 pg/ml ± 23.2 pg/ml vs 17.4 pg/ml ± 8.5 pg/ml vs 28.2 pg/ml ± 12.9 pg/ml, p < 0.05), 양성 대조군인 젤잔즈® 투여군과 비교하였을 때에도 감소를 나타내었다(Xeljanz® vs 10 mg/mouse vs MTX+Q-DDS, MCP 1: 207.9 pg/ml ± 954.6 pg/ml vs 69.8 pg/ml ± 9.4 pg/ml vs 111.8 pg/ml ± 12.9 pg/ml, p < 0.01; MIP-2: 126.8 pg/ml ± 46.9 pg/ml vs 17.4 pg/ml ± 8.5 pg/ml vs 28.2 pg/ml ± 12.9 pg/ml, p < 0.01).

결과적으로, 관절염 조직 내에서 측정한 주요 염증매개물질은 임상적 지표와 매우 유사한 패턴을 보였으며, 특히 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군에서 염증 촉진 사이토카인 A군(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α) 및 케모카인 B 군(MCP-1 및 MIP-2)에 속하는 염증매개물질 전부가, 음성 대조군에 비해 감소를 보였으며, 임상 표준 치료제인 젤잔즈® 투여군에 비해서도 감소를 나타내었다.

(2) 혈액의 염증매개인자 단백질 농도 분석을 통한 바이오마커 평가

상기 실시예 3. 1.의 방법으로 시험물질 치료 후 얻은 마우스 혈액(혈청)을 Pro-reagent kit V를 사용하여 투여군별로 동일량의 단백질(2.7mg/mL)을 1/4로 희석한 후, 표적-결합 비드(IL-6 표적)와 30분 동안 배양 접시에서 반응시켰다. 세척 완충액으로 씻어낸 후, 표적-측정 항체와 30분 동안 반응시키고, 다시 세척 완충액으로 세척한 후 streptavidin-PE로 10분동안 반응시킨다. 이후 Bio-Plex® 200 시스템(Bio-Rad)를 이용하여 투여군 별로 표적 단백질을 정량적으로 측정한다. 상기 표적-결합 비드는 상기 실시예 3. 6.(1)에 개시된 비드를 사용하였다.

측정 결과는 정량된 IL-6 단백질량에 마우스 발조직 무게를 보정하였다. 각 대상 관절은 뒷발을 주로 사용하였으며 관절조직에서 추출한 단백질량의 한계를 극복하기 위해, 한 개의 웰(well)에 최대 4개까지의 염증매개물질을 측정하였다.

측정한 결과는 도 13 및 하기 표 21에 정리하였다.

혈액 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	p-값
혈액 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX	vs Xeljanz®
IL-6	음성 대조군 (담체)	144.7	92.2	-	0.2065	0.4558
	MTX	39.6	24.3	0.2065	-	0.093
	Xeljanz®	94.5	30.8	0.4558	0.0903	-
	Q-DDS (1 mg/마우스)	79.5	36.1	0.3494	0.2594	0.6416
	Q-DDS (3 mg/마우스)	58.8	38.4	0.2293	0.5972	0.2933
	Q-DDS (5 mg/마우스)	33.5	19.1	0.0974	0.7898	0.0224
	Q-DDS (10 mg/마우스)	7.2	1.7	0.0400	0.0636	0.0006
	Q-DDS (20 mg/마우스)	7.2	2.8	0.0400	0.0648	0.0006
	MTX+ Q-DDS (3 mg/마우스)	5.2	1.9	0.0156	0.0233	0.0001

도 13 및 상기 표 21에서 알 수 있듯이, 염증매개인자 중 IL-6의 단백질량 측정 결과, 날트렉손 DDS 용량별 투여군에서는 모두 감소하였고, 일견 농도-의존적 감소를 보였으나, 특히 날트렉손 DDS 5 mg/마우스 이상의 투여 농도에서 현저한 감소를 보였다. 특히 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군과 20 mg/마우스 투여군 그리고 병용 투여군에서 가장 낮은 IL-6 농도를 나타냈고, 음성 대조군에 비교했을 때 감소하였으며, 양성 대조군인 젤잔즈® 투여군과 비교하였을 때에도 감소를 나타내었다.

결론적으로, 염증 반응 캐스케이드의 하류에 존재하는 IL-6의 혈중 농도는 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군과 병용 투여군에서 관절염 조직소견이나 임상 소견과 일치하는 결과를 보였다.

실시예 4. 류마티스 관절염에 대한 날트렉손 함유 마이크로스피어의 유효성 평가 (3차)

상기 실시예 2 및 실시예3에서 실시된 날트렉손 함유 마이크로스피어의 류마티스 관절염에 대한 생체 내 유효성 평가에 이어, 양성 대조군에 차이를 주어 추가적인 유효성 실험을 진행하였다.

피검 물질로서, 제조예 1에 기재된 바와 같이 준비된 날트렉손 DDS를 준비하였다. 음성 대조군으로서 날트렉손 대신 담체를 함유한 DDS를 사용하였고, 양성 대조군으로서 류마티스 관절염 치료제인 휴미라® (Humira®, 휴미라®프리필드시린지 주, 40mg/0.4mL, 한국애보트)를 사용하였다.

투여군별 투여 정보는 하기 표 22에 기재된 바와 같다

투여군 (각 군별, n=10)	투여 약물	투여 경로	투여 용법 및 용량 (유효성분 기준)	투여 부피(㎕)
1(음성 대조군)	담체 함유 DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 3 mg/마우스, N/A	140
2(양성 대조군)	휴미라®	피하 주사	2회/주, 10 mg/kg 체중/회	100
3(시험군)	Q-DDS	피하 주사	제23일에 1회 투여, 10 mg/마우스	500

2. 관절염 활성도의 임상학적 평가

각 투여군의 발가락 이미지를 도 14a에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, Humira: 휴미라 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 10mg/마우스 투여군). 시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 임상 관절염 지수(CAI)를 도 14b에 나타내고, 임상 관절염 지수의 곡선하면적(area under the curve: AUC)을 나타내는 그래프를 도 14c에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), ***: p-값 < 0.001). 임상 관절염 지수 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 23에 정리하였다.

군	CAI			CAI-AUC
군	평균	평균의 표준오차	p-값	평균	평균의 표준오차	p-값
담체 함유 DDS	10.55	1.44	-	130.48	15.24	-
휴미라	5.90	2.67	<0.0001	70.28	11.61	<0.0001
Q-DDS (10 mg/마우스)	5.15	1.27	<0.0001	71.88	14.38	<0.0001

도 14a, 도 14b, 및 상기 표 23에 나타난 바와 같이, 양성 대조군, 날트렉손 DDS 투여군(시험군)은 담체 함유 DDS 투여군(음성 대조군)과 비교하였을 때 임상 관절염 지수에서 감소를 보였다. 특히, 날트렉손 DDS 투여군이 41일차에 가장 낮은 임상 관절염 지수를 나타내었다(Vehicle DDS vs Q-DDS, 10.55 ± 1.44 vs 5.15 ± 1.27, p < 0.001). 임상 관절염 지수에 대한 곡선하면적(도 14c 및 표 23)를 분석한 결과에서, 임상 관절염 수치 결과와 유사한 양상을 보였으며, 담체 함유 DDS 투여군에 비해 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서 모두 감소를 보였다. 이상의 결과를 통해 본 발명의 날트렉손 DDS가 임상에서 사용되고 있는 대표적인 생물학적 항류마티스제인 휴미라와 유사한 정도의 관절염 억제효과를 나타냄으로써, 만성 염증성 관절염 치료제로서의 유효성을 확인하였다.

시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 관절염 발생 빈도(%)를 도 14d에 나타내고, 발생 빈도의 곡선하면적(AUC)을 나타내는 그래프를 도 14e에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001). 발생 빈도 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 24에 정리하였다.

군	발생 빈도(%)			발생 빈도-AUC
군	평균	평균의 표준오차	p-값	평균	평균의 표준오차	p-값
담체 함유 DDS	62.50	13.18	-	678.8	167.7	-
휴미라	25.00	31.18	<0.0001	155.0	186.1	<0.0001
Q-DDS (10 mg/마우스)	17.50	12.08	<0.0001	156.3	108.1	<0.0001

도 14d, 도 14e, 및 표 24에 나타난 바와 같이, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군(시험군)은 담체 함유 DDS 투여군과 비교하였을 때 관절염 발생 빈도에서 감소를 보였다. 특히, 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군에서 양성 대조군보다도 좀더 감소된 결과를 보였다(Humira vs Q-DDS, 25.00 ± 26.35 vs 17.50 ± 12.08). 관절염 발생 빈도에 대한 곡선하면적에서 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군과 비교했을 때 뚜렷한 감소 소견을 나타내었으며, 날트렉손 DDS 투여군이 휴미라 투여군과 비슷한 수준의 감소 소견을 보였다.

3. 조직형태학적 평가

(1) 헤마톡실린/에오신 염색

헤마톡실린/에오신으로 염색한 조직의 이미지를 도 15a에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, Humira: 휴미라 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 조직학적 점수를 도 15b에 나타내고 그 결과를 하기 표 25에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	p-값
조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs Q-DDS
윤활막 비대증	음성 대조군 (담체)	2.89	0.17	-	< 0.0001
	휴미라	1.05	0.41	< 0.0001	0.2498
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.86	0.17	< 0.0001	-
판누스 형성	음성 대조군 (담체)	2.55	0.32	-	< 0.0001
	휴미라	0.36	0.60	< 0.0001	0.2166
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.08	0.11	< 0.0001	-
연골 파괴	음성 대조군 (담체)	2.50	0.29	-	< 0.0001
	휴미라	0.80	0.44	< 0.0001	0.7799
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.75	0.12	< 0.0001	-
골 침식	음성 대조군 (담체)	2.45	0.38	-	< 0.0001
	휴미라	0.28	0.52	< 0.0001	0.2315
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.05	0.09	< 0.0001	-

도 15a, 도 15b, 및 표 25에 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서는 활막세포의 과증식과 함께 파누스 조직의 증가로 연골파괴 및 뼈 미란이 뚜렷하게 나타났으며, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군 모두에서는 활막조직 과증식을 비롯한 모든 parameter에서 음성 대조군에 비해 뚜렷하게 감소된 양상을 보였다. 날트렉손 DDS 투여군의 경우 양성 대조군과 비교하였을 때, 윤활막 비대증과 연골 파괴 항목은 유사한 수준으로 감소하였으나, 판누스 형성과 골 침식 항목에서는 휴미라 투여군보다도 더 낮은 수준의 지수를 보였다.

(2) 톨루이딘 블루 염색

톨루이딘 블루로 염색한 조직의 이미지를 도 15c에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, Humira: 휴미라 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 조직학적 점수를 도 15d에 나타내고 그 결과를 하기 표 26에 정리하였다(평균±SEM, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	p-값
조직염색학적 파라미터		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs Q-DDS
기질 염색	음성 대조군 (담체)	2.91	0.11	-	< 0.0001
	휴미라	1.31	0.59	< 0.0001	0.2249
	Q-DDS (10 mg/마우스)	1.00	0.37	< 0.0001	-
표면 규칙성	음성 대조군 (담체)	2.59	0.24	-	< 0.0001
	휴미라	0.72	0.76	< 0.0001	0.3335
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.44	0.25	< 0.0001	-
연골 두께	음성 대조군 (담체)	1.69	0.15	-	< 0.0001
	휴미라	0.34	0.43	< 0.0001	0.5824
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.25	0.16	< 0.0001	-

도 15c, 도 15d, 및 표 26에 나타난 바와 같이, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군는 3개 파라미터 모두에서 음성 대조군보다 감소를 나타내었고, 특히 날트렉손 DDS 투여군은 휴미라 투여군보다도 낮은 조직학적 점수를 보였다.

조직형태학적 평가 결과를 종합하면, 관절염 조직의 염증의 활동성 및 관절 손상의 중증도 평가에서 날트렉손 DDS 10 mg/마우스 투여군에서 음성 대조군에 비해 염증 치료효과가 있었을 뿐 아니라, 임상에서 사용하는 항류마티스제인 휴미라와 비교하였을 때 오히려 더 효과적인 관절염 억제효과를 나타내었다.

4. 생체 내 안전성 평가

실시예 4.1.의 각 투여군에서 마우스의 체중을 측정하여 시험물질의 생체 내 안전성을 평가하였다.

시험물질의 안전성 평가를 위해 투여 시작일(제23일)부터 투여 종료 직전(제41일)까지 매일 마우스 체중을 측정하고, 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)과 제41일째의 체중을 도 16a, 도 16b, 및 표 27에 나타내었다.

체중 변화	D23 체중		D41 체중		체중 변화 (%, D23 체중을 100%)
체중 변화	평균	표준오차	평균	표준오차	평균	표준오차	p-값 (vs 담체)
음성 대조군 (담체)	22.3	1.2	21.2	0.9	95.06	5.29	-
휴미라	22.2	1.6	22.6	1.9	102.11	7.67	0.0279
Q-DDS (10 mg/마우스)	23.0	1.4	24.4	1.8	106.39	3.79	< 0.0001

도 16a, 도 16b, 및 표 27에 나타난 바와 같이, 시험기간동안 관절염 중증도가 높을 경우 마우스의 체중이 감소하는 경향이 나타났다. 음성 대조군에서 4.94% 체중 감소가 일어난데 비해, 날트렉손 DDS 투여군 및 양성 대조군에서는 체중 감소가 관찰되지 않았다.

5. 마이크로-CT를 이용한 관절염의 영상학적 평가

상기 실시예 4.1.에서 시험물질 치료하고, 각 군별 결과를 대표하는 발조직을 고정한 후 micro-CT scanner(Quantum FX, Perkin Elmer, MA)를 이용하여 촬영하였다. 방사선 사진은 Quantum FX μCT 이미징 시스템 (Perkin Elmer, MA)를 이용하여 3D 렌더링한 후, 방사선학적 점수(radiological score)를 평가하고, 골 부피 비율(골 부피[Bone volume; BV]/조직 부피[Tissue volume; TV]), 골 표면 밀도(bone surface density; Bone surface area(BS)/Bone volume(BV)), 및 피질골 두께(cortical bone thickness)을 측정하였다. 두 명 이상의 연구자가 관절 파괴에 대해 암맹 평가를 수행하였고, 상기 표 17의 지표를 점수 부여 기준으로 하였다. 연구자들의 암맹평가 자료를 평균한 값을 점수로 하고, 발조직의 점수 평균을 각 그룹의 점수로 계산하였다.

마이크로-CT로 촬영한 각 군별 대표 이미지를 도 17a에 나타내고, 특히 관절 부분을 확대한 이미지를 도 17b에 나타내었다(Vehicle DDS: 음성 대조군, MTX: 메토트렉세이트 투여군, Xeljanz®: 젤잔즈® 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, MTX + Q-DDS: 메토트렉세이트 + 날트렉손 DDS 병용 투여군, 200배 확대, 막대자: 100 ㎛). 방사선학적 점수를 도 17c에 나타내고 그 결과를 하기 표 28에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), *: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.05, **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001, #: MTX 투여군 대비 p-값 < 0.05, †: MTX 투여군 대비 p-값 < 0.05).

방사선학적 분석 수치		평균	평균의 표준오차	p-값
방사선학적 분석 수치		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs Q-DDS
골 부피/조직 부피 (%)	음성 대조군 (담체)	16.53	1.50	-	0.0209
	휴미라	24.21	3.83	0.0209	0.8845
	Q-DDS (10 mg/마우스)	25.71	0.48	0.0209	-
골 표면 넓이/골 부피 (mm^-1)	음성 대조군 (담체)	6.88	0.71	-	0.0202
	휴미라	6.08	0.09	0.0202	0.2944
	Q-DDS (10 mg/마우스)	5.97	0.15	0.0202	-
피질골 두께 (mm)	음성 대조군 (담체)	0.62	0.06	-	0.0209
	휴미라	0.78	0.03	0.0202	0.7674
	Q-DDS (10 mg/마우스)	0.78	0.03	0.0209	-

도 17a, 및 도 17b에서 확인되듯이, 마이크로-CT 스캔 결과 음성 대조군의 경우 뼈의 부피가 감소하였고 발 관절의 뼈 미란이 여러 관절에서 뚜렷이 관찰되었으며, 양성 대조군인 휴미라 투여군에서는 관절 부피의 감소 현상이 음성 대조군에 비해 적었다. 날트렉손 DDS 투여군에서는 골 부피 비율이 음성 대조군에 비해 높았으며, 휴미라 투여군보다도 약간 더 높게 나타났다(Vehicle DDS vs Q-DDS, 16.53 % ± 1.50 % vs 25.71 % ± 0.48 %, p < 0.05).

골 표면 밀도 측정 결과, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군 대비 낮게 나타났으며, 날트렉손 DDS 투여군의 경우 양성 대조군과 비슷한 수준으로 낮게 나타났다 (Vehicle DDS vs humira vs Q-DDS, 6.88 mm^-1 ± 0.71 mm^-1 vs 6.08 mm^-1 ± 0.09 mm^-1 vs 5.97 mm^-1 ± 0.15 mm^-1, p < 0.05).

피질골 두께 정량 결과, 음성 대조군의 경우 뼈 미란에 의해 피질골 두께가 얇아져 있었으나, 양성 대조군에서는 음성 대조군에 비해 두께가 더 두꺼운 것으로 나타났다. 날트렉손 DDS 투여군의 경우, 음성 대조군보다 두꺼웠으며(Vehicle DDS vs Q-DDS, 0.62 mm ± 0.06 mm vs 0.78 mm ± 0.03 mm p < 0.05), 휴미라 투여군과 비슷한 수준의 두께를 나타내었다.

방사선학적 점수에서도, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군에 비해 감소를 나타내었고, 결과적으로 영상학적 분성을 통해, 날트렉손 DDS가 관절염의 염증을 치료할 뿐 아니라, 그 결과로 관절 파괴의 진행을 억제하는 것을 확인하였다.

마우스 관절염 조직 및 혈액 내 염증 물질의 정량적 분석을 통해 염증 활성도 평가와 시험물질의 활성 기작(mode of action)을 확인하기 위해 염증 매개 인자를 단백질 수준에서 조사하였다. 상기 실시예 3. 6.과 동일한 Luminex technology 기반의 다중-분석물-ELISA(multi-analyte-ELISA) 방법을 사용하였다.

상기 실시예 4. 1.의 방법으로 시험물질 치료 후 얻은 마우스 관절조직을 세라믹 비드를 통해 분쇄하고 용해 완충액(lysis buffer, Cat. 1713040111, Bio-Rad)를 사용하여 전 단백질을 추출하였다. Pro-reagent kit V를 사용하여 투여군별로 동일량의 단백질(2.7mg/mL)을 1/4로 희석하여 표적-결합 비드와 30분 동안 배양 접시에서 반응시켰다. 세척 완충액으로 씻어낸 후, 표적-측정 항체와 30분 동안 반응시키고, 다시 세척 완충액으로 세척한 후 streptavidin-PE로 10분동안 반응시킨다. 이후 Bio-Plex® 200 시스템(Bio-Rad)를 이용하여 투여군 별로 표적 단백질을 정량적으로 측정한다. 상기 표적-결합 비드는 Bio-Plex Mouse cytokine 4-plex (IL-1β, IL-6, IL-17A, TNF-α, IL-2; Cat. 171G5002M), Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 1-plex (MCP1 ; Cat. 171G5019M), Bio-Plex Pro Mouse Cytokine II 1-plex (MIP2 ; Cat. 171G6006M), Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 1-plex (IL-6; Cat. 171G5007M)(상기 제품은 모두 Bio Rad 사) 등으로부터 필요에 따라 조합이 가능한 set로 구성하여 측정에 사용하였다.

한편, 측정하는 표적 단백질을 염증매개물질 중 대표적인 염증 촉진 사이토카인 A군(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α) 및 염증매개물질 중 IL-2과 케모카인 B 군(IL-2, MCP-1 및 MIP-2)으로 선정하여 실험을 진행하였다. 측정한 결과는 도 18a 및 도 18b, 및 하기 표 29 및 표 30에 정리하였다.

관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	p-값
관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs Q-DDS
IL-1β	음성 대조군 (담체)	56.80	8.43	-	< 0.0001
	휴미라	4.09	1.90	< 0.0001	0.0018
	Q-DDS (10 mg/마우스)	1.67	0.42	< 0.0001	-
IL-6	음성 대조군 (담체)	397.25	247.40	-	0.0002
	휴미라	10.75	12.57	0.0003	0.0589
	Q-DDS (10 mg/마우스)	2.20	1.02	0.0002	-
IL-17	음성 대조군 (담체)	40.56	11.83	-	< 0.0001
	휴미라	9.93	1.01	< 0.0001	0.0001
	Q-DDS (10 mg/마우스)	7.50	1.02	< 0.0001	-
TNF-α	음성 대조군 (담체)	105.64	20.60	-	< 0.0001
	휴미라	18.93	7.64	< 0.0001	0.0299
	Q-DDS (10 mg/마우스)	12.49	2.77	< 0.0001	-

관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	p-값
관절염 발 조직 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs MTX
IL-2	음성 대조군 (담체)	182.26	170.68	-	0.0093
	휴미라	36.59	16.19	0.0215	0.0016
	Q-DDS (10 mg/마우스)	14.00	7.56	0.0093	-
MCP-1	음성 대조군 (담체)	7808.4	3280.5	-	< 0.0001
	휴미라	281.3	204.6	< 0.0001	0.0536
	Q-DDS (10 mg/마우스)	138.4	22.4	< 0.0001	-
MIP-2	음성 대조군 (담체)	12373.11	3255.29	-	< 0.0001
	휴미라	564.83	393.77	< 0.0001	0.0165
	Q-DDS (10 mg/마우스)	211.31	43.55	< 0.0001	-

상기 과정을 통해 관절염 조직에서 대표적인 염증 촉진 사이토카인 4종(IL-1β, IL-6, IL-17, 및 TNF-α)의 단백질량 측정 결과, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서는 음성 대조군에 비해 감소를 나타내었고, 특히 IL-1β, IL-17, 및 TNF-α에 대해서 날트렉손 DDS 투여군은 양성 대조군인 휴미라 투여군과 비교하였을 때에도 감소를 나타내었다(IL 1β : Humira vs Q-DDS, 4.09 pg/ml ± 1.90 pg/ml vs 1.67 pg/ml ± 0.42 pg/ml, p < 0.01; IL-17: Humira vs Q-DDS, 9.93 pg/ml ± 1.01 pg/ml vs 7.50 pg/ml ± 1.02 pg/ml, p < 0.05; TNF-α : Humira vs Q-DDS, 18.9 3 pg/ml ± 7.64 pg/ml vs 12.49 pg/ml ± 2.77 pg/ml, p < 0.05).

IL-6 의 경우도 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군보다 감소를 보였다.

아울러, 케모카인 MCP-1 및 MIP-2의 측정 결과, A 군의 염증촉진 사이토카인과 유사한 패턴으로 나타났다. 구체적으로, IL-2 농도는 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군에 비해 낮게 나타났을 뿐 아니라, 양성 대조군인 휴미라 투여군보다도 낮은 수준으로 측정되었다(Humira vs Q-DDS, 36.59 pg/ml ± 16.19 pg/ml vs 14.00 pg/ml ± 7.56 pg/ml, p < 0.01). MIP-2 와 MCP-1 측정결과에서도 날트렉손 DDS 투여군에서 음성 대조군에 비해 감소를 나타내었다.

결과적으로, 관절염 조직 내에서 측정한 주요 염증매개물질은 앞서 측정된 임상적 지표와 매우 유사한 패턴을 보였으며, 날트렉손 DDS 투여군에서 IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α, IL-2, MCP-1, 및 MIP-2 모두 음성 대조군에 비해 감소를 보였을 뿐 아니라 표준 치료제인 휴미라에 비해서도 억제 소견을 보였다. 이와 같은 관절염 조직 내의 주요 염증 사이토카인 및 케모카인은 관절염의 중요한 바이오마커이다. 따라서 휴미라 투여군보다 날트렉손 DDS 투여군에서 염증의 주요 원인 물질들이 더 억제되는 상기 결과로부터, 관절염 치료에서 본 발명의 날트렉손 DDS가 관절염의 증상 및 염증을 모두 효과적으로 억제하거나 완화하거나 또는 조절할 수 있는 장점을 가지고 있음을 확인할 수 있다.

상기 실시예 4. 1.의 방법으로 시험물질 치료 후 얻은 마우스 혈액(혈청)을 Pro-reagent kit V를 사용하여 투여군별로 동일량의 단백질(2.7mg/mL)을 1/4로 희석한 후, 표적-결합 비드(IL-6 표적)와 30분 동안 배양 접시에서 반응시켰다. 세척 완충액으로 씻어낸 후, 표적-측정 항체와 30분 동안 반응시키고, 다시 세척 완충액으로 세척한 후 streptavidin-PE로 10분동안 반응시킨다. 이후 Bio-Plex® 200 시스템(Bio-Rad)를 이용하여 투여군 별로 표적 단백질을 정량적으로 측정한다. 상기 표적-결합 비드는 상기 실시예 4. 6. (1)에 개시된 비드를 사용하였다.

측정한 결과는 도 19 및 하기 표 31에 정리하였다.

혈액 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	p-값
혈액 내 ELISA 값 (pg/mL)		평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs Q-DDS
IL-6	음성 대조군 (담체)	74.72	20.33	-	< 0.0001
	휴미라	29.02	21.74	0.0003	0.0219
	Q-DDS (10 mg/마우스)	10.45	2.85	< 0.0001	-

도 19 및 상기 표 31에서 알 수 있듯이, 염증매개인자 중 IL-6의 단백질량 측정 결과, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서는 음성 대조군에 비교했을 때 감소를 나타내었고, 특히 날트렉손 DDS 투여군에서 가장 낮은 수준의 농도를 나타내었을 뿐 아니라, 양성 대조군인 휴미라 투여군과 비교하였을 때에도 감소를 나타내었다(Vehicle DDS vs Q-DDS, 74.72 pg/ml ± 20.33 pg/ml vs 10.45 pg/ml ± 2.85 pg/ml, p < 0.001; Humira vs Q-DDS, 29.02 pg/ml ± 21.74 pg/ml vs 10.45 pg/ml ± 2.85 pg/ml, p < 0.05).

결론적으로, 염증 반응 캐스케이드의 하류에 존재하는 IL-6의 혈중 농도는 날트렉손 DDS 투여군에서 관절염 조직소견이나 임상 소견과 일치하는 감소 소견을 보였다. 본 발명의 날트렉손 DDS의 경우 양성 대조군인 휴미라와 비교하여 혈중 내 IL-6의 농도를 감소시키는 효과를 나타내며, 이는 본 발명이 관절염 조직에서뿐만 아니라 전신적 수준에서 IL-6를 감소시킴을 의미한다. 또한 IL-6는 실제 관절염 환자 혈청에서 높은 수준을 보이는 사이토카인으로서 질병 활성도를 반영하기에 본 결과는 날트렉손 DDS가 관절염의 치료에 효과적일 수 있음을 의미한다.

7. 관절염 조직 내 NK 세포 면역 염색

관절염 중증도에 따른 병인기전을 검증하기 위해, 상기 실시예 4. 1.의 방법으로 시험물질 투여 후 마우스 발조직에서 NK 세포의 침윤을 측정하였다.

구체적으로, 파라핀-포매 조직편 슬라이드에 탈-파라핀화 및 재수화 작업 후, 열 유도 항원 복구(Heat-induced antigen retrieval)를 통해 조직 내 항원을 노출시킨다. 혈청 블락킹 단계를 거쳐, 슬라이드에 CD56 표적 일차 항체(토끼 항-CD56 항체, Abcam, ab220360)를 1시간동안 반응시킨 후, 퍼옥시다제(Peroxidase) 블락킹을 15분간 수행했다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합된(Horseradish peroxidase conjugated) 이차항체(염소 항-토끼 IgG-HRP, Jackson lab, #111-035-144)를 30분간 반응시킨 뒤 OPAL 690 용액 팩(Akoya Biosciences, CA)을 10분간 반응시켜 이차항체와의 결합을 진행하였다. DAPI와 3분 동안 반응시켜 핵 염색한 후, 슬라이드를 형광 보존 포뮬라인 Vector Shield (Vector Lab, CA) medium으로 마운팅한 후, 공초점 현미경(confocal microscopy; C2 plus Ti2-E, 니콘, NY)를 이용하여 촬영하였다. 슬라이드당 3개의 영역을 촬영(400 배율)한 후, CD56 항체에 의해 염색된 세포 수(NK 세포)를 정량 평가하였다. 배율에 따라 촬영한 이미지는 도 20a, 도 20b, 및 도 20c와 같고, 정량 평가한 수치는 도 20d 및 하기 표 32와 같다.

CD56+ 세포 수 (수/HPF)	평균	평균의 표준오차	p-값
CD56+ 세포 수 (수/HPF)	평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs Q-DDS
음성 대조군 (담체)	10.25	3.25	-	< 0.0001
휴미라	2.00	1.41	< 0.0001	0.7841
Q-DDS (10 mg/마우스)	1.83	1.53	< 0.0001	-

도 20a, 도 20b, 도 20c, 및 상기 표 32에서 확인할 수 있듯이, 음성 대조군에서는 증식된 활막조직 내에 다수의 CD56+ 세포가 관찰되었으나, 양성 대조군과 날트렉손 DDS 투여군에서는 CD56+ 세포의 침윤이 매우 적게 일어났다(Vehicle DDS vs Q-DDS, 10.25 ± 3.25 vs 1.83 ± 1.53, p <0.001). 날트렉손 DDS 투여군의 경우 양성 대조군에 비해서도 감소를 보였다.

결과적으로, 관절염 발생에 있어 CD56 양성인 NK 세포의 경우 관절염이 심화됨에 따라 염증 조직 내로의 침윤이 일어나지만, 날트렉손 DDS 투여에 의해 침윤이 뚜렷하게 억제될 뿐 아니라, 임상에서 사용되는 항류마티스제인 휴미라에 비해서도 더 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 5. 다발성 경화증에 대한 날트렉손 함유 마이크로스피어의 유효성 평가

1. 다발성 경화증에 대한 날트렉손 함유 마이크로스피어의 생체 내 시험 방법

날트렉손 함유 마이크로스피어, 즉 날트렉손 약물 전달 시스템이 다발성 경화증에 대해 치료 효능이 있는지 여부를 확인하기 위해 생체 내 유효성을 평가하였다.

실험적 자가면역성 뇌척수염 마우스 모델(Mouse Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: EAE)로서, 6내지 10주령의 C57BL/6 계통의 암컷 마우스를 준비하였다. 마우스는 specific pathogen free (SPF) 실험동물실에서 21℃ 내지 23℃의 온도 및 40% 내지 50%의 상대습도의 환경에서 사육 및 실험하였다. 케이지 별 실험동물 개체수는 4 이하로 수용하고, 주 2 내지 3회 케이지 교환 및 사료 급이하였다.

인산-완충용액(phosphate-buffered saline; PBS)에 미엘린-올리고덴드로사이트 글리코프로틴(MOG)를 1 mg/mL이 되도록 녹여, 5 mg/mL의 Complete Freund's adjuvant와 1:1(v/v)로 섞어 에멀전화하였다. 이를 마우스 양 옆구리에 각 100 ㎕씩 피하주사하였으며, 그 후 2μg/mL 백일해 독소(pertussis toxin) 400 ㎕를 복강 주사하였다(1차 면역화, 제0일). 제2일에 2μg/mL 백일해 독소(pertussis toxin) 400 ㎕를 2차로 복강주사하였다. 1차 면역화 후 제3일에 실험군 분리하여 시험을 수행하였다.

피검 물질로서, 제조예 1에 기재된 바와 같이 준비된 날트렉손 DDS를 준비하였다. 음성 대조군으로서 날트렉손 대신 담체를 함유한 DDS를 사용하였고, 양성 대조군으로서 핑골리모드(Fingolimod, 피타렉스® 캡슐, 0.5 mg, 한국노바티스)와 날트렉손 염산염(Naltrexone hydrochloride, 레비아®정, 50mg, 제일약품)를 사용하였다.

투여군별 투여 정보는 하기 표 33에 기재된 바와 같다. 동물 모델 제작 및 투여 일정은 도 21a에 도시된 바와 같다.

투여군 (각 군별, n=6)	투여 약물	투여 경로	투여 용법 및 용량 (유효성분 기준)	투여 부피(㎕)
1(음성 대조군)	담체 함유 DDS	피하 주사	제3일에 1회 투여, N/A
2(양성 대조군)	피타렉스®	경구	1회/일, 3 mg/kg 체중/회
3(양성 대조군)	레비아®	경구	1회/일, 1 mg/kg/회
4(시험군)	날트렉손 DDS(Q-DDS)	피하	제3일에 1회 투여, 1 mg/마우스

각각의 평가 지표에 대한 암맹평가 자료를 기반으로 음성 대조군과 시험군 또는 두 시험군 간의 통계분석을 SPSS를 통해 수행하였다. 양 군 간의 비교를 위해 Student's t-test 또는 Mann Whitney U test를 이용하였다. 유의 수준은 p-값이 0.05 이하로 하였다.

2. 신경증상 발생과 중증도의 임상적 평가

실험적 자가면역성 뇌척수염 마우스 모델을 제적하여 면역화 후 제3일째부터 음성 대조군인 담체 함유 DDS 및 시험 물질인 Q-DDS를 1 mg/마우스로 1회 피하주사로 투여하였으며, 양성 대조군인 피타렉스와 레비아는 해당 용량으로 매일 경구투여하였다. 그런 뒤, 실험 종료일(제30일)까지 정기적으로 임상증상 발생 및 그 정도를 관찰하였다. 임상증상 수준은 하기 표 34의 기준에 따라 꼬리 및 네 발의 기능을 평가한후 0 내지 5점의 점수를 부여하고, EAE 임상 점수로 활용하였다.

점수	증상
0	비-면역화 마우스와 비교하여 운동 기능에 명백한 변화가 없음
0.5	꼬리 끝 부분이 축 늘어짐
1	축 늘어진 꼬리
1.5	축 늘어진 꼬리 및 뒷다리 억제(inhibition)
2	축 늘어진 꼬리 및 뒷다리 약화(weakness)
2.5	축 늘어진 꼬리 및 뒷다리 끌림
3	축 늘어진 꼬리 및 뒷다리 완전 마비(가장 흔함)
3.5	축 늘어진 꼬리 및 뒷다리 완전 마비. 추가로 마우스가 케이지 주위를 움직이고 있으나, 옆으로 눕히면 스스로 일어날 수 없음. 뒷다리는 몸의 한쪽에 붙어있음.
4	축 늘어진 꼬리, 뒷다리 완전 마비, 및 앞다리 부분 마비
4.5	뒷다리 완전 마비, 앞다리 부분 마비, 케이지 주변에서 움직임 없음. 마우스가 기민하지 않음.
5	마우스가 자발적으로 케이지 내에서 굴러다님(안락사 권장)

시험물질 투여 후 시간(일)에 따른 마우스의 EAE 임상 점수를 도 21b에 나타내고, 임상 점수의 곡선하면적(area under the curve: AUC)을 나타내는 그래프를 도 21c에 나타내었다(평균±표준오차(SEM), ***: p-값 < 0.001). EAE 임상 점수 및 이에 대한 곡선하면적의 결과를 하기 표 35에 정리하였다.

군	임상적 점수(D28)			임상적 점수-AUC
군	평균	평균의 표준오차	담체에 대한 p-값	평균	평균의 표준오차	담체에 대한 p-값
담체 함유 DDS	3.33	0.47	-	44.50	3.88	-
피타렉스®	1.67	0.13	0.002	20.67	2.10	0.0001
레비아®	2.00	0.16	0.008	21.08	4.37	0.0006
Q-DDS(1 mg/마우스)	1.92	0.25	0.008	21.71	2.42	0.0001

도 21b, 도 21c, 및 상기 표 35에 나타난 바와 같이, 양성 대조군(피타렉스® 및 레비아®)과 Q-DDS 1 mg/마우스 투여군에서 담체 함유 DDS 투여군과 비교하였을 때 EAE 임상 점수에서 감소를 보였다. 특히, Q-DDS 1 mg/마우스 투여군(Vehicle DDS vs Q-DDS 1 mg/mouse, 3.33 ± 0.47 vs 1.92 ± 0.25, p < 0.001)에서 현재 세계적인 표준 치료제인 피타렉스®(3 mg/kg)와 유사한 수준의 효과를 관찰할 수 있었다(Vehicle DDS vs 피타렉스® 3 mg/kg, 3.33 ± 0.47 vs 1.67 ± 0.13, p < 0.001).

임상 점수의 곡선하면적(AUC)을 분석한 결과에서도 상기 임상 점수의 경시(time course) 결과와 유사한 양상을 보였으며 담체 함유 DDS군에 비해 양성 대조군(피타렉스® 및 레비아®)과 Q-DDS 1 mg/마우스 투여군에서 감소를 나타내었다. 이상의 결과를 통해 저용량의 Q-DDS(1 mg/마우스)가 임상에서 사용되고 있는 표준 치료제와 유사한 정도의 임상지표의 감소효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한 서방성 주사제인 날트렉손 DDS 투여군의 경우 한달 1회 투여함에도 불구하고, 그 결과가 매일 투여하는 경구제인 레비아정 투여군의 결과와 거의 유사하게 나타났으며, 이로부터 본 발명의 서방성 주사제가 제제적 측면에서 더 우수하다는 점을 확인할 수 있었다.

3. 조직형태학적 평가

마우스 안락사 후 척수 조직을 적출하여 헤마톡실린/에오신 염색 및 Luxol Fast Blue 염색을 수행하고, MBP 표적으로 한 면역조직화학 염색을 수행하고 암맹 평가를 통해 조직학적 평가를 수행하였다.

(1) 헤마톡실린/에오신 염색

실험 종료일인 제30일에 마우스를 희생시키고, 마우스 척수 조직을 적출하여 파라핀-포매 슬라이드 제작 후 헤마톡실린/에오신으로 염색하고, 척수 조직을 50배율 및 200배율로 촬영하였다. 그런 뒤 염증세포 분포를 평가하는 하기 표 36의 조직학적 평가기준에 따라 조직학적 점수를 측정하였다.

점수	염증
0	염증 없음
1	혈관 주위 영역 및 수막에서만 세포성 침윤(Cellular infiltrate)
2	실질 조직 내에서 경미한 세포성 침윤
3	실질 조직 내에서 중간 정도의 세포성 침윤
4	실질 조직 내에서 심각한 세포성 침윤

헤마톡실린/에오신으로 염색한 조직의 이미지를 도 21d에 나타내었다(Vehicle: 음성 대조군, Fytarex: 피타렉스 투여군, Revia: 레비아 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 50배 및 200배 확대). 조직학적 점수를 도 21e에 나타내고 그 결과를 하기 표 37에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

투여군	평균	평균의 표준오차	p-값
투여군	평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs 피타렉스	vs 레비아
담체 함유 DDS	3.0	0.35	-
피타렉스(3 mg/kg)	1.08	0.29	0.0005
레비아(1 mg/kg)	1.42	0.46	0.0074	0.4702
Q-DDS(1 mg/마우스)	1.13	0.44	0.0046	0.5737	0.8753

도 21d, 도 21e, 및 상기 표 37에 나타난 바와 같이, 염증세포의 침윤을 평가한 염증 점수(inflammation score)에서 음성 대조군인 담체 함유 DDS 투여군의 경우 척수의 백질(white matter) 전층에 염증세포의 침윤이 뚜렷하였으며 뇌척수막에 대한 세포 침윤이 미만성으로 퍼져 있을 뿐 아니라 척수의 용적 역시 감소되어 있는 소견을 보였다. 이에 비해 양성 대조군인 피타렉스 투여군에서는 염증세포의 침윤이 백질의 일부분에 침윤되어 있거나 뇌척수막 부분에 한정된 분포를 보였으며 이를 염증 점수로 정량화 하였을 때 담체 함유 DDS 투여군에 비해 감소를 보였다. 또한 Q-DDS 1 mg/마우스 투여군도 감소를 보였다(Vehicle DDS vs Q-DDS 1 mg/마우스, 3.00 ± 0.35 vs 1.33 ± 0.44, p < 0.01). 또한 서방성 주사제인 날트렉손 DDS 투여군의 경우 한달 1회 투여함에도 불구하고, 그 결과가 매일 투여하는 경구제인 레비아정 투여군의 결과 보다 더 좋게 나타났으며, 이로부터 본 발명의 서방성 주사제가 효능적 측면과 제제적 측면에서 더 우수하다는 점을 확인할 수 있었다.

(2) 룩솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue) 염색

실험 종료일인 제30일에 마우스를 희생시키고, 마우스 척수 조직을 적출하여 파라핀-포매 슬라이드 제작 후 룩솔 패스트 블루로 염색하고, 척수 조직을 50배율 및 200배율로 촬영하였다. 룩솔 패스트 블루 염색은 수초(Myelin)가 파란색에서 녹색으로 염색되고, 신경이 보라색으로 염색되는 것이며, 이를 통해 척수에서의 신경 구조를 확인하여 EAE 모델에서 수초 탈락(demyelination) 정도를 분석하였다. 수초 탈락 분석은 아래 표 38에 기재된 기준에 따라 분석하여 점수로 측정하였다.

점수	수초 탈락
0	수초 탈락 없음
1	경미한 수초 탈락
2	중간 정도의 수초 탈락
3	심각한 수초 탈락

룩솔 패스트 블루 염색한 조직의 이미지를 도 21f에 나타내었다(Vehicle: 음성 대조군, Fytarex: 피타렉스 투여군, Revia: 레비아 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 50배 및 200배 확대). 조직학적 점수를 도 21g에 나타내고 그 결과를 하기 표 37에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

투여군	평균	평균의 표준오차	p-값
투여군	평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs 피타렉스	vs 레비아
담체 함유 DDS	1.72	0.51	-	< 0.0001	< 0.0001
피타렉스(3 mg/kg)	0.14	0.12	< 0.0001	-	0.0120
레비아(1 mg/kg)	0.61	0.36	< 0.0001	0.0120	-
Q-DDS(1 mg/마우스)	0.56	0.34	< 0.0001	0.0196	0.8136

도 21f, 도 21g, 및 상기 표 39에 나타난 바와 같이, 염증으로 인한 척수신경 손상이 심한 담체 함유 DDS 투여군에서 수초 탈락도 많이 일어나 있었으며, 양성 대조군(피타렉스 및 레비아)과 Q-DDS 1 mg/마우스 투여군에서 수초 탈락과 조직학적 점수의 감소가 관찰되었다(Vehicle DDS vs Q-DDS 1 mg/마우스, 1.72 ± 0.51 vs 0.56 ± 0.34, p < 0.001).

결과적으로, 척수염 조직의 염증 활성도 및 신경수초의 중증도 평가에서 Q-DDS 1 mg/마우스 투여군은 음성 대조군에 비해 치료 효과를 보였을 뿐 아니라 임상적으로 가장 많이 사용하고 있는 표준 다발성 경화증 치료제인 피타렉스®와 비교하였을 때에도 유사한 수준의 치료효과를 나타내었다. 또한 서방성 주사제인 날트렉손 DDS 투여군의 경우 한달 1회 투여함에도 불구하고, 그 결과가 매일 투여하는 경구제인 레비아정 투여군의 결과 보다 더 좋게 나타났으며, 이로부터 본 발명의 서방성 주사제가 효능적 측면과 제제적 측면에서 더 우수하다는 점을 확인할 수 있었다.

(3) 항-수초염기성 단백질(myelin basic protein; MBP) 항체를 이용한 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC) 염색

실험 종료일인 제30일에 마우스를 희생시키고, 마우스 척수 조직을 적출하여 파라핀-포매 슬라이드 제작 후 수초염기성 단백질(MBP)을 표적으로 하는 면역조직화학 염색을 수행하고, 척수 조직을 50배율 및 200배율로 촬영하였다. 이는 수초의 성분인 수초염기성 단백질(MBP)에 대한 항체를 이용한 면역조직화학 분석법을 통해 수초 탈락을 확인하고자 하는 것이다.

면역조직화학 염색을 수행한 조직의 이미지를 도 21h에 나타내었다(Vehicle: 음성 대조군, Fytarex: 피타렉스 투여군, Revia: 레비아 투여군, Q-DDS: 날트렉손 DDS 투여군, 50배 및 200배 확대). 염색된 면적을 전체 척수 단면적을 기준으로 정량화한 결과를 도 21i에 나타내고, 그 결과를 아래 표 40에 정리하였다(평균±표준오차(SEM), *: 음성 대조군 대비 p-값 <0.05, **: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.01, ***: 음성 대조군 대비 p-값 < 0.001).

투여군	평균	평균의 표준오차	p-값
투여군	평균	평균의 표준오차	vs 담체	vs 피타렉스	vs 레비아
담체 함유 DDS	39.72	8.46	-	0.0237	0.0251
피타렉스(3 mg/kg)	58.47	8.12	0.0237	-	0.9029
레비아(1 mg/kg)	58.23	5.67	0.0251	0.9029	-
Q-DDS(1 mg/마우스)	56.41	5.99	0.0454	0.4661	0.51514

도 21h, 도 21i, 및 상기 표 40에 나타낸 바와 같이, 염증이 심하고 수초 탈락이 진행된 담체 함유 DDS 투여군에서는 MBP를 발현하고 있는 백질 부분이 감소되어 있었으며 양성 대조군(피타렉스® 및 레비아®)에서는 MBP를 발현하고 있는 면적이 음성 대조군에 비해 보존되어 있었다. MBP 양성 영역/전체 척추 영역의 비율은 Q-DDS 1 mg/마우스 투여군에서 음성 대조군에 비해 증가되어 있었다(Vehicle DDS vs Q-DDS 1 mg/마우스, 39.72 ± 8.46 vs 56.41 ± 5.99, p < 0.0454). 결과적으로 척수의 염증이 억제되고 이에 따라 수초 탈락을 감소시키면서 Q-DDS 저용량 투여군이 수초(myelin sheath)를 건강하게 보존하여 다발성 경화증의 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 서방성 주사제인 날트렉손 DDS 투여군의 경우 한달 1회 투여함에도 불구하고, 그 결과가 매일 투여하는 경구제인 레비아정 투여군의 결과 보다 더 좋게 나타났으며, 이로부터 본 발명의 서방성 주사제가 효능적 측면과 제제적 측면에서 더 우수하다는 점을 확인할 수 있었다.

4. 생체 내 안전성 평가

실시예 5.1의 각 투여군에서 마우스의 체중을 측정하여 시험물질의 생체 내 안전성을 평가하였다.

대조물질과 시험물질의 안전성 평가를 위해 투여 시작 전(제0일)부터 투여 종료 직전(제30일)까지 매일 마우스 체중을 측정하고, 시간(일)에 따른 투여군별 마우스의 체중(%)을 도 22에 나타내었다.

도 22에 나타난 바와 같이, 시험기간동안 날트렉손 DDS 투여군은 음성 대조군에 비하여 체중이 높게 유지되었고, 경구 투여제인 레비아정과 유사한 수준을 나타내었다. 따라서, 날트렉손 DDS는 생체 내 안전성이 있음을 확인하였다.

실시예 6. 저용량 날트렉손 함유 마이크로스피어의 자가면역질환 관련 작용 기작 연구

톨-유사 수용체 4(Toll-like receptor 4; TLR4)는 체내 면역 반응의 첫 단계인 선천성 면역(innate immunity)과 밀접한 관련이 있으며, 세포 또는 체내에 손상이 있거나 감염이 발생할 경우 초기 면역 반응과 염증 반응의 조절을 담당하는 대표적인 수용체이다. 손상 또는 염증 반응으로 TLR4가 활성화되면 TLR4의 하위 조절인자인 NF-κB가 활성화되어 염증성 사이토카인의 발현을 증가시켜 체내에 염증성 사이토카인을 분비하게 된다 (J. Med. Chem.　2020, 63, 22, 13466-13513).

본 발명자는 저용량 날트렉손이 TLR4의 활성을 조절하여 길항제 효과를 보이는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. 날트렉손의 MD2 와의 직접 결합 여부 확인

날트렉손은 USP (Rockville, MD, USA), MD2는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. 표면 플라즈몬 공명 분석을 통해 날트렉손이 TLR4 신호전달 상 MD2 단백질과 결합하는 것을 확인하였다. 날트렉손의 농도가 높아짐에 따라 MD2와의 결합이 점차적으로 증가하였다(도 23).

본 개시에서는 저용량 날트렉손이 TLR4의 주요 활성 부위인 MD2에 결합한다는 점을 최초로 밝혀내었으며, 이러한 결과는 날트렉손이 TLR4 신호 전달의 활성 중심인자인 MD2에 직접 결합함으로써 TLR4 활성을 억제할 수 있음을 보이는 결과이다. 이러한 결과로부터 날트렉손이 신규 타겟인 TLR4 신호전달 분자를 타겟으로 면역 이상 또는 면역 과잉 반응을 차단함으로써, 비정상적 면역반응에 의해 발생한 자가면역질환 및 염증성 질환을 치유하는 기전을 가지는 것으로 예상된다. 저용량 날트렉손이 TLR4 신호전달에 영향을 미치는 기작에 대한 모식도는 도 24와 같다.

이하에서는 TLR4 신호 전달을 차단할 수 있는 저용량 날트렉손이, 실제 세포에서 LPS에 의해 증가된 TLR4 매개 염증 인자들을 억제할 수 있는지를 확인하였다.

2. 인간 활막 세포주에서 저용량 날트렉손이 전염증성 사이토카인 (TNF-α. IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, iNOS)의 발현에 미치는 영향

인간 활막 세포주(Human synovial cell line)인 SW982 세포주(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% 소태아혈청(FBS; bovine serum), 50 IU/ml의 페니실린, 및 50 ㎍/ml 의 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific Inc.)이 첨가된 RPMI 1640 배지(Welgene, Republic of Korea)에 넣고, 37 ℃, 5% CO₂의 조건의 배양 시스템(Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 지질 다당류(LPS)는 시그마 알드리치사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

SW982세포에 LPS(1 ug/ml)와 날트렉손 200 또는 500 ug/ml를 6시간 처리한 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대해 RT-qPCR을 수행한 결과, LPS에 의해 증가한 전염증성 사이토카인(TNF-α. IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, iNOS)의 발현이 날트렉손 200 또는 500 ug/ml에 의해 현저히 억제됨을 확인하였다(도 25 참조).

3. 인간 활막 세포주에서 저용량 날트렉손이 NF-κB의 활성에 미치는 영향

SW982 세포에 날트렉손 200 또는 500 ug/ml를 처리한 후 NF-κB의 활성의 억제 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 1 x 세포 용해 완충액(Cell lysis buffer)(Cell signaling, CA, USA)에 프로테아제, 및 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitor)를 섞어 SW982 세포에 첨가하였다. 세포로부터 단백질을 추출한 뒤 농도를 측정하여 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전개하고, ECL 니트로셀룰로스 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겨 1시간 동안 탈지 분유로 블로킹 하였다. 그 후 1차 항체(p65 NF-κB, phospho p65 NF-κB 또는 칼넥신; Cell signaling, CA, USA)로 4 ℃에서 24시간동안 쉐이킹하며 반응시켰다. 그 후 PBST 완충액으로 10분씩 3번 쉐이킹 워싱 한 후 2차 항체는 항-마우스 또는 항-래빗 HRP-결합 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 배양하고, Supersignal west pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 멤브레인 상의 단백질 밴드를 반응시켰다. 결과는 Bio-Rad Gel Documentation system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 시각화하였으며, 그 결과는 도 26에 나타내었다.

도 26에 나타낸 바와 같이 대조군인 LPS에 의해 증가한p65 NF-κB의 인산화가 날트렉손 200 ug/ml에 의해 억제되는 것으로 보아 저용량 날트렉손이 NF-κB의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있다.

4. 인간 활막 세포주에서 저용량 날트렉손이 미토겐-활성화 단백질 키나아제(Mitogen-activated protein kinase; MAPKs)의 활성에 미치는 영향

SW982 세포에 날트렉손 200 또는 500 ug/ml를 처리한 후 MAPKs의 활성의 억제 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 웨스턴 블로팅은 상기 실시예 6. 3. 항목과 같은 방법으로 수행하였다. 이 때 사용한 1차 항체는 p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38 및 칼넥신(Cell signaling, CA, USA)에 대한 항체이며, 2차 항체는 항-마우스 또는 항-래빗 HRP-결합 2차 항체이다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 얻은 결과는 도 27에 나타내었다.

도 27에 나타낸 바와 같이 대조군인 LPS에 의해 증가한 MAPKs의 인산화가 날트렉손 200 또는 500 ug/ml에 의해 감소하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 저용량 날트렉손은 LPS에 의해 유도된 MAPKs의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있다.

5. 마우스 대식세포에서 저용량 날트렉손이 전염증성 사이토카인 (TNF-α. IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, iNOS)의 발현에 미치는 영향

마우스 대식세포주(Murine macrophage cell line)인 Raw 264.7 세포주(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% 소태아혈청(FBS; bovine serum), 50 IU/ml의 페니실린, 및 50 ㎍/ml의 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific Inc.)이 첨가된 DMEM 배지(Welgene, Republic of Korea)에 넣고, 37 ℃, 5% CO₂의 조건의 배양 시스템(Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 지질 다당류(LPS)는 시그마 알드리치사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

Raw 264.7세포에 LPS(1 ug/ml)와 날트렉손 200 또는 500 ug/ml를 6시간 처리한 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대해 RT-qPCR을 수행한 결과,LPS에 의해 증가한 전염증성 사이토카인(TNF-α. IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, iNOS)의 발현이 날트렉손 200 또는 500 ug/ml에 의해 현저히 억제됨을 확인하였다(도 28 참조).

6. 마우스 대식세포에서 저용량 날트렉손이 NF-κB의 활성에 미치는 영향

Raw 264.7 세포에 날트렉손 100, 200, 500 또는 1000 ug/ml를 처리한 후 NF-κB의 활성의 억제 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 1 x 세포 용해 완충액(Cell lysis buffer)(Cell signaling, CA, USA)에 프로테아제 및 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitor)를 섞어 SW982 세포에 첨가하였다. 세포로부터 단백질을 추출한 뒤 농도를 측정하여 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전개하고, ECL 니트로셀룰로스 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겨 1시간 동안 탈지 분유로 블로킹 하였다. 그 후 1차 항체(p65 NF-κB, phospho p65 NF-κB 또는 칼넥신; Cell signaling, CA, USA)로 4 ℃에서 24시간동안 쉐이킹하며 반응시켰다. 그 후 PBST 완충액으로 10분씩 3번 쉐이킹 워싱 한 후 2차 항체는 항-마우스 또는 항-래빗 HRP-결합 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 배양하고, Supersignal west pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 멤브레인 상의 단백질 밴드를 반응시켰다. 결과는 Bio-Rad Gel Documentation system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 시각화하였으며, 그 결과는 도 29에 나타내었다.

도 29에 나타낸 바와 같이 대조군인 LPS에 의해 증가한p65 NF-κB의 인산화가 날트렉손 500 ug/ml처리한 농도부터 NF-κB의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있다.

7. 마우스 대식세포에서 저용량 날트렉손이 미토겐-활성화 단백질 키나아제(Mitogen-activated protein kinase; MAPKs)의 활성에 미치는 영향

Raw 264.7 세포에 날트렉손 100, 200, 500, 또는 1000 ug/ml를 처리한 후 MAPKs의 활성의 억제 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅 을 수행하였다. 웨스턴 블로팅은 상기 실시예 6. 3. 항목과 같은 방법으로 수행하였다. 이 때 사용한 1차 항체는 p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38 및 칼넥신(Cell signaling, CA, USA)에 대한 항체이며, 2차 항체는 항-마우스 또는 항-래빗 HRP- 결합 2차 항체이다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 얻은 결과는 도 30에 나타내었다.

도 30에 나타낸 바와 같이 대조군인 LPS에 의해 증가한 MAPKs의 인산화는 날트렉손 100, 200, 500, 또는 1000 ug/ml의 처리농도에서 모두 억제되지 않았다. 따라서, 도 31에 나타낸 바와 같이 저용량 날트렉손은 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 MAPKs의 활성을 억제하지 않고, TLR4 수용체 기전에서 NF-κB의 활성만을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 날트렉손과 6β-날트렉솔의 자가면역 염증 인자 억제 효과 및 TLR4 신호전달인자의 조절 여부 평가

1. 배경 및 개요

날트렉손을 사람에 경구투여할 경우 초회통과효과(first-pass effect)로 인해 체내에서 대사산물인 6β-날트렉솔이 생성되며, 이에 따라 경구제의 경우 주사제에 비하여 6β-날트렉솔이 상대적으로 대략 10배 많이 생성된다. 또한 경구투여시 환자간 날트렉손과 6β-날트렉솔 생성율의 편차가 개체간 128배 정도의 차이가 날 정도로 크고 (0.73~92.00), 6β-날트렉솔 생성율이 높을 경우 메스꺼움(Nausea) 및 두통을 포함한 부작용이 나타날 수 있으며, 이로 인해 약효, 독성, 및 환자순응도 등에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Journal of Analytical Toxicology 2014;38:212-217). 6β-날트렉솔이 현재 상업적으로 사용되는 오피오이드 중독에 대해 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으나, 날트렉손과 그 대사체인 6β-날트렉솔이 자가면역질환과 관련하여 TLR4에 대해 약효 차이를 보이는지에 대해서는 연구된 바 없다. 이에 본 발명자는 본 발명의 서방성 주사제가 경구제에 비하여 우수한 효과를 나타낸다는 점을 확인하기 위해, 최초로 세포 수준에서 날트렉손과 6β-날트렉솔의 자가면역 또는 염증 억제 효과를 비교하고 TLR4 신호전달인자(NF-κB, MAPKs)에 대한 조절 여부를 확인하였다.

류마티스 관절염의 병소인 활막 내에는 IL-1β와 IL-6이 높게 발현되어 있고 이것이 병의 악화를 가져온다. 최근 다발성 경화증에 걸린 생쥐를 대상으로 연구결과, IL-1β는 방관자(bystander) T세포를 활성화시키고, 이 세포가 척수로 이동해 다시 자가면역질환을 일으키는 신호물질인 인터류킨-17과 인터페론-감마 등을 방출해 중추신경계를 손상시키는 것으로 규명되었다(Nature Communications volume 10, Article number: 709 (2019)).

최근 생물학적 제제는 TNF-α 또는 IL-6 수용체의 작용을 차단하고 T 세포의 작용을 직접 방해하거나 B 세포를 고갈시키며, 아바타셉트에 의한 T 세포 억제와 JAK 억제제에 의한 사이토카인 신호전달 감소 또한 RA 치료효과를 입증하는 등 표적요법들이 개발되고 있지만 여전히 미충족 수요(Unmet needs)들이 남아있다.

TNF-α를 타겟으로 개발된 BDMARDs(biological disease-modifying antirheumatic drugs)는 류마티스 관절염 치료에 우수한 효과를 발휘하지만 환자들이 치료제에 부분적으로만 반응을 나타내거나, 치료제에 내성이 생기고 부작용이 발생하는 등 한계를 나타냈다. 다발성경화증 치료제 역시 최근 효능 및 복용편이성이 높아져 치료효과도 개선되고 있으나 여전히 신경세포보호(Neuroprotection)에 대한 효능이 부족하다는 문제점을 가지고 있다. 이는 기존 치료방법이 여러 병인기전 중 한가지 타겟만을 차단하기 때문에 복잡한 기전상의 네트워크로 인해 발병되는 사례에 관해서는 치료효과가 감소하거나 저항성이 발생하는 것으로 생각된다.

한편, 지질다당류 (LPS; lipopolysaccharide)는 그람 음성 박테리아의 외막에 위치한 거대 당지질 분자이며 TLR4-매개 면역 반응의 주요 유도 물질이다. TLR4는 Myd88 (myeloid differentiation primary response gene 88) 및 TRIF (Toll/interleukin-1 receptor(TIR)-domain-containing adaptor-inducing interferon-13) 의존 경로를 유도하고, MyD88-의존 경로가 개시되면 핵 인자 NF-κB 및 MAPKs를 활성화시켜 자가면역질환과 관련된 사이토카인의 발현을 유도하는 것으로 알려졌다(도 32 참조).

본 발명자는 면역-염증매개반응의 주요 원인물질인 LPS자극을 통한 TLR4 활성기전에서 날트렉손 및 6β-날트렉솔이 미치는 영향을 확인하였다.

2. 인간 활막 세포주에서 날트렉손과 6β-날트렉솔이 전염증성 사이토카인 (iNOS, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α)의 발현에 미치는 영향

SW982 세포에 LPS(1 ug/ml)와 날트렉손(0.5, 1, 10, 100 uM) 또는 6β-날트렉솔(0.5, 1, 10, 100 uM)을 6시간 처리한 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대해 RT-qPCR을 수행하여, LPS에 의해 증가한 전염증성 사이토카인(iNOS, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α)의 발현이 억제되는지 여부를 확인하였으며, 그 결과는 도 33에 나타내었다. 그 결과, 처리된 날트렉손 또는 6β-날트렉솔의 모든 농도에서 LPS에 의해 유도된 사이토카인들의 발현이 억제됨을 확인하였다. 또한, 날트렉손이 대사체인 6β-날트렉솔보다 우수한 사이토카인 억제활성을 나타내었다. 특히, iNOS의 경우 날트렉손 1 uM과 6β-날트렉솔 1 uM의 억제효과를 비교하였을 때 현저한 차이가 있었으며 (p=0.037), IL-1β의 경우 모든 처리농도에서 날트렉손 대비 6β-날트렉솔의 억제효과를 비교하였을 때 날트렉손의 사이토카인 억제효과에서 현저한 차이 (0.5 uM p=0.032, 1 uM p=0.011, 10 uM p=0.003, 100 uM p=0.009)를 보임으로써, 날트렉손의 매우 우수한 자가면역 염증(Autoimmune inflammation) 억제 효과를 확인하였다.

IL-1β는 자가면역질환을 유발하는 가장 강력한 사이토카인이며 관절염과 같은 자가면역질환의 임상적 지표로도 중요한 마커이기에, 날트렉손이 대사체인 6β-날트렉솔보다 사이토카인 억제 효과가 높다는 것은, 본 발명의 저용량 날트렉손 서방성 주사제가 날트렉손 경구제에 비해 우수한 효과를 나타낸다는 점을 나타낸다.

3. 마우스 대식 세포주에서 날트렉손과 6β-날트렉솔이 전염증성 사이토카인 (iNOS, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α)의 발현에 미치는 영향

마우스 대식세포주(Murine macrophage cell line)인 Raw 264.7 세포주(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% 소태아혈청(FBS; bovine serum), 50 IU/ml의 페니실린, 및 50 ㎍/ml 의 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific Inc.)이 첨가된 DMEM 배지(Welgene, Republic of Korea)에 넣고, 37 ℃, 5% CO₂의 조건의 배양 시스템(Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 지질 다당류(LPS)는 시그마 알드리치사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

Raw 264.7 세포에 LPS (1 ug/ml)와 날트렉손(0.5, 1, 10, 100 uM) 또는 6β-날트렉솔(0.5, 1, 10, 100 uM)을 6시간 처리한 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대해 RT-qPCR을 수행하여, LPS에 의해 증가한 전염증성 사이토카인(iNOS, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α)의 발현이 억제되는지 여부를 확인하였으며, 그 결과는 도 34에 나타내었다. 그 결과, 처리된 날트렉손 또는 6β-날트렉솔의 모든 농도에서 LPS에 의해 유도된 사이토카인들의 발현이 억제됨을 확인하였다. 특히, IL-1β의 경우 날트렉손 대비 6β-날트렉솔의 억제효과를 비교하였을 때 10uM (p=0.028) 과 100uM (p=0.005) 처리 농도에서 현저한 차이가 있었다.

4. 인간 활막 세포주에서 날트렉손과 6β-날트렉솔이 NF-κB 또는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(Mitogen-activated protein kinase; MAPKs)의 활성에 미치는 영향

SW982 세포에 LPS (1 ug/ml)와 날트렉손(0.5, 1, 10, 100 uM) 또는 6β-날트렉솔(0.5, 1, 10, 100 uM)을 30분간 처리한 후 세포로부터 단백질을 분리하여 NF-κB와 MAPKs의 활성 억제 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다.

1 x 세포 용해 완충액(Cell lysis buffer)(Cell signaling, CA, USA)에 프로테아제, 및 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitor)를 섞어 SW982 세포에 첨가하였다. 세포로부터 단백질을 추출한 뒤 농도를 측정하여 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전개하고, ECL 니트로셀룰로스 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겨 1시간 동안 탈지 분유로 블로킹 하였다. 그 후 1차 항체(p65 NF-κB, phospho p65 NF-κB, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38 또는 칼넥신; Cell signaling, CA, USA)로 4 ℃에서 24시간동안 쉐이킹하며 반응시켰다. 그 후 PBST 완충액으로 10분씩 3번 쉐이킹 워싱 한 후 2차 항체는 항-마우스 또는 항-래빗 HRP-결합 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 배양하고, Supersignal west pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 멤브레인 상의 단백질 밴드를 반응시켰다. 결과는 Bio-Rad Gel Documentation system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 시각화하였으며, 그 결과는 도 35에 나타내었다.

도 35에서와 같이 대조군인 LPS에 의해 증가한 TLR4 신호 하위인자인 p65 NF-κB 및 MAPKs (ERK1/2, JNK, p38)의 인산화가 날트렉손 1uM 부터 억제됨을 알 수 있었다. 하지만 6β-날트렉솔은 p65 NF-κB 및 MAPKs (ERK1/2, JNK, p38)의 인산화 억제효과가 없었다.

즉, 도 24 또는 도 32와 같이 날트렉손은 효과적으로 TLR4의 하위신호인자인 p65 NF-κB 및 MAPKs (ERK1/2, JNK, p38)의 인산화를 조절함으로써 자가면역질환 유발 사이토카인의 활성에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었으며, 대사체 6β-날트렉솔은 TLR4 신호전달인자의 활성에는 영향이 없음을 확인하였다. 즉, 사람 활막 세포주에서 LPS에 의해 유도되는 TLR4 활성으로 인한 자가면역질환 반응은 날트렉손에 의해 억제되며, 대사체 6β-날트렉솔은 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.

5. 마우스 대식 세포주에서 날트렉손과 6β-날트렉솔이 NF-κB 또는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(Mitogen-activated protein kinase; MAPKs)의 활성에 미치는 영향

Raw 264.7 세포에 LPS (1 ug/ml)와 날트렉손(0.5, 1, 10, 100 uM) 또는 6β-날트렉솔(0.5, 1, 10, 100 uM)을 30분간 처리한 후 세포로부터 단백질을 분리하여 NF-κB와 MAPKs의 활성 억제 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 웨스턴 블로팅은 상기 실시예 7. 4. 항목과 같은 방법으로 수행하였다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 얻은 결과는 도 36에 나타내었다.

도 36에서와 같이 마우스 대식 세포주에 대한 실험에서는 대조군인 LPS에 의해 증가한 TLR4 신호 하위인자 중 p65 NF-κB 인산화가 날트렉손 뿐만 아니라 6β-날트렉솔에 의해서도 억제됨을 알 수 있었다. 날트렉손과 6β-날트렉솔 모두 p65 NF-κB 인산화억제 효과는 비슷했다. 하지만, 앞서 인간 활막 세포주 SW982와는 달리 날트렉손과 6β-날트렉솔 모두 MAPKs (ERK1/2, JNK, p38)의 인산화에는 억제효과가 없었다. 즉, 도 31과 같이 날트렉손과 대사체 6β-날트렉솔은 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 MAPKs의 활성을 억제하지 않고, TLR4 활성기전에서 NF-κB의 활성만을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

날트렉손과 대사체 6β-날트렉솔 모두에서 유사한 결과가 나타났음에도 불구하고 실시예 7. 4. 항목에서 수행한 사이토카인 억제 효과 실험에서 분명한 차이(날트렉손이 6β-날트렉솔 대비 뚜렷한 감소를 보여 줌)를 보이는 것은, 마우스 대식 세포주의 경우 TLR4를 통한 효과 이외에도 추가적인 자가면역 억제 경로가 존재함을 시사한다.

6. 결론

본 실험에서는 저용량 날트렉손이 TLR4의 활성을 조절하여 길항제 효과를 보이는지 확인하기 위하여 실시한 LPS자극을 통한 TLR4 활성기전에서 날트렉손 및 6β-날트렉솔의 효과를 비교하였다. 그 결과 사람 활막 세포주(SW982 세포주)에서LPS에 의해 증가한 TLR4 신호 하위인자인 p65 NF-κB 및 MAPKs(ERK1/2, JNK, p38)의 인산화가 날트렉손을 처리한 군에서는 1 uM 부터 억제됨을 알 수 있었다. 그러나 6β-날트렉솔에서는 p65 NF-κB 및 MAPKs (ERK1/2, JNK, p38)의 인산화 억제효과를 볼 수 없었다. 즉, 경구 투여한 날트렉손에 의한 TLR4 를 통한 자가면역 저해 효과는 대사되지 않은 날트렉손에 의한 것이며 6β-날트렉솔에 의한 것이 아님을 의미한다.

또한, 자가면역에 관여하고 있는 사이토카인들의 생성량을 측정한 결과도 동일한 결과를 나타내었다. 6β-날트렉솔 대비 날트렉손을 처리할 때 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 루푸스 등 자가면역질환과 관련된 IL-6, TNF-α, iNOS과 같은 사이토카인에 대해 더 우수한 억제효과를 보였으며, 특히 IL-1β의 발현을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 날트렉손 처리에 의한 IL-1β, IL-6, TNF-α, iNOS등의 사이토카인 감소는 류마티스 관절염의 질병 활성도 억제를 통해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 의미하는 중요한 결과이다. 무엇보다 IL-1β의 발현을 현저히 억제한 결과는 날트렉손이 면역세포의 활성 및 염증 반응을 조절하는 우수하고 효과적인 자가면역질환 치료제로 기능함을 의미한다.

또한 마우스 대식세포주 (Raw 264.7 cell) 에서 진행한 실험에서는 TLR4 를 통하여 작용하는 메커니즘 중에서 NF-κB 를 매개하는 경로에 대한 차단을 날트렉손과 6β-날트렉솔 모두에서 관찰할 수 있었으며, MAPK 를 매개로 하는 경로에는 작용하지 않음을 확인할 수 있었다. 다만 특이하게도 사이토카인 저해에 있어서는 두 물질 사이에 분명한 차이를 보여 IL-1β, IL-6, TNF-α, iNOS 등에 있어서 억제율에 뚜렷한 차이를 보여주고 있어서, 날트렉손과 6β-날트렉솔 간에 저해율 차이를 가져오는 다른 작용기전이 있음을 시사한다. 이 사실 또한 자가면역 저해 효과를 나타내는 주요 물질은 날트렉손이며 6β-날트렉솔이 아님을 나타낸다.

결론적으로 TLR4 를 통해 자가면역 저해 효과를 나타내는 물질은 날트렉손이며 그 대사체인 6β-날트렉솔이 아님을 확인하였고, 6β-날트렉솔 대비 날트렉손에서 현저히 우수한 자가면역 염증 사이토카인 억제 효과가 나타나는 결과를 확인함으로써, 초회통과효과로 인해 경구제에서 발생하는 대표적인 대사물질인 6β-날트렉솔의 생성, 이로 인한 부작용 및 개체간 대사율 차이에 의한 약효 차이를 줄일 수 있고, 체내에서 날트렉손의 생체이용률과 효과를 극대화할 수 있는, 본 발명의 서방성 주사제가 안전성과 유효성 측면에서 더 우수함을 확인하였다. 또한 본 발명은, 주사제를 사용할 때 매일 투여하는 불편함과 통증을 없애고, 1회 투여로 그 목적을 달성할 수 있어 매우 편리한 장점을 가진다.

위와 같은 실시예 6 및 실시예 7의 결과로부터, 날트렉손을 저용량이자 유효농도로 장기간 우수하게 유지할 수 있는 본 발명의 날트렉손 마이크로입자를 이용하여, TLR4와 관련된 각종 자가면역질환 및 면역 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.

추가로 관절염과 같이 환부에 염증이 증가된 상태에서 날트렉손을 고용량으로 투여하면, 체내 TLR4의 활성이 강력하게 억제되어 일시적으로 염증 물질의 분비가 현저히 줄어들겠지만, 고용량 날트렉손의 투여로 인한 TLR4의 강한 억제는 체내의 염증반응이 모두 하향되어 급격한 면역력의 상실을 초래하게 된다. 고용량 투여와 달리 본 발명의 저용량 날트렉손 서방성 제제는 관절염과 같이 자가면역질환을 가지는 환자에게 투여되더라도, 급격한 면역력의 저하를 초래하지 않고 환자에서 정상적인 면역 반응과 면역 체계를 유지하면서 체내의 TLR4의 억제를 통해 효과적으로 염증반응을 억제할 수 있으므로, 자가면역질환을 치료하는데 안전하고 우수한 방법일 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

날트렉손(naltrexone) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 서방성 제제.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락티드, 폴리락트산, 폴리락티드-코-글리코리드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리포스파진, 폴리이미노카르보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리히드록시발레이트, 폴리히드록시부티레이트, 및 폴리아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 제제.
제2항에 있어서, 상기 폴리락티드-코-글리코리드에서 락티드에 대한 글리콜리드의 몰비는 50:50 내지 90:10인 것인 제제.
제2항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드 중 1종 이상을 포함하는 것인 제제.
제2항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 1종 이상의 폴리락티드와 1종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 것인 제제.
제5항에 있어서, 상기 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드의 중량비는 1:10 내지 10:1인 것인 제제.
제5항에 있어서, 상기 폴리락티드와 폴리락티드-코-글리코리드의 중량비는 1:1 내지 2:1인 것인 제제.
제2항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드를 포함하는 것인 제제.
제8항에 있어서, 상기 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드는 중량비 1:10 내지 10:1의 폴리락티드-코-글리코리드인 것인 제제.
제9항에 있어서, 상기 2종 이상의 폴리락티드-코-글리코리드는 중량비 1:1 내지 2:1의 폴리락티드-코-글리코리드인 것인 제제.
제2항에 있어서, 상기 폴리락티드의 고유 점도(intrinsic viscosity: IV)는 0.1 dl/g 내지 0.5 dl/g인 것인 제제.
제2항에 있어서, 상기 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 0.1 dl/g 내지 1.5 dl/g인 것인 제제.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 폴리락티드의 고유 점도는 0.1 dl/g 내지 0.5 dl/g인 것인 제제.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 폴리락티드-코-글리코리드의 고유 점도는 0.1 dl/g 내지 1.0 dl/g인 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 말단이 캡핑되거나 비캡핑된 것인 제제.
제1항에서, 상기 생분해성 고분자에서 용매의 잔류량은 1000 ppm 이하인 것인 제제.
제16항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 중 용매의 잔류량은 800 ppm 이하인 것인 제제.
제16항에 있어서, 상기 용매는 디클로로메탄(dichloromethane)인 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 10℃ 내지 20℃에서 200 내지 400 rpm으로 30분 내지 2시간, 25℃ 내지 35℃에서 200 내지 400 rpm으로 30분 내지 2시간, 및 35℃ 내지 45℃에서 200 내지 400 rpm으로 30분 내지 4시간 동안 교반하여 용매를 휘발시킨 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 생분해성 고분자와, 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 1:1 내지 10:1의 중량비로 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 생분해성 고분자와, 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 2:1 내지 5:1의 중량비로 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 마이크로입자의 중간 입자 크기(D50)는 25 ㎛ 내지 100 ㎛인 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 균질하게 분포된 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제가 비경구 제제인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 피하투여, 또는 근육투여를 위한 주사제인 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 단위 투여 제형 당 0.1 mg 내지 1 g의 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 저용량 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 1일 내지 1년에 1회 투여하는 것인 제제.
제28항에 있어서, 상기 제제는 1주 내지 2개월에 1회 투여하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 0.1 mg/kg 체중 내지 1 g/kg 체중의 용량으로 투여하기 위한 것인 제제.
제30항에 있어서, 상기 제제는 10 mg/kg 체중 내지 500 mg/kg 체중의 용량으로 투여하기 위한 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 혈구탐식성 림프조직구증(Hemophagocytic lymphohistiocytosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 기쿠치(Kikuchi) 병, 혈관염(vasculitis), 성인 스틸 병(Adult onset Still's disease), 염증성 근육염(Inflammatory Myositis), 베체트 병(Behcet disease), IgG4-연관성 질환, 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 거대세포 동맥염(Giant cell arteritis), 측두 동맥염(Temporal arteritis), 제1형 당뇨병, 아토피 피부염, 크론병(Crohn's disease), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 건선, 그레이브스 갑상선 항진증(Grave's hyperthyroidism), 하시모토병(Hashimoto's disease), 악성빈혈(Pernicious anemia), 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis), 근무력증(Myasthenia), 백반증(Vitiligo), 길리안바레증후군(guilian-Barre syndrome), 사구체신염(Glomerulonephritis), ANCA-혈관염(ANCA-associated vasculitis;AAV), 항인지질증후군 (antiphospholipid syndrome), 천포창 (Pemphigus), 암(Cancer), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 뇌척수염(Encephalomyelitis), 섬유근통(fibromyalgia), 및 건선 관절염(psoriatic arthritis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
1) 날트렉손 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제1용매에 용해시켜 약물 용액을 제조하는 단계;
2) 생분해성 고분자를 제2용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조하는 단계;
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계에서 제조한 약물 용액과 고분자 용액을 혼합 교반하여 유상 용액을 제조하는 단계;
4) 상기 3) 단계에서 제조한 유상 용액과 수상 용액을 마이크로입자(마이크로스피어) 제조 모듈에 적용하여 마이크로입자를 제조하는 단계; 및
5) 상기 4) 단계에서 제조된 마이크로입자를 교반하여 용매를 제거하는 단계를 포함하는 날트렉손 마이크로입자 제조 방법.
제33항에 있어서, 상기 제1용매는 디클로로메탄, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르, 벤질 알코올, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 제2용매는 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 또는 이들의 조합인 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 1) 단계와 2) 단계는 순차적으로, 동시에, 또는 역순으로 진행되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 3) 단계에서, 약물 용액과 고분자 용액은 약물과 고분자의 중량비가 1: 0.5 내지 1:10이 되도록 혼합되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 수상 용액은 폴리에틸렌글리콜 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 올레이트, 소듐라우릴설페이트, 또는 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol; PVA) 용액인 것인 방법.
제33항에 있어서, 6) 마이크로입자를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따라 제조된 날트렉손을 포함하는 마이크로입자.
제1항에 있어서, 하나 이상의 자가면역질환 치료제와 함께 투여되는 제제.
제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 자가면역질환 치료제는
메토트렉세이트, 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, 레플루노미드, 아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 골리무맙, 토실리주맙, 아바타셉트, 리툭시맙, 토파시티닙, 바리시티닙, 페피시티닙, 유파다시티닙, 글라티라머 아세테이트, 디메틸 푸마레이트, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 오크렐리주맙, 핀골리모드, 나탈리주맙, 오자니모드, 시포니모드, 알렘투주맙, 테리플루노미드, 클라드리빈, 미토산트론, 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 제제.
제1항의 서방성 제제를 개체에 1주 내지 1년에 1회 주사 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법.
날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제44항에 있어서, 상기 약학 조성물은 비경구 투여되는 약학 조성물.
제44항에 있어서, 상기 약학 조성물은 피하투여, 또는 근육투여를 위한 주사제인 약학 조성물.
제44항에 있어서, 상기 약학 조성물은 단위 투여 제형 당 0.1 mg 내지 1 g의 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물.
제44항에 있어서, 상기 약학 조성물은 저용량 날트렉손 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물.
제44항에 있어서, 상기 약학 조성물은 0.1 mg/kg 체중 내지 1 g/kg 체중의 용량으로 투여하는 약학 조성물.
제44항에 있어서, 상기 약학 조성물은 10 mg/kg 체중 내지 500 mg/kg 체중의 용량으로 투여하는 약학 조성물.