ES2616435T3 - Cinacalcet y tumores neuroblásticos - Google Patents
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Abstract
La presente invención pertenece al campo de la terapia de tumores pediátricos o del desarrollo. En concreto, se refiere al uso del activador alostérico del receptor sensor de calcio, cinacalcet, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores neuroblásticos, en particular para el tratamiento de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas.
Description
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DESCRIPCION
Cinacalcet y tumores neuroblasticos Campo de la invencion
La presente invencion pertenece al campo de los tumores pediatricos o del desarrollo infantil. En concreto, la invencion se refiere al activador alosterico del receptor sensor de calcio, cinacalcet, para su uso en el tratamiento de tumores neuroblasticos.
Antecedentes de la invencion
Se conocen como tumores del desarrollo infantil aquellos que se manifiestan principalmente durante la edad pediatrica o que unicamente se manifiestan en esta etapa. Por esta razon a veces se les denomina tambien tumores pediatricos. En el contexto de la presente invencion se usara indistintamente el termino tumor del desarrollo infantil o tumor pediatrico.
Dentro del grupo de los tumores del desarrollo infantil estan los neuroblastomas (NB), ganglioneuroblastomas (GNB) y ganglioneuromas (GN), que conforman el grupo de los tumores neuroblasticos (TN). Los tumores neuroblasticos son los tumores solidos extracraneales mas frecuentes de la infancia y se desarrollan a partir de celulas de la cresta neural ya comprometidas en la formacion del sistema nervioso periferico, por lo que se localizan en la medula suprarrenal o en los ganglios nerviosos de la cadena simpatica paravertebral. La mayona de los NB, GNB y GN localizados presentan indices de supervivencia excelentes, pero los NB metastasicos, pese a ser sometidos a terapias intensivas multimodales, tienen aun hoy dfa indices de supervivencia que rondan el 40%.
Los tumores neuroblasticos son un grupo de tumores muy heterogeneo desde el punto de vista clmico, anatomopatologico, genetico y biologico. Las bases biologicas responsables de la diversidad clmica de los TN se conocen solo parcialmente, pero se hallan sin duda tras las diferentes formas de respuesta de los tumores a los protocolos de tratamiento. Entre ellas, destacan las alteraciones de la ploidfa, las translocaciones desequilibradas, las deleciones o adiciones de regiones cromosomicas recurrentes y la amplificacion del oncogen MYCN. Estas alteraciones genetico-moleculares, aunque cruciales para el comportamiento biologico de los TN, apenas pueden ser modificadas terapeuticamente. Antes de que se describieran con mas detalle, se sabfa que los TN mas diferenciados y con mayor proporcion de componente estromal tipo Schwann (NB en diferenciacion, GNB y GN) estaban asociadas a un mejor pronostico que los NB indiferenciados. Se han descubierto algunas de las vfas moleculares responsables de los procesos de diferenciacion celular en TN. Estas rutas son de gran importancia terapeutica ya que son modulables farmacologicamente. Asf, por ejemplo, el acido retinoico induce diferenciacion en lmeas celulares de NB y en los tumores de los pacientes, mejorando la supervivencia global de un subgrupo de ellos. Algunos NB son resistentes a la accion de este farmaco, pero la falta de un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares responsables de la diferenciacion de los TN dificulta el diseno de nuevos agentes diferenciadores que puedan beneficiar a un mayor numero de pacientes.
El gen del receptor sensor de calcio (CASR) se clono en 1993 a partir de celulas paratiroideas bovinas y forma parte de la familia C de la superfamilia de receptores acoplados a protemas G (GpCR), junto a ocho receptores del glutamato, dos receptores GABA-B, algunos receptores del gusto y el sensor de aminoacidos GPRC6A. Esta familia de receptores detecta senales de iones, aminoacidos y nutrientes, entre otros, y las transmiten al medio intracelular. Todos ellos comparten una estructura similar que se compone de un gran dominio extracelular amino-terminal, siete helices transmembrana y una cola intracelular carboxilo-terminal. En el caso de CASR, su principal funcion es detectar las fluctuaciones del Ca2+ extracelular y regular consecuentemente la secrecion de hormona paratiroidea (PTH) en las glandulas paratiroides y de calcitonina en las celulas C del tiroides, hormonas encargadas de normalizar la calcemia. En el contexto de las paratiroides, la activacion de CASR por el calcio se traduce en una disminucion de la regulacion y produccion de la hormona paratiroidea (PTH), lo que a su vez disminuira la concentracion plasmatica de calcio para mantenerla dentro de un estrecho margen (1,1-1,3 mM).
Se ha hallado expresion de CASR en distintas neoplasias con la particularidad de que se le atribuyen funciones muy distintas, incluso contrapuestas, en diferentes contextos tumorales. Asf, por ejemplo, se ha descrito que la activacion de CASR promueve proliferacion y metastasis en carcinoma de prostata, mientras que los datos parecen apoyar que participa en los procesos de diferenciacion en carcinoma de colon.
Existen agonistas directos de CASR (o agonistas de tipo 1) y activadores alostericos de CASR (o agonistas de tipo 2). Los primeros, como son Ca2+, Mg +, Gd3+, neomicina, L-aminoacidos, activan CASR mediante interaccion directa con el dominio extracelular del mismo. En cambio, los activadores alostericos no activan al receptor por sf mismos sino que alteran su estructura tridimensional, de manera que se torna mas sensible al estimulo del calcio. El cinacalcet es un activador alosterico del receptor sensor de calcio. En la patente US 5.688.938 se describen varios agonistas de CASR, como NPS R-467 y NPS R-568, siendo NPS R-568 (denominado tambien R-568) el mas activo. Asimismo, la patente US 6.296.833 describe el uso de agonistas o antagonistas del calcio para el tratamiento de cancer. En la presente solicitud se describe el uso de cinacalcet para la preparacion de un medicamento para el
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tratamiento de tumores neuroblasticos. Sorprendentemente el uso de cinacalcet resulta en importantes ventajas ya que es capaz de inducir apoptosis de celulas tumorales a menor concentracion que otros agonistas de CASR.
Objeto de la invencion
La presente invencion se refiere a cinacalcet para su uso en el tratamiento de tumores neuroblasticos, en particular para el tratamiento de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1A muestra la morfologfa de celulas SK-N-LP con (paneles inferiores) o sin (paneles superiores) sobreexpresion de CASR tras 16 horas sometidas a deprivacion de suero y posterior exposicion a CaCl2 3 mM durante 24 y 48 horas. La figura 1B muestra un analisis de viabilidad celular en la lmea celular SK-N-LP, con sobreexpresion de CASR (barra negra) o sin sobreexpresion de CASR (barra vada), tras 16 horas de deprivacion de suero y exposicion posterior a CaCl2 0,5 mM, 1,4 mM o 3 mM durante 48 horas. La figura 1C muestra un analisis mediante inmunotransferencia Western de la activacion de caspasa 3 y clivaje de PARP en celulas SK-N-LP nativas (wild type, WT) y en celulas SK-N-LP con sobreexpresion de CASR (CASR) tras ser expuestas durante 24 h (dos primeros carriles) y 48 h (dos ultimos carriles) al modelo in vitro descrito en el apartado A.
La figura 2 muestra la viabilidad celular de lmeas celulares nativas de neuroblastoma tratadas in vitro con cinacalcet o con NPS R-568 durante 72 horas. Se representa el porcentaje de viabilidad respecto al control frente a la concentracion (Conc.) en pM de cinacalcet (circulo) o R-568 (cuadrado). Las lmeas celulares analizadas son las siguientes: LAN-1 (Fig. 2A), SK-N-LP (Fig. 2B), SK-N-JD (Fig. 2C), SK-N-BE(2)c (Fig. 2D), LA1-5s (Fig. 2E), LA1-55n (Fig. 2F) y SK-N-AS (Fig. 2G).
La figura 3 muestra el examen morfologico de xenoimplantes generados a partir de las lmeas celulares LAN-1 (Fig. 3A, 3C, 3E) y SK-N-LP (Fig. 3B, 3D, 3F) tratados con cinacalcet (Fig. 3C-3F) o no (Fig. 3A, 3B). Se muestran espedmenes en los que el cinacalcet produjo mayoritariamente muerte celular (Fig. 3C, 3D) o citodiferenciacion (Fig. 3E, 3F).
Descripcion detallada de la invencion
En un aspecto, la presente invencion se refiere a cinacalcet para su uso en el tratamiento de tumores neuroblasticos. En una realizacion particular, se refiere a cinacalcet para su uso en el tratamiento de neuroblastomas. En otra realizacion particular, se refiere a cinacalcet para su uso en el tratamiento de ganglioneuroblastomas. En otra realizacion particular, se refiere a cinacalcet para su uso en el tratamiento de ganglioneuromas.
Como se ha mencionado en el apartado de antecedentes, la patente US 5.688.938 describe NPS R-568 como el compuesto agonista de CASR mas activo. A este respecto, en la presente invencion se llevan a cabo ensayos comparativos de los efectos del uso de cinacalcet y R-568 en el tratamiento de tumores neuroblasticos. Sorprendentemente, cinacalcet presenta una serie de ventajas frente a NPS R-568 desde el punto de vista farmacologico y farmacodinamico. Uno de los efectos mas importantes y sorprendentes del cinacalcet es la induccion de apoptosis a concentraciones significativamente mas bajas que el NPS R-568 (Figura 2, Tabla 1). Esto supone importantes ventajas del cinacalcet frente a otros agonistas de CASR ya que permite un tratamiento eficaz con la administracion de una dosis menor de medicamento lo que en general implica menor riesgo de que aparezcan efectos secundarios o toxicidad y mayor tolerancia al tratamiento, ademas de facilitar la administracion y pauta de administracion. Estas ventajas se muestran especialmente relevantes cuando un farmaco se debe administrar de manera sostenida en el tiempo, como puede ser el caso del cinacalcet administrado para el tratamiento de los tumores neuroblasticos. Estos tumores presentan frecuentes recafdas, lo que hace previsible que este tratamiento, igual que otros utilizados en el contexto de enfermedad minima residual para evitar la recafda, deba administrarse de manera continuada durante un largo periodo de tiempo. Asimismo, es posible que si un tumor ha respondido adecuadamente al tratamiento inicial con cinacalcet se pueda beneficiar de la reutilizacion de este farmaco en caso de reaparecer (tras la remision inicial), estrategia que se ha mostrado util con diversos tratamientos en oncologfa (rechallenging).
Ejemplos
A continuacion se detallan unos ejemplos concretos de realizacion de la invencion que sirven para ilustrar la invencion.
Ejemplo 1. Analisis de los efectos promovidos in vitro por la activacion de CASR mediante calcio en lmeas celulares de neuroblastoma con o sin sobreexpresion de CASR.
Celulas SK-N-LP nativas, establemente transfectadas con pCMV-GFP o con pCMV-CASR-GFP (1x106) en RPMI 10% FBS fueron sembradas en placas P100. Al dfa siguiente, el medio se sustituyo por uno libre de suero (DMEM libre de calcio suplementado con albumina bovina al 0,2%, L-glutamina 4 mM y CaCl2 0,5 mM). Este se mantuvo durante 16 horas, antes de sustituirlo por el mismo medio suplementado o no con CaCl2 hasta 3 mM. Se observo asf que las celulas con sobreexpresion de CASR sufnan muerte celular en este modelo cuando eran expuestas a CaCl2
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3 mM (Figura 1A, panel inferior) pero no a 0,5 mM (datos no mostrados). Este fenomeno, que se iniciaba sobre las 6 horas tras el tratamiento con calcio y era masivo a partir de las 48 horas, apenas era apreciable en las lmeas celulares nativas o transfectadas con pCMV-GFP (Figura 1A, panel superior). En estas ultimas, se detectaron indicios de muerte celular, pero las celulas continuaron proliferando hasta alcanzar confluencia, mientras que las celulas con sobreexpresion de CASR desaparecieron completamente en 5 d^as.
Para cuantificar la disminucion de la viabilidad celular, se realizo el mismo modelo en placas de 24 pocillos en las lmeas y clones mencionados mas arriba (Figura 1B). A las 48 horas, se cuantifico el porcentaje de celulas viables mediante el sistema CellTiter 96(r) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) de Promega. Se observo asf que la viabilidad celular de las celulas con sobreexpresion de CASR (barra negra, Figura 1B) disminrna significativamente mas que la de la lmea celular SK-N-LP nativa (barra vada, Figura 1B).
Con el fin de determinar si el proceso de muerte celular tema lugar mediante apoptosis, se extrajeron protemas totales de celulas SK-N-LP nativas (wild-type, WT) y con sobreexpresion de CASR (CASR) a las 24 y 48 horas de exposicion a este modelo. Las protemas se sometieron a electroforesis en gel SDS-PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos espedficos para detectar caspasa 3 activada y c-PARP (Cell Signaling). Se utilizaron anticuerpos secundarios apropiados marcados con peroxidasa y el revelado se efectuo con el sistema ECL de Amersham. Asf, se puso de manifiesto que la muerte celular inducida por activacion de CASR mediante calcio se acompana de activacion de caspasa 3 y clivaje de PARP (Figura 1C), lo cual es compatible con muerte celular por apoptosis.
Ejemplo 2. Analisis de los efectos sobre la viabilidad celular promovidos in vitro por cinacalcet y NPS R-568 en siete lmeas celulares de neuroblastoma.
Se sembraron 5x103 celulas de cada lmea celular (LAN-1, SK-N-BE(2)c, LA1-55n, LA1-5s, SK-N-LP, SK-N-JD, SK- N-AS) en placas de 96 pocillos (6 replicas por condicion). Al dfa siguiente, se retiro el medio inicial (RPMI 10% FBS) y se sustituyo por el mismo medio que contema concentraciones diversas (100 |jM, 65 |jM, 30 |jM, 25 |jM, 20 |jM, 15 |jM, 10 jiM, 5 jiM, 3 jiM, 1 jiM, 0,3 jiM) de cinacalcet (Selleck Biochemicals) o NPS R-568 (Tocris) o cantidades equivalentes de DMSO (Sigma-Aldrich). A las 72 horas, se evaluo la viabilidad celular mediante la cuantificacion del porcentaje de celulas viables mediante el sistema CellTiter 96(r) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) de Promega. Se observo asf que ambos farmacos indudan una disminucion de la viabilidad celular en las 7 lmeas celulares examinadas (Figura 2), y que en 5 de ellas la CI50 (concentracion de farmaco que produce la muerte del 50% de las celulas con respecto al control) de cinacalcet era menor que la de NPS R-568 de manera estadfsticamente significativa (Tabla 1). En el caso de las lmeas celulares SK-N-AS y LA1-55n la diferencia en el efecto promovido por ambos farmacos no fue estadfsticamente significativa (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de CI50 obtenidos al tratar con cinacalcet o NPS R-568 siete lmeas celulares nativas de neuroblastoma.
- Lmea celular
- Cinacalcet NPS R-568 P valor
- LAN-1
- 17,19 24,81 < 0,0001
- SK-N-LP
- 10,31 22,38 < 0,0001
- SK-N-JD
- 10,92 25,82 < 0,0001
- SK-N-BE(2)C
- 10,69 16,65 < 0,0001
- LA1 -5s
- 16,73 34,5 < 0,0001
- LA1-55n
- 10,52 11,42 no significativo
- SK-N-AS
- 10,26 15,14 no significativo
Ejemplo 3. Analisis de los efectos del tratamiento con cinacalcet en un modelo in vivo de neuroblastoma.
Se generaron xenoimplantes de las lmeas celulares LAN-1 y SK-N-LP para lo cual se inocularon partes almuotas de 10x106 celulas provenientes de dichas lmeas celulares subcutaneamente en ratones hembra atfmicos nu/nu de 4-6 semanas (Charles Rivers). A partir del dfa 12, cuando el tumor en formacion ya era medible con pie de rey, se inicio el tratamiento de 6 dfas por semana con cinacalcet 100 mg/kg por via oral (Figuras 3C-3F) y con el vehmulo como control negativo (Figuras 3A y 3B). Se midio el volumen tumoral cada 2-3 dfas. A los 40 dfas, los ratones se sacrificaron. Cada tumor se peso antes de fraccionarlo en dos mitades: una de congelo en nitrogeno lfquido para el analisis de expresion y la otra se fijo y se embebio en parafina para el examen morfologico y los analisis inmunohistoqmmicos. En el analisis morfologico de los xenoimplantes de ambas lmeas celulares tratadas con
cinacalcet, se observaron espedmenes en los que hada grandes areas con necrosis y/o apoptosis (Figuras 3C y 3D) y/o signos morfologicos de diferenciacion en las celulas que eran viables (Figuras 3E y 3F).
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1) Cinacalcet para su uso el tratamiento de tumores neuroblasticos.5 2) Cinacalcet para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el tumor neurobastico es un neuroblastoma.3) Cinacalcet para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el tumor neurobastico es un ganglioneuroblastoma.4) Cinacalcet para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el tumor neurobastico es un ganglioneuroma.
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