ES2621324T3

ES2621324T3 - Equivalentes de piel secos e irradiados listos para su uso

Info

Publication number: ES2621324T3
Application number: ES09825325.5T
Authority: ES
Inventors: Allen R. Comer; B. Lynn Allen-Hoffmann; Barry Steiglitz
Original assignee: Stratatech Corp
Current assignee: Stratatech Corp
Priority date: 2008-11-04
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2017-07-03
Anticipated expiration: 2029-11-04
Also published as: EP2352472A4; US20150196686A1; CN102271634A; US20100119615A1; AU2009313656B2; CA2742595C; JP5632383B2; US8992997B2; US20170087276A1; US8685463B2; US20140067064A1; JP2012508064A; EP2352472A1; CN102271634B; CA2742595A1; EP2352472B1; US9526811B2; AU2009313656A1; JP2014221417A; US8580314B2

Abstract

Un método para conservar un equivalente de piel cultivado organotípicamente para su uso como un vendaje de heridas que comprende: proporcionar dicho equivalente de piel cultivado organotípicamente que comprende células NIKS y un envase; tratar dicho equivalente de piel con radiación a una dosis de 5 kGy a 25 kGy de radiación gamma y secarlo para eliminar la viabilidad celular en el equivalente de piel; y envasar dicho equivalente de piel para proporcionar un equivalente de piel envasado.

Description

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Equivalentes de piel secos e irradiados listos para su uso Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a sistemas y metodos para el almacenamiento a largo plazo de equivalentes de piel refrigerados o a temperature ambiente fabricados por cultivo organotipico.

Antecedentes

El campo emergente de la ingeniena de tejidos (IT) esta posicionado para producir un progreso enorme en el tratamiento de enfermedades y disfunciones de organos en la proxima decada. En 2001, hada 23 agentes terapeuticos aprobados para su comercializacion en los Estados Unidos (EE. UU.) y Europa, de los cuales nueve eran sustitutos o injertos de piel, y 100 productos mas estaban en desarrollo. (De Bree, Genomics-based Drug Data Report and Regenerative Therapy (1) 2:77-96 (2001)). En 2007, casi 100 compares estaban en implicadas en el desarrollo de tejidos creados por ingeniena, agentes terapeuticos basados en celulas, o tecnologfas relacionadas (Applied Data Research, Febrero 2007). La industria en total tuvo una tasa de crecimiento anual de un 16% desde 1995-2001. El segmento de la industria “estructural” (por ejemplo, piel, hueso, cartflago) presento un 85% de crecimiento desde 1998-2001. En 2004, el mercado en EE. uU. de remplazos/sustitutos de piel con tejidos creados por ingeniena y los moduladores activos de reparacion de heridas se valoro en aproximadamente 195 millones de $. Se espera que las ventas crezcan a una tasa anual compuesta del 9,5%, alcanzando aproximadamente 481 millones de $ en el ano 2014 (MedTech Insight, Windhover Information, Septiembre 2005). El mercado total de EE. UU. de tecnologfas avanzadas para tratar las heridas tema un valor de mas de 2,3 billones de $ en 2005. Se ha proyectado que crecera con una tasa media de crecimiento anual del 12,3% durante un periodo de cinco anos alcanzando los 4,6 billones de $ en 2011 (BCC Research, PHM011E, Enero 2007). El mercado global del tratamiento de heridas se estima que tendra un valor de 7,2 billones de $ estadounidenses en 2006 y comprende dos sectores, el tradicional y el avanzado (Espicom Business Intelligence, 2007). Los productos tradicionales para el tratamiento de heridas consisten principalmente en vendajes basados en gasa de baja tecnologfa tales como esponjas de tejido o sin tejido, vendajes de conformacion y vendajes no adherentes. El segmento de tratamiento avanzado de heridas (4,1 billones de $ estadounidenses en global) es el area de crecimiento mas rapido con un crecimiento de dos dfgitos del 10% por ano (Espicom Business Intelligence, 2007).

Aunque existe una multitud de aplicaciones revolucionarias y economicamente importantes para los tejidos y organos creados por ingeniena en el area de salud humana, el potencial economico completo de la industria esta lejos de conseguirse. En este momento, solo una de las compares de ingeniena de tejidos que cotizan en bolsa en todo el mundo, presenta beneficios a pesar de que la inversion global en estas tecnologfas excede los 3,5 billones de $ (Lysaghty Reyes, Tissue Engineering 7(5):485-93 (2001)).

Una barrera principal para la aceptacion de tejidos creados por ingeniena por parte de los facultativos medicos, proveedores de la salud y aseguradoras de salud es la falta de medios para conservar y almacenar eficaz y eficientemente los tejidos creados por ingeniena. La naturaleza de los productos de celulas y tejidos vivos hace que el almacenamiento a largo plazo sea impracticable. Los tejidos creados por ingeniena actuales a menudo se deben almacenar y transportar en condiciones controladas cuidadosamente para mantener la viabilidad y la funcion. Normalmente los productos tisulares creados por ingeniena necesitan semanas o meses para producirse pero se tienen que utilizar en horas o dfas tras la fabricacion. Como resultado, las compares de IT tienen que operar con sus instalaciones de produccion a maxima capacidad y absorber los costes del producto que no se vende que se tiene que desechar. Estas perdidas de inventario, ademas del ya costoso proceso de fabricacion, han forzado que los precios alcancen niveles que no son practicos. A modo de ejemplo espedfico, el APLIGRAF necesita aproximadamente cuatro semanas para fabricarse, se puede utilizar solamente en diez dfas, y se tiene que mantener entre 20 y 23 °C hasta su uso. En otro ejemplo, el EPICEL es transportado por una enfermera desde las instalaciones de produccion de Genzyme Biosurgery en Cambridge, MA hasta el punto de uso en una incubadora portatil y se utiliza inmediatamente al llegar. Dichos inconvenientes representan desaffos significativos para el desarrollo de productos convenientes y baratos.

Se ha explorado la crioconservacion como una solucion al problema de almacenamiento, pero se sabe que induce danos tisulares por la formacion de hielo, lesiones por fno, y desequilibrio osmotico. Junto con el APLIGRAF, el otro unico equivalente de piel vivo aprobado, el ORCEL, actualmente en ensayos clmicos es un producto congelado que tiene el inconveniente de que se tiene que mantener a temperaturas por debajo de -100 °C antes de su uso. Esto necesita condiciones especializadas de suministro y almacenamiento del producto, que incluye el uso de materiales peligrosos durante el transporte, y el uso de nitrogeno lfquido en el almacenamiento, que es caro, peligroso y no disponible facilmente en clmicas rurales y hospitales de campo. Ademas, el suministro de un producto congelado necesita un entrenamiento especial por parte del usuario final para descongelar satisfactoriamente el tejido antes de su uso.

El documento WO 2004/110372 A2 desvela composiciones y metodos para congelar y/o secar organos para su

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almacenamiento antes de su uso. Las composiciones y metodos desvelados en este documento utilizan celulas modificadas geneticamente que son viables tras la descongelacion y/o rehidratacion y que forman organos.

El documento WO 2005/012492 A2 desvela composiciones para cerrar heridas y metodos para producirlas. Las celulas que se utilizan en las composiciones de este documento expresan polipeptidos exogenos tales como polipeptidos antimicrobianos.

En consecuencia, lo que se necesita en la tecnica son metodos mejorados para preparar tejidos y celulas creados por ingeniena para su almacenamiento en condiciones que esten disponibles de manera rutinaria en el punto de uso. Como todas las instalaciones clmicas tienen un almacen refrigerado, el desarrollo de un equivalente de piel que se pueda almacenar durante periodos prolongados en un refrigerador convencional mejorana enormemente la disponibilidad y utilidad clmica de estos productos. El desarrollo de un equivalente de piel que se pueda almacenar durante periodos prolongados a temperatura ambiente aumentana adicionalmente la disponibilidad de dichos productos para su uso inmediato en el campo de batalla o en una variedad de situaciones de respuesta inmediata.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere en general a sistemas y metodos para el almacenamiento a largo plazo de equivalentes de piel a temperatura de refrigeracion o ambiente producidos por un cultivo organotfpico. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos para conservar un equivalente de piel cultivado organotfpicamente para su uso como un vendaje de heridas como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, que comprende: proporcionar dicho equivalente de piel cultivado organotfpicamente que comprende celulas NIKS y un envase; tratar dicho equivalente de piel para dar lugar a celulas no viables en el equivalente de piel; y envasar dicho equivalente de piel para proporcionar un equivalente de piel envasado. La presente invencion no se limita a un metodo para tratar el equivalente de piel para que de lugar a que las celulas que constituyen el equivalente de piel sean no viables. En algunas realizaciones, la etapa de tratamiento comprende la irradiacion de dicho equivalente de piel envasado de manera que dicho equivalente de piel sea esteril y no viable. En algunas realizaciones, la radiacion se lleva a cabo con radiacion gamma. En algunas realizaciones, la etapa de tratamiento comprende el secado de dicho equivalente de piel en condiciones tales que las celulas de dicho equivalente de piel se conviertan en no viables. La presente invencion no se limita a cualquier metodo particular de secado. En algunas realizaciones, el secado se lleva a cabo por un metodo que se selecciona de entre el grupo que consiste en secado al vacfo y secado por congelacion. La presente invencion no se limita a un orden particular de etapas, a menos de que se indique otra cosa. En algunas realizaciones, el tratamiento se aplica antes del envasado. En algunas realizaciones el tratamiento se aplica tras el envasado. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende el secado de dicho equivalente de piel en condiciones en las que dichas celulas producen que dicho equivalente de piel se convierta en no viable e irradiando dicho equivalente de piel en condiciones en las que dicho equivalente de piel se convierte en esteril. En algunas realizaciones, la etapa de secado se produce antes de dicho envasado y dicha etapa de radiacion se produce despues de dicha etapa de envasado.

La presente invencion no esta limitada al uso de un equivalente de piel en particular que comprenda celulas NIKS. El equivalente de piel cultivado organotfpicamente comprende celulas NIKS. En algunas realizaciones, las celulas NIKS comprenden una secuencia de acido nucleico exogeno que codifica un polipeptido exogeno. En algunas realizaciones, se expresan mas de un polipeptido exogeno por las celulas que producen este equivalente de piel. La presente invencion no esta limitada al uso de un polipeptido exogeno en particular. En algunas realizaciones, el polipeptido exogeno es un polipeptido antimicrobiano. En algunas realizaciones, el polipeptido exogeno se selecciona de entre el grupo que consiste en beta-defensina 1 humana, beta -defensina 2 humana, beta-defensina 3 humana, y catelicidina. En algunas realizaciones, el polipeptido antimicrobiano se proporciona en el equivalente de piel en una cantidad de desde 1 a 1000 ng de polipeptido antimicrobiano por mililitro de una solucion de extraccion superficial. En Algunas realizaciones preferidas, el polipeptido antimicrobiano se proporciona en el equivalente de piel en una cantidad de desde 1 a 1000 ng de polipeptido de un polipeptido antimicrobiano de solucion de extraccion superficial. En algunas realizaciones, el equivalente de piel se seca hasta un peso final de menos del 75%, 50%, 25% o preferentemente del 15% del equivalente de piel humedo o no secado. En algunas realizaciones, el equivalente de piel, tras la rehidratacion, tiene un valor de DPM inicial de desde aproximadamente 20 DPM a aproximadamente 300 DPM, preferentemente desde aproximadamente 70 a aproximadamente 140 DPM, y un valor de cambio de DPM de desde aproximadamente 5 DPM a aproximadamente 400 DPM, preferentemente desde aproximadamente 10 DPM a aproximadamente 220 DPM. En algunas realizaciones, el equivalente de piel, tras la rehidratacion, tiene una fuerza de tension de desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 MPa, preferentemente desde aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,8 MPa. En algunas realizaciones, el envase se puede sellarse por calor.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un equivalente de piel humana envasado producido por los metodos anteriores. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un equivalente de piel humana esteril envasado que se produce por los metodos anteriores.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona composiciones que comprenden un equivalente de piel humana in vitro, no viable, aislado que comprende celulas NIKS. En algunas realizaciones, el equivalente de piel

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esta envasado. En algunas realizaciones, el equivalente de piel es esteril. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel esteriles estan irradiados. En algunas realizaciones el equivalente de piel esta seco. En algunas realizaciones, el equivalente de piel tiene un peso de menos del 50% del peso de un equivalente de piel humedo. El equivalente de piel comprende celulas NIKS. En algunas realizaciones, las celulas NIKS comprenden una secuencia de acido nucleico exogena que codifica un polipeptido exogeno. En algunas realizaciones, se expresa mas de un polipeptido exogeno por las celulas que producen el equivalente de piel. La presente invencion no se limita al uso un polipeptido exogeno en particular. En algunas realizaciones, el polipeptido exogeno es un polipeptido antimicrobiano. En algunas realizaciones, el polipeptido antimicrobiano se selecciona de entre el grupo que consiste en beta- defensina 1 humana, beta-defensina 2 humana, beta-defensina 3 humana y catelicidina. En algunas realizaciones, el polipeptido antimicrobiano se proporciona por el equivalente de piel en una cantidad de desde 1 a 1000 ng de polipeptido antimicrobiano por mililitro de una solucion de extraccion superficial, en algunas realizaciones preferidas, el polipeptido antimicrobiano se proporciona por el equivalente de piel en una cantidad de desde 1 a 1000 ng de polipeptido antimicrobiano por mililitro de una solucion de extraccion superficial. En algunas realizaciones, el equivalente de piel se seca hasta un peso final de menos del 75%, 50%, 25% o preferentemente del 15% del de un equivalente de piel humedo o no secado. En algunas realizaciones, el equivalente de piel, tras la rehidratacion, tiene un valor de DPM inicial de desde aproximadamente 20 DPM a aproximadamente 300 DPM, preferentemente desde aproximadamente 70 a aproximadamente 140 DPM, y un valor de cambio de DPM de desde aproximadamente 5 DPM a aproximadamente 400 DPM, preferentemente desde aproximadamente 10 DPM a aproximadamente 220 DPM. En algunas realizaciones, el equivalente de piel, tras la rehidratacion, tiene una fuerza de tension de desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5,0 MPa, preferentemente desde aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,8 MPa.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos para tratar un sujeto que comprende la provision de una composicion de equivalente de piel como se ha descrito anteriormente y aplicando dicho equivalente de piel en una herida en condiciones en las que dicho equivalente de piel se pone en contacto con dicha herida. En algunas realizaciones, el equivalente de piel se aplica en dicha herida temporalmente.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona kits que comprenden un envase que contiene la composicion de equivalente de piel que se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, el equivalente de piel tiene una vida en almacen de aproximadamente un mes a aproximadamente seis meses.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona composiciones que comprenden un equivalente de piel cultivado organotipicamente in vitro, aislado, no viable que tiene un peso de menos del 50% del peso de un equivalente de piel humedo. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden al menos un polipeptido antimicrobiano expresado por celulas que integran dicho equivalente de piel.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona el uso de las composiciones anteriores para tratar un sujeto. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona el uso de las composiciones anteriores para tratar una herida en un sujeto.

Descripcion de las figuras

Figura 1. Viabilidad de los tejidos tras la radiacion. Se irradiaron los tejidos 9F1 y 2D2, y se recolectaron biopsias con un troquel a los 3, 7, o 14 dfas tras la radiacion y se analizaron en cuanto a su viabilidad utilizando un ensayo MTT. Los datos representan las medias +/- la desviacion estandar medidas en al menos tres muestras de biopsia independientes en cada grupo de tratamiento.

Figura 2. Ensayo de viabilidad/migracion de queratinocitos (A). Se valoraron los explantes que no mostraban crecimiento de queratinocitos como negativos en cuanto a queratinocitos viables. (B) Las muestras en las que los queratinocitos migraban alrededor del extremo de la dermis se valoraron como positivas en cuanto a queratinocitos viables.

Figura 3. Ensayo de crecimiento de fibroblastos. Se trataron con colagenasa las biopsias de tejidos 9F1 de control y radiados, y se cultivaron las celulas aisladas durante 6 dfas antes de la tincion con un 1% de azul de metileno para visualizar las colonias de celulas.

Figura 4. Protema liberada por tejidos 2D2 y 9F1 radiados. Los tejidos sustitutos de piel humana se irradiaron a una dosis de 0, 1, o 5 kGy. Se extrajeron las protemas en agua a partir de biopsias con troquel recolectadas a los 3 dfas tras la radiacion y se cuantificaron por el ensayo BCA. Los datos representan los valores medios +/- la desviacion estandar de cuatro mediciones.

Figura 5. Actividad antimicrobiana de tejidos 2D2 radiados. Se incubaron las biopsias con troquel obtenidas de tejidos 2D2 no radiados y radiados durante los tiempos indicados en medios de cultivo libres de suero. La actividad antimicrobiana del material extrafdo de estos tejidos se determino por recuento de UFC y se normalizo frente a los cultivos bacterianos de control. Cada punto de datos representa los valores medios que se obtienen de dos muestras independientes.

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Figura 6. Actividad antimicrobiana de tejidos 9F1 radiados. Se incubaron las biopsias con troquel obtenidas de tejidos 9F1 no radiados y radiados durante 4 h en un medio de cultivo libre de suero. La actividad antimicrobiana de estos tejidos se determino por recuento de las UFC y se normalizaron frente a cultivos bacterianos de control, cuyo valor se fijo en 1. Cada punto de datos representa los valores medios +/- la desviacion estandar de cuatro muestras de biopsia de los tejidos en el grupo de tratamiento indicado.

Figura 7. Actividad antimicrobiana de tejidos 2D2 radiados. Se incubaron las biopsias con troquel obtenidas de tejidos 2D2 no radiados y radiados durante 4 h en un medio de cultivo libre de suero. La actividad antimicrobiana de estos tejidos se determino por recuento de las UFC y se normalizaron frente a cultivos bacterianos de control, cuyo valor se fijo en 1. Cada punto de datos representa los valores medios +/- la desviacion estandar de cuatro muestras de biopsia de los tejidos en el grupo de tratamiento indicado.

Figura 8. Protema liberada total de tejidos equivalentes de piel almacenados en geles nutritivos o en gasa no adherente. Los tejidos equivalentes de piel humana se irradiaron y se recolectaron biopsias con troquel tras 14 dfas y se incubaron en 0,2 ml de agua esteril a 37 °C durante 24 h. La protema extrafda se cuantifico por un ensayo BCA. Los datos representan valores medios +/- la desviacion estandar de cuatro mediciones.

Figura 9. Analisis histologico de los equivalente de piel creados por ingeniana radiados secados por congelacion. Los equivalentes de piel recientes se compararon con equivalentes de piel que se habfan secado por congelacion, o secados por congelacion y radiados con un nivel de dosis de 1 kGy, 5 kGy, o 25 kGy. Las secciones de tejido se tineron con hematoxilina/eosina y se fotografiaron con una magnificacion de 400x. Barra de escala = 200 pm.

Figura 10. Analisis histologico de equivalentes de piel creados por ingeniena irradiados secados al vado. Equivalente de piel recientes se compararon con equivalentes de piel que se habfan secado al vado o secado al vado y radiados con un nivel de dosis de 1 kGy, 5 kGy, o 24 kGy. Las secciones de tejido se tineron con hematoxilina/eosina y se fotografiaron con una magnificacion de 400x. Barra de escala = 200 pm.

Figura 11. Viabilidad de equivalentes de piel irradiados secados al vado y secados por congelacion. Los colores de las barras representan (de izquierda a derecha): negro = 0 kGy (no radiado); gris oscuro = 1 kGy; gris claro = 5 kGy; blanco = 25 kGy. Los puntos de datos representan la media +/- desviacion estandar (n = 4-8), normalizados con tejido equivalente de piel no radiado recien preparado.

Figura 12. Funcion de barrera epidermica de equivalentes de piel radiados secos. Panel de la Izquierda. El cambio de la capacitancia electrica de la superficie tisular se midio durante intervalos de 10 segundos para los tejidos de piel creados por ingeniena, secados por congelacion o secados al vado, radiados a 1 kGy, 5 kGy, o 25 kGy. Los valores representan la media +/- la desviacion estandar de dos mediciones de cada uno de los dos tejidos independientes. Panel de la derecha. Se exponen los valores de DPM inicial para los tejidos secados por congelacion o secados al vado, radiados a 1 kGy, 5 kGy, o 25 kGy. Los colores de las barras representan (de izquierda a derecha): negro = 0 kGy (no radiado); gris oscuro = 1 kGy; gris claro = 5 kGy; blanco = 25 kGy. Los valores representan la media +/- la desviacion estandar de dos mediciones de cada uno de los dos tejidos independientes.

Figura 13. Propiedades mecanicas de tejidos de piel creados por ingeniena, secados y radiados. Los colores de las barras representan (de izquierda a derecha): negro = 0 kGy (no radiado); gris oscuro = 1 kGy; gris claro = 5 kGy; blanco = 25 kGy. Los datos son la media ± std. n = 2-4.

Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “equivalente de piel”, “equivalente de piel humana”, “sustituto de piel humana”, y “cultivos organotipicos” se utilizan de manera intercambiable para hacer referencia a un cultivo derivado in vitro de queratinocitos que se han estratificado en un epitelio escamoso. Normalmente, los equivalentes de piel se producen por cultivo organotfpico e incluyen una capa dermica junto con una capa de queratinocitos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “equivalente de piel humedo” se refiere a un equivalente de piel en cultivo organotfpico o retirado inmediatamente de un cultivo organotfpico.

Como se utiliza en el presente documento, “no viable” se refiere a celulas que no estan vivas como se determina por un ensayo tal como un ensayo MTT.

Como se utiliza en el presente documento el termino “esteril” se refiere a un equivalente de piel que esta esencialmente o completamente libre de contaminacion microbiana o fungica.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “secado” se refiere a una composicion de la que se ha extrafdo la humedad. Un “equivalente de piel secado” es un equivalente de piel al que se ha extrafdo la humedad de forma

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que el equivalente de piel secado tiene un contenido de humedad menor que un equivalente de piel humedo, o retirado inmediatamente de un cultivo organotipico. La comparacion de la peso del equivalente de piel secado con respecto al equivalente de piel humedo se utiliza como una medida de la extension del secado y refleja la cantidad de humedad extrafda del equivalente de piel durante el procedimiento de secado.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “celulas NIKS” se refiere a celulas que tienen las caractensticas de las celulas depositadas como la lmea celular ATCC CRL-1219.

El termino “homologfa” se refiere a un grado de complementariedad. Puede ser una homologfa parcial o una homologfa completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es la que al menos inhibe parcialmente una secuencia completamente complementaria de la hibridacion con un acido nucleico diana y a la que se hace referencia utilizando el termino funcional “sustancialmente homologa”. La expresion “inhibicion de la union”, cuando se utiliza en referencia a la union de acidos nucleicos, se refiere a la inhibicion de la union producida por la competicion de secuencias homologas por la union con una secuencia diana. La inhibicion de la hibridacion de la secuencia completamente complementaria a la secuencia diana se puede examinar utilizando un ensayo de hibridacion (transferencia de Southern o Northern, hibridacion en solucion, y similares) en condiciones de baja rigurosidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que permitan las uniones no espedficas; las condiciones de baja rigurosidad necesitan que la union de las dos secuencias entre ellas sea una interaccion espedfica (es decir, selectiva). La ausencia de union no espedfica se puede ensayar utilizando una segunda diana que carezca incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30% de identidad); en ausencia de union no espedfica, la sonda no se hibridara a la segunda diana no complementaria.

El termino “gen” se refiere a una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende las secuencias codificantes necesarias para la produccion de un polipeptido o precursor (por ejemplo, KGF-2). El polipeptido puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por una parte de la secuencia codificante siempre que se mantengan la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimatica, union al ligando, transduccion de la senal, etc.) del de longitud completa o fragmento. El termino tambien engloba la region codificante de un gen estructural y las secuencias que lo incluyen localizadas adyacentes a la region codificante tanto hacia el extremo 5' como 3' en una distancia de aproximadamente 1 kb hacia cada extremo de manera que el gen se corresponde con la longitud del ARNm de longitud completa. Se hace referencia a las secuencias que se localizan 5' de la region codificante y que estan presentes en el ARNm como secuencias 5' no traducidas. Se hace referencia a las secuencias que se localizan 3' de la region codificante y que estan presentes en el ARNm como secuencias 3' no traducidas. El termino “gen” engloba tanto el ADNc como las formas genomicas de un gen. Una forma genomica o clon de un gen contiene la region codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominados “intrones” o “regiones de intervencion” o “secuencias de intervencion”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en el ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como amplificadores. Los intrones se retiran o “se cortan” de la transcripcion nuclear o primaria; los intrones por lo tanto estan ausentes en la transcripcion en ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traduccion para especificar la secuencia o el orden de aminoacidos en un polipeptido emergente.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “molecula de acido nucleico codificante”, “secuencia codificante de ADN” y “ADN codificante” se refiere al orden o secuencia de desoxirribonucleotidos a lo largo de una cadena de acido desoxirribonucleico. El orden de esos desoxirribonucleotidos determina el orden de aminoacidos a lo largo de la cadena polipeptfdica (protema). La secuencia de ADN codifica por lo tanto la secuencia de aminoacidos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “molecula de ADN recombinante” se refiere a una molecula de ADN que esta compuesto por segmentos de ADN que se unen juntos por medio de tecnicas biologicas moleculares.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “purificado” o “purificar” se refiere a la retirada de contaminantes de una muestra.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “vector” se utiliza en referencia a moleculas de acido nucleico que transfieren segmentos de ADN de una celula a otra. El termino “vetuculo” se utiliza a veces de manera intercambiable con “vector”.

La expresion “vector de expresion” como se utiliza en el presente documento se refiere a una molecula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de acido nucleico apropiadas para la expresion de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huesped particular. Las secuencias de acido nucleico necesarias para la expresion en procariotas habitualmente incluyen un promotor, un operador (opcional), y un sitio de union al ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las celulas eucariotas utilizan promotores, amplificadores, y senales de terminacion y poliadenilacion.

“Unidos operativamente” se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes descritos se relacionan

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permitiendoles funcionar de la manera que se pretende. Una secuencia reguladora esta “unida operativamente” a una secuencia codificante cuando se unen de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

El termino “transfeccion” como se utiliza en el presente documento, se refiere a la introduccion de un ADN ajeno en celulas eucariotas. La transfeccion se puede conseguir por una variedad de medios que se conocen en la tecnica incluyendo la co-precipitacion de fosfato de calcio-ADN, fusion de liposomas, lipofeccion, fusion de protoplastos, infeccion retrovrnca, y biolfstica.

La expresion “transfeccion estable” o “transfectado establemente” se refiere a la introduccion e integracion de un ADN ajeno en el genoma de la celula transfectada. La expresion “transfectante estable” se refiere a una celula que ha integrado establemente el ADN ajeno en el ADN genomico.

La expresion “transfeccion transitoria” o “transfectado transitoriamente” se refiere a la introduccion de ADN ajeno en una celula en la que el ADN ajeno no se integra en el genoma de la celula transfectada. El ADN ajeno persiste en el nucleo de la celula transfectada durante varios dfas. Durante este tiempo, el ADN ajeno se somete a los controles reguladores que gobiernan la expresion de genes endogenos de los cromosomas. La expresion “transfectante transitorio” se refiere a celulas que han captado el ADN ajeno pero que no integran este ADN.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “polipeptido antimicrobiano” se refiere en general a polipeptidos cortos, de 5 a 100 aminoacidos de longitud, que presentan actividad antimicrobiana. Ejemplos de polipeptidos antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a, beta-defensinas humanas 1, 2 y 3 y catelicidina. Las secuencias de una amplia variedad de polipeptidos antimicrobianos en el alcance de la invencion se conocen y estan disponibles, incluyendo las que se identifican en el documento WO 05/012.492, que se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad.

Descripcion detallada

La presente invencion se refiere en general a sistemas y metodos para preparar, transportar y almacenar equivalentes de piel producidos por cultivo organotfpico. En particular, la presente invencion se refiere a los metodos para secar o radiar equivalentes de piel humana para eliminar la viabilidad del equivalente de piel, de manera que se pueda almacenar durante periodos prolongados y se transportan en condiciones convencionales para su uso en el campo, o su uso en el sitio, en oposicion a su uso en un hospital.

La planificacion medica fue una parte cntica de la Operacion de Libertad Iraqrn e inclrna modelos predictivos del numero esperado de urgencias por quemaduras (Barillo, D.J., et al., Tracking the daily availability of burn beds for national emergencies. J Burn Care Rehabil, 2005. 26(2): p. 174-82). En estos modelos se estima que las urgencias excedfan la capacidad del unico centro de quemaduras del Departamento de Defensa. El Departamento de Defensa en conjuncion con la Asociacion de Americana de quemados desarrollaron un plan masivo de urgencias basandose en las practicas actuales y la tecnologfa disponible para tratar quemaduras. En la primera Guerra del Golfo se supo que el ejercito enemigo dispoma de armas qrnmicas incluyendo mostaza sulfurica. En los conflictos Iraqrn y en Afganistan, el numero de quemaduras en el campo ha alcanzado nuevos niveles. Las quemaduras cutaneas termicas y qrnmicas vesiculosas (ampollosas), asf como los procedimientos de descostrado y desbridamiento que se utilizan comunmente para tratar estas lesiones, daban lugar a heridas abiertas susceptibles a la infeccion por patogenos bacterianos.

Desafortunadamente, en los ultimos 25 anos ha habido una falta significativa de desarrollo de tecnologfas innovadoras, que salven vidas, para el tratamiento de quemaduras cutaneas o heridas vesiculosas. La necesidad de innovaciones en esta area se enfatizo en la conferencia del 25-28 de octubre de 2006 titulada “Estado de la Ciencia de la Investigacion de quemaduras” financiada por el Instituto de Ciencias Medicas Generales. La piel de un cadaver humano radiada con rayos gamma es estable a temperatura ambiente y se ha utilizado satisfactoriamente en el tratamiento de defectos cutaneos (Rosales, M.A., M. Bruntz, y D.G. Armstrong, Gamma-irradiated human skin allograft: a potential treatment modality for lower extremity ulcers. Int Wound J, 2004. 1(3): p. 201-6; Cancio, L.C., et al., Burn support for Operation Iraqi Freedom and related operations, 2003 to 2004. J Burn Care Rehabil, 2005. 26(2): p. 151-61). Sin embargo, dichos productos no estan indicados para el uso en heridas que presenten evidencias de infeccion. Las heridas cutaneas, como las que resultan del a exposicion a agentes vesicantes y lesiones termicas, proporcionan un ambiente ideal para el crecimiento bacteriano y las complicaciones que radican en la sepsis de la herida (Milner, S.M. y M.R. Ortega, Reduced antimicrobial peptide expression in human burn wounds. Burns, 1999. 25(5): p. 411-3).

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un equivalente de piel creado por ingeniena de tejidos, seco o irradiado, antimicrobiano, listo para su uso en el campo para su uso en el tratamiento de lesiones cutaneas vesiculosas, termicas y traumaticas. Los equivalentes de piel, secos o radiados, se disenan para un almacenamiento a largo plazo a temperaturas ambientes y con maxima versatilidad y seguridad para los pacientes con una lesion vesiculosa, termica, o traumatica en el epitelio externo. En realizaciones preferidas, los equivalentes de piel, secos o radiados se crean por ingeniena para suministrar p-defensina 3 (hBD-3) o catelicidina (hCAP18/LL-37) peptfdicas de

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amplio espectro para defender a un huesped humano en el lecho de la herida.

En consecuencia, en algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un equivalente de piel humana seco o radiado que comprende celulas no viables. En algunas realizaciones, el equivalente de piel se ha creado por ingeniena para que exprese y proporcione polipeptidos antimicrobianos exogenos, preferentemente p-defensinas humanas 1, 2 y 3 o catelicidina (hCAP18/LL37). En algunas realizaciones, los equivalentes de piel no viables se aplican a las heridas. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel humana no viables se aplican temporalmente a las heridas. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel humana no viables se retiran y se remplazan con equivalentes de piel humana no viables adicionales proporcionando el mismo polipeptido antimicrobiano. En otras realizaciones, los equivalentes de piel no viables se retiran y remplazan con equivalentes de piel no viables adicionales que proporcionan un polipeptido antimicrobiano diferente. En otras realizaciones, los equivalentes de piel humana no viables se retiran antes de la aplicacion de un equivalente de piel viable o un injerto de piel permanente en la herida (por ejemplo, una herida por quemadura).

En realizaciones preferidas, los equivalentes de piel de la presente invencion se crean por ingeniena para expresar un polipeptido antimicrobiano exogeno. La presente invencion no se limita al uso de un polipeptido antimicrobiano en particular. En realizaciones preferidas, el polipeptido antimicrobiano es la p-defensina humana 1, p-defensina humana 2, p-defensina humana 3, o catelicidina (hCAP18/LL37) o una variante. En algunas realizaciones preferidas, las construcciones de acido nucleico o vectores que codifican el polipeptido antimicrobiano se introducen en los queratinocitos (por ejemplo, celulas NIKS) y los queratinocitos transfectados se utilizan para fabricar el equivalente de piel por tecnicas de cultivo organotipico. Se proporcionan realizaciones preferidas para la produccion de equivalentes de piel que expresan polipeptidos exogenos, asf como polipeptidos antimicrobianos de tipo silvestre y variantes, en la Solicitud relacionada 10/909.119, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

A) Equivalentes de piel producidos por cultivo organotfpico

La presente invencion no se limita al uso de una fuente particular de celulas que sean capaces de diferenciarse en un epitelio escamoso. Ademas, la presente invencion contempla el uso de una variedad de lmeas celulares y fuentes que pueden diferenciarse en un epitelio escamoso, incluyendo tanto los queratinocitos primarios e inmortalizados. Las fuentes de celulas incluyen los queratinocitos y fibroblastos dermicos obtenidos por biopsia de donantes humanos y cadaveres (Auger et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal 36:96-103; Pat de EE. UU. N° 5.968.546 y 5.693.332, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia), prepucios neonatales (Asbill et al., Pharm. Research 17(9): 1092-97 (2000); Meana et al., Burns 24:621-30 (1998); Pat de EE. UU. N° 4.485.096; 6.039.760; y 5.536.656, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia), y lmeas celulares de queratinocitos inmortalizados tales como las celulas NM1 (Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol. 23(3):205-213 (1987)), HaCaT cells (Boucamp et al., J. cell. Boil. 106:761-771 (1988)); y celulas NIKS (Lmea celular BC-1-Ep/SL; Pat de EE. UU. N° 5.989.837, incorporada en el presente documento por referencia; ATCC CRL- 12191). Cada una de estas lmeas celulares se pueden cultivar o modificar geneticamente con el fin de producir una lmea celular capaz de expresar o co-expresar la protema(s) deseada. En realizaciones particularmente preferidas, se utilizan las celulas NIKS. El descubrimiento de una nueva lmea celular de queratinocitos humanos (queratinocitos inmortalizados casi diploides o NIKS) proporciona una oportunidad para modificar geneticamente queratinocitos humanos con vectores no vmcos. La unica ventaja de las celulas NIKS es que son una fuente constante de queratinocitos humanos geneticamente uniformes, libres de patogenos. Por esta razon, son utiles para la aplicacion de estrategias de modificacion genetica y expresion genetica genomica para proporcionar cultivos de equivalentes de piel con propiedades mejoradas por encima de las tecnologfas disponibles actualmente y los productos tisulares de piel. La lmea celular de queratinocitos NIKS, identificada y caracterizada en la universidad de Wisconsin, no es tumorigenica, presenta un cariotipo estable, y presenta un crecimiento y diferenciacion normales tanto en monocapa como en cultivo organotfpico. Las celulas NIKS forman equivalentes de piel completamente estratificados en cultivo. Estos cultivos no se pueden distinguir en ninguno de los criterios ensayados de los cultivos organotfpicos formados a partir de queratinocitos humanos primarios. Sin embargo, a diferencia de las celulas primarias, las celulas NIKS inmortalizadas continuaran proliferando en un cultivo monocapa indefinidamente. Esto proporciona una oportunidad para modificar geneticamente las celulas y aislar nuevos clones de celulas con nuevas propiedades utiles (Allen- Hoffmann et al., J. Invest. Dermatol., 114(3): 444-455 (2000)).

Las celulas NIKS provienen de la cepa BC-1-Ep de queratinocitos del prepucio humano neonatal aislada de bebes ninos aparentemente normales. En los primeros pasajes, las celulas BC-1-Ep no presentan caractensticas morfologicas o de crecimiento que fueran atfpicas para los queratinocitos humanos normales en cultivo. Las celulas BC-1-Ep cultivadas presentaban estratificacion asf como caractensticas de muerte celular programada. Para determinar la vida util de replicacion, las celulas BC-1-Ep se cultivaron en serie hasta la senescencia en medio de cultivo de queratinocitos convencional a una densidad de 3 x 105 celulas por placa de 100 mm y se hacfan pasajes a intervalos semanales (aproximadamente una division de 1:25). Sobre el pasaje 15, la mayona de los queratinocitos de la poblacion tema el aspecto senescente segun se juzgaba por la presencia de numerosas colonias abortivas que presentabas grandes celulas planas. Sin embargo, en el pasaje 16, eran evidentes queratinocitos que presentaban celulas de pequeno tamano. La poblacion resultante de pequenos queratinocitos que sobrevivfa a este supuesto periodo de crisis se mostraba uniforme morfologicamente y produda colonias de queratinocitos que presentaban las

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caractensticas tipicas de un queratinocito incluyendo la adhesion celula-celula y una produccion escamosa evidente. Los queratinocitos que sobrevrnan a la senescencia se denominaron originalmente Lmea espontanea/BC-1-Ep y se llaman ahora NIKS. La lmea celular NIKS se exploro en cuanto a la presencia de secuencias de ADN provmico de VIH-1, VIH-2, EBV, CMV, HTLV-1, HTLV-2, HBV, HCV, parvovirus B-19, HPV-16, SV40, HHV-6, HHV-7, HPV-18 y HPV-31 utilizando el analisis PCR o Southern. No se detectaron ninguno de estos virus.

Se llevo a cabo un analisis cromosomico en las celulas parentales BC-1-Ep en el pasaje 3 y en las celulas NIKS en los pasajes 31 y 54. Las celulas parentales BC-1-Ep teman un complemento cromosomico normal de 46, XY. En el pasaje 31, todas las celulas NIKS conteman 47 cromosomas con un isocromosoma adicional del brazo largo del cromosoma 8. No se detectaron otras anormalidades cromosomas o cromosomas marcadores. El cariotipo de las celulas NIKS se mostraba estable al menos hasta el pasaje 54.

Las huellas de ADN de la lmea celular NIKS y los queratinocitos BC-1-Ep son identicas en los doce loci analizados demostrando que las celulas NIKS provienen de la poblacion parental de BC-1-Ep. Las posibilidades de la lmea celular NIKS que tienen la huella de ADN de BC-1-Ep parental por oportunidad aleatoria son de 4 x 10"16 Las huellas de tres fuentes diferentes de queratinocitos humanos, ED-1-Ep, SCC4 y SCC13y son diferentes del patron de BC-1- Ep. Estos datos tambien demuestras que los queratinocitos aislados de otras ED-1-Ep, SCC4 y SCC13y humanas, no se relacionan con las celulas BC-1-Ep o entre ellas. Los datos de la huella de ADN de NIKs proporcionan una forma ineqmvoca para identificar la lmea celular NIKS.

La perdida de la funcion de p53 se asocia con un aumento del potencial proliferativo y un aumento de la frecuencia de inmortalidad en celulas cultivadas. La secuencia de p53 en las celulas NIKS es identica a las secuencias p53 publicadas (numero de acceso de GenBank: M14695). En los seres humanos, el p53 existe en dos formas polimorficas predominantes que se distinguen por el aminoacido en el codon 72. Ambos alelos de p53 en las celulas NIKS son de tipo silvestre y tienen la secuencia CGC en el codon 72, que codifica la arginina. La otra forma comun de p53 tiene una prolina en esta posicion. La secuencia completa de p53 en las celulas NIKS es identica a la de las celulas BC-1-Ep progenitoras. Se descubrio que Rb tambien era de tipo silvestre en las celulas NIKS.

El crecimiento independiente del anclaje esta correlacionado altamente con tumorigenicidad in vivo. Por esta razon, se investigaron las caractensticas de crecimiento independiente de anclaje en las celulas NIKS en un medio que contema agar o metilcelulosa. Las celulas NIKS permanecieron como celulas unicas despues 4 semanas en medio que contema agar o metilcelulosa. Los ensayos continuaron durante un total de 8 semanas para detectar las variantes de crecimiento lento de las celulas NIKs. No se observo ninguna.

Para determinar la tumorigenicidad de los queratinocitos BC-1-Ep parentales y la lmea celular NIKS de queratinocitos inmortales, se inyectaron las celulas en los flancos de ratones desnudos atfmicos. Se utilizo la lmea celular de carcinoma de celulas escamosas humana, SCC4, como control positivo para la produccion tumoral en estos animales. La inyeccion de las muestras se diseno de manera que los animales recibieron las celulas SCC4 en un flanco y los queratinocitos BC-1-Ep parentales o las celulas NIKS en el otro flanco. Esta estrategia de inyeccion eliminaba los animales respecto a la variacion en la produccion tumoral de los animales y confirmaba que los ratones manteman un crecimiento vigoroso de las celulas tumorigenicas. Ni los queratinocitos BC-1-Ep parentales (pasaje 6) ni los queratinocitos NIKS (pasaje 35) produdan tumores en ratones desnudos atfmicos.

Las celulas NIKS se analizaron en cuanto a la capacidad para sufrir diferenciacion tanto en cultivo sumergido como en cultivo organotfpico. Las tecnicas para el cultivo organotfpico se describe en detalle en los ejemplos. En realizaciones particularmente preferidas, los equivalentes de piel cultivados organotfpicamente de la presente invencion comprenden un equivalente dermico formado por colageno o un material similar y fibroblastos. Los queratinocitos, por ejemplo las celulas NIKS o una combinacion de celulas NIKS y celulas de un paciente se sembraron en el equivalente dermico y formaron una capa epidermica que se caracteriza por una diferenciacion escamosa a continuacion del procedimiento de cultivo organotfpico.

Para las celulas en cultivo sumergido, la formacion de envolturas cornificadas se controlo como un marcador para la diferenciacion escamosa. En queratinocitos humanos cultivados, los primeros estadios de ensamblaje de las envolturas cornificadas daban como resultado la formacion de una estructura inmadura compuesta de involucrina, cistatina-a y otras protemas, que representan el tercio interno de la envoltura cornificada madura. Menos del 2% de los queratinocitos de las celulas BC-1-Ep adherentes o de la lmea celular NIKS produda envolturas cornificadas. Este hallazgo es consistente con los estudios previos que demostraban que los queratinocitos en crecimiento activo, subconfluentes producen menos de un 5% de envolturas cornificadas. Para determinar si la lmea celular NIKS es capaz de producir envolturas cornificadas cuando se induce su diferenciacion, se retiraron las celulas del cultivo adherente y se suspendieron durante 24 h en un medio semisolido con metilcelulosa. Muchos aspectos de la diferenciacion terminal, incluyendo la expresion diferencial de queratinas y la formacion de envoltura cornificada se pueden desencadenar in vitro, por perdida de adhesion de queratinocitos celula-celula y celula-sustrato. Los queratinocitos NIKS produdan la mismas y habitualmente mas envolturas cornificadas que los queratinocitos parentales. Estos hallazgos demuestran que los queratinocitos NIKS no carecen de su capacidad para iniciar la formacion de esta estructura de diferenciacion espedfica del tipo celular.

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Para confirmar que los queratinocitos NIKS pueden someterse a diferenciacion escamosa, se cultivaron las celulas en un cultivo organotipico. Los cultivos de queratinocitos que se cultivaban en sustratos plasticos y se sumergfan en medio se replicaban pero presentaban una diferenciacion limitada. Espedficamente, los queratinocitos humanos llegan a la confluencia y se someten a una estratificacion limitada que produce una lamina que consiste en 3 o mas capas de queratinocitos. Por microscopfa optica y electronica hay diferencias evidentes entre la arquitectura de las laminas multicapa que se forman en el cultivo sumergido y la piel humana intacta. Por el contrario, las tecnicas de cultivo organotipico permiten el crecimiento y diferenciacion en condiciones como in vivo. Espedficamente, las celulas se adhieren a un sustrato fisiologico que consiste en fibroblastos dermicos embebidos en una base de colageno fibrilar. El cultivo organotfpico se mantiene en la interfaz de medio-aire. De esta manera, las celulas de las laminas superiores estan expuestas al aire mientras que las celulas basales en proliferacion se mantienen mas cerca del gradiente de nutrientes proporcionados por difusion mediante el gel de colageno. En estas condiciones, se forma la correcta arquitectura tisular. Son evidentes varias caractensticas de una epidermis diferenciada normalmente. Tanto en las celulas parentales como en la lmea celular NIKS se encuentra una capa unica de celulas basales cuboides que reposan en la union de la epidermis y el equivalente dermico. La morfologfa redondeada y con una relacion nuclear alta respecto al citoplasma indica una poblacion de queratinocitos que se divide activamente. En la epidermis humana normal, segun se dividen las celulas basales dan lugar a celulas hijas que migran hacia arriba en capas de tejido diferenciadas. Las celulas hijas aumentan de tamano y se aplanan y se convierten en escamosas. Eventualmente estas celulas pierden el nucleo y forman estructuras cornificadas, queratinizadas. Este proceso de diferenciacion normal es evidente en las capas superiores tanto en las celulas parentales como en las celulas NIKS. La apariencia de celulas escamosas aplanadas es evidente en las capas epidermicas superiores y demuestra que la estratificacion se produce en los cultivos organotfpicos. En la parte mas externa de los cultivos organotfpicos las escamas sin nucleo se descaman de la parte superior del cultivo. Hasta la fecha, no se han observado diferencias histologicas en la diferenciacion a nivel de microscopfa optica entre los queratinocitos parentales y la lmea celular de queratinocitos NIKS cultivados en cultivo organotfpico.

Para observar caractensticas mas detalladas de los cultivos organotfpicos de celulas parentales (pasaje 5) y NIKS y para confirmar las observaciones histologicas, se analizaron las muestras utilizando microscopfa electronica. Las celulas parentales y la lmea celular de queratinocitos NIKS humanos inmortalizados se recolectaron despues de 15 dfas en el cultivo organotfpico y se seccionaron perpendicularmente respecto a la capa basal para mostrar la extension de la estratificacion. Tanto las celulas parentales como la lmea celular NIKS experimentaban una estratificacion extensa en el cultivo organotfpico y formaban estructuras que eran caractensticas de la epidermis humana normal. Se formaban abundantes desmosomas en los cultivos organotfpicos de celulas parentales y la lmea celular NIKS. Tambien se observaba la formacion de una lamina basal y los hemidesmosomas asociados en las capas basales de queratinocitos tanto de las celulas parentales como en la lmea celular.

Los hemidesmosomas son estructuras especializadas que aumentan la adhesion de los queratinocitos a la lamina basal y ayudan a mantener la integridad y la fuerza del tejido. La presencia de estas estructuras era especialmente evidente en areas en las que las celulas parentales o las celulas NIKS se habfan unido directamente al soporte poroso. Estos hallazgos son consistentes con los hallazgos ultraestructurales anteriores utilizando queratinocitos de prepucio humano cultivados en un soporte poroso que contema fibroblastos. El analisis tanto a nivel de microscopfa optica y microscopica demostraba que la lmea celular NIKS en cultivo organotfpico puede estratificarse, diferenciarse, y formar estructuras tales como los desmosomas, la lamina basal, y los hemidesmosomas que se encuentran en la epidermis humana normal.

B) Secado o irradiacion de equivalentes de piel

En realizaciones preferidas, los equivalentes de piel que se producen como se describe en el Ejemplo se irradiaron y/o secaron para proporcionar un equivalente de piel no viable. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se secan para eliminar la viabilidad celular. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se irradian, por ejemplo, se irradian con radiacion gamma. En algunas realizaciones los equivalentes de piel se dosifican con radiacion gamma desde aproximadamente 0,5 kGy a aproximadamente 25 kGy. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se dosifican con desde aproximadamente 0,5 a aproximadamente 12 kGy de radiacion, mas preferentemente desde aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 5 kGy de radiacion gamma. En cualquier caso, la cantidad de radiacion suministrada a los equivalentes de piel es preferentemente la suficiente para que las celulas contenidas en el equivalente de piel no sean viables segun se ensaya por un ensayo de viabilidad MTT u otros ensayos de viabilidad apropiados. En realizaciones preferidas adicionales, los equivalentes de piel se secan al vado o se secan por congelacion. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se secan antes de la radiacion. En algunas realizaciones preferidas, los equivalentes de piel se envasan en un envase esteril antes del secado o la radiacion. En realizaciones preferidas adicionales, los equivalentes de piel se envasan con un material esteril tal como una gasa para permitir el almacenamiento, transporte, y la facilidad de uso para el usuario final. En otras realizaciones, los equivalentes de piel secados o radiados mantienen la capacidad para liberar polipeptidos endogenos en la superficie de una herida despues de ponerlos en contacto con la herida. En realizaciones adicionales, los equivalentes de piel secados o radiados mantienen la capacidad para liberar polipeptidos exogenos en la herida despues de ponerse en contacto con el ambiente de la herida. En realizaciones adicionales, los equivalentes de piel se refrigeran antes de su uso, mientras que en otras realizaciones, los equivalentes de piel se almacenan a temperatura ambiente antes de su uso.

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Se reconocera que la extension a la que los equivalentes de piel se sequen se puede determinar comparando la peso del equivalente de piel seco con la peso de un equivalente de piel que no se ha secado (un equivalente de piel humedo), es decir, un equivalente de piel que se acaba de retirar del cultivo organotfpico. En algunas realizaciones, el equivalente de piel se seca hasta un peso final de menos del 75%, 50%, 25% o preferentemente el 15% de la del equivalente de piel humedo. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel secos de la presente invencion tienen un peso de menos del 75%, 50%, 25%, o preferentemente del 15% de la del equivalente de piel humedo o no secado. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel secos se rehidratan antes de la aplicacion a un sujeto. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel rehidratados tienen una fuerza de tension de 0, 1 a 0,5 MPa, preferentemente desde aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,8 MPa. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel rehidratados tienen un valor inicial de DPM de desde aproximadamente 20 DPM a aproximadamente 300 DPM, preferentemente desde aproximadamente 70 a aproximadamente 140 DPM, y un valor de cambio de DPM de desde aproximadamente 5 DPM a aproximadamente 400 DPM, preferentemente desde aproximadamente 10 DPM a aproximadamente 220 DPM.

En algunas realizaciones, los equivalentes de piel secos y/o radiados se utilizar para suministrar un peptido o protema de interes a un sujeto, y en algunas realizaciones preferidas al lecho de una herida de un sujeto. Los equivalentes de piel que expresan peptidos y protemas exogenos se han descrito anteriormente por los inventores, vease, por ejemplo, el documento WO 05/012492, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se crean por ingeniena para que expresen uno o mas polipeptidos antimicrobianos. En algunas realizaciones, el polipeptido antimicrobiano es catelicidina, beta-defensina humana 1, beta-defensina humana 2, o beta-defensina humana 3, o combinaciones de las mismas. En realizaciones preferidas, el peptido o el polipeptidos es exogeno, es decir, codificados y expresados por una construccion genetica exogena de los queratinocitos que se utilizan para fabricar el equivalente de piel. La cantidad de peptido o polipeptido suministrado por el equivalente de piel se puede determinar aplicando una solucion acuosa al equivalente de piel y midiendo la cantidad de peptido o polipeptido que se ha suministrado en la solucion. En algunas realizaciones, el polipeptido se proporciona en una cantidad de desde 1 a 1000 ng de polipeptido antimicrobiano por mililitro de solucion de extraccion. En algunas realizaciones, el polipeptido se proporciona en una cantidad de desde 10 a 500 ng de polipeptido antimicrobiano por mililitro de solucion de extraccion.

C) Usos terapeuticos

Se contempla que los equivalentes de piel no viables de la presente invencion se pueden utilizar terapeuticamente. En algunas realizaciones la piel seca o irradiada se utiliza en aplicaciones de tratamiento del cierre de heridas y quemaduras. El uso de autoinjertos y aloinjertos para el tratamiento de quemaduras y cierre de heridas se describe en Myers et al., A. J. Surg. 170(1):75-83 (1995) y Pat de EE. UU. N° 5.693.332; 5.658.331; y 6.039.760, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se pueden utilizar junto con sustitutos dermicos tales como DERMAGRAFT o INTEGRA. En consecuencia, la presente invencion proporciona metodos para el cierre de heridas, incluyendo las heridas causadas por quemaduras, que comprende proporcionar un equivalente de piel y un paciente que padece una herida y tratar al paciente con el equivalente de piel en condiciones tales que la herida se cierre.

En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se utilizan para tratar heridas cutaneas cronicas. Las heridas cutaneas cronicas (por ejemplo, ulceras venosas, ulceras diabeticas, ulceras por presion) son un problema serio. La curacion de dichas heridas a menudo conlleva mas de un ano de tratamiento. Las opciones de tratamiento actuales incluyen vendajes y desbridamiento (utilizacion de productos qmmicos o cirugfa para retirar el tejido necrotico), y/o antibioticos en el caso de infeccion. Estas opciones de tratamiento necesitan periodos extensos de tiempo y mucha colaboracion del paciente. Como tal, una terapia que pueda aumentar el exito del medico en la cicatrizacion de heridas cronicas y acelere la velocidad de cicatrizacion de heridas cubrina una necesidad no satisfecha en el campo. En consecuencia, la presente invencion contempla el tratamiento de heridas cutaneas con equivalentes de piel que comprenden las celulas de la presente invencion (por ejemplo, las celulas NIKS). En algunas realizaciones, los equivalentes de piel se aplican por via topica en las heridas. En otras realizaciones, los equivalentes de piel que comprenden celulas NIKS se utilizan para el injerto en el espesor parcial de las heridas. En otras realizaciones, los equivalentes de piel que comprenden las celulas NIKS se utilizan para el injerto en el espesor completo de las heridas. En otras realizaciones, los equivalentes de piel que comprenden celulas NIKS se utilizan para tratar numerosos tipos de heridas internas, incluyendo, pero no limitadas a, heridas internas de las membranas mucosas que recubren el tracto gastrointestinal, colitis ulcerativa, e inflamacion de membranas mucosas que puede estar producidas por las terapias contra el cancer. En otras realizaciones mas, los equivalentes de piel que comprenden celulas NIKS que expresan peptidos para la defensa del huesped se utilizan como un vendaje de heridas temporal o permanente.

En mas realizaciones adicionales, las celulas se crean por ingeniena para proporcionar agentes terapeuticos adicionales al sujeto. La presente invencion no se limita al suministro de un agente terapeutico en particular. Ademas, se contempla que se pueda suministrar una variedad de agentes terapeuticos al sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, enzimas, peptidos, hormonas peptfdicas, otras protemas, ARN ribosomico, ribozimas, aRn pequeno de interferencia (ARNip), micro ARN (miARN), y ARN antisentido. En realizaciones preferidas, los agentes son peptidos de defensa al huesped tales como beta-defensinas humanas 1, 2, o 3 o catelicidina, vease por ejemplo,

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Solicitud de Pat. de EE.UU. 10/909.119, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Estos agentes terapeuticos pueden suministrarse para una variedad de fines, incluyendo pero no limitados al fin de corregir defectos geneticos. En algunas realizaciones preferidas en particular, el agente terapeutico se suministra con el fin de detoxicar un paciente con un error de metabolismo congenito heredado (por ejemplo, aminoacidopatesis) en el que el injerto funciona como un tejido de tipo silvestre. Se contempla que el suministro del agente terapeutico corrija el defecto. En algunas realizaciones, las celulas se transfectan con una construccion de ADN que codifican un agente terapeutico (por ejemplo, insulina, factor IX de coagulacion, eritropoyetina, etc.) y las celulas transfectadas se administran al sujeto. El agente terapeutico se suministra entonces en la corriente sangumea del paciente u otros tejidos a partir del injerto. En realizaciones preferidas, el acido nucleico que codifica el agente terapeutico esta unido operativamente a un promotor adecuado. La presente invencion no esta limitada al uso de un promotor en particular. Ademas, se contempla el uso de una variedad de promotores, incluyendo, pero sin limitarse a, promotores inducibles, constitutivos, espedficos de tejidos, y espedficos de queratinocitos. En algunas realizaciones, el acido nucleico que codifica el agente terapeutico se introduce directamente en los queratinocitos (es decir, por electroporacion, co-precipitacion en fosfato calcico, o transfeccion por liposomas). En otras realizaciones preferidas, el acido nucleico que codifica el agente terapeutico se proporciona como un vector y el vector se introduce en los queratinocitos por metodos conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, el vector es un vector episomico tal como un plasmido replicante. En otras realizaciones, el vector se integra en el genoma de los queratinocitos. Ejemplos de vectores que se integran incluyen pero no se limitan a, vectores retrovmcos, vectores de virus adeno-asociados, vectores plasmidos no replicantes y vectores de transposon.

Experimentacion

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invencion y no se tienen que considerar como limitantes del alcance de la misma.

En la siguiente divulgacion experimental, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar), mM (milimolar); pM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); ng (nanogramos); l (litros); ml (mililitros); pl (microlitros); cm (centfmetros); mm (milfmetros); pm (micrometros), nm (nanometros); °C (grados centfgrados); U (unidades), mU (miliunidades); min. (minutos); seg. (segundos); % (porcentaje); kb (kilobase); pb (pares de bases); PCR (reaccion en cadena de polimerasa); BSA (seroalbumina bovina); UFC (unidades formadoras de colonias); kGy (kiloGray); PVDF (fluoruro de polivinilidina); BCA (acido bicinchomnico); SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecil sulfato sodico de poliacrilamida).

Ejemplo 1

Este ejemplo describe un metodo para la produccion de equivalentes de piel.

Medios. El procedimiento del cultivo organotfpico utiliza tres diferentes medios de cultivo, todos ellos basados en la formulacion del medio SMB descrita en la Patente de EE. UU. 7.407.805, con la excepcion de que se omite la toxina del colera en todos los medios. Se utiliza el FM01 para propagar los fibroblastos dermicos normales humanos (NHDF) para su uso en las capas equivalentes dermicas del equivalente de piel. El FM01 tiene la misma formulacion que SMB excepto en que contienen clon II de suero fetal (un 2% final) y carece de toxina del colera. El KM01 se utiliza para cultivar los queratinocitos NIKS y tiene la misma composicion que el SMB excepto que contiene un 2,5% de clon II fetal, y se anade factor de crecimiento epidermico (EGF) adicionalmente con una concentracion final de 5 ng/ml. El SM01 se utiliza durante la fase de estratificacion epidermica de la produccion de equivalente de piel y es identico al SMB excepto por la omision de la toxina del colera.

Preparacion del equivalente dermico. El dfa 0, las celulas NHDF congeladas se descongelaron y se colocaron en placas. Las celulas se alimentaron con FM01 al dfa siguiente (dfa 1) para retirar el crioprotector residual y de nuevo el dfa 3. El dfa 4, se recolectaron para su uso en el equivalente dermico. Para preparar el equivalente dermico, se diluyo primero colageno de cola de rata Tipo I a 3 mg/ml en acido acetico 0,03 N y se enfrio en hielo. Una mezcla de medio F12 de Ham (8,7x de fuerza normal y tamponado con HEPES a pH 7,5) se mezcla con el clon fetal II. Etas dos soluciones eran un 11,3 y un 9,6% del volumen de la solucion final. Se anadio NaOH 1 N a la mezcla de medio (2,4% de solucion final). Entonces se anadio el colageno diluido (74,7%) a la mezcla. Se anadio a la mezcla un volumen del 2% de fibroblastos suspendidos (2,78 x 106/ml). Se vertieron 9 ml de la mezcla de equivalente dermico en cada insercion de 75 mm TRANSWELL (Corning Costar). Tras un periodo de formacion de gel de 50-70 minutos, las inserciones Transwell se transfirieron a la superficie de una malla de acero inoxidable en una placa de cultivo de 150 mm. Se colocaron 80 ml de FM01 en la placa de 150 mm al exterior de la insercion TRANSWELL y se colocaron 10 ml sobre el equivalente dermico. Los equivalentes dermicos se situan en una incubadora a 37 °C, un 5% de CO2, con un 90% de humedad relativa durante 4-5 dfas antes de su uso en los cultivos organotfpicos.

Siembra y cultivo de NIKS. Las celulas NIKS se descongelaron y se colocaron en placas a una densidad de aproximadamente 5 x 105 celulas por placa de 100 mm. El cultivo de NIKS se puede llevar a cabo en presencia o ausencia de celulas alimentadoras murinas. El dfa 1, las celulas NIKS se alimentaron con KM01 reciente para retirar el crioprotector residual. Las celulas NIKS se alimentaron de nuevo el dfa 3. El dfa 4, las celulas NIKS se

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recolectaron de los cultivos iniciales p100 y se sembraron en matraces de cultivo de 225 cm2 a una densidad de 1,2 x 106 por matraz. Los cultivos de NIKS se alimentaron con medio reciente los dfas 7 y 8. El dfa 9, las celulas NIKS se recolectaron, se recontaron, y se re-suspendieron en SM01. Se sembraron 2,27 x 104 celulas NIKS/cm2 en la superficie de los equivalentes dermicos. Las placas son cultivos que se alimentan y se elevan a la interfaz aire- medio. Los cultivos se transfirieron a una incubadora de humedad controlada fijada al 75% en donde permanecieron durante el resto del crecimiento. Los cultivos se alimentaron con SM01 los dfas 14, 18, 22, 25, 28, y 30.

Ejemplo 2

Determinacion de la dosis de radiacion gamma necesaria para producir tejido equivalente de piel no viable esteril.

El calendario de produccion para desarrollar equivalentes de piel radiados se basaba en un procedimiento de produccion de 28 dfas establecido previamente para los productos de tejidos cutaneos humanos creados por ingeniena. Los tejidos 9F1 y 2D2, que se habfan creado por ingeniena para el aumento de la expresion de los peptidos de defensa al huesped hBD-3 y hCAP18/LL-37, respectivamente, se produjeron utilizando procedimientos asepticos. Los tejidos se transformaron en camaras de gel nutriente y se sellaron antes del envasado y transporte. Se llevo a cabo la radiacion en Sterigenics, Inc., utilizando el irradiador gamma de alta precision ExCell, en sus instalaciones de Charlotte, North Carolina. Los tejidos recibieron una de cinco dosis de radiacion: 0 kGy, 1 kGy, 5 kGy, 8 kGy, u 11 kGy. Estas dosis se escogieron basandose en la evaluacion previa de dosis similares en tejidos de aloinjertos. Tras la irradiacion los tejidos se refrigeraron antes del analisis en los tiempos indicados posteriormente.

Al devolver las muestras procesadas a Stratatech, se descubrio que algunos de los tejidos almacenados en geles nutrientes se desenganchaban de sus membranas de soporte subyacentes, dando como resultado el plegamiento y arrugamiento de los tejidos. Este fenomeno se observo en tejidos radiados y no radiados. Se desarrollaron posteriormente procedimientos de transporte que resolvieran este problema. Vease los Ejemplos posteriores.

Ensayo de esterilidad: Se obtuvieron biopsias con troquel a partir de tejidos 9F1 y 2D2 que se habfan sometido a radiacion gamma a dosis que variaban desde 0 a 11 kGy. Las muestras de los tejidos almacenadas durante 3 dfas tras la irradiacion se inocularon en caldo de soja tripticasa o medio fluido con tioglicolato. Los cultivos se incubaron durante 14 dfas en las condiciones definidas en cuanto al ensayo de esterilidad por la Farmacopea de EE. UU. Tras 14 dfas, los cultivos se examinaron visualmente en cuanto a crecimiento microbiano. No se observo ningun crecimiento microbiano en ninguno de los tejidos analizados, demostrando que los tejidos se manteman esteriles a lo largo de la manipulacion, irradiacion, y transporte.

Ensayo de viabilidad por el ensayo de viabilidad MTT: Se obtuvieron biopsias de los tejidos 9F1 y 2D2 irradiados con radiacion gamma y de control a los 3 dfas, 7 dfas, o 14 dfas tras el tratamiento de radiacion y se midio la viabilidad celular por el ensayo de viabilidad MTT. En resumen, el sustrato MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-3- il)-2,5-difenil tetrazolio, se convierte en el producto MTT formazan por las deshidrogenasas de las celulas viables. El producto coloreado se extrae entonces en isopropanol y se lee a 550 nm. Se midio la viabilidad den cuarto lotes de tejido independientes, y los resultados representativos se muestran en la Figura 1. La viabilidad de los tejidos no radiados no cambiaba significativamente durante el periodo de almacenamiento. Los tejidos tratados con 1 kGy de radiacion teman una actividad enzimatica residual a los 3 dfas tras la irradiacion que continuaba disminuyendo a los 7 y 14 dfas tras la radiacion. Sin embargo, los tejidos tratados con dosis de 5, 8, u 11 kGy presentaban una minima actividad residual en todos los puntos de tiempo y permaneda baja a lo largo del curso del periodo de 14 dfas de almacenamiento. A los 14 dfas tras la radiacion, la actividad metabolica de tejidos irradiados con 1 kGy se redujo al mismo nivel bajo que se vefa en las dosis de radiacion mas altas.

Determinacion de la viabilidad por el ensayo de migracion de queratinocitos: Se establecieron cultivos de explantes de biopsia a partir de tejidos de control o tejidos irradiados para determinar si los queratinocitos se inactivaban por los tratamientos con radiacion. Las biopsias con troquel obtenidas de los tejidos 3 dfas tras la irradiacion se transfirieron a un medio de cultivo, se cultivaron durante 48 horas y se procesaron para la tincion histologica utilizando hematoxilina/eosina y la microscopfa digital. Se obtuvieron imagenes para evaluar la arquitectura tisular y valorar como positivas o negativas en cuanto a la migracion de queratinocitos desde los extremos de la herida creada por los troqueles de biopsia de acuerdo con el esquema de la Figura 2. La migracion era evidente en los tejidos 9F1 y 2D2 no radiados pero estaba ausente en todos los tejidos sometidos a radiacion gamma.

Ensayo de extension de fibroblastos: Se obtuvieron biopsias a partir de tejidos de control e irradiados a los 7 dfas tras la radiacion, y se trataron con colagenasa bacteriana para liberar los fibroblastos. Las celulas liberadas de estos tejidos se transfirieron a placas de cultivo, permitiendolos que crecieran durante seis dfas en medio de cultivo, y se visualizaron por tincion con azul de metileno. La extension celular de fibroblastos se valoro como positiva o negativa basandose en la presencia o ausencia de celulas tenidas de azul, respectivamente. Las imagenes de los cultivos de fibroblastos aislados de los tejidos no radiados o radiados se muestran en la Figura 3. La extension de fibroblastos se observo en los cultivos de control que no recibieron radiacion, pero estaba ausente en las preparaciones derivadas de tejidos irradiados.

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A partir de los estudios anteriores, se determino que la esterilidad del producto se mantema a lo largo de la produccion y procesamiento de los tejidos. El tratamiento de los tejidos equivalentes de piel con dosis de radiacion de 1 kGy daba lugar a tejido no viable utilizando dos ensayos independientes de viabilidad. La dosis de 5 kGy o mayores daban como resultado tejidos no viables como se evaluaba con los tres metodos.

Ejemplo 3

Evaluacion de las propiedades estructurales de tejido equivalente de piel irradiado con radiacion gamma

Las propiedades estructurales de los tejidos irradiados tras 3 dfas de almacenamiento en refrigeracion se evaluaron por tincion histologica con hematoxilina y eosina y se visualizaron por microscopfa optica. La tincion histologica verificaba que los tejidos irradiados manteman una organizacion tisular normal y morfologfa macroscopica. Todas las capas celulares, incluyendo la dermis, capas de queratinocitos basal y espinosa, y el estrato corneo, eran identificables en los tejidos de control no radiados y los irradiados, aunque era aparente algun dano tisular con las dosis de radiacion mas altas, que se visualizaban como huecos entre los compartimentos dermico y epidermico. Como resultado, los niveles de dosis de 1 kGy y 5 kGy se identificaron como las mas prometedoras para su uso en estudios posteriores.

Ejemplo 4

Evaluacion de las propiedades bioqmmicas, incluyendo la actividad antimicrobiana in vitro, de tejido equivalente de piel irradiado con radiacion gamma

La radiacion gamma estimula el dano dependiente de la dosis a las protemas tanto directa como indirectamente. El dano directo ese inicia mediante ionizacion, mientras que el dano indirecto implica la hidrolisis de las moleculas de agua y la modificacion o entrecruzamiento oxidativo de macromoleculas. Como resultado, la protema del tejido puede presentar un aumento de degradacion y disminucion de la solubilidad al irradiarse. Como se espera que el producto en desarrollo funcione por medio de la provision de niveles elevados de peptidos de defensa al huesped, era necesario determinar la accesibilidad y actividad biologica de las protemas tras la radiacion. El analisis de tejidos irradiados inclma el analisis de protema total y soluble, analisis de inmunotransferencia, y ensayos de actividad antimicrobiana.

Analisis de protema total y soluble: Se obtuvieron biopsias con troquel de tejidos de piel 2D2 y 9F1 radiados y no radiados y se sumergieron en 0,2 ml de agua esteril. Las muestras de biopsia se incubaron a 37 °C durante 72 h para extraer la protema, se recolectaron los sobrenadantes, y se cuantifico la protema total por un ensayo BCA. Como se muestra en la Figura 4, la protema total elrnda en el sobrenadante disminma con el aumento de la dosis de radiacion. Estos resultados eran consistentes con el dano de protemas que se ha informado ampliamente mediado por la radiacion por entrecruzamiento, una modificacion que reduce la solubilidad proteica. Sin embargo, en estudios preliminares que utilizaban tejidos envasados en un ambiente menos hidratados que consistfan en una venda no adherente, se eliminaba esta disminucion de la extraccion proteica dependiente de la dosis (vease el Ejemplo 6).

Analisis de peptidos: La extraccion proteica puede reflejar el estado bioqmmico general de tejidos procesados; otros parametros relevantes que apoyan el desarrollo de un vendaje de heridas antimicrobiano son la integridad y solubilidad de los peptidos antimicrobianos. Para evaluar estos parametros, se llevo a cabo un analisis de inmunotransferencia sobre las protemas extrafdas de tejidos 2D2 radiados y no radiados. Se obtuvieron biopsias con troquel de tejidos 2D2 y se transfirieron en medio de cultivo libre de suero durante 48 horas adicionales. El medio acondicionado de tejidos por duplicado se recolectaron, se re-disolvieron las protemas por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDf, y se procesaron para el analisis de inmunotransferencia utilizando metodos convencionales. Los peptidos antimicrobianos se detectaron utilizando anticuerpos espedficos de hCAP-18, que detectan la protema antimicrobiana hCAP18 humana intacta y su fragmento proteolftico bioactivo, LL-37. Tanto la hCAP18 intacta como LL37 se detectaron facilmente en los medios acondicionados por los tejidos, independientemente de la dosis de radiacion, y el patron de migracion de estas protemas en la SDS-PAGE tampoco estaba afectada por las dosis de radiacion utilizados en estos estudios. Habfa ligeros aumentos de peptidos liberados de los tejidos de control no radiados. Estos ligeros aumentos pueden ser debidos a la nueva smtesis y secrecion de peptidos del tejido viable, o como resultado del aumento de la solubilidad del peptido en estos tejidos.

Ensayo de actividad antimicrobiana: Habiendo establecido la integridad de los peptidos antimicrobianos liberados de los tejidos radiados y no radiados, los inventores evaluaron los tejidos de control e irradiados en cuanto a las propiedades antimicrobianas. En resumen, se obtuvieron biopsias con troquel de tejidos radiados y no radiados, y se transfirieron a un medio de cultivo libre de suero durante 2, 4, o 24 h para permitir la extraccion de peptidos antimicrobianos. Los medios se recolectaron y se combinaron con un inoculo de 1,0 x 103 UFC de S. carnosus en un medio de crecimiento bacteriano. Esta mezcla se incubo a 37 °C con agitado continuo durante 60 min. A continuacion, las muestras se colocaron en placas en placas bacteriologicas utilizando un WASP2 Spiral Plater (Microbiology International, Frederick, MD) y se incubaron durante 16 h a 37 °C. Se hizo el recuento de las colonias, y se determino la densidad bacteriana viable, expresada en UFC/ml. Los valores se normalizaron frente a la densidad de cultivos bacterianos que crecen en presencia de medio de cultivo libre de suero sin extractos tisulares.

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Como se muestra en la Figura 5, las muestras extrafdas de los tejidos 2D2 se trataron con 1 kGy de radiacion presentaban un aumento de la actividad antimicrobiana segun indicaba la disminucion de la densidad bacteriana con respecto a los tejidos no radiados en los periodos de acondicionamiento de 2 y 4 horas. Este aumento transitorio no se observaba en tejidos tratados con una dosis de 5 kGy, ni era evidente en tiempos de acondicionamiento mas largos. Un aumento similar de la actividad se vefa en tejidos 9F1 que se habfan irradiado a 1 kGy (datos no mostrados). Esta actividad antimicrobiana mejorada es sorprendente ya que los ejidos irradiados pueden liberar menos cantidad de protema total y de peptidos de catelicidina antimicrobianos durante periodos de tiempo mas largos. Sin embargo, mientras que los estudios anteriores utilizaban tejidos que se incubaban durante al menos 48 h, la mejona de la actividad antimicrobiana se observaba solo en las muestras extrafdas de los tejidos irradiados durante 2 o 4 horas.

En total, el analisis bioqmmico de equivalentes de piel irradiados revelo que el nivel total de protema soluble estaba disminuido, pero la integridad del peptido antimicrobiano estaba muy conservada. Los peptidos extrafdos de los tejidos equivalentes de piel irradiados a 1 kGy demostraron que redudan el crecimiento bacteriano hasta un 80% con respecto a los cultivos bacterianos de control. Estos resultados demostraban la fiabilidad del mantenimiento de la actividad biologica en estos tejidos de piel creados por ingeniena procesados terminalmente.

Ejemplo 5

Almacenamiento de tejidos equivalentes de piel irradiados

Se llevo a cabo un analisis de la capacidad de almacenamiento a corto plazo de tejidos 9F1 y 2D2 irradiados almacenados en geles nutrientes. En estos estudios, se analizaron los tejidos irradiados refrigerados a los 7 dfas y los 37 dfas tras el tratamiento, y se evaluaron o ensayaron en cuanto a la arquitectura tisular y las actividades de los peptidos antimicrobianos. La organizacion total del tejido de los tejidos irradiados estaba preservada durante los 37 dfas de almacenamiento refrigerado. A los niveles de dosis examinados, los tejidos refrigerados manteman ambos compartimentos dermico y epidermico. En el compartimento epidermico, se mantema la distincion entre las capas de queratinocitos basales y espinosos, y las capas cornificadas permanecio sin cambios. El dano celular mmimo en el tejido se manifestaba como espacios intercelulares entre los queratinocitos en las capas basal y suprabasal, y el almacenamiento de tejidos daba como resultado una separacion parcial entre los compartimentos dermico y epidermico. Sin embargo, esto se vefa en los tejidos en todos los periodos de tiempo examinados.

Actividad de los peptidos antimicrobianos: Las muestras se obtuvieron a partir de tejidos 9F1 y 2D2 radiados y no radiados que se habfan almacenado a temperaturas de refrigeracion durante 7 dfas o 37 dfas tras la irradiacion. Los ensayos de actividad antimicrobiana se llevaron a cabo como anteriormente. Se determino la densidad bacteriana (UFC/ml) y se normalizaron los datos respecto al crecimiento de cultivos bacterianos cultivados en presencia de medio de crecimiento reciente libre de suero. Los resultados de estos estudios se muestran en las Figuras 6 y 7 para los tejidos 9F1 y 2D2, respectivamente Los tejidos 9F1, irradiados con una radiacion de 1 kGy y almacenados durante 7 dfas, presentaban un 86% de reduccion del crecimiento bacteriano con respecto a los cultivos bacterianos de control. En comparacion, los tejidos 9F1 no radiados daban como resultado un 52% de reduccion del crecimiento bacteriano. De manera similar, los tejidos 2D2 irradiados con 1 kGy refrigerados durante 7 dfas daban como resultado un 72% de reduccion del crecimiento bacteriano, en comparacion con un 57% de reduccion producida por los tejidos 2D2 no radiados. Las actividades antimicrobianas de los tejidos 9F1 y 2D2 irradiados con 1 kGy volvfan a aproximadamente las de los tejidos no radiados a los 27 dfas de almacenamiento en refrigeracion, pero segrnan presentando actividad antimicrobiana frente a los cultivos de control. Aunque todos los tejidos tratados con 5 kGy manteman una actividad antimicrobiana medible a los 7 dfas de almacenamiento tras la irradiacion, esta actividad se reduda en el almacenamiento prolongado. Estos datos sugieren que los tejidos irradiados pueden proporcionar una actividad antimicrobiana que es detectable despues de mas de un mes de almacenamiento en refrigeracion.

Ejemplo 6

Efectos de la configuracion del envasado

Se observo que los tejidos que se habfan procesado en el Ejemplo 2, anteriormente, se despegaban de la membrana del soporte subyacente, dando como resultado el plegamiento y arrugamiento de los tejidos. Para evitar este fenomeno, se desarrollo una configuracion de envasado que evitaba este movimiento del tejido. En esta configuracion modificada, los tejidos se retiraban de sus inserciones y se transfenan a una gasa no adherente esteril, y se sellaban en bolsas de plastico esteriles. Tras retirarlos de la bolsa de plastico, los tejidos no presentaban pruebas de arrugamiento o plegamientos.

Los efectos de la radiacion gamma en las protemas se ha descrito en otro sitio, y estos efectos estan mediados en gran parte por radicales libres y especies de oxfgeno reactivo generados por la hidrolisis de las moleculas de agua en la muestra. Debido al alto contenido de humedad en las camaras de gel nutriente que se utiliza para el transporte de los productos de tejido creados por ingeniena, se anticipaba que los tejidos radiados envasados en camaras de gel nutriente o gasa no adherente seca durante el tratamiento de irradiacion presentanan diferentes propiedades

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bioqmmicas. Se obtuvieron biopsias con troquel de tejidos 2D2 y 9F1 radiados y no radiados y se sumergieron en 0,2 ml de agua esteril. Se incubaron las biopsias a 37 °C durante 24 h, se recolectaron los sobrenadantes, y las protemas elmdas se cuantificaron por el ensayo BCA. Como se muestra en la Figura 8, la protema hidrosoluble total disminma segun aumentaba la dosis de radiacion en los tejidos envasados en camaras de gel nutriente, los que coincidfa con los estudios descritos anteriormente. Por el contrario, el envasado de tejidos irradiados en gasa no adherente restauraba la accesibilidad de las protemas a aproximadamente la de los niveles del control. El envasado de tejidos en gasa antes de la radiacion puede reducir por lo tanto el nivel de dano proteico en el tejido irradiado presentando un ambiente que menos permisivo al entrecruzamiento proteico.

Ejemplo 7

Secado por congelacion de equivalentes de piel creados por ingenieria

Los equivalentes de piel creados por ingeniena se fabricaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Al completarlos, las inserciones TRANSWELL que conteman los equivalentes de piel se transfirieron asepticamente a placas TRANSWELL de plastico, se cubrieron, y se colocaron en un estante del VIRTIS Genesis Freeze Dryer (Gardiner, NY) y se mantuvo a 20 °C. Los tejidos se congelaron reduciendo la temperatura de 20 °C a -20 °C a una velocidad de -1,33 °C por minuto a una presion de 2100 mT; y desde -20 °C a -60 °C a una velocidad de -0,67 °C por minuto a una presion de 2100 mT. Se aplico vacm para reducir la presion a 0 mT, y se calentaron los tejidos desde -60 °C a 20 °C a +0,25 °C por minuto. Se completo el secado manteniendo las muestras a 0 mT durante al menos 16 horas.

Ejemplo 8

Secado al vaao de equivalentes de piel creados por ingenieria

Los equivalentes de piel creados por ingeniena se fabricaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las inserciones TRANSWELL que conteman los equivalentes de piel se transfirieron asepticamente a placas TRANSWELL de plastico, se cubrieron y se depositaron en un estante de una camara del VIRTIS Genesis Freeze Dryer mantenida a 25 °C. La presion de la camara se redujo a intervalos de ocho minutos de la siguiente manera: 900 mT, 830 mT, 760 mT, 690 mT, 620 mT, 550 mT, 490 mT, 430 mT, 370 mT, 310 mT, 250 mT, 200 mT, 150 mT, 100 mT, 50 mT, 25 mT. Las muestras se mantuvieron a 25 mT durante al menos 16 horas hasta completar el secado.

Ejemplo 9

Peso seco de los equivalentes de piel creados por ingenieria

Los equivalentes de piel creados por ingeniena se fabricaron y se obtuvieron las pesos de tejido humedo antes y despues del secado del secado por congelacion. Los pesos de tejido obtenidos tras el secado por congelacion variaban desde un 11,7% a un 13,7% del peso de tejido humedo original. (Tabla 1).

Tabla 1. Medicion del peso seco de los equivalentes de piel creados por ingeniena

I.D. del tejido: Peso humedo (mg) Peso seco (mg) % del peso humedo

050508-1: 1330,2 156,0 11,7

050508-2: 1035,5 122,4 11,8

050508-3: 1204,4 165,2 13,7

Ejemplo 10

Irradiacion de equivalentes de piel creados por ingenieria secos

Los tejidos equivalentes de piel creados por ingeniena para que sobre-expresaran peptidos de defensa al huesped hCAP18/LL-37 se fabricaron como se describe en el Ejemplo 1, y se secaron como se ha descrito en los Ejemplos 7 y 8. Tras el secado, los tejidos se retiraron de las inserciones TRANSWELL y se sellaron por calor en bolsas de plastico esteriles. Los tejidos se irradiaron en Sterigenics como se ha descrito en el Ejemplo 2, a los nieles de dosis de 1, 5, o 25 kGy, seguido por el almacenamiento de los tejidos a temperatura ambiente durante has los dos meses. Se evaluo la arquitectura tisular total por tincion de secciones histologicas con hematoxilina y eosina. La viabilidad tisular se evaluo por un ensayo MTT como se ha descrito en el Ejemplo 2. La funcion de barrera tisular se evaluo en los tejidos irradiados secos utilizando mediciones metricas de impedancia. Los espedmenes obtenidos de tejidos irradiados secos se estiraron hasta el fallo bajo tension uniaxial y se determinaron las propiedades mecanicas. Los niveles de peptido antimicrobiano se cuantificaron por ELISA de los extractos solubles que se obtuvieron de los tejidos irradiados secos.

Analisis histologico: Se obtuvieron las biopsias de tejidos recientes, o de tejidos que se habfan secado por congelacion o secados al vaco a temperatura ambiente y posteriormente se irradiaron a uno de los tres niveles de

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dosis y se almacenaron a temperatura ambiente durante hasta dos meses. Los espedmenes se procesaron para la tincion histologica utilizando hematoxilina/eosina con el fin de visualizar la arquitectura tisular, y se obtuvieron micrograffas con una magnificacion de 400x. Las imagenes representativas de los tejidos irradiados secados por congelacion y secados al vado se muestran en la Figura 9 y la Figura 10, respectivamente. Los espedmenes recien preparados presentaban la arquitectura tisular esperada para los tejidos sustitutos de piel creados por ingeniena (Figuras 9 y 10, panel 1).

Los tejidos equivalentes de piel secados por congelacion sometidos a radiacion manteman una arquitectura tisular macroscopica normal, con componentes dermicos y epidermicos reconocibles (Figura 9). El compartimento dermico presenta cambios estructurales, que incluyen la compactacion y la deslaminacion del compartimento epidermico. En el compartimento epidermico, la organizacion de las capas basal, espinosa y del estrato corneo estaban muy conservadas.

Los tejidos equivalentes de piel creados por ingeniena secados al vado sometidos a radiacion mantienen la estructura tisular normal macroscopica, con componentes dermicos y epidermicos reconocibles (Figura 10); incluyendo las capas de queratinocitos reconocibles de dermis, basal y espinosa, y el estrato corneo. Sin embargo, la compactacion de los compartimentos dermicos es evidente, dando como resultado un tejido que es mas delgado que los tejidos sin conservar. El aumento de la dosis de radiacion no introduda cambios adicionales en la histologfa total de los tejidos secados al vado.

Ensayo de viabilidad por ensayo de viabilidad MTT: Se recolectaron biopsias con troquel (de 8 mm de diametro) a partir de tejidos recientes o de tejidos que se habfan secado por congelacion o secado al vado a temperatura ambiente y se radiaron a una de las tres dosis. Las biopsias se procesaron, y se cuantifico la actividad metabolica midiendo la absorbancia de las muestras a 550 nm utilizando un TECAN GENios plate reader (TECAN US, Durham, NC). La actividad metabolica se normalizo respecto a los tejidos de control recien preparados. Como se muestra en la Figura 11, se redujo la actividad metabolica hasta un 90% utilizando una combinacion de secado y radiacion. Lo que coincide con la reduccion observada previamente en la actividad metabolica que se observaba en los tejidos irradiados (Ejemplo 2).

Analisis de la funcion de barrera del tejido: La funcion de barrera se llevo a cabo en espedmenes con forma de hueso de perro ASTM que se cortaron de los tejidos de piel creados por ingeniena que estaban secados al vado o por congelacion y expuestos a una de las tres dosis de radiacion (1, 5, o 25 kGy). Los espedmenes se recolectaron con un troquel y se envasaron individualmente antes del almacenamiento o la irradiacion.

Los espedmenes con forma de hueso de perro se retiraron de su envase, se rehidrataron, y se ensayaron en cuanto a su funcion de barrera. En resumen, los espedmenes se coloraron con la parte epidermica en las inserciones TRANSWELL, colocadas en placas con 10 ml de medio y se permitio que se rehidrataran (a partir del fondo hacia arriba) durante 1 h a temperatura ambiente. Las inserciones TRANSWELL se transfirieron a papeles de filtro humedecidos y se dejo que se equilibraran durante 45 min. La funcion de barrera epidermica en las regiones de enganche de cada especimen se cuantificaba midiendo la capacitancia electrica de superficie de las superficie del tejido con un medidor NOVA Dermaphase (NOVA Technology Corp, Portsmouth, NH), que se utiliza clmicamente para evaluar la funcion de barrera epidermica. Los cambios en las mediciones de impedancia durante un periodo de medicion de 10 segundos reflejan los cambios en el estado de hidratacion de la superficie del tejido. Debido a que el aumento de hidratacion resulta del pasaje de agua a traves del estrato corneo, la magnitud del cambio refleja la integridad de la permeabilidad de la barrera epidermica. Basandose en los datos de la funcion de barrera recolectados de mas de 80 lotes del tejido de StrataGraft®, las lecturas iniciales de < 294 DPM y los cambios de menos de 658 DPM unidades se consideraban como una funcion de barrera aceptable.

Como se muestra en la Figura 12, el cambio de la impedancia electrica de la superficie del tejido y las lecturas de DPM iniciales eran similares para los tejidos secados irradiados y para los tejidos de piel creados por ingeniena preparados recientemente. Tanto los tejido preparados recientemente como los secados irradiados consegrnan una funcion de barrera epidermica que se consideraba aceptable de acuerdo con los datos historicos recopilados en el tejido de piel StrataGraft®. Basandose en estos resultados, se anticipaba que la radiacion del tejido de piel creado por ingeniena no produda efectos adversos sobre la funcion de barrera el producto resultante.

Analisis de la fuerza de tension - Despues del ensayo de barrera epidermica, cada especimen se sumergio en 10 ml de PBS y se permitio que se rehidratara durante al menos 1 hora adicional. A continuacion de la rehidratacion, se midio el espesor del especimen en la region medible utilizando un calibre de grosor Mitutoyo. Se tiro entonces de los espedmenes extensibles hasta la rotura por tension uniaxial con una tasa el 100%/min (25 mm/min), con la hidratacion del especimen mantenida por recirculacion de PBS. Los datos de carga y desplazamiento de cada experimento se exportaron a Microsoft Excel para el analisis y recopilacion de datos. Los datos de estos analisis se presentan en la Figura 13.

El secado y radiacion de los equivalentes de piel creados por ingeniena daba como resultado efectos variables en las propiedades mecanicas de los tejidos. El analisis de los resultados del ensayo mecanico era complicado por la alta variabilidad entre los espedmenes de tejido, sin embargo se observaban algunas fuertes tendencias. Los tejidos

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secados, independientemente del metodo de secado o dosis de irradiacion, son incapaces de volver a tener su espesor completo de antes del secado tras la re-hidratacion, lo que resulta en espedmenes significativamente mas finos en comparacion con los controles recientes. En cuanto a la histologfa, esta reduccion parece que ocurre principalmente en la capa dermica, manteniendose el espesor epidermico relativamente constante. Tambien hay una fuerte tendencia en el secado a dar como resultado un tejido mas ngido y quebradizo, anadiendo la irradiacion a este efecto. Esto se puede ver por el incremento del modulo inicial, asf como por la reduccion del alargamiento hasta la ruptura. Aunque algunos de los valores en los modulos se pueden atribuir a la reduccion de grosor (aumento de la tension medida para un determinado aumento de la carga), las diferencias de grosor no se tienen en cuenta completamente para diferenciar los grupos.

El grado de variabilidad en los resultados hace diffcil discernir los efectos adicionales con certeza estadfstica. La fuerza de tension media no pareda estar afectada adversamente por el secado o la irradiacion hasta 25 kGy; sin embargo la irradiacion pudo haber causado un ligero, pero insignificante estadfsticamente, descenso en el pico de carga.

Analisis del peptido antimicrobiano: Los peptidos derivados de hCAP18 de los equivalentes de piel creados por ingeniena se cuantificaron utilizando una kit de deteccion ELISA disponible en el mercado. Los extractos solubles se prepararon aplicando topicamente medio de cultivo libre de suero en la superficie de los tejidos recientes o conservados (0,16 ml de medio libre de suero por cm2), y equilibrando los tejidos durante 2 h a 37 °C. Los extractos se utilizaron en un ELISA que detecta la protema hCAp18 intacta y los metabolitos LL37 procesados post- traduccionalmente. Las muestras se cuantificaron con respecto a una curva de referencia de peptido LL37 y los niveles de protema hCAP18 se expresaron como ng de protema por ml de extracto tisular.

Como se muestra en la Tabla 2, los tejidos secados por congelacion y secados al vado presentaban niveles de peptido derivado de hCAP18 extrafbles mayores del 75% de los que se obteman de los tejidos de piel creados por ingeniena preparados recientemente.

Tabla 2. Cuantificacion de Peptidos derivados de hCAP18 en equivalentes de piel creados por ingeniena irradiados secos. Los valores se presentan como la media de concentracion ± la desviacion estandar de la protema inmunorreactiva en extractos de tejidos de dos tejidos independientes.

Grupo de Tratamiento: Protema hCAP18 (ng/ml)

EG111008 Reciente: 97,4 ± 14

EG111008 Secado por congelacion 0 kGy: 73,1 ± 4,8

EG111008 Secado por congelacion 1 kGy: 183 ± 4,8

EG111008 Secado por congelacion 5 kGy: 179 ± 2,0

EG111008 Secado por congelacion 25 kGy: 120 ± 3,2

EG111008 Secado al vado 0 kGy: 122 ± 10

EG111008 Secado al vado 1 kGy: 120 ± 15

EG111008 Secado al vado 5 kGy: 77,7 ± 3,4

EG111008 Secado al vado 25 kGy: 66,8 ± 7,0

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la memoria descriptiva anterior se incorporan en el presente documento por referencia. Seran evidentes distintas modificaciones y variaciones del metodo descrito y sistema de la invencion para los expertos en la tecnica sin alejarse del alcance y espmitu de la invencion. Aunque la invencion se ha descrito en conexion con realizaciones preferidas espedficas, se debena entender que la invencion reivindicada no se debena limitar indebidamente a dichas realizaciones espedficas. Ademas, se tiene la intencion de que distintas modificaciones de los modos descritos de llevar a cabo la invencion que sean obvias para los expertos en cultivos tisulares, biologfa molecular, bioqmmica, o campos relacionados esten dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para conservar un equivalente de piel cultivado organotipicamente para su uso como un vendaje de heridas que comprende:

proporcionar dicho equivalente de piel cultivado organotipicamente que comprende celulas NIKS y un envase; tratar dicho equivalente de piel con radiacion a una dosis de 5 kGy a 25 kGy de radiacion gamma y secarlo para eliminar la viabilidad celular en el equivalente de piel; y

envasar dicho equivalente de piel para proporcionar un equivalente de piel envasado.
2. El metodo de la Reivindicacion 1, donde dicha etapa de tratamiento comprende la irradiacion de dicho equivalente de piel de manera que dicho equivalente de piel se vuelve esteril y no viable.
3. El metodo de la Reivindicacion 1, donde dicha etapa de tratamiento comprende el secado de dicho equivalente de piel en condiciones tales que las celulas de dicho equivalente de piel se vuelven no viables, donde dicho equivalente de piel se seca hasta un peso final de menos del 50% de un equivalente de piel humedo.
4. El metodo de la Reivindicacion 1, donde dicho tratamiento comprende el secado de dicho equivalente de piel en condiciones tales que las celulas que producen dicho equivalente de piel se vuelven no viables e irradiando dicho equivalente de piel en condiciones tales que el equivalente de piel se vuelve esteril.
5. El metodo de la Reivindicacion 1, donde dichas celulas NIKS comprenden una secuencia de acido nucleico exogeno que codifica un polipeptido antimicrobiano.
6. El metodo de la Reivindicacion 3, donde dicho equivalente de piel, tras la rehidratacion, tiene un valor inicial de DPM de desde 20 a 300, y un valor de cambio de DPM de desde 5 a 400 y una fuerza de tension de desde 0,1 a 5,0 MPa.
7. Un equivalente de piel humana envasado producido por el metodo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6.
8. Una composicion que comprende un equivalente de piel humana, no viable, aislado in vitro como se desvela en la reivindicacion 7, donde dicho equivalente de piel comprende celulas NIKS y tiene un peso de menos del 50% del peso de un equivalente de piel humedo.
9. La composicion de la Reivindicacion 8, donde dichas celulas NIKS comprenden una secuencia de acido nucleico exogeno que codifica un polipeptido exogeno.
10. La composicion de la Reivindicacion 9, donde dicho polipeptido exogeno es un polipeptido antimicrobiano.
11. La composicion de cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 10, donde dicho equivalente de piel, tras la rehidratacion, tiene un valor inicial de DPM de desde 20 a 300, y un valor de cambio de DPM de desde 5 a 400 y una fuerza de tension de desde 0,1 a 5,0 MPa.
12. La composicion de cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 11 para su uso en el tratamiento de un sujeto.
13. La composicion de la Reivindicacion 12 para su uso en el tratamiento de una herida.
14. La composicion de la Reivindicacion 13, donde dicho equivalente de piel se utiliza para tratar dicha herida temporalmente.