KR20160143327A - 미세조류의 배양방법 및 이를 이용한 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가영양조건에서 배양된 미세조류의 생장기와 유도기 동안 배양 온도 변화 및 질소결핍 배지에서의 배양을 통하여, 미세조류의 세포내에 축적되는 단백질, 탄수화물 및 지질의 함량을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

미세조류의 배양방법 및 이를 이용한 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법{Method of culturing microalgae and method of controlling nutritional ingredients accumulated in cells of microalgae}

본 발명은 미세조류의 배양방법 및 이를 이용한 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자가영양조건에서 배양된 미세조류의 생장기와 유도기 동안 배양 온도 변화 및 질소결핍 배지에서의 배양을 통하여, 미세조류의 세포내에 축적되는 단백질, 탄수화물 및 지질의 함량을 조절하는 방법에 관한 것이다.

미세조류는 일반 식물에 비해 약 200배 정도 광합성 속도가 빠르고 경작지에 구애받지 않고 토양을 오염시키지 않는 새로운 지속 가능한 바이오매스 생산원으로서 주목받고 있다.

미세조류는 독립영양(autotrphism)이거나 종속영양(heterotroph)으로 생장에 필요한 에너지를 얻고, 이들은 이산화탄소, 영양염류와 같은 무기물과 빛 에너지를 이용하여 성장할 수 있다.

그런데, 독립영양 미세조류에 있어서 광합성은 그들의 생존에 필수적인데, 엽록체로 흡수한 이산화탄소와 태양 에너지를 세포 수준에서 유용한 에너지인 ATP와 호흡에 필요한 산소로 변환한다.

또한, 모든 종류의 미세조류의 생장에서 광합성은 세포 생장과 바이오매스 생산에 영향을 주는 핵심 요인으로서, 이러한 광합성에 영향을 주는 요인은 크게 빛과 온도이다.

한편, 미세조류 엽록체의 틸라코이드(thylakoid) 막에서 주로 광합성의 명반응이 일어난다. 미세조류는 광합성을 담당하는 여러 색소(pigment)를 가지는데, 광합성에 직접적으로 관여하는 클로로필 a, 보조적 역할을 담당하는 클로로필 b, 그 외 전자 전달계, 과도한 광 에너지로부터 세포를 보호하기 위한 보조 색소 등이 있다.

빛은 클로로필 a 분자를 들뜨게(excited) 하고, 이 들뜬 클로로필 a 분자가 바닥상태(ground state)로 돌아오면서 에너지를 방출한다. 이 때 방출된 에너지는 여러 형태를 띠는데, 먼저 형광(flourescence)으로 나타나기도 하고, 광합성을 위한 에너지를 제공해 주기도 한다.

그리고, NPQ(non photosynthetic quenching)에 의해 열로 방출되기도 하는데, 이 NPQ는 과도한 빛 에너지에 대한 세포의 방어 매커니즘으로서, 광 에너지는 광합성에 이용되기도 하나, 매우 반응성이 높은 활성 산소(Reactive Oxygen Species)를 생산하므로, 상기 NPQ는 이를 흡수하여 무해한 열로 방출해 주는 보호적인 역할을 한다.

온도 또한 광합성에 영향을 주는 중요한 요인인데, 광합성에 관여하는 포토시스템(Photosystem) Ⅱ는 온도에 매우 민감한 기관이고, 열 스트레스는 광합성에 관여하는 전자 전달 시스템과 효소 Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase oxygenase(Rubisco) 활성을 저해한다.

세포는 열 스트레스를 방어하기 위해 크산토필(xanthophyll), 제아잔틴(zeaxanthin), antherxanthin 등 카로티노이드(carotenoid)가 관여하는 경로를 가지고 있다.

NPQ 또한 열 스트레스에 의해 유도되기도 하는데, 이러한 미세조류는 풍부한 단백질원이 될 뿐만 아니라, 그 밖에 여러 기능성 유용 물질 생산이 가능하다.

특히, 국내에서는 미세조류 가공품 중 클로렐라, 스피루리나 등이 잘 알려져 있고, 다이어트 및 건강에 대한 인식 고조와 환경오염 문제가 사회적 이슈로 등장하면서 새로운 기능성 식품소재 내지는 건강보조식품으로 조명되고 있다.

상기 클로렐라는 동물의 생장에도 영향을 주는 것으로 알려져 있는데, 농촌진흥청 국립축산과학원에서는 육계 사료 내 클로렐라 부산물을 첨가 급여하여 면역력 강화로 인한 항생제 저사용 및 생산성 향상의 효과를 거둔 바 있다 (강환구 외, 육계 사료 내 클로렐라 부산물의 급여가 생산성 및 면역력에 미치는 영향, 농촌진흥청 국립축산과학원, 2007).

그러나, 클로렐라 등과 같은 미세조류는 생산 단가가 비싸, 축산 산업에서 아직 상용화되지 못하고 있는 실정이다.

한편, 클로렐라 등과 같은 미세조류를 이용한 예로는 공배양에 의한 광합성 미세조류의 배양방법 (힌국공개특허 제10-2012-0021566호), 클로렐라 함유 사료 조성물, 이의 제조방법 및 그 용도 (한국공개특허 제10-2012-0001373호) 등이 개시되어 있으나, 이들 종래기술은 본 발명과는 구성이 전혀 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 자가영양조건에서 배양된 미세조류의 생장기와 유도기 동안 배양 온도 변화를 통하여, 미세조류의 세포내에 축적되는 단백질, 탄수화물 및 지질의 함량을 조절할 수 있는 미세조류의 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 방법을 이용하여 미세조류 세포내에 축적되는 영양성분의 함량을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, (a) 자가영양 조건의 배지에서 유도기(lag phase) 및 생장기(logarithmic growth phase)를 거쳐 정체기(stationary phase)에 도달하도록 미세조류를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 정체기에 도달한 미세조류의 배양액에서, 미세조류를 수확하여 질소결핍 배지에서 상기 생장기와 상이한 온도에서 배양하는 단계를 포함하는, 미세조류의 배양방법을 제공한다

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 미세조류를 배양하여, 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 미세조류의 배양방법 및 이를 이용한 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법은, 모든 생산 공정이 미세조류 내 생물학적인 매커니즘을 이용하는 방법이므로, 에너지 소비가 적으며 친환경적인 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 클로렐라 속 균주와 같은 미세조류에서 유도기 동안 온도 적응을 이용하여 세포내 성분의 함량을 변화시켜, 농가의 필요에 의한 맞춤형 사료 개발에 이바지 할 수 있다.

도 1은 실험실 규모에서 자가 영양 조건을 이용한 미세조류의 배양을 이해하기 쉽게 나타낸 개략도이다.
도 2는 클로렐라 소로키니아나의 생장기 동안 배양 온도가 바이오매스 생장에 미치는 영향에 관한 그래프이다.
도 3a는 클로렐라 소로키니아나의 유도기 동안 광합성 활성을 나타낸 것이다.
도 3b는 클로렐라 소로키니아나의 유도기 동안 NPQ를 나타낸 것이다.
도 3c는 클로렐라 소로키니아나의 유도기 동안 클로로필의 농도를 나타낸 것이다.
도 3d는 클로렐라 소로키니아나의 유도기 동안 카로테노이드의 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 생장기와 유도기 온도의 4가지 조건에서 바이오매스 농도 변화에 대한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 생장기와 유도기 온도의 4가지 조건에서 세포 내 물질 함량의 % 변화를 나타낸 것으로서, 도 5a는 23℃(실온)→23℃(실온), 도 5b는 23℃(실온)→36℃(고온), 도 5c는 36℃(고온)→23℃(실온), 도 5d는 36℃(고온)→36℃(고온)의 온도 변화를 나타낸 것이다.

본 발명은 (a) 자가영양 조건의 배지에서 유도기(lag phase) 및 생장기(logarithmic growth phase)를 거쳐 정체기(stationary phase)에 도달하도록 미세조류를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 정체기에 도달한 미세조류의 배양액에서, 미세조류를 수확하여 질소결핍 배지에서 상기 생장기와 상이한 온도에서 배양하는 단계를 포함하는, 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 (a) 단계의 생장기의 배양온도는 22℃ 내지 24℃, 바람직하게는 22℃이고, 상기 (b) 단계의 배양온도는 35℃ 내지 37℃, 바람직하게는 36℃일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 (a) 단계의 생장기의 배양온도는 35℃ 내지 37℃, 바람직하게는 36℃이고, 상기 (b) 단계의 배양온도는 22℃ 내지 24℃, 바람직하게는 22℃일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 (a) 단계의 배지는 4 내지 6 %(v/v), 바람직하게는 5 %(v/v)의 이산화탄소를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 정체기는 배양후 11일째 내지 13일째, 바람직하게는 12일째일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 (b) 단계의 배양은 3일 내지 5일, 바람직하게는 4일 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 미세조류는 클로렐라 속(Chlorella sp.), 스피루리나(Spirulina sp.) 또는 네오클로리스 속(Neochloris sp.)일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 미세조류는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 배양방법에서, 상기 클로렐라 소로키니아나는 녹조류과 단세포 생물로서, 분류학상 Chlorellales 강, Chlorellaceae 목, Chlorella 속으로서, 광합성을 이용하여 성장증식하며, 그 속도가 매우 빠른 것으로 알려져 있다.

상기 클로렐라는 보통 담수에서 생육하며 직경이 2~10 μm로 매우 작다. 또한 엽록소를 다량 함유하고 있으며 세포 표면은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 세포막으로 이루어져 있는 것으로 알려져 있다. 다른 식물이나 미세조류와 마찬가지로 광합성 과정은 빛과 물을 에너지원과 전자 공여체로 이용하여 당을 합성하며 이산화탄소를 고정한다.

또한, 상기 클로렐라는 단백질이 풍부하고, 그 외 여러 카로테노이드, 엽록소를 함유하고 있으며, 여타 배양 조건의 조절에 따라 탄수화물, 지질 등을 축적한다. 특히 클로렐라에는 세포의 빠른 생장 속도에 기여하는 CGF(Chlorella growth factor)라는 생리활성 물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있어, 어린이, 환자 등의 건강 기능 식품으로 주목받고 있다.

또한, 본 발명은 상기 미세조류의 배양방법에 의해 미세조류를 배양하여, 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 상기 영양 성분은 단백질, 탄수화물 및 지질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 상기 조절은 단백질의 함량을 감소시키고, 탄수화물 및 지질의 함량을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에 의하면, 서로 다른 온도 조건에서 미세조류, 바람직하게는 클로렐라 소로키니아나의 생장기 동안 바이오매스 생장 및 광합성 활성은 차이를 보인다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 광합성 활성은 바이오매스 생산량과 나아가서 광 배양 공정의 효율과도 연결되는데, 생장기 이후의 세포 주기는 배양액 내 영양원의 농도가 줄어들고, 세포 내 대사 및 세포 분열의 정체기에 들어선다.

또한, 본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 미세조류의 세포가 정체기에 접어든 시점에서 세포 배양액에서 상등액은 버리고, 바이오매스만 수확하여 Nitrogen free-media(TAP-N)으로 배지를 바꾸어 준다.

이 때, 온도 조건은 생장기와 다르게 하고, 온도에 따른 세포 내 물질 함량 변화를 관찰한 결과, 영양 조건의 변화는 미세조류의 생장과 2차 대사산물 생산 모두에 영향을 준다. 그러므로, 원하는 유용 물질을 얻기 위해서는 광합성을 위한 충분한 빛과 이산화탄소의 공급뿐만 아니라 적절한 영양 조건을 제공할 필요가 있다

광합성을 통해 미세조류는 상당한 양의 탄수화물과 지질을 축적하는데, 주변 환경이 적절할 때 미세조류는 주로 지방산을 에스테르화하여 세포내 세포막의 주 구성 성분인 글리세롤(glycerol)에 기반한 극성 지질로 바꾼다.

그러나, 주변 환경이 적절하지 않거나 스트레스를 받으면, 많은 미세조류는 지질 생합성 경로를 중성 지질이나 Triacylglycerol(TAG)를 생산하는 쪽으로 바꾼다. 서로 다른 환경에서 지질과 탄수화물의 축적과 사용 조절 매커니즘은 아직 명확히 밝혀지지 않았다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서에서, 질소 결핍은 클로렐라에서 대사 경로를 바꾸어 지질 및 탄수화물 축적을 유도하는 효과적인 환경적 스트레스이다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 질소 결핍 2일 후 클로렐라 세포 안에 지질 소구체(oil droplet) 형성과 상당한 지질 축적이 이루어 지고, 지질 소구체 형성 동안 세포 엽록체의 광합성 기관인 PSII의 손상으로 인해 광합성 효율, 호흡률, 광화학적 효율 감소가 초래된다. 또한, 순환성 전자전달 시스템(cyclic electron transfer system) 효율이 증가하여 TAG(triacylglycerols) 합성을 위한 ATP 생산이 증가된다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 미세조류의 세포는 질소 결핍 후 하루 내로 적응하고, 초기 스트레스에 반응하는 전환점을 맞는다. 그리고 산화 스트레스로 인해 막 과산화가 증가되고, 중성 지질이 축적된다.

본 발명의 상기 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법에서, 이러한 산화 스트레스는 물질 대사 및 세포 구성 성분 변화를 초래한다. 온도 또한 생리적 활성에 영향을 주는 주요 요인으로서, 본 발명에서는 환경적 스트레스가 주어졌을 때 서로 다른 온도에서 세포 내 물질 함량의 변화를 조사하여 맞춤형 생산품 개발이 가능하게 한다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

이하의 실시예에 사용된 균주는 Chlorella sorokiniana UTEX 2805로서, University of Texas at Austin, USA으로부터 구입하였다.

또한, 이하의 실시예에 사용된 배지의 종류는 모두 2가지로서, 탄소결핍 배지(TAP-C) 및 질소결핍 배지(TAP-N 배지)로서, 상기 TAP-C 배지는 생장을 위한 자가영양 배지(autotrophic medium)이고, 상기 TAP-N 배지는 생육억제, 영양 결핍 스트레스로 인한 세포내 물질대사의 변화를 위한 자가영양 배지이다.

클로렐라의 배양 조건은 하기와 같다.

- 가스 공급 : 5 %(v/v) 이산화탄소

- 유량 : 20 cc/min

- 배양 온도 : 23℃ , 36℃ (생장기와 유도기 각각, 총 4가지 조건)

- 광주기 : 명/암 주기 12:12

- 배양 부피 : 500ml elynmer flask에 300ml 부피로 배양

- 광조건 : 35W 형광등을 이용한 150μE/m2/s 광

<실시예 1> 클로렐라 소로키니아나 생장기 동안의 바이오매스 생장과 광합성 효율에 온도가 미치는 영향

자가 영양 조건에서 배양 온도가 클로렐라 소로키니아나의 생장기 동안 광합성 효율과 바이오매스 생장에 주는 영향에 대해 탐구하기 위하여, 하기 도 1과 같이 실험 환경을 조성하였다.

고온에 대해 저항성이 있는 균주인 Chlorella sorokiniana UTEX 2805를 미세조류에 널리 이용하는 TAP 배지에 접종하였고 광 독립 영양 조건이므로, 공기 중의 이산화탄소를 탄소원으로 사용할 수 있도록 TAP-C 배지를 사용하였다.

미세조류의 배양은 Shaking incubator(VS-8480, Vision, Korea)안에서 이루어졌고 통상적으로 미세조류가 잘 자라는 온도인 23℃(실온)과 36℃(고온) 2종류로 설정했다.

배양 부피는 500 ml 플라스크에 배양 부피(culture volume)이 300 ml이 되게 접종하였다. 그리고 교반속도는 120~130 rpm으로 하여 플라스크 내의 배지가 잘 혼합될 수 있게 하였다. 또한, 초기 바이오매스 농도는 0.1g/L이 되게 접종하였다.

광주기는 휴지기에 세포 내 물질 축적이 잘 이루어지므로 이를 극대화하기 위해, 12:12 (명조건: 암조건)로 설정하였다. 35W 형광등을 이용하여 150μE/m2/s의 광을 공급해 주었다.

그리고, CO2 공급에 의한 광합성 및 바이오매스 생산 실험을 위하여, 쉐이킹 인큐베이터의 옆면에 구멍을 내어 에어호스를 삽입하였으며, CO2 혼합 가스를 공급할 수 있는 레귤레이터와 혼합 챔버 시설도 연결하였다. CO2 혼합 가스는 공기 중 5%(v/v)의 농도이다.

접종 후 생장기, 즉 지수성장기(exponential growth stage)에서 정체기(stationary phase)로 접어드는 16일까지 미세조류의 생장을 관찰하였다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 바이오매스는 지수기를 거쳐 접종 후 10일째 최대가 되고, 세포 생장은 정체기로 접어든다. 바이오매스 생장량은 각각 23℃(실온)에서 0.8g/L, 36℃(고온)에서 1.0g/L이고, 비생장량(μ; specific growth rate)은 23℃(실온)에서 0.207, 36℃(고온)에서 0.23이며, 배가시간(Doubling time)은 약 3일이다.

23℃(실온), 36℃(고온)에서 각각 광합성 활성을 조사하기 위해, Pulse Amplitude Modulation fluorometry(Hansa Instrument 社, Germany)를 이용하여 PS II 활성(ΦPS II)과 NPQ(non photosynthetic quenching)를 측정하였다. 또한 광합성 색소인 클로로필 및 카로테노이드 농도와 바이오매스 생장을 분석하였다.

도 3a에서 볼 수 있듯이, 광합성 활성을 나타내는 ΦPSII는 두 온도 조건에서 모두 접종 후 차차 증가하는 것을 볼 수 있다. ΦPSⅡ는 Photosystem Ⅱ(PSⅡ)에 의한 양자 수율이며 실제 광합성 효율을 나타낸다. 광합성에 관여하는 Photosystem Ⅱ는 온도에 매우 민감한 기관이며, 광합성에 관여하는 전자 전달 시스템과 효소 RubisCO 활성은 고온에서 저해된다.

하기 도 3b에서 확인할 수 있듯이, NPQ는 36℃(고온)에서 더 높았다. 그리고 광합성이 고온에 취약한 반응임에도 불구하고, ΦPSⅡ 또한 23℃와 비교해서 활성이 떨어지지 않았는데, 이는 세포의 방어 매커니즘인 NPQ와 카로테노이드(carotenoid)를 이용한 열 분산 경로 때문에, 고온에도 불구하고 광합성 효율이 높게 유지될 수 있다고 추측할 수 있다.

NPQ와 카로테노이드 농도 또한 36℃(고온)에서 더 높게 나타났기 때문이다. 이러한 방어 매커니즘의 존재로 인해 클로렐라 소로키니아나는 고온과 강한 빛을 견딜수 있는 것으로 추측된다.

광합성 효율은 접종 후 10일에서 최대가 되는데, 높은 광합성 효율은 세포 생장 증가를 의미하기 때문에, 지수 성장기가 12일째까지 지속되며, 바이오매스가 급격히 증가하는 것을 설명해 준다.

도 3c에서는 클로로필 농도를 확인할 수 있는데, 세포가 생장할수록 광합성 색소인 클로로필 농도 또한 증가하였고, 도 3d에서는 카로테노이드 농도를 확인할 수 있는데, 36℃(고온)에서 카로테노이드 농도가 더 높았고, 이는 과도한 열로부터 세포를 보호하기 위함으로 추측된다.

<실시예 2> 클로렐라 소로키니아나 유도기 동안 바이오매스 및 세포 구성 성분의 함량 변화에 온도가 미치는 영향

미세조류는 특수화된 배양으로 대사 경로를 조절할 수 있다. 질소 결핍은 Neochloris oleoabundance , Chlorella vulgaris , Chlorella protothecoides 등 많은 미세조류에서 지질(triacylglyceride, TAG) 축적을 높일 수 있는 효과적인 환경 스트레스이다.

정체기에 접어든 클로렐라 소로키니아나 세포를 회수하여 원심분리한 후 상등액을 버리고, 배지를 질소원이 없는 TAP-N으로 바꾸어 주었다. 지질체(oil droplet)의 형성은 질소 결핍 후 2일 이내 관찰되었고, 이후 상당한 양의 지질이 계속적으로 축적되었다.

PS II의 손상으로 인해 광합성 색소인 클로로필이 줄어들어, 전체적인 세포의 광 수확은 감소한다. 보조 색소인 카로테노이드는 과산화로부터 오일 바디(oil body)의 불포화 지질을 보호하는 항산화적인 역할을 수행하고, 엽록체에 흡수되어 손상을 초래할 수도 있는 과량의 광을 가리거나 가두는 역할에도 참여한다.

질소결핍 조건에서 지질을 축적하는 동안 클로렐라 소로키니아나의 PS II 효율이 먼저 줄어들었고, 그 결과로서 광합성 색소들이 줄어들었으며, PS II 반응 중심이 닫혔다. 이로 인해 광 수확 효율이 감소하고, 광 손상이 증가하였으며, PS II 손상 또한 증가하여 광합성 효율이 감소하였다.

광합성 효율의 감소는 산소 방출과 호흡률을 방해하여 더 적은 ATP 합성을 초래하였다. 반면에 지질 축적은 더 많은 ATP를 필요로 하므로 PS I 주변을 순환하는 전자 흐름은 이러한 현상을 보충하기 위해 상당히 증가하게 된다. 이와 같이 질소 결핍은 광합성의 화학 양론에 영향을 주고 ,두 광계(photosystem) 내에 들뜬 에너지를 분배한다.

질소 결핍이 광합성에 미치는 손실은 광합성 활성의 손실과 호흡 활성 감소이다. 질소 결핍 초기에서는 클로렐라 소로키니아나 세포는 순간적인 반응으로 광합성을 조절함으로서 스트레스에 적응하려 노력하나, 질소 결핍이 지속됨에 따라 증가한 스트레스 때문에 실패하고, 후기 단계에서는 영구적인 손상을 입는다.

이러한 대사 과정의 급격한 변화는 세포 내 물질 함량에도 영향을 준다. 이 때 온도는 추가적인 환경 스트레스로서 작용하는데, 높은 광도와 온도에서 과다 생성된 활성 산소종(Reactive Oxygen Species)은 반응성이 높아 세포막과 세포 소기관을 손상시킨다.

세포는 고온, 활성산소종으로 인한 스트레스를 방어하기 위하여, xanthophyll, zeaxanthin, antherxanthin 등 카로테노이드(carotenoid)가 관여하는 경로를 가지고 있다. 또한 열 스트레스에 의해 유도되기도 하는 NPQ도 있는데, 이는 과도한 에너지를 방출하는 보호적 역할을 하는 기관이다.

그리고, NPQ 활성이 높을수록 광합성 반응 중심인 클로로필이 수확한 에너지 흐름이 광화학적 물질 합성보다 열로 방출되는 쪽으로 향한다는 것을 의미한다. NPQ의 주 역할은 틸라코이드 내강(lumen)의 높은 수소 이온 농도([H+])와 크산토필 싸이클을 이용한 PS II 광 안테나의 down regulation이다.

화학 양론적 관점에서, 지수 생장기(exponential growth stage)동안 광합성을 이용하여 고정된 탄소는 세포가 흡수한 배양액 내의 영양원(질소, 인, 미량원소 등)과 함께 단백질 등 세포 생장에 필요한 물질 합성에 이용된다.

그러나, 영양원이 고갈됨에 따라 세포 내 물질 대사는 생장에 필요한 물질 합성보다 저장 물질 합성으로 방향이 바뀌게 된다. 저장 물질은 주로 탄수화물과 긴 알킬 체인을 가진 지방산(C:14~C:20)이다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 영양 결핍 후 온도 조건에 따라서 세포 바이오매스 생장은 차이를 보인다. 세포 내 단백질 함량은 점차 줄어들고 탄수화물 및 지질 함량이 증가하는 것을 볼 수 있다.

영양 결핍으로 인한 PS II 손상은 탄소 고정 효율을 감소시키고, 더불어 36℃(고온) 조건에서 더 높은 NPQ 활성은 세포가 흡수한 에너지는 광화학적 합성보다 열 분산 쪽으로 향한다는 것을 의미한다. 그리고 실온에서 생장기를 거치고, 고온에서 유도기를 거친 세포는 심화된 스트레스로 인해 바이오매스 감소를 보인다.

하기 표 1은 4가지 온도 조건에서 세포물질의 함량변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 5a는 생장기에서 유도기의 온도 조건이 23℃(실온)→23℃(실온)인 경우의 세포 내 물질 함량의 % 변화를 나타낸 것으로서, 상기 표 1 및 도 5a에서 볼 수 있듯이, 초기 단백질, 탄수화물, 지질 함량은 각각 32%, 29%, 32%이지만, 영양 결핍 후 단백질 함량은 24%로 감소하고, 탄수화물 및 지질의 함량이 35%, 35%로 각각 증가한다. 실온 조건은 지질 축적에 유리한 것으로 추측된다.

도 5b는 생장기에서 유도기의 온도 조건이 23℃(실온)→36℃(고온)인 경우의 세포 내 물질 함량의 % 변화를 나타낸 것으로서, 상기 표 1 및 도 5b에서 볼 수 있듯이, 초기 단백질, 탄수화물, 지질 함량은 각각 33%, 42%, 18%이나 영양 결핍 후 단백질 함량은 14%로 급격히 감소하고, 탄수화물, 지질의 함량이 48%, 31%로 증가한다.

실온 조건에서 생장기를 거친 세포는 유도기의 영양 결핍에 의한 스트레스뿐만 아니라, 고온 스트레스로 인해 세포 손상이 발생하여 바이오매스 및 단백질 함량의 급격한 감소를 보이는 것으로 추측된다.

도 5c는 생장기에서 유도기의 온도 조건이 36℃(고온)→23℃(실온)인 경우의 세포 내 물질 함량의 % 변화를 나타낸 것으로서, 상기 표 1 및 도 5c에서 볼 수 있듯이, 초기 단백질, 탄수화물, 지질 함량은 각각 38%, 40%, 16%이지만, 영양 결핍 후 단백질 함량은 25%로 급격히 감소하고, 탄수화물, 지질의 함량이 46%, 23%로 각각 증가한다.

고온에서 생장기를 거친 세포는 실온에서 유도기를 거치며, 탄수화물을 다량 축적한다. 생장기와 유도기의 온도 조건이 다른 세포는 단백질의 함량이 감소하고 탄수화물 함량이 증가하는데, 이 때 온도는 추가적인 스트레스로 작용하여 단백질 함량이 더 많이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

도 5d는 장기에서 유도기의 온도 조건이 36℃(고온)→36℃(고온)인 경우의 세포 내 물질 함량의 % 변화를 나타낸 것으로서, 상기 표 1 및 도 5d에서 볼 수 있듯이, 초기 단백질, 탄수화물, 지질 함량은 각각 31%, 38%, 25%이지만, 영양 결핍 후 단백질 함량은 21%로 급격히 감소하고, 탄수화물, 지질의 함량이 43%, 31%로 각각 증가한다.

여기에서, 생장 기간 동안 고온에 의해 유도된 광합성에 참여하지 않는 요소(Carotenoid, NPQ)의 증가는 수확한 광 에너지가 광합성에 이용된다기 보다 열 등의 다른 형태로 분산됨을 의미한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 미세조류의 배양방법 및 이를 이용한 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법은, 모든 생산 공정이 미세조류 내 생물학적인 매커니즘을 이용하는 방법이므로, 에너지 소비가 적으며 친환경적인 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 클로렐라 속 균주와 같은 미세조류에서 유도기 동안 온도 적응을 이용하여 세포내 성분의 함량을 변화시켜, 농가의 필요에 의한 맞춤형 사료 개발에 이바지 할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims (11)

1. (a). 자가영양 조건의 배지에서 유도기(lag phase) 및 생장기(logarithmic growth phase)를 거쳐 정체기(stationary phase)에 도달하도록 미세조류를 배양하는 단계; 및
   (b). 상기 정체기에 도달한 미세조류의 배양액에서, 미세조류를 수확하여 질소결핍 배지에서 상기 생장기와 상이한 온도에서 배양하는 단계를 포함하는, 미세조류의 배양방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생장기의 배양온도는 22℃ 내지 24℃이고, 상기 (b) 단계의 배양온도는 35℃ 내지 37℃인 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생장기의 배양온도는 35℃ 내지 37℃이고, 상기 (b) 단계의 배양온도는 22℃ 내지 24℃인 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 4 %(v/v) 내지 6 %(v/v)의 이산화탄소를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 정체기는 배양후 11일째 내지 13일째에 도달하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양은 3일 내지 5일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 속(Chlorella sp.), 스피루리나(Spirulina sp.) 또는 네오클로리스 속(Neochloris sp.)인 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)인 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 미세조류를 배양하여, 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 영양 성분이 단백질, 탄수화물 및 지질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 영양성분의 함량을 조절하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 조절이 단백질의 함량을 감소시키고, 탄수화물 및 지질의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 영양성분의 함량을 조절하는 방법.

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