ES2612752T3 - Biosensor implantable y métodos de uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un sensor (100), que comprende a) una región de transporte de oxígeno (001) que comprende una matriz de transporte de oxígeno estabilizada, una primera proteína de unión a oxígeno reversible inmovilizada en la matriz de transporte de oxígeno estabilizada, una primera superficie permeable a oxígeno (004) en comunicación con un entorno externo, y una segunda superficie permeable a oxígeno (006) que es impermeable al analito diana; b) una región de reacción de analito diana (002) en comunicación con la región de transporte de oxígeno (001) en la segunda superficie permeable a oxígeno (006), donde la región de reacción de analito diana (002) comprende una enzima oxidasa del analito diana, y una superficie permeable al analito diana (007); y c) una región de detección (003) que comprende al menos una sonda de detector (009) en comunicación con la región de reacción de analito diana (002).

Description

DESCRIPCION

Biosensor implantable y metodos de uso del mismo.

5 DATOS DE SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad bajo el Artfculo 35 U.S.C. § 119(e)(1) del documento de Estados Unidos n.° de serie 60/531.447, presentado el 18 de diciembre de 2003, cuyo contenido en su totalidad se incorpora en el presente documento por referencia.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION

15 La invencion se refiere en general al control de la glucosa, y mas especfficamente a sensores de glucosa implantables.

INFORMACION DE ANTECEDENTES

20 La diabetes es una enfermedad de la regulacion insuficiente de glucosa en sangre. En las personas no diabeticas, las celulas beta del cuerpo controlan la glucosa y entregar la cantidad correcta de insulina en una base minuto a minuto para los tejidos en el cuerpo para captar la cantidad adecuada de glucosa, manteniendo la glucosa en sangre en niveles saludables. En los diabeticos, este sistema de regulacion sana falla principalmente a los dos factores siguientes, ya sea en solitario o en combinacion:

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1) insuficiente produccion de insulina y secrecion, 2) una falta de sensibilidad normal a la insulina por los tejidos del cuerpo.

El primer gran avance en el tratamiento de la diabetes fue el descubrimiento de la insulina. El pilar de los 30 tratamientos de hoy en dfa se basa en este descubrimiento, y la iniciativa propia y el cumplimiento del paciente. Dos tipos de diabetes mellitus son comunes. La diabetes tipo 1 representa el 5-10 % de todos los casos, y la diabetes tipo 2 representa el 90-95 % de la poblacion diabetica. En la diabetes tipo 1, la enfermedad requiere inyecciones de insulina para vivir, ademas requiere una alimentacion saludable y ejercicio. El tratamiento de la diabetes tipo 2 puede requerir insulina, pero la enfermedad puede ser controlable con medicacion oral, perdida de peso, una dieta 35 cuidadosa y un programa de ejercicios regular.

Todavfa no existe ninguna pfldora magica para tratar la diabetes. Los farmacos actuales tienen el potencial de eliminar por completo las complicaciones, unicamente si paciente sabe cuando y cuanto debe tomar. Se requiere un programa de toma de muestras muy frecuente para proporcionar tanto la velocidad como la extension de las 40 excursiones glucemicas. Este conjunto de medidas de la glucosa es informacion absolutamente necesaria para calcular el tiempo y la cantidad de acciones correctivas necesarias para tratar con eficacia la diabetes y prevenir complicaciones. La importancia de la monitorizacion de la glucosa en la sangre ha sido subrayada por los resultados del Ensayo sobre el Control y Complicaciones de la Diabetes, que demostro que muchas de las complicaciones a largo plazo de la diabetes se pueden prevenir mediante la regulacion de la glucosa en sangre.

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Sin embargo, las pruebas actuales de glucosa en sangre son dolorosas, que requieren la puncion del dedo para obtener una muestra de sangre. Son inconvenientes debido a la interrupcion de la vida diaria y ser diffciles de realizar en los pacientes diabeticos a largo plazo debido a los callos en los dedos y la mala circulacion. Con la tecnologfa actual, el paciente diabetico promedio pone a prueba sus niveles de glucosa en sangre menos de dos 50 veces al dfa en comparacion con la cantidad recomendada de 4-7 veces por dfa. Ademas, incluso el horario recomendado esta lejos de ser suficiente para permitir la normalizacion de la glucosa en sangre.

Asf, con la tecnologfa actual, el seguimiento necesario con frecuencia es una tarea inacabada. El programa de muestreo requerido no puede esperarse de forma realista de incluso los pacientes mas comprometidos durante el 55 dfa y no es factible por la noche. Los metodos actuales de controla de la glucosa en sangre no son automaticos, lo que requiere cronicamente la iniciativa usuario. Por lo tanto, no se puede confiar en que este sistema detecte una hipoglucemia espontanea u otras excursiones glucemicas. Por consiguiente, incluso los pacientes mas diligentes no pueden evitar complicaciones graves. Como resultado, se gastaron $85 billones en 2002, sobre el tratamiento de las complicaciones de la diabetes, incluyendo la perdida de vision, perdida de la funcion renal, perdida de extremidades,

enfermedad vascular, insuficiencia cardiaca, ictus, coma y dolor constante grave.

Se necesitan nuevos metodos de control de glucosa para hacer frente a estas deficiencias. Un medio automatico, incoloro, y comodo de control continuo de la glucosa podrfa proporcionar la informacion necesaria para un control 5 adecuado. Esto reducirfa en gran medida las complicaciones observadas en estos pacientes y el coste clfnico asociado de su tratamiento.

Con el fin de satisfacer las necesidades de monitorizacion continua de la glucosa para la diabetes, el proceso de seguimiento debe satisfacer lo siguiente:

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• No requerir la preparacion de muestras (las mediciones se realizan automaticamente)

• Ser altamente selectivo y sensible

• Proporcionar una respuesta rapida a cambios en la glucosa

• Proporcionar mediciones altamente repetibles/reproducibles 15 • Operar con estabilidad y baja desviacion

Se han aplicado varias tecnologfas diferentes para desarrollar un sensor de glucosa para satisfacer estas necesidades. Sin embargo, la ruta mas directa para poner un dispositivo de exito en el mercado es el desarrollo de un sensor desechable que opere en el tejido subcutaneo. Esto reduce al mfnimo el riesgo de complicaciones graves 20 asociadas a un dispositivo totalmente implantado.

Un metodo muy acertado que satisfaga todos los requisitos anteriores para una biodeteccion es la deteccion de electrodo amperimetrica basada en enzimas. Este metodo fue disenado para funcionar en un entorno de oxfgeno homogeneo con una alta disponibilidad de oxfgeno, tal como un vaso sangufneo principal en el cuerpo. El metodo 25 empleado consumfa oxfgeno, manteniendo de manera efectiva una concentracion de oxfgeno nulo en la superficie del electrodo con el fin de medir el oxfgeno. Sin embargo, este enfoque no es aplicable directamente al tejido subcutaneo.

Como suele ser el caso, el tipo de metodo de deteccion aplicado afectara a la capacidad de lograr el exito en los 30 nuevos entornos de deteccion. Muchos metodos de deteccion se realizaran bien in vitro o bajo condiciones cuidadosamente controladas, pero despues no funcionaran bien en el cuerpo. Su fracaso se ha atribuido a la selectividad insuficiente, el envenenamiento del electrodo, y la insuficiente sensibilidad a la glucosa.

La alta selectividad de la glucosa es esencial para proporcionar una medicion precisa de la glucosa en el cuerpo. La 35 selectividad de una medicion se refiere al grado en el que un analito particular puede determinarse en una mezcla compleja sin la interferencia de otros componentes en la mezcla. En el cuerpo, hay una mezcla compleja que puede denominarse la matriz de tejido en la que se debe medir la glucosa. La matriz de tejido contiene muchos componentes que cambian constantemente y que pueden interferir con diferentes tipos de enfoques de medicion. El estado constante de flujo de la matriz de tejido evita establecer una calibracion para la medicion selectiva a traves de 40 una tecnica como la regresion multiple para eliminar el impacto de los constituyentes de interferencia no medidos de la matriz.

Una amplia gama de enfoques de no invasivos a invasivos se estan desarrollando en un intento por comercializar un nuevo tipo de sensor de glucosa. Sin embargo, mientras se espera, las mediciones opticas no invasivas 45 generalmente no son suficientemente selectivas para la glucosa sin un conocimiento detallado de la matriz que se sondea. La medicion optica se realiza centrando un haz de energfa sobre el cuerpo. La energfa se modifica por el tejido despues de la transmision a traves de la zona diana. Una firma del contenido de tejido se produce por la energfa que sale del tejido. La salida de energfa es una funcion de componentes qufmicos encontrados, asf como el grosor, el color y la estructura de la matriz de tejido a traves del cual pasa la energfa. En el cuerpo, la matriz de tejido 50 esta cambiando constantemente. Ademas, los constantes cambios en el entorno externo, y su impacto en la piel proporcionan un entorno no estacionario. Este es un grave problema para las mediciones puramente opticas que son altamente selectivas para la glucosa.

Para lograr suficiente selectividad para la glucosa, la enzima glucosa oxidasa se puede emplear en un enfoque semi- 55 invasivo. Clark y Lyons utilizan en primer lugar la estrategia de combinar la especificidad de un sistema biologico para conseguir la selectividad necesaria para las mediciones de glucosa en una matriz de tejido. La glucosa oxidasa tiene una alta especificidad para la glucosa. Esta enzima reduce la glucosa a acido gluconico y peroxido en presencia de oxfgeno y agua.

Mediante el acoplamiento de la glucosa oxidasa con un transductor adecuado, la concentracion de glucosa puede ser medida mediante el control de la produccion de peroxido o el consumo de oxfgeno.

Sin embargo, existen problemas en la aplicacion directa de ambos enfoques. Las sondas de peroxido de hidrogeno a 5 menudo tienen interferencia electroqufmica por las especies oxidables en una matriz compleja tal como la encontrada en el cuerpo. El electrodo oxida estos otros constituyentes electroactivos, asf como peroxido de hidrogeno, lo que se traduce en mediciones con un error positivo y variable neto. El peroxido de hidrogeno, si no se elimina, tambien puede tener una reaccion indeseable con el tejido circundante, asf como degradar la enzima oxidasa necesaria para el funcionamiento del sensor en el transcurso de la operacion del sensor. Ademas, a menos 10 que el oxfgeno este disponible en exceso para la glucosa que se va a reducir por la reaccion, las variaciones en el oxfgeno de masa entera tambien cambiaran la cantidad de glucosa que se oxida, dando lugar a mediciones erroneas si la concentracion de oxfgeno que influye en la reaccion no se contabiliza directamente en una calibracion, o se impide que afecte a la dinamica de reacciones. El problema de la sensibilidad a la variacion de la concentracion de oxfgeno tambien esta presente en los enfoques basados en la medicion del consumo de oxfgeno. 15 Desgraciadamente, el entorno de tejido subcutaneo se ha demostrado que tiene tanto una concentracion de oxfgeno variable como heterogenea. Por tanto, estas mediciones deben abordar las variaciones de oxfgeno de fondo para determinar con precision la cantidad de oxfgeno que se consume, necesario para la medicion precisa de la glucosa.

Por lo tanto, para utilizar eficazmente la glucosa oxidasa, deben superarse una serie de problemas. En primer lugar, 20 suficiente oxfgeno debe estar disponible para que la reaccion avance. En segundo lugar, independientemente de como se acopla la glucosa oxidasa a un transductor, si el oxfgeno no esta disponible en exceso, como sera el caso en el tejido subcutaneo, se necesita entonces el conocimiento de la concentracion de oxfgeno para proporcionar una medicion completamente selectiva de la glucosa. En tercer lugar, la glucosa oxidasa debe acoplarse a un detector de manera que cumpla los requisitos de los biosensores anteriormente indicados.

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Gran parte del trabajo se ha hecho sobre el acoplamiento de la glucosa oxidasa a un electrodo. Sin embargo, los problemas de la estabilidad, la deriva, la selectividad y la sensibilidad deben ser superados si se utiliza un sistema de electrodos. Se han dedicado extensos esfuerzos para estabilizar el electrodo, minimizando el error de la interferencia electroactiva, y evitando el "envenenamiento del electrodo"; sin embargo, un enfoque alternativo 30 consiste en evitar el uso de un electrodo como un transductor mediante la seleccion de un metodo de medicion optica. En el entorno subcutaneo, el oxfgeno es escaso, haciendo que un metodo optico que mida el resultado de la reaccion de oxidacion de la glucosa, sin consumir al mismo tiempo oxfgeno sea incluso mas deseable.

En el acoplamiento de la glucosa oxidasa con un transductor optico, se plantea un problema adicional de la 35 deteccion selectiva de oxfgeno. Afortunadamente, los medios opticos de deteccion de oxfgeno selectivamente estan bien establecidos.

El documento US 4.680.268 se refiere a un biosensor que contiene gas implantable y un metodo para medir un analito. En particular, un dispositivo tfpico de este documento de patente es uno con un sensor dotado de un bolsillo 40 de gas con espacio de aire en el lateral de una membrana permeable de gas opuesta a la enzima que funciona como un deposito independiente del oxfgeno para suministrar una reaccion enzimatica. Se incorpora en un recipiente cerrado del dispositivo un agente de transporte de oxfgeno, tal como un perfluorocarbono o un derivado del mismo, aceites de silicona u otros disolventes de oxfgeno organicos. En el caso de un perfluorocarbono o un derivado del mismo, se prefiere un perfluorociclocarbono.

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El documento WO 03/059286A2 se refiere a metodos y composiciones para el transporte de oxfgeno que comprenden hemoglobina modificada en plasma. En particular, este documento de patente se refiere a sustitutos de la sangre que comprenden vehfculos de oxfgeno a base de hemoglobina.

50 RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion se basa, al menos en parte, al descubrimiento de una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible, tal como hemoglobina, inmovilizada a traves de toda la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada. La matriz estabilizada recoge el oxfgeno, estabiliza la dinamica 55 del oxfgeno, y transporta rapidamente oxfgeno dentro de la matriz. Por ejemplo, la matriz estabilizada puede transportar oxfgeno desde una region de oxfgeno relativamente elevado que rodea una superficie de la matriz estabilizada, a una region de menor o nada de oxfgeno sobre una segunda superficie. Ademas, la matriz estabilizada puede transportar oxfgeno a un sitio dentro de la matriz o yuxtapuesto a la matriz, donde se produce una reaccion en la que se consume el oxfgeno.

La matriz de oxfgeno estabilizada proporciona numerosas funciones, incluyendo un rapido transporte de oxfgeno en un sensor implantable y un rapido transporte de oxfgeno a un tejido artificial. Por consiguiente, se proporciona en el presente documento en una realizacion un metodo para transportar oxfgeno desde una primera area que tiene una 5 concentracion de oxfgeno relativamente alta a una segunda area que tiene una concentracion de oxfgeno relativamente baja, que incluye poner en contacto el oxfgeno de la primera area, con una primera superficie de una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada a traves de toda la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, y transportar oxfgeno lejos de la primera superficie de la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada a una segunda superficie de la matriz de transporte de oxfgeno, 10 donde la segunda superficie de la matriz de transporte de oxfgeno entra en contacto con la segunda area.

En realizaciones ilustrativas, la presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada puede usarse para transportar rapidamente oxfgeno en un biosensor, especialmente un sensor de glucosa implantable, para superar los problemas de los sensores implantables, tales 15 como cambios espaciales y temporales en la concentracion de oxfgeno en el sitio de un implante. Adicionalmente, la presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que una sonda que no consume sustancialmente oxfgeno puede acoplarse con un mediador selectivo tal como glucosa oxidasa con condiciones de geometrfa y demarcacion apropiadamente definidas para desarrollar un sensor de glucosa que funcionara con precision a baja tension de oxfgeno tal como es tfpico en los tejidos subcutaneos. El transportador de protefna de 20 union a oxfgeno reversible puede usarse para aumentar el suministro de oxfgeno al sitio de reaccion de la glucosa oxidasa de una manera mas homogenea, proporcionando un entorno para que la reaccion proceda que sea mas adecuada para hacer mediciones de glucosa sensibles con un amplio rango dinamico. Ademas, puede usarse una protefna de union a oxfgeno reversible, o un tinte sensible al oxfgeno adicional, para medir opticamente los cambios en la concentracion de oxfgeno que son resultado de la reaccion catalizada por glucosa-oxidasa de la glucosa que 25 esta siendo mediada por oxfgeno. Escogiendo este enfoque, las cuestiones de la selectividad se superan cuando se toma una medicion de oxfgeno de referencia en una region en el sensor de glucosa que esta distante de un sitio donde la glucosa entra en el sensor, pero que tiene una concentracion de oxfgeno (en la region de referencia) que proporciona una medida de la concentracion de oxfgeno que habrfa estado presente en el lugar donde la glucosa entra en el sensor en ausencia de glucosa.

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En una realizacion, la presente invencion proporciona un sensor de base enzimatica capaz de controlar selectiva y sensiblemente la glucosa en los tejidos subcutaneos en bajas tensiones de oxfgeno. El sensor incluye una region de transporte de oxfgeno que comprende una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, una primera protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada en la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, una primera superficie 35 permeable a oxfgeno en comunicacion con un entorno externo, y un segunda superficie permeable a oxfgeno que es impermeable al analito diana; una region de reaccion del analito diana en comunicacion con la region de transporte de oxfgeno en la segunda superficie permeable a oxfgeno, donde la region de reaccion del analito diana comprende una enzima oxidasa del analito diana, y una superficie permeable al analito diana; y una region de deteccion que comprende al menos una sonda detectora en comunicacion con la region de reaccion del analito diana. Tfpicamente, 40 una superficie impermeable al analito diana y al oxfgeno se situa en el sensor de tal forma que la region de deteccion esta entre la superficie impermeable al analito diana y al oxfgeno y la region de transporte de oxfgeno.

El analito diana puede ser, por ejemplo, glucosa, galactosa, lactosa, peroxido, colesterol, aminoacidos, alcohol o acido lactico. En ciertos ejemplos ilustrativos, el analito diana es glucosa y el sensor es un sensor de glucosa. Por 45 ejemplo, el sensor de glucosa puede ser un sensor de glucosa implantable, tal como un sensor de glucosa transcutaneo.

La primera protefna de union a oxfgeno reversible puede ser una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo. En ejemplos ilustrativos, la primera protefna de union a oxfgeno reversible es mioglobina o hemoglobina.

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La region de deteccion puede incluir adicionalmente una sonda de oxfgeno. Por ejemplo, la sonda de oxfgeno puede ser una segunda protefna de union a oxfgeno reversible, tal como una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo. En ejemplos ilustrativos, la primera y la segunda protefna de union a oxfgeno reversible es hemoglobina.

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En ciertos sensores ejemplares proporcionados en el presente documento, se usa al menos una sonda detectora que no consume sustancialmente oxfgeno. La sonda detectora puede incluir adicionalmente un espectrometro. Al menos una sonda detectora, en ciertos ejemplos, es capaz de emitir y/o recibir luz a una longitud de onda de hemoprotefna creada por ingenierfa sensible a oxfgeno, o derivado hemo. Por ejemplo, uno o mas emisores pueden

emitir luz hacia uno o mas receptores, y los emisores y los receptores pueden ambos entrar en el sensor a traves de un primer extremo. El uno o mas emisores pueden ser una o mas fibras opticas que se forman en un bucle de tal forma que la luz que sale de las fibras opticas del emisor transcurren en una trayectoria que es sustancialmente opuesta a la luz de una fuente de luz que entra en las fibras opticas del emisor.

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En otra realizacion, se proporciona en el presente documento un metodo para medir una concentracion de un analito, que comprende transportar oxfgeno desde un entorno externo a traves de una region de transporte de oxfgeno que comprende una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada dentro de un sensor a una region de reaccion del analito del sensor usando una primera protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada en la matriz 10 de transporte de oxfgeno estabilizada; hacer reaccionar una porcion del oxfgeno transportado con el analito enzimaticamente en la region de reaccion del analito para formar un producto; y medir el oxfgeno o un producto de la reaccion de oxfgeno y el analito en una region de deteccion que comprende la region de reaccion del analito o una region de deteccion en contacto con la region de reaccion del analito, midiendo de esta manera la concentracion del analito.

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En aspectos ilustrativos, el analito que se mide es glucosa, galactosa, lactosa, peroxido, colesterol, aminoacidos, alcohol o acido lactico. En una realizacion particularmente ilustrativa, el analito que se mide es glucosa. La medicion puede realizarse repetidamente, por ejemplo, al menos en un primer punto temporal y un segundo temporal, proporcionando de esta manera informacion con respecto a los cambios en la concentracion de analito con el 20 tiempo. En ciertos ejemplos, el oxfgeno se transporta desde el entorno externo que comprende tejido subcutaneo a la region de reaccion del analito usando una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo como la primera protefna de union a oxfgeno reversible. Por ejemplo, el oxfgeno se transporta desde el entorno externo a la region de reaccion del analito usando hemoglobina como la primera protefna de union a oxfgeno reversible.

25 El oxfgeno puede medirse, por ejemplo, midiendo la union a oxfgeno de una sonda de oxfgeno. La union a oxfgeno puede medirse usando un espectrometro que mide la absorcion de la protefna de union a oxfgeno tal como una segunda protefna de union reversible. La segunda protefna de union a oxfgeno reversible puede ser una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo, tal como hemoglobina. En aspectos ilustrativos, la hemoglobina es tanto la primera protefna de union reversible como la segunda protefna de union reversible.

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La medicion se realiza tfpicamente usando una o mas sondas detectoras, por ejemplo, una poblacion de sondas detectoras que no consumen sustancialmente oxfgeno, emitiendo luz hacia uno o mas receptores que no consumen oxfgeno a una longitud de onda de hemoprotefna creada por ingenierfa sensible al oxfgeno o derivado hemo. En ciertos aspectos, la luz viaja a traves de una o mas fibras opticas del emisor de una fuente de luz que emite en una 35 primera direccion, y despues viaja en una segunda direccion que es sustancialmente opuesta a la primera direccion a traves de al menos una porcion de la region de deteccion donde se recibe por una o mas fibras opticas del receptor. En un aspecto relacionado, la luz viaja a traves de una o mas fibras opticas del emisor de una fuente de luz que emite en una primera direccion a traves de al menos una porcion de la region de deteccion, y despues viaja en una segunda direccion que es sustancialmente opuesta a la primera direccion donde se recibe por una o mas fibras 40 opticas del receptor. En otras palabras, las fibras del emisor o los receptores pueden incluir un bucle en la fibra.

El metodo puede incluir una medicion de referencia dentro del sensor de deteccion. Tfpicamente, el analito entra en la region de reaccion a traves de una entrada del analito y la concentracion de analito se determina usando la senal de al menos una sonda de oxfgeno que esta suficientemente cerca de la entrada del analito para ser sensible a los 45 gradientes de oxfgeno derivados de analito dentro de la region de deteccion junto con la senal de al menos una segunda sonda de oxfgeno que esta suficientemente lejos de la entrada del analito para actuar como una sonda de referencia para el perfil de oxfgeno. La sonda de referencia puede estar suficientemente lejos de la entrada del analito de manera que la senal de la sonda de referencia no se vea sustancialmente influenciada por el analito que entra en la entrada del analito.

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En aspectos ilustrativos, una concentracion de oxfgeno sustancialmente uniforme espacialmente esta presente en la demarcacion de la region de reaccion y la region de transporte de oxfgeno. Ademas, la region de transporte de oxfgeno proporciona tfpicamente un flujo de oxfgeno suficiente a la region de reaccion de tal forma que la reaccion enzimatica no se limita a oxfgeno. Ademas, el tamano de la entrada del analito, la concentracion de una enzima en 55 la region de reaccion, y la concentracion de la protefna de union a oxfgeno reversible en la region de reaccion puede ajustarse para proporcionar un gradiente de oxfgeno sensible a analito cerca de la entrada de tal forma que el intervalo dinamico deseado de las concentraciones de analito puede medirse, y para proporcionar una concentracion de referencia de oxfgeno insensible a analito distal a la entrada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 proporciona un diagrama esquematico de la geometrfa del sensor de glucosa de acuerdo con aspectos ilustrativos de la presente invencion.

La figura 2 es un grafico de la tension de fotodiodo correspondiente a la transmision del diodo laser a traves de una pelfcula de Hemoglobina (Hb) unida en una membrana impermeable a oxfgeno, salvo para una pequena region en un extremo expuesto a sus entornos. La senal representa el cambio de la absorcion de Hb a 635 nm de luz laser. En el tiempo anterior a la referencia "A", se aplico aire ambiental en la region expuesta de la pelfcula de Hb. En la 10 referencia "A", se aplico una mezcla de gas oxfgeno al 5 % a la region expuesta de la pelfcula de Hb, seguido de aire ambiental aplicado de nuevo a la region expuesta de la pelfcula de Hb en la referencia "B".

La figura 3A proporciona un diagrama esquematico de un ejemplo ilustrativo de un sensor de glucosa de la presente invencion, como se desvela en el Ejemplo 2. La figura 3B proporciona un diagrama esquematico del sensor de 15 glucosa ilustrativo del Ejemplo 2 conectado a un emisor de luz 490, un detector de luz 495, y una unidad de procesamiento de senal 498.

La figura 4A proporciona un dibujo esquematico que ilustra la trayectoria de haces de fibra optica y la luz en un sensor de glucosa ilustrativo de la presente invencion. La figura 4B proporciona un dibujo esquematico que ilustra 20 haces de fibra optica y la emision de luz en un sensor de glucosa ilustrativo de la presente invencion que incluye una vista mas cercana de la region de acoplamiento 425 donde el haz de deteccion 415 recibe luz del haz emisor 410.

La figura 4C proporciona un diagrama esquematico de una vista en seccion transversal de un haz de deteccion (tambien denominado un haz receptor) 415 y un haz emisor 410. En la figura 4B, se ilustra una separacion entre el haz emisor y la region de reaccion. Sin embargo, en otros aspectos de la invencion, el haz emisor esta en contacto 25 con, y hace tope contra, la region de reaccion.

Las figuras 5A y 5B proporcionan un diagrama esquematico y graficos que ilustran los cambios de concentracion de oxfgeno y glucosa esperados en un sensor de glucosa de acuerdo con la presente invencion. El grafico superior en las figuras 5A y 5B representa las fluctuaciones espaciales esperadas en la concentracion de oxfgeno en el tejido 30 subcutaneo fuera del sensor de glucosa en la superficie donde el oxfgeno entra en la region de transporte de oxfgeno 001 del sensor de glucosa. El grafico inferior en la figura 5A ilustra las concentraciones de oxfgeno esperadas a traves de la superficie del inyector de oxfgeno 6 y dentro de la zona de reaccion de glucosa en ausencia de glucosa. El grafico inferior en la figura 5B ilustra los cambios en la concentracion de oxfgeno espaciales esperados (lfnea discontinua) y la concentracion de glucosa (lfnea continua) a traves de la zona de reaccion de 35 glucosa 2 en un plano dentro de la zona de reaccion de glucosa 2 despues de la entrada de glucosa a traves de una entrada de glucosa 7.

La figura 6 ilustra la deteccion de glucosa en una matriz fina de glucosa oxidasa-hemoglobina de glucosa estabilizada. Los resultados se presentan como graficos de las concentraciones de glucosa en un bano de agua con 40 una burbuja de mezcla de gas O2 al 5 % + N2 al 95 %, que se representa en relacion con la tension de fotodiodo correspondiente cuando el gel de reaccion se interrogo en una ubicacion de 50 um o 100 um de la entrada de glucosa 7.

La figura 7 muestra la respuesta calibrada del gel fino de glucosa oxidasa - hemoglobina de la figura 6 que se 45 representa en relacion con el medidor de glucosa TrueTrack™ que mide las mismas soluciones de glucosa.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que una protefna de union a oxfgeno 50 reversible, tal como hemoglobina, puede usarse como un conducto de oxfgeno en una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada. La matriz estabilizada recoge el oxfgeno, estabiliza la dinamica del oxfgeno, y transporta rapidamente oxfgeno lejos de una region de oxfgeno relativamente elevado que rodea una superficie de la matriz estabilizada, a una region de menor o nada de oxfgeno sobre una segunda superficie. La matriz de oxfgeno estabilizada proporciona numerosas funciones, incluyendo un rapido transporte de oxfgeno en un sensor implantable 55 y un rapido transporte de oxfgeno a un tejido artificial.

Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento biosensores, especialmente sensores de glucosa implantables, que utilizan la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada como una region de transporte de oxfgeno y una region de reaccion para superar los problemas de los sensores implantables, tales como cambios espaciales y

temporales en la concentracion de oxfgeno en el sitio de un implante. El conducto de protefna de union a oxfgeno reversible puede usarse para aumentar el suministro de oxfgeno a un mediador selectivo tal como glucosa oxidasa de una manera homogenea y medible. Ademas, la protefna de union a oxfgeno dentro de una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada puede usarse para medir opticamente los cambios en la concentracion de oxfgeno dentro de 5 regiones de la matriz que son resultado de las reacciones dentro de la matriz en la que se consume el oxfgeno, tal como una reaccion catalizada por glucosa-oxidasa de glucosa con oxfgeno.

En una primera realizacion, la presente invencion proporciona un sensor que incluye una region de transporte de oxfgeno que comprende una primera protefna de union a oxfgeno reversible, una primera superficie permeable a 10 oxfgeno en comunicacion con un entorno externo, y una segunda superficie permeable a oxfgeno que es impermeable al analito diana; una region de reaccion del analito diana en comunicacion con la region de transporte de oxfgeno en la segunda superficie permeable a oxfgeno, donde la region de reaccion del analito diana comprende una enzima oxidasa del analito diana, y una superficie permeable al analito diana y una region de deteccion que comprende al menos una sonda detectora en comunicacion con la region de reaccion del analito diana. Tfpicamente, 15 una superficie impermeable al analito diana y al oxfgeno se situa en el sensor de tal forma que la region de deteccion esta entre la superficie impermeable al analito diana y al oxfgeno y la region de transporte de oxfgeno. La region de deteccion esta tfpicamente en comunicacion optica, electrica o molecular con la region de reaccion del analito diana.

En ciertos aspectos, el sensor incluye un medio de transporte de oxfgeno para transportar oxfgeno desde una 20 superficie en contacto con un entorno externo a una region de reaccion del analito diana y un medio de deteccion para detectar y/o medir el oxfgeno, el analito diana, o un producto de la reaccion de oxfgeno y el analito diana dentro de una region de deteccion en la region de reaccion o poner en contacto de la region de reaccion. Se proporcionan en el presente documento numerosos ejemplos de los medios de transporte de oxfgeno y los medios de deteccion.

25 La primera protefna de union a oxfgeno reversible puede ser, por ejemplo, una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo. En ejemplos ilustrativos, la primera protefna de union a oxfgeno reversible es miogloblina, o en ejemplos ilustrativos adicionales, hemoglobina.

Muchos analitos diana diferentes pueden detectarse y medirse por los sensores proporcionados en el presente 30 documento con la condicion de que el analito diana reaccione con oxfgeno. Por ejemplo, el analito diana puede ser galactosa, lactosa, peroxido, colesterol, aminoacidos, alcohol o acido lactico. En un ejemplo ilustrativo, el analito diana es glucosa y el sensor es un sensor de glucosa. Se entendera que las ensenanzas proporcionadas en el presente documento con respecto a glucosa pueden usarse para fabricar y usar sensores para otros analisis que reaccionan con oxfgeno.

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Por consiguiente, como se ilustra en la figura 1, se proporciona en el presente documento un sensor de glucosa 100 que incluye una region de transporte de oxfgeno 001, que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible, una primera superficie permeable a oxfgeno 004 y una superficie permeable al oxfgeno opcional 005 en comunicacion con un entorno externo, y una segunda superficie permeable a oxfgeno 006, a veces denominada en el presente 40 documento como el inyector de oxfgeno 006; una region de reaccion de glucosa 002 en comunicacion de transporte de masa con la region de transporte de oxfgeno 001 en la segunda superficie permeable a oxfgeno, donde la region de reaccion de glucosa incluye, la protefna de union a oxfgeno reversible, una enzima glucosa oxidasa y una superficie permeable a glucosa 007, a veces denominada en el presente documento como la entrada de glucosa 007, y una region de deteccion 003 en comunicacion optica o electrica con la region de reaccion de glucosa 002, 45 donde la region de deteccion 003 incluye una sonda, tal como una sonda de oxfgeno, una sonda de glucosa, o una sonda que se une a, o esta afectada de otro modo por, un producto de la reaccion de oxfgeno y glucosa. La region de deteccion 003 puede ser una region dentro de la region de reaccion 002, o una region suficientemente en contacto con la region de reaccion de glucosa para representar el perfil espacial y temporal de la glucosa u otro analito diana, oxfgeno, y/o el producto de reaccion dentro de la region de reaccion, que se interroga por una o mas 50 sondas detectoras 009, que son elementos de deteccion individuales 009 dentro de una interfaz de deteccion. Ademas, el dispositivo puede tener un eje de simetrfa 010. La region de transporte de oxfgeno 001 es una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada ejemplar de la presente invencion. La comunicacion entre la region de transporte de oxfgeno 001 y la region de reaccion de glucosa 002 se produce tfpicamente a traves de una superficie 006 donde la region de transporte de oxfgeno 001 y la region de reaccion de glucosa 002 estan en contacto. La comunicacion 55 entre la region de transporte de oxfgeno 001 y la region de reaccion de glucosa 002 puede ser cualquier tipo de comunicacion que implique la difusion y permita el transporte de oxfgeno desde la region de transporte de oxfgeno 001 hasta la region de reaccion de glucosa 002. La comunicacion puede ser, por ejemplo, el movimiento del lfquido, gas y/o iones de la region de transporte de oxfgeno 001 a la region de reaccion de glucosa 002.

En ciertos aspectos de un sensor de la presente invencion, una membrana externa 011 puede rodear todo o una porcion del dispositivo. La membrana es tfpicamente permeable al oxfgeno y la glucosa, pero impermeable al menos a algunas biomoleculas, tales como protefnas, especialmente biomoleculas tales como protefnas dentro del sensor y de protefnas inmunes. Por lo tanto, la membrana tiene un corte, por ejemplo, de 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, o 25.

5 En algunos aspectos, los poros de la membrana puede ser de hasta aproximadamente 10 um, o la membrana puede ser laminar con una capa externa con poros de hasta 10 um para facilitar la infiltracion celular, y la capa interna puede tener tamanos de poro tan pequenos como de 10 kDa para impedir el transporte de protefna.

En otra realizacion, se proporciona en el presente documento un metodo para medir una concentracion de un 10 analito, que incluye transportar el oxfgeno desde un entorno externo a traves de una region de transporte de oxfgeno dentro de un sensor a una region de reaccion del analito del sensor usando una primera protefna de union a oxfgeno reversible; hacer reaccionar una porcion del oxfgeno transportado con el analito enzimaticamente en la region de reaccion del analito para formar un producto; y medir el oxfgeno o un producto de la reaccion de oxfgeno y el analito. La medicion se realiza en una region de deteccion que incluye la region de reaccion del analito o una region de 15 deteccion en contacto con la region de reaccion del analito. Como se analiza en el presente documento, virtualmente cualquier analito puede detectarse y medirse usando los metodos en el presente documento con la condicion de que el analito reaccione con el oxfgeno. En ciertos aspectos, el analito que se mide es galactosa, lactosa, peroxido, colesterol, aminoacidos, alcohol o acido lactico. En aspectos ilustrativos, el analito que se mide es glucosa. Se entendera que las ensenanzas con respecto a la medicion de la glucosa pueden aplicarse a metodos para detectar 20 virtualmente cualquier analito que reaccione con oxfgeno.

Por consiguiente, se proporciona en el presente documento un metodo para medir la concentracion de glucosa, que incluye transportar el oxfgeno de un entorno externo a traves de una region de transporte de oxfgeno 001 a una region de reaccion de glucosa 002 usando una protefna de union a oxfgeno reversible, hacer reaccionar una porcion 25 del oxfgeno transportado con glucosa en la region de reaccion de glucosa 002 para formar un producto; y medir el oxfgeno, la glucosa, o un producto de la reaccion de oxfgeno y glucosa en una region de deteccion 003 dentro de la region de reaccion de glucosa 002 o en contacto con la region de reaccion de glucosa 002, midiendo de esta manera la concentracion de glucosa. En ejemplos ilustrativos, el oxfgeno se mide en la region de reaccion para medir la concentracion de glucosa.

30

En un aspecto ilustrativo, un sensor de glucosa 100 proporcionado en el presente documento es un sensor de glucosa implantable, por ejemplo, un sensor de glucosa transcutaneo. Tfpicamente, el sensor de glucosa transcutaneos puede retirarse por un usuario. Algunos sensores proporcionados en el presente documento pueden suministrarse como parte de, o conectarse a un cateter, a un vaso sangufneo. Los metodos proporcionados en el 35 presente documento miden las concentraciones relativas o absolutas de glucosa en el tejido, transportando el oxfgeno del tejido en la region alrededor del sensor a la zona de reaccion de glucosa usando un medio de transporte de oxfgeno. En aspectos ilustrativos, el sensor implantable se implanta en el tejido subcutaneo y el oxfgeno se transporta por el transportador de oxfgeno a la zona de reaccion del tejido que rodea al menos una porcion de un lado del transportador de oxfgeno, y tfpicamente todos los lados del transportador excepto para el lado que es 40 adyacente a la zona de reaccion de glucosa. En realizaciones donde el sensor se implanta en el tejido subcutaneo, el sensor puede ser un sensor subcutaneo, pero tfpicamente el sensor es un sensor transcutaneo en el que una porcion del sensor atraviesa la piel de un animal, por ejemplo, un mamffero, tal como un ser humano. Por ejemplo, las sondas conectadas al sensor pueden atravesar la piel para alcanzar una fuente de luz y un detector que se situan fuera del cuerpo. En realizaciones subcutaneas, todo el sensor, asf como el detector pueden situarse de 45 manera subcutanea. La fuente de luz puede situarse de manera subcutanea, o puede usarse una fuente de luz externa que no esta ffsicamente conectada al sensor. El sensor tambien puede usarse para medir las concentraciones de glucosa, asf como en la vasculatura, excreciones corporales, u otros tejidos tales como el musculo, o grasa, que pueden tener mayor o menor vascularizacion y tension de oxfgeno que el tejido subcutaneo.

50 El metodo y los sensores proporcionados en el presente documento pueden usarse para controlar los cambios en la configuracion absoluta o relativa de la glucosa. Por ejemplo, los diabeticos pueden utilizar los sensores y los metodos para controlar sus niveles de glucosa para determinar si los cambios en las concentraciones de glucosa estan siendo gestionadas adecuadamente por un regimen de tratamiento. Ademas, los diabeticos pueden utilizar el sensor 100 en el control de la administracion de insulina. Por lo tanto, los metodos proporcionados en este 55 documento tfpicamente incluyen al menos la medicion de las concentraciones de glucosa en un primer punto de tiempo y un segundo punto de tiempo, proporcionando de esta manera informacion sobre los cambios en la concentracion de glucosa en el tiempo. Los dispositivos y metodos proporcionados en el presente documento pueden usarse para medir los cambios relativos o absolutos de las concentraciones de glucosa, con alta sensibilidad y precision en todo el intervalo de al menos 10 a 600 mg/dl que abarca las concentraciones clfnicamente relevantes

de 70 mg/dl y menos que definen la hipoglucemia, y 250-400 mg/dl y mas que definen la hiperglucemia. El dispositivo explora la distribucion espacial del oxfgeno en una zona de reaccion de glucosa en la que los cambios de la concentracion de oxfgeno se usan para inferir cambios de la concentracion de glucosa de acuerdo con la cinetica de la enzima glucosa oxidasa. La calibracion del sensor, que puede incluir la medicion de referencia de oxfgeno que 5 se describe en el presente documento, permite las mediciones de la concentracion absoluta de glucosa en base a los cambios en la distribucion de la concentracion de oxfgeno. Los pacientes pueden alertarse por el sensor si su glucosa en sangre desciende por debajo de las concentraciones de ajuste de fabrica o de usuario, por ejemplo, 90 mg/dl y/o si el descenso de la velocidad de concentracion de glucosa excede las velocidades de ajuste de fabrica o de usuario, por ejemplo, 10 mg/dl*min-1 durante un periodo sostenido.

10

En ciertos ejemplos ilustrativos, los sensores y metodos proporcionados en el presente documento se usan para medir las concentraciones de glucosa en una base constante, tal como periodicamente en puntos temporales repetidos (por ejemplo, primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, septimo, etc., puntos temporales) o continuamente. Las mediciones de glucosa pueden tomarse virtualmente en cualquier intervalo, por ejemplo, en 15 tiempo real para un control continuo, o a intervalos de menos de un segundo, segundos, minutos, horas o dfas. El control continuo incluye el uso de luz pulsada que se emite en la region de deteccion a una frecuencia relativamente alta (por ejemplo, una vez cada 5 o l0 segundos con 1 a 5 segundos de duracion, o cada segundo con una duracion de .1 - .5 segundos). Los sensores pueden insertarse facilmente por debajo de la piel, por ejemplo, simplemente sosteniendo el alojamiento del sensor, que puede ser un cilindro de 2,54 cm (1 pulgada) de diametro y 1,27 cm (1/2 20 pulgadas) de espesor del cual sobresale una aguja en la que se encuentra el sensor, y conduciendo la aguja a traves de la piel hasta el tejido subcutaneo. Como alternativa, el alojamiento puede cargarse en un dispositivo cargado por resorte que se pone contra la piel, y tras el accionamiento de una palanca o boton, dicho dispositivo puede insertar la aguja bajo la piel. El dispositivo puede permanecer entonces en su ubicacion transcutanea o subcutanea durante un periodo de horas, dfas, semanas, meses o incluso anos, para permitir una deteccion 25 periodica o continua de los niveles de glucosa en sangre.

Un biosensor 001 de acuerdo con la presente invencion utiliza tfpicamente un sistema disenado en torno a una reaccion entre un compuesto y oxfgeno que esta mediada por una enzima oxidasa. Como una realizacion especffica, la enzima glucosa oxidasa se usa para catalizar la reaccion de oxidacion de glucosa para dar acido gluconico y 30 peroxido en presencia de agua y oxfgeno.

C@H12 Oq + O2 +H2 O —— C@H12 O7 + H2 O2 (1)

Esta reaccion consume tanto el analito deseado (glucosa) como el oxfgeno y crea productos distintos de oxfgeno y 35 analito deseado. Esta reaccion depende tanto del analito como del oxfgeno presente en el sitio catalftico de la enzima. Por lo tanto, una concentracion de glucosa se acopla a una reduccion de oxfgeno y nuevas concentraciones de producto. Despues, el sensor puede medir la concentracion de glucosa midiendo la reduccion en la concentracion de oxfgeno, glucosa, o un producto de la reaccion de oxfgeno y glucosa, segun se consume o se produce en la reaccion mediada por la enzima oxidasa. Esto requiere tfpicamente que se proporcione una medicion de oxfgeno de 40 fondo en el sitio de la reaccion de glucosa para interpretar los cambios en el campo de oxfgeno.

Los ejemplos ilustrativos de los biosensores proporcionados en el presente documento pretenden operar en condiciones tisulares fisiologicas, en las que la disponibilidad de oxfgeno es significativamente menor que la disponibilidad de la glucosa. La colocacion del sensor intravenoso proximal al corazon ha demostrado ser un 45 excelente entorno para la deteccion de la glucosa a largo plazo en cuanto la disponibilidad de oxfgeno y el rechazo muy limitado por el cuerpo. Sin embargo, existen riesgos mortales asociados a la colocacion intravenosa haciendo una colocacion no vascular deseable, ya que es menos invasiva y no plantea ninguno de los riesgos amenazantes para la vida potenciales del sitio del implante vascular. Aun en los tejidos subcutaneos, se ha demostrado que la tension de oxfgeno del tejido es bastante baja en comparacion con la tension de oxfgeno atmosferico o arterial. 50 Muchos tejidos del cuerpo humano tienen una tension de oxfgeno equivalente a entre aproximadamente el 5 % de oxfgeno en nitrogeno o menor, y puede haber una relacion de la glucosa con respecto a oxfgeno a veces tan alta como de 100 a 1 en los fluidos intersticiales subcutaneos.

Dado que la reaccion de oxidacion de la glucosa (ecuacion 1) requiere cantidades molares iguales de oxfgeno y 55 glucosa, la reaccion puede estar limitada por la falta de oxfgeno. Si el oxfgeno en volumen esta considerablemente menos disponible que la glucosa en volumen (que es la norma en el entorno subcutaneo), entonces la disponibilidad de oxfgeno con respecto al sitio catalftico regira la reaccion en lugar de la disponibilidad de la glucosa. Bajo estas condiciones, la camara de reaccion del sensor es como un motor de automovil que tiene el carburador inundado de combustible, la reaccion de combustion en el motor no procedera de manera eficiente con demasiado combustible y

sin suficiente oxfgeno. La reaccion de combustion todavfa avanzara pero solo en la medida en que hay oxfgeno disponible ya que hay un exceso de combustible. Esto limita la sensibilidad del sistema de deteccion a la glucosa.

Para superar las limitaciones ffsicas de la glucosa, el oxfgeno, y la enzima que trabajo en una solucion no regulada 5 sencilla, los biosensores de acuerdo con la presente invencion se construyen muy parecidos a un motor. Dentro de esta analogfa, el combustible es glucosa, la bujfa de encendido es el sitio catalftico de la enzima, y el oxfgeno es necesario para que la reaccion avance. Esto crea un problema de transporte y de reaccion. El objetivo es conseguir las cantidades equilibradas de oxfgeno y glucosa con respecto al sitio catalftico de la enzima. Esto hara que la reaccion en la enzima sea sensible a cambios en la concentracion de glucosa, como un motor de automovil es 10 sensible a los cambios en el flujo de combustible controlado por el conductor, y no a los cambios en el oxfgeno ambiente. Especfficamente, el biosensor esta disenado para tener la reaccion que sea sensible a las variaciones en la concentracion de glucosa en volumen e insensible a las variaciones transitorias de la concentracion de oxfgeno en volumen.

15 La invencion supera el problema de la sensibilidad a la glucosa limitada implementando las condiciones lfmites necesarias para que la reaccion de la glucosa oxidasa se produzca facilmente. Esto se logra transportando rapidamente el oxfgeno necesario a una region de reaccion 002 donde las condiciones lfmites que rigen la reaccion de glucosa se regulan cuidadosamente.

20 La region de reaccion 002 se forma a partir de multiples lfmites (figura 1):

Un lfmite 006, tambien denominado en el presente documento como el inyector de oxfgeno, en la camara de reaccion que permite un elevado transporte de oxfgeno pero no un transporte de glucosa.

25 Un lfmite 007, tambien denominado en el presente documento como la entrada de glucosa, que permite la entrada de glucosa de la masa entera a la camara de reaccion yuxtapuesta al lfmite 006. El lfmite 007 tambien puede permitir que el oxfgeno entre. Todo el lfmite 007 puede ser permeable a la glucosa o puede contener una entrada o entradas que son permeables a la glucosa.

30 Un lfmite 008, denominado la superficie de deteccion, que es impermeable tanto a la glucosa como al oxfgeno permite la deteccion de la camara de reaccion y se desvfa axialmente del inyector de oxfgeno 006 y se yuxtapone a la entrada de glucosa 007.

Ademas de los tres lfmites 006, 007, 008 que delinean la camara de reaccion, el sistema de sensor completo 35 contiene una region de transporte de oxfgeno 001 y una region de deteccion 003 continua al lfmite 008. En ciertos aspectos, la region de reaccion 002 se interroga con una sonda de temperatura. Las lecturas de la sonda de temperatura pueden usarse en una determinacion de la concentracion absoluta de la glucosa, debido a la dependencia de la temperatura de la reaccion de oxidacion de la glucosa. La sonda de temperatura puede ser una sonda optica por lo que la luz infrarroja se recoge por una fibra optica o haz de fibra optica que se acopla a un 40 detector piroelectrico situado en el mismo alojamiento que, y que comunica con, una unidad de senal de procesamiento. La sonda de temperatura puede usarse como una entrada con respecto a la calibracion para la concentracion de glucosa. Puede comunicar, por ejemplo, electronicamente con una unidad de procesamiento de senal.

45 La region de transporte de oxfgeno 001 esta disenada para recoger oxfgeno, estabilizar la dinamica del oxfgeno, y transportar rapidamente el oxfgeno de una region extendida lejos de la camara de reaccion a la superficie de inyeccion de oxfgeno, denominada el inyector de oxfgeno, 006, de la camara de reaccion. Por lo tanto, la region de transporte de oxfgeno funciona como un medio de transporte de oxfgeno. La region de transporte de oxfgeno 001 proporciona un flujo de oxfgeno suficiente a la region de reaccion 002 de tal forma que la reaccion enzimatica no se 50 limita al oxfgeno. El elemento de deteccion interroga opticamente la camara de reaccion la subregion o subregiones de la camara de reaccion para medir el oxfgeno a traves del lfmite 008. La figura 5A demuestra la funcion de la region de transporte de oxfgeno 001, por lo que el oxfgeno de un campo de oxfgeno sustancialmente no nulo heterogeneo fuera de la primera superficie de la region de transporte de oxfgeno se transporta a la segunda superficie de transporte de oxfgeno 006 donde entrada en la region de reaccion 002 como un campo de oxfgeno 55 uniforme que se representa por las graficas de perfiles de concentracion de oxfgeno "[O2] exterior", y "superficie de deteccion de [O2]" (con fines de ilustracion, la superficie de deteccion 008 y la superficie 006 tendran perfiles suficientemente equivalentes en ausencia de glucosa).

Una "protefna de union a oxfgeno reversible" es una protefna portadora de oxfgeno que se une de forma reversible a

oxfgeno a concentraciones de oxigeno fisiologicamente relevantes. La protefna de union a oxfgeno reversible se une a oxfgeno a algunas presiones parciales mas elevadas y libera oxfgeno cuando las concentraciones de oxfgeno disminuyen, el cambio en la saturacion de la protefna en funcion de la presion parcial de oxfgeno que se describe por una curva de saturacion de oxfgeno (tambien denominado disociacion). Por ejemplo, las curvas de saturacion de 5 oxfgeno de las protefnas de union a oxfgeno de forma reversible hemoglobina o miogloblina tienen caracterfsticas de carga y descarga muy diferentes como se resume por sus curvas de saturacion sorprendentemente diferentes. La curva de saturacion de hemogloblina es sigmoidal, lo que refleja su union cooperativa, mientras que para la miogloblina es hiperbolica, lo que refleja una union no cooperativa. Comparando las curvas para hemogloblina con respecto a mioglobina, la saturacion de la mioglobina es siempre mayor que la hemoglobina a todas las presiones 10 parciales, lo que indica la afinidad mas elevada de la miogloblina para oxfgeno que la de la hemoglobina para el oxfgeno. En consecuencia, en los capilares sangufneos (la presion parcial del oxfgeno es de aprox. 20 mmHg) la hemogloblina liberara su oxfgeno a los tejidos, permitiendo a la miogloblina almacenar el oxfgeno para liberarlo posteriormente a los tejidos.

15 La protefna de union a oxfgeno reversible contiene un sitio de union a oxfgeno que se modula por al menos una unidad peptfdica. Por ejemplo, un grupo hemo se modula en hemoglobina o mioglobina. Sin embargo, el sitio de union a oxfgeno reversible puede no emplear un grupo hemo como es el caso para algunos ortologos de hemoglobina. Por ejemplo, las protefnas de union a oxfgeno reversibles que se encuentran en los invertebrados, tales como la hemocianina que se encuentra en los moluscos y artropodos cangrejos que tiene dos iones de Cu para 20 el sitio de union a oxfgeno reversible, o la hemeritrina que se encuentra en algunos invertebrados marinos que tampoco contiene un grupo hemo. La protefna de union a oxfgeno tambien puede derivarse sinteticamente con multiples funciones, tales como la albumina serica humana recombinante (rHSA) que incorpora la hemo sintetica "albumina-hemo" para formar una protefna de plasma portadora de oxfgeno (J Biomed Mater Res. 15 de diciembre de 2004; 71A(4): 644-51), o tal como el polipeptido beta-globina de anti-formacion humano recombinante, designado 25 beta(AS3) (betaGly(16) --> Asp/betaGlu(22) --> Ala/betaThr(87) -- > Gln), se designo para aumentar la afinidad para alfa-globina (J Biol Chem. 25 de junio de 2004; 279(26): 27518-24. Epub 14 de abril de 2004). Adicionalmente, pueden usarse otros cambios geneticos para conseguir diferentes variantes de protefnas de union a oxfgeno reversibles, tales como la hemoglobina recombinante producida por Escherichia coli (alfa 29leucina --> fenilalanina, alfa 96valina -- > triptofano, beta 108asparagina --> lisina) que muestra baja afinidad a oxfgeno y alta cooperatividad 30 combinada con la resistencia a la auto-oxidacion (Biochemistry. 5 de octubre 1999 5; 38(40); 13433-42.

La protefna de union a oxfgeno reversible en los ejemplos ilustrativos esta presente en la region de reaccion de glucosa (tambien denominada la zona de reaccion de glucosa) y/o la region de deteccion, asf como la region de transporte de oxfgeno. La protefna de union a oxfgeno reversible esta presente en la region de transporte de 35 oxfgeno tfpicamente a una concentracion de 0,1 g/dl -100 g/dl, por ejemplo 7,5 g/dl. La protefna de union a oxfgeno reversible puede aumentarse o reducirse en concentracion hasta tal punto en el que las extraordinarias velocidades de transporte de oxfgeno, como se ilustra en los Ejemplos, ya no pueden conseguirse mas. El lfmite superior de la concentracion de la protefna de union a oxfgeno reversible tambien se limita por la capacidad maxima para cargar la protefna en base a la masa de la protefna.

40

La protefna de union a oxfgeno reversible en realizaciones ilustrativas es un portador de oxfgeno de origen natural, por ejemplo, un derivado hemo o una protefna de union a oxfgeno que no contiene hemo, o la protefna de union a oxfgeno reversible es una hemoprotefna creada por ingenierfa. Una hemoprotefna creada por ingenierfa es un portador de oxfgeno basado en hemo de origen sintetico o una protefna portadora de oxfgeno basada en hemo de 45 origen natural modificada adecuada para realizar la funcion de la protefna de union a oxfgeno reversible que se desvela en el presente documento. La protefna esta disenada tfpicamente usando tecnologfas de ADN recombinante. Un derivado hemo es un portador de oxfgeno basado en hemo de origen natural tal como una protefna de union a oxfgeno, que incluye, por ejemplo, hemoglobina y mioglobina, u ortologos de origen natural y variantes de los mismos. En ciertos ejemplos ilustrativos, la protefna de union a oxfgeno reversible es hemoglobina. 50 La protefna de union a oxfgeno reversible tfpicamente experimenta cambios relativamente grandes en la saturacion de O2 con respecto pequenos cambios en la presion parcial de O2. Por ejemplo, en las aplicaciones de sensor transcutaneo, la protefna de oxfgeno reversible puede experimentar cambios relativamente grandes en la saturacion en presiones parciales de O2 hasta al menos, por ejemplo, de 1, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o el 10 %, de presiones parciales ilustrativas en ciertos tejidos subcutaneos. Por consiguiente, en los metodos proporcionados en el presente 55 documento el oxfgeno se transporta desde el entorno externo a la zona de reaccion de glucosa usando

hemoglobina, mioglobina o una hemo-protefna disenada por ingenierfa como la protefna de union a oxfgeno

reversible. En realizaciones ilustrativas, la protefna de union a oxfgeno reversible tiene una saturacion casi lineal a presiones de oxfgeno esperadas para la aplicacion del sensor. Por ejemplo, la protefna de union a oxfgeno

reversible puede tener una respuesta de saturacion casi lineal en presiones parciales de O2 entre el 0 y el 1, 2, 2,5,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o el 10 %, en sensores transcutaneos. En ciertos ejemplos particularmente ilustrativos, la protefna de union a oxfgeno reversible es hemoglobina a una concentracion de entre 1 y 25 g/dl, por ejemplo entre 5 y 10 g/dl, o en un ejemplo ilustrativo a 7-8 g/dl, e incluso mas particularmente, por ejemplo, a 7,5 g/dl. Se conocen variantes de hemoglobina dentro de y entre especies. Ademas, la hemoglobina o las hemo-protefnas disenadas por 5 ingenierfa (Winslow R.M., .MP4, a new nonvasoactive polyethylene glycol-hemoglobin conjugate. Artif Organs. 2004 Sep; 28(9): 800-6; Komatsu T, y col., Physicochemical characterization of cross-linked human albumina serica dimer and its synthetic heme hybrid as an oxygen carrier. Biochim Biophys Acta. 18 de noviembre de 2004; 1675 (1-3): 2131)) pueden disenarse y producirse usando enfoque, tales como tecnicas de ADN recombinante (Leon RG, y col., High-level production of recombinant sulfide-reactive hemoglobin I from Lucina pectinata in Escherichia coli High 10 yields of fully functional holoprotein synthesis in the BLi5 E. coli strain. Protein Expr Purif. 2004 Dec; 38(2): 184-195) que pueden tener propiedades de union a oxfgeno normales o alteradas que son ideales para los biosensores proporcionados en el presente documento, dependiendo de la aplicacion especffica del biosensor. Adicionalmente, la hemoglobina o hemoprotefna creada por ingenierfa puede modificarse para conseguir diferentes curvas de saturacion de oxfgeno adecuadas para la administracion o mejores propiedades de medicion para un sensor 15 transcutaneo que funciona a las tensiones de bajo oxfgeno fisiologico esperado. Los ejemplos de modificaciones incluyen el entrecruzamiento como parte del proceso para crear la matriz estabilizada con hemoglobina usando glutaraldehfdo u otros agentes para cambiar la p50 de la curva de insaturacion de hemoglobina. En el caso de la modificacion de glutaraldehfdo, el grado del cambio de p50 dependera de la fuente de hemoglobina (por ejemplo, humana o bovina), la relacion molar de glutaraldehfdo con respecto a hemoglobina y si se incluyen cofactores 20 adicionales durante el entrecruzamiento (Keipert, P.E., y col., Functional properties of a new crosslinked hemoglobin designed for use as a red cell substitute. Transfusion. 1989 Nov-Dec; 29(9): 768-73; y Eike, J.H., Effect of glutaraldehfdo concentration on the physical properties of polymerized hemoglobin-based oxygen carriers. Biotechnol Prog. 2004 Jul-Aug; 20(4): 1225-32). En ciertos aspectos, la region de transporte de oxfgeno incluye una serie de bandas, comprendiendo cada una, una diferente hemoprotefna creada por ingenierfa, mioglobina, variante de 25 hemoglobina, o hemoglobina, o una combinacion de las mismas, con una curva de saturacion de oxfgeno alterada, de tal forma que las protefnas de union a oxfgeno reversibles en cada banda tienen diferentes caracterfsticas de carga y/o descarga de oxfgeno. Tal diseno puede usarse para configurar el sensor de glucosa para una aplicacion particular.

30 Se entendera que aunque el sensor y los metodos proporcionados en el presente documento se ilustran usando la deteccion de glucosa, las ensenanzas en el presente documento pueden usarse en los sensores y los metodos tambien para detectar otros analitos. Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento metodos y dispositivos de sensores para medir un analito, donde el dispositivo incluye una region de difusion de oxfgeno que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible a una concentracion suficiente para transportar el oxfgeno de una 35 o mas superficies de entrada de oxfgeno de la region de difusion de oxfgeno a una zona de reaccion de analito que incluye una enzima oxidasa que cataliza la reaccion de oxfgeno con el analito. El dispositivo tfpicamente incluye una region de sensor para medir el analito, oxfgeno o un producto catalizado por la enzima oxidasa. El dispositivo en los ejemplos ilustrativos, mide el oxfgeno midiendo los cambios en la absorcion de la protefna de union a oxfgeno reversible (es decir, utiliza la protefna de union a oxfgeno reversible tanto como un transportador de oxfgeno como 40 una sonda de oxfgeno). Puede medirse virtualmente cualquier analito usando los sensores y los metodos de la invencion donde el oxfgeno puede usarse como un cofactor para una reaccion enzimatica que implica el analito, y el O2 no esta presente tras la finalizacion de la reaccion enzimatica. Ademas de la glucosa oxidasa, como se ilustra en el presente documento, otros analitos que pueden medirse incluyen galactosa, usando galactosa oxidasa, lactosa, usando lactosa oxidasa, peroxidos, usando peroxidasas, colesterol usando colesterol oxidasa, aminoacidos usando 45 aminoacido oxidasa, alcohol usando alcohol oxidasa, y acido lactico usando lactato oxidasa.

Las caracterfsticas de una protefna de union a oxfgeno reversible pueden analizarse con respecto a la protefna de union a oxfgeno reversible ilustrativa hemoglobina. Las caracterfsticas de carga y descarga no lineales de hemoglobina y mioglobina facilitan en gran medida el transporte de oxfgeno de la masa entera a traves de la region 50 de transporte de oxfgeno 001 y hasta la camara de reaccion a traves del inyector de oxfgeno 006. Las caracterfsticas de transporte de hemoglobina mueven el oxfgeno a traves de la region de transporte de oxfgeno 001 a las regiones de tension de oxfgeno bajo a una velocidad muy por encima de la difusion normal. Este transito extremadamente rapido acoplado con las caracterfsticas de carga y descarga unicas de la hemoglobina crean una distribucion espacialmente sustancialmente uniforme o auto-consistente que puede identificarse por el valor de referencia de 55 oxfgeno a traves del perfil de la region de transporte de oxfgeno 001 en la superficie del inyector 006. Adicionalmente, estas caracterfsticas de carga y descarga unicas regulan las variaciones en el suministro de oxfgeno que se transporta a traves de la region de transporte de oxfgeno 001. Un valor en la referencia deberfa corresponder con la misma distribucion de oxfgeno independientemente de la distribucion fuera de la primera superficie de la region de transporte de oxfgeno. Aquf "corresponder" pretende significar que un valor de referencia

codifica unicamente una distribucion de oxfgeno a traves del inyector. Aunque un campo o perfil de oxfgeno del inyector no espacialmente uniforme puede dar como resultado un campo de oxfgeno no monotonico en la zona de reaccion de glucosa que puede compensarse en una calibracion apropiada, un campo o perfil de oxfgeno del inyector espacialmente sustancialmente uniforme proporciona una calibracion de oxfgeno con respecto a glucosa 5 mas sencilla. Por lo tanto, la region de transporte de oxfgeno 001 proporciona un perfil de concentracion de oxfgeno sustancialmente amortiguado temporalmente con respecto a la dinamica del oxfgeno de masa entera en el lfmite 006 de la zona de reaccion de glucosa 002 y la region de transporte de oxfgeno 001. Esas caracterfsticas unicas permiten que el conducto 001 se extienda hasta el entorno de tejido de masa entera, uniendo de forma eficaz un suministro de oxfgeno de los capilares y las arteriolas a la region de reaccion 002 donde se necesita para la reaccion 10 oxidativa mediada enzimaticamente. El area de recogida de oxfgeno extensiva de la region de transporte de oxfgeno, 001 mueve el oxfgeno hasta el pequeno volumen de la region de reaccion 002 que suministra oxfgeno suficiente para la reaccion de la glucosa oxidasa. En este sentido, la region de transporte de oxfgeno 001 actua como una microcirculacion artificial que acopla la region de reaccion 002 a la microcirculacion del tejido.

15 El potencial conductor de oxfgeno de la region de transporte de oxfgeno 001 tambien mejora otra barrera clave en la deteccion subcutanea a corto plazo. Se han hecho numerosos intentos para fabricar dispositivos implantados por via subcutanea para medir la glucosa en los diabeticos. Sin embargo, los dispositivos experimentales han fracasado en ultima instancia debido a la falta de sensibilidad a la glucosa despues de la implantacion. La falta de sensibilidad se ha atribuido, entre otras cuestiones, al aislamiento del electrodo del biosensor por capas de tejido tipo cicatricial. La 20 escala y la composicion biocompatible del exterior de la region de transporte de oxfgeno 001 deben permitirla permanecer proximal a las arteriolas y numerosos capilares. Esto debe permitir que se siga transportando suficiente oxfgeno al sitio de deteccion, incluso si el dispositivo esta encapsulado. Por consiguiente, el sensor de glucosa implantable 100 de la presente invencion en ciertas realizaciones ilustrativas, puede contener una gran gama de disposiciones geometricas diferentes de los componentes de sensor principales que produciran un dispositivo 25 operativo. En ciertos aspectos, la geometrfa puede ser, por ejemplo, un cilindro de no mas de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 mm3 de volumen total. Por ejemplo, en realizaciones donde el sensor de glucosa implantable tiene forma cilfndrica, el diametro del sensor de glucosa implantable en ciertos aspectos no es mayor de 3,4 mm, 0,64 mm, o 0,31 mm. En ciertas realizaciones, el diametro del sensor de glucosa implantable es el diametro de una aguja hipodermica de calibre 18, 23, o 30. En una realizacion ilustrativa, el diametro puede ser tan pequeno 30 como de 0,030 mm y tan grande como de 0,31 o 0,64 mm donde el menor representa la implantacion de una unica sonda de fibra optica y el mayor representa haces de fibra optica implantados en una jeringa de aguja que varfa de calibre de 30 a 23. La longitud del sensor de glucosa implantable puede ser, por ejemplo, entre 1 mm y 100 mm, o en ciertos ejemplos ilustrativos preferidos, se encuentra entre 2 mm y 10 mm donde la longitud es una compensacion entre la recogida de oxfgeno y el confort.

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Por consiguiente, las longitudes de los diversos lfmites y regiones con el sensor proporcionado en el presente documento son lo suficientemente pequenas para permitir que el sensor tenga las dimensiones totales generales proporcionadas anteriormente. Por ejemplo, el inyector de oxfgeno 006 puede tener, por ejemplo, entre 0,05 y 10 mm, 0,1 y 1 mm, o entre 0,1 y 0,3 mm de longitud. La entrada de glucosa 007 tiene tfpicamente entre 0,0001 y 40 1 mm, o en ejemplos ilustrativos, entre 0,001 y 0,1 mm de longitud. La superficie de deteccion 008 puede tener, por ejemplo, entre 0,05 y 10 mm de longitud y, en ejemplos ilustrativos, tiene entre 0,1 y 0,3 mm de longitud. La relacion de la longitud del inyector de oxfgeno 006 con respecto a la longitud de la entrada de glucosa 7, tiene tfpicamente entre 1 y 1000 y, en una realizacion ilustrativa, tiene entre 5 y 100, o mas especfficamente entre 6 y 30. Sin embargo, se reconocera que los biosensores proporcionados en el presente documento son escalables y pueden 45 adoptar diversas formas. La entrada de glucosa es lo suficientemente pequena para asegurar que una subregion dentro de la region de reaccion 002 no tiene glucosa detectable. En ciertos aspectos, una longitud caracterfstica de la entrada de glucosa, definida como la rafz cuadrada de su area, no tiene mas de 1/2 de una longitud caracterfstica de la region de reaccion de glucosa donde la longitud caracterfstica se define como la distancia desde la entrada de glucosa al lfmite eficaz de la region de reaccion de glucosa en una direccion que apunta a lo largo de la superficie 50 normal de la entrada de glucosa. Con respecto a las relaciones de otras regiones del sensor de la presente invencion, la longitud del inyector de oxfgeno 006 puede ser, por ejemplo, aproximadamente identica, o identica a la longitud de la superficie de deteccion 008. La relacion del volumen de la region de transporte de oxfgeno 001 y el volumen de la region de reaccion 002 es tfpicamente al menos 2:1, y en aspectos ilustrativos es 5:1, 10:1, 100:1, 250:1, 500:1, o 1000:1. En realizaciones preferidas, las relaciones de al menos 5:1, y tanto como 200:1, pueden 55 implantarse donde 200:1 representa una region de reaccion de 0,050 mm de espesor 002 con una region de transporte de oxfgeno de 10 mm 001.

La region de transporte de oxfgeno 001 en ciertos ejemplos tiene un area en seccion trasversal de entre 0,005 y 1 mm2, o en una realizacion ilustrativa, es entre 0,015 y 0,08 mm2, las areas en seccion transversal del diametro

interno de la aguja de calibre 30 y 23 respectivamente, y la region de reaccion de glucosa 002 tiene tfpicamente un area en seccion transversal correspondiente a lo largo del eje de la region de transporte de oxfgeno 001, al igual que la region de deteccion 003, en ciertos aspectos. La region de deteccion en ciertos ejemplos, tiene un area en seccion transversal ligeramente reducido en comparacion con la region de transporte de oxfgeno. En aspectos donde la 5 entrada de glucosa 7 es un orificio circular, el diametro puede estar entre 1 um y 1 mm, pero se entendera que la longitud de la entrada de glucosa 7, independientemente de su forma puede ser tan grande como la distancia desde el inyector de oxfgeno 006 a la superficie de deteccion 008. La region de reaccion de glucosa 002 tiene tfpicamente un area en seccion transversal correspondiente a lo largo del eje de la entrada de glucosa 007 de entre aproximadamente 10 um y 1 mm, por ejemplo, entre 25 um y 250 um, o en ciertos ejemplos ilustrativos, 10 aproximadamente 100 um. Sin limitarse por la teorfa, se cree que las grandes relaciones entre las areas en seccion transversal a lo largo del eje de la region de transporte de oxfgeno 001 y a lo largo del eje de la entrada de glucosa 007 (y de la propia entrada de glucosa), explican al menos parte de la capacidad del sensor para operar en entornos de bajo oxfgeno.

15 Dentro de la region de reaccion 002, tambien denominada como una zona de reaccion o una camara de reaccion, se proporciona un medio para transportar rapidamente oxfgeno desde el lfmite de la region de transporte de oxfgeno (es decir, el inyector de oxfgeno) 006 hasta la region de reaccion y a los sitios catalfticos de las enzimas en la region de reaccion. Esto puede realizarse de nuevo empleando una protefna de union a oxfgeno reversible tal como hemoglobina, mioglobina, o una hemoprotefna creada por ingenierfa para disminuir la resistencia al transporte de 20 oxfgeno de la superficie del inyector de oxfgeno hasta los sitios catalfticos de la enzima glucosa oxidasa. Adicionalmente, la presencia de una protefna de union a oxfgeno reversible dentro de la region de reaccion tambien disminuira la capacidad de difusion de la glucosa, ayudando a regular la reaccion disminuyendo el lujo de glucosa por debajo del gradiente establecido en la region de reaccion 002, como se analiza en mas detalle a continuacion. El resultado neto es que la reaccion enzimatica sigue siendo sensible a los cambios en la concentracion de glucosa de 25 masa entera en un amplio intervalo de concentraciones de glucosa de masa entera, y que la reaccion acopla los cambios de masa entera en la concentracion de glucosa a los cambios en el campo de oxfgeno en la zona de reaccion.

En ciertos aspectos, la protefna de union a oxfgeno reversible dentro de la region de transporte de oxfgeno 001, y/o 30 la protefna de union a oxfgeno reversible y la glucosa oxidasa en la region de reaccion de glucosa 002 pueden situarse en una emulsion estabilizada para asegurar la alta disponibilidad de los portadores de oxfgeno a los sitios catalfticos de la enzima en la zona de reaccion. Por ejemplo, la emulsion estabilizada puede ser una matriz estabilizada.

35 Las ensenanzas en el presente documento con respecto a una region de transporte de oxfgeno 001 y una region de reaccion 002 de un biosensor 100, se aplicables mas generalmente a cualquier metodo o dispositivo para transportar rapidamente oxfgeno de una region de presion parcial de oxfgeno relativamente elevada a una region de presiones parciales inferiores, como se ilustra en los Ejemplos proporcionados en el presente documento. Esta aplicabilidad general es especialmente cierta para aspectos de la invencion donde la region de transporte de oxfgeno y/o la region 40 de reaccion son matrices estabilizadas. El transporte se produce tfpicamente sin conveccion. Por consiguiente, se proporciona en el presente documento en otra realizacion, una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada en la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada. La protefna de union a oxfgeno reversible esta estabilizada tfpicamente por toda la matriz. Sin embargo, como se indica en el presente documento, la concentracion de la protefna de union a oxfgeno reversible puede cambiar 45 dentro de la matriz.

La matriz estabilizada recoge el oxfgeno, estabiliza la dinamica del oxfgeno, y transporta rapidamente oxfgeno dentro de la matriz. Por ejemplo, la matriz estabilizada puede transportar oxfgeno desde una region de oxfgeno relativamente elevado que rodea una superficie de la matriz estabilizada, a una region de menor o nada de oxfgeno 50 sobre una segunda superficie. Ademas, la matriz estabilizada puede transportar oxfgeno a un sitio dentro de la matriz o yuxtapuesto a la matriz, donde se produce una reaccion en la que se consume el oxfgeno, como se ilustra por la region de reaccion 002 en los sensores de glucosa proporcionados en el presente documento. En realizaciones ilustrativas, la protefna de oxfgeno reversible, como se indica en el presente documento para otras realizaciones de la invencion, es hemoglobina, mioglobina, o una hemoprotefna creada por ingenierfa.

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La matriz de transporte de oxfgeno estabilizada puede adoptar virtualmente cualquier forma con la condicion de que al menos 1 superficie de la region de transporte de oxfgeno sea permeable a oxfgeno y una segunda superficie sea permeable a oxfgeno o el oxfgeno se consuma en una region dentro de la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada. Por ejemplo, la matriz puede ser una o una serie de laminas o cilindros.

La matriz de oxfgeno estabilizada puede incluir una diversidad de componentes ademas de la protefna de union a oxfgeno reversible, como se desvela en el presente documento con respecto a una region de transporte de oxfgeno 001 y una region de reaccion 002 de un sensor 100. Por ejemplo, la matriz estabilizada puede incluir una protefna 5 portadora para proteger la funcion de la protefna durante la estabilizacion de la matriz y durante el funcionamiento del sensor. La protefna portadora en ciertas realizaciones ilustrativas es albumina serica y/o gelatina. Se ha indicado que la adicion de la protefna portadora del 1 al 15 % en peso de la concentracion final protegera la funcion de la protefna (Pat. de Estados Unidos n.° 6.815.186), espacialmente para cargas enzimaticas relativamente bajas, tfpicamente igual a, o menor del, 70 % en la concentracion final. En ciertos aspectos, la carga puede ser tan alta 10 como de 15 g/l a 25 g/l a concentraciones finales. La estabilizacion de la matriz puede conseguirse, para un ejemplo no limitante, a traves del entrecruzamiento por al menos uno de los siguientes agentes: un aldehfdo, tal como glutaraldehfdo o formalina, una carbodiimida, un imidoester, un pirocarbonato, un epoxido o N-hidroxisuccinimida ester. En ciertos aspectos, la matriz estabilizada contiene la enzima catalasa o peroxidasas para disminuir los niveles de peroxido dentro de la matriz. En ciertos aspectos, la carga de catalasa puede ser de 1 a 20 unidades/ml 15 (vease, por ejemplo, formulaciones de glucosa oxidasa disponibles en Biozyme, Reino Unido) o de 100 a 1000 unidades/ml; y la Sol. Pat. Pub. de Estados Unidos n.° 2002/0006634). Ademas, la matriz de oxfgeno estabilizada puede incluir acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (PLA), poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), PLLA, poli(caprolactona) (PCL), poli(dioxanona) (PDS), o un material inhibidor de la capsula fibrosa que promueve la neovascularizacion, tal como politetrafluoroetileno (PTFE), politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), polipropileno, y 20 alcohol polivinflico (PVA). Estos componentes pueden usarse para estabilizar la protefna de union a oxfgeno reversible en la matriz de transporte de oxfgeno. La concentracion de protefna de union a oxfgeno reversible puede ser tan pequena como del 10 % en masa dentro del polfmero, o en ciertos ejemplos, usando polietilenglicol como el polfmero, en el orden de 5 a 200 partes de protefna de union a oxfgeno reversible con respecto al polfmero, y aun conservar sus caracterfsticas portadoras de oxfgeno (vease, por ejemplo, Wettstein y col., "Resuscitation with 25 polyethylene glycol-modified human hemoglobin improves microcirculatory blood flow and tissue oxygenation after hemorrhagic shock in awake hamsters", Crit Care Med 2003 Vol. 31, N.° 6; Moore, "Blood Substitutes: The Future Is NoW', J Am Coll Surg., Vol. 196, N.° 1, enero de 2003, y Pat. de Estados Unidos N.° 5.585.484). La matriz de oxfgeno estabilizada puede incluir silicio o puede revestirse con un revestimiento de silicio, caucho o un polfmero. Ademas, en ciertos aspectos, toda o una porcion de la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada puede 30 encapsularse por una membrana, tal como una membrana no natural hecha de, por ejemplo, un material hidrofobo, tal como silastic. En ciertos aspectos, la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada incluye una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada en la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada dentro de los poros de una membrana permeable. La membrana puede hacerse virtualmente de cualquier tipo de material de membrana, pero en ciertos aspectos, es una membrana biocompatible que puede implementarse en un animal, especialmente un 35 mamffero, tal como un ser humano. En ciertos aspectos, el material de membrana puede ser un material de origen natural tal como, pero sin limitacion, colageno, alginato, agarosa, derivados de acido hialuronico, quitosano, pegamento de fibrina, o un polfmero sintetico, tal como acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (PLA), poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), PLLA, poli(caprolactona) (PCL), poli(dioxanona) (PDS), o un material inhibidor de la capsula fibrosa que promueve la neovascularizacion tal como politetrafluoroetileno (PTFE), politetrafluoroetileno 40 expandido (ePTFE), polipropileno, y alcohol polivinflico (PVA).

En una realizacion relacionada se proporciona en el presente documento un metodo para transportar oxfgeno desde una primera area que tiene una concentracion de oxfgeno relativamente alta a una segunda area que tiene una concentracion de oxfgeno relativamente baja, que incluye poner en contacto el oxfgeno de la primera area, con una 45 primera superficie de una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada a traves de toda la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, y transportar oxfgeno lejos de la primera superficie de la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada a una segunda superficie de la matriz de transporte de oxfgeno, donde la segunda superficie de la matriz de transporte de oxfgeno entra en contacto con la segunda area. La matriz de transporte de oxfgeno reversible es un ejemplo de un medio de transporte de oxfgeno. El 50 transporte de oxfgeno desde una region de transporte de oxfgeno 001 a una region de reaccion 002 de un sensor 100, es un ejemplo ilustrativo de esta realizacion.

En otra realizacion relacionada mas, se proporciona en el presente documento un metodo para transportar oxfgeno desde una primera area que tiene oxfgeno hasta un area de reaccion, que incluye poner en contacto el oxfgeno de la 55 primera area, con una primera superficie de una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada que incluye una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada a traves de toda la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, y transportar el oxfgeno lejos de la primera superficie al area de reaccion, donde el oxfgeno se consume en una reaccion en el area de reaccion. El transporte del oxfgeno dentro de una region de reaccion 002 de un sensor 100 desde un sitio de concentracion de oxfgeno relativamente alta lejos de una entrada de glucosa a un sitio de glucosa

mas cercano a la entrada de glucosa, es un ejemplo ilustrativo de esta realizacion. Los metodos de la presente invencion pueden usarse para transportar oxfgeno a traves de distancias de entre 001 mm y 20 mm, por ejemplo, entre ,01 mm y 0,5 mm.

5 Las matrices de oxfgeno estabilizadas proporcionan numerosas funciones, incluyendo no solo el rapido transporte de oxfgeno en un sensor implantable, sino tambien el rapido transporte de oxfgeno a un tejido artificial. Como tal, las matrices de transporte de oxfgeno estabilizadas proporcionadas en el presente documento se pueden usar como sistemas de suministro de oxfgeno para los organos artificiales o trasplantes de celulas/tejido. Las matrices de oxfgeno estabilizadas son importantes para lograr respuestas deseadas del trasplante, tales como, pero sin 10 limitacion, viabilidad, diferenciacion, y funcion, que depende de la disponibilidad de oxfgeno. De hecho, una o mas matrices de transporte de oxfgeno estabilizadas pueden ser parte de una microvasculatura artificial, un tipo especffico de region de transporte de oxfgeno utilizado para recoger el oxfgeno de las regiones de presiones parciales elevadas distales de un implante y descargar el oxfgeno al implante donde la presion parcial de oxfgeno es inferior. En estas realizaciones, las matrices de transporte de oxfgeno estabilizadas pueden formar un conjunto en 15 forma de arana de regiones de transporte de oxfgeno o una malla reticulada de matrices, con el fin de maximizar el area de superficie de la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada que entra en contacto con las regiones de tejido que tienen oxfgeno.

Tambien pueden usarse microvasculaturas artificiales compuestas por matrices de transporte de oxfgeno 20 estabilizadas que se proporcionan en el presente documento para suministrar oxfgeno a los tejidos endogenos, para un ejemplo no limitante, en una patologfa, en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular, en la cicatrizacion de heridas, en el tratamiento de la hipoxia cerebral o la encefalopatfa hipoxica, o en la reinsercion de miembros despues de la amputacion. Otras aplicaciones incluyen el suministro de oxfgeno a tumores para evitar la radio y quimiorresistencia mediada por hipoxia, el tratamiento de afecciones medicas relacionadas con la hipoxia, tales 25 como artritis reumatoide y otros tipos de artritis, enfermedad intestinal inflamatoria cronica, enfermedades de la piel, tal como el eccema y psoriasis, vasculopatfa inflamatoria diabetica y la neuropatfa diabetica, y la degeneracion del tendon.

Los biosensores de la presente invencion, en ciertos aspectos ilustrativos, utilizan el descubrimiento de que un 30 metodo optico se puede acoplar con un mediador selectivo, tal como glucosa oxidasa, para desarrollar un sensor de glucosa que operara con precision en los tejidos subcutaneos. El componente detector de oxfgeno del biosensor se consigue mediante la interrogacion del campo de oxfgeno dentro de la region de reaccion 002. Esto se logra electrica u opticamente, en el que los volumenes de la region de reaccion 002 unidos por el lfmite de la region de transporte de oxfgeno 006 y el lfmite de deteccion 008 se muestrean por una o mas sondas de deteccion. La figura 35 5B ilustra la transformacion del perfil de oxfgeno de un perfil relativamente uniforme, como se muestra en la figura 5A en ausencia de glucosa, en un perfil sustancialmente no uniforme tras la entrada de la glucosa a traves de la entrada Como se ilustra en la figura, la glucosa en la entrada reacciona con el oxfgeno, que se media por la enzima glucosa oxidasa, por lo que el oxfgeno se consume. El consumo de oxfgeno determina un perfil de oxfgeno dentro de la region de reaccion que es detectable dentro de la region de deteccion, que depende de la concentracion de 40 glucosa, la carga de la enzima, y el flujo de oxfgeno en la superficie del inyector (para cualquier geometrfa de dispositivo dado de esta invencion). Por el diseno, el perfil de oxfgeno distal a la entrada de la glucosa es sensible a la concentracion de oxfgeno del inyector y no a la concentracion de glucosa, y se puede usar como una entrada para mapear el perfil de oxfgeno a una concentracion de glucosa determinada. Las sondas detectoras, en aspectos ilustrativos, son una serie de sondas que no consumen oxfgeno sustancialmente que, en ciertos aspectos, 45 consumiran menos del 10 % del oxfgeno dentro de la region de deteccion por tiempo caracterfstico en la que el tiempo caracterfstico es el tiempo de subida del 95 % para la concentracion de oxfgeno dentro de la region de deteccion despues de un cambio de etapa de la concentracion de oxfgeno en su lfmite con la region de reaccion, o en ciertos aspectos, con la superficie de inyector. En otros aspectos, el tiempo caracterfstico puede definirse como el tiempo de subida del 95 % de la concentracion de oxfgeno dentro de la region de deteccion despues de un cambio 50 de etapa de la concentracion de glucosa en la entrada de la glucosa. Las sondas detectoras son tfpicamente conductos de luz que recogen la luz de un extremo y la gufan de manera eficiente a un segundo extremo. Los emisores son sondas detectoras que emiten la luz que interactua con un medio de sensible a oxfgeno dentro de la zona de reaccion 002. Los receptores recogen la luz que hace contacto con los medios sensibles al oxfgeno, para su analisis. Por lo tanto, los emisores y receptores forman un medio de deteccion. Por ejemplo, las sondas detectoras 55 pueden ser fibras de fibra optica, haces de fibra optica, o gufas de luz, incluyendo gufas de luz lfquidas. Sin embargo, las sondas detectoras en ciertos aspectos, son sustancialmente electrodos que no consumen oxfgeno sustancialmente que miden el oxfgeno o un producto de la reaccion a traves de un sistema de deteccion de polarografico. En otros aspectos, se utilizan una o mas sondas amperimetricas como sondas detectoras para medir el oxfgeno o un producto de la reaccion de oxfgeno y un analito tal como glucosa, utilizando un metodo de

amperimetrico. El metodo amperimetrico tfpicamente no consume oxfgeno, pero consume un producto de la reaccion enzimatica entre el analito diana y el oxfgeno. En ciertos aspectos, la una o mas sondas detectoras son electrodos de peroxido. El peroxido es un producto de una reaccion catalizada por glucosa oxidasa. Los electrodos de peroxido se pueden usar junto con una referencia de oxfgeno que podrfa ser polarografica u optica o cualquier sonda que 5 sustancialmente no consume oxfgeno. La profundidad de la interrogacion se puede ajustar. Ademas, en los ejemplos ilustrativos, la region esta espacialmente muestreada con mas de una trayectoria de luz para proporcionar una mayor precision en el control de cambios en el campo de oxfgeno de la zona de reaccion. Pueden detectarse oxfgeno, glucosa, o un producto de la reaccion de oxfgeno y glucosa.

10 Dado que una protefna de union a oxfgeno reversible, tal como hemoglobina, esta presente por toda la region de reaccion 002, puede servir tanto como un transportador de oxfgeno como una sonda de oxfgeno. En otras palabras, tanto la primera protefna de union a oxfgeno reversible, un transportador de oxfgeno ejemplar, como la segunda protefna de union a oxfgeno reversible, una sonda de oxfgeno ejemplar, pueden ser hemoglobina. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la sonda de oxfgeno es una molecula opticamente sensible, por ejemplo un hemoprotefna creada 15 por ingenierfa o un derivado hemo, tal como hemoglobina. En otros aspectos, la sonda de oxfgeno es una sonda optica, tal como un colorante, que en funcion del tinte especffico utilizado, puede consumir oxfgeno. Los medios opticos de medicion de la saturacion de oxfgeno de la hemoglobina estan bien establecidos, lo que permite que la concentracion de oxfgeno se mida opticamente de una manera sensible y selectiva. Esto proporciona mediciones de la concentracion de oxfgeno, a traves de, y si es necesario, fuera de la zona de reaccion de la enzima. Por 20 consiguiente, en ciertos ejemplos ilustrativos, las sondas emiten y reciben luz a una longitud de onda de absorcion de hemoglobina sensible a oxfgeno, o una longitud de onda de absorcion sensible al oxfgeno de otra protefna de union a oxfgeno reversible. Una longitud de onda de absorcion de hemoglobina sensible al oxfgeno es una longitud de onda que pertenece al subconjunto de las longitudes de onda del espectro de absorcion de la hemoglobina para el que la absorcion es una funcion de la saturacion de oxfgeno de la hemoglobina. Cuando se usa hemoglobina 25 como la protefna de union a oxfgeno reversible, las sondas detectoras emiten y reciben luz a entre 600 y 800 nm. Las longitudes de onda mayores de 800 nm tambien tienen las propiedades favorables de baja absorcion y de los cambios en la absorcion con la oxigenacion. Las longitudes de onda mas cortas de 600 nm tienen una absorcion muy alta y son menos adecuadas para medir la oxigenacion debido a un caudal de luz deficiente. Para el dispositivo ilustrado en los Ejemplos en el presente documento, se escogieron 635 nm por su bajo coste y ubicuidad en la 30 fabricacion y la industria de los chips de silicio, la optoelectronica y circuitos integrados. Otras dos longitudes de onda de trabajo incluyen, por ejemplo, 660 nm o 905 nm, que se utilizan comunmente para medir la oxigenacion de la hemoglobina. Puede usarse una segunda longitud de onda, ademas de una longitud de onda primaria para mejorar la estabilidad de calibracion. En particular, la longitud de onda isobestica de la hemoglobina, 805 nm, se puede utilizar para proporcionar una medicion independiente de la oxigenacion que se realiza por y proporciona una 35 medida de la cantidad de hemoglobina encontrada en la trayectoria de la luz.

Las cuestiones de la selectividad se superan por metodos de biodeteccion y los dispositivos biosensores proporcionados en el presente documento, cuando se toma una medicion de fondo de oxfgeno en una region en el sensor de glucosa que esta distante de un sitio 007 donde la glucosa entra en el sensor, pero que tiene una 40 concentracion de oxfgeno que es similar a la inicialmente presente en el sitio donde la glucosa entra en el dispositivo. Por consiguiente, para tratar adicionalmente el tema de la sensibilidad y el rango dinamico de deteccion, se disenan tres superficies 006, 007, y 008 de la region de reaccion 002 para crear un gradiente de glucosa a lo largo del lfmite de deteccion 008, que tambien se crea por la muy elevada normalizacion espacial lateral del oxfgeno de la region de transporte de oxfgeno. Por consiguiente, en un punto a lo largo de un lfmite de deteccion 008 en la 45 zona de reaccion, toda la glucosa medible se ha convertido en producto, mientras que en el lfmite de entrada de la glucosa 007, la concentracion de glucosa es mayor. Este diseno hace que la glucosa se extraiga por debajo de un gradiente de concentracion desde el lfmite de entrada de la glucosa 007 hacia el centro de la camara de reaccion. En consecuencia, existe un gradiente de oxfgeno en la camara de reaccion, ya que se consume junto con la glucosa por la glucosa oxidasa. Cuando este campo de oxfgeno es espacialmente interrogado por los elementos de 50 deteccion opticos, el resultado es un perfil que depende de la concentracion de glucosa de masa entera. El resultado es que la reaccion enzimatica sigue siendo sensible a los cambios en la concentracion de glucosa de masa entera en un amplio intervalo de concentraciones de glucosa de masa entera, y esta reaccion acopla los cambios de masa entera en la concentracion de glucosa a los cambios en el campo de oxfgeno en la zona de reaccion.

55 La composicion de la region de reaccion 002 esta disenada para contener suficiente glucosa oxidasa y la protefna de union a oxfgeno reversible de manera que la glucosa se mueva de la entrada de la glucosa 007 a traves de la region de reaccion 002. Su concentracion se reduce de tal forma que en un punto a lo largo de la zona de reaccion 002 lejos de la entrada de la glucosa 007, la concentracion de glucosa se reduce a un nivel que no reduce sensiblemente la concentracion de oxfgeno, incluso en presencia de glucosa oxidasa. La region de referencia 029 es la region

dentro de la region de reaccion 007 donde la concentracion de glucosa es suficientemente baja a fin de no reducir sensiblemente la concentracion de oxfgeno en la region de referencia 029. El inicio exacto de la region de referencia 029 dentro de la region de reaccion 002 depende de la velocidad de reaccion de la glucosa cerca de la entrada de glucosa 007, los que configurara a que profundidad se extiende el gradiente de oxfgeno. Esto se controla por el 5 diseno a traves de la carga de glucosa oxidasa, la concentracion de protefna de union a oxfgeno reversible, el tamano de la entrada de la glucosa 007, el area de la zona de reaccion 002, y la relacion del area de superficie del inyector de oxfgeno 006, con respecto a la entrada de la glucosa 007. Por lo tanto, el aspecto de medicion de oxfgeno de referencia de la presente invencion es ajustable y escalable. En ciertos aspectos, la concentracion de una enzima en la region de reaccion 002, y la concentracion de la protefna de union a oxfgeno reversible en la region 10 de reaccion 002 se ajustan para proporcionar un gradiente de oxfgeno sensible a analito cerca de la entrada 007 de tal forma que el intervalo dinamico deseado de las concentraciones de analito puede medirse, y para proporcionar una concentracion de referencia de insensible a analito distal a la entrada. La region de referencia es al menos lo suficientemente grande como para incluir una region de la region de reaccion 007 interrogada por uno o mas emisores de referencia y/o uno o mas detectores de referencia. Una region de referencia 029 se encuentra dentro de 15 la region de reaccion 002. La region de referencia 029, por ejemplo, puede extenderse en ciertos aspectos, desde el centro de la region de reaccion 007 con respecto a un plano que se extiende desde la entrada de la glucosa 007, a un lfmite distal 027 de la region de referencia, y puede extenderse a traves del lfmite distal 027. En ciertos aspectos, por ejemplo, la region de referencia puede comenzar a aproximadamente 200 micrometres o menos de la entrada de la glucosa.

20

Una o mas sondas detectoras de referencia 028, tal como uno o mas haces de fibra optica emisores de referencia, pueden emitir luz en la region de referencia 029. Por ejemplo, las sondas de referencia pueden estar situadas al menos 1/2, 2/3, o 4/5 de la longitud total de la zona de reaccion de la entrada de la glucosa. En ciertas realizaciones, los 1, 2, 3, 4 o 5 haces de fibra optica mas alejados o pares adyacentes de haces de fibra optica, en una serie de 25 haces de fibra optica emisores, pueden ser el haz de fibra optica emisor de referencia. Por lo tanto, la luz puede ser emitida desde uno o mas haces de fibra optica de referencia para excitar una sonda de union a oxfgeno, tal como la hemoglobina, y la absorcion o emision de luz de la sonda de union a oxfgeno puede ser detectada por uno o mas haces de fibra optica del detector. Esta disponibilidad de la medicion de fondo para el oxfgeno dentro de la zona de reaccion es util, ya que proporciona una medicion de fondo de gran relevancia de la disponibilidad de oxfgeno a la 30 enzima sin alterar la reaccion que se produce en la zona de reaccion. La medicion de referencia se puede utilizar para determinar las concentraciones absolutas o relativas de analitos, y puede proporcionar una medida que puede utilizarse para mapear un perfil de oxfgeno en la camara de reaccion.

En ciertas realizaciones ilustrativas, los emisores 410 y/o los receptores 415 son fibras de fibra optica. En una 35 implementacion de este diseno, el lfmite de deteccion 008 es el extremo de un haz de fibra optica. La superficie resultante satisface el requisito de una condicion de lfmite sin flujo. El diametro del haz de fibra optica puede estar, por ejemplo, entre 100 um y 300 um. En ciertos aspectos, el receptor, a veces denominado como un optodo receptor, o el emisor, a veces denominado como un optodo emisor, es una fibra de fibra optica conformada. Tfpicamente, el sensor incluye al menos 2 receptores y/o emisores. Esto permite el muestreo espacial de la zona de 40 reaccion 002 desvelada en el presente documento, que se puede realizar utilizando mas de un receptor, mas de un emisor, o mas de un receptor y emisor. En ciertos aspectos, el receptor es un receptor optico electronico miniaturizado. Las sondas detectoras, tales como las fibras de fibra optica o haces de fibras de fibra optica, pueden revestirse con una molecula de bioadhesivo que aumenta la adhesion de las biomoleculas a la fibra o fibras. Por ejemplo, las sondas detectoras se pueden revestir con polilisina. La molecula de bioadhesivo sirve para aumentar la 45 adhesion de la matriz de la region de reaccion 002 a la sonda detectora. En ciertos ejemplos, el emisor y/o el detector son electronica miniaturizada alojada dentro de una carcasa del sensor, en cuyo caso no se utilizan fibras opticas. La ffsica de la medicion para estos ejemplos es la misma que cuando se usa fibra optica, pero el metodo de interrogacion podrfa cambiar, como se entendera. En un aspecto, pueden usarse haces de fibras fusionadas (tambien denominados conductos de formacion de imagenes). Por ejemplo, los haces de fibras fundidas que tienen 50 un diametro exterior de 50 um, pero contienen una matriz de fibras fundidas dentro de este, cada una, por ejemplo, de 10 um de diametro. En este aspecto, la region de reaccion puede muestrearse con una resolucion de 10 um o menos.

En un sensor de glucosa ilustrativo que utiliza fibra de fibra optica, un tubo de membrana de micro-poros hueco 55 biocompatible, tal como una membrana de fibras huecas microporosas 11 permeable a la glucosa rodea la punta del haz de fibras opticas y se extiende mas alla del haz de fibras opticas. La membrana de fibra hueca de microporos 11 cubre el lfmite de entrada de la glucosa 007 (es decir, la entrada de glucosa). Despues, la camara de reaccion 002 se forma mediante la colocacion de una mezcla de glucosa oxidasa, albumina serica bovina, y glucosa, y la hemoglobina oxigenada en el interior de la membrana de de microfibra hueca 11 y en la superficie del haz de fibra

optica 008. La mezcla se llena hasta un espesor de 50 um y a continuacion se entrecruza usando glutaraldehfdo. A continuacion, se anade de silicona lfquida de calidad medica a la hemoglobina en una cantidad suficiente para formar una suspension que llenara la membrana de microfibra hueca 11 creando la region de transporte de oxfgeno 001 y poniendo en contacto la superficie expuesta de la camara de reaccion 002 para formar un lfmite 006.

5

Se produce entonces la deteccion en este sensor de glucosa ilustrativo dirigiendo la luz laser a traves de subregiones del haz de fibra optica para interrogar el campo de oxfgeno de la camara de reaccion mediante el control de la saturacion de oxfgeno de la hemoglobina. Esta luz se refleja a continuacion en el inyector de oxfgeno 006 de vuelta a traves del haz de fibra optica y se mide por un fotodiodo.

10

En ciertos ejemplos ilustrativos, tal como el sensor de glucosa ilustrado en la figura 3, la figura 4, y el Ejemplo 2, una matriz de fibras de fibra optica se utilizan como los emisores 410 para emitir luz hacia un haz circular de 1/2 de fibras de fibra optica, los receptores 415. La matriz de fibras de fibra optica del emisor 410 se puede formar en un bucle de tal forma que la luz emitida desde el extremo de las fibras de fibra optica emisoras 410 se desplaza en una segunda 15 direccion 478 que es sustancialmente opuesta, u opuesta, a la luz que entra en las fibras de fibra optica del emisor en una primera direccion 475 producida por una fuente de luz 490. Por lo tanto, en estos aspectos, los emisores y los receptores pueden entrar en el sensor de glucosa 400 a traves de un primer extremo 482 del sensor de glucosa 400. Este diseno lo hace mucho mas conveniente para conectar el sensor de glucosa a una fuente de luz 490, el fotodetector 495, y/o la unidad de procesamiento de senales 498. Ademas, este diseno mejora la relacion senal- 20 ruido del dispositivo sobre una que se basa en mediciones de dispersion, reflexion, absorcion u otros fenomenos opticos en los que la luz se emite y se detecta a partir de/mediante el mismo haz. Puesto que las fibras de fibra optica del emisor se alinean facilmente con las fibras de fibra optica del receptor, la cantidad de luz recogida puede ser de ordenes de magnitud mayores. El haz de fibra optica del emisor y el haz de fibra optica del receptor puede ser un haz circular, 1/2 de haz circular, o una matriz de lado a lado, pero en los ejemplos ilustrativos, el haz emisor es 25 una matriz de lado a lado y el haz receptor es un haz de fibras circular o de 1/2 cfrculo.

En otra realizacion, se proporciona en el presente documento un espectrometro que comprende una fuente de luz, un fotodetector, una fibra de fibra optica de emisor o un haz de fibra optica de emisor de fibras, para emitir luz desde la fuente de luz a una region de deteccion, y una fibra de fibra optica del receptor, o un haz de fibra optica de 30 receptor de fibras, para recibir la luz emitida por la fibra optica del emisor y transmitir la luz al fotodetector, donde la fibra de fibra optica del emisor forma un bucle de tal forma que la luz que se emite desde la fibra de fibra optica del emisor viaja en una segunda direccion que es sustancialmente opuesta, u opuesta, a la luz producida por una fuente de luz que entra en las fibras de fibra optica del emisor en una primera direccion. Como se comprendera, muchas de las ensenanzas proporcionadas en el presente documento dirigidas a la region de deteccion de un biosensor se 35 aplican a la region de deteccion del espectrometro de la presente invencion. De hecho, se entendera que un sensor de acuerdo con la presente invencion utiliza un espectrometro de la presente invencion para su deteccion y funciones de medicion de analitos. Por ejemplo, en ciertos aspectos del espectrometro, asf como en los aspectos de un biosensor de la presente invencion, tal como un sensor de glucosa, la fibra de la fibra optica del emisor y la fibra de la fibra optica del receptor pueden introducirse en el microespectrometro a traves de un primer extremo. En una 40 realizacion relacionada, se proporciona en el presente documento un metodo para analizar opticamente una muestra mediante la transmision de luz de una fuente de luz a una fibra de fibra optica del emisor a traves de una muestra hasta una fibra de fibra optica del receptor en comunicacion optica con la fibra de fibra optica del emisor, donde la luz viaja de la fuente de luz a traves de un bucle en la fibra de fibra optica del emisor, o haz de fibras de fibra optica, de tal forma que la luz que sale de las fibras opticas del emisor viaja en una segunda direccion que es 45 sustancialmente opuesta, o contraria, a la luz producida por una luz fuente que entra en las fibras opticas del emisor en una primera direccion. Por lo tanto, en estos aspectos, la luz puede entrar y salir del espectrometro desde un primer extremo, que, combinado con el pequeno tamano del dispositivo, simplifica y mejora los posibles usos de un espectrometro proporcionado en el presente documento.

50 Puede usarse practicamente cualquier fuente de luz y fotodetector para el espectrometro o sensor de la presente invencion, tal como un sensor de glucosa. La fuente de luz puede ser de banda amplia o estrecha en el espectro de luz y puede ser de entre una seleccion de multiples bandas disponibles para la fibra o fibras de fibra optica del emisor. En ciertos aspectos, la fuente de luz es una fuente de luz laser, un LED, una bombilla incandescente, una lampara de arco, y en las realizaciones ilustrativas, la fuente de luz es un diodo laser. Las fibras de fibra optica del 55 emisor se pueden conectar a optica u optoelectronica interna o externa para controlar la longitud de onda, la intensidad, la polarizacion, el ancho de pulso, u otras caracterfsticas opticas de la luz. La fibra receptora se puede conectar a optica u optoelectronica interna o externa adicional para medir la intensidad, la polarizacion, la decadencia fluorescente u otras propiedades opticas en bandas estrechas o anchas del espectro de luz. Se entendera que aunque la invencion se ilustra en el presente documento por el uso de una fuente de luz y un

fotodetector, pueden usarse otros tipos de fuentes de energfa y detectores, respectivamente.

En un esquema de deteccion alternativa, un colorante sensible al oxfgeno se puede colocar en el lfmite de deteccion 008 de un biosensor o espectrometro que se proporciona en el presente documento. El colorante puede sondarse 5 despues opticamente para controlar el campo de oxfgeno y evaluar la concentracion de glucosa.

El detector 495, la fuente de luz 490, y la unidad de procesamiento de senales 498 estan conectados a un extremo del biosensor o espectrometro que se proporciona en el presente documento. En algunos ejemplos ilustrativos, el detector 495, la fuente de luz 490, y la unidad de procesamiento de senales 498 estan alojados dentro del mismo 10 conjunto. Para los sensores de glucosa proporcionados en el presente documento, tfpicamente sondas de los sensores, o tubos finos o cables u otros revestimientos que albergan las sondas, pasan a traves de la piel y se conectan a un alojamiento fuera de la piel que incluye el detector 495, la fuente de luz 490, la unidad de procesamiento de senal 498 y, en el caso de electronica internalizada, electronica de soporte. Por consiguiente, en estos ejemplos ilustrativos, el dispositivo es un dispositivo transdermico. En ciertos aspectos de un dispositivo 15 transdermico, una unidad no desechable externa a la piel se conectoriza para conectarse con un sensor de tipo aguja implantable desechable conectorizado en su extremo posterior. En tal escenario, las dos unidades estan conectadas entre si de tal manera que, en un ejemplo ilustrativo, las fuentes de luz y los fotodetectores dentro de la unidad no desechable estan alineados, a traves de la conexion, con gufas de luz alojadas en el sensor de tipo aguja desechable que terminan apropiadamente cerca o adyacentes a la zona de reaccion de la glucosa dentro del 20 implante desechable. La unidad no desechable gestiona la sincronizacion de las mediciones, el analisis de datos, la fuente de alimentacion, la comunicacion con el paciente, etc., que la unidad desechable aloja la sonda detectora.

En ciertos aspectos ilustrativos, como se ilustra en el Ejemplo 2, el muestreo espacial de la region de reaccion se consigue mediante la activacion de ciertas fibras emisoras en diferentes momentos. Por ejemplo, las fibras emisoras 25 individuales 412, pares adyacentes de fibras emisoras, o trios adyacentes de fibras dentro de un conjunto emisor 410 pueden activarse y desactivarse en orden del mas cercano o el mas lejano de la entrada de la glucosa 7, al extremo opuesto. En estos aspectos, puede usarse un unico fotodetector 495 para medir la luz en cada punto de tiempo en el que un par de conjuntos emisores 410 se enciende. Estas mediciones se pueden utilizar para volver a crear el contenido de oxfgeno y glucosa espacial de la zona de reaccion 002, y proporcionar un aumento sustancial 30 de la relacion senal-ruido sobre aspectos donde todas las fibras emisoras se encienden simultaneamente.

En ciertos aspectos, debido a que la reduccion de la glucosa da como resultado peroxido, los tejidos circundantes pueden protegerse de cualquier secrecion del sensor. Esto se puede lograr mediante la reduccion del peroxido en agua y oxfgeno en el espacio que rodea inmediatamente la camara de reaccion a traves de la reaccion enzimatica 35 de peroxido con la catalasa.

Para evitar la deriva en el proceso de deteccion de oxfgeno, pueden anadirse agentes (por ejemplo, catalasa, deshidrogenasa) para evitar que cualquier radical libre que se cree durante la interrogacion optica degrade la emulsion de la hemoglobina. Uno de dichos agentes es albumina serica sangufnea, que tambien se puede utilizar 40 como protefnas portadoras solubles para la reticulacion de la glucosa oxidasa. La enzima glucosa oxidasa se reticula con la albumina serica bovina para estabilizar la actividad enzimatica durante el perfodo de control. En ciertos aspectos, la protefna portadora soluble puede ser albumina serica bovina, albumina serica humana y/o gelatina. A concentraciones de glucosa oxidasa (en el orden del 70 % o mas), puede ser necesario anadir las protefnas portadoras solubles para formar un hidrogel (vease, por ejemplo, Clark, Pat. de Estados Unidos N.° 6.815.186). 45 Como un metodo general de acuerdo con la presente invencion, pueden usarse concentraciones de albumina iniciales de 15 g/l a 25 g/l en la formacion de la matriz o el hidrogel. Este valor se basa en el intervalo de albumina humana normal que es 35-47 g/l, dividido por dos (suponiendo un hematocrito del 50 %) (datos de la web en hoslink.com/LabResults/refranges.htm).

50 Los sensores de glucosa proporcionados en el presente documento pueden calibrarse antes de la implantacion exponiendolos a concentraciones de oxfgeno de masa entera del 3 % al 7 % y de concentraciones de glucosa de 30 mg/dl a 500 mg/dl. Los perfiles individuales controlados se usan entonces para cuantificar con precision las mediciones de glucosa desconocidas en presencia de tensiones de oxfgeno de masa entera variables.

55 Los siguientes pretenden ilustrar pero no limitar la invencion.

EJEMPLO 1

ANALISIS DE LA CAPACIDAD DE CONDUCCION DE OXIGENO DE LA HEMOGLOBINA

El siguiente ejemplo ilustra la capacidad de conducir oxfgeno de la hemoglobina y la funcionalidad prevista de la protefna de union a oxfgeno reversible. Se preparo una pelfcula de la hemoglobina como se indica a continuacion. Se extrajo sangre humana con un dispositivo de puncion en el dedo. Una gran gota de sangre se deposito en un 5 extremo de un portaobjetos de vidrio de microscopio rectangular. Se creo un frotis de sangre de 1/8 pulgadas por 1 1/2 pulgadas de dimension deslizando una cubierta de vidrio de microscopio de la gota de sangre, a traves de un portaobjetos de vidrio para crear una fina pelfcula de sangre por el portaobjetos de vidrio. A continuacion, la portaobjetos de vidrio se cubrio de celofan dejando aproximadamente 6,35 mm (1/4 pulgada) del frotis de de sangre expuesto en el eje largo. Un cubreobjetos de vidrio se coloco en el celofan para asegurar un buen sellado. Esta 10 configuracion garantiza la ausencia de lfmites de flujo de oxfgeno en todas las superficies y los bordes del frotis de sangre, a excepcion de los 6,35 mm expuestos (1/4 de pulgada) al final. Un haz de laser de diodo se dirigio a traves del portaobjetos, el frotis de sangre, el celofan, y la cubierta de vidrio en un punto de 2,54 cm (1 pulgada) de los lfmites expuestos. Luz que sale de la muestra se midio por un fotodiodo. La tension de fotodiodo, que es proporcional a luz recogida se controlo con el tiempo antes, durante y despues de cambio de las concentraciones de 15 oxfgeno en el lfmite expuesto.

La senal de la figura 2 representa el cambio de la absorcion de la hemoglobina a 635 nm de luz laser. Esta figura muestra la respuesta del fotodiodo primero para la transicion de aire ambiental en el lfmite con respecto a una mezcla de oxfgeno al 5 %, gas nitrogeno al 95 % (flecha A), y despues para la transicion de esa mezcla de gas de 20 nuevo al aire ambiental (flecha B). Como se puede ver, la tension de fotodiodo cambia solo segundos despues del cambio de la condicion lfmite: Por lo tanto, una cantidad significativa de oxfgeno se movio 1 pulgada en cuestion de segundos, una velocidad mucho mas alla de la esperada por difusion. Este experimento es fundamentalmente identico al escenario el transporte de oxfgeno en el sensor implantado en el cuerpo; la region de transporte de oxfgeno sera proximal a las arteriolas y capilares de alta tension de oxfgeno y se acoplara a la zona de reaccion 25 donde se consumira el oxfgeno. Este experimento demuestra que el oxfgeno del cuerpo se puede dirigir rapidamente al lugar de la reaccion enzimatica donde se necesita.

EJEMPLO 2

30 SENSOR DE GLUCOSA IMPLANTABLE ILUSTRATIVO

Este Ejemplo desvela ciertas caracterfsticas de un sensor de glucosa ilustrativo 400 de la presente invencion, como se ilustra en la figura 3 y la figura 4, e ilustra un metodo para fabricar el sensor de glucosa ilustrativo 400. En el sensor de glucosa ilustrativo 400 proporcionado en este ejemplo e ilustrado en la figura 3, la fuente de luz electronica 35 490 y el fotodetector 495 se comunican a traves de una serie de haces de fibra optica 410, 415 con el sensor de la glucosa ilustrativo 400. En el metodo utilizado para crear el sensor de glucosa 400, una matriz de emisores individuales de fibra optica 410 se doblo en forma de gancho de manera que la luz que emanaba de la red de emisores 410 viajase a traves de la zona de reaccion 402 y se recogiera por un haz de fibra optica de deteccion 415 (es decir, un conjunto de receptores de fibra optica). En este sensor de glucosa ilustrativo 400, todo el extremo 40 posterior del haz de deteccion 415 se acoplo a un fotodetector de tipo fotodiodo 495.

Durante el uso del sensor de glucosa 400, se realizo un muestreo espacial de la zona de reaccion 402 cambiando el patron de emision por debajo de la matriz de emision 410. En un metodo ejemplar, pares adyacentes de fibras emisoras dentro de la matriz 410 se encendieron en orden del mas cercano al lfmite de la entrada de glucosa (es 45 decir, entrada de glucosa) 407 hacia dentro, hacia la region de referencia de oxfgeno donde la region de referencia de oxfgeno esta al menos tan lejos de la entrada de la glucosa como la distancia, en una direccion que apunta a lo largo de la superficie normal de la entrada de la glucosa, en la que los cambios de concentracion de oxfgeno son independientes de la glucosa, registrando cada vez la salida del unico fotodiodo. La region de referencia de oxfgeno era la region dentro de la region de reaccion de la glucosa 402, que transcurrfa entre 200 um desde la entrada de 50 glucosa al lfmite 427 de la region de reaccion de la glucosa opuesta a la entrada de la glucosa 407. Esta region fronteriza 427 opuesta a la region de reaccion de la glucosa en el sensor de glucosa ilustrativo era de aproximadamente 300 um desde la entrada de la glucosa 407. Al conocer la fuente de emision correspondiente a cada resultado de salida, el contenido espacial de la zona de reaccion puede ser reconstruido. Una ventaja clave de este modo de funcionamiento sobre aquel en el que todas las fibras de emision estan encendidas al mismo tiempo y 55 el haz de deteccion se divide en subconjuntos, cada uno con su propio fotodetector 495, es el aumento sustancial de la senal por encima del ruido. Los detalles del metodo que se uso para hacer el sensor de glucosa ilustrativo 400 se proporcionan en los siguientes parrafos.

La aguja de implante 480

Las agujas de implante 480 se fabrican de forma personalizada modificando agujas de jeringa de calibre 23 disponibles en el mercado. Una ventana 470 se tallo en un punto en el lado o en la pared de la aguja entre la punta 481 de la aguja 480 y el extremo posterior 482 de la aguja 480 utilizando una herramienta rotativa de alta velocidad 5 con una punta de ceramica. La ventana 470 se corto de 1 mm de longitud, y se extendio aproximadamente 1/2 de la curvatura o la circunferencia de la aguja 480. La punta de la herramienta rotativa se eligio para suavizar el borde de la ventana entre la pared exterior e interior de la aguja, mientras cortaba la herramienta rotativa. El objetivo de la suavizacion era reducir al mfnimo los lfmites de tension superficial, y facilitar la entrada de tejido en el espacio entre las paredes interiores y exteriores del lfmite de la ventana para reducir al mfnimo las distancias de difusion con 10 respecto a la zona de reaccion.

La matriz de emision 410

La matriz de emision 410 era un conjunto lineal de fibras individuales 412 con un diametro del revestimiento (es 15 decir, un diametro exterior) de 40 pm o 50 pm y una apertura numerica de 0,54, 0,57, o 0,64. Las fibras 412 tenfan una apertura numerica de 0,54. La longitud total de la matriz 410 era ligeramente mas pequena que el diametro interior de la aguja de implante 480. Para este ejemplo ilustrativo, que correspondfa a aproximadamente 10 fibras. Se descubrio que al acoplar las fibras de emision 412 al acoplador de fibra de salida del laser primario utilizando un conector FC multimodo con un 125 pm de diametro, los pares de fibras se acoplan tan eficientemente como tripletes. 20 Adicionalmente, las fibras individuales 412 se acoplaron mal, probablemente como resultado de la flexion alrededor del eje optico debido a las tensiones en la fibra 412, y el espacio extra en el conector. Trios de fibras no se ajustan linealmente dentro del acoplador, y la muestra de un mayor volumen de la zona de reaccion. Como tal, se opto por acoplar pares de fibras individuales 412 dentro de la matriz de emision 410, cada uno a su propia fuente de laser.

25 Una caracterfstica notable de este sensor de glucosa ilustrativo 400 es la curva de 180 grados en la matriz de emision 410 permitiendo que la matriz de emision 410 entre en la parte posterior 482 de la aguja de implante 480, para pasar la ventana de reaccion 470 tallada en la aguja 480, y despues girar en torno a la aguja 480 y alinearse en una orientacion paralela adyacente al haz de deteccion, tambien denominado en el presente documento como el haz receptor 415, como se ilustra en la figura. 3. Por lo tanto, el haz de emision 410 y el haz de deteccion 415, 30 transcurren paralelos para un tramo del sensor de glucosa ilustrativo 400 en el extremo posterior 482 donde el haz de emision 410 y el haz detector 415 se introducen el sensor de glucosa 400. La curva 414 en una sola fibra 412 se forma mediante la insercion en una aguja de calibre 30 para formar un bucle y reduciendo el tamano del bucle hasta que sea justo ligeramente mas grande que su punto de ruptura. Se aplico una fuente de calor, en este caso una llama de un mechero, momentaneamente para fundir la fibra y hacer que cediera a las tensiones aplicadas inducidas 35 por la flexion. Del mismo modo un conjunto de fibras se puede doblar como un grupo suministrandolas en una aguja de calibre 28 y formando un bucle ligeramente mayor que el tamano en el que se rompen. Una vez mas, se aplico brevemente la llama de un mechero a las fibras para hacer que cedieran a las tensiones aplicadas por el bucle. En ambos casos, si el bucle resultante es demasiado grande en su radio de curvatura, el proceso puede repetirse al retraer aun mas el bucle en la aguja par poner una tension adicional en el bucle formado y calentando 40 momentaneamente el bucle con la llama de un mechero, en realidad un encendedor Quicker Clicker™ para un tronco de chimenea. Despues de probar la llama de una variedad de fuentes, incluyendo un lapiz soldador de butano, una cerilla, un soplete de propano, y un soplete, se descubrio que era necesario solo una llama muy pequena, y que una llama demasiado grande causaba una flexion involuntaria fuera del plano pretendido del bucle. El area de la matriz de emision es suficientemente pequena en comparacion con el area total del sensor de glucosa 45 y el volumen total dentro del lumen de la aguja de tal manera que una region de transporte de oxfgeno 401 puede rodear la matriz de emision en el lumen de la aguja 480 mas alla de la ventana de reaccion 470 y aun funcionar segun lo previsto originalmente.

El haz de deteccion 415 (tambien denominado en el presente documento como un haz receptor)

50

El haz de deteccion 415 en el ejemplo ilustrativo es un haz circular de fibras individuales 416, en el que se elimina la mitad de la seccion transversal circular. Es decir, en seccion transversal el haz forma un 1/2 cfrculo. La geometrfa facilita la fabricacion a mano a una alta tasa de rendimiento. Para un gran volumen de fabricacion, pueden usarse geometrfas alternativas. Se construyeron dos haces a la vez mediante la construccion de un haz circular y, a 55 continuacion, dividiendo el haz en dos haces transversales semicirculares, cada uno utilizado en su propio dispositivo. Los haces circulares se construyeron rellenando una aguja de calibre mas pequeno (calibre 28) con el mayor numero de fibras individuales posibles. Se usaron fibras de 50 pm como se ha descrito anteriormente en la seccion de la matriz de emision 410. A continuacion, las fibras individuales 416 se mantienen unidas mediante esmalte de unas de acuerdo con el siguiente protocolo. Las fibras individuales 416 estan roscadas en la aguja desde

el extremo puntiagudo 481 de la aguja 480, y salen por el extremo posterior romo 482 en al menos una pulgada. Se deposita una generosa cantidad de esmalte de unas en la parte posterior 482 de la aguja 480, mantenida en su lugar por la tension superficial de la interfaz aguja/fibra/esmalte. El haz 415 se arrastra despues de vuelta a la aguja, pasado el extremo romo 482, y despues se hace avanzar de nuevo de modo que el extremo del haz 415 se alinee 5 con el extremo romo de la aguja. Un momento antes de que el endurecimiento del esmalte de unas se haya completado, el haz 415 se hace avanzar de nuevo fuera de la aguja 480, permitiendo que las fibras 416 se curen pero sin estar adheridas a la aguja 480. Antes de la finalizacion de la curacion, el haz 415 se divide cuidadosamente por la mitad con una hoja de cuchillo afilado Exacto™, a lo largo de un diametro de la seccion transversal y se deja curar. El resultado final es dos haces transversales semicirculares.

10

Depositar la region de reaccion 402 sobre el haz de deteccion 415

En este sensor de glucosa ilustrativo, la region de reaccion (tambien denominada la zona de reaccion) 402 se deposita sobre la superficie del haz de deteccion 408 que se describe a continuacion.

15

1. El par de haces de deteccion se vuelve a insertar en el extremo en punta de una aguja de calibre 28 o se mantiene en la aguja de calibre 28 utilizada para formar el par de haces, y se alinea con el extremo posterior romo 482.

2. El extremo del haz de deteccion 415 y el haz emisor 410 fue pulido para aumentar la eficiencia de recogida de luz. 20 Se ha descubierto que puede conseguirse un aumento en la eficiencia de recogida de luz de aproximadamente 3

veces mediante el pulido del extremo de recogida del haz de deteccion 415 y el extremo de emision del haz emisor 410. El pulido se logro en primer lugar por el avance ligeramente del haz mas alla del extremo romo 482 de la aguja de calibre 28 y despues por deslizamiento del extremo del haz en una serie de papeles de pulido para aumentar la finura segun el uso de tecnicas conocidas para pulir fibras a mano. "Thor's Guide to Connectorization and Polishing 25 Optical Fibers" Thor Labs, Newton, NJ, 1997.

3. La punta del haz de fibras se sumergio en una solucion del 0,1 % (p/v), o equivalentemente 1 pg/ml, de poli-lisina en agua desionizada. La poli-1-lisina se uso para facilitar la adhesion de biomoleculas al extremo del haz de deteccion 415. El vidrio pulido tiene una pobre adhesion a las biomoleculas.

4. La mezcla de la region de reaccion preparada se deposita sobre la punta del haz 408. La mezcla de reaccion es 30 una matriz estabilizada compuesta por la hemoglobina, un hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo,

tal como mioglobina, la enzima glucosa oxidasa, una protefna portadora, tal como albumina, y un fijador tal como glutaraldehfdo. Esto se logra arrastrando en primer lugar el haz 415 de nuevo a la aguja de calibre 28 aproximadamente 2 mm desde el extremo romo de la aguja. El extremo romo de la aguja se utiliza para cortar la matriz de la zona de reaccion, que se ha depositado sobre una superficie plana, tal como un portaobjetos de vidrio, 35 en la forma exacta del lumen interior de la aguja, analogo a un cortador de galletas. Se usaron dos variaciones para realizar esta etapa.

a. Se uso un haz circular en su totalidad 415, y se dividio en dos haces despues de depositar la zona de reaccion

b. Se uso un par de haces semicirculares 415 40

5. El haz 415 se empuja cuidadosamente de vuelta a traves del extremo romo de la aguja de calibre 28, transportando la zona de reaccion cortada 402 con este.

6. La aguja se retira del paquete 415, y el haz 415 se sumerge en un adhesivo de silicio se diluyo con tolueno en una relacion de 6:1 de tolueno para adhesivo, para recubrir la punta del haz y la zona de reaccion 402 con una

45 membrana permeable al oxfgeno, e impermeable a la glucosa.

Montaje del sensor de glucosa ilustrativo 400

El sensor de glucosa ilustrativo 400 se ensamblo mediante la alineacion de la matriz de emision 410 con la matriz de 50 deteccion 415 fuera de la aguja de implante 480 de tal forma que la region de reaccion 402 esta entre la matriz de emision 410 y la matriz de deteccion 415, y luego deslizando la matriz de emision alineada 410, la region de reaccion 402, y la matriz de deteccion 415 (es decir, el sistema de luz acoplado) de nuevo a la aguja 480 de tal forma que la region de acoplamiento (es decir, la region entre la matriz de emision 410 y la matriz de deteccion 415, que incluye la zona de reaccion de glucosa y en la que la luz de la matriz de emision 410 se recibe por el haz de deteccion 415) 55 esta dentro de la ventana de reaccion 470 cortada en la aguja 480. Las etapas se describen a continuacion con mas detalle.

1. El haz de deteccion 415 y el haz emisor 410 estan ambos avanzado a traves de la aguja de implante 480, o retrocedidos a traves de la aguja 480 de manera que unas pocas pulgadas de ambos se extiendan mas alla del

extremo puntiagudo 481 de la aguja 480, incluyendo la curva 414, y el extremo de emision 413 del haz emisor 410 y el extremo de recepcion 408 del haz de deteccion 415, y la longitud del haz de deteccion 415 y el haz emisor 410 se extiende mucho mas alla del extremo posterior de la aguja de implante.

2. El extremo emisor 413 del haz de emision 410 se coloca cerca del extremo receptor 408 del haz de deteccion 415 5 hasta que la transmision maxima se consigue a traves del extremo posterior del haz de deteccion 415. Esta posicion

corresponded a una geometrfa en la que la disposicion lineal del haz de emision 410 esta alineada transversalmente con respecto al lfmite lineal del haz semicircular. Ese mismo lfmite, junto con la forma lineal del haz de emision 410 eliminan los grados de libertad de rotacion del procedimiento de alineacion. De forma ideal, si sistema se construye de forma que unicamente la colocacion axial sea crftica, pero puede requerirse algo de 10 traslacion transversal del haz emisor 410 con respecto al haz detector 415.

3. Un adhesivo tal como el silicio o el esmalte de unas, se aplica a lo largo del acoplamiento longitudinal del haz de emision 410 y el haz de deteccion 415 detras de la region acoplada optica. Esta etapa bloquea de forma estable los dos sistemas de fibra juntos.

4. El sistema de iluminacion acoplado se apoya en la aguja 480 de modo que el acoplamiento este dentro de la 15 ventana de reaccion de 470 cortada en la aguja 480.

5. La longitud de la aguja 480 entre la ventana de reaccion 470 y la punta 481 de la aguja se llena con el material de la region de transporte de oxfgeno 401 y se deja secar. La region de transporte de oxfgeno es una matriz estabilizada compuesta por la hemoglobina, una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo tal como la mioglobina, una protefna portadora, tal como albumina y un fijador tal como glutaraldehfdo. La mezcla se aplica al

20 sensor antes de la finalizacion de su tiempo de curado de tal manera que aun se comporta como un lfquido.

6. Un orificio de entrada de glucosa 407 se corta en el lado de la zona de reaccion 402 usando la punta puntiaguda de una pequena aguja de jeringa para permitir que la glucosa entre en la zona de reaccion.

7. La ventana de reaccion 470 se cubre con una membrana permeable a la glucosa y el oxfgeno.

25 Toda la aguja 480, o solo la region de la ventana de reaccion 470, se cubre con una membrana biocompatible. Por ejemplo, la membrana puede ser una membrana con poros de aproximadamente 5 pm para promover la resistencia de la reaccion inmune.

EJEMPLO 3

30

MEDICIONES DE GLUCOSA USANDO UN SENSOR ILUSTRATIVO

Este Ejemplo demuestra la deteccion de glucosa en un sensor de glucosa relativamente sencillo que incluye dos matrices de transporte de oxfgeno estabilizadas en comunicacion entre sf. Una de las matrices de transporte de 35 oxfgeno estabilizadas ilustrativas era una region de transporte de oxfgeno y la otra era una region de reaccion de la glucosa que inclufa un gel fino de glucosa oxidasa-hemoglobina estabilizado.

Una region de transporte de oxfgeno y una region de reaccion de la glucosa contiguas se depositaron sobre un portaobjetos de vidrio, se cubrieron con silicio, y una entrada de la glucosa estaba presente en una superficie de la 40 region de reaccion de la glucosa. La region de reaccion de glucosa se hizo con 20 mg de glucosa oxidasa y 0,1 ml de sangre humana reticulada con una solucion diluida de formaldehfdo. Las etapas para la construccion de la region de reaccion de la glucosa se describen a continuacion con mas detalle.

1. Se combinaron 0,1 ml de sangre humana entera con 0,3 ml de una solucion que contenfa una relacion 1:3 de 45 alcohol isopropflico al 70 % con respecto a agua destilada para lisar las membranas de los globulos rojos.

2. Se anadieron 20 mg de glucosa oxidasa a la mezcla de celulas sangufneas lisadas de la etapa 1. La mezcla no contenfa ningun precipitado visible de glucosa oxidasa tras la mezcla adecuada

50 3. Usando el borde de un cubreobjetos de vidrio, una porcion de la mezcla de la etapa 2 se transfirio a la parte inferior un portaobjetos de vidrio para formar una tira delgada a traves de la dimension corta del portaobjetos. La anchura de la tira fue de 2 mm.

4. La mezcla se dejo secar sobre el portaobjetos.

55

5. El portaobjetos de vidrio se sumergio en una solucion al 4 % de formaldehfdo durante 10 minutos y despues se aclaro con alcohol isopropflico al 70 % y se dejo secar.

La region de transporte de oxfgeno se realizo con 0,1 ml de sangre humana reticulada con una solucion diluida de

formaldehfdo. Las etapas para la construccion de la region de reaccion de transporte de oxfgeno y la finalizacion del sensor se describen a continuacion con mas detalle.

1. Se combinaron 0,1 ml de sangre humana entera a una relacion 1:3 con respecto a una solucion que contenfa una 5 relacion 1:3 de alcohol isopropflico al 70 % con respecto a agua destilada para lisar las membranas de los globulos

rojos.

2. La mezcla se mezclo hasta obtener una consistencia uniforme y aproximadamente la mitad se aplico al portaobjetos de vidrio que contenfa la region de reaccion de glucosa de manera que la mezcla cubriese la mayor

10 parte del portaobjetos de vidrio a traves de su dimension corta y formase una capa contigua a la zona de reaccion de la glucosa. La mezcla se dejo secar.

3. Toda la preparacion en el portaobjetos de vidrio se cubrio con una capa fina de caucho de silicona. Utilizando una cuchilla muy afilada, se cortaron ranuras paralelas a traves del caucho de silicio y las capas depositadas. Un sensor

15 se define asf por las regiones contiguas entre dos ranuras paralelas. El silicio se seco por soplado con aire frfo para acelerar el curado.

4. Con la punta de una aguja de jeringa, una entrada de glucosa se corto a traves de la silicona en la interseccion de una de las ranuras y la region de reaccion de glucosa justo debajo de donde se conectan la region de transporte de

20 oxfgeno y la region de reaccion de la glucosa.

El portaobjetos de vidrio se suspendio en un bano de agua con una mezcla de gas [O2 al 5 % + N2 al 95 %] en burbujeo. La zona de reaccion se sondeo opticamente por luz laser enfocada en un punto de aproximadamente 10 um de diametro situado 50 um o 100 um de la entrada de glucosa a lo largo del eje de la superficie del inyector. 25 La luz laser se recogio en un fotodiodo cuya corriente electrica se convirtio en tension y se registro en una amplia gama de soluciones de glucosa clfnica en el bano. La figura 6 muestra graficos de las concentraciones de glucosa dentro del bano representado en relacion con la tension de fotodiodo correspondiente cuando el gel de reaccion se interrogo en una ubicacion de 50 um o 100 um de la entrada para la glucosa (es decir, la entrada de glucosa). Los graficos demuestran la utilidad del muestreo espacial dentro de la zona de reaccion. El punto de interrogacion 50 um 30 de la entrada de glucosa demostro una buena sensibilidad a los cambios de concentracion de glucosa en concentraciones de glucosa inferiores, pero pierde la sensibilidad cerca de 150 mg/dl, momento en el que la relacion de la funcion de potencia hizo la transicion en pendiente. El punto de interrogacion situado 100 um la entrada de la glucosa demostro una buena sensibilidad a 150 mg/dl hasta al menos 300 mg/dl. La informacion de las dos ubicaciones juntas produce una buena sensibilidad en toda la gama clfnica de las concentraciones de glucosa. Las 35 soluciones de glucosa se midieron por triplicado utilizando un medidor de glucosa de venta libre TrueTrack™ de marca compartida por Sav-On/Osco/Albertson y Home Diagnostics, Inc.

La figura 7 muestra la respuesta calibrada del gel fino de glucosa oxidasa - hemoglobina de la figura 6 representada en relacion con el medidor de glucosa TrueTrack™ que mide las mismas soluciones de glucosa. Un ajuste lineal 40 produce un valor R2 de 0,99, demuestra asf que los resultados se obtuvieron utilizando lo ilustrativo.

Claims (40)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un sensor (100), que comprende

   5 a) una region de transporte de oxfgeno (001) que comprende una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, una primera protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada en la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada, una primera superficie permeable a oxfgeno (004) en comunicacion con un entorno externo, y una segunda superficie permeable a oxfgeno (006) que es impermeable al analito diana;

   10 b) una region de reaccion de analito diana (002) en comunicacion con la region de transporte de oxfgeno (001) en la segunda superficie permeable a oxfgeno (006), donde la region de reaccion de analito diana (002) comprende una enzima oxidasa del analito diana, y una superficie permeable al analito diana (007); y

   c) una region de deteccion (003) que comprende al menos una sonda de detector (009) en comunicacion con la 15 region de reaccion de analito diana (002).
2. 2. Un sensor de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada comprende una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada a traves de la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada.

   20
3. 3. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde la superficie impermeable al analito diana y al oxfgeno se situan en el sensor de tal forma que la region de deteccion (003) esta entre la superficie impermeable al analito diana y al oxfgeno y la region de transporte de oxfgeno (001).

   25 4. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde el analito diana se selecciona del grupo

   que consiste en glucosa, galactosa, lactosa, peroxido, colesterol, aminoacidos, alcohol, acido lactico y mezclas de los mismos.
4. 5. El sensor de la reivindicacion 4, donde el analito diana es glucosa y el sensor es un sensor de 30 glucosa.
5. 6. El sensor de glucosa de la reivindicacion 5, donde el sensor de glucosa es un sensor de glucosa implantable.

   35 7. El sensor de glucosa de la reivindicacion 6, donde el sensor de glucosa es un sensor de glucosa

   transcutaneo.
6. 8. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde la primera protefna de union a oxfgeno reversible es una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo.

   40
7. 9. El sensor de la reivindicacion 8, donde la primera protefna de union a oxfgeno reversible es hemoglobina.
8. 10. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde al menos una de la region de transporte de 45 oxfgeno (001), la region de reaccion de analito diana (002), y la region de deteccion (003) comprenden una matriz

   estabilizada.
9. 11. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde la al menos una sonda de detector (009) es al menos una sonda detectora que no consume sustancialmente oxfgeno.

   50
10. 12. El sensor de la reivindicacion 11, donde la region de deteccion (003) comprende adicionalmente una sonda de oxfgeno.
11. 13. El sensor de la reivindicacion 12, donde la sonda de oxfgeno es una segunda protefna de union a 55 oxfgeno reversible.
12. 14. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde la sonda detectora (009) comprende adicionalmente un espectrometro.
13. 15. El sensor de la reivindicacion 13, donde la segunda protefna de union a oxfgeno reversible es una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo.
14. 16. El sensor de la reivindicacion 15, donde la segunda protefna de union a oxfgeno reversible es 5 hemoglobina.
15. 17. El sensor de la reivindicacion 13, donde la primera protefna de union a oxfgeno reversible es identica a la segunda protefna de union a oxfgeno reversible.

    10 18. El sensor de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde la al menos una sonda de detector (009)

    es capaz de emisor y/o recibir luz.
16. 19. El sensor de la reivindicacion 18, donde la al menos una sonda de detector (009) es capaz de emitir y recibir luz a una longitud de onda de absorcion de una hemoprotefna creada por ingenierfa sensible al oxfgeno, o

    15 derivado hemo.
17. 20. El sensor de la reivindicacion 19, donde la al menos una sonda de detector (009) incluye uno o mas emisores (410) que emiten luz hacia uno o mas receptores (415), donde los emisores (410) y los receptores (415) entran ambos en el sensor (100) a traves de un primer extremo.

    20
18. 21. El sensor de la reivindicacion 20, donde el uno o mas emisores (410) estan compuestos por una o

    mas fibras de fibra optica que se forman en un bucle de tal forma que la luz que sale de las fibras de fibra optica del

    emisor transcurre en una direccion (478) que es sustancialmente opuesta a la luz (475) de una fuente de luz (490) que entra en las fibras de fibra optica del emisor.

    25
19. 22. El sensor de la reivindicacion 20, donde el uno o mas receptores (415) estan compuestos por una o

    mas fibras de fibra optica que se forman en un bucle de tal forma que la luz que sale de las fibras de fibra optica del

    emisor viaja en una direccion (478) que es sustancialmente opuesta a la luz de una fuente de luz (475) que entra en las fibras de fibra optica del emisor.

    30
20. 23. El sensor de la reivindicacion 18, donde la region de reaccion de analito (002) comprende una entrada

    de analito (007) sustancialmente ortogonal a la superficie en la que la region de transporte de oxfgeno (001) entra en contacto con la region de reaccion de analito (002).

    35 24. El sensor de la reivindicacion 23, donde la serie de sondas comprende una sonda de referencia para

    medir la concentracion de oxfgeno de referencia en la region de reaccion de analito (002), donde la concentracion de oxfgeno de referencia es una medicion de la concentracion de oxfgeno en la region de reaccion en ausencia del analito.

    40 25. El sensor de la reivindicacion 24, donde la sonda de referencia se comunica con la region de reaccion

    de analito (002) mas alla o en el punto en el que los efectos del analito sobre un perfil de oxfgeno dentro de la region de reaccion no son detectables.
21. 26. Un metodo para medir una concentracion de un analito, que comprende 45

    transportar oxfgeno de un entorno externo a traves de una region de transporte de oxfgeno (001) que comprende una matriz de transporte de oxfgeno estabilizada dentro de un sensor (100) a una region de reaccion de analito (002) del sensor usando una primera protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada en la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada;

    50 hacer reaccionar una porcion del oxfgeno transportado con el analito enzimaticamente en la region de reaccion de analito (002) para formar un producto; y

    medir el oxfgeno o un producto de la reaccion de oxfgeno y el analito en una region de deteccion (003) que comprende la region de reaccion de analito (002) o una region de deteccion (003) en contacto con la region de reaccion de analito (002), midiendo de esta manera la concentracion del analito.

    55
22. 27. Un metodo para medir una concentracion de un analito de acuerdo con la reivindicacion 26, donde la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada comprende una protefna de union a oxfgeno reversible inmovilizada a traves de toda la matriz de transporte de oxfgeno estabilizada.
23. 28. El metodo de la reivindicacion 26 o la reivindicacion 27, donde el analito que se mide es glucosa, galactosa, lactosa, peroxido, colesterol, aminoacidos, alcohol, o acido lactico.
24. 29. El metodo de la reivindicacion 28, donde el analito que se mide es glucosa.

    5
25. 30. El metodo de la reivindicacion 26 o la reivindicacion 27, donde la medicion se realiza al menos en un primer punto temporal y un segundo punto temporal, proporcionando de esta manera informacion con respecto a los cambios en la concentracion de analito.

    10 31. El metodo de la reivindicacion 26 o la reivindicacion 27, donde el oxfgeno se transporta desde el entorno externo que comprende el tejido subcutaneo a la region de reaccion de analito (002).
26. 32. El metodo de la reivindicacion 26 o la reivindicacion 27, donde el oxfgeno se transporta desde el entorno externo a la region de reaccion de analito (002) usando una hemoprotefna creada por ingenierfa o un

    15 derivado hemo como la primera protefna de union a oxfgeno reversible.
27. 33. El metodo de la reivindicacion 32, donde el oxfgeno se transporta desde el entorno externo a la region de reaccion de analito (002) usando hemoglobina como la primera protefna de union a oxfgeno reversible.

    20 34. El metodo de la reivindicacion 26 o la reivindicacion 27, donde el oxfgeno se mide midiendo la union a

    oxfgeno de una sonda de oxfgeno.
28. 35. El metodo de la reivindicacion 34, donde la union a oxfgeno se mide usando un espectrometro que mide al menos una longitud de onda.

    25
29. 36. El metodo de la reivindicacion 35, donde el espectrometro mide la absorcion de la protefna de union a oxfgeno.
30. 37. El metodo de la reivindicacion 34, donde se mide la union a oxfgeno de una segunda sonda de 30 oxfgeno de protefna de union reversible.
31. 38. El metodo de la reivindicacion 35, donde la segunda protefna de union a oxfgeno reversible es una hemoprotefna creada por ingenierfa o un derivado hemo.

    35 39. El metodo de la reivindicacion 38, donde la segunda protefna de union a oxfgeno reversible es

    hemoglobina.
32. 40. El metodo de la reivindicacion 26 o la reivindicacion 27, donde la medicion se realiza usando una o mas sondas detectoras (028).

    40
33. 41. El metodo de la reivindicacion 40, donde la medicion se realiza usando una poblacion de sondas detectoras que no consumen sustancialmente oxfgeno (009).
34. 42. El metodo de la reivindicacion 34, donde la luz se emite y se recibe por la sonda detectora (028) a una 45 longitud de onda de hemoprotefna creada por ingenierfa sensible a oxfgeno, o derivado hemo.
35. 43. El metodo de la reivindicacion 34, donde la luz se emite por uno o mas emisores (410) hacia uno o mas receptores (415).

    50 44. El metodo de la reivindicacion 43, donde la luz viaja a traves de una o mas fibras de fibra optica del

    emisor de una fuente de luz que emite en una primera direccion (475) y despues viaja en una segunda direccion (478) que es sustancialmente opuesta a la primera direccion a traves de al menos una porcion de la region de deteccion (003) donde se recibe por una o mas fibras de fibra optica del receptor.

    55 45. El metodo de la reivindicacion 44, donde la luz viaja a traves de un bucle en las fibras de fibra optica

    del emisor antes de que entre en al menos una porcion de la region de deteccion (003).
36. 46. El metodo de la reivindicacion 40, donde el analito entra en la region de reaccion (002) a traves de una

    entrada de analito (007).
37. 47. El metodo de la reivindicacion 46, donde la concentracion de analito se determina usando la senal de al menos una sonda de oxfgeno que esta lo suficientemente cerca de la entrada de analito (007) para ser sensible a los gradientes de oxfgeno derivado de analito dentro de la region de deteccion (003) junto con la senal de al menos

    5 una segunda sonda de oxfgeno que esta lo suficientemente lejos de la entrada de analito (007) para actuar como una sonda de referencia para el perfil de oxfgeno.
38. 48. El metodo de la reivindicacion 47, donde una sonda de referencia esta lo suficientemente lejos de la entrada de analito (007) de manera que la senal de la sonda de referencia no se vea sustancialmente afectada por el

    10 analito que entra en la entrada de analito (007).
39. 49. El metodo de la reivindicacion 46, donde la region de transporte de oxfgeno (001) proporciona un flujo de oxfgeno suficiente a la region de reaccion (002) de tal forma que la reaccion enzimatica no este limitada en oxfgeno.

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40. 50. El metodo de la reivindicacion 49, donde el tamano de la entrada de analito (007), la concentracion de una enzima en la region de reaccion (002), y la concentracion de la protefna de union a oxfgeno reversible en la region de reaccion (002) se ajustan para proporcionar un gradiente de oxfgeno sensible a analito cerca de la entrada (007) de tal forma que el intervalo dinamico deseado de concentraciones de analito pueda medirse, y para

    20 proporcionar una concentracion de referencia de oxfgeno insensible a analito distal a la entrada (007).