ES2613745T3 - Secuenciación de proteínas de una sola molécula - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el tipo de una proteína en un líquido que comprende la proteína, comprendiendo el método: a) funcionalizar una proteína con al menos 2 tipos de marcadores de aminoácidos, que son selectivos para 2 tipos de aminoácidos de proteína predefinidos, b) guiar en la fase líquida la proteína funcionalizada con una máquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada, a través de un área de detección de un detector, configurado para detectar una señal en función de los marcadores de los aminoácidos marcados; c) determinar, a partir de la señal detectada, una secuencia de los aminoácidos de proteína predefinidos; d) comparar la secuencia de los aminoácidos de proteína predefinidos con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de proteínas y determinar el tipo de proteína en el líquido.

Description

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DESCRIPCION

Secuenciacion de protemas de una sola molecula Campo de la invencion

La invencion se refiere a un metodo (de una sola molecula) para determinar el tipo de una protema (mediante secuenciacion), as^ como a un dispositivo que puede usarse para dicho metodo.

Antecedentes de la invencion

Metodos para analisis de protemas de una sola molecula son conocidos en la tecnica. El documento WO2010065531, por ejemplo, describe que dichos metodos pueden usarse para el descubrimiento de nuevos biomarcadores, cuantificacion y cribado de alto rendimiento. Se indica que peptidos unidos a la superficie son capaces de ser secuenciados directamente usando una degradacion de Edman modificada seguida por deteccion, p. ej., deteccion de anticuerpos marcados. El cribado de alto rendimiento se habilita usando combinados de moleculas (p. ej., anticuerpos marcados) para identificar y cuantificar analitos de protemas individuales en una muestra biologica.

Ademas, el documento WO2010144151 describe composiciones, metodos y sistemas para realizar analisis en tiempo real, de una sola molecula, de reacciones analfticas en las que se esta produciendo smtesis de protemas. La capacidad de analizar dichas reacciones proporciona una oportunidad de estudiar esas reacciones asf como de potencialmente identificar factores y/o estrategias para influir en dichas reacciones, p. ej., para mejorar, inhibir, o afectar de otro modo a dichas reacciones incluyendo, aunque sin limitarse a, afectar a la tasa, procesividad, fidelidad, duracion y similares, de la reaccion. Este documento describe especialmente un metodo de determinacion de una secuencia de aminoacidos codificada por una molecula de ARNm diana, que comprende: a) proporcionar una mezcla de reaccion que comprende la molecula de ARNm diana, un complejo ribosomico que comprende tMet- ARNt, tMet en el sitio P, y una pluralidad de tipos de aminoacil-ARNt marcados, libres en solucion, en donde el ribosoma y/o la molecula de ARNm diana esta inmovilizada/o sobre un soporte, de modo que un volumen de observacion contenga no mas de un ribosoma y/o molecula de ARNm, y en donde ademas el complejo ribosomico no comprenda un marcador detectable o un grupo de extincion; b) iniciar una traduccion procesiva de la molecula de ARNm por el complejo ribosomico; c) durante dicha traduccion procesiva, detectar secuencial y opticamente la asociacion del complejo ribosomico con al menos un primer aminoacil-ARNt marcado y un segundo aminoacil-ARNt marcado, donde dicha asociacion da como resultado una incorporacion de un primer aminoacido del primer aminoacil-ARNt marcado y un segundo aminoacido del segundo aminoacil-ARNt marcado en una cadena polipeptfdica naciente; y d) identificar el primer aminoacido y el segundo aminoacido, determinando de este modo una secuencia de aminoacidos codificada por la molecula de ARNm diana.

Sumario de la invencion

La invencion se describe segun las reivindicaciones adjuntas, en detalle de la siguiente manera. Las protemas son la base de la vida, dado que son los engranajes de funcionamiento en todas las formas de vida. Para entender los fenomenos biologicos, se requiere tener un conocimiento exhaustivo de las protemas implicadas. La secuenciacion de protemas, que determina la secuencia de aminoacidos de una protema, se usa para obtener un perfil de poblaciones de protemas, de lmeas celulares a tejidos celulares a organismos individuales. Desde la primera secuenciacion de protemas de insulina en los anos 1950, la tecnologfa de secuenciacion ha evolucionado de forma constante para abrir la era de la proteomica, el mapeo exhaustivo de las protemas celulares.

La secuenciacion de protemas moderna se basa principalmente en tecnicas de espectrometna de masas (ESI, MALDI, etc.). Cada una tiene sus propias ventajas y desventajas, pero todas ellas comparten las mismas limitaciones. En primer lugar, pueden analizar solamente fragmentos de protemas (de aproximadamente 10-20 aminoacidos). Cuando se examinan protemas de longitud completa (normalmente de varios cientos de aminoacidos de longitud), una complicacion computacional impide una prediccion de secuencias precisa. En segundo lugar, a menudo no consiguen reconocer especies secundarias integradas entre otras especies dominantes, dado que la prediccion de secuencias se realiza mediante analisis de picos espectrales complejos. Dado que muchas protemas celulares existes en baja abundancia, esto hace diffcil obtener informacion proteomica a gran escala.

En la secuencia de ADN, se afrontan desaffos similares, pero se superan cuando se amplifican muestras de ADN hasta que se consigue una elevada relacion de senal con respecto a ruido. A diferencia del ADN, no existe ninguna maquinaria natural que pueda amplificar protemas. En esta memoria se pretende desarrollar un metodo completamente novedoso que pueda cuantificar protemas celulares con una precision tan elevada como para tecnicas a gran escala, y usar cantidades de muestra tan pequenas como una sola celula.

Por lo tanto, es un aspecto de la descripcion proporcionar un metodo (de secuenciacion) (de una sola molecula) alternativo para determinar el tipo de una protema y/o un dispositivo alternativo para determinar el tipo de una protema, especialmente adecuado para uso en dicho metodo (de una sola molecula) alternativo, metodo y/o dispositivo que preferiblemente obvian al menos parcialmente, ademas, una o mas de las limitaciones descritas anteriormente.

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Por lo tanto, se propone un novedoso metodo de secuenciacion usando una tecnica de fluorescencia de una sola molecula. Este nuevo enfoque explorara protemas, molecula a molecula, sin tomar solamente su promedio; por lo tanto, puede abarcar protemas completas a pesar de la compleja naturaleza y el amplio intervalo dinamico de protemas celulares. A diferencia de la secuenciacion basada en espectrometna de masas, este enfoque leera la secuencia de protemas de longitud completa, lo que hara a la prediccion de secuencias menos propensa al error. La deteccion de una sola molecula es tan sensible que este enfoque puede requerir solamente una pequena cantidad de muestra (no mas de 1 fmol) para el analisis de protemas celulares. Esto creara la oportunidad de analisis de celula unica. Estas ventajas contrastan con las limitaciones de la espectrometna de masas, lo que normalmente requiere 103-105 veces mas protemas para el analisis.

Este nuevo metodo puede estar marcado por tres conceptos novedosos: (1) identificacion genetica (“fingerprinting”), (2) manipulacion basada en enzimas, y (3) secuenciacion en tiempo real. Dado que el analisis de los inventores sugiere que la secuencia de una protema (ya) puede predecirse con la lectura de solamente dos tipos de aminoacidos (vease acerca del poder de prediccion mas adelante), las protemas pueden identificarse sondeando dos aminoacidos diferentes solamente, tales como residuos de cistema y lisina solamente. Para controlar el proceso de secuenciacion con precision nanometrica, puede aplicarse una protema chaperona (p. ej., ClpXP), aunque tambien pueden aplicarse otras maquinas transportadoras moleculares adecuadas. Usando microscopfa de fluorescencia de una sola molecula, se vigilaran sustratos de secuenciacion individuales que estan siendo sondeados mediante, p. ej., protemas ClpXP individuales en tiempo real. Por lo tanto, la tecnica novedosa es especialmente adecuada para la secuenciacion de protemas que tienen al menos 300 aminoacidos, aun mas especialmente al menos 600 aminoacidos. Por lo tanto, incluso con tan solo aproximadamente 300 aminoacidos puede realizarse secuenciacion (aunque en algunos casos puede ser posible un numero aun menor; vease tambien mas adelante).

Se aplica una tecnica de nanoporos.

La descripcion proporciona un metodo para analizar una protema en un lfquido (que comprende la protema), especialmente para determinar el tipo de una protema en un lfquido que comprende la protema, comprendiendo el metodo (a) funcionalizar una protema con marcadores de aminoacidos, especialmente al menos 2, tal como 2-8, especialmente 2-4, como solamente 2, tipos de, marcadores de aminoacidos, que son selectivos para especialmente al menos 2, tal como 2-8, especialmente 2-4, como solamente 2, tipos de, aminoacidos de protema predefinidos, especialmente solamente dos marcadores de aminoacidos selectivos para solamente dos aminoacidos, especialmente los aminoacidos C y K, (b) guiar en la fase lfquida la protema funcionalizada con una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada a traves de un area de deteccion de un detector, configurado para detectar una senal en funcion de los marcadores de los aminoacidos marcados (cuando se realiza el guiado, la protema funcionalizada es guiada a traves de un area de deteccion del detector (con la maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada)); (c) determinar, a partir de la senal detectada, una secuencia de los aminoacidos predefinidos; y opcionalmente (d) comparar la secuencia de los aminoacidos predefinidos con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y determinar el tipo de protema en el lfquido. La expresion “marcador de aminoacido” se refiere a un marcador para un aminoacido. En la presente memoria, en lugar de “marcador de aminoacido” tambien se aplica el termino “marcador”. Estos marcadores son especialmente colorantes, vease tambien mas adelante.

Ademas, la descripcion proporciona un dispositivo para determinar el tipo de protema en un lfquido, comprendiendo el dispositivo (a) una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada configurada para guiar a una protema que esta funcionalizada con marcadores (es decir algunos aminoacidos (predeterminados) estan funcionalizados con marcadores) a traves de un area de deteccion de un detector, (b) dicho detector, configurado para detectar una senal en funcion de los marcadores de los aminoacidos marcados, (c) una unidad procesadora, configurada para identificar, a partir de la senal detectora, una secuencia de aminoacidos de la protema funcionalizada, en donde (d) la unidad procesadora esta opcionalmente configurada, ademas, para comparar la secuencia de aminoacidos identificada con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y para (basandose en la comparacion) identificar el tipo de protema. Por lo tanto, el dispositivo puede comprender una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada configurada para guiar una protema que esta funcionalizada con marcadores de aminoacidos, que son selectivos para (especialmente 2-4 tipos de) aminoacidos de protema predefinidos, a traves de un area de deteccion de un detector.

Este revolucionario enfoque de una sola molecula proporcionara una novedosa herramienta de secuenciacion profunda para analisis de protemas. Se esperan diversas aplicaciones en biologfa, biotecnologfa y ciencias medicas. Cuando esta tecnica se desarrolle a una herramienta de mesa en el futuro, se preve que los investigadores medicos seran capaces de dilucidar perfiles de expresion de protemas rastreando variaciones entre individuos, entre diferentes tejidos, y en diferentes condiciones medioambientales. Esta novedosa tecnica de secuenciacion puede cambiar el paradigma de la proteomica y puede convertirse en una herramienta de diagnostico universal.

Un desaffo inmediato para secuenciacion de protemas de una sola molecula es que las protemas estan compuestas por 20 aminoacidos diferentes. A diferencia de la secuenciacion de ADN, que distingue solamente cuatro nucleotidos diferentes (A, G, C y T) y requiere solamente cuatro fluoroforos, la secuenciacion de protemas completas demanda

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20 marcadores fluorescentes. Sin embargo, es practicamente imposible encontrar 20 fluoroforos cuyos espectros no se solapen entre sr

De este modo, se proporcionara un nuevo concepto, “identificacion genetica de protemas”, abordando la secuenciacion de protemas desde un angulo muy diferente a la secuenciacion de ADN. En primer lugar, hay que preguntarse cuanta informacion se necesita para la identificacion de protemas. La secuenciacion de ADN requiere una lectura precisa de cada nucleotido; en caso contrario, la informacion obtenida carece de sentido debido a deleciones, inserciones y mutaciones. La secuenciacion de protemas, por otro lado, no requiere autentica lectura de todos los aminoacidos. En su lugar, con referencia a bases de datos genomicas y proteomicas publicas, la secuenciacion puede reducirse a un problema de identificar protemas entre un combinado de poblaciones de protemas (por ejemplo, -20.000 especies en celulas humanas) en cada organismo.

Supongamos que solamente se leen dos tipos de aminoacidos. Con esta informacion de dos elementos, ^cuantos aminoacidos se deben leer en serie para identificar una protema? Una estimacion matematica, 214 < 20.000 < 215, sugiere que solamente se necesitan leer 15 aminoacidos o mas. Para convertir la informacion de 20 elementos de peptidos de protemas en 2 elementos, se seleccionaran como diana los dos aminoacidos altamente nucleofilos que pueden marcarse tanto eficiente como espedficamente - lisina (Lys, K) y cistema (Cys, C). Tal como se presente en la figura 1a (vease tambien mas adelante), una lectura de aminoacidos K y C se registrara como '...CKCCKCKCKCCKCK...,' y estos datos se usaran para predecir la identidad de protemas. K se observa 1 de cada 20 aminoacidos de promedio; y C, 1 de cada 40. Una protema tfpica tiene -400 aminoacidos de longitud, y de este modo contiene 30 residuos de K y C de promedio. Este numero esta muy por encima del numero mmimo, 15 aminoacidos, que se requiere (en general) para identificacion con referencia a una base de datos de protemas (vease, sin embargo, ademas tambien mas adelante).

Mientras que la prediccion anterior se basa en una simple estimacion matematica, una estimacion del poder de prediccion practico de la identificacion genetica se llevo a cabo usando la base de datos de protemas humanas Uniprot (
www.uniprot.org). Se llevo a cabo un analisis de identificacion genetica computacional usando un proteoma completo y revisado del organismo humano (N.° 9606). Toda la informacion posicional procedente de la base de datos se descargo y cada secuencia de protemas completa se redujo a las secuencias de los aminoacidos C y K solamente (una base de datos de C-K). Dada una secuencia simulada, el programa de los inventores la comparaba con todas las secuencias en la base de datos de C-K y sugena la mejor o mejores coincidencias. La fidelidad de prediccion se define como la inversa del numero de las mejores coincidencias. Para estos analisis computacionales, se adopto tanto un algoritmo de coincidencia punto a punto (que se basa en el analisis de la correlacion) como el algoritmo de Smith-Waterman (Smith, Temple F.; y Waterman, Michael S. (1981). "Identification of Common Molecular Subsequences". Journal of Molecular Biology 147: 195-197).

El analisis de los inventores demuestra que el poder de prediccion alcanza un nivel satisfactorio cuando se leen aproximadamente 17 aminoacidos o mas (figura 1b). Este numero es ligeramente mayor que los 15 aminoacidos que se estimaron, pero mucho mas pequeno que el numero promedio de residuos de K y C, 30, por protema. Por lo tanto, el metodo implica especialmente detectar la presencia de al menos 15, especialmente al menos 17, de los aminoacidos de protema predefinidos en la protema a identificar. Esto puede aplicarse especialmente a protemas humanas. Para protemas no humanas (y/o para protemas no animales), puede ser que menos de al menos 15 aminoacidos amino puedan estar marcados, y seguir obteniendo una buena predictibilidad. Ademas, se observa que, en caso de que la tecnica se use para determinar el tipo de protema entre un numero limitado de protemas predeterminadas, tambien el numero de al menos 15 aminoacidos puede ser menor.

Notese que la frase “detectar la presencia de al menos 15, especialmente al menos 17, de los aminoacidos de protema predefinidos en la protema” no excluye al metodo de secuenciar y medir, ademas, mas de solamente 15, o solamente 17 de las protemas predeterminadas. No se excluye medir mas de, p. ej., (en total) 15 aminoacidos K y C, tales como mas de 20, como mas de 40 aminoacidos.

Ademas, basandose en el principio anterior, se sugiere marcar 2-8 aminoacidos diferentes, especialmente solamente 2-4, tal como incluso solamente 2 aminoacidos diferentes, tales como especialmente Lys (K) y Cys (C). En la presente memoria, la expresion “aminoacido de protema” y expresiones similares se usan para indicar que la invencion se refiere a aminoacidos que es conocido que estan disponibles en procedimientos. En lugar de esta expresion, tambien el termino corto “aminoacidos” se aplica en la presente memoria. El termino “protema” se refiere especialmente a protemas de origen natural, tales como protemas humanas, animales o vegetales.

Se observa que errores de medicion intrmsecos y el marcado del fluoroforo incompleto pueden interferir en la prediccion, dado que conduciran a aparentes deleciones, inserciones, o intercambios de senales de Lys y Cys. El analisis de error indica que la identificacion de protemas es tolerable al -10 % de error en el marcado y la medicion por fluorescencia. Por ejemplo, el analisis de los inventores (figura 4a) muestra que la fidelidad de prediccion (PF) no cae significativamente incluso cuando hay un numero de errores de intercambio (NSE) presentes (es decir el orden de C y K se intercambia durante la exploracion) dada una secuencia CK de 40 de longitud. Se realizo este analisis de error usando tanto un algoritmo de coincidencia punto a punto como el algoritmo de Smith-Waterman.

Para leer residuos C y K de una protema, se necesita un nano-aparato espedfico que despliegue la protema desde

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una conformacion tridimensional complicada hasta una unidimensional lineal y la explore con precision nanometrica. Se propone un enfoque en tiempo real basado en enzimas, usando una herramienta para leer rapidamente (tal como 0,1-60 aminoacidos/s) sin que este implicada ninguna reaccion qmmica. En esta perspectiva, se pretende usar una protema que existe de forma natural que se transloca a lo largo de un sustrato de protemas con interaccion estrecha. La secuenciacion de ADN en tiempo real usa una enzima (ADN polimerasa) que se une a DNA y explora la cadena de ADN, accion que proporciona mas informacion de forma natural sobre la secuencia de ADN.

ClpXP (un complejo de protemas de ClpX y ClpP) es un complejo de chaperona que despliega un sustrato de protemas y se transloca a lo largo de este (figura 2a). Es una enzima procesiva y rapida que se mantiene en contacto estrecho con su sustrato. Una unica ClpXP puede translocarse a lo largo de monomeros concatenados (ocho monomeros de 20 kD, >1000 aminoacidos de longitud). ClpXP puede translocarse a hasta 60 aminoacidos por segundo (Maillard, R.A., Chistol, G., Sen, M., Righini, M, Tan, J., Kaiser, CM., Hodges, C, Martin, A., y Bustamante, C. (2011). ClpX(P) genera fuerza mecanica para desplegar y translocar sus sustratos de protemas. Cell 145, 459469). ClpX tiene un canal de anchura nanometrica, y ClpP tiene poros de anchura naometrica, cuyas dimensiones proporcionan la capacidad de manipular un sustrato de secuenciacion con precision nanometrica. Las propiedades bioqmmicas de ClpXP tales como especificidad del sustrato y resistencia a modificaciones de protemas estan bien caracterizadas. ClpXP puede translocar y degradar sustratos modificados tales como sustratos desnaturalizados qmmicamente, sustratos marcados con colorantes, y protemas reticuladas qmmicamente. ClpXP parece altamente indiscriminado en el procesamiento del sustrato. Se ha descubierto que la modificacion de sustratos de secuenciacion no interferira en la actividad de ClpXP. La secuenciacion de una sola molecula tambien puede requerir modificacion de ClpP o ClpX. La mutacion y el marcado con colorante de ClpP y ClpX parecen ser factibles.

Sin embargo, tambien pueden aplicarse otras proteasas dependientes de ATP. En una realizacion, la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular seleccionada entre el grupo que consiste en entre otros una ClpXP, una ClpAP, una ClpCP, una ClpEP, una ClpYQ (una HslUV), una ClpB, una Lon, una FtsH, una PAN de arqueas y una maquina transportadora molecular basada en el proteasoma (vease tambien Kirstein, J., Molliere, N., Dougan, D.A., y Turgay, K., Adapting the machine: adaptor proteins for HsplOO/Clp and AAA+ proteases, Nature Reviews - Biology, 7 de agosto de 2009, 589-599), especialmente una maquina transportadora molecular basada en ClpXP. Sin embargo, tambien pueden aplicarse otras maquinas transportadoras moleculares (proteasa dependiente de ATP). Estas proteasas dependientes de ATP comparten una estructura basica y un mecanismo de accion comunes, en los que la enzima AAA+ puede seleccionar sustratos de protemas y se transloca a lo largo de ellos de forma procesiva, mientras que la proteasa puede degradar los sustratos de protemas. En una realizacion espedfica, se aplica ClpXP. En otra realizacion mas, se aplica ClpAP.

Usando ClpXP como sonda de exploracion, pueden aplicarse tecnicas de fluorescencia de la siguiente manera. En primer lugar se necesita marcar sustratos de secuenciacion con colorantes. Se seleccionan, aminoacidos altamente nucleofilos, lisina (K) y cistema (C). El grupo amino de K se conjugara con colorante ester de NHS y el grupo tiol de C con colorante maleimida. Las dos reacciones son ortogonales entre sf, lo que impide el marcado cruzado. Estas reacciones qmmicas se producen de forma tan eficiente, alcanzando ~100 % de rendimiento en una condicion de reaccion general (una concentracion micromolar de colorantes reactivos y varias horas de incubacion), que varios kits de marcado estan disponibles en el mercado. Esto hace al procedimiento de marcado eficaz en tiempo y coste. Para garantizar el completo marcado de residuos C y K, se expondran aminoacidos internos a traves de desnaturalizacion de protemas. En lugar o ademas de lisina y cistema, tambien pueden seleccionarse serina, treonina, tirosina, y aminoacidos modificados de forma postraduccional. Por lo tanto, especialmente dos o mas de lisina, cistema, serina, treonina, tirosina, y aminoacidos modificados de forma postraduccional pueden seleccionarse para ser marcados, especialmente dos o mas de lisina, cistema, serina, treonina, y tirosina. En una descripcion, solamente se marcan cistema y lisina.

Entre varios metodos de desnaturalizacion, puede emplearse desnaturalizacion mediada por SDS (dodecilsulfato sodico) e inducida por calor, que es eficaz para alterar estructuras secundaria y terciaria de protemas. Para romper puentes disulfuro, pueden usarse reactivos reductores fuertes (tales como p-mercaptoetanol), en esta condicion de desnaturalizacion rigurosa. En la posterior etapa de marcado con colorante, reactivos reductores se eliminaran preferiblemente dado que pueden interferir en el marcado (con cistema). Esta eliminacion puede llevarse a cabo p. ej., con un procedimiento de precipitacion de protemas general (con acetona, sulfato de amonio, o polietilenimina). Despues del marcado con colorante, puede llevarse a cabo un intercambio de tampon (a traves de dialisis o una columna de exclusion por tamano) o una ronda adicional de precipitacion de protemas para eliminar colorantes en exceso. Estas etapas de purificacion pueden garantizar especialmente que las reacciones de secuenciacion mediadas por enzimas discurren en condiciones biologicamente optimas.

Como resultado del marcado, se entremezclaran colorantes a lo largo de un sustrato de secuenciacion sobre, en general, unos pocos nanometros de distancia. Para resolverlos en orden, se necesita un metodo de imaginologfa de resolucion nanometrica. En este caso se presenta una regla nanometrica, FRET (transferencia de energfa de resonancia por fluorescencia entre fluoroforos donador y aceptor) (Roy, R., Hohng, S., y Ha, T. (2008). A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods 5, 507-516). Mas adelante, tambien se presenta un filtro de nanoporos, que puede usarse para resolver el orden de los marcadores. Con residuos K y C marcados con dos colores diferentes de colorantes aceptores respectivamente (Cy5 y Cy7), las moleculas aceptoras pueden sondearse mediante exploracion con una molecula donadora de Cy3 y midiendo FRET de senales de fluorescencia de Cy5 y

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Cy7 con Cy3. Otros colorantes aceptores tales como Cy3.5 y Cy5.5 (para otros aminoacidos) pueden sondearse de manera analoga. Por lo tanto, los marcadores pueden comprender un fluoroforo organico seleccionado p. ej., entre uno o mas de la familia de cianina, la familia Alexa, la familia Atto, la familia Dy, y la familia de rodamina, aunque otros fluoroforos no estan excluidos.

Tal como se ilustra en la figura 2b, ClpX (un anillo hexamerico, mostrado como una elipse) tiene un puerto de entrada en la parte superior, y ClpP (un dfmero de anillos heptamericos) tiene un supuesto puerto de salida en la parte inferior. Estas dos protemas, unidas estrechamente, son de aproximadamente 16 nm de altura y de aproximadamente 9-15 nm de anchura. Cuando un sustrato de secuenciacion se acopla sobre el puerto de entrada de ClpX mediante su marcador, el sustrato se transloca al interior del canal estrecho (1 nm de ancho) de ClpX y se vuelve desplegado. La protema desplegada es transferida a su protema socia, la proteasa de ClpP, que a continuacion escinde el peptido translocado en fragmentos pequenos.

ClpXP reconoce sustratos que muestran cierta marca espedfica solamente. Una marca bien conocida, XO (TNTAKILNFGR) (Farell, CM., Baker, T.A, y Sauer, R.T., Altered specificity of a AAA+ protease, Molecular Cell 25, 161-166, 12 de enero de 2007, 161-166-), puede ligarse en el extremo N de sustratos de secuenciacion. Puede usarse qmmica de EDC para conjugar el extremo C (grupo carboxilo) del peptido XO sintetico con el extremo N (grupo amino) de los sustratos de secuenciacion. Dado que el grupo amino de Lys tambien es dirigido por qmmica de EDC, este ligamiento requiere consideraciones cuidadosas. En primer lugar, dado que el valor pK del grupo amino alfa (pKa = 8,9) es menor que el del grupo amino epsilon de Lys (pKa = 10,5), la qmmica de EDC puede llevarse a cabo a un pH de 6,5 - 8,5. En segundo lugar, la reaccion de ligamiento puede llevarse a cabo despues del marcado de Lys a pH 9,0-11,0, para minimizar cualquier ligamiento inespedfico. En lugar de la marca XO N-terminal (TNTAKILNFGR), tambien puede aplicarse una marca C-terminal ssrA (AANDENYALAA), o cualquier otra marca No C-terminal (vease tambien Flynn J.M., Neher, S.B., Kim, Y, Sauer, R.T., Baker, A.T., Proteomic Discovery of Cellular Substrates of the ClpXP Protease Reveals Five Classes of ClpX-Recognition Signals, Molecular Cell, Vol.11, marzo de 2003, 671- 683). Por lo tanto, el metodo comprende ademas marcar la protema con una marca (o marcador) que es reconocible por la maquina transportadora molecular.

El radio de la camara de ClpP es ~5 nm. Esta dimension es optima para aprovechar la sensibilidad de FRET, dado que el par Cy3-Cy5 es el mas sensible a 6 nm y el Cy3-Cy7 a 4 nm. Si se coloca el donador (Cy3) en una camara de ClpP, se puede usar esta distancia optima para medir FRET entre el donador (Cy3) y los aceptores (Cy5 y Cy7) de un fragmento peptfdico. Ademas, de esta manera puede evitarse FRET inespedfica entre el donador y un combinado de aceptores cerca del puerto de entrada, dado que la distancia entre el puerto de entrada y la camara de ClpP es 7,5-12,5 nm, mayor que distancias FRET normales (que son del orden de 4-6 nm). Como alternativa, ClpX puede marcarse con un fluoroforo donador de Cy3. Ademas, Cy3, Cy5 y Cy7 se refieren a colorantes de cianina, conocidos en la tecnica, tal como p. ej., se describen en Lee et al, 2010 (Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C, Ha, T., y Hohng, S. (2010). Single-molecule four-color FRET. Angew. Chem Int. Ed. Engl. 49, 9922-9925). Sin embargo, tambien pueden aplicarse otros marcadores, seleccionados entre una o mas de la familia de cianina, la familia Alexa, la familia Atto, la familia Dy, y la familia de rodamina.

Se producira FRET desde el donador con cualesquiera moleculas aceptoras dentro de una camara de ClpP. De este modo, para obtener rastros temporales de FRET de alta calidad, es esencial tener los menos colorantes posibles dentro de una camara en un momento. Para conseguir esto, la tecnica de secuenciacion utiliza la caractenstica unica de ClpP. ClpP escinde una protema en fragmentos y libera cada fragmento fuera de la camara. Especialmente cuando se ralentiza la velocidad de translocacion de ClpX lo suficiente (tal como reduciendo la cantidad de energfa de ATP disponible) (Martin, A., Baker, T.A., Sauer, R.T., Protein unfolding by a AAA+ protease is dependent on AT- hydrolysis rates and substrate energy landscapes, Nature Structural & Molecular Biology, volumen 15, no. 2, febrero de 2008, 139-145; Shin, Y, Davids, J.H., Brau, R.R., Martin, A., Kenniston, J.A., Baker, Sauer, R.T., Lang, M.J., Single-molecule denaturation and degradation of proteins by the AAA+ ClpXP protease, PNAS, 17 de noviembre de 2009, vol. 106, no. 46, 19340-19345), se producira solamente una reaccion de escision que se produce dentro de la camara de ClpP cada vez, que es seguida por la liberacion regida por difusion del fragmento unico. Este esquema de translocacion controlada mantendra el numero de fragmentos dentro de una camara inferior a uno de promedio, lo que permitira interpretar un rastro temporal de FRET con ambiguedad minima. De forma relacionada, este ensayo garantizara tambien que el orden de la liberacion de fragmentos sigue el mismo orden de la secuencia de protema original, lo que minimiza cualesquiera errores de intercambio en la lectura (C <-----> K).

El marcado de ClpX o ClpP con donador y biotina puede llevarse a cabo conjugando el grupo tiol de cistema con colorante maleimida-Cy3 y maleimida-biotina, respectivamente. Tanto ClpX como ClpP de E. coli tienen dos residuos cistema por monomero. Dado que ambos aminoacidos no son conservados entre especies bacterianas, se pueden inactivar ambos de ellos e introducir nuevos residuos de cistema donde deben posicionarse Cy3 y biotina. Las estructuras cristalinas de la protema ClpX y ClpP se utilizaran cuando se asigna la posicion de la mutacion puntual de cistema.

Una camara de ClpP esta compuesta por 14 monomeros de ClpP, lo que plantea dos problemas practicos. En primer lugar, debido a esta estructura oligomerica, la camara puede estar marcada con mas de una molecula donadora. Dado que solamente pueden analizarse senales aceptoras, los multiples colorantes donadores no interferiran en la medicion de los inventores. De hecho, se puede anadir intencionadamente mas de una molecula

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donadora para prolongar el tiempo de observacion total. En segundo lugar, debido a la simetna puntual de la camara de ClpP, el posicionamiento aleatorio de una molecula donadora puede dar como resultado que esta se coloque en un lado no deseado, es decir en la interfaz entre ClpX y ClpP en lugar de adyacente al puerto de salida. Este problema puede resolverse generando una camara de ClpP asimetrica, en la que uno de los anillos esta compuesto por ClpP mutante que no puede interactuar con ClpX. Se marcara con colorante solamente esta ClpP mutante antes de ensamblar la camara. Puede aplicarse el procedimiento tal como se describe por Maglica et al. (Maglica, Z., Kolygo, K., y Weber-Ban, E., Optimal efficiency of ClpAP and ClpXP chaperone-proteases is achieved by architectural symmetry, Structure 17, 2009, 508-516.). Por lo tanto, especialmente la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP, en donde la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una camara de ClpP asimetrica de monomeros de ClpP y al menos un monomero de ClpP mutante, en la que el al menos un monomero de ClpP mutante no puede acoplarse a ClpX, y en donde esta al menos una ClpP mutante esta marcada con donador fluorescente (antes de ensamblar la camara). Se observa que, en el caso de que ClpX este marcada con un fluoroforo donador, no es necesario crear una protema ClpP asimetrica. Por lo tanto, en otra divulgacion, la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP, en donde la ClpX esta marcada con un fluoroforo donador.

Por lo tanto, mas en general, la maquina transportadora molecular puede comprender un donador, especialmente un donador fluorescente (fluoroforo donador), donador que puede estar especialmente configurado para sondear un marcador de aminoacido. Esto puede incluir una ClpXP marcada con donador fluorescente o una ClpAP marcada con donador fluorescente, etc. C1PX o CIPA, etc., puede marcarse. Sin embargo, opcionalmente ademas de o como alternativa, ClpP puede marcarse con el donador fluorescente (fluoroforo donador). Opcionalmente, pueden aplicarse dos o mas marcadores.

Para observar eventos de secuenciacion con fluorescencia de una sola molecula, se pueden inmovilizar protemas de ClpXP sobre una superficie de cuarzo y se obtendran imagenes con microscopfa TIRF (fluorescencia por reflexion interna total). La inmovilizacion puede llevarse a cabo marcando protemas ClpX o ClpP con biotina y presentandolas sobre una superficie de cuarzo estratificada con estreptavidina (figuras 3a-3c). Las reacciones de secuenciacion comenzaran cuando sustratos de secuencia marcados con colorante se introducen en una camara de una sola molecula, especialmente mediante flujo laminar, y se acoplan sobre las protemas ClpXP inmovilizadas mediante difusion dentro de la camara.

Trayectorias temporales de FRET consecuentes pueden obtenerse a resolucion temporal elevada (hasta 10 milisegundos) con una camara CCD del estado de la tecnica (tal como p. ej., Andor, iXon, CCD con multiplicacion de electrones). Para la mejor relacion de senal con respecto a ruido, un trio de colorantes de cianina (Cy3, Cy5 y Cy7) (Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C, Ha, T., y Hohng, S. (2010). Single-molecule four-color FRET, Angew. Chem Int. Ed. Engl. 49, 9922-9925) pueden usarse como pares de FRET. Para foto-parpadeo mmimo y foto- blanqueo lento, pueden usarse un sistema secuestrador de oxfgeno (glucosa oxidasa y catalasa) y un extintor en estado de triplete (Trolox). Tal como se prefiere para prevenir adsorcion inespedfica de protemas sobre una superficie, una superficie de cuarzo se revestira con polfmero (PEG, polietilenglicol). Sin embargo, tambien pueden aplicarse otras superficies. Por ejemplo, pueden aplicarse superficies revestidas con albumina de suero bovino o casema. En el caso en el que en lugar de una senal optica, se evalue una senal electrica (como en el caso de un sistema de nanoporos), la superficie tambien puede estar revestida con protemas o bicapas de lfpidos.

La translocacion de ClpX debe ser suficientemente rapida para que la secuenciacion se complete antes de que la moleculas donadoras se foto-blanqueen. Un reciente estudio de una sola molecula sugiere que la velocidad de ClpX es de 60 aminoacidos por segundo. Esta tasa se convierte en 6,7 segundos por secuenciacion (de un sustrato de protemas de tamano promedio, ~400 aminoacidos). Esta ventana temporal esta bien dentro de la escala temporal de observacion de Cy3, normalmente unos pocos minutos cuando se usa una resolucion temporal de 0,1 s. Por otro lado, la translocacion de ClpX debe ser suficientemente lenta para estadfsticas de foton adecuadas y analisis fiable de rastros temporales. Cuando se necesita ralentizar el proceso, se necesita solamente rebajar la concentracion de ATP (de milimolar a micromolar) debido a que la translocacion de ClpX es dependiente de energfa (ATP).

Por lo tanto, en una descripcion, la protema funcionalizada se transloca con la maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada con una velocidad de translocacion a traves del area de deteccion del detector, en donde la velocidad de translocacion se selecciona entre el intervalo de 0,1-60 aminoacidos por segundo. Especialmente, la velocidad de translocacion se controla controlando una concentracion de ATP en el lfquido.

Por lo tanto, en una realizacion, con una maquina transportadora molecular (basada en proteasa dependiente de ATP) inmovilizada, la protema funcionalizada (en la fase lfquida) es guiada a traves de un area de deteccion de un detector.

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Debido a la baja afinidad de asociacion de los monomeros de CIpX, se desea usar una forma hexamerica enlazada artificialmente de ClpX para un estudio de una sola molecula. Se ha expresado y se ha purificado esta forma hexamerica de ClpX. ClpP, por otro lado, tiene una elevada afinidad de asociacion, y de este modo se ha expresado ClpP como monomeros.

ClpX y ClpP pueden formar un complejo 1:2 o 2:2 (ClpX:ClpP). Para la secuenciacion de protemas, se puede usar especialmente el complejo 1:2, para evitar el procesamiento de multiples sustratos simultaneamente mediante el mismo complejo. Esta estequiometna puede alcanzarse de forma fiable usando una relacion superestequiometrica, tal como relacion al menos 3:1 ratio entre concentraciones de tetradecamero de ClpP y hexadecamero de ClpX en mezcla.

Las protemas desplegadas tienden a agregarse. Para impedir que esto ocurra con sustratos de secuenciacion, los sustratos marcados desplegados pueden guardarse en un desnaturalizante. Notese que este desnaturalizante puede no interferir en la reaccion de secuenciacion debido a que los sustratos desplegados se introduciran en una camara de secuenciacion a concentracion ~1 nM mediante dilucion en un tampon fisiologico, y esto dara como resultado la baja concentracion de desnaturalizante. Para minimizar adicionalmente cualquier agregacion, se pueden diluir rapidamente sustratos de secuenciacion inmediatamente antes de una reaccion de secuenciacion, despues de un procedimiento optimizado por Meyer (Meyer, A.S., Gillespie, J.R., Walther, D, Millet, IS., Doniach, S., y Frydman, J. (2003). Closing the folding chamber of the eukaryotic chaperonin requires the transition state of ATP hydrolysis. Cell 113, 369-381).

Por la presente se proporciona una demostracion del proceso de exploracion basado en ClpXP usando la tecnica FRET de una sola molecula (figura 4b). Se genero una forma hexamerica enlazada artificialmente de ClpX y se biotinilo su extremo C-terminal. Se inmovilizo esta protema de nanocanal, en complejo con la proteasa ClpP, sobre una superficie de cuarzo usando conjugacion de estreptavidina-biotina. En esta camara de muestra, se anaden peptidos que contema un residuo de K y uno de C. El residuo de K se marco con un fluoroforo Cy3 que contema un grupo ester de NHS (esfera verde en la figura), y el residuo de C se marco con un fluoroforo Cy5 que contema un grupo mono-maleimida (esfera roja). El peptido contema la marca ssrA que es reconocida por ClpX con especificidad elevada.

Se obtuvieron imagenes del proceso de translocacion del peptido a traves del nanocanal de ClpX usando un microscopio de reflexion interna total construido en laboratorio y se registraron senales de fluorescencia usando una camara CCD con multiplicacion de electrones. Un subito incremento de la senal de fluorescencia (tiempo a 25,5 s en la figura Y) indica el acoplamiento de un peptido a un escaner de ClpXP inmovilizado. FRET entre Cy3 y Cy5 es inicialmente eficiente debido a la estructura plegada del peptido designado, tal como se muestra mediante la elevada fluorescencia del aceptor (el rastro temporal del donador es una lmea verde, y el aceptor en rojo). Cuando el peptido es arrastrado por ClpX y es translocado a traves del nanocanal de la ClpX mediante hidrolisis de ATP, se estira linealmente, la distancia entre Cy3 y Cy5 se vuelve mayor, y la eficiencia de FRET se vuelve menor (tiempo a 26,2 s). Este proceso de translocacion viene seguido por el replegamiento del peptido dentro de la camara de ClpP (tiempo a 26,5 s) y sus eventos de escision y posterior disociacion (tiempo a 27,0 y 27,6 s).

Por lo tanto, tal como se describio anteriormente, la divulgacion puede proporcionar, en una realizacion, un metodo para analizar una protema en un lfquido que comprende la protema, especialmente para determinar el tipo de una protema en un lfquido que comprende la protema, comprendiendo el metodo (a) funcionalizar una protema con 2-4 tipos de marcadores de aminoacidos, que son selectivos para 2-4 tipos de aminoacidos de protema predefinidos, especialmente solamente dos marcadores de aminoacidos selectivos para solamente dos aminoacidos, especialmente los aminoacidos C y K, (b) guiar en la fase lfquida la protema funcionalizada con una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada a traves de un area de deteccion de un detector, configurado para detectar una senal en funcion de los marcadores de los aminoacidos marcados; y (c) determinar, a partir de la senal detectada, una secuencia de los aminoacidos predefinidos. Especialmente, este metodo de analisis implica, ademas, (d) comparar la secuencia de los aminoacidos predefinidos con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y determinar el tipo de protema en el lfquido. De esta manera, puede determinarse el tipo de protema. Dicha base de datos puede ser una base de datos remota. Por ejemplo, la secuencia descubierta puede compararse con datos de Internet sobre aminoacidos secuenciados conocidos.

Especialmente, el metodo es un metodo ex vivo. El lfquido mencionado anteriormente puede ser un lfquido corporal, pero tambien puede ser un lfquido corporal diluido. Ademas, tambien son concebibles otros lfquidos, tales como extractos de celulas y organulos de bacterias, arqueas, eucariotas. Especialmente, el lfquido es un lfquido acuoso.

Como tambien se indico anteriormente, la descripcion tambien proporciona un dispositivo para determinar el tipo de protema en un lfquido, comprendiendo el dispositivo (a) una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada, configurada para guiar una protema que esta funcionalizada con marcadores a traves de un area de deteccion de un detector, (b) dicho detector, configurado para detectar una senal en funcion de los marcadores de los aminoacidos marcados, (c) una unidad procesadora, configurada para identificar a partir de la senal detectora una secuencia de aminoacidos de la protema funcionalizada, y opcionalmente configurada, ademas, para comparar la secuencia de aminoacidos identificada con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y para identificar el tipo de protema.

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Especialmente, la unidad procesadora puede estar configurada para comparar la secuencia de los aminoacidos de protema predefinidos de la protema con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y determinar el tipo de protema en el lfquido, en donde la protema esta funcionalizada con 2-8, tal como especialmente solamente 2-4 tipos de marcadores de aminoacidos, que son selectivos para 2-8, especialmente 2-4 tipos de aminoacidos de protema predefinidos. Por lo tanto, la unidad procesadora puede estar configurada para determinar, basandose en solamente 2-8, especialmente 2-4 tipos de aminoacidos marcados, es decir 2-8, especialmente 2-4 tipos de diferentes marcadores selectivos para aminoacidos, el tipo de protema cuando los aminoacidos de protema respectivos (o al menos parte del numero total de los mismos) estan marcados con estos marcadores selectivos. Incluso solamente 2 tipos de marcadores, p. ej., para lisina y cistema, pueden ser suficientes.

El marcador, para uso en el metodo, puede usarse para metodos de analisis basados en fluorescencia o el marcador puede usarse para un metodo de analisis basado en senales electronicas (vease a continuacion cuando se describe en mas detalle el metodo de nanoporos). En principio, los aceptores fluorescentes tal como se describio anteriormente, tambien pueden aplicarse en el metodo de nanoporos, aunque tambien pueden aplicarse otros marcadores en el ultimo metodo, tales como perlas de oro, puntos cuanticos (“quantum dots”), y otras nanopartmulas en estado solido. Por lo tanto, los marcadores comprenden aceptores fluorescentes, en donde un donador fluorescente, configurado para formar temporalmente un par donador-aceptor con uno de los aceptores fluorescentes, esta configurado dentro del area de deteccion, y en donde el detector comprende un microscopio de fluorescencia que incluye un microscopio de fluorescencia por reflexion interna total (TIRF), un microscopio de fluorescencia confocal, o un microscopio de fluorescencia a base de grna de ondas en modo cero. Por lo tanto, especialmente el detector comprende un microscopio de fluorescencia que incluye un microscopio de fluorescencia por reflexion interna total (TIRF), un microscopio de fluorescencia confocal, o un microscopio de fluorescencia a base de grna de ondas en modo cero. En una descripcion espedfica, maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada comprende un donador fluorescente unido a ella. Aun mas especialmente, vease tambien anteriormente, la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP, en donde la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una camara de ClpP asimetrica de monomeros de ClpP y al menos un monomero de ClpP mutante, en la que al menos un monomero de ClpP mutante no puede interactuar con ClpX, y en donde este al menos una ClpP mutante esta marcado con donador fluorescente, o en donde la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una protema ClpX que comprende un marcador de donador fluorescente por hexamero. Como se menciono anteriormente, pueden aplicarse marcadores p. ej., seleccionados entre una o mas de la familia de cianina, la familia Alexa, la familia Atto, la familia Dy y la familia de rodamina, etc.

Sin embargo, en otra descripcion mas, el metodo comprende guiar la protema funcionalizada con la maquina transportadora molecular a traves de un nanoporo de un filtro que comprende nanoporos que tiene un lado nano- transportador y un lado opuesto, en donde el detector comprende una unidad detectora configurada para medir un parametro electrico entre el lado nano-transportador y el lado opuesto del filtro que comprende nanoporos, y en donde el parametro electrico se selecciona entre el grupo que consiste en una diferencia de potencial, una corriente y la resistencia. Por lo tanto, el dispositivo, como se describe en la presente memoria, puede comprender ademas un filtro que comprende nanoporos que tiene un lado nano-transportador y un lado opuesto y en donde el detector esta configurado para medir un parametro electrico entre el lado nano-transportador y el lado opuesto del filtro que comprende nanoporos, en donde el parametro electrico se selecciona entre el grupo que consiste en una diferencia de potencial, una corriente y la resistencia, en donde el dispositivo esta configurado ademas para guiar a la protema que esta funcionalizada con marcadores a traves del nanoporo durante el uso del dispositivo. Los poros de los nanoporos pueden tener diametros en el intervalo de 0,1-10 nm. La anchura del filtro, es decir la longitud del canal del nanoporo puede estar en el intervalo de 0,3-10 nm.

En lugar o ademas de determinar el orden de los aminoacidos (marcados), el intervalo de tiempo entre los aminoacidos (marcados) (tambien) puede determinarse. A partir de esta informacion (y la velocidad de secuenciacion de la maquina transportadora molecular), la distancia entre aminoacidos (marcados) adyacentes puede determinarse. Esta informacion puede usarse (ademas) para determinar el tipo de protema (en el lfquido). Por lo tanto, a partir de la senal del sensor, tambien puede determinarse un parametro de distancia entre AA marcados adyacentes. Este parametro de distancia tambien puede aplicarse para determinar adicionalmente el tipo de protema (en el lfquido).

En la presente memoria, se aplica especialmente un sistema de transporte molecular para translocar un sustrato de secuenciacion con precision nanometrica y tambien para ralentizar todo el proceso de translocacion. La comunidad de fluorescencia y nanoporos ha estado esperando una estrategia de secuenciacion de protemas de una sola molecula durante decadas. A pesar de toda la bibliograffa existente sobre sistemas de transporte molecular y el desarrollo de nuevas tecnicas de una sola molecula, nadie de la comunidad ha conseguido ningun diseno similar al nuestro. Por ejemplo, en la tecnica anterior no se conoce o se sugiere ningun marcado con colorante de ClpXP u otros transportadores.

El termino “sustancialmente” en la presente memoria, tal como en “sustancialmente toda la emision” o en “consiste sustancialmente”, sera entendido por el experto en la materia. El termino “sustancialmente” tambien puede incluir realizaciones con “totalmente”, “completamente”, “todo”, etc. Por lo tanto, en realizaciones el adjetivo sustancialmente tambien puede eliminarse. Donde sea aplicable, el termino “sustancialmente” tambien puede

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referirse al 90 % o superior, tal como el 95 % o superior, especialmente el 99 % o superior, aun mas especialmente el 99,5 % o superior, incluyendo el 100 %. El termino “comprenden” incluye tambien realizaciones en donde el termino “comprende” significa “consiste en”.

Ademas, los terminos primero, segundo, tercero y similares en la descripcion y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronologico. Debe entenderse que los terminos usados de este modo son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la descripcion descritas en la presente memoria son capaces de funcionamiento en secuencias diferentes a las descritas o ilustradas en la presente memoria.

Los dispositivos o aparatos en la presente memoria se describen, entre otros, durante el funcionamiento. Como quedara claro para el experto en la materia, la invencion no esta limitada a metodos de funcionamiento o dispositivos en funcionamiento.

El uso del verbo “comprender” y sus conjugaciones no excluye la presencia de elementos o etapas diferentes de las indicadas en una reivindicacion. El artmulo “un” o “una” precediendo a un elemento no excluye la presencia de una pluralidad de dichos elementos. La invencion puede implementarse por medio de hardware que comprende varios elementos distintos, y por medio de un ordenador programado adecuadamente. En la reivindicacion del dispositivo que enumera varios medios, varios de estos medios pueden estar materializados por uno y el mismo artmulo de hardware. El mero hecho de que ciertas medidas se enumeren en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que una combinacion de estas medidas no pueda usarse para su conveniencia.

La invencion se aplica, ademas, a un aparato o dispositivo que comprende uno o mas de los elementos caracterizantes descritos en la descripcion y/o mostrados en los dibujos adjuntos. La invencion se refiere, ademas, a un metodo o proceso que comprende uno o mas de los elementos caracterizantes descritos en la descripcion y/o mostrados en los dibujos adjuntos.

Los diversos aspectos descritos en esta patente pueden combinarse para proporcionar ventajas adicionales. Ademas, algunos de los elementos pueden formar la base para una o mas solicitudes divisionales.

Breve descripcion de los dibujos

A continuacion se describiran realizaciones de la invencion, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos esquematicos adjuntos en los que sfmbolos de referencia correspondientes indican partes correspondientes, y en los que:

Las figuras, 1a-1b representan algunos aspectos de un principio de la invencion;

Las figuras 2a-2b representan esquematicamente algunos aspectos de una realizacion del transportador molecular basado en proteasa dependiente de ATP, que en este caso es una ClpXP;

Las figuras 3a-3c representan esquematicamente algunas realizaciones y variantes del metodo y dispositivo de la invencion; y

Las figuras 4a y 4b muestran algunas simulaciones y resultados de experimentacion.

Los dibujos no son necesariamente a escala.

Descripcion detallada de las realizaciones

La figura 1a representa esquematicamente una protema, tal como una enzima. La protema se indica con la referencia 100. La protema 100 consiste esencialmente en una cadena de aminoacidos 110. Los aminoacidos 110 que estan marcados, se indican con las referencias 111. La referencia L1 indica un primer marcador y la referencia L2 se refiere a un segundo marcador (es decir aminoacidos con el marcador L1 y L2, respectivamente). Como se indico anteriormente, especialmente dos aminoacidos pueden estar marcados, tal como lisina (a partir de 1 de 20 aminoacidos) y cistema (aproximadamente 1 de 40 aminoacidos). Como se indico anteriormente, una protema puede identificarse a partir del orden de, p. ej., residuos de C (Cys) y K (Lys) solamente.

La figura 1b muestra un calculo sobre el poder de prediccion del metodo sugerido. La fidelidad de prediccion es proporcionar al numero de residuos de C y K en un sustrato de secuenciacion. La identificacion genetica se vuelve fiable cuando el numero es mayor de 15, tal como al menos 16, como especialmente al menos 17. Por encima de 25, el poder de prediccion es del 100 %. Notese que el numero de al menos 15 se refiere al numero de diferentes aminoacidos marcados con diferentes marcadores. Por lo tanto, 6 aminoacidos C marcados y 12 aminoacidos K marcados hacen 18 aminoacidos marcados, lo que dara un elevado poder predictivo. Por lo tanto, despues de medir al menos del orden de 15-25 aminoacidos marcados, la determinacion puede ser concluyente.

La figura 2a representa esquematicamente la enzima ClpXP 200, con ClpX (ATPasa), estando indicada con la referencia 210 y con ClpP (proteasa) estando indicada con la referencia 220. Los monomeros individuales se indican con las referencias 211 (ClpX) y 221 (ClpP), respectivamente. La figura 2b muestra una vista de seccion transversal

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de CIpXP. Un sustrato de secuenciacion 100 marcado con Cy5 y Cy7, es decir la protema 100 (que tiene aminoacidos marcados, en este caso de nuevo marcado con los marcadores L1 y L2), es arrastrado al interior del canal estrecho 212 de ClpX 210. El sustrato estirado es entregado a ClpP 220 donde es digerido a un fragmento pequeno (~7 aminoacidos). Habra FRET entre Cy3 (donador, indicado con la referencia 50) cerca del puerto de salida de ClpP y Cy5 y Cy7 en un fragmento dentro de la camara de ClpP (vease a continuacion).

La altura de ClpX 210 se indica con la referencia H1 (aproximadamente 7,5 nm); la anchura se indica con la referencia d2 (aproximadamente 15 nm). El diametro del canal del canal 212 se indica con d1 (aproximadamente 1 nm). La altura de ClpP 220 se indica con H2 (aproximadamente 9 nm); la anchura (no indicada) es tambien de aproximadamente 9 nm; la anchura de la camara 223 se indica con el diametro d3 (que es de aproximadamente 5 nm).

La figura 3a a la izquierda muestra una realizacion de inmovilizacion de la enzima ClpXP 200 en una superficie 300, tal como cuarzo. La inmovilizacion se lleva a cabo, p. ej., marcando protemas (enzimas) ClpP 200 con biotina 302 y presentandolas sobre una superficie estratificada con estreptavidina, tal como cuarzo. La estreptavidina se indica con la referencia 303. La superficie del sustrato puede revestirse previamente con un polfmero, indicado con la referencia 301, tal como PEG (polietilenglicol). En el lado izquierdo de la figura 3a, se indica esquematicamente el proceso (con la flecha). PEG puede impedir la adsorcion inespedfica de protemas (ClpXP y sustratos de secuenciacion) a una superficie. Si PEG, ClpXP puede perder su funcion, y las senales procedentes de sustratos de secuenciacion pueden aparecer de forma inespedfica en una pantalla CCD. PEG tambien puede proporcionar biotina a la que se une estreptavidina.

La figura 3b representa esquematicamente una dispositivo (de deteccion) basado en FRET para uso, p. ej., en el metodo de la invencion. El dispositivo se indica con la referencia 400. Las referencias 431 y 432 indicaban laseres, respectivamente, tales como un laser de 532 nm y 633 nm, respectivamente. La referencia 434 es un espejo, la referencia 433 es un espejo transmisivo (tal como un espejo dicroico). La referencia 433 puede estar compuesta por mas de un espejo. La referencia 435 es un espejo, y la referencia 436 es una lente, con p. ej., una distancia focal de 100 mm, la referencia 440 indica un microscopio TIRF (fluorescencia por reflexion interna total) (vease el aumento). La referencia 441 indica una hendidura y la referencia 442 indica una lente, con p. ej., una distancia focal de 100 mm, la referencia 443 indica un espejo dicroico (especialmente para el haz donador), y la referencia 444 indica un espejo (especialmente para el haz aceptor). La referencia 445 es de nuevo una lente, con una distancia focal de p. ej., 150 mm; la referencia 446 indica un espejo, y la referencia 447 indica un detector, tal como un EM-CCD (CCD con multiplicacion de electrones). La referencia 402 indica un prisma de Pellin-Broca y la referencia 300 indica la superficie, en este caso una placa de cuarzo. Sobre la superficie 300, con respecto a la figura 3a descrita, esta presente ClpXP 200 inmovilizada. El campo evanescente se indica con la referencia 401. La referencia 404 indica una cubierta transparente, tal como un cubreobjetos de vidrio. La referencia 405 indica un medio transparente, tal como agua. La referencia 406 indica un filtro de paso de banda y la referencia 407 indica una lente del objetivo (tal como 60x agua, NA 1.2). La referencia 480 indica un procesador y la referencia 490 indica una biblioteca opcional (que puede ser remota, p. ej., base de datos de internet con secuencias de aminoacidos de protema).

La figura 3c representa esquematicamente una realizacion alternativa del dispositivo 1, con una placa 472 con un nanoporo 461. La placa puede ser, p. ej., de los siguientes materiales, nitruro de silicio (“SiN”), Si/SiO2, AI2O3, polfmero, grafeno, Bn. Una senal electrica se mide entre un lado nano-transportador 472 y un lado opuesto 471. En este caso, el detector 440 comprende una unidad detectora configurada para medir un parametro electrico entre el lado nano-transportador y el lado opuesto del filtro que comprende nanoporos. El parametro electrico se selecciona entre el grupo que consiste en una diferencia de potencial, una corriente y la resistencia. Cuando la protema 200 pasa a traves del nanoporo 461 (desde el lado opuesto hasta el lado nano-transportador 462), debido a la presencia de los marcadores, la senal electrica cambiara. El cambio de senal dependera del tipo de marcador. Notese que, en este caso los marcadores no son necesariamente luminiscentes. Ademas, notese que la maquina transportadora molecular esta configurada para arrastrar la protema 100 a traves del nanoporo 461.

Por ejemplo, el analisis (figura 4a) muestra que la fidelidad de prediccion (PF) no cae de forma significativa incluso cuando hay un numero de errores de intercambio (NSE) presentes (es decir el orden de C y K se intercambia durante la exploracion) dada una secuencia CK de 40 de longitud. Este analisis de error se realizo usando tanto un algoritmo de coincidencia punto por punto como el algoritmo de Smith-Waterman.

Por la presente se proporciona una demostracion del proceso de exploracion basado en ClpXP usando la tecnica FRET de una sola molecula (figura 4b). Se genero una forma hexamerica enlazada artificialmente de ClpX y se biotinilo su extremo C-terminal. Se inmovilizo esta protema de nanocanal, en complejo con la proteasa ClpP, sobre una superficie de cuarzo usando conjugacion de estreptavidina-biotina. En esta camara de muestra, se anadieron peptidos que conteman un residuo de K y uno de C. El residuo de K se marco con un fluoroforo Cy3 que contema un grupo ester de NHS (esfera verde en la figura), y el residuo de C se marco con un fluoroforo Cy5 que contema un grupo mono-maleimida (esfera roja). El peptido contema la marca ssrA que es reconocida por ClpX con alta especificidad. Las referencias RN, TN, DN y RE indican reconocimiento, translocacion, degradacion y liberacion, respectivamente. En el grafico, I en el eje y indica intensidad (en unidades arbitrarias), y t en el eje x es tiempo (en segundos).

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para determinar el tipo de una protema en un Ifquido que comprende la protema, comprendiendo el metodo:

   a) funcionalizar una protema con al menos 2 tipos de marcadores de aminoacidos, que son selectivos para 2 tipos de aminoacidos de protema predefinidos,

   b) guiar en la fase lfquida la protema funcionalizada con una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada, a traves de un area de deteccion de un detector, configurado para detectar una senal en funcion de los marcadores de los aminoacidos marcados;

   c) determinar, a partir de la senal detectada, una secuencia de los aminoacidos de protema predefinidos;

   d) comparar la secuencia de los aminoacidos de protema predefinidos con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y determinar el tipo de protema en el lfquido.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular seleccionada entre el grupo de proteasas dependientes de ATP que consisten en una ClpXP, una ClpAP, una ClpCP, una ClpEP, una ClpYQ, una ClpB, una Lon, una FtsH, una pAn de arqueas, y una maquina transportadora molecular basada en el proteasoma, especialmente en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP.
3. 3. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde solamente estan marcadas cistema y lisina y en donde la maquina transportadora molecular comprende un donador configurado para sondear un marcador de aminoacidos.
4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los marcadores comprenden aceptores fluorescentes, en donde un donador fluorescente, configurado para formar temporalmente un par donador-aceptor con uno de los aceptores fluorescentes, esta configurado dentro del area de deteccion, y en donde el detector comprende un microscopio de fluorescencia que incluye un microscopio de fluorescencia por reflexion interna total (TIRF), un microscopio de fluorescencia confocal, o un microscopio de fluorescencia a base de grna de ondas en modo cero; y en donde los marcadores comprenden un fluoroforo organico seleccionado entre uno o mas de la familia de cianina, la familia Alexa, la familia Atto, la familia Dy y la familia de rodamina.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 6, en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP, en donde (i) especialmente la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una camara de ClpP asimetrica de monomeros de ClpP y al menos un monomero de ClpP mutante, en el que al menos un monomero de ClpP mutante no puede acoplarse a ClpX, y en donde esta al menos una ClpP mutante esta marcada con un donador fluorescente o en donde (ii) especialmente, la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una ClpX marcada con un donador fluorescente en complejo con una protema ClpP no marcada.
6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el metodo comprende guiar la protema funcionalizada con la maquina transportadora molecular a traves de un filtro que comprende nanoporos que tiene un lado nano-transportador y un lado opuesto, en donde el detector comprende una unidad detectora configurada para medir un parametro electrico entre el lado nano-transportador y el lado opuesto del filtro que comprende nanoporos, y en donde el parametro electrico se selecciona entre el grupo que consiste en una diferencia de potencial, una corriente y la resistencia.
7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas marcar la protema con una marca que es reconocible por la maquina transportadora molecular.
8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la protema funcionalizada es translocada con la maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada con una velocidad de translocacion a traves del area de deteccion del detector, en donde la velocidad de translocacion se selecciona entre el intervalo de 0,1-60 aminoacidos por segundo, especialmente en donde la velocidad de translocacion se controla controlando una concentracion de ATP en el lfquido.
9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende detectar la presencia de al menos 15, especialmente al menos 17, de los aminoacidos de protema predefinidos en la protema a identificar, que comprende funcionalizar la protema dos 2-4 tipos de marcadores de aminoacidos, que son selectivos para 2-4 tipos de aminoacidos de protema predefinidos.
10. 10. Un dispositivo para determinar el tipo de protema en un lfquido, comprendiendo el dispositivo:

    a) una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada configurada para guiar una protema que esta funcionalizada con marcadores de aminoacidos, que son selectivas para al menos 2 tipos de aminoacidos de protema predefinidos, a traves de un area de deteccion de un detector,

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    b) dicho detector, configurado para detectar una senal en funcion de los marcadores de los aminoacidos marcados,

    c) una unidad procesadora, configurada para identificar, a partir de la senal detectora, una secuencia de aminoacidos de la protema funcionalizada, en donde la unidad procesadora esta configurada, ademas, para comparar la secuencia de aminoacidos identificada con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y para identificar el tipo de protema.
11. 11. El dispositivo segun la reivindicacion 17, en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular seleccionada entre el grupo de proteasas dependientes de ATP que consisten, entre otras, en una ClpXP, una ClpAP, una ClpCP, una ClpEP, una ClpYQ, una ClpB, una Lon, una FtsH, una PAN de arqueas y una maquina transportadora molecular basada en el proteasoma, especialmente en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP.
12. 12. El dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en donde el detector comprende un microscopio de fluorescencia que incluye un microscopio de fluorescencia por reflexion interna total (TIRF), un microscopio de fluorescencia confocal, o un microscopio de fluorescencia a base de grna de ondas en modo cero, y en donde especialmente la maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada comprende un donador fluorescente unido a ella.
13. 13. El dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-21, en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP, en donde la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una camara de ClpP asimetrica de monomeros de ClpP y al menos un monomero de ClpP mutante, en el que el al menos un monomero de ClpP mutante no puede acoplarse a ClpX, y en donde esta al menos una ClpP mutante esta marcada con un donador fluorescente, especialmente en donde la maquina transportadora molecular es una maquina transportadora molecular basada en ClpXP, en donde la maquina transportadora molecular basada en ClpXP comprende una ClpX marcada con un donador fluorescente en complejo con una protema ClpP.
14. 14. El dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-23, en donde el dispositivo comprende ademas un filtro que comprende nanoporos que tiene un lado nano-transportador y un lado opuesto y en donde el detector esta configurado para medir un parametro electrico entre el lado nano-transportador y el lado opuesto del filtro que comprende nanoporos, en donde el parametro electrico se selecciona entre el grupo que consiste en una diferencia de potencial, una corriente y la resistencia, en donde el dispositivo esta configurado ademas para guiar a la protema que esta funcionalizada con marcadores a traves del nanoporo durante el uso del dispositivo.
15. 15. El dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 17-24, en donde una maquina transportadora molecular basada en proteasa dependiente de ATP inmovilizada esta configurada para guiar una protema que esta funcionalizada con marcadores de aminoacidos, que son selectivos para 2-4 tipos de aminoacidos de protema predefinidos, a traves de un area de deteccion de un detector, en donde el detector esta configurado para comparar la secuencia de los aminoacidos de protema predefinidos de la protema con la presencia de dicha secuencia en una base de datos de protemas y determinar el tipo de protema en el lfquido, en donde la protema esta funcionalizada con solamente 2-4 tipos de marcadores de aminoacidos, que son selectivos para 2-4 tipos de aminoacidos de protema predefinidos.