ES2622628T3 - Proceso para la producción de microalgas, cianobacterias y metabolitos de las mismas - Google Patents

Proceso para la producción de microalgas, cianobacterias y metabolitos de las mismas Download PDF

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Abstract

Un proceso para el aumento de la producción de (a) ácido eicosapentaenoico en microalgas seleccionadas de la familia Pleurochloridaceae o (b) exopolisacárido en microalgas de la especie Dictyosphaerium chlorelloides, comprendiendo dicho proceso las etapas de: (i) cultivar una cepa de microalgas seleccionada de la familia Pleurochloridaceae o de la especie Dictyosphaerium chlorelloides mediante una fase de producción; (ii) exponer el cultivo de microalgas a un estímulo, donde el estímulo comprende (a) una disminución del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 6, seguido de un aumento del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 7 y (b) un aumento de la irradiancia lumínica hasta al menos 400 μmol/m2/seg.

Description

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DESCRIPCION
Proceso para la produccion de microalgas, cianobacterias y metabolitos de las mismas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un proceso donde un cultivo de microalgas se expone a un estfmulo con el fin de potenciar la produccion de uno o mas metabolitos. Tambien se describe en la presente memoria, un proceso para la produccion de microalgas y/o cianobacterias que comprende una etapa de adaptacion donde se cultiva un cultivo de algas/cianobacterias en el agua de alimentacion del proceso y/o bajo diodos emisores de luz (LED) que emiten luz dentro del espectro de las longitudes de onda lummicas entre aproximadamente 400 nm y 700 nm y una etapa de produccion, donde las microalgas o cianobacterias se cultivan en el mismo agua de alimentacion del proceso y/o en las mismas condiciones de luz utilizadas en la etapa de adaptacion.
La presente invencion integra metodos de cultivo de microalgas formadoras de lfpidos preferiblemente en sistema(s) de fotobiorreactores, estanques abiertos u otros metodos de cultivo. Proporciona un proceso integrado y continuo para la produccion de biomasa de algas y la conversion en subproductos de alto valor como EPA o biocombustibles. Tambien se describe una cepa espedfica para su uso en la invencion, a la que se hace referencia aqrn como ALG02.
En la presente memoria se describe un proceso para aumentar la produccion de exopolisacaridos (EPS) de una unica cepa de microalgas (Dictyosphaerium chlorelloides ALG03) que esta pre-ajustada/adaptada en cultivo para su posterior produccion a gran escala usando espectros de iluminacion LED definidos junto con el CO2 de los residuos industriales y agua como nutriente y energfa para el crecimiento en fotobiorreactores (FBR). Ademas, proporciona un proceso integrado y continuo para la produccion de biomasa de algas antes/despues de la extraccion de hidratos de carbono que puede usarse para otros propositos posteriores, por ejemplo, para aumentar la disponibilidad de nutrientes y la adherencia del suelo en las zonas de las rafces de las plantas irrigadas con riego por goteo subterraneo; como biomasa para unidades de digestores anaerobios o plantas de bioetanol o para la produccion de biogas. Tambien se describe una cepa espedfica para su uso en la invencion, a la que se hace referencia aqrn como ALG03.
Antecedentes de la invencion
Las algas son uno de los organismos que crecen mas rapido en la tierra. Pueden reproducirse (floracion) en cuestion de horas. Solo requieren CO2 y luz para crecer en agua fresca, aguas residuales o agua de mar. Ademas, los niveles elevados de nutrientes (principalmente nitrogeno y fosfatos) que se encuentran en el agua de los procesos industriales con otros compuestos que favorecen el crecimiento pueden aumentar el crecimiento de la biomasa por las algas (a).
Las algas estan siendo objeto de interes tanto para futuros combustibles como para soluciones de tratamiento de aguas residuales en investigaciones que se estan llevando a cabo en todo el mundo. Esto se debe a que las algas, en el proceso de producir combustible de algas, pueden secuestrar las emisiones de CO2 de fuentes industriales y ayudar a secuestrar los nutrientes (y algunos metales pesados) que se mantienen en el agua de proceso parcialmente tratada (b, c).
Las algas y las cianobacterias son tambien fuentes valiosas de metabolitos, por ejemplo acidos grasos incluyendo acido minstico, acido palmftico, acido palmitoleico, acido behenico, acido laurico, acido linoleico, acido alfa y gamma linolenico, acido estearico, acido araquidonico y acido eicosapentaenoico. Ademas, las sustancias polimericas extracelulares de las microalgas y las cianobacterias (de naturaleza polisacandica) presentan propiedades bioqmmicas unicas que las hacen interesantes desde el punto de vista biotecnologico. Las cianobacterias producen exopolisacaridos complejos y sus aplicaciones incluyen revestimiento de alimentos, agentes emulsionantes y gelificantes, floculantes, viscosificantes e hidratantes en las industrias alimentaria y no alimentaria. Tambien hay potencial para su uso como una fuente de nuevos compuestos en adhesivos de tejidos blandos en el sector sanitario (d). En el campo de la biorremediacion, los polisacaridos extracelulares (EPS) pueden eliminar los metales pesados toxicos de los suelos y aguas contaminadas (e, f) y en el reciclaje de aguas residuales de nutrientes y otros elementos.
De lo anterior se desprende que las algas y cianobacterias representan recursos valiosos en muchas areas diferentes de la tecnologfa, por lo que los presentes inventores buscaron desarrollar nuevos procesos para el crecimiento y produccion de tales microorganismos.
Hu et al. (Extracellular carbohydrate polymers from five desert soil algae with different cohesion in the stabilization of fine sand grain (2003) Carbohydrate polymers. 54; 33-42) describe la caracterizacion de sustancias polimericas extracelulares (EPS) de cuatro cianobacterias filamentosas: Microcoleus vaginatus; Scytonema javanicum; Phormidium tenue y Nostoc sp., y un alga verde coccoide unicelular Desmococcus olivaceus.
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Hu et al. (Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production; perspectives and advances. (2008) The Plant Journal. 54; 621-639) es un artfculo de revision relacionado con la smtesis de triacilgliceroles (TAG) por las algas. El documento resume entre otros el conocimiento de las algas oleaginosas y su biosmtesis de acidos grasos y TAG, sistemas de modelos de algas y el potencial de uso de las algas en la investigacion y comercializacion de biocombustibles.
Molina Grima et al. (EPA from Isochrysis galbana. Growth Conditions and Productivity. (1992) Process Biochemistry 27; 299-305) describe la produccion de EPA por el alga Isochrysis galbana. En el estudio descrito, se ensayaron los efectos de diversas condiciones de crecimiento sobre la produccion de EPA.
Sumario de la invencion
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona un proceso para el aumento de la produccion de (a) acido eicosapentaenoico en microalgas seleccionadas de la familia Pleurochloridaceae o (b) exopolisacarido en microalgas de la especie Dictyosphaerium chlorelloides, comprendiendo dicho proceso las etapas de:
(i) cultivar una cepa de microalgas seleccionada de la familia Pleurochloridaceae o de la especie Dictyosphaerium chlorelloides mediante una fase de produccion;
(ii) exponer el cultivo de microalgas a un estimulo, donde el estimulo comprende (a) una disminucion del pH hasta un pH no mayor de aproximadamente pH 6, seguido de un aumento del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 7 y (b) un aumento de la irradiancia lummica hasta al menos 400 |jmol/m2/segundo.
Tambien se describe en la presente memoria un proceso para la produccion o crecimiento de microalgas y/o cianobacterias o la produccion de uno o mas metabolitos derivados de las mismas, proceso que comprende:
(i) una etapa de adaptacion, que comprende cultivar microalgas o cianobacterias:
(a) en el agua de alimentacion del proceso y seleccionar aquellas microalgas o cianobacterias capaces de crecer en el agua de alimentacion del proceso y/o
(b) bajo diodos emisores de luz (LED) que emiten 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro de las longitudes de onda lummicas entre aproximadamente 400 y 700 nm y
(ii) una fase de produccion, que comprende cultivar las microalgas o cianobacterias seleccionadas de (i) en el mismo agua de alimentacion del proceso utilizada en la etapa de adaptacion y/o en las mismas condiciones de luz utilizadas en la etapa de adaptacion.
Tambien se describe en la presente memoria un microorganismo que es, o tiene las caractensticas de identificacion de, una cepa de Chlorogibba allorgei depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 817/1, o una cepa mutante derivada de la misma. La cepa de Chlorogibba allorgei depositada con el numero de acceso CCAP 817/1 tambien se denomina aqrn ALG02.
Se describe adicionalmente en la presente memoria un microorganismo que es o tiene las caractensticas de identificacion de una cepa de Dictyosphaerium chlorelloides depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 222/98 o una cepa mutante derivada de la misma. La cepa de Dictyosphaerium chlorelloides depositada con el numero de acceso CCAP 222/98 tambien se denomina aqrn ALG03.
El proceso descrito en la presente memoria puede ser para el aumento de la produccion de microalgas que contienen bioprotemas, lfpidos y metabolitos valiosos comercialmente incluyendo acido eicosapentaenoico (EPA), acido minstico, acido palmftico, acido behenico, acido laurico, acido linoleico, acido alfa linolenico y acido estearico. El proceso utiliza longitudes de onda de luz optimizadas para el cultivo y la produccion preferiblemente en fotobiorreactores de cepas de microalgas ricas en lfpidos tales como las del filo Chlorophyta y seleccionadas de la familia Pleurochloridaceae. Se usan subproductos industriales tales como agua de proceso y CO2 como fuentes recuperadas de nutrientes y carbono para ajustar/adaptar las algas para un mayor crecimiento utilizando estos insumos.
Tambien se describe un proceso unico en dos etapas para la optimizacion de la produccion de un exopolisacarido comercialmente valioso en algas, en particular en Dictyosphaerium chlorelloides y puede aplicarse a una cepa de microalgas espedfica. El proceso tiene lugar en un sistema fotobiorreactor (FBR). El proceso aprovecha el dioxido de carbono (CO2)/agua del proceso industrial para cultivar el alga y aumentar las tasas de crecimiento en condiciones similares en el sistema de FBR escalado. El proceso utiliza el cultivo de pre-adaptacion del alga para ajustar el organismo al uso escalado de agua del proceso/CO2 y la iluminacion de LED. Esto, a su vez, permite que el alga produzca niveles elevados de un exopolisacarido con usos comerciales. La biomasa de algas cargada de hidratos de carbono se puede emplear en el riego de cultivos como un fertilizante rico en nutrientes y con un alto contenido de carbono o, en otra alternativa, en la produccion de energfa en procesos posteriores (produccion de bioetanol u otros sistemas de biomasa energetica, por ejemplo, digestores anaerobicos o vasos de fermentacion).
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En la presente memoria se describe ademas un nuevo proceso de produccion con rendimientos elevados de un exopolisacarido a partir de una cepa adaptada de Dictyosphaerium chlorelloides ALG03 que se ha desarrollado para crecer a altas velocidades en una fuente secundaria de aguas residuales tratadas bajo luces LED ajustadas. Este tratamiento duplica el rendimiento del polisacarido extracelular del 38 % al 77 % observado en la fase de adaptacion del crecimiento. El alto porcentaje de polisacarido producido puede ser trasladado a un proceso posterior donde el polfmero se puede extraer para una variedad de usos. La biomasa residual que queda despues de la extraccion de los hidratos de carbono puede utilizarse tanto para alimentacion animal (si se utiliza agua pura en el biorreactor) como para la produccion de energfa, por ejemplo, en digestores anaerobios, procesos de fermentacion o sistemas de pirolisis.
En la presente memoria se describe una cepa espedfica (aislada) de algas pertenecientes a la familia de Dictyosphaeriaceae y en particular al genero Dictyosphaerium, mas espedficamente una cepa de Dictyosphaerium chlorelloides. La cepa se deposito en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 222/98 y se acepto el 25 de enero de 2011. Esta cepa se muestra en la presente memoria como util en la produccion de metabolitos espedficos.
Se describe adicionalmente en la presente memoria un nuevo proceso de utilizacion de la biomasa de algas producida como acondicionador de suelo espedfico utilizando sistemas de riego por goteo subterraneo (SDI). La biomasa cultivada dentro del agua tratada pasa a un tanque de retencion de riego listo para mezclarse con agua de riego normal y otros productos qmmicos compatibles. El suministro de dosis de las celulas de algas que ya han absorbido fosfatos y nitratos junto con otros nutrientes de los desechos o del agua de proceso ayuda a proporcionar un fertilizante de 'liberacion lenta natural’ a la zona de las rafces de las plantas. Tambien aumenta el carbono en los suelos y ayuda a agregar las partfculas de suelo alrededor de las rafces en desarrollo de las plantas, evitando la erosion del suelo, que es vital en las zonas aridas.
Estos y otros objetos, que se pondran de manifiesto durante la siguiente descripcion detallada, se han logrado mediante el descubrimiento de los inventores de que la formacion de exopolisacarido por cepas de algas pre- ajustadas/adaptadas puede duplicar los rendimientos del biopolfmero rico en hidratos de carbono mediante la manipulacion de su pre-cultivo y manejo durante el crecimiento en FBR.
Breve descripcion de los dibujos
Fig. 1 Adaptacion de iluminacion LED - Perfil FAME.
Perfiles FAME de HPLC aumentados bajo luces LED ajustadas en comparacion con la iluminacion fluorescente de una especie de Scenedesmus (ALG05), que tema 6 meses de pre-exposicion a la iluminacion LED PAR (400-700 nm) con 6 ciclos de sub-cultivo.
Los perfiles de HPLC (FAME) obtenidos a partir de cepas de algas cultivadas utilizando iluminacion LED PAR solo en ciclos de 24 horas durante 6 meses (6 sub-cultivos). Observese la aparicion de acidos grasos de mayor peso molecular (flecha en la imagen derecha) en comparacion con la misma cepa cultivada con iluminacion fluorescente (imagen izquierda) de la misma irradiancia.
Fig. 2 Aumento del crecimiento en el agua de proceso tratada con pre-cultivo.
Aumento del crecimiento de Trachydiscus sp. (ALG01), Chlorella sp. (ALG04) y Scenedesmus sp. (ALG05) mediante pre-cultivo con 6 meses (6 ciclos) de exposicion al agua de proceso tratada y luces LED PAR ajustadas (27 °C y 24 horas de luz).
Las celulas adaptadas se cultivaron durante 6 meses en agua de una planta de proceso (tratamiento secundario) y se volvieron a cultivar cada 4 semanas en agua de proceso fresca. Se cultivaron celulas no adaptadas en medio de crecimiento ZBB estandar 100 % y se volvieron a cultivar cada 4 semanas en medio nuevo ZBB. A continuacion, ambas cepas se cultivaron durante 9 dfas (hasta la fase estacionaria) en el agua de proceso nueva. Los resultados muestran una clara adaptacion al entorno del agua de proceso y la iluminacion LED por celulas pre-adaptadas.
Fig. 3 Contenido de lfpidos de diferentes cepas.
Comparacion de la produccion de hidratos de carbono/lfpidos/protemas por cepas en fase de crecimiento exponencial y valores calonficos de la biomasa. Los cultivos se cosecharon en la fase de crecimiento exponencial.
Fig. 4 Produccion de acido eicosapentaenoico (EPA) en una cepa de Chlorogibba sp. (ALG02)
Porcentaje de contenido de acidos grasos principales en la muestra de biomasa producida en condiciones de crecimiento suboptimo (sin adicion de CO2 o irradiancia PAR) y analizados por cromatograffa capilar. Otros analisis de esta cepa y Trachydiscus sp. ALG01 cultivada utilizando fuentes de luz PAR y a la que se anadio CO2 han mostrado porcentajes de EPA en el intervalo del 30-38 % del contenido total de acidos grasos. Se han detectado niveles significativos de acidos grasos palmttico y minstico en los analisis bajo iluminacion PAR controlada.
La Fig. 5A y B son graficos que muestran los resultados de trabajos experimentales que ilustran la relacion entre las concentraciones de nutrientes y los niveles de luz y el crecimiento de la cepa de algas Dictyosphaerium chlorelloides ALG03.
5A. Requisites de bajos niveles de nutrientes
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El crecimiento durante 4 dfas en el medio basal de Bold para algas muestra que el alga necesita niveles relativamente bajos de nutrientes para un crecimiento optimo a 27 °C bajo irradiancia optima de luz.
5B. Niveles de irradiancia luminica LED para el crecimiento
El grafico muestra que el alga crece mejor en condiciones de poca luz durante 7 dfas en medio BB 25 % a 27 °C.
La Fig. 6 Es una ilustracion esquematica de un sistema para producir biopolfmero de algas de acuerdo con la presente invencion para su uso en el riego.
La Fig. 7 es un grafico que muestra la recoleccion secuencial de Dictyosphaerium chlorelloides ALG03. La biomasa se muestra como lecturas de densidad optica (680 nm) en un FBR que muestra que la cosecha diaria a tasas del 50 % permite el nuevo crecimiento de la misma biomasa de Dictyosphaerium chlorelloides ALG03 en 24 horas cuando se rellena con nuevo medio de crecimiento.
La Fig. 8 muestra la adaptacion de la cepa a las aguas residuales y la iluminacion LED, lo que aumenta las tasas de crecimiento en comparacion con la cepa no adaptada.
Aumento del crecimiento de Dictyosphaerium chlorelloides por adaptacion fisiologica con 6 meses (6 ciclos) de exposicion a aguas residuales y luces LED PAR ajustadas (27 °C y 24 horas de luz).
La Fig. 9 muestra la duplicacion de EPS despues del final de la segunda fase de cultivo (imagen a la derecha).
La Fig. 10 muestra la comparacion de los contenidos de hidratos de carbono/lfpidos/protemas de las celulas de 3 organismos y los valores calonficos.
Comparacion de la produccion de hidratos de carbono/lfpidos/protemas por una cepa de Dictyosphaerium chlorelloides ALG03 en fase logantmica de crecimiento y valores calonficos de la biomasa. Los cultivos se cosecharon en la fase de crecimiento exponencial.
La Fig. 11 muestra los resultados del uso del riego por goteo para cultivar puerros en un suelo arenoso infertil en un ensayo en invernadero durante un penodo de 12 semanas.
Descripcion detallada de la invencion
En un primer aspecto, la invencion proporciona un proceso para el aumento de la produccion de (a) acido eicosapentaenoico en microalgas seleccionadas de la familia Pleurochloridaceae o (b) exopolisacarido en microalgas de la especie Dictyosphaerium chlorelloides, comprendiendo dicho proceso las etapas de:
(i) cultivar una cepa de microalgas seleccionada de la familia Pleurochloridaceae o de la especie Dictyosphaerium chlorelloides mediante una fase de produccion;
(ii) exponer el cultivo de microalgas a un estimulo, donde el estimulo comprende (a) una disminucion del pH hasta un pH no mayor de aproximadamente pH 6, seguido de un aumento del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 7 y (B) un aumento de la irradiancia lummica hasta al menos 400 pmol/m2/segundo.
En el contexto de la presente invencion, el termino “cultivo” se usa para indicar el crecimiento de una o mas cepas de microalgas en cualquier medio adecuado. Dichos medios pueden incluir medios de crecimiento estandar como senan conocidos por un experto en la materia, por ejemplo, el medio basal de Bold o equivalente. En una realizacion preferida, las cepas de microalgas se cultivan en agua de proceso, donde la expresion “agua de proceso” incluye agua de proceso procedente de sistemas industriales y aguas residuales domesticas. El agua del proceso puede ser tratada antes de su uso (por ejemplo, esterilizada o no) y suplementada con nutrientes de manera que los niveles de nutrientes esten dentro de los intervalos observados en los medios de crecimiento estandar.
El cultivo puede ser un lote, un lote alimentado o un cultivo al menos parcialmente continuo (antes de la fase estacionaria) en ciertas realizaciones.
La fase de produccion
El crecimiento de la cepa de microalgas durante la fase de produccion generalmente ocurre a una velocidad exponencial. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la fase de produccion corresponde a la fase exponencial del crecimiento del cultivo.
La “fase exponencial”, tambien conocida como “fase log” o “fase logantmica”, es un penodo definido durante el cultivo discontinuo de microorganismos, incluyendo microalgas, caracterizado por la duplicacion de las celulas. El numero de nuevos organismos que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la poblacion existente. Si el crecimiento no es limitado, la duplicacion continuara a una tasa constante de modo que tanto el numero de celulas como la tasa de aumento de poblacion se duplican con cada penodo de tiempo consecutivo. La velocidad de crecimiento real puede variar dependiendo de la cepa del microorganismo utilizado y/o de las condiciones de crecimiento.
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Las condiciones medioambientales o de cultivo utilizadas durante la fase de produccion pueden seleccionarse espedficamente para permitir un crecimiento exponencial de la cepa de microalgas que se esta utilizando.
En ciertas realizaciones, la densidad celular para la cepa de microalgas en el punto en que el crecimiento exponencial comienza a cesar, antes del comienzo de la fase estacionaria, el final de la fase exponencial de produccion, no debe ser inferior a 108 celulas por ml de medio de cultivo y preferiblemente entre 107 y 108 celulas por ml. Las condiciones de cultivo utilizadas para conseguir un crecimiento optimo del cultivo o crecimiento exponencial del cultivo pueden seleccionarse de entre las siguientes:
- luz artificial continua de longitud de onda entre aproximadamente 400 nm y 700 nm y/o
- luz artificial continua de entre aproximadamente 50 jmol/m2/seg y 200 pmol/m2/seg y/o
- temperatura entre aproximadamente 20 °C y 40 °C y/o
- niveles de oxfgeno entre aproximadamente 500 mV y 800 mV y/o
- pH entre aproximadamente pH6 y pH9.
El experto en la materia entendera que las condiciones de cultivo pueden variarse dependiendo de la cepa de microalgas a cultivar. Las condiciones espedficas se describen en la presente memoria para cepas espedficas de la invencion y tales condiciones pueden usarse como una grna para aplicar a otras cepas, como sena entendido por un experto en la materia.
En realizaciones preferidas de la invencion, el cultivo o crecimiento de la cepa de microalgas durante la fase de produccion se produce en un fotobiorreactor (FBR). Tal como se utiliza en la presente memoria, un fotobiorreactor debe entenderse como un biorreactor que incorpora una o mas fuentes de luz para proporcionar una entrada de energfa fotonica al reactor. En realizaciones preferidas, las microalgas crecen en un sistema cerrado al entorno (externo). Las fuentes de luz preferidas incluyen diodos emisores de luz (LED) y, en particular, LED que emiten luz PAR (radiacion fotosinteticamente activa en el intervalo de 400-700 nm). En ciertas realizaciones, un FBR puede configurarse de manera que incluya fuentes de luz LED (muy ajustadas) disenadas para proporcionar iluminacion de angulo de 360 grados desde el centro del biorreactor para maximizar el crecimiento de diferentes cepas de algas alrededor de la fuente de luz. En realizaciones preferidas, la luz es suministrada por LED que emiten 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro PAR de 400-700nm. En una realizacion preferida, la luz es suministrada por LED que emiten un pico de luz roja en el intervalo entre aproximadamente 500-665 nm, preferiblemente aproximadamente 660 nm y un pico de luz azul en el intervalo entre aproximadamente 440-500 nm, preferiblemente aproximadamente 460 nm.
Cuando la fase de produccion se lleva a cabo en un FBR, la densidad para la cepa de microalgas no debe ser inferior al 10 % (v/v) del volumen del FBR al comienzo de la fase de produccion. En las mismas realizaciones o realizaciones alternativas, los cultivos de microalgas no estan expuestos a la luz solar natural.
El estimulo
En la segunda etapa del proceso de la invencion, el cultivo de microalgas se expone a un estimulo, donde el estimulo comprende, consiste esencialmente en (a) una disminucion del pH hasta un pH no superior a aproximadamente pH 6 seguido por un aumento del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 7, y (b) un aumento de la irradiancia lummica hasta al menos aproximadamente 400 jmol/m2/segundo.
El pH del cultivo durante la fase de produccion estara generalmente en la region de aproximadamente pH 7-9 y, por lo tanto, el estimulo puede comprender una disminucion del pH desde un pH de entre aproximadamente 7 y 9 hasta un pH entre aproximadamente pH 3 y pH 6, preferiblemente entre aproximadamente pH 5 y pH 6. El pH del cultivo puede disminuirse y aumentarse posteriormente por cualquier medio adecuado conocido por el experto en la materia, siempre que la viabilidad del cultivo no se vea comprometida. En una realizacion preferida, el pH se reduce por la adicion de dioxido de carbono, CO2.
La irradiancia lummica suministrada al cultivo durante la fase de produccion estara generalmente en la region de 50200 |jmol/m2/seg y por lo tanto el estimulo puede comprender un aumento de la irradiancia lummica entre aproximadamente 50-200 jmol/m2/seg entre aproximadamente 400-2000 jmol/m2/seg. La fuente de luz comprende preferiblemente, consiste esencialmente en o consiste en uno o mas LED.
El cultivo de microalgas se expone generalmente al estimulo una vez que el cultivo ha alcanzado el pico de crecimiento de fase exponencial. Este pico se produce inmediatamente antes del comienzo de la fase estacionaria. La fase estacionaria es un periodo bien definido durante el cultivo discontinuo de microorganismos, incluyendo microalgas, donde la velocidad de crecimiento del cultivo se ralentiza, generalmente como resultado del agotamiento de los nutrientes y la acumulacion de productos toxicos. Durante esta fase, la tasa de crecimiento de microorganismos es generalmente igual a la tasa de mortalidad de los microorganismos. El experto en la materia comprendera que cualquier cultivo de microalgas experimenta una transicion del pico de crecimiento exponencial a la fase estacionaria. El cultivo puede estar expuesto al estimulo en cualquier momento durante el pico de
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crecimiento de fase exponencial o en cualquier momento durante la transicion de la fase exponencial a la fase estacionaria.
La tasa de crecimiento de las microalgas puede controlarse a lo largo de la fase de produccion, por ejemplo, utilizando tecnicas de muestreo tales como recuentos celulares o midiendo los niveles de clorofila a en el cultivo. El numero de celulas se puede determinar usando muestreo espectrofotometrico del cultivo, por ejemplo, tomando lecturas a aproximadamente una de DO 680 nm. Estas medidas pueden ser utilizadas para identificar la fase exponencial del crecimiento, el pico de crecimiento de la fase exponencial y el momento en el que el cultivo empieza a entrar en la fase estacionaria de crecimiento. Se puede emplear cualquier tecnica adecuada.
El esffmulo comprende como mmimo una disminucion del pH hasta un pH no superior a aproximadamente pH 6 seguido de un aumento del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 7 y un aumento de la irradiancia lummica hasta al menos 400 |jmol/m2/seg. El esffmulo puede comprender adicionalmente la adicion de una fuente de carbono, donde la fuente de carbono es CO2 en sus diversas formas.
En realizaciones preferidas, la disminucion y el subsiguiente aumento del pH preceden al aumento de la irradiancia lummica. El pH puede reducirse hasta un pH no superior a aproximadamente pH 6, preferiblemente entre aproximadamente pH 5 y pH 6, durante un periodo de entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 2 horas. Posteriormente, el pH puede aumentarse hasta un pH entre aproximadamente pH 6 y pH 9, preferiblemente entre aproximadamente pH 7 y pH 9. El pH puede elevarse usando cualquier medio adecuado, siempre que esto no comprometa la viabilidad del cultivo. En general, el pH se restaura a los niveles pre-esffmulo.
En ciertas realizaciones, el cultivo de microalgas se cultiva durante un penodo adicional de crecimiento de al menos aproximadamente 12, 24, 36, 48 horas, etc., despues de que comience la exposicion al esffmulo. En las realizaciones en las que el pH disminuye durante un periodo comprendido entre aproximadamente 30 minutos y 2 horas, y subsiguientemente elevado, por ejemplo, a niveles pre-esffmulo, el periodo de cultivo despues de la exposicion al esffmulo puede calcularse a partir del momento de disminucion del pH inicial, o desde el momento en que se restaura el pH y se aumenta posteriormente la irradiancia.
Produccion de metabolitos
Un efecto de la exposicion de la cepa de microalgas al esffmulo es inducir o promover la produccion de metabolitos particulares dentro de las microalgas. Los presentes inventores han observado que la exposicion de ciertas cepas de microalgas al esffmulo como se define en la presente memoria, conduce a la produccion de grandes cantidades de metabolitos particulares, dependiendo el metabolito particular de la cepa del microorganismo utilizado. El proposito de llevar a cabo el proceso reivindicado descrito anteriormente es, por tanto, mejorar la produccion de uno o mas metabolitos en celulas de microalgas. Tales metabolitos se recogen generalmente despues del penodo adicional de crecimiento despues de que el cultivo haya sido expuesto al esffmulo. Los metabolitos pueden recogerse, purificarse y/o analizarse utilizando cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en Bligh, E.G. Y Dyer, W.J. 1959. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can.J.Biochem.Physiol. 37:911-917.
Los lfpidos tambien pueden ser cosechados/analizados de acuerdo con procesos estandar industriales tales como las variantes de CO2 supercntico en extracciones con disolvente, destilacion fraccionada y cromatograffa, o de acuerdo con el siguiente protocolo:
Se mezclan 25 mg de muestra de producto de algas con el patron interno si se usa para medidas de GC-MS en tubos de cultivo. Anadir 1,5 ml de hidroxido de sodio 0,5 N en metanol, tapar los tubos y calentar a 100 °C durante 5 minutos. Dejar enfriar y anadir 2 ml de reactivo de BF3/metanol, tapar los tubos, mezclar y calentar a 100 °C durante 30 minutos. Dejar enfriar y anadir 2 ml de isohexano + BHT y despues 5 ml de cloruro de sodio saturado, tapar el tubo y agitar vigorosamente durante 30 segundos. Enfriar a temperatura ambiente y dejar que las capas se separen. La capa de isohexano superior se coloca en una columna corta de sulfato sodico anhidro y se recoge. La capa acuosa se extrae con 2 ml de isohexano + BHT (hidroxitolueno butilado) y la capa superior de isohexano se coloca en la columna de sulfato sodico anhidro y el disolvente se recoge con la otra muestra. La columna se lava con 2 ml de iso-hexano + BHT y tambien se coloca en el mismo tubo de muestra.
Los polisacaridos pueden analizarse por tecnicas de cromatograffa disponibles para los expertos en la materia. El analisis de hidratos de carbono y alcoholes de azucar puede realizarse en extractos de biomasa de microalgas mediante cromatograffa de intercambio anionico a pH elevado (HPAE) seguida de deteccion electroqmmica (IPAD) y deteccion de espectrometffa de masas en paralelo. En una realizacion preferida, el extracto de muestra se analiza utilizando un sistema modular ICS-5000 acoplado a un espectrometro de masas MSQ Plus. Los analitos se separan en una columna CarboPac MA1 usando una condicion isocratica. Despues de la columna analftica, se divide el efluente de las columnas, de modo que la mitad de este fluye a traves de la celula de amperometffa, donde se realiza la deteccion amperometrica integrada y pulsada (IPAD), mientras que la otra mitad se desaliniza continuamente utilizando un dispositivo de desalinizacion de membrana (ASRS). El efluente neutralizado se mezcla a continuacion con una solucion acuosa de cloruro de litio para facilitar la deteccion de los hidratos de carbono en la
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EM como sus aductos de litio.
La biomasa gastada puede, a su vez, ser utilizada para una variedad de aplicaciones, incluyendo, pero sin limitarse a, alimentacion de rumiantes, alimentacion de ganado, acuicultura, pienso para aves de corral, fraccion de hidratos de carbono para produccion de bioetanol de la biomasa y extraccion de valiosos aminoacidos a partir de protemas.
En ciertas realizaciones, el proceso de la invencion es para el aumento de la produccion de acido eicosapentaenoico (EPA). El proceso descrito en la presente memoria puede utilizarse en particular para obtener perfiles de acidos grasos deseados en las cepas de microalgas cultivadas, para optimizar la produccion de EPA en cepas productoras de EPA. La EPA producida por medio del proceso descrito en la presente memoria puede, por ejemplo, ser utilizada en el sector alimentario, para la produccion de biocombustibles lfquidos, para ingredientes cosmeticos.
En ciertas realizaciones, el proceso de la invencion es para el aumento de la produccion de exopolisacarido (EPS).
Microalgas/Cianobacterias
Las microalgas para su uso junto con el proceso de la presente invencion se seleccionan de la familia Pleurochloridaceae y Dictyosphaerium chlorelloides de acuerdo con las presentes reivindicaciones.
En realizaciones en las que el proceso se va a utilizar para el aumento de la produccion de acido eicosapentaenoico, se prefiere que la cepa de microalgas se seleccione de Trachydiscus sp. y Chlorogibba sp., y es en particular, la cepa de Chlorogibba allorgei depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 817/1 (tambien denominada ALG02), o una cepa mutante derivada de la misma.
En realizaciones en las que el proceso se va a usar para el aumento de la produccion de exopolisacarido, se prefiere que la cepa de microalgas sea en particular la cepa de Dictyosphaerium chlorelloides depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 222/98 (tambien denominada ALG03), o una cepa mutante derivada de la misma.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion “cepa mutante” pretende significar una cepa derivada de la cepa de microalgas original, que retiene las caractensticas de la cepa de origen en la medida en que dichas caractensticas se relacionan con el perfil de metabolitos producidos cuando la cepa se expone a un estfmulo de acuerdo con el proceso de la invencion, descrito anteriormente.
Las microalgas para su uso junto con el proceso de la presente invencion pueden haber sido preseleccionadas, por ejemplo en base a un crecimiento optimo en las mismas condiciones de cultivo que las utilizadas durante la fase de produccion. Esta etapa de preseleccion o adaptacion, que puede preceder a las etapas del proceso detallado anteriormente, se describe con mas detalle a continuacion. Todas las realizaciones descritas a continuacion en la presente memoria son aplicables al primer aspecto de la invencion.
En la presente memoria se describe un proceso para la produccion o crecimiento de microalgas y/o cianobacterias o la produccion de al menos un metabolito derivado de las mismas, cuyo proceso comprende:
(i) una etapa de adaptacion, que comprende cultivar microalgas o cianobacterias:
(a) en el agua de alimentacion del proceso y seleccionar aquellas microalgas o cianobacterias capaces de crecer en el agua de alimentacion del proceso y/o
(b) bajo diodos emisores de luz (LED) que emiten 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro de las longitudes de onda lummicas entre aproximadamente 400 y 700 nm y
(ii) una fase de produccion, que comprende cultivar las microalgas o cianobacterias seleccionadas de (i) en el mismo agua de alimentacion del proceso utilizada en la etapa de adaptacion y/o en las mismas condiciones de luz utilizadas en la etapa de adaptacion.
Adaptacion
El agua de alimentacion del proceso puede ser obtenida de sistemas de procesos industriales o sistemas de aguas residuales domesticas. En dicho material de alimentacion existen generalmente importantes nutrientes para el crecimiento de las algas tales como nitratos y fosfatos. Tambien pueden estar presentes otros estimulantes de las algas, tales como elementos menores y vitaminas. Los sectores de los alimentos, refrescos y cervecenas tienen muchos flujos de agua de este tipo adecuados. Otras fuentes de agua dulce menos ricas en nutrientes pueden usarse si se anaden nutrientes equivalentes a los niveles usados en los medios de crecimiento estandar.
Las microalgas o cianobacterias se cultivan generalmente en el agua de alimentacion del proceso durante la etapa de adaptacion en condiciones optimas de cultivo incluyendo, pero sin limitarse a lo siguiente:
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- luz artificial continua de longitud de onda entre aproximadamente 400 nm y 700 nm y/o
- luz artificial continua de entre aproximadamente 50 |jmol/m2/seg y 200 pmol/m2/seg y/o
- temperatura entre aproximadamente 20 °C y 29 °C y/o
- pH entre aproximadamente pH 7 y pH 9.
El agua de proceso puede ser pre-acondicionada, por ejemplo para reducir las partfculas. El crecimiento de microalgas o cianobacterias durante la etapa de adaptacion se puede llevar a cabo utilizando matraces Erlenmeyer (100-500 ml) o fotobiorreactores preparativos. La luz puede ser suministrada por fuentes LED u otra luz no natural. En una realizacion preferida, la luz es suministrada por LED que emiten 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro de PAR de 400-700 nm. En una realizacion preferida adicional, la luz es suministrada por LED que emiten un pico de luz roja en el intervalo entre aproximadamente 500-665 nm, preferiblemente aproximadamente 660 nm y un pico de luz azul en el intervalo entre aproximadamente 440-500 nm, preferiblemente aproximadamente 460 nm.
En ciertas realizaciones, el objetivo de la etapa de adaptacion es identificar cepas de microalgas o cianobacterias que sean capaces de crecer en el agua de alimentacion del proceso para ser usadas en la fase de produccion del proceso.
En otra alternativa, o adicionalmente, la luz puede usarse para adaptar o “ajustar” las microalgas o cianobacterias a las condiciones que se utilizaran en la fase de produccion, preferiblemente para optimizar el crecimiento durante la fase de produccion. En una realizacion preferida, la fase de adaptacion implica el crecimiento de algas y/o cianobacterias bajo LED que emiten 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro PAR de 400-700 nm. En una realizacion preferida adicional, la luz es suministrada por LED que emiten un pico de luz roja en el intervalo entre aproximadamente 500-665 nm, preferiblemente aproximadamente 660 nm y un pico de luz azul en el intervalo entre aproximadamente 440-500 nm, preferiblemente aproximadamente 460 nm.
La etapa de adaptacion puede implicar cultivar las cepas de microalgas o cianobacterias durante un penodo de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6 meses, preferiblemente al menos aproximadamente 3 meses. La etapa de adaptacion puede implicar cultivar las cepas de microalgas o cianobacterias durante al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 generaciones de cultivo, preferiblemente al menos aproximadamente 6 generaciones de cultivo. En las realizaciones donde las microalgas o cianobacterias se cultivan durante varios meses o durante al menos 2 generaciones de cultivo, las microalgas o cianobacterias pueden ser subcultivadas, donde subcultivar se entiende que significa la transferencia de parte o la totalidad del cultivo a un nuevo medio de crecimiento. En una realizacion preferida, las microalgas o cianobacterias se subcultivan una vez al mes o una vez cada 4 semanas.
Una vez que se ha seleccionado una cepa de microalgas o cianobacterias de acuerdo con la etapa de adaptacion descrita anteriormente, la segunda etapa del proceso es la fase de produccion, la cual comprende cultivar las microalgas o cianobacterias seleccionadas en la misma agua de alimentacion del proceso y/o en las mismas condiciones de luz utilizadas en la etapa de adaptacion.
La expresion “el mismo” agua de alimentacion del proceso se entiende que significa agua de proceso del mismo lote, es decir, con las mismas caractensticas, que se utilizan para la etapa de adaptacion, en lugar de los mismos medios exactos utilizados para el crecimiento de las celulas durante la etapa de adaptacion.
La fase de produccion puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la fase de produccion como se ha descrito anteriormente para el proceso del primer aspecto. Por ejemplo, el crecimiento de la cepa adaptada de microalgas o cianobacterias puede llevarse a cabo en condiciones que permitan un crecimiento exponencial. Ademas, el crecimiento durante la fase de produccion se lleva a cabo preferiblemente en un fotobiorreactor de acuerdo con las definiciones anteriores. Las condiciones utilizadas en la fase de produccion pueden reflejar las condiciones utilizadas en la etapa de adaptacion. Por lo tanto, ademas de utilizar agua de proceso como materia prima, la adaptacion puede extenderse a condiciones ambientales adicionales, como se ha indicado anteriormente (longitud de onda de luz, niveles de irradiancia, temperatura, pH, etc.). Mas espedficamente, la adaptacion puede consistir en el uso de iluminacion por LED como se describe en la presente memoria. En una realizacion preferida, la adaptacion es a la iluminacion de LED suministrada a 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro de PAR de 400-700 nm. En una realizacion preferida adicional, la luz es suministrada por LED que emiten un pico de luz roja en el intervalo entre aproximadamente 500-665 nm, preferiblemente aproximadamente 660 nm y un pico de luz azul en el intervalo entre aproximadamente 440-500 nm, preferiblemente aproximadamente 460 nm.
En ciertas realizaciones, la fase de produccion puede ser seguida por una etapa que comprende la exposicion del cultivo de microalgas o cianobacterias a un estfmulo para aumentar la produccion de metabolitos. Todas las realizaciones del estfmulo descrito anteriormente en el contexto del primer aspecto de la invencion se aplican mutatis mutandis al proceso descrito. Ademas, las cepas de microalgas y/o cianobacterias para su uso de acuerdo con el proceso descrito pueden seleccionarse entre cualquiera de los filos, ordenes, familias y/o especies de microalgas y/o cianobacterias ya descritas anteriormente.
El proceso puede usarse para aumentar la produccion de biomasa de microalgas y/o cianobacterias. Dicha biomasa puede usarse en aplicaciones tales como la produccion de biocombustible, biodiesel, gasolina, queroseno o para su
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uso como acondicionador de suelos o biofertilizante, incluso en sistemas de riego subterraneo, como se describe mas adelante en la presente memoria. Como alternativa o ademas, el proceso puede usarse para la produccion de metabolites, incluyendo, pero sin limitarse a, el aumento de la produccion de lfpidos y/o hidratos de carbono. En realizaciones preferidas, el proceso es para el aumento de la produccion de acido eicosapentaenoico. En una realizacion preferida adicional, el proceso es para el aumento de la produccion de exopolisacarido.
Tambien se describe en la presente memoria un microorganismo que es, o tiene las caractensticas identificativas de una cepa de Chlorogibba allorgei depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 817/1 o una cepa mutante derivada de la misma.
Se describe adicionalmente en la presente memoria un microorganismo que es o tiene las caractensticas identificativas de una cepa de Dictyosphaerium chlorelloides depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 222/98, o una cepa mutante derivada de la misma.
La presente invencion describe un proceso para la produccion de acido eicosapentaenoico a partir de algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae (por ejemplo, Trachydiscus sp. y Chlorogibba sp.). Por consiguiente, la invencion proporciona un proceso para cebar y seleccionar celulas adaptadas de dichos cultivos de algas preparadas para el biorreactor y/u otras condiciones de cultivo utilizadas para producir productos de biomasa de algas que contienen lfpidos y metabolitos descritos en la presente memoria. El metodo puede comprender un metodo para preparar algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae y que contengan los lfpidos y acidos grasos antes mencionados incrementando la eficiencia fotosintetica, el ajuste de nutrientes y la actividad metabolica para la produccion de biodiesel, gasolina, queroseno y otras sustancias qmmicas de alto valor. Tambien la presente invencion proporciona un proceso para obtener perfiles de acidos grasos deseados en el acido eicosapentaenoico formando cepas de algas. Este proceso permite optimizar la produccion de acido eicosapentaenoico para el sector alimentario. En la presente memoria se describe un metodo para preparar especies del orden de las cianobacterias Chroococcales de los generos Synechocystis y Synechoccocus que contienen algunos o todos los lfpidos y acidos grasos anteriormente mencionados aumentando la eficacia fotosintetica y la actividad metabolica. Se describe adicionalmente en la presente memoria un proceso para obtener una produccion espedfica de acidos grasos en los lfpidos ajustando la eficiencia fotosintetica en presencia de bandas seleccionadas dentro de las longitudes de onda de la radiacion fotosinteticamente activa (PAR) usando luz continua.
En la presente memoria se describe una cepa espedfica (aislada) de algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae y en particular el genero Chlorogibba, mas espedficamente una cepa de Chlorogibba allorgei. La cepa se deposito en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 817/1 y se acepto el 25 de enero de 2011. Esta cepa se muestra en la presente memoria como util en la produccion de metabolitos espedficos.
Tambien se describe en la presente memoria un proceso para la produccion de un producto de biomasa de algas que contiene acido eicosapentaenoico y los lfpidos, acidos grasos y metabolitos anteriormente mencionados, adecuados para la produccion posterior de biodiesel, gasolina, queroseno y otros biocombustibles lfquidos y sustancias qmmicas industriales de alto valor que comprende las etapas de:
a) una etapa de cultivo previo que se usa para aislar, subcultivar y preparar algas ajustadas pertenecientes a
especies de Chlorophyta incluyendo espedficamente a la familia Pleurochloridaceae rica en ePa y al orden de las cianobacterias Chroococcales de los generos Synechocystis y Synechoccocus utilizando longitudes de onda de PAR de luz continua ajustada y tension de agua de proceso. Las algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae y las cianobacterias del orden Chroococcales de los generos Synechocystis y

Synechoccocus estan ahora listos para ser escaladas en biorreactores usando suministros de luz y fuentes de

agua similares. Los resultados muestran que se puede esperar hasta un aumento del doble en las tasas de
crecimiento en comparacion con los mismos cultivos cultivados en agua normal con nutrientes anadidos y luz del dfa o iluminacion fluorescente en las diferentes cepas.
b) una etapa de fotobiobioreactor en la cual las algas pertenecientes al filo Chlorophyta, la familia

Pleurochloridaceae o las cianobacterias del orden Chroococcales de los generos Synechocystis y
Synechoccocus se cultivan en el agua de proceso industrial, +/- nutrientes (medio de crecimiento BB estandar 100 % que comprende NaNOa (0,25 g/l); CaCh .2H2O (0,025 g/l); MgSO4.7H2O (0,075 g/l); K2HPO4 (0,075 g/l); NaCl (0,025 g/l); KH2PO4 (0,175 g/l); FeSO4 .7H2O (4,98 mg/l); H2SO4 (0,01 pl/l); H3BO3 (0,1142 g/l); ZnSO4 .7H2O (0,00882 g/l); MnCh .4H2O (0,00144 g/l); MoOa (0,00071 g/l); CuSO4 .5H2O (0,00157 g/l); Co(NOa)2 .6H2O (0,00049 g/l); EDTA (0,005 g/l); KOH (0,031 g/l)), longitudes de onda de luz PAR espedficas y niveles de irradiancia en un sistema de flujo continuo donde se mantiene la fase de crecimiento exponencial para permitir la recoleccion diaria de una proporcion establecida de producto de biomasa. El producto de biomasa que contiene los lfpidos, acidos grasos y metabolitos anteriormente mencionados y las bioprotemas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae y las cianobacterias Chroococcales de los generos Synechocystis y Synechoccocus. El biorreactor se rellena con agua de proceso o agua de proceso modificada con nutrientes para permitir que la densidad celular de las algas se recupere hasta la etapa de crecimiento exponencial antes de la proxima cosecha.
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Generalmente, las algas contienen aproximadamente 7 a 60 % en peso de contenido de Upidos con relacion al peso total de las algas secas. En el caso de las algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae, el acido eicosapentaenoico comprende del 25 al 40 % del acido graso total en el lfpido y los restantes acidos grasos son principalmente los acidos grasos saturados o insaturados anteriormente mencionados. Por lo tanto, las algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae poseen mayores cantidades de EPA que las fuentes tradicionales derivadas de los aceites de pescado.
Los lfpidos y metabolitos del acido eicosapentaenoico, del acido minstico, del acido palmftico, del acido behenico, del acido laurico, del acido linoleico, del acido alfa-linolenico y del acido estearico y similares pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae estan presentes como acidos grasos libres y/o in situ en el medio de crecimiento y/o se obtienen a partir del producto de biomasa de algas humedas y/u homogeneizado de algas y/o las algas despues de la liofilizacion o secado al aire y extrafdas en presencia de un disolvente organico adecuado y/o sonicadas o usando CO2 supercntico.
En ciertas realizaciones, cuando los medios de crecimiento (que utilizan agua para remediar o agua modificada con nutrientes) fluyen a traves del biorreactor con las algas, se exponen a conjuntos ajustados de bancos de luces LED regulables internamente o externamente al biorreactor que comprende patrones unicos de diodos que emiten luz Roja y Azul (LED) que estan configurados para operar a diferentes longitudes de onda dependiendo de la cepa de algas. La angulacion de los LED se optimiza para obtener el maximo suministro de irradiancia a los cultivos de algas que crecen dentro del FBR para promover y mantener la fase de crecimiento exponencial de las algas. La biomasa de algas se controla para determinar la densidad celular pero tambien para los contenidos de lfpidos/acidos grasos para comprobar que han alcanzado los niveles objetivo. A continuacion se deshidrata la biomasa y se pasa al proceso apropiado posterior para biocombustibles o se extraen acidos grasos de alto valor. La biomasa gastada restante puede utilizarse para alimentacion animal (si se utiliza agua pura en el biorreactor) o para la produccion de energfa en sistemas de digestion anaerobia (AD) o pirolisis.
Bioreactor
En la presente memoria se describe un proceso integrado de utilizacion de cualquier combinacion de energfas estandar o renovables tales como energfa solar, eolica, hidraulica, geotermica y termica y/u otras energfas renovables para alimentar un fotobiorreactor y producir continuos altos rendimientos de biomasa de algas. Mediante el uso de metodos eficientes y rentables la biomasa de algas se refina aun mas para producir biodiesel, bioqueroseno, gasolina, etanol y otros co-productos valiosos.
El sistema abarca fuentes de luz LED muy ajustadas que estan disenadas para maximizar el crecimiento de diferentes cepas de algas. El sistema abarca, pero no se limita a, la inclusion de fuentes de luz LED muy ajustadas que estan disenadas para proporcionar iluminacion en un angulo de 360 grados desde el centro de un biorreactor para maximizar el crecimiento de diferentes cepas de algas (creciendo alrededor de la fuente de luz).
Fuentes de energia
El sistema puede ser autoalimentado utilizando energfa de energfa solar, eolica, hidraulica, geotermica y termica y/o energfas renovables. Estas diversas fuentes de energfa se gestionan a traves de un sistema comercial de gestion de energfa que utiliza una instalacion de almacenamiento escalable (como un banco de batenas) para almacenar y suministrar energfa.
La temperatura del proceso se controla por dos medios: el calentamiento del agua a traves del suministro de agua de proceso que se produce naturalmente de los sistemas industriales o aguas residuales domesticas y que se regula mediante termostatos o intercambiadores de calor o se gestiona a traves de una unidad de control automatizada de procesos.
Fuentes de luz de baja energia
El proceso emplea una amplia gama de luces de bajo voltaje (tales como LED, asf como otras fuentes unicas de emision de luz) el cual esta alimentado por una combinacion de fuentes de energia estandar y/o renovables, donde las luces estan ajustadas para optimizar el crecimiento de algas sin comprometer el lfpido u otros subproductos comercialmente valiosos.
En las realizaciones preferidas, un conjunto de luces, que emiten luz que abarca longitudes de onda con un angulo preciso de emisiones de haz dentro de las longitudes de onda de radiacion fotosinteticamente activa (PAR) de 400700 nm, esta montado internamente o externamente al FBR. Esto ayuda a estimular las algas para maximizar el crecimiento de la biomasa a una tasa de produccion rentable.
Las algas han sido seleccionadas de un acondicionamiento adaptativo ambiental previo, usando fuentes de luz y longitudes de onda espedficas, agua de proceso, temperatura y control del pH, para producir cepas capaces de crecimiento optimo con insumos energeticos reducidos.
En la presente memoria se describe un proceso nuevo para aumentar la produccion de exopolisacarido (EPS) del alga Dictyosphaerium chlorelloides ALG03 dentro de cualquier sistema fotobiorreactor. Este comprende (a) precultivar para adaptar la cepa a la iluminacion LED ajustada dentro de las longitudes de onda de radiacion
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fotosinteticamente activa (PAR) y a las condiciones de agua de proceso industrial (por ejemplo, agua de proceso secundaria tratada); (b) cultivar la cepa de formacion de EPS dentro de un FBR complementado iluminacion LED PAR (radiacion fotosinteticamente activa) (400-700 nm) ajustada para proporcionar a las algas cada dfa iluminacion continua entre 1 y 24 horas; (c) trasladar despues de la fase exponencial maxima de crecimiento una parte tal como aproximadamente 50 % del rendimiento a un sistema de tanque iluminado estatico con aireacion suave (aire ambiente sin adicion de CO2) para mejorar la formacion de EPS durante 3-4 dfas; (d) deshidratar la pasta de algas para la extraccion del biopolfmero o para otros usos descritos anteriormente o para la produccion de energfa mediante fermentacion con etanol u otros procesos (por ejemplo, digestion anaerobia o gasificacion de biomasa).
Ejemplos de las cepas gelatinosas revestidas de microalgas adecuadas para su uso en el proceso descrito pueden ser del filo Chlorophyta y seleccionadas de la familia Dictyosphaeriaceae.
Cepas de algas adaptadas
La cepa de microalgas utilizada para la produccion de EPS se mantiene en suministros heterogeneos de agua de proceso industrial en cultivos en matraz estandar y se le suministra iluminacion PAR a traves de lmeas de LED con patrones de luz ajustados. La luz se puede suministrar internamente dentro del FBR o externamente. Los cultivos se subcultivan cada mes para seleccionar celulas adaptadas a los constituyentes de las aguas residuales y a la iluminacion LED. Este proceso de seleccion fenotfpica incluye una etapa de evaluacion para comprobar la produccion de EPS en cada subcultivo. Los cultivos madre se mantienen en estas condiciones de crecimiento para continuar el proceso de adaptacion.
Algas que se desarrollan en fotobiorreactores (“FBR”)
Se han hecho muchos intentos para desarrollar FBR de pequena escala para la produccion de microalgas (g). Los FBR de escala comercial (> 100.000 litros) debenan tener una gran capacidad de volumen y tener una pequena superficie ocupada. Ademas, deben tener superficies transparentes, altas tasas de transferencia de masa y deben ser capaces de producir grandes rendimientos de biomasa. Ademas, cualquier diseno de FBR debe tener en cuenta las necesidades unicas de las cepas individuales de microalgas y ser de bajo mantenimiento y robustas.
Se ha sugerido que los FBR tambien pueden actuar como recipientes de cultivo para los sistemas de crecimiento de estanque al aire libre. Dado que los FBR al aire libre son generalmente iluminados naturalmente con luz solar, la productividad de la biomasa dependena de las condiciones ambientales predominantes durante todo el ano en esa localidad. Hay variaciones estacionales en las temperaturas y la luz solar durante todo el ano en la mayona de las regiones que han sido probadas (a menudo ambientes deserticos) por lo que es diffcil llevar a cabo el cultivo al aire libre en masa de algas durante todo el ano en esas regiones. Hay una serie de disenos para FBR del dominio publico, que se venden comercialmente y disenos en artfculos academicos, pero no existe un modelo definitivo de la 'mejor practica’.
En un primer conjunto de realizaciones, cualquier aparato FBR (diseno tubular de elevacion de aire o tanque plano) que tenga un dispositivo para drenar o recoger las celulas diariamente puede ser iluminado durante una parte del dfa o durante las 24 horas del dfa con longitudes de onda de PAR de iluminacion LED (internamente o externamente). El crecimiento de las algas se monitoriza mediante un dispositivo de control de proceso adjunto para medir la DO a 680 nm que esta correlacionado con el numero de celulas mediante un calculo previo y que permite la determinacion del crecimiento exponencial maximo desde la puesta en marcha del FBR. El sistema abarca, pero no se limita a, la inclusion de fuentes de luz LED muy ajustadas que estan disenadas para proporcionar una iluminacion en un angulo de 360 grados desde el centro de un biorreactor para maximizar el crecimiento de diferentes cepas de algas (creciendo alrededor de la fuente de luz).
Cuando se alcanza el maximo de crecimiento exponencial el 50 % de las celulas se cosechan diariamente a un tanque de retencion del lote separado que tiene aireacion (mezcla del aire ambiente) conectada e iluminacion LED 24/7. Las cepas de algas se mantienen en las condiciones prescritas durante 3-4 dfas y las muestras del tanque se monitorizan visualmente en un microscopio diariamente para determinar la produccion de EPS. Estas celulas se extraen finalmente por deshidratacion para la extraccion de hidratos de carbono o para los usos descritos anteriormente.
Fuentes de luz
Los sistemas de cultivo de algas pueden ser iluminados por luz artificial, luz solar o ambos. Uno de los factores mas importantes para controlar la elevada produccion de biomasa de microalgas en el FBR cerrado es la irradiancia lummica y la calidad del espectro de luz suministrado. Si el FBR se coloca al aire libre, se puede limitar a los niveles de luz altos observados durante el dfa y durante los meses de verano, pero esto puede variar geograficamente. Los niveles de luz ultravioleta (“UV”) en la luz solar natural tambien pueden causar la foto-inhibicion de las algas en ciertos momentos del dfa y por lo tanto carece del potencial control del FBR cultivado usando luz artificial.
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Una fuente de luz importante que puede suministrar longitudes de onda de luz espedficas es la gama de los diodos emisores de luz (“LED”) que ahora estan siendo desarrollados por varios fabricantes importantes de luz. Los LED tienen la capacidad de ahorrar energfa y tienen una expectativa de vida util muy larga. Su eficiencia electrica ayuda a minimizar la generacion de calor. Esta alta eficiencia y el espectro agudo han eliminado la necesidad de un sistema de refrigeracion y filtro y por lo tanto se reducen significativamente los requisitos de aporte de energfa. Estos factores amplfan el potencial para optimizar el suministro de luz para cepas espedficas de microalgas (h).
Se sabe que partes del espectro de radiacion fotosinteticamente activa (PAR) (400-700 nm que cubre los extremos rojo y azul del espectro) podnan contribuir a maximizar la fotosmtesis eficiente de las algas en general, pero existen pocos datos (en el dominio publico) sobre interacciones espedficas de tal irradiancia luminosa sobre el crecimiento y estado fisiologico de precursores de biocombustibles (lfpidos/hidratos de carbono) para diferentes cepas de algas cultivadas bajo luz artificial en FBR. Los solicitantes han descubierto los requisitos precisos de LED rojo/azul y los niveles de irradiancia suministrados para una serie de microalgas y para el proceso de doble etapa de produccion de EPS aqrn.
Insumos energeticos 'sostenibles' para sistemas de FBR
El uso potencial de las corrientes de 'residuos', donde los gases de combustion lavados proporcionan CO2 con agua de proceso modificada utilizada como medio nutritivo para el crecimiento de algas, ha sido extensamente debatido en la bibliograffa. Hasta la fecha se han desarrollado algunos proyectos de demostracion significativos o exitosos. Se ha estimado que usando sistemas dbridos, las algas pueden ser usadas para reciclar el 20 % de las emisiones de CO2 en la generacion de energfa industrial. Si se pueden desarrollar fuentes nuevas y baratas de captura de CO2 se reducina el costo y los requisitos de energfa de los FBR.
El proceso de cultivo de algas en el agua de proceso industrial puede reducir los niveles de nutrientes a los niveles potencialmente necesarios establecidos en los estrictos objetivos de la legislacion en diferentes partes del mundo para la eliminacion de agua al medio ambiente y de organismos de gestion de agua particulares.
Los solicitantes han descubierto los niveles optimos de nutrientes requeridos bajo temperatura y niveles de irradiancia lumfnica controlados para el crecimiento rentable de las algas descritas en este documento.
Biomasa de algas y biopolimeros
Los polisacaridos de las algas se utilizan actualmente comercialmente (d). Se sabe que las algas del suelo excretan una variedad de sustancias polimericas extracelulares (EPS) especialmente polisacaridos que pueden desempenar un papel importante para su funcion vital (e). El exopolisacarido (EPS) que forma la cepa de algas tiene la ventaja de que tambien es utilizado en el agua para remediar secuestrando elementos potencialmente toxicos dentro del EPS formado en la etapa discontinua y antes. Hay pruebas claras de que elementos como el cobre pueden unirse a estos compuestos mucilaginosos (i). Esto tiene un valor claro cuando existe el agua limpia para la eliminacion posterior o si su uso es el objetivo principal. En el analisis de hidratos de carbono realizado en la composicion de EPS se observaron 94-95 % de monosacaridos neutros y aproximadamente 5-6 % de acido uronico. Este ultimo es particularmente importante para la union de metales pesados.
Se sabe que las algas del suelo mejoran la formacion del suelo y la retencion de agua, estabilizan el suelo, aumentan la disponibilidad de nutrientes para el crecimiento de las plantas cercanas y reducen la erosion del suelo. Se han introducido como acondicionadores de suelos en muchos pafses y tambien se han sugerido para su uso como biofertilizantes (j).
La disminucion del suministro de agua 'dulce' aumentara la necesidad de utilizar agua reciclada, asf en Israel, se ha utilizado agua secundaria tratada para la produccion de hortalizas y frutas frescas para el mercado utilizando sistemas de riego. Sin embargo, es necesario que las regulaciones en muchos pafses sean modificadas para su uso generalizado incluso con SDI donde el agua tratada no llega a las porciones comestibles del cultivo (sobre la superficie del suelo).
El riego tradicional por goteo se realiza sobre el suelo, pero recientemente numerosas empresas que fabrican sistemas de riego por goteo han inventado e implementado sistemas de riego por goteo en subsuelo (SDI). Las lmeas estan enterradas bajo tierra y tienen una vida mas larga. El riego en el subsuelo permite la aplicacion precisa de agua, nutrientes y otros agroqmmicos directamente a la zona de las rafces de las plantas. Esto permite al agricultor optimizar el ambiente de cultivo y conduce a rendimientos de la cosecha de mayor calidad.
Cuando se gestiona adecuadamente, el SDI es uno de los metodos mas eficaces de regar plantas con eficiencias >90 %. El ahorro en el agua aplicada puede ser de hasta un 50 % en comparacion con otros metodos. Se preve que la cantidad de agua disponible para el riego disminuira en las proximas decadas y que la conservacion del agua sera mas importante. Aqrn es donde SDI es crucial prolongando la vida de los acrnferos. Su uso para cultivos de biocombustibles tiene un gran potencial y se ha demostrado en suelos pobres que el uso de SDI puede duplicar los rendimientos de la cana de azucar y aumentar su contenido de azucar mientras se conserva el 70 % de la necesidad
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de agua.
El exopolisacarido de una cepa adaptada de Dictyosphaerium chlorelloides ALG03 tambien se puede utilizar en fases posteriores para la produccion de bioetanol utilizando los hidratos de carbono extrafdos. Los restantes hidratos de carbono y protemas pueden utilizarse para otros subproductos tales como aditivos alimentarios y piensos.
La invencion se entendera adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Algas pertenecientes a la familia Pleurochloridaceae o cianobacterias del orden Chroococcales de los generos Synechocystis y Synechoccocus fueron preincubadas en agua modificada con nutrientes y condiciones continuas de iluminacion de pAr (dentro de las longitudes de onda de 400-700 nm) durante un penodo de 6 meses y subcultivadas a intervalos regulares. Los cultivos aislados se subcultivaron adicionalmente para llevarlos a una fase de crecimiento exponencial y se usaron en una serie de biorreactores de 50 l. La densidad celular inicial del inoculo de algas fue de l06 celulas por mililitro extrafdo de las algas subcultivadas que se transfirio a un biorreactor de 50 l que contema agua enriquecida con nutrientes y permitio alcanzar una fase de crecimiento exponencial en presencia de condiciones de iluminacion de PAR continuas (longitudes de onda entre 400-700 nm). El proceso se controlo en cuanto a diversos parametros incluyendo; pH (mantenido entre 6-9); temperatura (mantenida entre 20-40 °C); aireacion (0,02 a 1,0 v/v/m - volumen de aire por volumen de ffquido por minuto) y/o CO2, (0 % en la puesta en marcha terminando en al menos 0,7 % en la primera cosecha aunque con el tiempo se puede llegar al 5 % dentro del sistema); O2 mantenido entre 500-800 mV); irradiancia lummica maxima en las primeras celulas en FBR (600 |jmol m-2 s'1), aireacion, CO2 (comenzando con un 0 % de CO2 anadido y aumentando hasta el 0,7 % en la cosecha), densidad celular, temperatura (27 °C promedio) y suministro de luz (24 horas al dfa). Cuando casi se hubo alcanzado el crecimiento exponencial maximo, se extrajeron de los reactores 500 g de producto de biomasa de algas humedas. Se anadio una mezcla disolvente que contema metanol/cloruro de acetilo/hexano produciendo esteres mefflicos de los acidos lipfdicos nativos. Los esteres mefflicos se separaron por cromatograffa usando hexano y solucion de acetona y posteriormente se evaporaron para obtener 1,6 g de acido eicosapentaenoico. La cromatograffa tambien proporciono muestras puras de acido miffstico, acido palmftico, acido behenico, acido laurico, acido linoleico, acido alfa-linolenico y acido estearico y similares.
Ejemplo 2
Se secaron 50,08 g de biomasa durante 6 horas a 105 °C. Despues de enfriar en un secador, la muestra se coloco durante 1 hora en un horno a 105 °C y se peso de nuevo. En un dispositivo de extraccion Soxhlet la biomasa seca se extrajo en 260 ml de eter de petroleo durante 8 horas en una capsula de extraccion. Despues de la evaporacion del disolvente en un evaporador de rotacion con vado, la muestra se seco adicionalmente haciendo pasar una corriente fina de nitrogeno sobre la muestra y se peso de nuevo despues de enfriar. Para obtener los ffpidos, la muestra se disolvio en 50 ml de hexano y se dividio por la mitad. Se anadieron diez gramos de carbon activado a la primera muestra y la solucion se filtro y volvio a evaporarse y se hizo fluir con nitrogeno y se peso. Todavfa habfa algo de color presente, por lo que para la segunda muestra se uso 20 g de carbon activado.
Las muestras se analizaron utilizando un Agilent Technologies 6890N y una columna HP 88, cianopropilo - Longitud: 100 m - diam: 0,25 mm, ancho de la capa: 0,20 jm.
Tabla 1 - Los resultados de los analisis de los porcentajes de 3 acidos grasos unidos por su ruta metabolica de 3
diferentes ciclos de FBR por lotes
Acido graso
Porcentaje de acido graso ME en el grupo de ffpidos totales de Chlorogibba allorgei
Aproximacion al final de la fase de crecimiento log Estres parcial despues del crecimiento log (Dfa 1 post-cosecha) Despues del estres total (Dfa 3 - fase estacionaria)
Acido Y-linolenico (GLA)
18,0 11,0 0,7
Acido araquidonico (ARA)
2,4 3,7 0,0
Acido eicosapentaenoico (EPA)_________________
20,0 23,5 27,0
Los resultados indican claramente el cambio de GLA a EPA a traves de ARA a medida que la cepa de algas crece y luego es inducida a entrar en la fase estacionaria post esffmulo como se ha descrito anteriormente. Esto es senal de que el proceso descrito en la presente memoria esta controlado directamente por las vfas metabolicas percibidas que permiten la interconversion entre el acido Y-linolenico y el acido eicosapentaenoico a traves del acido araquidonico en microalgas de agua dulce (I).
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Ejemplo 3
Dictyosphaerium chlorelloides (ALG03) se cultivo durante 4 dfas en Medio Basico Basal. La Figura 5a muestra que el alga necesita niveles relativamente bajos de nutrientes para un crecimiento optimo a 27 °C bajo irradiancia optima de la luz. La Figura 5b muestra que el alga crece mejor con luz menos intensa durante 7 dfas en un medio BB al 25 % a 27 °C.
Durante un proceso de produccion continuo, Dictyosphaerium chlorelloides (ALG03) se cosecho diariamente. La Figura 7, con la biomasa mostrada como lecturas de densidad optica (680nm) en FBR, muestra que la recoleccion diaria a tasas del 50 % permite un nuevo crecimiento de la misma biomasa de Dictyosphaerium chlorelloides (ALG03) en el plazo de 24 horas cuando se rellena con nuevo medio de crecimiento.
Se cultivaron celulas fisiologicamente adecuadas durante 6 meses en aguas residuales de una planta municipal (tratamiento secundario) y se volvieron a cultivar cada 4 semanas en nuevas aguas residuales. Las celulas no adaptadas se cultivaron en medio de crecimiento ZBB estandar y se volvieron a cultivar cada 4 semanas en medio ZBB nuevo. A continuacion, se cultivaron ambas cepas durante 9 dfas (hasta la fase estacionaria) en nuevas aguas residuales. Los resultados (Figura 8) muestran una clara adaptacion al ambiente de las aguas residuales y la iluminacion por LED mediante celulas pre-adaptadas. La Figura 9 muestra la duplicacion de la produccion de EPS despues del proceso de FBR de 2 etapas.
Las etapas subsiguientes del metodo incluyeron purificacion, aislamiento del EPS e hidrolisis de la muestra usando HCl metanolico seguido por acido trifluoroacetico.
Los exopolisacaridos comprenden 94-95 % de monosacaridos neutros con 5-6 % de acido uronico. Algunos monosacaridos neutros estan parcialmente metilados. Los azucares predominantes fueron:
galactosa (~ 20-21 %)
glucosa (~ 20-21 %)
hexosa no identificada (~ 12-13 %)
ramnosa (~ 12 %)
hexosa metilada no identificada (~ 9-10 %) hexosa metilada no identificada (~ 7-8 %) manosa (~ 6-7 %) xilosa (~ 3-4 %) arabinosa (~ 1-2 %)
monosacarido desconocido (~ hasta 0,5 %) monosacarido desconocido (~ 0,5-1,0 %) acidos uronicos (~ 5-6 %).
La relacion molar entre azucares en gel seco y muestras liofilizadas de EPS hidrolizado se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Relacion molar de azucares (%)
F1 F2
Fucosa
2,73 0,81
Ramnosa
10,20 15,54
Arabinosa
5,34 8,28
Galactosa
9,83 15,10
Glucosa
65,31 51,12
Manosa
4,32 6,86
Xilosa
2,27 2,29
Ejemplo 4
Los resultados del uso de riego por goteo para cultivar puerros en un suelo arenoso infertil en un ensayo de invernadero durante un penodo de 12 semanas se pueden ver en la imagen de la Figura 11. De izquierda a derecha: Control sin algas; simbionte fungico micornzico (mezcla de Glomus spp.) utilizados en la siembra; algas usadas semanalmente; algas y simbionte fungico micornzico. Los resultados muestran claramente un efecto promotor del crecimiento de las celulas de Dictyosphaerium chlorelloides ALG03 anadidas dos veces por semana sobre el crecimiento y la nutricion de un puerro. Se observo un efecto sinergico del uso de las celulas de algas con una mezcla de simbionte fungico micornzico adaptado.
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La presente invencion no debe estar limitada en su alcance por las realizaciones espedficas descritas en la presente memoria, sino que esta definida en su sentido mas amplio por las reivindicaciones adjuntas. De hecho, varias modificaciones de la invencion ademas de las descritas en la presente memoria resultaran evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripcion anterior y de las figuras adjuntas. Ademas, todos los aspectos y realizaciones de la invencion descritos en la presente memoria se consideran ampliamente aplicables y combinables con cualquiera y todas las demas realizaciones consistentes, incluyendo las tomadas de otros aspectos de la invencion (incluyendo aisladamente) segun sea apropiado.
Referencias
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b. Olaizola M - 2005 Microalgal removal of CO2 from flue gases: Changes in medium pH and flue gas composition do not appear to affect the photochemical yield of microalgal cultures. The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering 8: 60-367.
c. Braun AR - 1996 Reuse and Fixation of CO2 in Chemistry, Algal Biomass and Fuel Substitutions in the Traffic Sector. Energy Convers Manage., 37:1229-1234.
d. Bitton R & Bianco-Peled H - 2008 Novel Biomimetic Adhesives Based on Algae Glue. Macromolecular Bioscience 8:393-400.
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Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para el aumento de la produccion de (a) acido eicosapentaenoico en microalgas seleccionadas de la familia Pleurochloridaceae o (b) exopolisacarido en microalgas de la especie Dictyosphaerium chlorelloides, comprendiendo dicho proceso las etapas de:
    (i) cultivar una cepa de microalgas seleccionada de la familia Pleurochloridaceae o de la especie Dictyosphaerium chlorelloides mediante una fase de produccion;
    (ii) exponer el cultivo de microalgas a un estimulo, donde el estimulo comprende (a) una disminucion del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 6, seguido de un aumento del pH hasta un pH no inferior a aproximadamente pH 7 y (b) un aumento de la irradiancia lummica hasta al menos 400 |jmol/m2/seg.
  2. 2. El proceso de la reivindicacion 1, donde el estimulo comprende una disminucion del pH desde un pH entre aproximadamente pH 7 y pH 9 hasta un pH de entre aproximadamente pH 5 y pH 6.
  3. 3. El proceso de la reivindicacion 1 o 2, donde el estimulo comprende un aumento de la irradiancia suministrada por LED entre aproximadamente 50-200 |jmol/m2/seg y entre aproximadamente 400-2.000 |jmol/m2/seg.
  4. 4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la fase de produccion corresponde a la fase exponencial de crecimiento y/o implica el crecimiento de la cepa de microalgas en condiciones que permiten un crecimiento exponencial.
  5. 5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la fase de produccion implica el crecimiento de la cepa de microalgas en un fotobiorreactor y/o implica el crecimiento de microalgas en presencia de LED que emiten 2 picos de luz roja y azul dentro del espectro de PAR de 400-700 nm y/o los cultivos no estan expuestos a la luz solar natural.
  6. 6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el cultivo de microalgas se expone al estfmulo en el pico de crecimiento de la fase exponencial y/o al inicio de la fase estacionaria de crecimiento.
  7. 7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el estfmulo comprende adicionalmente la adicion de una fuente de carbono.
  8. 8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la disminucion del pH se inicia mediante la adicion de CO2.
  9. 9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el pH se reduce hasta un pH de entre aproximadamente pH 5 y pH 6 durante un periodo de entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 2 horas y dicho penodo precede al aumento de la irradiancia lummica, opcionalmente donde despues de la disminucion del pH, el pH se incrementa hasta un pH de entre aproximadamente 7 y 9.
  10. 10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde despues de la exposicion de las microalgas al estimuio, las microalgas se cultivan durante un penodo adicional de aproximadamente 48 horas antes de la cosecha del metabolito.
  11. 11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, donde la cepa de microalgas se selecciona entre las especies: Trachydiscus sp. y Chlorogibba sp., o la cepa de microalgas es una cepa de Chlorogibba allorgei depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 817/1 o una cepa mutante derivada de la misma o la cepa de microalgas es una cepa de Dictyosphaerium chlorelloides depositada en la Coleccion de Cultivos de Algas y Protozoos con el numero de acceso CCAP 222/98 o una cepa mutante derivada de la misma.
  12. 12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el proceso comprende la etapa adicional de cosechar el acido eicosapentaenoico o exopolisacarido despues de un penodo adicional de crecimiento despues de que el cultivo ha sido expuesto al estfmulo.
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