JP5632383B2 - 即時使用のための乾燥され、放射線照射された皮膚同等物 - Google Patents
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Description
本出願は、その内容が参照によって本明細書全体に援用される、米国仮出願第61/111,153号(出願日:2008年11月4日)の利益を主張する。
本発明は、一般的に、器官培養によって製作された皮膚同等物を、冷蔵温度又は周囲温度において長期保存する系及び方法に関する。
組織工学(TE)の先端分野は、今後10年において、臓器の疾患及び機能不全の処置を著しく進歩させる準備が整っている。2001年に、米国及び欧州の市場について承認された細胞に基づく治療法が23あった。そのうちの9つは、皮膚代用物又は皮膚移植片であり、100を超える製品が、開発中であった(De Bree, Genomics-based Drug Data Report and Regenerative Therapy (1) 2:77-96 (2001))。2007年には、人工組織、細胞に基づく治療法、又は関連技術の開発に、ほぼ100の会社が関与していた(Applied Data Research, February 2007)。全体としては、この産業は、1995〜2001年において16%の年間成長率を有していた。「構造」産業部門(例えば、皮膚、骨、軟骨)は、1998〜2001年において85%の成長を示した。2004年に、組織から構築された皮膚代替物/代用物、及び創傷を修復する活性な調整物にとっての米国市場は、約1億9500万ドルと評価された。売上高は、9.5%の複利年率において増加し、2014年には約4億8100億ドルに達すると予想される(MedTech Insight, Windhover Information, September 2005)。創傷の手当てに関する先端技術の全米市場は、2005年において23億ドルを超えていた。これは、5年間にわたって12.3%の平均年間成長率において成長し、2011年に46億ドルに達すると予測されてきた(BCC Research, PHM011E, January 2007)。創傷の手当ての世界市場は、2006年に72億米ドルであると見積もられ、2つの部門(従来部門及び先端部門)から構成される(Espicom Business Intelligence, 2007)。創傷の手当てに関する従来の用品は、主に、織布のスポンジ、不織布のスポンジ、付着性の包帯、及び非付着性の包帯のような、低技術なガーゼに基づく被覆材からなる。創傷の手当てに関する先端部門(世界で41億米ドル)は、年に10%の2桁成長をともなった、最も急成長している分野である(Espicom Business Intelligence, 2007)。
本発明は、一般的に、器官培養によって製作された皮膚同等物を、冷蔵温度又は周囲温度において長期保存する系及び方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、創傷被覆物としての使用のための器官培養されている皮膚同等物を保存する方法を提供する。ここで当該方法は、上記器官培養されている皮膚同等物、及び包装容器を準備すること、上記皮膚同等物の処理を行って、上記皮膚同等物中の細胞を成育不能にすること、並びに上記皮膚同等物の包装を行って、包装されている皮膚同等物を準備することを包含している。本発明は、皮膚同等物を構成している細胞を成育不能にするための皮膚同等物の処理について、任意の特定の方法に限定されない。いくつかの実施形態において、上記処理の工程は、上記皮膚同等物を無菌状態及び成育不能にするための、上記皮膚同等物に対する放射線照射を包含している。いくつかの実施形態において、上記放射線照射はガンマ線照射を用いて行われる。いくつかの実施形態において、上記処理の工程は、上記皮膚同等物中の細胞を成育不能にする条件における上記皮膚同等物の乾燥を包含している。本発明は、乾燥について任意の特定の方法に限定されない。いくつかの実施形態において、上記乾燥は真空乾燥及び凍結乾燥からなる群から選択される方法によって行われる。本発明は、特に指定がなければ、工程の任意の特定の順序に限定されない。いくつかの実施形態において、上記処理は包装の前に行われる。いくつかの実施形態において、上記処理は包装の後に行われる。いくつかの実施形態において、上記処理は、上記皮膚同等物を構成している細胞を成育不能にする条件における上記皮膚同等物の乾燥、及び上記皮膚同等物を無菌状態にする条件における上記皮膚同等物に対する放射線照射を包含している。いくつかの実施形態において、上記乾燥の工程が上記包装の前に行われ、上記放射線照射の工程が上記包装の工程の後に行われる。
(図1)放射線照射後の組織の成育度。9F1組織及び2D2組織に放射線照射し、放射線照射後の3日、7日又は14日目にパンチ生検の試料を回収し、MTTアッセイを用いて成育度を評価した。データは、各処理グループにおける少なくとも3つの独立した生検試料から測定された、平均+/−標準偏差を示す。
本明細書に使用されるとき、「皮膚同等物」、「ヒト皮膚同等物」、「ヒト皮膚代用物」及び「器官培養物」という用語は、層状化して扁平上皮になっている、インビトロにおいて得られるケラチン生成細胞の培養物を指すために、交換可能に使用される。典型的に、皮膚同等物は、器官培養によって作製され、ケラチン生成細胞層に加えて真皮層を含んでいる。
本発明は、一般的に、器官培養によって作製された皮膚同等物の用意、発送及び保存のための系及び方法に関する。特に、本発明は、乾燥され、放射線照射されたヒトの皮膚同等物から皮膚同等物の成育能力を消失させる方法であって、成育能力の消失によって、当該皮膚同等物を長期間にわたって保存可能であり、病院における使用ではなく、野外又は発生現場における当該皮膚同等物の使用にとって標準的な条件において輸送し得る方法に関する。
本発明は、扁平上皮に分化可能な任意の特定の細胞供給源の使用に限定されない。実際に、本発明は、扁平上皮に分化可能な種々の細胞株及び供給源(初代ケラチン生成細胞及び不死化ケラチン生成細胞が挙げられる)の使用を意図している。細胞の供給源としては、ヒト及び死体ドナーから生体採取されたケラチン生成細胞及び真皮繊維芽細胞(いずれも参照によって本明細書に援用される、Auger et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal 36:96-103; 米国特許第5,968,546号及び米国特許第5,693,332号)、新生児包皮(参照によって本明細書に援用される、Asbill et al., Pharm. Research 17(9): 1092-97 (2000); Meana et al., Burns 24:621-30 (1998); 米国特許第4,485,096号、米国特許第6,039,760号、及び米国特許第5,536,656号)、並びにNM1細胞(Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol. 23(3):205-213 (1987))、HaCaT細胞(Boucamp et al., J. cell. Boil. 106:761-771 (1988))及びNIKS細胞(細胞株BC-1-Ep/SL;参照によって本明細書に援用される、米国特許第5,989,837号;ATCC CRL-12191)のような不死化されたケラチン生成細胞株が挙げられる。これらの各細胞株は、所望のタンパク質の発現又は共発現が可能な細胞株を作製するために、培養され得るか、又は遺伝子組換えされ得る。特に好ましい実施形態において、NIKS細胞が使用される。新規なヒトケラチン生成細胞株(近二倍体の不死化ケラチン生成細胞(near-diploid immortalized keratinocytes)又はNIKS)の発見は、非ウイルスベクターを用いてヒトケラチン生成細胞を遺伝子改変する機会を提供する。NIKS細胞に特有の利点は、それらが、遺伝的に均一であり、病原体がないヒトケラチン生成細胞の定常的な供給源であることである。このため、現在利用できる技術及び皮膚組織製品よりも向上された特性を有している皮膚同等物の培養物を提供するための、遺伝子工学及びゲノム遺伝子発現方法の適用において、NIKS細胞に特有な利点は有用である。NIKSケラチン生成細胞株(ウィスコンシン大学において同定され、特性が調べられている)は、非腫瘍原性であり、安定な核型を示し、単層培養及び器官培養のいずれにおいても正常な増殖及び分化を示す。NIKS細胞は、培養において完全に層状化された皮膚同等物を形成する。これらの培養物は、これまでに調べられている全ての基準において、初代ヒトケラチン生成細胞から形成された器官培養物から区別できない。しかし、不死化されたNIKS細胞は、初代細胞と異なり、単層培養において無制限に増殖し続ける。これは、細胞を遺伝的に処理し、新たな有用な特性を有している新たな細胞のクローンを単離する機会を提供する(Allen-Hoffmann et al., J. Invest. Dermatol., 114(3): 444-455 (2000))。
好ましい実施形態において、実施例1に記載されているように作製された皮膚同等物は、成育不能な皮膚同等物を提供するために、放射線照射されるか、及び/又は乾燥される。いくつかの実施形態において、皮膚同等物は細胞の成育可能性を排除するために乾燥される。いくつかの実施形態において、皮膚同等物は例えばガンマ線照射される。いくつかの実施形態において、皮膚同等物は約0.5kGyから約25kGyのガンマ線に曝される。いくつかの実施形態において、皮膚同等物は約0.5kGyから約12kGyの放射線、より好ましくは約1kGyから約5kGyのガンマ線に曝される。何れかの場合においても、皮膚同等物に送達される放射線の総量は、皮膚同等物に含まれている細胞が、MTT成育度アッセイ又は他の適当な成育度アッセイによってアッセイされる場合に、成育不能にするために十分であることが好ましい。さらに好ましい実施形態において、皮膚同等物は真空又は凍結乾燥の条件において乾燥される。いくつかの実施形態において、皮膚同等物は放射線照射される前に乾燥される。いくつかの好ましい実施形態において、皮膚同等物は乾燥又は放射線照射の前に無菌の容器に包装される。さらに好ましい形態において、皮膚同等物は、保存、輸送、及び末端使用者による容易な使用を可能にするため、ガーゼのような無菌の布地を用いて包装されている。他の実施形態において、乾燥されたか、又は放射線照射された皮膚同等物は、創傷に接触させた後に、創傷の表面に対する外来性のポリペプチドの放出能を保持している。さらなる実施形態において、乾燥されたか、又は放射線照射された皮膚同等物は、創傷の周囲に接触させた後に、創傷に対する外来性のポリペプチドの放出能を保持している。さらなる実施形態において、皮膚同等物は使用前に冷蔵される。一方、他の実施形態において、皮膚同等物は使用前に周囲温度において保存される。
本発明の成育不能な皮膚同等物は治療的に使用され得ることが意図されている。いくつかの実施形態において、乾燥又は放射線照射された皮膚は、創傷閉鎖及び熱傷に対する処置の用途に用いられる。熱傷に対する処置及び創傷閉鎖のための自己移植及び同種異系移植の利用について、それぞれ参照によって本明細書に援用される、Myers et al., A. J. Surg. 170(1):75-83 (1995)及び米国特許第5,693,332号、米国特許第5,658,331号、及び米国特許第6,039,760号に記載されている。いくつかの実施形態において、皮膚同等物はDERMAGRAFT又はINTEGRAのような真皮代用物と共に用いられ得る。したがって、本発明は、創傷(熱傷によって生じた創傷が挙げられる)の閉鎖の方法であって、創傷を受けている患者及び皮膚同等物を準備すること、並びに創傷が閉鎖されるような状況下において皮膚同等物によって患者を処置することを包含している方法を提供する。
下記の実施例は、本発明の好ましい特定の実施形態及び側面を説明し、さらに例証するために設けられているが、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
本実施例は、皮膚同等物の作製方法を示す。
放射線を受けている皮膚同等物を構築する作製スケジュールは、人工のヒト皮膚組織作製物のためにこれまでに確立されている28日目の作製工程を基にした。9F1組織及び2D2組織を、無菌手順を用いて作製した。上記9F1組織は、宿主防御ペプチドであるhBD−3の発現の向上のために改変されており、上記2D2組織は、宿主防御ペプチドであるhCAP18/LL−37の発現の向上のために改変されている。組織を、栄養性のゲルの容器上に移し、梱包及び輸送の前に密封した。ノースカロライナ州のシャーロットの施設において、ExCell高精度ガンマ線照射器を用いて、Sterigenics, Incによって、ガンマ線照射を行った。組織は、5つの放射線量:0kGy、1kGy、5kGy、8kGy、及び11kGyのうち、1つの放射線量を受けた。これらの線量は、組織の同種移植片に対する同様の線量に関するこれまでの評価に基づいて選択した。放射線照射後に、以下に示されている時点における分析に先立って、組織を冷却した。
冷蔵保存後の3日目の放射線照射された組織の構造的特性を、ヘマトキシリン及びエオシンを用いた組織染色よって評価し、光学顕微鏡を用いて可視化した。組織染色によって、放射線照射された組織は、正常な組織構造及び外部形態を維持していることが証明された。全ての細胞層(真皮、ケラチン生成細胞の基底層、ケラチン生成細胞の有棘層、及び角質層が挙げられる)が、放射線照射されていない対照と放射線照射された組織との間において同一であったが、いくらかの組織の損傷が高放射線量において明らかであり、当該損傷が真皮部分と上皮部分との隙間として可視化された。結果として、1kGy及び5kGyの線量レベルが、以降の実験における使用に最も有望であると確認された。
ガンマ線は、線量に依存したタンパク質に対する損傷を、直接的及び間接的に刺激する。直接的な損傷はイオン化を通して惹起される。一方、間接的な損傷は、水分子の加水分解、並びに巨大分子の酸化的修飾又は架橋に伴って生じる。結果として、組織のタンパク質は、放射線照射によって、変質の増進及び溶解度の低下を示し得る。開発した作製物は、上昇したレベルの宿主防御ペプチドの供給を通じて機能することが予想されるため、放射線照射後のタンパク質の利用可能性及び生物学的な活性を決定することが必要である。放射線照射された組織の分析に、可溶性タンパク質及び総タンパク質の量の分析、イムノブロット分析、並びに抗菌活性のアッセイを含めた。
栄養性のゲル上に保存されている放射線照射された9F1組織及び2D2組織の、短期間の保存能の分析を行った。これらの実験において、放射線照射後の7日目及び37日目に、冷蔵された放射線照射された組織を分析し、組織構造及び抗菌ペプチド活性を評価するか、またはアッセイした。放射線照射された組織の全体的な組織構造は、冷蔵保存されていた37日間にわたって維持されていた。試験された線量レベルにおいて、冷蔵された組織は、真皮部分及び上皮部分の両方を維持していた。上皮部分において、ケラチン生成細胞の基底層及び有棘層は識別可能な状態を維持しており、角化層はほとんど変化していない。組織内における最小の細胞の損傷が、基底層のケラチン生成細胞と基底上層のケラチン生成細胞との細胞間隙として現われている。組織の保存は、真皮部分と上皮部分との部分的な分離を生じる。しかし、これは試験した全ての期間における組織に認められた。
上記の実施例2において処理された組織は、下にある支持膜から分離して、組織の折り重なり及びしわを生じることが認められた。この現象を回避するために、組織の移動を防ぐ包装構成を開発した。この改良された構成では、組織をそれらの挿入物から取り外し、無菌の非付着性のガーゼ上に移し、無菌のプラスチック製の袋に密封した。プラスチック製の袋から取り出した後、組織はしわになった形跡又は折り重なった形跡を示さなかった。
人工皮膚同等物を、実施例1に記載したように作製する。完成直後に、皮膚同等物を含んでいるTRANSWELL挿入物を、プラスチック製のTRANSWELLディッシュに無菌的に移し、蓋を被せ、20℃に保たれたVIRTIS Genesis Freeze Dryer(Gardiner、NY)チャンバーのたなの上に置く。2100mTの圧力において、1分当たり−1.33℃の割合において、20℃から−20℃まで温度を下げ、2100mTの圧力において、1分当たり−0.67℃の割合において、−20℃から−60℃まで温度を下げることによって、組織を凍結させる。減圧によって0mTまで圧力を下げ、1分当たり+0.25℃の割合において、−60℃から20℃まで、組織を加温する。0mT、20℃において少なくとも16時間にわたって試料を保持することによって、試料を乾燥させる。
人工皮膚同等物を実施例1に記載したように作製する。皮膚同等物を含んでいるTRANSWELL挿入物を、プラスチック製のTRANSWELLディッシュに無菌的に移し、蓋を被せ、25℃に保たれたVIRTIS Genesis Freeze Dryer(Gardiner、NY)チャンバーのたなの上に置く。8分間の間隔を空けて、チャンバーの圧力を900mT、830mT、760mT、690mT、620mT、550mT、490mT、430mT、370mT、310mT、250mT、200mT、150mT、100mT、50mT、25mTに下げる。少なくとも16時間にわたって25mTにおいて試料を保持して、試料を乾燥させる。
人工皮膚同等物を作製し、組織の湿重量を凍結乾燥の前後において得る。凍結乾燥後の組織の重量は、元の湿潤な組織の重量の11.7%から13.7%の間である(表1)。
宿主防御ペプチドhCAP18/LL−37を過剰発現するように構築された皮膚同等物組織を実施例1に記載したように作製し、実施例7及び実施例8に記載したように乾燥させる。乾燥後、組織をTRANSWELL挿入物から取り外し、無菌のプラスチック製の袋の中にヒートシールする。実施例2に記載したように、Sterigenicsにおいて、1、5又は25kGyの線量レベルにおいて、乾燥させた組織に放射線照射し、その後、最大2ヶ月間にわたって室温において組織を保存する。ヘマトキシリン及びエオシンを用いた組織切片の染色によって、全体的な組織構造を評価する。実施例2に記載したように、MTTアッセイによって、組織の成育度を評価する。乾燥させ、放射線照射された組織において、インピーダンスメータによる測定を用いて、組織のバリア機能を評価する。乾燥させ放射線照射された組織から得られた試料を、単軸引張りの条件において破損するまで引っ張り、機械的特性を測定した。抗菌ペプチドの量を、乾燥させ放射線照射された組織から得られた可溶性の抽出物のELISAによって定量した。
Claims (32)
- 創傷被覆物としての使用のための器官培養されている皮膚同等物を保存する方法であって、
層状化して扁平上皮になっているケラチン生成細胞を含んでおり、上記器官培養されている皮膚同等物、及び包装容器を準備すること、
上記皮膚同等物を構成している細胞を成育不能にする条件において上記皮膚同等物を凍結乾燥させること、及び上記皮膚同等物を無菌状態にする条件において上記皮膚同等物に対して放射線照射することによって、上記皮膚同等物の処理を行って、上記皮膚同等物中の細胞の成育能力を消失させること、並びに
上記皮膚同等物の包装を行って、包装されている皮膚同等物を準備することを包含している、方法。 - 上記放射線照射はガンマ線照射を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 上記処理は包装の前に行われる、請求項1に記載の方法。
- 上記処理は包装の後に行われる、請求項1に記載の方法。
- 上記乾燥の工程が上記包装の前に行われ、上記放射線照射の工程が上記包装の工程の後に行われる、請求項1に記載の方法。
- 上記器官培養された皮膚同等物はNIKS細胞を含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 上記NIKS細胞は抗菌ポリペプチドをコードしている外来性の核酸配列を含んでいる、請求項6に記載の方法。
- 上記抗菌ポリペプチドは、ヒトβ−ディフェンシン1、ヒトβ−ディフェンシン2、ヒトβ−ディフェンシン3及びカテリシジンからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 上記抗菌ポリペプチドは、表面抽出溶液の1ミリリットル当たり10から500ngの抗菌ポリペプチドの量として供給されている、請求項7に記載の方法。
- 上記皮膚同等物が湿潤な皮膚同等物の50%未満の最終的な重量まで乾燥させられる、請求項1に記載の方法。
- 再び湿潤状態になった後の上記皮膚同等物は、20から300の初期のDPM値、及び5から400の変化するDPM値を有している、請求項1に記載の方法。
- 再び湿潤状態になった後の上記皮膚同等物は0.1から5.0MPaの引張り強度を有している、請求項1に記載の方法。
- 上記包装容器はヒートシール可能である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって作製されている、包装されているヒト皮膚同等物。
- 請求項1に記載の方法によって作製されている、包装されている無菌のヒト皮膚同等物。
- 層状化して扁平上皮になっているケラチン生成細胞を含んでおり、単離されている成育不能なインビトロのヒト皮膚同等物であって、上記ケラチン生成細胞は凍結乾燥されて、成育能力を消失しており、且つ上記ケラチン生成細胞は放射線照射されているヒト皮膚同等物を含んでいる、組成物。
- 上記皮膚同等物は無菌である、請求項16に記載の組成物。
- 皮膚同等物は湿潤な皮膚同等物の重量の50%未満の重量を有している、請求項16に記載の組成物。
- 上記皮膚同等物はNIKS細胞を含んでいる、請求項16に記載の組成物。
- 上記NIKS細胞は、外来性のポリペプチドをコードしている外来性の核酸配列を含んでいる、請求項19に記載の組成物。
- 上記外来性のポリペプチドは抗菌ポリペプチドである、請求項20に記載の組成物。
- 上記抗菌ポリペプチドは、ヒトβ−ディフェンシン1、ヒトβ−ディフェンシン2、ヒトβ−ディフェンシン3、カテリシジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 上記抗菌ポリペプチドは、表面抽出溶液の1ミリリットル当たり10から500ngの抗菌ポリペプチドの量として供給されている、請求項22に記載の組成物。
- 再び湿潤状態になった後の上記皮膚同等物は、20から300の初期のDPM値、及び5から400の変化するDPM値を有している、請求項18に記載の組成物。
- 再び湿潤状態になった後の上記皮膚同等物は、0.1から5.0MPaの引張り強度を有している、請求項18に記載の組成物。
- 包装されている、請求項16に記載の組成物。
- 創傷を処置するために、上記皮膚同等物が当該創傷に接触する条件において、上記皮膚同等物が当該創傷に対して使用される、請求項16に記載の組成物。
- 上記皮膚同等物は上記創傷に一時的に使用される、請求項27に記載の組成物。
- 請求項16に記載の皮膚同等物を収納している包装容器を含んでいる、キット。
- 上記皮膚同等物は1ヶ月から6ヶ月の保存期間を有している、請求項29に記載のキット。
- インビトロにおいて器官培養されており、単離されている成育不能な皮膚同等物を含んでいる組成物であって、当該皮膚同等物は湿潤な皮膚同等物の重量の50%未満の重量を有しており、
上記皮膚同等物は層状化して扁平上皮になっているケラチン生成細胞を含んでおり、上記ケラチン生成細胞は凍結乾燥されて、成育能力を消失しており、且つ上記ケラチン生成細胞は放射線照射されている、組成物。 - 上記皮膚同等物は、上記皮膚同等物に必須の細胞によって発現される少なくとも1つの外来性の抗菌ポリペプチドを含んでいる、請求項31に記載の組成物。
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