ES2617081A1 - Procedimiento para la producción de dha - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un cultivo para la producción de DHA que comprende al menos un alga productora de DHA de la clase de los Laberintulidos, y que comprende en proporciones específicas al menos una fuente de carbono, al menos un extracto de levadura y una o más fuentes secundarias de nitrógeno. La presente invención también se dirige a un proceso de fermentación que utiliza dicho cultivo y a los productos de fermentación obtenidos.
Description
- •
- La aireación debe ser lo suficientemente elevada como para alcanzar una buena producción de biomasa sin provocar todavía excesiva producción de DHA. Valores típico se encuentran entre 1 y 5 L/min, preferiblemente entre 2 y 4 L/min.
- •
- Volumen del reactor: El volumen del primer reactor puede estar comprendido entre
5 un 5% y un 25%, preferiblemente entre el 10% y el 20% del volumen total del sistema.
• Conviene que la tasa de dilución sea tan alta como sea posible, para establecer una elevada tasa de crecimiento. Esto repercutirá en la productividad final de DHA. Se puede trabajar entre: 0,0211 a 0,070 h-1. La óptima sería entre 0,050 y 0,060 h-1 .
10 Por lo tanto, todas las condiciones están encaminadas a maximizar la producción de biomasa, y el experto en la materia puede aplicar distintas variaciones dependiendo de las circunstancias de cada caso. En la segunda fase se busca la máxima producción de DHA, aumentando su contenido en las células que se han producido en la primera fase. Para ello se busca un tiempo de
15 residencia adecuado para acumular cantidades significativas de DHA. Esto se puede conseguir, por ejemplo, reduciendo la tasa de dilución e incrementando así el volumen en la segunda fase, lo cual se puede hacer en un único tanque si es suficientemente grande, o en varios tanques. De esta forma se provoca una mayor residencia de las células en esta fase. La dilución en esta segunda fase se establece preferentemente entre 0,0001h-1 y 0,0100h-1 ,
20 preferiblemente entre 0,001h-1 y 0,010h-1 . El volumen total en el o los tanques de esta segunda fase está pues preferiblemente comprendido entre el 75% y el 95%, preferiblemente entre el 80% y 90%, del volumen total del sistema. Condiciones que típicamente estimulan la producción de DHA son una o más de las siguientes:
• Modulación de la concentración de la fuente de carbono. Los inventores han
25 encontrado que una concentración de glicerol menor que en la primera etapa, por ejemplo de entre 0,1 y 8 g/L, estimula de forma sorprendente la acumulación de ácidos grasos, un efecto que hasta el momento no se había observado en la literatura. Así, por ejemplo, se comprobó que al finalizar un cultivo, la adición de una pequeña cantidad de glicerol (hasta los 5g/l) aumento el rendimiento un 30%.
30 • Esta reducción en la concentración de la fuente de carbono puede venir acompañada de una menor temperatura a la utilizada en la primera fase, por ejemplo entre 1020°C. En WO 2004/083442 se describe un proceso de fermentación en dos etapas en donde la segunda etapa comprende bajar la temperatura a 10°C, pero no se describe el efecto de la reducción de la concentración de la fuente de carbono.
35 • Una menor agitación, por ejemplo, entre 200 rpm y 500 rpm, o superior a 350 rpm para garantizar una buena disponibilidad de oxígeno.
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- •
- Una menor aireación, por ejemplo entre 0,1 y 1 g/min para estimular la producción de DHA de forma casi exclusiva.
- •
- Concentración nula o despreciable de la fuente de nitrógeno.
- •
- Al mismo tiempo, las condiciones de esta segunda fase pueden ser tales que provocan el estrés necesario como para provocar la generación de pigmentos en presencia de las cantidades adecuadas de glutamato. Estas condiciones implican por lo general baja disponibilidad de oxígeno y de temperaturas bajas.
Por tanto, los investigadores han encontrado que la combinación de una primera temperatura más elevada en la primera fase con una temperatura menor en la segunda, eleva la eficiencia en la producción de DHA de una forma sorprendente. En el estado de la técnica ya se había observado que una menor temperatura favorece la producción de DHA
(Y. Taoka et al., Effects of cold shock treatment on total lipid content and fatty acid composition of Aurantiochytrium limacinum strain mh0186., J. Oleo Sci. 60, 217–20 (2011)). No obstante, el crecimiento de la biomasa resultó ser tan bajo, que la productividad final hacía el proceso inviable para la escala industrial. Se intentó por otro lado un choque térmico, es decir, almacenar la biomasa a temperaturas bajas después de una fermentación a mayor temperatura, sin obtener un incremento en la cantidad de DHA producido. Por otro lado, la presencia en bajas concentraciones de la fuente de carbono en la segunda fase (bien porque se adiciona o porque proviene de la primera fase) permite que los rendimientos de DHA aumenten alrededor de entre un 5% y un 15%. El proceso de la invención puede comprender una tercera fase en la que se almacena el cultivo a temperaturas menores de 10°C, preferiblemente menores de 7°C, en presencia de glicerol. Como ocurre con la temperatura, en el caso del oxígeno las condiciones para una mejor producción de DHA y biomasa, no convergen. Muchos trabajos, han identificado que cuando la disponibilidad de oxígeno se baja, aumenta la concentración de DHA. Por ejemplo, en la primera fase la concentración de oxígeno disuelto, puede ser tan alta como sea posible, por ejemplo puede estar entre el 2 y el 70%, preferiblemente a más del 20%, mientras que puede bajar a menos del 2% durante la segunda fase. Hay que añadir que si se combinan temperaturas de 15°C o menores, así como una baja disponibilidad de oxígeno, por ejemplo de entre un 0,5 y el 20 %, preferiblemente entre el 1 y el 10 %, se generan los pigmentos con capacidad antioxidante anteriormente mencionados. Este fenómeno es importante, pues protege los DHA en el momento de la extracción. Por tanto, el proceso de la invención puede ser un proceso continuo en donde la primera fase tiene lugar a una temperatura y concentración de oxígeno mayores que en segunda fase, y la segunda fase tiene lugar en presencia de una concentración de glutamato mayor de 10 mM. Alternativamente, la primera fase tiene lugar a una temperatura de entre 20°C y 35°C,
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de cultivo está comprendida entre 0,007 y 0,6; a una temperatura mayor de 20°C y una concentración de oxígeno mayor del 20%; y
- (ii)
- durante una segunda fase a una temperatura menor de 20°C, en presencia de una concentración menor de oxígeno del 20% y una concentración de glutamato mayor de 10 mM. Preferiblemente, el producto de fermentación tiene una concentración de dichos pigmentos, como por ejemplo Astaxantina, superior a 20 µg de pigmento por g de biomasa, preferiblemente mayor de 30 µg de pigmento por g de biomasa. Típicamente, la concentración del pigmento se encuentran entre 20 y 300 µg de pigmento por g de biomasa. Estas elevadas concentraciones de pigmento se obtienen directamente del proceso de fermentación sin necesidad de adición externa, y cuyas propiedades antioxidantes durante el proceso de fermentación y la posterior manipulación, permiten obtener más fácilmente un DHA de mayor pureza. Estas composiciones que comprende DHA y al menos un pigmento, preferiblemente un tetraterpeno, en concentraciones superiores a 20 µg de pigmento por g de biomasa constituyen también un aspecto de la presente invención, como también lo es una composición que comprende DHA y al menos un pigmento, preferiblemente un tetraterpeno, en donde dicha composición es obtenible por un procedimiento que comprende cultivar un cultivo que comprende al menos un alga productora de DHA de la clase de los Laberintulidos:
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- durante una primera fase en presencia de al menos una fuente de carbono, al menos un extracto de levadura y una o más fuentes secundarias de nitrógeno seleccionadas del grupo que consiste en triptona, licor de maíz fermentado, peptona y casaminoácido, caracterizado porque la proporción en el cultivo entre la concentración de la suma de fuentes secundarias de nitrógeno en gramos por litro de cultivo y la concentración de la fuente de carbono en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,005 y 0,4, y la proporción entre la concentración del extracto de levadura en gramos por litro de cultivo y la concentración de la fuente de carbono en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,008 y 1, y en donde la proporción entre la concentración de la suma de fuentes secundarias de nitrógeno en gramos por litro de cultivo y la concentración del extracto de levadura en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,007 y 0,6; a una temperatura mayor de 20°C y una concentración de oxígeno mayor del 20%;
- (ii)
- durante una segunda fase a una temperatura menor de 20°C, en presencia de una concentración de oxígeno menor del 20% y una concentración de glutamato mayor de 10 mM;
(iii) extraer de la biomasa resultante al menos los lípidos y pigmentos resultantes.
Por otra parte, la invención no está limitada a las realizaciones concretas que se han descrito sino abarca también, por ejemplo, las variantes que pueden ser realizadas por el experto medio en la materia (por ejemplo, en cuanto a la elección de materiales, dimensiones, componentes, configuración, etc.), dentro de lo que se desprende de las
5 reivindicaciones.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos muestran la eficacia y las mejoras de un cultivo de acuerdo con la presente invención frente a un cultivo preparado de acuerdo con el estado de la técnica
10 (Medio estándar). Los cultivos se prepararon de acuerdo con las composiciones indicadas abajo en la Tabla 1.
- Componente
- Concentración Componente Concentración
- KH2PO4
- 0.85 g/L Na2EDTA·2H2O 0.20 mM
- NaOH
- 0.14 g/L H3BO3 1 mM
- NaCl
- 18 g/L MnSO4·H2O 0.097 mM
- CaCl2
- 0.19 g/L ZnSO4·7H2O 7 µM
- MgSO4
- 0.1 g/L FeSO4·7H2O 0.83 mg/L
- Extracto de levadura
- 2.3·(C/10) Medio de la presente invención
- Triptona
- 0.4·(C/10)
- Fuente de carbono
- Valor de C entre 10 g/L y 100 g/L
- Componente
- Concentración Componente Concentración
- Tris
- 1 g/L Na2EDTA·2H2O 0.20 mM
- CH3COONH4
- 1 g/L H3BO3 1 mM
- NaCl
- 18 g/L MnSO4·H2O 0.097 mM
- MgSO4·7H2O
- 2.5 g/L ZnSO4·7H2O 7 µM
- CaCl2
- 0.3 g/L CoCl2·6H2O 2 µm
- KCl
- 0.6 g/L FeSO4·7H2O 0.83 mg/L
- NaNO3
- 1 g/L FeCl3·6H2O 0.018 mM
- NH4Cl
- 0.03 g/L Medio estándar
- KH2PO4
- 0.05 g/L
- Extracto de levadura
- 1 g/L
- Peptona
- 1 g/L
- Vitamina B12
- 0.15 µg/L
- Fuente de carbono
- Valor de C entre 10 g/L y 100 g/L
Tabla 1: composición de los cultivos
Tabla 2
* Indica cálculo aproximado de productividades en batch, para ser comparable al continuo (descrito en los siguientes parágrafos)
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Comparando estrategias de cultivo, se puede ver que el medio según la presente invención tiene un efecto positivo en las productividades también cuando se utiliza un sistema continuo, proporcionando los nutrientes necesarios para mantener un crecimiento sostenido, incluso en situaciones de elevada concentración de biomasa. Por otro lado, con el sistema multi-tanque se pueden incluso producir pigmentos y DHA de forma simultánea y sostenida. Además, el coste por litro de medio se reduce un 30%.
Aspectos y realizaciones de la invención pueden encontrarse en las siguientes cláusulas numeradas: Clausula 1: Cultivo para la producción de DHA que comprende al menos un alga productora de DHA de la clase de los Laberintulidos , al menos una fuente de carbono, al menos un extracto de levadura y una o más fuentes secundarias de nitrógeno seleccionadas del grupo que consiste en triptona, licor de maíz fermentado, peptona y casaminoácido, caracterizado porque la proporción entre la concentración de la suma de fuentes secundarias de nitrógeno en gramos por litro de cultivo y la concentración de la fuente de carbono en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,005 y 0,4, y la proporción entre la concentración del extracto de levadura en gramos por litro de cultivo y la concentración de la fuente de carbono en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,008 y 1, y en donde la proporción entre la concentración de la suma de fuentes secundarias de nitrógeno en gramos por litro de cultivo y la concentración del extracto de levadura en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,007 y 0,6. Clausula 2: Cultivo para la producción de DHA que comprende al menos un alga de la clase de los Laberintulidos en presencia de al menos una fuente de carbono y de al menos una fuente de nitrógeno, caracterizado porque comprende MgSO4 en una concentración menor de 1 g/L. Clausula 3: Cultivo para la producción de DHA que comprende al menos un alga de la clase de los Laberintulidos en presencia de al menos una fuente de carbono y de al menos una fuente de nitrógeno, caracterizado porque comprende CaCl2 en una concentración menor de 0,25 g/L. Clausula 4: Cultivo para la producción de DHA que comprende al menos un alga de la clase de los Laberintulidos en presencia de al menos una fuente de carbono y de al menos una fuente de nitrógeno, caracterizado porque no contiene uno o más de los compuestos que se seleccionan del grupo que consiste en KCl, NaNO3 y vitamina B12.
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de cultivo está comprendida entre 0,007 y 0,6; a una temperatura mayor de 20°C y una concentración de oxígeno mayor del 20%;
(ii) durante una segunda fase a una temperatura menor de 20°C, en presencia de una concentración menor del 20% y una concentración de glutamato mayor de 10 mM;
(iii) extraer de la biomasa resultante al menos los lípidos y pigmentos resultantes. Cláusula 33: La composición según una cualquiera de las cláusulas 31 o 32 en donde la concentración de dicho pigmento es superior a 20 µg de pigmento por g de biomasa. Cláusula 34: Procedimiento para la preparación del cultivo de la cláusula 1 que comprende mezclar en un medio acuoso al menos un alga productora de DHA de la clase de los Laberintulidos , al menos una fuente de carbono, al menos un extracto de levadura y una o más fuentes secundarias de nitrógeno seleccionadas del grupo que consiste en triptona, licor de maíz fermentado, peptona y casaminoácido de forma que la proporción entre la concentración de la suma de fuentes secundarias de nitrógeno en gramos por litro de cultivo y la concentración de la fuente de carbono en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,005 y 0,4, y la proporción entre la concentración del extracto de levadura en gramos por litro de cultivo y la concentración de la fuente de carbono en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,008 y 1, y en donde la proporción entre la concentración de la suma de fuentes secundarias de nitrógeno en gramos por litro de cultivo y la concentración del extracto de levadura en gramos por litro de cultivo está comprendida entre 0,007 y 0,6. Cláusula 35: Procedimiento para la preparación de un cultivo según la cláusula 2 que comprende mezclar en un medio acuoso al menos un alga de la clase de los Laberintulidos , al menos una fuente de carbono, al menos una fuente de nitrógeno, y MgSO4 en una concentración menor de 1 g/L. Cláusula 36: Procedimiento para la preparación de un cultivo según la cláusula 3 que comprende mezclar en un medio acuoso al menos un alga de la clase de los Laberintulidos , al menos una fuente de carbono, al menos una fuente de nitrógeno, y CaCl2 en una concentración menor de 0,25 g/L. Cláusula 37: Procedimiento para la preparación de un cultivo según la cláusula 4 que comprende mezclar en un medio acuoso al menos un alga de la clase de los Laberintulidos , al menos una fuente de carbono, al menos una fuente de nitrógeno, en ausencia uno o más de los compuestos que se seleccionan del grupo que consiste en KCl, NaNO3 y vitamina B12. Cláusula 38: Uso del cultivo según una cualquiera de las cláusulas 1-19 para la producción de DHA.
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Citations (2)
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| WO2015150716A2 (fr) * | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Fermentalg | Procede de culture des microalgues du genre aurantiochytrium dans un milieu de culture sans chlorure et sans sodium pour la production de dha |
-
2015
- 2015-12-15 ES ES201531814A patent/ES2617081B1/es active Active
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN103614427A (zh) * | 2013-11-13 | 2014-03-05 | 福建师范大学 | 利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法 |
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| SULEEPORN KITCHA et al. Screening of Oleaginous Yeasts and Optimization for Lipid Production Using Crude Glycerol as a Carbon Source.Energy Procedia Elsevier, NL // VOL: 9 Pags: 274 - 282 ISSN 1876-6102.resumen. * |
Also Published As
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| ES2617081B1 (es) | 2018-03-23 |
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