ES2613740T3 - Medios porosos funcionalizados de forma espacialmente no homogénea y procedimiento para su uso en la eliminación selectiva de contaminantes - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para separar ácidos nucleicos bicatenarios a partir de una mezcla que comprende ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos nucleicos monocatenarios y/o nucleótidos libres en una solución acuosa que comprende las etapas de: a) poner en contacto a la mezcla con un material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogénea, donde la superficie del material nanoporoso comprende superficie de poro y superficie de no-poro y donde la superficie de poro se funcionaliza con una amina primaria para adsorber dNTP, cebadores y cadenas sencillas y la superficie de no-poro se funcionaliza con compuestos cargados negativamente seleccionados de entre el grupo que consiste en compuestos aniónicos, compuestos polianiónicos, polielectrolitos y combinaciones de los mismos, y/o compuestos hidrófobos y/o compuestos resistentes a la adsorción que son resistentes a la adsorción de ácido nucleico bicatenario y donde el material nanoporoso tiene poros de aproximadamente 2 a 300 nm; b) incubar la solución acuosa y el material nanoporoso de a) en condiciones tales que los ácidos nucleicos monocatenarios y/o nucleótidos libres se adsorban selectivamente a la superficie de poro; y c) aislar el material nanoporoso a partir de la solución acuosa separando de este modo los ácidos nucleicos bicatenarios de los ácidos nucleicos monocatenarios y/o de los nucleótidos libres, donde la solución acuosa se incuba con el material nanoporoso durante de 5 a 60 segundos.

Description

DESCRIPCION

Medios porosos funcionalizados de forma espacialmente no homogenea y procedimiento para su uso en la eliminacion selectiva de contaminantes.

La presente invencion se refiere a composiciones y procedimientos para aislar biomoleculas deseadas a partir de una mezcla de biomoleculas. En una realizacion, la presente invencion se refiere a composiciones y procedimientos para aislar acidos nucleicos bicatenarios a partir de mezclas que comprenden acidos nucleicos bicatenarios, acidos nucleicos monocatenarios y nucleotidos libres.

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En el analisis de materiales biologicos, a menudo es necesario aislar o purificar en primer lugar moleculas de interes a partir de una mezcla de moleculas tales como las descubiertas en una muestra biologica. Aunque pueden separarse diferentes moleculas basandose en sus propiedades qufmicas, dichos procedimientos de separacion pueden ser tediosos y requerir tiempo. En el analisis de moleculas de acido nucleico, si las moleculas deseadas no 15 son suficientes para ser detectadas facilmente, pueden usarse tecnicas para incrementar su numero de copias para una deteccion facil.

Por ejemplo, el analisis y la secuenciacion de ADN normalmente implica incrementar el numero de copias de una parte diana del genoma mediante amplificacion por PCR. La limpieza de productos de PCR para eliminar cebadores 20 y dNTP es necesaria antes de la secuenciacion, dado que los cebadores residuales pueden actuar como cebadores de extension durante la secuenciacion y producir fragmentos de secuencia marcados con colorante que pueden complicar la interpretacion de datos o, peor, llevar a falsas conclusiones. Ademas, el fallo en la eliminacion de dNTP puede dar como resultado proporciones suboptimas de dNTP con respecto a ddNTP (di-desoxinucleotidos) marcados usados para regular longitudes de lectura en reacciones se secuenciacion. Consideraciones similares se 25 aplican a la eliminacion de cebadores no extendidos a partir de muestras antes de analisis MALDI-TOF.

Las estrategias convencionales de limpieza de PCR generalmente dependen de la inmovilizacion de amplicones de ADN, cebadores y dNTP sobre soportes solidos (por ejemplo, membranas o partfculas magneticas), normalmente usando sales caotropicas, y a continuacion eliminando selectivamente por elucion componentes no deseados de 30 estas superficies en diversos disolventes hasta que se eluye el componente deseado. Estos procesos de multiples etapas requieren tiempo, son muy laboriosos e introducen componentes indeseables tales como disolventes organicos y sales caotropicas que interfieren en reacciones posteriores y, por lo tanto, requieren una limpieza adicional.

35 Para mejorar la usabilidad de amplicones de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para aplicaciones posteriores, es deseable eliminar el exceso de cebadores y desoxinucleotidos trifosfato no incorporados (dNTP) de manera mas eficiente, mientras se retiene el ADN (acidos nucleicos) bicatenario (ds) amplificado.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION 40

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona composiciones y procedimientos que separan biomoleculas a partir de una mezcla de biomoleculas. En una realizacion, la presente divulgacion proporciona composiciones y procedimientos para separar acidos nucleicos bicatenarios de una mezcla que comprende acidos nucleicos monocatenarios y/o libres (individuales). Como ejemplo, este procedimiento puede usarse para separar ADN 45 bicatenario a partir de mezclas obtenidas en reacciones de amplificacion de ADN.

En una realizacion, la presente invencion proporciona un procedimiento para separar acidos nucleicos bicatenarios a partir de una mezcla que comprende acidos nucleicos bicatenarios (por ejemplo, ADN), acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres en una solucion acuosa. La mezcla tambien puede comprender enzimas. La 50 mezcla se pone en contacto con un material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea, donde la superficie del material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea comprende superficie de poro y superficie de no-poro y donde la superficie de poro tiene grupos superficiales de una funcionalidad y la superficie no de poro tiene grupos superficiales de una funcionalidad diferente. La solucion acuosa y el material nanoporoso se incuban en condiciones tales que los acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos 55 libres se adsorban selectivamente a la superficie de poro. El material nanoporoso se afsla a partir de la solucion acuosa, separando de este modo los acidos nucleicos bicatenarios de los acidos nucleicos monocatenarios y/o de los nucleotidos libres.

Por ejemplo, los acidos nucleicos bicatenarios se separan de modo que la solucion acuosa comprenda menos del 60 10%, 5%, 2% o 1% de acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres, y si estan presentes enzimas en la mezcla, y/o enzimas.

La superficie de poro puede funcionalizarse con compuestos cargados positivamente seleccionados de entre el grupo que consiste en aminas, iminas, compuestos que contienen iones metalicos y combinaciones de los mismos y/o compuestos hidrofobos para proporcionar grupos superficiales de una funcionalidad, y la superficie de no-poro 5 puede funcionalizarse con compuestos cargados negativamente seleccionados de entre el grupo que consiste en compuestos anionicos, compuestos polianionicos, polielectrolitos y combinaciones de los mismos, y/o compuestos hidrofobos y/o resistentes a la adsorcion para proporcionar grupos superficiales de una funcionalidad diferente.

El material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea esta compuesto por al menos dos 10 materiales nanoporosos funcionalizados de forma espacialmente no homogenea independientes, y los materiales nanoporosos funcionalizados de forma espacialmente no homogenea independientes muestran diferente funcionalidad de superficie de poro y/o diferente funcionalidad de no-poro.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende un material nanoporoso 15 funcionalizado de forma no homogenea, donde la superficie del material nanoporoso funcionalizado de forma no homogenea comprende superficie de poro y superficie de no-poro, donde la superficie de poro tiene grupos superficiales de una funcionalidad y la superficie de no-poro tiene grupos superficiales de una funcionalidad diferente, donde el material nanoporoso tiene poros de 2 a 300 nm de diametro. El material nanoporoso puede ser, por ejemplo, sflice porosa, alumina porosa o zeolita.

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En una realizacion, la superficie de poro del material nanoporoso funcionalizado de forma no homogenea esta funcionalizada con compuestos cargados positivamente, tales como, por ejemplo, aminas, iminas, compuestos que contienen iones metalicos, y/o compuestos hidrofobos para proporcionar grupos superficiales de una funcionalidad, y la superficie de no-poro esta funcionalizada con compuestos cargados negativamente tales como, por ejemplo, 25 compuestos anionicos, compuestos polianionicos, polielectrolitos, y/o compuestos hidrofobos y/o compuestos resistentes a la adsorcion para proporcionar grupos superficiales de una funcionalidad diferente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

30 Figura 1(a). Estrategia general para revestimientos espacialmente no homogeneos

Figura 1(b). Representacion grafica que muestra como son eliminados contaminantes a partir de mezclas explotando la funcionalizacion diferencial de superficies interior y exterior.

35 Figura 2. Espectros FTIR de sflice porosa no funcionalizada (lfnea negra continua) y sflice porosa modificada con aminopropiltrimetoxisiloxano (APTMS) (lfnea discontinua). Las vibraciones de tension de OH y CH2 estan marcadas y la asignacion de otras bandas se describe en el ejemplo 1.

Figura 3. Representacion grafica de datos de retencion de una mezcla de cebador, dNTP modelo y un amplicon de 40 PCR de 1956 pares de bases frente al peso de perlas porosas funcionalizadas de forma diferencial.

Figura 4a. Espectros de absorcion de nucleotidos antes y despues del tratamiento con perlas porosas funcionalizadas de forma diferencial. Los espectros de lfnea continua son espectros de solucion de partida y los espectros de lfnea discontinua corta se toman despues del tratamiento usando perlas porosas no funcionalizadas. 45 Los espectros de lfnea discontinua larga son los resultados despues del tratamiento con las perlas de APTMS/PAA descritas en el texto. Para la solucion de dNTP, la lfnea discontinua de puntos presenta el espectro despues del tratamiento con el kit de purificacion de PCR PureLink (K3100-01) de Invitrogen.

Figura 4b. Representacion grafica de retencion de amplicones (1956bp), “dfmeros de cebadores” (ds 7 pb), cadenas 50 sencillas (ss 20 pb) y dNTP de soluciones de partida.

Figura 5. Representacion grafica de la cinetica de eliminacion de dNTP y amplicones (1956 pb) a partir de una solucion usando tratamientos mediante perlas porosas funcionalizadas con APTMS/PAA.

55 Figura 6. Resultados de electroforesis en gel para tres productos de PCR diferentes y un marcador de bajo peso molecular de referencia (NEB N3233S) despues de tratamientos con las perlas porosas funcionalizadas de forma diferencial, el kit PureLink de Invitrogen (“columna de centrifugado”) o controles.

Figura 7. (a) Representacion grafica de datos que demuestran que los materiales nanoporosos funcionalizados de la 60 presente invencion pueden eliminar rapidamente impurezas mientras retienen el dsADN diana en solucion. La cinetica se mide mezclando solucion de ADN individuales con los materiales nanoporosos funcionalizados y

tomando alfcuotas de pequenos volumenes de solucion en puntos temporales indicados para analisis en el Nanodrop1000. Las impurezas de dNTP (nucleotido) y ssADN (cebador) estan en lfneas discontinuas (rombo negro y cuadrado gris) mientras que la diana esta representada con una lfnea negra continua y cfrculos. A los 60 segundos, el rendimiento tfpico muestra >90% de retencion de la diana y >90% de eliminacion de impurezas de ADN 5 de menos de 50 pb. (b) La purificacion de dsADN tiene un excelente rendimiento. Volumenes iguales de producto de PCR no tratado (-) y tratado (con materiales nanoporosos funcionalizados) (+) (0,5 Kb, 1 Kb y 2 Kb) se hicieron pasar sobre un gel de agarosa al 1% junto con Plus Ladder (L) de 1 Kb de Invitrogen y se marcaron con SybrSafe.

Figura 8. Representacion grafica de datos de cinetica de adsorcion para materiales nanoporosos preparados 10 mediante autoensamblaje electrostatico.

Figura 9. Datos de secuenciacion para solucion de PCR tratada con materiales nanoporosos de la presente invencion.

15 Figura 10. Tabla que resume varias de las aplicaciones de purificacion y ensayo de acido nucleico que pueden realizarse usando los materiales y protocolos descritos en el presente documento.

Figura 11. Datos que muestran la eliminacion de una enzima (Taq ADN polimerasa) de la solucion.

20 En un aspecto, la presente divulgacion proporciona composiciones y procedimientos que separan biomoleculas a partir de una mezcla de biomoleculas. En una realizacion, la presente divulgacion proporciona composiciones y procedimientos para separar acidos nucleicos bicatenarios de una mezcla que comprende acidos nucleicos monocatenarios y/o libres (individuales). En una realizacion, la presente divulgacion proporciona composiciones y procedimientos para purificar acidos nucleicos bicatenarios a partir de otros componentes de reacciones de 25 amplificacion de acido nucleico tfpicas, tales como cebadores, dNTP, y/o enzimas (por ejemplo, polimerasa) y similares.

El procedimiento de separacion de acido nucleico bicatenario se basa en el uso de materiales nanoporosos en los que las superficies internas (superficies de poro) estan funcionalizadas para adsorber pequenas moleculas 30 (cebadores y dNTP) y las superficies externas (superficies de no-poro) estan funcionalizadas para inhibir la adsorcion de las moleculas mas grandes (amplicones de PCR bicatenarios) - ilustrados en la figura 1(a). Dado que el dsADN mas grande esta excluido del interior de los poros, solamente las moleculas pequenas se adsorberan a los materiales nanoporosos y, por lo tanto, el ADN bicatenario puede purificarse a partir de las mezclas explotando la funcionalizacion diferencial de superficies interior y exterior, tal como se ilustra en la figura 1(a).

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En una realizacion, la presente invencion proporciona un procedimiento para separar acidos nucleicos bicatenarios de una mezcla que comprende acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres usando material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea. La superficie del material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea comprende superficie de poro y superficie de no-poro. La superficie de poro 40 tiene grupos superficiales de una funcionalidad y la superficie de no-poro tiene grupos superficiales de una funcionalidad diferente. El procedimiento comprende las etapas de: a) poner en contacto una mezcla que comprende acidos nucleicos bicatenarios, acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres en una solucion acuosa con el material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea; b) incubar la solucion acuosa y el material nanoporoso de a) en condiciones tales que los acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres se 45 adsorben selectivamente sobre la superficie de poro; y c) aislar el material nanoporoso a partir de la solucion acuosa separando de este modo los acidos nucleicos bicatenarios (que quedan en solucion) de los acidos nucleicos monocatenarios y/o de los nucleotidos libres.

En la identificacion de materiales nanoporosos adecuados a partir de los cuales pueden prepararse materiales 50 nanoporosos funcionalizados de forma espacialmente no homogenea, el tamano de las moleculas pequenas que se desea eliminar (es decir, contaminantes tales como, por ejemplo los dfmeros de cebadores y dNTP en una mezcla obtenida en una reaccion de PCR) se tiene en consideracion. Los poros comprenden una abertura en la superficie externa (es decir, orificio) del material nanoporoso y una superficie de poro interna. El material (por ejemplo, una solucion) puede acceder al poro solamente mediante la abertura del poro.

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Los poros adecuados tambien excluiran moleculas mas grandes, tales como amplicones de ADN bicatenarios que pueden ser de varias decenas a cientos de pares de bases de longitud, y por lo tanto, varias decenas de nm de alcance espacial. Se cree que la longitud de persistencia mas larga del ADN bicatenario (la distancia promedio a lo largo de la cual el ADN adopta una trayectoria rectilfnea en el espacio tridimensional) tambien facilita la exclusion de 60 dicho ADN con respecto al ADN monocatenario que se puede plegar mas facilmente y, por lo tanto, difundirse facilmente al interior de materiales nanoporosos.

El material nanoporoso (tambien llamando en el presente documento perlas) es util en la presente invencion y tiene superficies que pueden funcionalizarse. Los materiales adecuados tienen un area superficial elevada. Pueden usarse materiales tales como gel o espumas (tales como, por ejemplo, materiales sol-gel, xerogeles y aerogeles). 5 Los materiales pueden ser particulados (tales como, por ejemplo, gel de sflice) o capas de gel o espuma sobre un sustrato solido (tal como, por ejemplo, un sustrato esferico o sustrato plano). Los materiales particulados nanoporosos adecuados incluyen sflice porosa, alumina porosa, oxido de titanio poroso y zeolitas. Los geles/espumas de area superficial elevada adecuados incluyen sflice, alumina, oxido de titanio, oxido de hafnio, oxido de germanio y zeolitas. Tambien pueden usarse oxidos mixtos.

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En una realizacion, el material nanoporoso es partfculas de sflice porosa. Los materiales nanoporosos adecuados son genes de sflice disponibles en el mercado. Las partfculas de sflice son de aproximadamente 10 a 500 micrometros, incluyendo todos los numeros enteros entre ambos, de diametro.

15 En una realizacion, el fndice de refraccion del material nanoporoso se selecciona basandose en la eleccion de oxido metalico u oxido metalico mixto.

Los materiales nanoporosos estan compuestos por poros. El tamano de la abertura del poro, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la longitud del eje mas largo de la abertura del poro. Por ejemplo, si la abertura del 20 poro es circular o puede aproximarse a un cfrculo, el tamano de la abertura del poro es el diametro del cfrculo. Los materiales nanoporosos adecuados tienen tamanos de poro de aproximadamente 2 nm a 300 nm. Por ejemplo, los poros de este tamano permiten acceso adecuado para los contaminantes al interior de los poros. No es necesario que todos los poros en los materiales nanoporosos sean del mismo tamano. En diversas realizaciones, el material nanoporoso comprende poros, donde la mayorfa de los diametros de poro, mas preferentemente, el 70, 80, 90 o 25 95% estan dentro del 10% o el 5% del tamano de poro nominal. El tamano de poro nominal puede ser de 2 a 300 nm, incluyendo todos los numeros enteros entre ambos.

Un ejemplo de un material particulado nanoporoso adecuado es sflice nanoporosa de calidad de cromatograffa que puede obtenerse como una partfcula sustancialmente esferica con un diametro de 40 a 60 micrometros, y un tamano 30 de poro de aproximadamente 60 A. Un material con estas caracterfsticas esta disponible en el mercado, tal como gel de sflice Merck 9385.

Otros ejemplos de materiales nanoporosos adecuados incluyen Gel de sflice Davisil®, Grado 633, tamano de poro 60 A, malla 200-425, Gel de sflice Davisil®, Grado 634, tamano de poro 60 A, malla 100-200, Gel de sflice Davisil®, 35 Grado 635, tamano de poro 60 A, malla 60-100, Gel de sflice Davisil®, Grado 636, tamano de poro 60 A, malla 3560, Gel de sflice Davisil®, Grado 643, tamano de poro 150 A, malla 200-425, Gel de sflice Davisil®, Grado 644, tamano de poro 150 A, malla 100-200, Gel de sflice Davisil®, Grado 645, tamano de poro 150 A, malla 60-100, Gel de sflice Davisil®, Grado 646, malla 35-60, tamano de poro 150 A, Gel de sflice Grado 12, tamano de poro 22 A, malla 28-200, Gel de sflice Grado 62, tamano de poro 150 A, malla 60-200, Gel de sflice Grado 62, tamano de poro 40 150 A, malla 60-200 y Gel de sflice Grado 923, tamano de poro 30 A, malla 100-200, todos los cuales estan disponibles en el mercado.

La figura 1(a) proporciona una ilustracion de funcionalizacion espacialmente no homogenea de un material nanoporoso. “funcionalizado de forma espacialmente no homogenea” o “funcionalizacion espacialmente no 45 homogenea” pretende significar que el material nanoporoso comprende al menos dos superficies, con cada superficie portando al menos un grupo funcional que es distinto de la otra u otras superficies y, por lo tanto, la una o varias superficies tienen diferente funcionalidad.

En una realizacion, los materiales nanoporosos comprenden una superficie de poro que porta un grupo superficial 50 que tiene una funcionalidad (y como resultado es decir, un caracter) y una superficie de no-poro que porta grupos superficiales que tienen una funcionalidad (es decir, un caracter) diferente. Por ejemplo, los grupos funcionales en la superficie dan como resultado que la superficie tenga un caracter cargado positivamente, un caracter cargado negativamente, un caracter hidrofilo, un caracter hidrofobo, un caracter resistente a la adsorcion, o cualquier combinacion de estos caracteres. Las superficies de poro son generalmente inaccesibles a los polfmeros usados 55 para funcionalizar la superficie de no-poro.

En una realizacion, para conseguir la eliminacion selectiva de contaminantes de reacciones de amplificacion de acido nucleico, los poros de los materiales nanoporosos estan revestidos (es decir, funcionalizados de modo que la superficie funcionalizada tenga grupos de una funcionalidad particular) para adsorber dNTP, cebadores y cadenas 60 sencillas mientras que el exterior de los materiales nanoporosos (la superficie de no-poro) se hace resistente a la adsorcion de amplicones. Esto da como resultado funcionalizacion espacialmente no homogenea de los materiales.

En otra realizacion, diferentes nanoporos se funcionalizan con diferentes materiales que proporcionan cierta superficie de nanoporo funcionalizada que es eficaz para eliminar dNTP y otra superficie funcionalizada que es eficaz para eliminar ssADN. En otra realizacion mas, pueden usarse dos conjuntos de materiales nanoporosos 5 funcionalizados - un conjunto que esta funcionalizado con un material (tal como para eliminar dNTP y cebadores) y otros conjunto que esta funcionalizado con otro material (tal como para eliminar ssADN).

Una superficie nanoporosa, ya sea una superficie de poro o una superficie de no-poro, puede funcionalizarse de modo que tenga grupos superficiales que hacen a la superficie cargada positivamente, cargada negativamente, 10 hidrofila, hidrofoba o resistente a la adsorcion. Una superficie nanoporosa tambien puede funcionalizarse de modo que tenga una combinacion de estos caracteres/restos.

Cualquier compuesto con un grupo funcional capaz de tener una carga positiva puede usarse para funcionalizar la superficie de un material nanoporoso, de modo que se haga a la superficie cargada positivamente. Por ejemplo, 15 compuestos con grupos funcionales que tienen un pKa apropiado y, por lo tanto, retienen protones en solucion, pueden usarse para funcionalizar la superficie de un material nanoporoso (por ejemplo, la superficie de poro de una nanopartfcula) con grupos que tienen una funcionalidad de carga positiva. Como otro ejemplo, para impartir una carga positiva a la superficie del material nanoporoso (por ejemplo, una superficie de poro de una nanopartfcula) pueden usarse compuestos que contienen iones amina, imina, tiol o metalicos.

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Los compuestos que contienen amina incluyen, aunque sin limitarse a, cualesquiera compuestos con grupos amina primaria, secundaria o terciaria. Para compuestos con grupos amina sustituidos por alquilo, los grupos alquilo pueden ser, por ejemplo, ramificados o lineales y tener, por ejemplo, de 1 a 20 carbonos. Los ejemplos de compuestos que contienen amina incluyen, por ejemplo, aminosilanos con aminas primarias, secundarias y 25 terciarias. Los aminosilanos adecuados tambien incluyen aquellos con multiples grupos amina. Un ejemplo de un aminosilano es aminopropiltrimetoxisilano (APTMS), que esta disponible en el mercado. Otro ejemplo de un compuesto que contiene amina es un polfmero que tiene grupos amina.

Los compuestos que contienen imina incluyen, aunque sin limitarse a, cualquier compuesto con un grupo imina. Un 30 ejemplo de un compuesto que contiene imina es polietilenimina (PEI), que esta disponible en el mercado, y polietilenimina modificada con dimetoximetilsililpropilo, que tambien esta disponible en el mercado.

Un compuesto que contiene un ion metalico puede ser cualquier compuesto que contiene un ion metalico, tal como, por ejemplo, un compuesto organometalico (por ejemplo, ferroceno) o compuesto de coordinacion (por ejemplo, 35 rutenio tris-bipiridilo o macrociclos que contienen metal).

El material nanoporoso puede funcionalizarse de modo que una superficie del material porte grupos funcionales que hacen a la superficie hidrofoba. Los ejemplos de grupos funcionales hidrofobos incluyen, por ejemplo, grupos hidrocarburo (tales como grupos alcano inferior (por ejemplo, de C4 a C40) que pueden ser ramificados o lineales, 40 grupos ciclohidrocarburo (tales como grupo ciclohexilo), grupos aromaticos (tales como grupos fenilo y bencilo) y similares). Estos grupos hidrofobos pueden estar fluorados (por ejemplo, politetrafluoroetileno). Por ejemplo, un compuesto con cualquiera de estos grupos puede usarse para funcionalizar una superficie nanoporosa que hace a la superficie hidrofoba. Por ejemplo, a superficies de poro se les puede dotar de funcionalidad con caracter hidrofobo desde el punto de vista de adsorber pequenas especies hidrofobas y seguir teniendo aun un numero suficiente de 45 grupos superficiales sin reaccionar (por ejemplo, grupos hidroxilo (-OH)) que son hidrofilos, de modo que las partfculas preparadas de esta manera puedan seguir siendo solubles en agua.

En una realizacion, la superficie de poro se funcionaliza de modo que tenga caracter hidrofobo. Por ejemplo, la superficie de poro puede funcionalizarse con octadeciltriclorosilano (OTS) o politetrafluoroetileno (PTFE) lo que dara 50 como resultado que la superficie de poro porte grupos que hacen a la superficie hidrofoba. Otros ejemplos de compuestos que pueden usarse para funcionalizar una superficie proporcionando una superficie hidrofoba incluyen, aunque sin limitarse a, n-butiltrimetoxisilano (grupos superficiales de alcano C4), ciclooctiltriclorosilano (grupos superficiales de ciclooctano), fenoxipropiltriclorosilano (grupos superficiales fenilo) y nonafluorohexiltrimetoxisilano (cadenas parcialmente fluoradas como grupos superficiales). Como un ejemplo especffico, partfculas de sflice 55 porosa modificadas con OTS, donde coberturas de OTS del 30-70% hacen a regiones de la superficie hidrofobas, de modo que estas adsorban materiales hidrofobos tales como ADN monocatenario y enzimas en un amplio intervalo de condiciones tanto de sal como de pH, mientras que las partfculas de sflice permanecen dispersadas en una solucion acuosa.

60 En una realizacion, la superficie de poro puede estar funcionalizada con compuestos cargados positivamente y/o hidrofobos. Los compuestos cargados positivamente o hidrofobos adsorben contaminantes, tales como dNTP,

cebadores, ssADN y similares. Cuando estos compuestos se usan para funcionalizar la superficie de poro, estos se denominan “materiales funcionalizadores de poros”.

Los compuestos que contienen aniones incluyen cualquier compuesto cargado negativamente o compuesto que 5 porta un grupo/fraccion cargada negativamente (por ejemplo, grupo carboxilato, grupo sulfonato, grupo fosfato, grupo hidroxido y similares). Los ejemplos de compuestos cargados negativamente incluyen, aunque sin limitarse a, 3(-cianobutil)dimetilclorosilano y metoxietoxiundeciltriclorosilano. Los compuestos polianionicos incluyen compuestos que portan mas de un grupo/resto cargado negativamente (por ejemplo grupo carboxilato, grupo sulfonato, grupo fosfato, grupo hidroxido y similares). Los polielectrolitos anionicos incluyen polfmeros (y copolfmeros, donde el 10 copolfmero puede comprender monomeros que no tienen grupos cargados negativamente (por ejemplo, un copolfmero de PAA-polietileno)) que comprenden monomeros con grupos cargados negativamente. Los ejemplos de polielectrolitos anionicos incluyen acido poliestirenosulfonico, acido poliacrflico y similares.

Los compuestos de polielectrolito pueden modificarse para incluir grupos hidrofobos antes o despues de 15 funcionalizar una superficie. Por ejemplo, grupos carboxilato de PAA pueden hacerse reaccionar para formar grupos fluorocarburo u otros grupos hidrofobos antes de funcionalizar una superficie.

En una realizacion, se usa una sal sodica del acido poliacrflico de alto peso molecular (PAA) como polielectrolito. En otra realizacion, se usa poliestireno sulfonado como polielectrolito.

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La una o varias superficies del material nanoporoso pueden funcionalizarse con compuestos que resisten la adsorcion de acidos nucleicos ds, por ejemplo, amplicones de PCR de ADN, que se difunden mal en los nanoporos. Cuando dichos compuestos se usan para funcionalizar la superficie externa o de no-poro, estos de denominan “materiales funcionalizadores de superficie externa o de no-poro”. Los materiales resistentes a la adsorcion 25 adecuados incluyen compuestos cargados (positivos o negativos) y/o hidrofilos, o cualquier compuestos que se sabe que es resistente a la adsorcion de biomoleculas (por ejemplo, polietilenglicol). Los ejemplos de dichos compuestos incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), y compuestos que contienen polietilenglicol (por ejemplo, un siloxano funcionalizado con PEG), y compuestos que contienen fluor. El PEG y los compuestos que contienen PEG adecuados tienen de 1 a 100 grupos de etilenglicol. El PEG y los compuestos que contienen PEG adecuados para 30 funcionalizacion de la superficie de no-poro tienen un peso molecular (o radios hidrodinamicos) tales que el PEG o el compuesto que contiene PEG no entra en el poro.

En una realizacion, la carga positiva y/o negativa en la superficie de poro y/o de no-poro resulta de la exposicion de la superficie a una solucion acuosa de un pH apropiado, de modo que el compuesto este protonado (dando como 35 resultado una superficie cargada positivamente) y/o sea negativo (dando como resultado una superficie cargada negativamente). Por ejemplo, un pH apropiado puede ser de 5 a 10, incluyendo todos los numeros enteros y valores hasta 0,1 entre ambos.

La superficie de no-poro puede funcionalizarse independientemente de que propiedad de la superficie de poro se 40 seleccione. Suponiendo que la superficie de poro tiene un caracter positivo (por ejemplo, la superficie de poro se funcionaliza con una amina), la superficie de no-poro puede modificarse para tener caracter negativo, hidrofobo, de resistencia a la adsorcion o de reconocimiento selectivo).

La superficie de poro puede estar cargada negativamente y la superficie no de poro tener un caracter superficial 45 diferente. Por ejemplo, en el caso de la sflice, las superficies de poro podrfan hacerse negativas mediante union covalente de silanos carboxilados o cualquiera de los compuestos cargados negativamente descritos en el presente documento. El posterior tratamiento de esta sflice con PAH o polilisina de alto PM (peso molecular) que no pueden penetrar en los poros harfan a las superficies de no-poro exteriores positivas, mientras que la reacciones con PEG aminado o compuestos hidrofobos aminados como octadecilamina (ODA) podrfan hacer a las superficies exteriores 50 resistentes a la adsorcion o hidrofobas respectivamente.

Un ejemplo es un caso donde hay dos materiales con elevado PM en una solucion de analito, y es deseable eliminar solamente un analito y concentrar el otro. Esto puede conseguirse tratando la solucion con un material nanoporoso funcionalizado, de modo que absorba selectivamente el componente de analito no deseado. Como un ejemplo 55 especffico, protefnas hidrofobas pueden separarse de ADN hidrofilo mientras se concentra el ADN usando materiales nanoporosos funcionalizados, de modo que la superficie de poro sea resistente a la adsorcion y la superficie de no-poro sea hidrofoba. La protefna puede tener regiones cargadas positivamente que se adsorberfan sobre una superficie exterior cargada negativamente mientras que el ADN no se adsorberfa.

60 La superficie de no-poro puede estar funcionalizada con, por ejemplo, oligonucleotido de ADN sintetico terminado en amina que puede conjugarse a grupos carboxilato en la superficie de no-poro funcionalizada con PAA, garantizando

que la fraccion oligonucleotfdica del ADN estarfa presente solamente en la superficie de no-poro. La conjugacion del oligonucleotido de ADN puede realizarse antes o despues de la funcionalizacion de la superficie de no-poro con PAA.

5 La superficie de poro de un material nanoporoso tambien puede funcionalizarse con secuencias de acido nucleico diana, y dicho material puede usarse, por ejemplo, para extraer un componente particular de una mezcla de moleculas pequenas y grandes en solucion (por ejemplo, eliminacion de una secuencia de oligonucleotidos particular de una mezcla de oligonucleotidos pequenos).

10 Como un ejemplo especffico, puede ser deseable para separar un miARN particular de una solucion que contiene ARN heterogeneo o eliminacion de un conjunto de cebadores particular durante PCR anidada. La superficie de poro puede estar funcionalizada con el oligonucleotido complementario y la superficie de no-poro funcionalizada con un material de elevado PM. Para funcionalizar la superficie de poro con un oligonucleotido complementario, la superficie de poro puede estar funcionalizada con un oligonucleotido modificado con amina que se funcionalizo previamente 15 con un grupo epoxi usando qufmica de silanizacion. El grupo epoxido puede reaccionar con el grupo amina del oligonucleotido modificado con amina dando como resultado la funcionalizacion de la superficie de poro. La superficie de no-poro puede funcionalizarse de modo que se le haga resistente a la adsorcion mediante union covalente de PEG aminado de alto PM con epoxidos sin reaccionar. Como alternativa, la superficie de no-poro puede funcionalizarse con grupos cargados positivamente mediante autoensamblaje electrostatico de polielectrolitos 20 que contienen amina de alto Pm (por ejemplo, PAH) o con grupos cargados negativamente mediante reaccion con PAA seguida por reaccion con PAH.

La seleccion del tamano de poro y polfmeros de alto PM puede llevarse a cabo para recoger selectivamente especies particulares pequenas de interes a partir de un analito complejo. El protocolo general puede implementarse 25 para retener las especies recogidas o para retener la solucion purificada que ya no contiene las especies recogidas.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una estrategia general para funcionalizar de forma diferencial la superficie de poro y de no-poro de un material nanoporoso. En general, la superficie de no-poro se funcionaliza mediante reaccion/exposicion a materiales (normalmente polfmeros de alto peso molecular) macromoleculares 30 grandes que no encajan facilmente en los poros y, por lo tanto, solamente funcionalizan la superficie de no-poro. La funcionalizacion de la superficie de no-poro puede realizarse antes o despues de la de la superficie de poro, y cada estrategia tiene sus ventajas. Por ejemplo, la funcionalizacion de la superficie de no-poro puede conseguirse a traves de union covalente, tal como qufmica de silanizacion sobre oxidos porosos o mediante autoensamblaje electrostatico as por ejemplo adsorcion de polielectrolitos sobre superficies cargadas tales como oxidos hidroxilados.

35

Las macromoleculas pueden aplicarse antes o despues de la funcionalizacion interior. Ademas, las macromoleculas pueden, aunque no es necesario que lo hagan, portar la funcionalidad exterior final. Las macromoleculas pueden llevar grupos funcionales generales sometidos a reaccion qufmica adicional que posteriormente otorga la propiedad deseada selectivamente sobre las superficies exteriores.

40

Cuando las superficies de poro se funcionalizan primero, las macromoleculas “cubren” la superficie de no-poro exterior y reaccionan con o simplemente bloquean mecanica o electrostaticamente la funcionalizacion de la superficie original haciendo a estas fracciones inaccesibles a un analito subsiguiente. Por ejemplo, un polielectrolito cargado negativamente demasiado grande para penetrar en los poros puede ponerse en contacto con partfculas 45 prefuncionalizadas con restos positivos tales como grupos amina. En este ejemplo, los poros tendrfan un caracter superficial cargado positivamente mientras que la superficie de no-poro exterior tendrfa un caracter superficial cargado negativamente. Por lo tanto, estos materiales podrfan usarse en aplicaciones donde es deseable eliminar moleculas cargadas negativamente, pequenas de un analito mientras se retienen moleculas cargadas negativamente grandes en solucion. La limpieza de PCR es un ejemplo de dicha aplicacion donde dNTP y 50 cebadores monocatenarios pueden adsorberse sobre superficies de poro que tienen un caracter superficial cargado positivamente mientras que, moleculas de ADN bicatenario grandes permanecen en la solucion.

Como alternativa, las macromoleculas tambien pueden funcionalizar primero y subsiguientemente los poros. Esta estrategia es eficaz en la medida en que las macromoleculas cubren eficazmente la superficie de no-poro exterior y 55 bloquean la qufmica de funcionalizacion que esta siendo aplicada a las superficies de poro. Como otra estrategia alternativa, la funcionalizacion de no-poro puede ser qufmica que se produce “debajo de” las macromoleculas sobre la superficie de no-poro exterior, de modo que la funcionalidad que se le esta dando a la superficie porosa interior este “oculta” en la superficie de no-poro exterior a pesar de la qufmica de poro que tambien se produce en el exterior como en el ejemplo anterior donde las macromoleculas se aplican despues de la funcionalizacion de poros.

En general, la funcionalizacion superficial, tal como se usa en la presente invencion, puede llevarse a cabo usando

cualquier reaccion, procedimiento, etc., que de como resultado que el compuesto deseado se inmovilice sobre la superficie del material nanoporoso. Por ejemplo, pueden inmovilizarse compuestos sobre la superficie del material nanoporoso mediante uno o varios enlaces covalentes entre el compuesto y la superficie. Los compuestos tambien pueden depositarse de forma electrolftica sobre revestimientos adecuados. Cuando solamente se pretende 5 funcionalizacion exterior, las fracciones deseadas pueden unirse previamente al polfmero de peso molecular grande que esta electrolfticamente adsorbido sobre la superficie. Como un ejemplo, se podrfa decorar PAA de alto peso molecular con biotina y a continuacion depositarlo sobre las superficies exteriores que portan la biotina consigo y de este modo biotinilar selectivamente el exterior.

10 Por ejemplo, puede introducirse funcionalidad de carga positiva usando qufmica de silanizacion (por ejemplo, reaccion con aminosilanos tales como APTMS) o autoensamblaje de polielectrolitos cargados positivamente con bajo peso molecular (por ejemplo poli(alilamina), poli(etilenimina) o poli(lisina)).

Un ejemplo del uso de qufmica de silanizacion para funcionalizar la superficie de poro de sflice nanoporosa con 15 grupos cargados positivamente es union covalente de aminas con aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) o cualquiera de los silanos disponibles en el mercado. Como otro ejemplo, la exposicion del material nanoporoso a polielectrolitos pequenos, tales como polietilenimina (PEI) de bajo peso molecular, clorhidrato de polialilamina (PAH) o polilisina, que se sabe que se adsorben sobre sflice nativa. Dicha funcionalizacion de la superficie de poro transmitira caracter positivo a esta superficie debido a los grupos amina que estan expuestos sobre la superficie. Otros tipos de sustratos 20 pueden funcionalizarse con qufmica superficial analoga. Por ejemplo, alumina porosa puede modificarse para presentar los grupos qufmicos deseados mediante qufmica de fosfonato y oxido de titanio tambien puede funcionalizarse con qufmica de silanizacion estandar usada sobre sflice.

Como otro ejemplo, la superficie de poro puede funcionalizarse usando qufmica de silanizacion (usando, por 25 ejemplo, compuestos disponibles en el mercado) para unir grupos hidrofobos comunes (tales como, por ejemplo, alcanos, grupos fenilo e hidrocarburos fluorados).

En otra realizacion, el procedimiento para preparar un material nanoporoso funcionalizado de forma diferencial comprende, como etapa inicial, poner en contacto el material nanoporoso con un material funcionalizador de poros 30 que da como resultado que ambas superficies se funcionalicen con el material funcionalizador de poros. Una etapa subsiguiente implica poner en contacto el material nanoporoso (funtionalizado con el material funcionalizador de poros) con un material funcionalizador de superficie que da como resultado que la superficie externa y no la superficie de poro se funcionalice con el material funcionalizador de la superficie externa. Un experto en la materia reconocerfa que pueden usarse otras metodologfas que darfan como resultado los materiales de la presente 35 invencion que comprenden dos superficies funcionalizadas distintas con las propiedades deseadas.

Como un ejemplo de esta realizacion, se produce un material nanoporoso con una superficie de poro resistente a la adsorcion y una funcionalizacion de superficie de no-poro diferente sobre partfculas de sflice. En primer lugar, una superficie se funcionaliza mediante silanizacion con una amina, de modo que se produce una superficie cargada 40 positivamente. A continuacion, las aminas exteriores se cubren y/o se hacen reaccionar con PAA de alto PM. En tercer lugar, las aminas interiores se hacen reaccionar con oligoetilenglicol carboxilado de un PM tal que pueda penetrar en los poros. Esto producirfa un material nanoporoso con una superficie de poro resistente a la adsorcion y superficie de no-poro cargada negativamente. La superficie de no-poro podrfa hacerse hidrofoba usando un copolfmero de PAA/hidrofobo o hacerse positiva sobrerrevistiendo pAa con PAH de alto PM. Otros ordenes de 45 aplicacion y el uso de capas de silanizacion mixtas para impartir sitios de union junto con interiores resistentes a la adsorcion, tambien son posibles.

En otra realizacion mas, es posible eliminar (u ocultar) selectivamente las aminas sobre la superficie de no-poro exterior mediante aplicacion de una macromolecula. Por ejemplo, si se desea que la superficie exterior tenga un 50 caracter negativo, la superficie exterior puede funcionalizarse en ultimo lugar con, por ejemplo, un polielectrolito negativo tal como acido poliacrflico (PAA) con peso molecular (PM) suficientemente alto (es decir, tamano suficientemente grande) para que los poros permanezcan no afectados. Los grupos carboxilato portados por el PAA son electrostaticamente atrafdos a las aminas y, dado que el PAA los porta en exceso, la carga exterior cambiarfa a negativa. Otros polfmeros cargados negativamente tales como sulfonato de poliestireno (SPS) tambien podrfan 55 usarse para este fin. Notese que la carga del polielectrolito y la carga de la amina dependen del pH, de modo que esta atraccion es solamente en ciertos intervalos de pH (en estos casos, bastante amplios, de aproximadamente pH 5 a pH 8). Tambien es posible hacer al acoplamiento independiente del pH uniendo covalentemente PAA a las aminas superficiales mediante qufmica de acoplamiento de carboxilato-amina.

60 La funcionalizacion del exterior pude realizarse de al menos dos maneras. En primer lugar, capas de silanizacion mixtas con un componente minoritario que contiene grupos marginalmente hidrofilos que portan fracciones

funcionales que pueden hacerse reaccionar con polfmeros de alto PM en el exterior. Por ejemplo, los materiales nanoporosos pueden funcionalizarse con capas mixtas de OTS e hidrocarburos de cadena larga que tienen una terminacion amina. Esta ultima reaccionara con materiales carboxilados tales como PAA y copolfmeros de PAA con otros polfmeros que son o contienen unidades funcionales. La reaccion con PAA harfa al exterior negativo, mientras 5 que la reaccion con PEG carboxilado lo harfa resistente a la adsorcion. Analogamente, el deposito de polielectrolitos cargados positivamente tales como PAH o PEI de alto PM encima de PAA podrfa usarse para hacer al exterior positivo.

Si es deseable hacer a la superficie exterior hidrofoba, existen al menos dos maneras generales de hacerlo. En 10 primer lugar, se podrfa hacer reaccionar un polfmero de alto PM con las aminas superficiales (por ejemplo, un copolfmero de pAa con polietileno) para llevar alcanos hidrofobos u otros grupos a la superficie. En segundo lugar, se podrfa eliminar por reaccion el exceso de grupos carboxilato en el PAA con compuestos hidrofobos que contienen amina, tales como octadecilamina. En el ultimo caso, se puede cambiar incluso las propiedades de la superficie exterior selectivamente con moleculas pequenas, dado que estas no serfan capaces de unirse a los grupos amina u 15 OH residual en el interior de sflice porosa funcionalizada. La qufmica para modificar algunos de los carboxilatos de PAA podrfa realizarse antes o despues de la aplicacion del PAA.

Estrategias similares que usan estas dos alternativas (union anterior de la funcionalidad deseada al polfmero que contiene carboxilato o reacciones con exceso de carboxilatos de PAA no amarrados por aminas despues del 20 deposito) tambien pueden usarse para otorgar caracter resistente a la adsorcion al exterior. Por ejemplo, polietilenglicol carboxilado (COOH-PEG) de alto PM, que no puede penetrar en los poros, puede hacerse reaccionar con las aminas. La funcionalizacion de una superficie con PEG da como resultado una suspension biocompatible, hidrofila y resistente a la adsorcion. Como alternativa, puede hacerse reaccionar oligoetilenglicol aminado con el exceso de grupos carboxilato para funcionalizar la superficie.

25

En una realizacion, micropartfculas de sflice porosa pueden funcionalizarse con polielectrolitos de bajo peso molecular (PM) o APTMS en los poros y con PAA de alto PM en el exterior usando tecnicas convencionales.

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un procedimiento para separar acidos nucleicos bicatenarios 30 de acidos nucleicos monocatenarios y/o libres (individuales) usando los materiales nanoporosos descritos en el presente documento.

En una realizacion, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para la purificacion de dsADN a partir de una mezcla que comprende dsADN y uno o mas de dNTP, cebadores y/u otros ssADN. El procedimiento comprende 35 combinar la mezcla con el material nanoporoso descrito anteriormente, incubar la mezcla combinada durante un periodo de tiempo para efectuar secuestro de dNTP y ssADN (incluyendo cebadores) sobre o dentro de los poros de los materiales nanoporosos; y, separar el material nanoporoso de la solucion de mezcla para obtener una solucion de dsADN purificada. Por lo tanto, separar el material nanoporoso de la mezcla elimina dNTP y ssADN adsorbidos a las superficies de nanoporo (y por lo tanto, secuestrados o atrapados en los poros) del dsADN que puede 40 recuperarse en la solucion. Por ejemplo, este procedimiento puede usarse para “limpiar”/purificar un producto de PCR. En exposicion de una mezcla de productos de PCR de ADN bicatenario, acidos nucleicos y dNTP a un material nanoporoso de la presente invencion, el ADN bicatenario no se adsorbera sobre las superficies mientras que otros componentes se adsorberan preferentemente. La solucion eliminada de las superficies sera ADN bicatenario purificado. Las figuras 1(a) y (b) ilustran graficamente la preparacion de materiales tfpicos y representan 45 el comportamiento de un producto de PCR.

En esta realizacion, la superficie de poro debe funcionalizarse de modo que adsorba fuertemente dNTP y cadenas sencillas de acidos nucleicos mientras que la superficie de no-poro exterior del material nanoporoso debe ser resistente a la adsorcion de acido nucleico bicatenario. Una estrategia es funcionalizar los poros para que presenten 50 carga positiva mientras se funcionaliza el exterior para que presente superficies con carga negativa o completamente inertes (es decir, resistentes a la adsorcion) que inhiben la adsorcion de amplicones. La carga positiva podrfa introducirse sobre partfculas de sflice porosa usando qufmica de silanizacion (por ejemplo, reaccion con aminosilanos tales como aminopropiltrimetoxisilano) o autoensamblaje de polielectrolitos cargados positivamente con bajo peso molecular (por ejemplo, polialilamina, polietilenimina o polilisina). Dado que estos revestirfan 55 presumiblemente superficies tanto interiores como exteriores, se bloquearfan las superficies exteriores con polielectrolitos cargados negativamente grandes (tales como acido poliacrflico de alto peso molecular) demasiado grandes para penetrar en los poros. Tambien puede ser posible usar revestimientos hidrofobos en el interior y revestimientos hidrofilos, negativos o inertes en el exterior de las partfculas para adsorber de forma diferencial dNTP y cebadores.

El presente procedimiento es diferente de procedimientos previos donde todos los componentes de una reaccion de

amplificacion se movilizan sobre superficies homogeneas y diversos componentes se eluyen a continuacion selectivamente. El procedimiento proporciona una metodologfa de separacion de etapa unica que combina exclusion por tamano (por ejemplo, materiales con un radio hidrodinamico mayor que el tamano de poro promedio del material nanoporoso son excluidos) con superficies que tienen caractensticas de adsorcion diferencial, de modo que un 5 subconjunto de moleculas y complejos pequenos pueden eliminarse selectivamente de mezclas para aplicaciones de purificacion o ensayo.

La mezcla que comprende dsADN y material nanoporoso puede incubarse durante periodos de tiempo que vanan entre menos de un minuto y varios minutos. El tiempo de incubacion puede ser optimizado por un experto en la 10 materia para contemplar diversos parametros de reaccion de amplificacion de acido nucleico, tales como el volumen de la mezcla que se combina con el material nanoporoso, asf como la cantidad de dsADN, ssADN y/o dNTP presente o que se espera que este presente en la mezcla. Por ejemplo, y sin pretender estar limitados por ninguna teona particular, generalmente se considera que entre 40 - 200 pM de dNTP es una concentracion de dNTP optima para reacciones de PCR convencionales. Del mismo modo, generalmente se considera que entre 0,1 - 1,0 pM es 15 una concentracion optima de cebadores de PCR para reacciones de PCR tfpicas. Sin embargo, concentraciones mayores o menores de dNTP y/o cebadores pueden usarse para ciertas reacciones de amplificacion, dependiendo de diversos factores, tales como la cantidad y calidad del patron de ADN, la longitud de amplicones esperados, y el numero, temporizacion y temperaturas de ciclos de amplificacion. Por lo tanto, el periodo de incubacion puede prolongarse o acortarse para cualquier protocolo de PCR particular para optimizar la cantidad de tiempo que dNTP 20 no incorporados y/o cebadores no incorporados tienen que difundirse en los nanoporos. La invencion contempla tiempos de incubacion de mas de un minuto, y tiempos entre 5-60 segundos ambos inclusive, y que incluyen todos los numeros enteros entre 5 y 60 segundos. Ademas, el periodo de incubacion puede ajustarse para conseguir una cantidad deseada de eliminacion de dNTP o ssADN, y/o una cantidad deseada de retencion de dsADN en la mezcla. Por ejemplo, en una realizacion, un periodo de incubacion de entre 30 y 45 segundos es suficiente para eliminar mas 25 del 90% de los dNTP y mantener mas del 80% de los amplicones de PCR en la solucion de mezcla.

La cantidad de material nanoporoso funcionalizado de forma no homogenea anadida a una mezcla de amplificacion de acido nucleico particular puede optimizarse teniendo en cuenta diversos factores. Por ejemplo, y sin pretender estar limitados por la teona, es posible calcular los moles de dNTP y cebadores que se anaden a una reaccion de 30 amplificacion de acido nucleico particular. Tambien es posible estimar, basandose en factores tales como el numero y la temperatura de ciclos de amplificacion y la actividad polimerasa esperada, la cantidad de dNTP y cebadores no incorporados que permanecera en la mezcla una vez que el protocolo de amplificacion esta completo. Por consiguiente, la capacidad total del material nanoporoso en la mezcla de adsorber dNTP y cebadores no incorporados puede ajustarse para proporcionar mas (o menos) area superficial de nanoporo para facilitar la 35 eliminacion de tantos dNTP y cebadores como fuera posible, sin hacer que la mezcla se vuelva diffcil de procesar debido a, por ejemplo, la viscosidad incrementada. Por ejemplo, en un volumen de reaccion de PCR tfpico de 100 pl que comprende al comienzo del protocolo de amplificacion una concentracion convencional de dNTP y cebadores, una cantidad ejemplar del material nanoporoso que podna anadirse a la solucion postamplificacion para eliminar dNTP y cebadores no incorporados esta entre 2-4 mg.

40

El material nanoporoso (con los contaminantes atrapados) puede separarse del dsADN mediante una tecnica adecuada, incluyendo aunque sin limitarse a tecnicas de centrifugado y magneticas. Como alternativa, el material nanoporoso puede retenerse mediante filtracion y la eliminacion de la solucion de amplificacion, tal como pipeteando. Esto dara como resultado la separacion de dsADN de los contaminantes, proporcionando de este modo 45 una solucion de acido nucleico bicatenario purificado. La cantidad de contaminantes que quedan en (o eliminados de) una preparacion de acido nucleico bicatenario purificado puede determinarse mediante tecnicas estandar, tales como analisis espectroscopico.

Se espera que la invencion pueda usarse para purificar acidos nucleicos bicatenarios a cualquier grado de 50 purificacion deseado, tal como purificacion parcial, purificacion sustancialmente completa o purificacion completa. En realizaciones diferentes, los contaminantes pueden comprender menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 1%, y menos que todos los numeros enteros entre el 50% y el 1%. La invencion tambien puede dar como resultado una preparacion de acido nucleico bicatenario que esta completamente libre de contaminantes. Por lo tanto, los acidos nucleicos bicatenarios pueden comprender del 55 50% al 100%, incluyendo todos los numeros entre ambos, de los acidos nucleicos en la solucion despues de que las nanopartfculas porosas se separen de la mezcla.

El procedimiento de la presente invencion puede usarse para purificar dsADN a partir de una solucion de reaccion de amplificacion de acido nucleico, una preparacion de ADN plasmfdico concentrado, una preparacion de digestion por 60 restriccion, una extraccion de ADN, soluciones de hibridacion de ensayo de ADN y/o ARN, una preparacion de ARN, o una reaccion de mutagenesis dirigida de ssADN, y similares. Los acidos nucleicos bicatenarios purificados usando

el procedimiento de la invencion pueden ser ADN bicatenario, ARN bicatenario, o moleculas de acido nucleico monocatenarias (ss) que adoptan regiones significativas de estructura bicatenaria. Las moleculas de acido nucleico bicatenarias pueden ser lineales o circulares. Usando el procedimiento y los materiales nanoporosos de la presente invencion, puede aislarse dsADN de tan solo 10 pb a partir de una reaccion de amplificacion.

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En una realizacion, se usan micropartfculas de sflice porosa con superficies de poro funcionalizadas con APTMS y superficies de no-poro funcionalizadas con PAA de alto PM en el procedimiento. Varios mg de material nanoporoso se anaden a 100 pl de una solucion acuosa de mezcla de ss/dsADN y en la separacion del material nanoporoso y la mezcla, solamente el dsADN es retenido en la solucion acuosa.

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En otra realizacion, micropartfculas de sflice porosa con superficies de poro funcionalizadas con polielectrolitos de bajo PM cargados positivamente y superficies de no-poro revestidas con PAA de alto PM. Varios mg de material nanoporoso se anaden a 100 pl de una solucion acuosa de mezclas de ss/dsADN y, en la separacion del material nanoporoso y la mezcla, solamente el dsADN es retenido en la solucion acuosa.

15

En otros aspectos, la presente divulgacion proporciona procedimientos para separar acidos nucleicos bicatenarios de protefnas. Ejemplos no limitantes de las protefnas incluyen protefnas enzimaticas, tales como polimerasas y nucleasas. Las polimerasas incluyen, sin limitacion, ADN polimerasas, ARN polimerasas, transcriptasas inversas y ARN polimerasas dependientes de ARN. Las nucleasas incluyen sin limitacion endonucleasas de restriccion, y 20 ADNasa y ARNasa de todas las variedades.

En diversas realizaciones ilustrativas, para algunas aplicaciones posteriores de ADN amplificado, es deseable separar el dsADN de la enzima ADN polimerasa usada para amplificacion del ADN, tal como Taq polimerasa, Sin embargo, dado que las ADN polimerasas estan cargadas negativamente y tienen pesos moleculares grandes y, por 25 lo tanto, probablemente no penetrarfan en los poros de las nanopartfculas funcionalizadas de forma heterogenea divulgadas en el presente documento, la presente divulgacion contempla el uso de partfculas nanoporosas que tienen funcionalizacion superficial hidrofoba para adsorber selectivamente las polimerasas y/u otras protefnas que pueden estar presentes con acidos nucleicos bicatenarios en una mezcla. A este respecto, se demuestra la separacion de Taq polimerasa de acido nucleico ds usando partfculas nanoporosas funcionalizadas con fracciones 30 hidrofobas. Se espera que este resultado pueda extenderse a la separacion de acidos nucleicos bicatenarios de otras protefnas, tales como enzimas implicadas en catalisis de acidos nucleicos, dado que en la tecnica se conoce que, por ejemplo, las nucleasas se adsorberan selectivamente sobre superficies hidrofobas mientras que el ADN no lo haran. Tambien es conocido que si cualquier protefna particular se adsorbera sobre una superficie hidrofoba esta correlacionado con el contenido de aminoacidos aromaticos de la protefna, y que aquellas protefnas que tienen mas 35 del 10% de contenido de aminoacidos aromaticos tendran alta afinidad por las superficies hidrofobas. (Vease, por ejemplo, el documento Cashion y col., Nucleic Acids Research, vol. 8, No. 5, Mar. 11, 1980, pags. 1167-1185.)

En una realizacion, puede usarse una sflice nanoporosa parcialmente funcionalizada covalentemente con OTS (octadeciltriclorosilano) de modo que la superficie de no-poro sea hidrofoba, para eliminar Taq polimerasa de la 40 solucion. El grado de revestimiento con OTS es tal que las partfculas siguen siendo hidrofilas y se dispersan facilmente en agua.

Como alternativa, materiales nanoporosos que comprenden una superficie de no-poro funcionalizada con un compuesto de polielectrolito que tiene una funcionalidad multiple (es decir, diferentes grupos funcionales) pueden 45 usarse para eliminar selectivamente polimerasa. Por ejemplo, copolfmeros de PAA y un resto hidrofobo tal como polietileno pueden usarse para funcionalizar la superficie de no-poro. Esta superficie funcionalizada se volvera no atractiva para dsADN grande debido a que el PAA resiste electrostaticamente la adsorcion de ADN, pero las regiones hidrofobas eliminaran polimerasa, dado que esta es mucho mas hidrofoba que el dsADN. El grado de hidrofobia de la superficie de no poro puede ajustarse a medida apropiadamente usando diferentes copolfmeros con 50 composicion de grupos funcionales variable. La multiple funcionalidad de superficie de no-poro tambien puede crearse mediante sustitucion de un numero controlado de los grupos carboxilato en el PAA por grupos hidrofobos. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar PAA con una cantidad apropiada de octadecilamina antes o despues de la funcionalizacion de la superficie de no-poro.

55 La separacion de acidos nucleicos ds de protefnas con caracter hidrofobo pueden conseguirse como parte de una limpieza de etapa unica de soluciones de PCR. La eliminacion de protefnas puede comprender usar mas de un material nanoporoso (por ejemplo, perlas mixtas)

En otra realizacion, las partfculas nanoporosas pueden comprender una o varias funcionalizaciones de no-poro para 60 tener tanto carga negativa como caracter hidrofobo, lo que permitirfa, por ejemplo, limpieza de PCR y eliminacion de enzimas simultaneamente con un unico material nanoporoso, por ejemplo, perlas nanoporosas. En una realizacion,

una superficie de no-poro se funcionaliza con copolfmeros de PAA (por ejemplo donde el copolfmero es hidrofobo (por ejemplo polietileno o poliestireno)).

Otra realizacion mas se refiere a la limpieza de reacciones de marcado. Frecuentemente es deseable anadir marcas 5 fluorescentes u otras (por ejemplo, biotina o ferroceno) a oligonucleotidos. Despues de estas reacciones, el colorante fluorescente no unido debe eliminarse de la mezcla para purificar el oligonucleotido marcado. La metodologfa general de los procedimientos descritos en el presente documento puede aplicarse a esas situaciones en las que es deseable adsorber las marcas en los poros del material nanoporoso mientras se excluyen los oligonucleotidos. Puede usarse un material nanoporoso con poros muy pequenos (hasta 30A estan disponibles en el mercado en 10 sflice) funcionalizado de modo que el marcador libre se adsorba en el poro y la cadena sencilla marcada no pueda entrar en el poro. Puede usarse la funcionalizacion de la superficie de poro que hace a la superficie de poro cargada positivamente, cargada negativamente o hidrofoba dependiendo de la naturaleza del marcador.

Otro procedimiento mas se refiere a aplicaciones en ensayos de hibridacion. Se realizan ensayos de hibridacion para 15 pruebas de secuenciacion en ADN o ARN (por ejemplo, deteccion de SNP rapida en ADN genomico amplificado por PCR). Los ensayos de hibridacion son habituales, por ejemplo, en tecnologfa de cribado genetico. En general, despues de la amplificacion qufmica de ADN, pruebas rapidas para determinar si se amplifico la secuencia diana correcta son valiosas. A menudo, se usa electroforesis en gel para valorar si se han amplificado fragmentos de la longitud esperada, pero la electroforesis en gel es lenta y no puede usarse facilmente para la deteccion de 20 polimorfismos de nucleotido sencillo (SNP). Una alternativa habitual, al menos para el ADN, es PCR en tiempo real donde se incorporan sondas en el proceso de amplificacion para realizar una deteccion especffica de secuencia. El ensayo de hibridacion en el presente documento obvia la necesidad del complejo diseno de ensayo y la infraestructura necesaria para PCR en tiempo real y permite el uso de PCR simple seguida por un rapido ensayo de hibridacion con una sonda marcada para lograr el mismo fin. Dado que se puede adsorber y eliminar de forma 25 diferencial ADN monocatenario mientras se deja una preponderancia de ADN bicatenario (o parcialmente bicatenario) en solucion, se puede valorar si sondas monocatenarias marcadas han hibridado con secuencias diana. Estas dianas pueden ser complementos monocatenarios (o complementos parciales) o pueden ser ADN bicatenario donde las sondas monocatenarias se unen con una cadena de la doble cadena despues de una etapa de deshibridacion e hibridacion. Las dianas tambien pueden ser estructuras parcialmente de doble cadena donde el 30 oligonucleotido de la sonda se une a regiones monocatenarias en la diana como podrfa ser el caso para la union a ARN plegado o para ensayos de sandwich.

Las partfculas para adsorcion diferencial podrfan estar compuestas por sflice, alumina, oxido de titanio o polfmeros solubles en agua posiblemente hidrofilos. Las partfculas porosas tienen la ventaja de tener una mayor area de 35 adsorcion. Dado que las partfculas se trataran con revestimientos hidrofobos pero es ventajoso tener partfculas solubles en agua, tambien puede ser de cierta ventaja la porosidad para permitir una gran area superficial que es relativamente diffcil que se vuelva hidrofoba. Los revestimientos hidrofobos normalmente estaran unidos covalentemente a la superficie de la partfcula, como por ejemplo usando qufmica de silanizacion para modificar o modificar parcialmente la superficie de sflice con fracciones hidrofobas, tales como alcanos o anillos fenilo. Sin 40 pretender estar limitados por ninguna teorfa particular, se considera que la razon ffsica por la que superficies hidrofobas pueden adsorber de forma diferencial ADN monocatenario es que este es mucho mas hidrofobo que el ADN bicatenario. La termodinamica que impulsa la adsorcion es que entidades relativamente hidrofobas pueden adsorber y sustituir al agua forzada a residir en superficies hidrofobas donde no puede satisfacer eficazmente sus requisitos de union. La liberacion del agua interfacial causa una ganancia entropica que hace la adsorcion 45 termodinamicamente favorable. La divulgacion contempla adicion de sales caotropicas para afinar este proceso e incrementar el contraste entre las eficiencias de adsorcion de las especies relevantes.

Una ilustracion no limitante de un protocolo util para realizar ensayos de hibridacion de acuerdo con la invencion es la siguiente.

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En primer lugar, se anaden sondas marcadas a una muestra de ADN a ensayar. Las sondas pueden ser oligonucleotidos monocatenarios que tienen estructuras secundarias mfnimas o no tienen. Las marcas pueden ser colorantes fluorescentes (por ejemplo rodamina, fluorescefna, cy-3, cy-5, etc.), restos redox (por ejemplo ferroceno, etc.) o marcadores radiactivos (por ejemplo 32P). Las dianas pueden ser cualesquier acido nucleico. Los ejemplos no 55 limitantes incluyen ADN genomico bicatenario, ADN amplificado por PCR, ARN o ADN que contiene cadenas dobles, o cadenas sencillas no marcadas de ADN o ARN. Para dianas de amplicon de PCR, las marcas pueden anadirse a la mezcla de PCR antes de la amplificacion, dado que son normalmente cortas en comparacion con cebadores y no interferiran en la PCR. Esto evita manipulacion adicional y contaminacion potencial. Por ejemplo, los cebadores tfpicos tienen 20-25 bases y una Tm de aproximadamente 55°C, de este modo sondas con aproximadamente 15 60 bases que tienen una Tm de aproximadamente 40°C hibridaran solamente en la ultima etapa del ciclo cuando la muestra se refrigera finalmente a por debajo de 55°C.

La segunda etapa comprende calentar la mezcla para permitir que las sondas hibriden con la diana. Cuando la diana es bicatenaria, es necesario deshibridarla, de modo que las sondas puedan hibridar con la diana. En el caso de amplificacion por PCR, la hibridacion de las sondas se realiza como la ultima etapa del protocolo de ciclado termico, 5 que normalmente comprende calentar el sistema a 95 grados y enfriar a por debajo de la temperatura de fusion del complejo sonda-diana (por ejemplo ~40 grados centfgrados para una sonda de 15-mero). Este protocolo de ensayo de hibridacion podrfa usarse con procedimientos de amplificacion de ADN o ARN diferentes de PCR para valorar si una diana particular esta presente. Estos otros procedimientos incluyen, aunque sin limitarse a, reaccion en cadena de la ligasa, amplificacion mediada por transcripcion, amplificacion por desplazamiento de cadena y amplificacion 10 isotermica. En el caso de deteccion de polimorfismo de nucleotido sencillo (SNP), la solucion de hibridacion se hibrida en condiciones de astringencia (habitualmente una temperatura entre las temperaturas de fusion de sondas de tipo silvestre y mutantes) donde la determinacion de emparejamientos erroneos de una sola base es factible. Sin embargo, el ensayo es independiente de la hibridacion y se puede ejecutar en condiciones ambiente.

15 En tercer lugar, la mezcla hibridada se expone a las partfculas con revestimiento hidrofobo. Las partfculas pueden estar compuestas por sflice, oxido de titanio, alumina, etc., y se funcionalizan con una capa hidrofoba, tal como alcanos unidos a sflice mediante qufmica de silanizacion. Puede ser ventajoso funcionalizar de forma incompleta las superficies de partfculas nanoporosas de modo que estas retengan suficiente caracter hidrofilo para dispersarse bien en solucion acuosa. Las partfculas porosas se aprovechan del area superficial elevada para adsorcion. La 20 exposicion puede ser anadiendo una dispersion de perlas al analito o viceversa. Como alternativa, las partfculas pueden estar en forma seca y contenidas en un tubo o pipeta. El analito puede anadirse al tubo o aspirarse al interior de la pipeta. Durante la exposicion, las cadenas sencillas no hibridadas se adsorberan sobre las perlas. Por lo tanto, la separacion de las perlas del analito (o viceversa) dejara solamente sondas que han hibridado con la diana en solucion.

25

Finalmente, se ensaya en la solucion la presencia de la marca. Por ejemplo, se detectan marcas fluorescentes usando fotoluminiscencia y marcas redox usando voltametrfa cfclica o voltametrfa de pulso diferencial. Su presencia indica hibridacion con exito de la sonda con la diana y, por lo tanto, la presencia de la secuencia complementaria en la diana.

30

En otra realizacion, para determinar si un oligonucleotido de sonda con un marcador ha hibridado con su secuencia complementaria en ADN o ARN genomico o amplificado por PCR, la sonda puede comprender una secuencia que coinciden con el amplicon diana que ha sido incluido deliberadamente en la reaccion de PCR pero con una temperatura de fusion menor que la de los cebadores, asf que no interfiere en la PCR. En este caso, los materiales 35 no porosos, por ejemplo, las nanopartfculas en la figura 1(b), pueden anadirse a la mezcla final. Si la sonda hibrida con el amplicon al refrigerarse por debajo de su temperatura de fusion, no se adsorbera, dado que el complejo resultante es demasiado grande para penetrar en los poros del material nanoporoso. Si la sonda no hibrida con la diana, se adsorbera en los poros del material nanoporoso. Por lo tanto, la presencia de marcas en el analito (determina mediante, por ejemplo, tecnicas de fluorescencia o redox) una vez que el material nanoporoso se elimina, 40 demuestra la presencia de la secuencia diana. Adicionalmente, el procedimiento puede adaptarse para usar ensayos colorimetricos para demostrar la presencia del hfbrido diana basandose en agregacion inducida por sales de nanopartfculas de oro coloidal.

Otros ejemplos de hibridacion incluyen los siguientes. Eliminacion de oligonucleotido marcado no hibridado, donde el 45 oligonucleotido marcado no hibridado es un cebador no extendido. En esta realizacion, la falta de senal de marca en el analito restante despues de la eliminacion de cadenas sencillas reflejarfa una amplificacion por PCR fallida. A la inversa, la presencia de senal de marca indicarfa que los cebadores habfan sido extendidos y que la PCR funciono. Esta ultima circunstancia refleja la presencia de la secuencia diana en la muestra original

50 El uso de varias oligosecuencias con diferentes marcas colorantes simultaneamente para detectar multiples dianas (por ejemplo, para la lectura de PCR multiple o para genotipado de SNP donde una sonda serfa un complemento de tipo silvestre con un tipo de fluoroforo y la otra la secuencia complemento mutante con un fluoroforo distinguible). Una prueba de astringencia adecuada, tal como se ha descrito anteriormente, se prefiere en el caso de SNP. Un caso especial para deteccion de SNP combinarfa el uso de varias oligosecuencias con diferentes marcas colorantes 55 simultaneamente para detectar multiples dianas y la eliminacion de cebador no extendido donde se usan dos cebadores que solapan el SNP con secuencias de tipos silvestre y mutante que tienen diferentes marcas y la solucion de PCR amplificada se expone al medio hidrofobo para eliminar cebadores no extendidos. En este caso, la prueba de astringencia estarfa integrada en el protocolo de ciclado termico de PCR ajustando la temperatura de hibridacion de los cebadores para preferir el uno o varios cebadores perfectamente complementarios.

Otro uso incluye la adicion deliberada de sales para facilitar adsorcion diferencial y optimizar el contraste de ss frente

a ds. Dado que la fluorescencia es suficientemente sensible, una pequena alfcuota de la solucion de hibridacion puede diluirse enormemente en otras soluciones tampon y permitir controlar la intensidad del efecto hidrofobo durante la exposicion a las partfculas revestidas.

5 Otro uso mas incluye el uso de funcionalizacion superficial mixta adicional, tal como, por ejemplo, incluir una baja densidad de extintores FRET que no alterarfan el caracter hidrofobo pero que servirfan para extinguir la fluorescencia de cadenas sencillas marcadas que no hibridan y de este modo obvian la necesidad de eliminar las perlas antes de leer la fluorescencia. Los ejemplos de extintores FRET incluyen, aunque sin limitarse a, BHQ™ (Biosearch Technologies) y Iowa Black™ (Integrated DNA Technologies) y Blackberry650 ™ (Berry Associates). 10 Estos materiales pueden estar unidos covalentemente a capas de silanizacion mixtas. Se espera que 0,001 - 0,1 monocapas de extintor sean adecuadas para proporcionar extincion casi completa basandose normalmente en radios de transferencia de energfa de Forster.

En el caso donde se usa ensayo electroqufmico, los materiales nanoporosos, puede no ser necesario eliminar perlas 15 para ensayos electroqufmicos dado que las marcas redox adsorbidas tendran una difusividad reducida drasticamente y por lo tanto, la senal que aportan a voltametrfa se reducira proporcionalmente.

Otro ejemplo mas incluye insercion de sondas ss marcadas en cadenas triples (donde se espera que la cadena triple no se adsorba).

20

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invencion. No pretenden ser limitantes de ninguna manera.

EJEMPLO 1

25

Ejemplo de material nanoporoso funcionalizado de forma diferencial preparado mediante union covalente de funcionalizacion de no-poro.

Sflice mesoporosa, sflice de grado de cromatograffa, Merck 9385, es un ejemplo de sustrato adecuado para uso en 30 la invencion. Esta sflice es normalmente esferica, con un diametro de 40-60 micrometros, tamano de poro de 60 A y un area superficial BET de 480-540 m2/g. Los nanoporos y la superficie pueden funcionalizarse con grupos amina mediante injerto con APTMS. Para este ejemplo, APTMS (Fluka), 0,5 ml, se anadio a 25 ml de EtOH y la solucion se agito durante 5 minutos en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Se anadio gel de sflice Merck 9385, 1 g, a la solucion, y la suspension se calento a reflujo durante 1 hora. La suspension se transfirio a un vaso de precipitados 35 de 100 ml y la solucion de decanto. La sflice se lavo con 200 ml de agua caliente en 8 alfcuotas, agitando y decantando. Finalmente, la sflice se lavo con 25 ml de agua a temperatura ambiente, y se seco en un horno a 110°C durante 30 minutos. Se cree que este procedimiento da como resultado funcionalizacion con APTMS en todas las superficies de sflice hidroxiladas, internas y externas.

40 La superficie de partfculas de sflice, excepto los nanoporos, se funcionalizo a continuacion con carboxilato mediante la introduccion de sal sodica del acido poliacrflico (PAA), que se autoensambla solamente en la superficie de partfcula, dado que es demasiado grande para entrar en los poros. Evidencia de esto es proporcionada tanto por ensayos funcionales como por datos de espectroscopfa FTIR presentados a continuacion. La sal sodica del acido poliacrflico, PM 100.000 (Aldrich) se anadio a las superficies externas de la siguiente manera. Gel funcionalizado con 45 APTMS, 0,5 g, se anadio a 10 ml de solucion de pAa (0,01 M en PAA, 0,1 M en NaCl). La suspension se mezclo en un agitador Rocker durante 20 minutos. El gel se lavo mediante centrifugado y decantacion sucesivas tres veces con 10 ml de agua cada vez, seguido por un lavado final con 10 ml de EtOH. El gel se seco en un horno a 110°C durante 10 minutos.

50 1. Verificacion de la qufmica superficial

Se uso espectroscopfa infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) como estrategia analftica debido a su sencillez, amplia disponibilidad y capacidad para proporcionar informacion molecularmente especffica. En la medida en que se conocen secciones transversales de absorcion en modo infrarrojo, tambien se puede calcular la cobertura superficial 55 aproximada de diversas fracciones. La figura 2 presenta los espectros de FTIR de las perlas de sflice porosa no tratadas y tratadas con APTMS. En cada caso, las perlas se dispersan en un sedimento de KBr cuya transmision se mide con un espectrometro 8400 FTIR de Shimadzu.

La asignacion de las bandas espectrales usando espectro de APTMS puro es sencilla. La amplia absorcion en perlas 60 no tratadas cerca de 3400 cm-1 es debida a grupos OH superficiales unidos a hidrogeno, mientras que la absorcion a 1635 cm-1 procede del pliegue de OH unido a silano y la banda de 1100 - 1200 cm-1 (no mostrada) procede de las

vibraciones de tension de Si-O en la masa. Esta ultima banda sirve como una excelente referencia para corregir la cantidad total de material. La banda cerca de 2300 cm-1 es debida a CO2 en la atmosfera sin corregir mediante sustraccion del fondo, dado que la calidad de la purga del espectrometro varfa con el tiempo. La qufmica de union por silanizacion elimina una parte sustancial de la intensidad de la banda de OH y mientras aparecen nuevas bandas 5 transparentes en la region de tension de CH2 asociadas con APTMS. La supresion sustancial de la tension de OH no solamente indica union eficaz de APTMS a la superficie tratada, sino que tambien prueba que el APTMS se infiltra eficazmente en los poros. Dado que la gran mayorfa del area superficial total esta en los poros (solo aproximadamente el 0,2% del area superficial total esta en el exterior), la reduccion sustancial de OH superficial significa que mucha de la superficie ha sido modificada qufmicamente. Una grosera estimacion de la cantidad de 10 APTMS adsorbido puede obtenerse a partir de la intensidad de la absorcion por tension de CH2 y es coherente con una cobertura sustancia (> 10 %) del area superficial total de la perla. La pequena cantidad de serial de PAA es atribuible al hecho de que su gran peso molecular le impide entrar en los poros y adsorberse sobre la gran mayorfa del area superficial de las perlas. Se sabe que el PAA esta presente a partir del hecho de que las perlas tratadas con solamente APTMS eliminan eficazmente amplicones de ADN de la solucion.

15

Se uso espectroscopfa infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) como estrategia analftica debido a su sencillez, amplia disponibilidad y capacidad para proporcionar informacion molecularmente especffica. En la medida en que se conocen secciones transversales de absorcion en modo infrarrojo, tambien se puede calcular la cobertura superficial aproximada de diversas fracciones. La qufmica de union por silanizacion elimina una parte sustancial de la 20 intensidad de banda de OH y aparecen nuevas bandas transparentes blancas en la region de tension de CH2 asociadas con APTMS. La supresion sustancial de la tension de OH no solamente indica union eficaz de APTMS a la superficie tratada, sino que tambien prueba que el APTMS se infiltra eficazmente en los poros. Dado que la gran mayorfa del area superficial total esta en los poros (solamente aproximadamente el 0,2% del area superficial total esta en el exterior), la reduccion sustancial de OH superficial significa que mucha de la superficie ha sido modificada 25 qufmicamente. Una grosera estimacion de la cantidad de APTMS adsorbido puede obtenerse a partir de la intensidad de la absorcion por tension de CH2 y es coherente con una cobertura sustancia (> 10%) del area superficial total de la perla. El instrumento de FTlR no es suficientemente sensible para ver sobrecapas de PAA en las partfculas pero se ha verificado su deposito independientemente usando microscopfa confocal con PAA modificado fluorescentemente. En ese caso, es posible determinar que la adsorcion de PAA es casi exclusivamente 30 sobre los exteriores de las partfculas dado que se pueden obtener imagenes usando una profundidad de campos (~1 micrometro) mucho menores que los tamanos de partfcula (~50 micrometres).

2. Eficacia de limpieza

35 a. Rendimiento de componentes de solucion de PCR

Se realizaron estudios iniciales para determinar la eficacia de las perlas para eliminar los diversos componentes de la solucion de productos de PCR usando un espectrometro de absorcion NanoDrop 1000. Los datos del NanoDrop proporcionan informacion cuantitativa sobre la cantidad de interaccion entre los componentes de solucion de PCR 40 individuales y las perlas funcionalizadas. Se midio la cantidad de amplicones de PCR purificados, ssADN (TAATACGACTCACTATAGGG; SEQ ID NO: 1), ssADN autocomplementario hibridado

(ATCGTCCTGCAGGACGAT; SEQ ID NO: 2) y cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) retenido en solucion despues de exposicion de ~30 segundos a las perlas funcionalizadas de forma diferencial descritas anteriormente. Los amplicones de PCR eran bandas de 530 pb, 1063 pb y 1956 pb de un patron de ADN lambda de New England 45 Biolabs (NEB) (NEB N3011S) amplificadas usando los cebadores disenados 11F (TGA AAC GCT TGC TGC AAC GCC AAA; SEQ ID NO: 3) y 15R (AAA GCA ATT GGC GGT GAT GTA AAC ACT ATG; SEQ ID NO: 4) con reactivos y condiciones de reaccion a partir de NEB (E5100S), una temperatura de hibridacion de 60°C, un tiempo de extension de 2,5 minutos y 25 ciclos. Los amplicones se recuperaron de la solucion usando el kit de purificacion de PRC PureLink de Invitrogen (K3100-01). Se uso absorbancia en la region de 260 nm como medida de concentracion 50 relativa antes y despues de la exposicion a las perlas. En cada caso, los analitos mencionados anteriormente se disolvieron en un tampon Tris 20 mM (pH 8,4) con K+ 50 mM y Mg2+ 2 mM constituido para simular la solucion tampon de PCR de Invitrogen y las concentraciones de analito estaban en las inmediaciones de lo que podrfa esperarse del producto de PCR (el cebador era 10 veces la concentracion tfpica, el dNTP era 0,2 veces el tfpico y los amplicones eran los tfpicos para PCR). La idea detras de evaluar ADN Lambda y amplicones purificados antes y 55 despues de la exposicion a las perlas era poner a prueba la retencion de dsADN en solucion. Las secuencias de ssADN sinteticas pretendfan simular cebadores mientras que las secuencias autocomplementarias simulan dfmeros de cebadores fortuitos. Se definen estos ultimos como cebadores que complementan partes de sf mismos o del otro cebador de modo que podrfan formar cadenas dobles parciales a 25°C.

60 La figura 3 muestra “curvas de dosificacion” tanto para dNTP, cebador, y dsADN (amplicones de PCR purificados de 1956 pb). Estos cuantifican la cantidad de material que queda despues de exposicion de 30 segundos a diversos

numeros de perlas. Soluciones puras (25 pi) de cada uno se mezclaron con las perlas durante 30 segundos y, despues de una etapa de centrifugado para separar las perlas, se muestreo una alfcuota del sobrenadante usando un espectrometro NanoDrop que registro espectros en el intervalo espectral de 240 - 280 nm. Las concentraciones iniciales del cebador, dNTP y amplicones eran ~3,5 pM, 170 pM y 0,02 pM (23, 56, 14 ng/pl) respectivamente.

5

Aproximadamente 2 mg de perlas son adecuados para eliminar ~90% del dNTP o los cebadores a concentraciones y cantidades tfpicas de soluciones de producto de PCR. Incluso aunque los cebadores (normalmente 20 bases) son mucho mas grandes que dNTP, las demandas de area superficial del dNTP son mucho mayores, dado que las concentraciones de dNTP son de cerca de 1 mM mientras que las concentraciones de cebador son como maximo 1 10 pM. Las perlas deben ser, por lo tanto, capaces de acomodar hasta ~ 25 nmoles de dNTP (~ 1,5 x 1014 moleculas). Una cantidad de 2 mg de perlas porta ~104 cm2 de area superficial. Si la cobertura del area de APTMS es ~10%, tal como se ha estimado anteriormente, el resultado de la figura 3 puede conseguirse incluso si solamente cada centesimo sitio de APTMS adsorbe una unica molecula de dNTP.

15 Las mediciones de la retencion del amplicon muestran que las soluciones despues de la exposicion a las perlas son ligeramente mas concentradas que antes del tratamiento. La razon para esto es que los poros retienen parte del agua, mientras que no permiten penetrar a los amplicones. Esto da como resultado una concentracion eficaz de los amplicones. La retencion total del amplicon puede cuantificarse de al menos dos maneras. En primer lugar, se puede medir la cantidad de agua retenida y corregir la concentracion indicada por la medicion del NanoDrop (o, como 20 alternativa, recuperar tanta agua como sea posible y rediluirla con tampon al volumen original de 25 pl). En segundo lugar, se pueden usar simplemente volumenes de analito mas grandes, de modo que la cantidad de retencion de agua se vuelva menos importante. Usando cualquier estrategia, se concluye que la recuperacion de los amplicones de 1956 pares de bases es del 85 +/- 5% (donde la incertidumbre citada se deriva de la desviacion estandar de multiples experimentos). Por lo tanto, elegir una cantidad de perlas de 2 mg para limpieza de 25 pl de reacciones de 25 PCR debe dar un excelente rechazo de dNTP y cebadores y retencion de amplicones. Esta cantidad representa una pequena fraccion del volumen de la solucion a limpiar.

La Figura 4a presenta los datos en bruto de experimentos donde los diversos componentes de dNTP, cebadores y amplicones se exponen a 2 mg de las perlas funcionalizadas con APTMS/PAA. En cada caso, se usaron 2 mg de 30 perlas y tiempos de exposicion de 30 segundos. Los tubos se centrifugaron (10.000 x g, 10 segundos) para sedimentar el material y la concentracion de sobrenadante se midio inmediatamente en el NanoDrop1000. La Figura 4b resume, la fraccion retenida que se deriva a partir de estos datos y la compara con lo que se obtuvo usando un kit de purificacion de PCR de Invitrogen. 15 pl de solucion de partida se mezclaron con 2 mg de perlas durante 30 segundos y se muestrearon como en la figura 4a. Soluciones analogas se trataron con el kit de purificacion de PCR 35 PureLink de Invitrogen (K3100-01) (“columna de centrifugado”); la ds (1956 pb) se incrementa con perlas no funcionalizadas debido a la retencion de agua por las perlas. Notese que tambien se puso a prueba polimerasa pura en tampon simulado de manera similar y se observo eliminacion completa mediante las perlas funcionalizadas. Es probable que restos positivos en la enzima se adhieran fuertemente al revestimiento exterior de PAA.

40 Se analizo la cinetica de adsorcion para determinar durante cuanto tiempo se deberfa incubar el producto de PCR con las perlas antes de eliminarlo. 25 pl de solucion de dNTP o amplicon se aspiraron en una punta de pipeta que contenfa 3,5 mg de material (no funcionalizado, rombos y triangulos o funcionalizado, cuadrados y cfrculos), se mezclaron y se disperso 1 gota sobre el espectrometro NanoDrop a los tiempos indicados. Para esta medicion, se empleo un formato de pipeta donde se aspiro y se expulso material. La figura 5 muestra que, en esta realizacion 45 particular, los tiempos optimos estan entre 30 y 45 segundos donde > 90% del dNTP ha sido eliminado y > 80% de los amplicones permanecen. Esta ventana es satisfactoria para establecer un protocolo robusto pero, basandose en los resultados presentados en el presente documento, se espera que la optimizacion adicional del protocolo de manipulacion de materiales y de fluido conseguira una eliminacion de impurezas mas rapida y estabilizara adicionalmente los amplicones para que permanezcan en solucion indefinidamente.

50

b. Rendimiento para producto de PCR

Las pruebas en la seccion anterior tienen la ventaja del rigor, dado que se trabajo con dNTP, cebadores y amplicones independientemente. Por lo tanto, no habfa ninguna ambiguedad aparente en la interpretacion de la 55 absorbancia de Uv incluso aunque los tres componentes adsorban en la region entre 240 y 280 nm. No obstante, se analizo un producto de PCR fiable y sus complejidades concomitantes. Para analizar cada componente independientemente, se separaron por masa con electroforesis en gel (Figura 6). La PCR se ejecuto como anteriormente excepto que tres segmentos de longitud diferente de ADN Lambda (590 pb, 1063 pb y 1956 pb) se amplificaron a partir de un patron lambda (NEB N2011S) usando tres conjuntos de cebadores.

Todo el ADN usado en las limpiezas y controles procedfa de los mismos tubos de PCR y 5 microlitros se hicieron pasar sobre el gel. Los carriles de partida incluyen muestra sin alterar para comparacion. 15 pl de solucion de ADN se mezclaron en tubos que contenfan 2 mg de perlas no funcionalizadas o funcionalizadas durante 15 segundos y una alfcuota de 5 microlitros para su analisis en gel se extrajo despues del centrifugado como se muestra en la 5 Figura 4. Para el control de la columna de centrifugado, 50 microlitros de cada reaccion se trataron con el kit de purificacion de PCR PureLink de Invitrogen (K3100-01) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (con la adicion de un centrifugado extra para eliminar tampon de lavado residual) y se eluyeron en un volumen de 50 microlitros; 5 microlitros se hicieron pasar sobre un gel de poliacrilamida al 5%. Se tuvo cuidado de garantizar que volumenes iguales se cargaran en cada carril. Sin embargo, los carriles indicados mediante “f” en la parte inferior 10 tienen concentraciones reducidas debido a muestras flotantes causadas de la forma mas probable mediante etanol residual a partir de la purificacion en columna de centrifugado. El etanol residual persistfa a pesar de 3 centrifugados para eliminar tampon de lavado (el protocolo requiere 2 centrifugados) y una corta incubacion a 100 grados C. La flecha continua apunta a las bandas de cebador monocatenario (~20 pb) mientras que la flecha doble indica el area donde se encuentran los amplicones bicatenarios (590, 1063 o 1956 pb).

15

Cualitativamente, los resultados en la Figura 6 confirman esencialmente los resultados de la Figura 4, concretamente retencion eficaz de ADN y rechazo de cebadores, comparable a la que se consiguio con el tratamiento en columna de centrifugado comercial. Es notable que, en la Figura 6, el tratamiento del marcador estandar de bajo peso molecular con el procedimiento de los inventores parece dar una sustancialmente mejor retencion de ADN en el 20 intervalo de peso molecular menor de 500 pb. Aunque la mayorfa de la amplificacion por PCR para secuenciacion implica amplicones mas largos, esto sugiere, no obstante, un area potencial de ventaja de rendimiento diferencial para la presente invencion.

3. Secuenciacion despues de la limpieza 25

La aplicacion mas amplia para la limpieza de reacciones de PCR es el uso de los amplicones para secuenciacion capilar, y para este fin la eliminacion eficiente de cebadores y dNTP es crftica. Se ha puesto a prueba la presente invencion usando exposicion a perlas porosas funcionalizadas de forma diferencial durante 45 segundos y se preparo la muestra recuperada para secuenciacion anadiendo 8 pmol del cebador de secuenciacion Lambda16seq 30 (GCCAAAGGCGGTTAAGGTGGTAAT; SEQ ID NO: 5) a 10 ng/pl por 100 pb de amplicon patron. Estas muestras se enviaron al Functional Genomics Center (FGC) en el University of Rochester Medical Center sin procesamiento adicional. En casos donde se compararon nuestros resultados frente a kits de limpieza comerciales u otros controles, las muestras se enviaron marcadas de tal manera que se cree que no se podrfan introducir sesgos en el personal de secuenciacion. Los protocolos estandar estan disponibles en la pagina web del FGC y conllevan secuenciacion en 35 un secuenciador 3700 Prism de Applied Biosystems usando qufmica de marcado con Big Dye® estandar. Los resultados de los inventores demuestran que la eficacia (desde el punto de vista de calidad de la secuencia) de la limpieza usando las perlas porosas funcionalizadas de forma diferencial es similar a aquella usando protocolos con columna de centrifugado comercial, segun lo determinado a partir de un cromatograma generado a partir del centro aproximado de una secuencia de 1956 pb. El cromatograma mostraba una mejora de la calidad de los picos entre 40 muestras no purificadas y purificadas, tal como se mostraba mediante una fidelidad de base incrementada y una proporcion de senal con respecto a ruido mejorada. Se observaron resultados similares en mas de 5 experimentos. Para caracterizar adicionalmente la calidad del dsADN obtenido usando el procedimiento de la invencion, se seleccionaron dos medidas de secuenciacion estandar, longitud de lectura contigua (CRL) y valor de calidad superior a 20 (QV20). QV20 es el numero total de bases en toda la pista de secuenciacion que tienen valores de calidad de 45 lector de nucleotidos (basecaller) mayores o iguales que 20, aquellos que se considera que tienen una probabilidad de error de asignacion de menos del 1%. CRL es el tramo de bases mas largo ininterrumpido con QV mayor que un lfmite especificado, en este caso 20. En la evaluacion de la calidad de cada base, no solamente es el valor de calidad de esa base usado, sino tambien aquellos de bases adyacentes dentro de un tamano de ventana especificado. Resultados representativos de ensayos usando estas medidas se muestran en la Tabla 1. Al realizar 50 los experimentos indicados en la Tabla 1, se ha usado deliberadamente una muestra de producto de PCR “sucia” (es decir, una muestra nominalmente identica sin limpieza) donde se descubre que la calidad de secuenciacion es muy mala en ausencia de limpieza para incrementar la astringencia de nuestras pruebas. Se obtienen excelentes resultados de secuenciacion con el procedimiento de limpieza de los inventores.

55 Tabla 1. Medida de calidad de secuencia para tres series de PCR donde se emplearon diferentes protocolos de limpieza. Para los ensayos I y II, el tratamiento de perlas porosas usa el protocolo de la Figura 4 mientras que el ensayo III usa un formato de pipeteador.

APTMS/PAA APTMS/PAA APTMS/PAA

Ensayo I (pre-prototipo) Ensayo II (pre-prototipo) Ensayo III (prototipo)

CRL QV20 CRL QV20 CRL QV20

Sin limpieza

921 865 51 194 840 843

Columna de

962 978 995 994 960 971

centrifugado (competidor I) Tratado con

919 989 884 933 935 932

perlas porosas

EJEMPLO 2

5

Preparacion y uso de ejemplos de materiales nanoporosos funcionalizados de forma diferencial preparados usando ensamblaje electrostatico del revestimiento de no-poro.

Sfntesis y preparacion de materiales nanoporosos.

10

Ejemplo 1. Gel de sflice 3-aminopropilsililado. Con agitacion mecanica suave, gel de sflice Davisil (25 g, poro de 150 Angstrom, 60-200 micrometros de tamano de partfcula) se suspendio en tolueno anhidro (200 ml) en una atmosfera de nitrogeno. A esto se le anadio 3-aminopropiltrietoxisilano (12,5 ml, 53,59 mM) y la mezcla se calento a reflujo. Despues de 6 horas, la mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se filtro. El gel de sflice 3-aminopropilsililado 15 resultante se lavo a continuacion con tolueno anhidro (2x100 ml), diclorometano anhidro (2x100 ml) y se seco al aire. Este material se seco finalmente a peso constante en un horno a 60°C durante 12 horas. Rendimiento 27,5 g.

El matl-1 Acido poliacrflico-gel de sflice 3-aminopropilsililado, Pm 100K. Cloruro sodico (1,5 g, 25,7 mM), acido 4- morfolinoetanesulfonico x-hidratado (2,44 g) y acido poliacrflico acuoso al 35%, Pm=100K, (50 mg) se disolvieron en 20 agua (200 ml), se ajustaron a pH 7,0 con hidroxido de potasio 1 N y finalmente se enrasaron a 250 ml con agua. A la solucion preparada anteriormente (200 ml) con agitacion mecanica suave, se le anadio gel de sflice 3- aminopropilsililado (2 g). El pH del sobrenadante se monitorizo de forma constante y se elevo a aproximadamente 9,0 durante un periodo de 1 hora. (Si fuera necesario, el pH del sobrenadante puede ajustarse a 9,0 mediante la adicion de pequenas cantidades de hidroxido de potasio o acido clorhfdrico diluidos.) Despues de agitar durante 1 25 hora, el acido poliacrflico-gel de sflice 3-aminopropilsililado se retiro por filtracion, se lavo con etanol (30 ml), se seco al aire y finalmente se seco en un horno a 60°C durante 1 hora. Rendimiento 1,8 g.

Ejemplo 2. Matl-2 acido poliacrflico-gel de sflice 3-aminopropilsililado, Pm 450K. Una solucion acuosa (250 ml) que contiene cloruro sodico (1,5 g, 25,7 mM), acido 4-morfolinoetanosulfonico x-hidratado (2,44 g) y acido poliacrflico, Pm 30 450K (35 mg) se preparo y se ajusto a pH 7,0 con hidroxido de potasio 1 N. En un procedimiento identico al descrito en el ejemplo de sfntesis tambien se preparo acido poliacrflico-gel de sflice 1,3-aminopropilsililado, Pm 450K. Rendimiento 1,8 g.

Ejemplo 3. Matl-3 acido poliacrilamida-co-acrflico-gel de sflice 3-aminopropilsililado. Una solucion acuosa (250 ml) 35 que contenfa cloruro sodico (1,5 g, 25,7 mM), acido 4-morfolinoetanosulfonico x-hidratado (2,44 g) y acido poliacrilamida-co-acrflico 20:80) (35mg) se preparo y se ajusto a pH 7,0 con hidroxido de 1 N. En un procedimiento identico al descrito en el ejemplo de sfntesis tambien se preparo acido poliacrilamida-co-acrflico-gel de sflice 1,3- aminopropilsililado. Rendimiento 1,8 g.

40 Pruebas.

Analisis de mezclas de compuestos biologicos y qufmicos a menudo requieren la separacion y el aislamiento de sus componentes individuales. Por ejemplo, el analisis y el aislamiento del amplicon de ADN bicatenario recien formado (dsADN) en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de los reactivos de PCR y subproductos no 45 deseados. Estos reactivos y subproductos no deseados son normalmente 2'-desoxinucleosido 5'-trifosfatos (dNTP), cebadores (cadenas de acidos nucleicos que sirven como puntos de partida para la replicacion de ADN) y sus derivados.

Los materiales de la invencion se pusieron a prueba por su capacidad para eliminar los cuatro dNTP asociados con 50 la amplificacion de ADN, es decir 2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (dATP), 2'-desoxicitidina 5'-trifosfato (dCTP), 2'-

desoxiguanosina 5'-trifosfato (dGTP) y 2'-timidina 5 '-trifosfato (dTTP). Una mezcla 10 mM de los cuatro nucleotidos puede adquirirse de Invitrogen, numero de catalogo 18427-088. Esta mezcla de dNTP se diluyo a 1:250 para dar una solucion con una concentracion final de ~150 pM, util para poner a prueba la capacidad de los materiales de la invencion para eliminar los cuatro nucleotidos de la reaccion de PCR. Habitualmente existe cierta variabilidad en la 5 dilucion de estas soluciones debido a errores de pipeteo pero normalmente las concentraciones de NanoDrop son de 50-100 ng/pl, alrededor de 5 veces por debajo de una concentracion de partida tfpica para dNTP en una reaccion de PCR. Debe observarse que el termino Nano-Drop se usa junto con el espectrometro NanoDrop 1000, que es un instrumento analftico usado para medir la absorbancia de volumenes muy pequenos de soluciones, normalmente 2,5 pl o menos y, por lo tanto, la concentracion de componentes en las soluciones. El espectrometro NanoDrop esta 10 disponible para adquisicion de Thermo Scientific.

Para poner a prueba la capacidad de los materiales de la invencion para eliminar cebadores o ADN monocatenario (ssADN) y sus derivados de la reaccion de PCR, se empleo el cebador de secuencia T7 estandar. Este es un cebador de 20 pares de bases (pb) con la secuencia TaA TAC GAC TCA CTA TAG GG (SEQ ID NO: 6). Esta 15 disponible de Integrated DNA Technologies y se emplearon soluciones de prueba de ~20 ng/pl, que es aproximadamente 5 veces una concentracion de PCR de partida tfpica.

La capacidad de los materiales de la invencion para dejar el amplicon de dsADN intacto y, de este modo, separarlo de los otros componentes se puso a prueba usando Lambda-ADN. Lambda es un bacteriofago con un genoma 20 bicatenario lineal de 48 Kb. Este se usa ampliamente como ADN genomico de partida en biologfa molecular. Invitrogen, numero de catalogo 15612-013 (Lambda/Hindlll), es el lambda-ADN genomico digerido por la enzima de restriccion HindIII en pedazos que varfan entre 500-23000 pb. Lambda/Hindlll se adquiere como una solucion de partida de 500 ng/pl que a continuacion se diluye a ~30 ng/pl para pruebas en Nano-Drop. A 10-50 ng/pl, esta es la concentracion de amplicon de PCR tfpica.

25

Para poner a prueba la eficacia de los materiales de la invencion, una muestra de 2,5 mg se mezclo con 25 pl de cada uno de las soluciones de dNTP, ssADN o dsADN descritas anteriormente. La suspension se agito durante 30 segundos, se centrifugo brevemente y se elimino una alfcuota de 2,5 pl y su absorbancia se registro en el espectrofotometro NanoDrop. Para tener en cuenta variaciones en las lecturas, se llevaron a cabo varias pruebas 30 para cada una de las pruebas de dNTP, ssADN y dsADN y se calculo un promedio. Conociendo la absorbancia y la concentracion de las soluciones de partida iniciales de dNTP, ssADN y dsADN, puede determinarse la cantidad de dNTP, ssADN y dsADN que queda en las soluciones de prueba que contienen los materiales de la invencion.

Para mostrar la eficacia de la invencion, materiales de comparacion Comp-1 y Comp-2 que estan fuera del alcance 35 de la invencion, se prepararon y se pusieron a prueba. Comp-1 es gel de sflice que es identico en todos los aspectos al gel de sflice usado en la preparacion de materiales de la invencion, excepto que no ha sido funcionalizado con amino, sino que, como Matl-1, ha sido expuesto a 100K de acido poliacrflico. Comp-2, similar a la invencion, es gel de sflice que ha sido funcionalizado con amino tal como se ha descrito previamente pero, a diferencia de la invencion, no ha sido tratado con acido poliacrflico.

40

A partir de la Tabla 1 puede verse que, aunque Comp-1 no elimina dsADN de la solucion de prueba, tambien es ineficaz para eliminar dNTP y ssADN. Por otro lado, Comp-2 elimina todos los compuestos puestos a prueba. Ni Comp-1 ni Comp-2 son utiles, dado que ninguno muestra selectividad alguna para eliminar el dNTP, ssADN o dsADN de la solucion. Sin embargo, los materiales de la invencion Matl-1, Matl-2 y Matl-3 que se prepararon de 45 acuerdo con la descripcion de la invencion y estan tanto funcionalizados adecuadamente como tratados con un polfmero adecuado son muy eficaces para eliminar dNTP y ssADN mientras dejan el dsADN en la solucion.

Tabla 1: eficacia de materiales de la invencion.

% que queda en solucion

Eiemplo

Material dNTP ssADN dsADN

1 (invencion)

Comp-1 104* 99 100

2 (invencion)

Comp-2 7 7 5

3 (invencion)

Matl-1 2 9 106*

4 (invencion)

Matl-2 5 8 97

5 (invencion)

Matl-3 7 9 101*

*esta dentro del error experimental 50

1. Rendimiento de componentes de solucion de PCR

Se realizaron estudios iniciales para determinar la eficacia de las perlas para eliminar los diversos componentes de

solucion de producto de PCR usando un espectrometro de absorcion NanoDrop 1000. Los datos de NanoDrop proporcionan informacion cuantitativa sobre la cantidad de interaccion entre los componentes de la solucion de PCR individuales y las perlas funcionalizadas. Se midio la cantidad de amplicones de PCR purificados, ssADN (TAATACGACTCACTATAGGG), ssADN autocomplementario hibridado (ATCGTCCTGCAGGACGAT) y cada dNTP 5 (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) retenido en solucion despues de exposicion de ~30 segundos a las perlas funcionalizadas de forma diferencial descritas anteriormente. Las cadenas dobles estaban representadas por el patron de ADN (NEB N3011S) de New England Bio labs (NEB). Se uso absorbancia en la region de 260 nm como medida de la concentracion relativa antes y despues de la exposicion a las perlas. En cada caso, los analitos mencionados anteriormente se disolvieron en un tampon Tris 20 mM (pH 8,4) con K+ 50 mM y Mg2+ 2 mM 10 constituidos para simular la solucion tampon de PCR de Invitrogen y las concentraciones de analito estaban en las inmediaciones de lo que podrfa esperarse del producto de PCR (el cebador era 10 veces la concentracion tfpica, el dNTP era 0,2 veces el tfpico y los amplicones eran los tfpicos para PCR). La idea detras de evaluar ADN Lambda y amplicones purificados antes y despues de la exposicion a las perlas era poner a prueba la retencion de dsADN en solucion. Las secuencias de ssADN sinteticas pretendfan simular cebadores mientras que las secuencias 15 autocomplementarias simulan dfmeros de cebadores fortuitos. Se definen estos ultimos como cebadores que complementan partes de si mismos o del otro cebador de modo que podrfan formar cadenas dobles parciales a 25°C.

Las cantidades de perlas usadas eran las mismas que para el ejemplo 1, 2,5 mg por 25 microlitros de solucion de 20 prueba.

La Figura 7(a) ilustra la retencion del cebador modelo, mezcla de dNTP y dsADN Lambda demostrando excelente eliminacion de dNTP y ADN monocatenario y casi completa retencion de la diana ds. Soluciones similares se trataron con el kit de purificacion de PCR PureLink de Invitrogen (K3100-01) (“columna de centrifugado”) y el analogo 25 Wizard de Promega, mostrandose los datos en la figura.

La Figura 7(b) es una comparacion entre el producto de PCR antes y despues de la limpieza usando los materiales nanoporosos funcionalizados de la presente invencion, que demuestran buen rendimiento de ADN independientemente de la longitud.

30

Los datos de cinetica de adsorcion para las partfculas preparadas mediante autoensamblaje electrostatico se muestran en la Figura 8. Para esta medicion, se uso el formato de pipeta donde se aspira y se expulsa material, dado que esto serfa mas representativo de como se preve que los clientes usen el producto pretendido. La Figura 8 presenta la cinetica de eliminacion de dNTP y dsADN de la solucion usando tratamientos mediante perlas porosas 35 funcionalizadas con APTMS/PAA. 25 pl de solucion de amplicon de dNTP o ADN se aspiraron en una punta de pipeta que contenfa 3,5 mg de material (no funcionalizado, rombos y triangulos o funcionalizado, cuadrados y cfrculos), se mezclaron, y se dispenso 1 gota sobre el espectrometro NanoDrop a los tiempos indicados. Los datos muestran que los tiempos optimos estan entre 30 y 45 segundos donde > 95% del dNTP ha sido eliminado y > 95% de los amplicones permanecen. Los amplicones permanecen en solucion durante al menos 10 minutos.

40

2. Secuenciacion despues de la limpieza

La aplicacion mas amplia para limpieza de reacciones de PCR es el uso de los amplicones para secuenciacion por capilaridad. Tal como se explica en la seccion sobre necesidad del mercado, la eliminacion eficiente de cebadores y 45 dNTP es crftica. Resultados de secuenciacion analogos a los mostrados para los materiales unidos covalentemente (vease el Ejemplo 1) se muestran en la Figura 9.

EJEMPLO 3

50 Este ejemplo demuestra la eliminacion de la enzima TAQ polimerasa de soluciones de PCR usando perlas con revestimiento hidrofobo (materiales nanoporosos).

El protocolo usado es el siguiente. En una preparacion tfpica, 0,5 ml de octadeciltriclorosilano (OTS, SIO6640.0, Gelest, Morrissville, PA) se anadieron a 25 ml de EtOH (200% en volumen) y se dejaron agitar durante 5 minutos en 55 un matraz de fondo redondo de 50 ml. Se anadio gel de sflice 60 (0,5 g de Merck 9385 o SiliaFlash 60, por ejemplo) al matraz, y la mezcla se calento a reflujo durante 0,5 horas. El gel se lavo cuatro veces con EtOH en ebullicion y se seco en un horno durante diez minutos a 110°C.

Solucion de partida de TAQ (25 microlitros) (dilucion 1:10) se trato con material nanoporoso (2,5 mg) funcionalizado 60 con OTS en replicas de 2 cada una. Diluciones de TAQ conocidas se midieron usando absorbancia a 280 nm para crear una curva patron, que se uso para calcular diluciones desconocidas despues del tratamiento.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para separar acidos nucleicos bicatenarios a partir de una mezcla que comprende 5 acidos nucleicos bicatenarios, acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres en una solucion acuosa que

   comprende las etapas de:

   a) poner en contacto a la mezcla con un material nanoporoso funcionalizado de forma espacialmente no homogenea,

   10

   donde la superficie del material nanoporoso comprende superficie de poro y superficie de no-poro y donde la superficie de poro se funcionaliza con una amina primaria para adsorber dNTP, cebadores y cadenas sencillas y la superficie de no-poro se funcionaliza con compuestos cargados negativamente seleccionados de entre el grupo que consiste en compuestos anionicos, compuestos polianionicos, polielectrolitos y combinaciones de los mismos, y/o 15 compuestos hidrofobos y/o compuestos resistentes a la adsorcion que son resistentes a la adsorcion de acido nucleico bicatenario y donde el material nanoporoso tiene poros de aproximadamente 2 a 300 nm;

   b) incubar la solucion acuosa y el material nanoporoso de a) en condiciones tales que los acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres se adsorban selectivamente a la superficie de poro; y

   20

   c) aislar el material nanoporoso a partir de la solucion acuosa separando de este modo los acidos nucleicos bicatenarios de los acidos nucleicos monocatenarios y/o de los nucleotidos libres,

   donde la solucion acuosa se incuba con el material nanoporoso durante de 5 a 60 segundos.

   25
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el material nanoporoso es sflice porosa, alumina porosa, oxido de titanio poroso o zeolita.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la superficie de poro se funcionaliza con un 30 aminosilano.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la superficie de poro se funcionaliza con aminopropiltrimetoxisiloxano y donde la superficie de no-poro se funcionaliza con polielectrolitos seleccionados de entre el grupo que consiste en sal sodica del acido poliacrflico y sulfonato de poliestireno y/o el compuesto resistente

   35 a la adsorcion polietilenglicol.
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la superficie de no-poro se funcionaliza con compuestos hidrofobos seleccionados de entre el grupo que consiste en octadeciltriclorosilano, poli(tetrafluoroetileno), n- butiltrimetoxisilano, ciclooctiltriclorosilano, fenoxipropiltriclorosilano, nonafluorohexiltrimetoxisilano y combinaciones

   40 de los mismos.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la superficie de no-poro se funcionaliza con copolfmeros de PAA por ejemplo donde el copolfmero es hidrofobo tal como polietileno o poliestireno.

   45 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el material nanoporoso se afsla de la solucion acuosa

   mediante centrifugado, magneticamente o por filtracion.
7. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la solucion acuosa se incuba con el material nanoporoso durante de 30 a 45 segundos.

   50
8. 9. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el acido nucleico bicatenario es ADN.
9. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la mezcla comprende ademas enzimas, y donde la

   superficie de no-poro se funcionaliza con compuestos cargados negativamente y compuestos hidrofobos.

   55
10. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde la mezcla comprende ademas enzimas, y donde la

    solucion acuosa y un primer material nanoporoso tal como se define en la etapa a) de la reivindicacion 1 y un

    segundo material nanoporoso funcionalizado con grupos de la superficie de no-poro hidrofobos se incuban en condiciones tales que los acidos nucleicos monocatenarios y/o nucleotidos libres se adsorben selectivamente a la

    60 superficie de poro del primer material nanoporoso y las enzimas se adsorben sobre la superficie de no-poro hidrofoba del segundo material nanoporoso, y donde cuando el primer material nanoporoso y el segundo material

    nanoporoso se separan de la solucion acuosa de modo que los acidos nucleicos bicatenarios se separen de las enzimas.
11. 12. Una composicion que comprende un material nanoporoso funcionalizado de forma no homogenea, 5 donde la superficie del material nanoporoso funcionalizado de forma no homogenea comprende superficie de poro y

    superficie de no-poro, donde la superficie de poro tiene grupos superficiales de amina primaria y la superficie de no- poro se funcionaliza con compuestos cargados negativamente seleccionados de entre el grupo que consiste en compuestos anionicos, compuestos polianionicos, polielectrolitos y combinaciones de los mismos, y/o compuestos hidrofobos y/o compuestos resistentes a la adsorcion que son resistentes a la adsorcion de acido nucleico 10 bicatenario, donde el material nanoporoso tiene poros de 2 a 300 nm de diametro.
12. 13. La composicion de la reivindicacion 12, donde el material nanoporoso es sflice porosa, alumina porosa o zeolita.

    15 14. La composicion de la reivindicacion 12, donde la superficie de poro se funcionaliza con un

    aminosilano.
13. 15. La composicion de la reivindicacion 12, donde

    20 (a) la superficie de poro se funcionaliza con aminopropiltrimetoxisiloxano; o

    (b) la superficie de no-poro se funcionaliza con polielectrolitos seleccionados de entre el grupo que consiste en sal sodica del acido poliacrflico, sulfonato de poliestireno; o

    (c) la superficie de no-poro se funcionaliza con el compuesto resistente a la adsorcion polietilenglicol; o

    (d) la superficie de no-poro se funcionaliza con compuestos hidrofobos seleccionados de entre el grupo que consiste 25 en octadeciltriclorosilano, octadeciltriclorosilano, n-butiltrimetoxisilano, ciclooctiltriclorosilano,

    fenoxipropiltriclorosilano, nonafluorohexiltrimetoxisilano y poli(tetrafluoroetileno).