ES2616540T3

ES2616540T3 - Métodos para determinar un pronóstico de supervivencia para un paciente con leucemia

Info

Publication number: ES2616540T3
Application number: ES11736082.6T
Authority: ES
Inventors: Frédéric PENDINO; Pierre De La Grange; Johan R. Lillehaug; Thomas Aloysius; Stian Knappskog
Original assignee: Bergen Teknologioverforing AS
Current assignee: Bergen Teknologioverforing AS
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2031-07-21
Also published as: EP2596126A1; US20130217590A1; WO2012010661A1; EP2596126B1

Abstract

Método para determinar la progresión de la enfermedad o un pronóstico de supervivencia de un paciente con leucemia mieloide aguda, o el riesgo de una recaída de leucemia mieloide aguda en un paciente con diagnóstico de y, opcionalmente, tratado frente a leucemia mieloide aguda, caracterizado porque dicho método comprende: a) determinar el nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en una muestra biológica de dicho paciente, b) comparar el nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en dicha muestra con un nivel de referencia de CXXC5, por lo cual un nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en dicha muestra de dicho paciente menor que el nivel de referencia se correlaciona con un mejor pronóstico y una supervivencia incrementada de dicho paciente, una progresión más lenta de la enfermedad o un menor riesgo de una recaída, y por lo cual un nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en dicha muestra mayor que el nivel de referencia se correlaciona con una supervivencia disminuida y un mal pronóstico, una progresión más rápida de la enfermedad o un mayor riesgo de recaída.

Description

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MÉTODOS PARA DETERMINAR UN PRONÓSTICO DE SUPERVIVENCIA PARA UN PACIENTE CON

LEUCEMIA

DESCRIPCIÓN

5

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a un método para determinar un pronóstico de supervivencia o la progresión de la enfermedad para un paciente con leucemia, el riesgo de resistencia al tratamiento, o el riesgo de una recaída de leucemia, como una leucemia mieloide aguda, por ejemplo una leucemia mieloide aguda con cariotipo normal o una leucemia mieloide aguda con CBF (factor de unión al núcleo), y un método para monitorizar la eficacia de un transcurso de tratamiento para un paciente con leucemia, así como un kit para su uso en dichos métodos, preferiblemente, cuantificando la expresión de ARNm de RINF.

15 Antecedentes de la invención

La identificación de genes específicamente desregulados en células tumorales puede sacar a la luz nuevos supresores tumorales y oncogenes con aplicaciones clínicas potenciales en diagnóstico, pronóstico, y terapia. En la solicitud PCT WO 2009/151337 se ha descrito que un nuevo gen diana de retinoides, CXXC5, que codifica para un factor nuclear se caracterizó funcionalmente por primera vez a nivel de ARNm y proteína y se denominó RINF (factor nuclear inducible por retinoide). En la solicitud PCT WO 2010/085153 se describe por primera vez que la medición de ARNm de RINF en tumores de cáncer de mama, puede ser informativa para la supervivencia global de pacientes con cáncer de mama.

25 Los datos presentes indican que RINF tiene un papel esencial durante la hematopoyesis humana in vitro. En efecto, los estudios de expresión y experimentos de silenciamiento génico demostraron ambos la implicación de RINF durante la diferenciación terminal de células de leucemia mieloide (líneas celulares NB4 y HL60), pero también durante la mielopoyesis de células progenitoras hematopoyéticas normales (células de médula ósea CD34+). Coincidiendo con su papel esencial durante la diferenciación mieloide terminal y su localización con respecto al cromosoma 5q31.3, una región delecionada a menudo en leucemia mieloide (más especialmente en leucemia mieloide aguda y mielodisplasia), se ha sugerido RINF como un candidato de supresor tumoral prometedor en ese locus en algunos tumores malignos mieloides.

Debido a que la expresión de RINF no está restringida al tejido hematopoyético y también puede estar implicada en

35 el desarrollo y/o homeostasis de otros tejidos, se ha investigado la expresión de RINF en algunos tumores sólidos derivados de diferentes tejidos. Se muestra en la solicitud PCT WO 2009/151337 que este gen puede tener una expresión desregulada en algunos tejidos malignos en comparación con sus tejidos de origen normales. En efecto, se examinó la expresión de ARNm de RINF en muestras de tumor sólido de pacientes que padecen cáncer de mama, y la expresión de RINF era significativamente mayor en tumores de mama en comparación con controles de tejidos de mama normales.

Además, en la solicitud PCT WO 2010/085153 se muestra que la medición de ARNm de RINF en tumores de cáncer de mama, puede ser informativa para la supervivencia global de estos pacientes con cáncer de mama. En esta solicitud, también se describe un “kit” para la detección de ARNm de RINF mediante RT-PCR cuantitativa.

45 La leucemia (Español; del griego leukos ó, “blanco”; aima í, “sangre”) es un cáncer de la sangre o médula ósea caracterizado por un incremento anómalo de hematocitos, habitualmente leucocitos (glóbulos blancos).

Las formas mayoritarias de leucemia pueden dividirse en cuatro categorías principales. Leucemias mielógenas y linfocíticas/linfoblásticas, cada una tiene formas agudas y crónicas. Los términos mielógena o linfocítica/linfoblástica indican el tipo celular implicado. Además, dentro de cada categoría, se definen distintas leucemias según una combinación de morfología, inmunofenotipo, y características citogenéticas además de síntomas clínicos.

La leucemia aguda es una enfermedad clónica de células madre hematopoyéticas. Por ejemplo, en los Estados

55 Unidos más de la mitad de todas las nuevas leucemias son leucemias agudas. Dichas leucemias agudas pueden diferenciarse en leucemia mielógena aguda (LMA), también denominada leucemia no linfocítica aguda y leucemia linfocítica aguda o linfoblástica aguda (LLA) basándose en si las células madre hematopoyéticas se han diferenciado a lo largo del linaje linfoide o mieloide. Además, los tipos crónicos de leucemia se diferencian en leucemia mielógena crónica (LMC) o leucemia linfocítica/linfoblástica crónica (LLC).

Entre leucemia, la leucemia mieloide aguda (LMA) representa un grupo distinguido de enfermedad con base genética heterogénea, patofisiología, y pronóstico. En el pasado, el cariotipo de las células de LMA ha emergido como el factor de pronóstico más importante, y los pacientes pueden clasificarse en grupos de pronóstico favorable, intermedio, y desfavorable según el número y los tipos específicos de aberraciones cromosómicas. Sin embargo, 65 casi la mitad de todos los pacientes con LMA adultos se presentan con un cariotipo normal en el diagnóstico. Estos pacientes se asignan habitualmente al grupo de pronóstico intermedio. Más recientemente, se han descrito

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mutaciones en genes específicos que permiten la identificación de subgrupos de pronóstico en LMA citogenéticamente normal (CN). Las duplicaciones en tándem internas (ITD) del gen de la tirosina cinasa de tipo fms 3 (FLT3) son factores pronóstico fuertes de un desenlace inferior. Las mutaciones en el gen de nucleofosmina 1 (NPM1) llevaron a la localización citoplásmica de la proteína NPM y son un factor de pronóstico favorable,

5 especialmente en pacientes sin ITD en FLT3. Otras alteraciones relevantes con respecto al pronóstico incluyen mutaciones en los genes MLL y CEBPA así como una sobreexpresión de WT1, MN1, BAALC, ERG, y EVI1 (MECOM). Sin embargo, en aproximadamente el 24% de los casos con LMA-CN, ninguna de las mutaciones mencionadas anteriormente puede detectarse. Estos hallazgos ilustran que LMA-CN en sí mismo constituye una enfermedad heterogénea y que probablemente existen muchas alteraciones genéticas en LMA-CN por descubrir que afecten a la respuesta al tratamiento y supervivencia.

En el caso de leucemia, como LLA, LMA, LLC y LMC, y especialmente en el caso de LMA y LMA-CN, pero también con LMA-CBF, estos indicadores de pronóstico son muy importantes para ayudar a los médicos a distinguir el grupo de pacientes que se beneficiaría más probablemente de una quimioterapia (habitualmente, enfermedad con un

15 pronóstico favorable) de pacientes que (más probablemente) no lo harían, y por ejemplo, que deberían considerarse para un trasplante de células madre autólogas o alogénicas (estos pacientes presentan habitualmente un pronóstico desfavorable y una edad menor de 60). En otros términos, los factores de pronóstico tienen un potencial muy elevado para la toma de decisiones de tratamiento en estas hemopatías malignas y se necesitan marcadores de pronóstico adicionales.

Sumario de la presente invención

Sorprendentemente los inventores han encontrado ahora que el nivel de expresión de RINF se correlaciona con la supervivencia de pacientes con leucemia, la progresión de la enfermedad, el riesgo de recaída de leucemia más

25 precisamente una leucemia mieloide aguda, más precisamente una leucemia mieloide aguda con cariotipo normal.

La presente invención por tanto se refiere a métodos para determinar el pronóstico de supervivencia, la progresión de la enfermedad, o el riesgo de recaída de leucemia mieloide aguda, tal como se define en las reivindicaciones. La divulgación también se refiere a un kit para determinar el pronóstico de supervivencia, y para someter a prueba el efecto de regímenes de tratamiento.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Alta expresión de ARNm de RINF en el diagnóstico se asocia con una supervivencia global menor para 35 pacientes con LMA con cariotipo normal LMA-CN (n=163).

El conjunto de datos de microalineamiento (Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133B) realizado por Metzeler KH, et al., Blood. 15 de noviembre de 2008; 112(10):4193-201 (n=163 muestras de pacientes) se descargó de la página web de Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con número de registro GSE12417. Todos los datos sin procesar se normalizaron usando RMA (método de determinación de promedio de múltiples alineaciones robusto Robust Multiarray Averaging) con el software Expression Console de Affymetrix. Entonces se calculó la expresión de ARNm de CXXC5 como la intensidad media de los 3 conjuntos de sonda que seleccionaban como diana CXXC5 (222996_s_at, 224516_s_at y 233955_x_at). Los pacientes se han clasificado en dos grupos equivalentes (A), según una expresión por encima (alta, n=81) o por debajo de (baja, n=81) la mediana,

45 o en 3 grupos equivalentes (B y C), según un nivel de expresión de RINF alto (n=55), intermedio (n=54), o bajo (n=54). Para el panel C, se han fusionado los grupos bajo (n=54) e intermedio (n=54). Obsérvese que debido a un número impar de pacientes (n=163), el paciente en la mediana se ha censurado para la estratificación de los 2 grupos y no eran exactamente equivalentes para la estratificación de los 3 grupos (n=55 frente a 54). Entonces se correlacionaron los grupos de pacientes con alto o bajo nivel de ARNm de CXXC5 (RINF) con los desenlaces clínicos con respecto a la supervivencia que también se consultaron a través de la página web de Gene Expression Omnibus. Las curvas de Kaplan-Meier (para el análisis de supervivencia) y la prueba de rango logarítmico se realizaron usando el programa estadístico SPSS 15.0. Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles.

55 Figura 2: El nivel bajo de expresión de ARNm de RINF se refiere a un mejor pronóstico en LMA, considerándose todos los subgrupos citogenéticos conjuntamente (n=266).

Los conjuntos de datos de microalineamiento (microalineamientos de Standford) realizados por Gaidzik VI, et al., J Clin Oncol. 1 de abril de 2011; 29(10):1364-72 (n=269, pero n=266 muestras de pacientes con datos de expresión de CXXC5 disponibles) se descargaron de la página web de Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con número de registro GSE23312. Las razones de fluorescencia se normalizaron por centrado en la media de genes para cada alineamiento y entonces centrando en la media cada gen en todos los alineamientos. Entonces se extrajo la expresión de ARNm de CXXC5 y los pacientes se han clasificado en tres grupos equivalentes (A y B), según un nivel de expresión de RINF alto (n=88), intermedio (n=89), o bajo (n=89). Para 65 el panel B, se han fusionado los grupos alto (n=88) e intermedio (n=89) (n=177). Obsérvese que el número de pacientes no era exactamente equivalente para la estratificación de los 3 grupos (n=89, 89 frente a 88) ya que el

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número total de pacientes no era un múltiplo de 3 (n=266). Entonces se correlacionaron los grupos de pacientes con alto, intermedio y bajo nivel de ARNm de CXXC5 con los desenlaces clínicos con respecto a la supervivencia que también se consultaron a través de la página web de Gene Expression Omnibus. Las curvas de Kaplan-Meier (para el análisis de supervivencia) y la prueba de rango logarítmico se realizaron usando el programa estadístico SPSS

5 15.0. Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles.

Figura 3: El nivel bajo de expresión de ARNm de RINF se refiere a un mejor pronóstico en LMA con cariotipo normal (n=102).

Los conjuntos de datos de microalineamiento (microalineamientos de Standford) realizados por Gaidzik VI et al. (véase anteriormente) se usaron y analizaron tal como se describe anteriormente. Entonces se extrajo la expresión de ARNm de CXXC5 y los pacientes se han clasificado en tres grupos equivalentes (A y B), según un nivel de expresión de RINF alto (n=35), intermedio (n=34), o bajo (n=34). Para el panel B, se han fusionado los grupos alto

15 (n=35) e intermedio (n=34) (n=69). Obsérvese que el número de pacientes no era exactamente equivalente para la estratificación de los 3 grupos (n=34, 34 frente a 35) ya que el número total de pacientes no era un múltiplo de 3 (n=102). Entonces se correlacionaron los grupos de pacientes con alto, intermedio y bajo nivel de ARNm de CXXC5 con los desenlaces clínicos con respecto a la supervivencia que también se consultaron a través de la página web de Gene Expression Omnibus. Las curvas de Kaplan-Meier (para el análisis de supervivencia) y la prueba de rango logarítmico se realizaron usando el programa estadístico SPSS 15.0. Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles.

Figura 4: El nivel bajo de expresión de ARNm de RINF se refiere a un mejor pronóstico en LMA con inversión (16) (n=31).

25 Los conjuntos de datos de microalineamiento (microalineamientos de Standford) realizados por Gaidzik VI et al. se obtuvieron y analizaron tal como se describe anteriormente. Entonces se extrajo la expresión de ARNm de CXXC5 y los pacientes se han clasificado en tres grupos equivalentes (A y B), según un nivel de expresión de RINF alto (n=11), intermedio (n=10), o bajo (n=10). Para el panel B, se han fusionado los grupos alto (n=11) e intermedio (n=10) (n=21). Obsérvese que el número de pacientes no era exactamente equivalente para la estratificación de los 3 grupos (n=10, 10 frente a 11) ya que el número total de pacientes no era un múltiplo de 3 (n=31). Entonces se correlacionaron los grupos de pacientes con alto, intermedio y bajo nivel de ARNm de CXXC5 con los desenlaces clínicos con respecto a la supervivencia que también se consultaron a través de la página web de Gene Expression Omnibus. Las curvas de Kaplan-Meier (para el análisis de supervivencia) y la prueba de rango logarítmico se

35 realizaron usando el programa estadístico SPSS 15.0. Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles.

Figura 5: El nivel bajo de expresión de ARNm de RINF se refiere a un mejor pronóstico en LMA con translocación t(8;21) (n=19).

Los conjuntos de datos de microalineamiento (microalineamientos de Standford) realizados por Gaidzik VI et al. (n=269, pero n=19 muestras de pacientes con datos de nivel de expresión de CXXC5 disponibles y translocación t(8;21)) se analizaron tal como se describe anteriormente. Entonces se extrajo la expresión de ARNm de CXXC5 y los pacientes se han clasificado en tres grupos equivalentes (A y B), según un nivel de expresión de RINF alto (n=7),

45 intermedio (n=6), o bajo (n=6). Para el panel B, se han fusionado los grupos bajo (n=6) e intermedio (n=6) (n=12). Obsérvese que el número de pacientes no era exactamente equivalente para la estratificación de los 3 grupos (n=6, 6 frente a 7) ya que el número total de pacientes no era un múltiplo de 3 (n=19). Entonces se correlacionaron los grupos de pacientes con alto, intermedio y bajo nivel de ARNm de CXXC5 con los desenlaces clínicos con respecto a la supervivencia que también se consultaron a través de la página web de Gene Expression Omnibus. Las curvas de Kaplan-Meier (para el análisis de supervivencia) y la prueba de rango logarítmico se realizaron usando el programa estadístico SPSS 15.0. Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles.

Figura 6: La figura 6 se refiere a la tasa de supervivencia para moléculas marcadoras descritas en la técnica como

55 moléculas marcadoras adecuadas en leucemia. La cohorte se clasificó en dos o tres grupos, respectivamente, basándose en los niveles de expresión del marcador respectivo. (A) ERG, MECOM BAALC, (B) MN1, WT1.

Figura 7: En la figura 3 la expresión de ARNm de RINF (a un tiempo de diagnóstico) es mayor en el grupo de pacientes con leucemia linfocítica aguda (n=197) que recaían después del tratamiento que en personas que no muestran recaída.

Figura 8. La expresión de ARNm de RINF se aumenta durante la progresión de leucemia mieloide crónica de la fase crónica (CP) a crisis blástica (BC). Los datos de expresión génica de RINF (CXXC5) se extrajeron de una lista de genes (tabla de apoyo 4 o 10423Table4.xls) disponible en línea en la página web de PNAS 65 (http://www.pnas.org/content/103/8/2794/suppl/ DC1). CP: fase crónica (n=42), AP: fase acelerada mediante los criterios de recuento de blastos (n=9) o mediante la incidencia de cambios citogenéticos clónicos adicionales (n=8),

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Descripción detallada de la presente invención

5 En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar la progresión de la enfermedad

o un pronóstico de supervivencia de un paciente con leucemia mieloide aguda, o el riesgo de una recaída de leucemia mieloide aguda en un paciente con diagnóstico de y, opcionalmente, tratado frente a leucemia mieloide aguda, caracterizado porque dicho método comprende:

a) determinar el nivel de expresión de ARNm de RINF en una muestra biológica de dicho paciente,

b) comparar el nivel de expresión de ARNm de RINF en dicha muestra con un nivel de referencia de RINF,

por lo cual un nivel de expresión de ARNm de RINF en dicha muestra de dicho paciente menor que el nivel de

15 referencia se correlaciona con un mejor pronóstico y una supervivencia incrementada de dicho paciente, una progresión más lenta de la enfermedad o un menor riesgo de una recaída, y por lo cual un nivel de expresión de ARNm de RINF en dicha muestra mayor que el nivel de referencia se correlaciona con una supervivencia disminuida y un mal pronóstico, una progresión más rápida de la enfermedad o un mayor riesgo de recaída.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” o “individuo” o “paciente” que se usa en el presente documento de manera intercambiable se refiere a un individuo o un sujeto o un paciente que necesita una terapia o que se sospecha que está afectado por un estado o enfermedad, concretamente leucemia. Preferiblemente, el sujeto o individuo es un vertebrado, incluso más preferido un mamífero, particularmente preferido un ser humano.

25 El método según la presente divulgación se lleva a cabo preferiblemente recogiendo una muestra del individuo y determinando in vitro el nivel de RINF usando medios apropiados.

El término “muestra de control” o “muestra de referencia” tal como se usa en el presente documento se refiere por ejemplo a una muestra de un individuo de la misma especie cuyo individuo no padece leucemia. Alternativamente, la “muestra de control” o “muestra de referencia” es una muestra que representa la mediana de un panel de pacientes afectados por leucemia. En otra realización, la “muestra de control” es una muestra de línea celular (por ejemplo tal como NB4, HL60, K562, MCF7).

Una muestra según la invención es un material biológico, que se ha obtenido de un individuo. El término “muestra” y

35 “muestra biológica” se usan en el presente documento de manera intercambiable. En particular, dichos términos incluyen material obtenido a partir de sangre, plasma, tejido, médula ósea, suero o tumor, biopsia tumoral o muestra que contiene células neoplásicas.

La expresión “nivel” o “cantidad” pretende describir el nivel relativo de dichas moléculas según la presente invención en relación con la misma molécula en una muestra de control o muestra de referencia, o la cantidad absoluta de dichas moléculas según la presente invención. Relativo significa que no se declaran distintas cantidades tales como moles o miligramos por litro etc., pero que por ejemplo se declara que la muestra contiene más, menos o la misma cantidad de una determinada molécula en comparación con una muestra de control. El término “más, menos o la misma cantidad” en esta situación incluye también unidades arbitrarias.

45 Con “elevado” o “mayor” y por otra parte “disminuido” o “menor” según la invención se entiende que la molécula está presente en una muestra en cantidades o concentraciones mayores (o menores, respectivamente), en comparación con otra muestra, o en comparación con una muestra de control o en comparación con una muestra de referencia o en comparación con un valor de referencia, independientemente de si estas mediciones son mediciones relativas o absolutas. Preferiblemente, la molécula que se aumenta o disminuye está presente en una concentración, o cantidad que es de al menos el 10%, como al menos el 20%, por ejemplo al menos el 30%, o el 50% por encima o por debajo del valor con el que se compara. En otras palabras, preferiblemente, la molécula se aumenta o disminuye en al menos 2 veces, por ejemplo 3 veces, 4 veces o incluso 5 veces o más por encima o por debajo del nivel y/o cantidad en la muestra de control o de referencia. Por ejemplo, la molécula en la muestra es mayor de 4,5 veces el nivel de

55 células NB4 medido en la muestra de referencia.

Con “estratificación de un sujeto” según la invención se pretende determinar el régimen de terapia para el tratamiento de leucemia. En particular, dicha estratificación incluye determinar si dicho sujeto se beneficiará de un tratamiento específico, quimioterapia por irradiación, o trasplante de células madre.

El pronóstico es un término médico para describir el desenlace probable de una enfermedad. En este documento, un buen “pronóstico de supervivencia” se correlaciona con una alta tasa de supervivencia de los pacientes y “mal pronóstico de supervivencia” se correlaciona con una baja tasa de supervivencia del grupo de pacientes.

65 Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar un pronóstico de supervivencia para un paciente con leucemia mieloide aguda, comprendiendo dicho método:

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(a): determinar una medida para el nivel de expresión de ARNm de RINF en una muestra biológica de dicho paciente,

(b): comparar el nivel de expresión de ARNm de RINF en dicha muestra con un nivel de referencia de RINF,

5 en el que un nivel de expresión de RINF menor que el nivel de referencia en dicha muestra se correlaciona con una probabilidad o tasa de supervivencia incrementada de dicho paciente, y en el que un nivel de expresión de RINF mayor que el nivel de referencia en dicha muestra se correlaciona con una probabilidad o tasa de supervivencia disminuida.

Con respecto a esto, los términos “una medida para el nivel” y “nivel” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

En una realización preferida, dicha muestra biológica es sangre completa, suero, plasma, líquido, médula ósea, un

15 tumor, o una biopsia tumoral o muestra que contiene células neoplásicas. De hecho, la muestra biológica puede ser una fracción de sangre o médula ósea, por ejemplo, es una preferiblemente CMSP (células mononucleares de sangre periférica) o BMMC (células mononucleares de médula ósea), aislada después de una separación por gradiente de densidad de ficol, y/o enriquecimiento por clasificación de células CD34+.

Una realización preferida se refiere a leucemia mieloide aguda (LMA). Además, se prefiere que la leucemia sea una leucemia con cariotipo normal o CBF, más preferiblemente una leucemia mieloide aguda con cariotipo normal.

En una realización preferida dicha medida para el nivel de expresión de RINF se determina mediante la cuantificación de la expresión de ARNm que codifica para una proteína RINF, o una cuantificación de un ácido

25 nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o un fragmento funcional o variante de los mismos, o una secuencia de ADN aislada funcionalmente equivalente que puede hibridarse a los mismos.

Con respecto a esto, el término “que puede hibridarse a los mismos” se refiere a condiciones en las que las secuencias hibridan en condiciones rigurosas de hibridación (véase, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982), molecular Cloning/ a laboratory manual, páginas 387 a 389) a las secuencias de SEQ ID NO 1 ó

2. Un ejemplo de una condición rigurosa de hibridación es hibridación a 4 x SSC a 65ºC, seguido por un lavado en 0,1 x SSC a 65ºC durante una hora. Alternativamente, una condición rigurosa de hibridación a modo de ejemplo es en formamida al 50%, 4 x SSC a 42ºC.

35 Además, el término “fragmento funcional” se refiere a unos fragmentos de SEQ ID N.os 1 ó 2 que tienen la misma funcionalidad que el polipéptido codificado por SEQ ID N.os 1 ó 2, respectivamente. Además, el término “variante” se refiere a unas moléculas que tienen la misma funcionalidad que las moléculas de ácido nucleico de SEQ ID N.os 1 y 2 o los polipéptidos codificados por dichas secuencias, como el polipéptido de SEQ ID NO 3.

En una realización preferida adicional está el nivel de expresión de RINF en relación con dicho nivel de referencia usado para determinar un transcurso de tratamiento apropiado para dicho paciente.

En una realización preferida está el nivel de expresión de RINF determinado por RT-PCR cuantitativa. Más preferiblemente, dicha RT-PCR cuantitativa usa oligonucleótidos que seleccionan como diana SEQ ID NO 1 o SEQ

45 ID NO 2 para determinar la expresión de RINF, y más preferiblemente dicha RT-PCR usa cebadores que amplifican el exón 3 y 4, o exón 1 y 2 de SEQ ID NO 3.

Preferiblemente, el nivel de expresión de RINF se determina basándose en la expresión relativa de RINF normalizada con respecto a la expresión del gen rpP2, también conocido como proteína ribosómica grande P2, RPLP2 (HGNC: 10377). Preferiblemente, los cebadores para la detección de SEQ ID NO 1 ó 2 son 5’tccgctgctctggagaag-3’ (SEQ ID N.º 4), 5’-cacacgagcagtgacattgc-3’ (SEQ ID N.º 5) y 6-FAM-aacccaaagctgccctctcc-BBQ (SEQ ID N.º 8).

Preferiblemente, los cebadores para la detección de rpP2 son 5’-atgcgctacgtcgcc-3’ (SEQ ID N.º 6), 5’55 ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3’ (SEQ ID N.º 7) y Cy5-agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-BBQ (SEQ ID N.º 9).

6-FAM es una tinción fluorescente soluble en agua reactiva. Es un isómero de carboxifluoresceina, ampliamente usada para marcar oligonucleótidos para aplicaciones de PCR a tiempo real. 6-FAM se excita como máximo a 492 nm y emite como máximo a 517 nm.

Cy5 (cianina-5) es una tinción fluorescente soluble en agua reactiva de la familia de tinciones de cianina. Cy5 se excita como máximo a 649 nm y emite como máximo a 670 nm, en la parte de rojo lejano del espectro.

BBQ significa extintor BlackBerry es un “extintor oscuro” para cada tinción fluorescente. Los extintores no

65 fluorescentes son fundamentales para aplicaciones de múltiplex con más de una tinción. Un extintor oscuro es una sustancia que absorbe energía de excitación de un fluoróforo y disipa la energía como calor (mientras que un Por supuesto, cualquier otro marcador o etiqueta puede usarse para efectuar el análisis en consecuencia. El experto es muy consciente de moléculas de etiqueta o marcadoras adecuadas.

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5 Preferiblemente, la amplificación mediante PCR se lleva a cabo mediante una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min, y entonces las muestras atraviesan 44 ciclos de las siguientes condiciones: desnaturalización durante 10 segundos a 95ºC y elongación a 55ºC durante 20 segundos.

En un aspecto adicional el nivel de expresión de RINF se determina inmunoquímicamente basándose en un sistema de detección basado en anticuerpos. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, y es más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, dicho anticuerpo interactúa con un epítopo de una proteína o secuencia de proteínas de SEQ ID NO 3, y más preferiblemente dicho anticuerpo interactúa con los aminoácidos 45-48 de SEQ ID NO 3.

15 En un aspecto adicional, la expresión de RINF se mide mediante un alineamiento de ADN, ARN o proteína.

Los métodos adecuados para detectar el nivel, por ejemplo el nivel relativo y/o cantidad absoluta de RINF en las muestras se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los métodos adecuados incluyen métodos de espectrometría de masas adecuados, por ejemplo desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI), ionización por Electrospray (ESI) continua o pulsada y métodos relacionados tales como ionospray o termospray o impacto de agrupaciones masivo. Las fuentes iónicas pueden coincidir con formatos de detección incluyendo tiempo de vuelo (TOF) de reflejo lineal o no lineal, cuadrupolo individual o múltiple, sector magnético individual o múltiple, resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FTICR), trampa iónica, y combinaciones de los mismos. Otros

25 métodos por espectrometría de masas adecuados son por ejemplo bombardeo con átomos rápidos (FAB), espectrometría de masas, desorción (ionización) por láser de superficie mejorada (SELDI), espectrometría de masas, etc.

Además, métodos inmunológicos adecuados entre otros son inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), ensayos ELISA de tipo sándwich, directos, indirectos, o competitivos, inmunoensayos ligados a enzimas por puntos (ELIspot), radioinmunoensayos (RIA), ensayos de citometría de flujo (FACS), inmunohistoquímica, inmunotransferencia de tipo Western, ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), ensayos de chip de proteína usando por ejemplo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, ligandos de receptor u otros agentes que unen las moléculas de la divulgación.

35 Entre otros, hibridación por inmunotransferencia de tipo Northern o Southern, hibridación por inmunotransferencia de ranura o punto de ácido nucleico, hibridación in situ, ensayos de chip de ácido nucleico (por ejemplo, usando ARN, ADN u otros ácidos nucleicos para capturar específicamente el ácido nucleico de interés), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR a tiempo real, y en particular, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (RQ-PCR) después de la transcripción inversa pueden usarse como métodos de biología molecular para detectar las moléculas de la invención.

Métodos adicionales, tales como resonancia magnética nuclear (RMN), fluorometría, colorimetría, radiometría, luminometría u otros métodos de espectrometría, cromatografía líquida, cromatografía capilar, cromatografía de

45 capa fina, resonancia de plasmones, electroforesis en gel de una o dos dimensiones etc. pueden usarse para detectar las moléculas de la invención.

En otra realización preferida el nivel y/o cantidad de RINF se determina a nivel de ARNm. Particularmente se prefiere la determinación que se lleva a cabo mediante RQ-PCR, por ejemplo aplicando métodos conocidos de PCR a tiempo real. Otro aspecto preferido se refiere a la determinación del nivel y/o cantidad de RINF a nivel de proteína. Por ejemplo, dicho nivel puede determinarse mediante métodos inmunológicos tal como se explica de manera resumida anteriormente usando anticuerpos anti-RINF específicos.

En una realización adicional, dicho método comprende además una etapa (c); (c) clasificar dicho paciente como que

55 pertenece a o bien un primer o bien un segundo grupo de pacientes, en el que dicho primer grupo de pacientes que tiene niveles de expresión de RINF menores que el nivel de referencia se clasifica como que tiene una probabilidad aumentada de supervivencia, una progresión más lenta de la enfermedad, un mejor pronóstico o menor riesgo o recaída en comparación con dicho segundo grupo de pacientes que tiene niveles de expresión de RINF mayores que el nivel de referencia.

En una realización adicional, dicho método comprende además una etapa (c);

(c) clasificar dicho paciente como que pertenece a o bien un primer o bien un segundo grupo de pacientes, en el que dicho primer grupo de pacientes que tiene niveles de expresión de RINF menores que dicho segundo grupo

65 de pacientes, y en el que el primer grupo de pacientes se clasifica como que tiene una probabilidad aumentada de supervivencia, una progresión más lenta de la enfermedad, un mejor pronóstico o menor riesgo o recaída en

comparación con dicho segundo grupo de pacientes.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para monitorizar la eficacia de un transcurso de tratamiento para un paciente con leucemia mieloide aguda, comprendiendo dicho método: 5

(a): determinar un nivel de expresión de ARNm de RINF en una muestra biológica de dicho paciente antes del tratamiento, y

(b): determinar el nivel de expresión de ARNm de RINF en una muestra que contiene células neoplásicas de dicho paciente después del tratamiento, por lo cual la comparación del nivel de expresión de RINF antes del tratamiento con el nivel de expresión de RINF después del tratamiento indica la eficacia de dicho tratamiento, en el que un descenso en el nivel de expresión de RINF después del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz frente a dicha leucemia.

15 Además, la presente divulgación se refiere a un método para la estratificación del paciente que está afectado por leucemia para determinar el régimen de terapia para el tratamiento de leucemia que comprende

a) el nivel relativo y/o la cantidad absoluta de RINF en una muestra de dicho paciente;

b) comparar el nivel y/o cantidad de RINF con el nivel y/o cantidad de RNIF en una muestra de control, con el nivel y/o cantidad de RINF en muestras obtenidas antes del inicio de la terapia de dicho paciente, u obtenidas en estadios anteriores del régimen de terapia de dicho paciente.

Un tercer aspecto de la presente divulgación se refiere a un uso según cualquiera de las reivindicaciones del

25 método, en el que se usa al menos un miembro de detección de RINF en un kit para determinar un pronóstico de supervivencia para un paciente con leucemia.

Un cuarto aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit para determinar un pronóstico de supervivencia para un paciente con leucemia, caracterizado porque dicho kit comprende compuestos que pueden detectar el nivel de expresión de RINF en una muestra biológica.

Aspectos preferibles para el segundo, tercer y cuarto aspecto (independientemente para cada aspecto) se indican a continuación:

35 -dicha leucemia es LMA, LLA, LMC, o LLC, preferiblemente leucemia mieloide aguda, y más preferiblemente leucemia mieloide aguda con cariotipo normal o CBF (factor de unión al núcleo) (LMA-CBF se caracterizan por una translocación t(8:21) o inversión inv(16), respectivamente). LMA-CBF habitualmente responde bien a la quimioterapia. Sin embargo, algunos de estos pacientes no responden bien a la terapia y se ha reconocido que estos grupos se caracterizan por una alta expresión de RINF.

-dicha muestra biológica se obtiene a partir de médula ósea, sangre o tejido, como plasma, suero, líquido, un tumor, o una biopsia tumoral o muestra que contiene células neoplásicas.

-dicha medida para el nivel de expresión de RINF se determina mediante la cuantificación de la expresión de

45 ARNm que codifica para una proteína RINF, o una cuantificación de un ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o un fragmento funcional o variante de los mismos, o una secuencia de ADN aislada funcionalmente equivalente que puede hibridarse a los mismos.

-el nivel de expresión de RINF en relación con dicho nivel de referencia se usa para determinar un transcurso de tratamiento apropiado para dicho paciente.

-el nivel de expresión de RINF se determina mediante RT-PCR cuantitativa. Más preferiblemente, dicha RT-PCR cuantitativa usa oligonucleótidos también determinados sondas de hidrólisis que seleccionan como diana SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 para determinar la expresión de RINF, y más preferiblemente dicha RT-PCR usa

55 cebadores que amplifican el exón 3 y 4, o exón 1 y 2 de SEQ ID NO 3.

Con respecto a esto, el término “sondas de hidrólisis” se usa para definir oligonucleótidos de ADN específicos de secuencia que están químicamente modificados (marcados tanto con una tinción fluorescente como una tinción extintora) con el fin de monitorizar fácilmente la concentración de un ADN específico durante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qRT PCR). La fluorescencia emitida (cuando se excita por una fuente de luz externa en cada ciclo de PCR) es proporcional a la cantidad del producto de ADN específico formado.

La química de sonda de hidrólisis recae sobre la actividad 5’-3’-exonucleasa de la Taq polimerasa, que degrada una sonda de ADN no extensible hibridada durante la etapa de extensión de la reacción en cadena de la polimerasa 65 (PCR). Esta sonda se diseña para hibridar específicamente a una región dentro del amplicón y está marcado doblemente con una tinción fluorescente y un extintor. La estrecha proximidad del extintor suprime la fluorescencia

imagen7

-El nivel de expresión de RINF se determina basándose en la expresión relativa de RINF normalizada con 5 respecto a la expresión del gen rpP2.

-Los cebadores para la detección de SEQ ID NO 1 ó 2 son 5’-tccgctgctctggagaag-3’ (SEQ ID N.º 4), 5’cacacgagcagtgacattgc-3’ (SEQ ID N.º 5) y 6-FAM-aacccaaagctgccctctcc-BBQ (SEQ ID N.º 8).

-Los cebadores para la detección de rpP2 son 5’-atgcgctacgtcgcc-3’ (SEQ ID N.º 6), 5’-ttaatcaaaaaggccaaatcccat3’ (SEQ ID N.º 7) y Cy5-agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-BBQ (SEQ ID N.º 9).

-La amplificación mediante PCR se lleva a cabo mediante una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min, y entonces las muestras atraviesan 44 ciclos de las siguientes condiciones: desnaturalización durante 10 segundos 15 a 95ºC y elongación a 55ºC durante 20 segundos.

-El nivel de expresión de RINF se determina inmunoquímicamente basándose en un anticuerpo. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, y es más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, dicho anticuerpo interactúa con un epítopo de una proteína o secuencia de proteínas de SEQ ID NO 3, y más preferiblemente dicho anticuerpo interactúa con los aminoácidos 45-48 de SEQ ID NO 3.

-La expresión de RINF se mide mediante un alineamiento de ADN, ARN o proteína.

Sección experimental

25 Materiales y métodos

RT-PCR cuantitativa de RINF

Se llevó a cabo la síntesis de ADNc de primera cadena (RT) comenzando con ARN total (1 g) en un volumen de 20 l usando cebadores oligodT con transcriptasa inversa Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche, n.º de cat 05 531 287 001) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron las PCR cuantitativas usando sondas de hidrólisis específicas que seleccionan como diana el gen CXXC5 en una máquina LightCycler 480 (Roche) según las instrucciones del fabricante del kit Lightcycler® 480 ProbesMaster (n.º de cat 04 707 494 001). Se normalizaron las

35 expresiones de ARNm relativas con respecto a la expresión del gen rpP2 en una reacción de dúplex de dos colores. Se diseñaron cebadores para la detección de CXXC5 (5’-tccgctgctctggagaag-3’ (SEQ ID N.º 4), 5’cacacgagcagtgacattgc-3’ (SEQ ID N.º 5) y 6FAM-aacccaaagctgccctctcc-BBQ (SEQ ID N.º 8)) y rpP2 (5’atgcgctacgtcgcc-3’ (SEQ ID N.º 6), 5’-ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3’ (SEQ ID N.º 7) y Cy5agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-BBQ (SEQ ID N.º 9)), para usarse en las mismas condiciones de una amplificación por PCR a tiempo real. Después de la desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min, se hizo que las muestras atravesaran 44 ciclos de las siguientes condiciones: desnaturalización durante 10 segundos a 95ºC y elongación a 55ºC durante 20 segundos.

Análisis de la expresión de ARNm de CXXC5 en un conjunto de datos de microalineamiento y análisis de correlación 45 con la supervivencia global de pacientes con leucemia mieloide aguda con una citogenética normal.

Se descargó un conjunto de datos de microalineamiento para el que estaban disponibles (1) los datos de expresión de ARNm de CXXC5, y (2) los datos de supervivencia en línea, de la página web de Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con número de registro GSE12417. Se realizó este conjunto de datos de microalineamiento originalmente por Metzeler et al., véase anteriormente con el fin de desarrollar una señal de expresión génica para predecir un desenlace de tratamiento para pacientes con leucemia mieloide aguda con cariotipo normal (n=163 muestras de pacientes). Para cada plataforma de microalineamiento (Affymetrix GeneChip® Human Genome U133A, Affymetrix GeneChip® Human Genome U133B, y Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus 2,0), todos los datos sin procesar de expresión génica se normalizaron usando RMA con el software 55 Expression Console de Affymetrix. Se calculó la expresión de ARNm de CXXC5 como la intensidad media de los 3 conjuntos de sonda que seleccionaban como diana CXXC5 (222996_s_at, 224516_s_at y 233955_x_at). También se extrajeron datos de expresión génica para algunos factores de pronóstico WT1 (206067_s_at y/o 206067_s_at), MN1 (205330_at), BAALC (222780_s_at), ERG (241926_s_at), MECOM (EVI, 226420_at) ya aprobados. Entonces se agruparon pacientes en dos (por encima o por debajo de la mediana) o tres (alta, intermedia o baja expresión génica) grupos según su intensidad media de CXXC5. Entonces se correlacionaron los grupos de pacientes con alto

o bajo nivel de ARNm de CXXC5 (RINF) con los desenlaces clínicos con respecto a la supervivencia que también se consultaron a través de la página web de Gene Expression Omnibus (archivo “E-GEOD-12417.sdrf.xls”). Las curvas de Kaplan-Meier (para el análisis de supervivencia) y la prueba de rango logarítmico se realizaron usando el programa estadístico SPSS 15.0.

65 Detección de RINF mediante anticuerpos También puede determinarse la expresión de RINF mediante un enfoque con anticuerpos. Se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Wearwen tal como se describe previamente por Wu ILO, Dudognon C, Nguyen E, et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) reappraised: nucleolin and telomerase cross

imagen8

5 paths. J Cell Sci. 2006; 119:2797-2806.

Se produjo anticuerpo específico de péptido policlonal de conejo adaptado frente a RINF por Biogenes GmBH. El péptido inmunogénico corresponde a los aminoácidos 45-58 de la proteína RINF. Se confirmó la especificidad del anticuerpo mediante inhibición competitiva de la señal de inmunotransferencia de tipo Western mediante la adición del péptido inmunógeno a la disolución de anticuerpo primario. En resumen, se incubaron las inmunotransferencias con anticuerpo primario frente a RINF (anticuerpo policlonal), y entonces con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa apropiado. Se realizó la detección de proteína usando un sistema de detección quimioluminiscente (Amersham Pharmacia Biotech).

15 Kit

Para los estudios de expresión del gen/proteína, RINF, mencionado anteriormente puede usarse cualquier método para detectar cuantitativamente el producto amplificado, incluyendo, por ejemplo usar cualquier tinción fluorescente

o sonda marcada y métodos habituales.

La cuantificación de una muestra que contiene un número desconocido de secuencias diana normalmente se lleva a cabo con referencia a una “curva patrón” generada a partir de una serie de amplificaciones de muestras que contienen la secuencia diana en un intervalo de cantidades conocidas. La curva patrón se usa para calcular un número de copias de entrada a partir de la señal generada durante una amplificación. Por tanto, el número de copias

25 de secuencia diana desconocida en la muestra de interés se estima usando la curva patrón calculando el número de copias que se determinó previamente para obtener una señal igual a la observada. Entonces se calcula la concentración de la secuencia diana en la muestra a partir del número de copias de entrada y el tamaño de muestra, que se determina antes de la reacción.

Las estimaciones cuantitativas pueden ser sensibles a la variabilidad en o bien el tamaño de muestra de entrada o bien en la eficiencia de reacción. El efecto de la variabilidad inter-reacción del tamaño de muestra de entrada sobre la concentración de RINF calculada puede eliminarse usando un gen de control. Se selecciona un gen de control que proporciona una medida independiente de la cantidad de ARN en la muestra. Se ajusta la concentración calculada del ARNm de RINF basándose en la medida independiente de la muestra.

35 La variabilidad en la eficiencia de amplificación entre las reacciones usadas para generar la curva patrón y la reacción usada para someter a ensayo la muestra de interés puede afectar a la aplicabilidad de la curva patrón. Llevando a cabo las reacciones usadas para generar la curva patrón simultáneamente con la reacción usada para someter a ensayo la muestra de interés, usando la misma “mezcla maestra” de reactivos de amplificación, y, preferiblemente, en pocillos adyacentes en el mismo ciclador térmico, minimizará la variación inter-reacción en eficiencia. Alternativamente, puede usarse un patrón interno para ajustar los resultados para representar la variación en eficiencia de amplificación.

El efecto de variabilidad inter-reacción de eficiencia de reacción entre las reacciones usadas para generar la curva

45 patrón y la reacción usada para someter a ensayo la muestra de interés puede eliminarse usando una muestra de interés y se amplifica con un patrón interno. El patrón interno se añade a la reacción en un número de copias conocido y se coamplifica junto con la diana de ARNm de RINF. La señal generada a partir de la cantidad conocida del patrón interno proporciona una indicación de la eficiencia de reacción global que puede usarse para ajustar la diferencia estimada en número de copias para representar la diferencia en eficiencias de reacción.

El patrón interno es una secuencia de nucleótidos que contiene los mismos sitios de unión a cebador presentes en la diana de manera que se amplifica por el mismo par de cebadores, pero puede distinguirse de la secuencia diana o bien por longitud o bien, preferiblemente, por la presencia de una secuencia interna única. El patrón interno se incluye en unas amplificaciones de número de copias conocido de la muestra de interés y se amplifica con

55 aproximadamente la misma eficiencia que la secuencia diana. Cualquier cambio en la señal generada mediante amplificación del patrón interno en relación con la señal esperada de la curva patrón refleja un cambio en la eficiencia de reacción global y se usa para ajustar la estimación del número de copias de secuencia diana de manera correspondiente.

El cuarto aspecto de la divulgación se refiere a kits que comprenden componentes útiles para practicar el presente método: Un kit útil puede contener cebadores de oligonucleótido y, opcionalmente, sondas específicas para las regiones diana del ARNm de RINF descritas. Otros componentes opcionales del kit incluyen, por ejemplo, cualquier producto habitual conocido por el científico experto en el campo para la amplificación por RT-PCR cuantitativa como, agentes para catalizar la síntesis de extensión de cebador (enzimas, tampón), los desoxinucleótido trifosfatos 65 (dNTP), ácidos nucleicos de patrón interno, un ARN de referencia (control positivo), ácido nucleico de control no amplificado (control negativo), tampones apropiados para reacciones de PCR o hibridación, e instrucciones para

5

15

25

35

45

55

llevar a cabo el presente método. Por ejemplo, el control de referencia puede ser ARN de líneas celulares tales como NB4, K562, HL60, o MCF7.

Otro kit, u otro componente en el mismo kit, puede contener SYBR Green, cebadores de oligonucleótido y, opcionalmente, específico para las regiones diana del RINF. Otros componentes del kit incluyen, nucleótido trifosfatos de sustrato, patrón interno, agentes para catalizar la síntesis de extensión de cebador, control positivo, y control negativo.

Los ejemplos de la presente invención presentados en el presente documento se proporcionan solo con fines ilustrativos y no para limitar el alcance de la invención.

Resultados

La invención y los resultados de los experimentos que conducen a la invención se describirán ahora adicionalmente, con referencia a las siguientes figuras:

La figura 1 muestra que una alta expresión de ARNm de RINF se refiere a un mal pronóstico en LMA con cariotipo normal LMA-CN (n=163). En estas cohortes, las supervivencias acumulativas (Kaplan-Meier) se representan según los niveles de expresión de ARNm de RINF detectados por alineamientos de Affymetrix (HG-U133B o U133 plus 2,0). Los pacientes se han clasificado en dos grupos equivalentes (A), según una expresión por encima (alta, n=81)

o por debajo de (baja, n=81) la mediana, o en 3 grupos equivalentes (B y C), según un nivel de expresión de RINF alto (n=55), intermedio (n=54), o bajo (n=54). Obsérvese que debido a un número impar de pacientes (n=163), el paciente en la mediana se ha censurado para la estratificación de los 2 grupos y no eran exactamente equivalentes para la estratificación de los 3 grupos (n=55 frente a 54). Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles.

Las figuras 2 a 5 resumen los resultados del estudio GSE23312 en LMA. En este estudio, están disponibles los datos para individuos que padecen LMA con todos los subgrupos citogenéticos. Tal como se muestra en las figuras 2, 3, 4, y 5, baja expresión de ARNm de RINF se refiere a un mejor pronóstico en todos los subtipos de LMA, incluyendo cariotipo normal, así como con inversión o translocación (LMA-CBF).

Las figuras 6a y 6b muestran la predicción de desenlaces de supervivencia mediante la medición de expresión génica de factores de pronóstico WT1, MN1, BAALC, ERG, MECOM (EVI1) en la misma cohorte de pacientes con LMA con cariotipo normal LMA-CN (n=163). Se extrajeron expresiones génicas de ARNm con los conjuntos de sonda específicos WT1 (206067_s_at y/o 206067_s_at), MN1 (205330_at), BAALC (222780_s_at), ERG (241926_s_at) y MECOM (EVI, 226420_at). Las supervivencias acumulativas (Kaplan-Meier) se representan según los niveles de expresión de ARNm detectados por alineamientos de Affymetrix (HG-U133A, HGU133B o U133 plus 2,0). Al igual que para ARNm de RINF, los pacientes se han clasificado en dos grupos equivalentes (A), según una expresión por encima (alta, n=81) o por debajo de (baja, n=81) la mediana, o en 3 grupos equivalentes (B y C), según un nivel de expresión de RINF alto (n=55), intermedio (n=54), o bajo (n=54). Obsérvese que debido a un número impar de pacientes (n=163), el paciente en la mediana se ha censurado para la estratificación de los 2 grupos y no eran exactamente equivalentes para la estratificación de los 3 grupos (n=55 frente a 54). Los valores de p (prueba de rango logarítmico) de la comparación de los diversos grupos de pacientes se indican en los paneles. En particular, tal como se muestra en las figuras 2a y 2b, ninguno de estos factores de pronóstico ya aprobados era tan eficiente como RINF para predecir el desenlace de supervivencia (tal como se indica por los valores de p) de estos pacientes con LMA con cariotipo normal.

Además, se sometió a prueba una cohorte de pacientes con LLA para determinar si la expresión de ARNm de RINF puede correlacionarse con el riesgo de recaída. Para todos los pacientes con LLA (n=197) de esta cohorte, se analizaron los datos de expresión de RINF mediante análisis por microalineamiento (estudio GSE13576) tal como se describe para la cohorte de LMA (GSE12417). Tal como se muestra en la figura 7, la expresión de ARNm de RINF mediana no era equivalente en los diferentes grupos de pacientes que recayeron o no recayeron. Además, tal como se muestra en la tabla 1 una alta expresión de ARNm de RINF se asocia con un mayor riesgo de recaída (el 11,7% frente al 4,6%), y más especialmente de recaída temprana (el 9,1% frente al 3%). Una alta expresión de ARNm de RINF predice un riesgo aumentado en tres veces de recaída temprana en comparación con baja expresión de RINF. Alta y baja expresión de ARNm de RINF, respectivamente, representa el grupo de pacientes con una expresión de ARNm de RINF por encima o por debajo de la mediana.

tabla 1 leucemia linfocítica aguda (LLA), GSE13576 5

Alta RINF (n=98): Baja RINF (n=99) Total (n=197)

Sin recaída (%): 75 (38%) 90 (45,7%) 165

Recaída (%) -Recaída temprana -Recaída tardía: 23 (11,7%) 18 (9,1%) 5 (2,6%) 9 (4,6%) 6 (3%) 3 (1,5 %) 32 24 8

15

25

35

45

55

A partir de los resultados anteriores resulta evidente que RINF representa una medida que permite determinar la progresión de la enfermedad o un pronóstico de supervivencia del paciente con leucemia, en particular, leucemia mieloide o linfocítica/linfoblástica aguda y crónica, o el riesgo de una recaída o leucemia en un paciente con diagnóstico de y, opcionalmente, tratado frente a leucemia. Además, RINF permite estratificar regímenes de terapia de pacientes afectados por leucemia. Esto está en contraposición con otros marcadores descritos hasta este punto. Por ejemplo, tal como se muestra en el presente documento, otros marcadores descritos en la técnica, como MN1 o WT1 no permiten identificar los diferentes grupos de pacientes afectados por leucemia, o al menos en menor grado de los que es posible para RINF y, por tanto, no permite juzgar acerca de un mayor riesgo de recaída o acerca de la progresión de la enfermedad así como acerca del pronóstico de supervivencia y para estratificar los regímenes de terapia tal como es posible basándose en RINF. En la figura 7 la expresión de ARNm de RINF (a un tiempo de diagnóstico) es mayor en el grupo de pacientes con leucemia linfocítica aguda (n=197) que recaían después del tratamiento que en personas que no muestran recaída.

Además, estudios en leucemia linfoide crónica (LLC) (estudio de microalineamiento GSE10138) demostraron que una alta expresión de ARNm de RINF se asocia con un mayor riesgo de progresión, véase la tabla 2, a continuación:

Tabla 2

Alta RINF (n=6): Baja RINF (n=62) Total (n=68)

Estable (%): 1 (16,7%) 35 (57,1%) 36 (53%)

Progresiva (%): 5 (83,3%) 27 (42,9%) 32 (47%)

Además, en leucemia mieloide crónica basándose en los datos de GSE4170, se aumenta la expresión de RINF durante la progresión de LMC de la fase crónica a crisis blástica, véase la figura 8. Los datos de expresión génica de RINF (CXXC5) se extrajeron de una lista de genes (tabla de apoyo 4 o 10423Table4.xls) disponible en línea en la página web de PNAS (http:// www.pnas.org/content/103/8/2794/suppl/DC1). CP: fase crónica (n=42), AP: fase acelerada mediante los criterios de recuento de blastos (n=9) o mediante la incidencia de cambios citogenéticos clónicos adicionales (n=8), BC: crisis blástica (n=28). Por tanto, la expresión de RINF puede usarse como marcador para identificar las etapas de progresión en leucemia linfocítica y también mieloide crónica.

Cuantificar el nivel de ARNm relativo de RINF en células neoplásicas de pacientes con leucemia puede ayudar a los médicos a determinar si un tumor es o no es de buen o mal pronóstico, así como si un determinado tratamiento es probable que sea exitoso. En el caso de leucemia, y especialmente en el caso de LMA, estos indicadores de pronóstico son importantes para los médicos para distinguir el grupo de pacientes que se beneficiaría más probablemente de una quimioterapia (habitualmente, enfermedad con un pronóstico favorable) de pacientes que no lo harían y que deberían considerarse para un trasplante de células madre (habitualmente, pacientes con un pronóstico desfavorable y una edad menor de 60).

Los resultados demuestran que la cuantificación de la expresión de ARNm de RINF puede ser un factor pronóstico significativo de la supervivencia del paciente y progresión de leucemia.

En efecto, extrayendo los datos de expresión de ARNm de CXXC5 de varios estudios de microalineamiento independientes disponibles en bases de datos públicas, y correlacionándolos con el desenlace clínico, se ha sometido a prueba y demostrado por primera vez, una fuerte correlación, entre una alta expresión de ARNm de RINF y baja tasa de supervivencia para pacientes que padecen leucemia, más precisamente LMA, LLA, LLC, y LMC, más precisamente LMA con citogenética normal así como con LMA-CBF (translocación t(8;21) o inv(16)).

Supuesto lo mejor del conocimiento, ningún estudio previo ha examinado la relación entre la expresión de ARNm de RINF y el pronóstico en leucemia de un paciente. Esta idea inventiva se sometió a prueba ya que se ha sido la primera vez que se ha observado que este gen tenía un papel importante en la diferenciación de células mieloides y estaba desregulado en tipos celulares cancerosos. Sin embargo, y de manera importante, estos resultados no eran obvios debido a que muchos genes mostraron estar desregulados en cáncer, de hecho no tienen valor predictivo con respecto a la respuesta a la terapia o la supervivencia de un paciente. Además, mientras que el documento WO2009/151337 describe que la inducción de la expresión de ARNm de RINF (por ácido retinoico) se correlaciona con una detención del crecimiento del modelo de células leucémicas NB4 in vitro de leucemia promielocítica aguda (LMA-con t(15;17)) (y la remisión/recaída clínica de los pacientes). En el presente documento, se encontró sorprendentemente la tendencia opuesta en leucemia (LMA, LLA, LLC), ya que la expresión de RINF en el diagnóstico se correlaciona con un fenotipo más agresivo de las células leucémicas (una menor tasa de supervivencia de pacientes, o una menor probabilidad de respuesta a la terapia, o una mayor probabilidad a la recaída, o una mayor probabilidad de que la enfermedad progrese a un mayor riesgo).

Además, no era “obvio”” debido a que tampoco se encontró esta tendencia en otras hemopatías malignas (mieloma) en las que alta RINF no parece correlacionarse con la supervivencia. Este es un campo de investigación importante en cáncer debido a que existen pocos datos para ayudar a médicos a elegir qué tratamiento es el mejor para qué pacientes o para determinar cuándo se justifica un cambio en el tratamiento.

Potencialmente, esta herramienta puede ser útil en la clínica para médicos para tomar sus decisiones acerca de si 5 un tratamiento está ayudando. El objetivo final es continuar un tratamiento eficaz, pero evitarles a los pacientes los efectos secundarios de un tratamiento que está destinado al fracaso.

Para concluir, la presente divulgación proporciona un marcador con propiedades superiores con respecto a un marcador de la técnica anterior que permite determinar la progresión de leucemia en un paciente afectado por la 10 misma o permite proporcionar un pronóstico de supervivencia de un paciente con leucemia. Además, la presente divulgación permite determinar el riesgo de una recaída de leucemia en un paciente con diagnóstico de y, opcionalmente, tratado frente a leucemia basándose en la expresión de RINF. Además, la presente divulgación permite estratificar regímenes de terapia de individuos afectados por leucemia. Además, tal como se demuestra en el presente documento en los cuatro tipos mayoritarios de leucemia, LLA, LLC, LMA, LMC, RINF representa un

15 marcador adecuado, y, notablemente, comparando RINF por primera vez en la misma cohorte con otros marcadores bien conocidos en la técnica, como MN1, WT1, ERG, MECOM o BAALC, RINF tiene una capacidad claramente superior de predecir la supervivencia con respecto a estos otros marcadores.

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. Método para determinar la progresión de la enfermedad o un pronóstico de supervivencia de un paciente con leucemia mieloide aguda, o el riesgo de una recaída de leucemia mieloide aguda en un paciente con

5 diagnóstico de y, opcionalmente, tratado frente a leucemia mieloide aguda, caracterizado porque dicho método comprende:

a) determinar el nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en una muestra biológica de dicho paciente,

b) comparar el nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en dicha muestra con un nivel de referencia de CXXC5,

por lo cual un nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en dicha muestra de dicho paciente menor que el nivel de referencia se correlaciona con un mejor pronóstico y una supervivencia incrementada de dicho

15 paciente, una progresión más lenta de la enfermedad o un menor riesgo de una recaída, y por lo cual un nivel de expresión de ARNm de CXXC5 en dicha muestra mayor que el nivel de referencia se correlaciona con una supervivencia disminuida y un mal pronóstico, una progresión más rápida de la enfermedad o un mayor riesgo de recaída.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que la leucemia mieloide aguda es leucemia mieloide aguda con cariotipo normal.
3.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra biológica se

proporciona a partir de médula ósea, sangre o tejido, como plasma, suero, médula ósea, tumor, biopsia 25 tumoral o muestra que contiene células neoplásicas.
4.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de CXXC5 se determina mediante la cuantificación de la expresión de ARNm que codifica para CXXC5 o una cuantificación de un ácido nucleico que comprende una secuencia de SEQ ID N.º 1 o SEQ ID N.º 2.
5.

Método según la reivindicación 4, en el que el nivel de CXXC5 se determina mediante RT-PCR cuantitativa, por lo cual se amplifican al menos partes de SEQ ID N.º 1 o SEQ ID N.º 2, opcionalmente en el que dicha RT-PCR usa cebadores que amplifican el exón 3 y 4, o exón 1 y 2 de SEQ ID N.os 1 a 2, y/o en el que el nivel de expresión de CXXC5 se determina basándose en la expresión relativa de CXXC5 normalizada con

35 respecto a la expresión del gen rpP2 también conocido como RPLP2 (fosfoproteína ribosómica ácida P2).
6. Método según la reivindicación 4, en el que los cebadores y sonda para determinar el nivel de SEQ ID N.º 1 ó 2 son:

5’-tccgctgctctggagaag-3’ (SEQ ID N.º 4), 5’-cacacgagcagtgacattgc-3’ (SEQ ID N.º 5) y 6-FAMaacccaaagctgccctctcc-BBQ (SEQ ID N.º 8), o

los cebadores y sonda para determinar el nivel de rpP2 son:

45 5’-atgcgctacgtcgcc-3’ (SEQ ID N.º 6), 5’-ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3’ (SEQ ID N.º 7) y Cy5agctgaatggaaaaaacattgaagacgtc-BBQ (SEQ ID N.º 9).
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho método comprende además la etapa de

c1) clasificar dichos pacientes como que pertenecen a o bien un primer o bien un segundo grupo de pacientes, en el que dicho primer grupo de pacientes que tiene niveles de expresión de ARNm de CXXC5 menores que el nivel de referencia se clasifica como que tiene una probabilidad aumentada de supervivencia, una progresión más lenta de la enfermedad, un mejor pronóstico o menor riesgo o recaída

55 en comparación con dicho segundo grupo de pacientes que tiene niveles de expresión de ARNm de CXXC5 mayores que el nivel de referencia; o

c2) clasificar dicho paciente como que pertenece a o bien un primer o bien un segundo grupo de pacientes, en el que dicho primer grupo de pacientes que tiene niveles de expresión de ARNm de CXXC5 menores que dicho segundo grupo de pacientes, y en el que el primer grupo de pacientes se clasifica como que tiene una probabilidad aumentada de supervivencia, una progresión más lenta de la enfermedad, un mejor pronóstico o menor riesgo o recaída en comparación con dicho segundo grupo de pacientes.
8. Método según la reivindicación 1, en el que cuando se compara el nivel de expresión de ARNm de CXXC5

65 antes del tratamiento con el nivel de expresión de ARNm de CXXC5 después de o durante el tratamiento indica la eficacia de dicho tratamiento en el que un descenso en el nivel de expresión de ARNm de CXXC5

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imagen2

después del tratamiento indica que el tratamiento es eficaz frente a dicha leucemia mieloide aguda.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de control o muestra de referencia es de un individuo no afectado por leucemia mieloide aguda.

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