ES2607987T3 - Mutantes de la proteína nucleofosmina (NPM), secuencias génicas correspondientes y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Proteína nucleofosmina (NPM) mutada caracterizada por tener una ubicación citoplasmática y comprender una mutación que tiene como resultado la pérdida de los restos de triptófano en las posiciones 288 y 290 y la generación de un motivo de señal de exportación nuclear (NES) en la región C-terminal de la secuencia de la nucleofosmina humana (NP_002511), en el que dicho motivo de señal de exportación nuclear (NES) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de LxxxVxxVxL (SEQ ID No. 1), LxxxLxxVxL (SEQ ID No. 2), LxxxFxxVxL (SEQ ID NO. 3), LxxxMxxVxL (SEQ ID No. 4) o LxxxCxxVxL (SEQ ID No. 5), en la que x puede ser cualquier aminoácido.

Description

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DESCRIPCION

Mutantes de la protefna nucleofosmina (NPM), secuencias genicas correspondientes y usos de los mismos

La presente invencion se refiere a nuevos mutantes de la protefna nucleofosmina, secuencias genicas correspondientes y uso diagnostico de los mismos, control de la enfermedad minima residual, evaluacion de pronostico y terapia de la leucemia mieloide aguda (LMA).

Mas particularmente, la invencion se refiere a nuevos mutantes de la protefna nucleofosmina citoplasmatica (NPM) y sus correspondientes secuencias genicas y al uso de los mismos como marcadores para el diagnostico, pronostico y terapia de la leucemia mieloide aguda con cariotipo normal.

La presente invencion proporciona protefna nucleofosmina mutada (NPM) caracterizada por tener una ubicacion citoplasmatica y que comprende una mutacion que tiene como resultado la perdida de los restos de triptofano en las posiciones 288 y 290 y la generacion de un motivo de senal de exportacion nuclear (NES, del ingles signal of nuclear export) en la region C-terminal de la secuencia de la nucleofosmina humana (NP_002511), en el que dicho motivo de senal de exportacion nuclear (NES) comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de LxxxVxxVxL (SEQ ID No. 1), LxxxLxxVxL (SEQ ID No. 2), LxxxFxxVxL (SEQ ID NO. 3), LxxxMxxVxL (SEQ ID No. 4) o LxxxCxxVxL (SEQ ID No. 5), en la que x puede ser cualquier aminoacido.

La leucemia mieloide aguda primaria, la forma de leucemia mas comun en adultos, es una enfermedad que se origina en la medula osea, mas frecuentemente en una celula madre pluripotente o multipotente, ya “dedicada” a la mielopoyesis. La transformacion neoplasica modifica los mecanismos que regulan la proliferacion y diferenciacion de la celula madre evitando la maduracion de su progenie. La consecuencia de este hecho es una acumulacion, principalmente en la medula osea y despues en la sangre periferica y en otros organos y tejidos, de celulas leucemicas (o blasticas) que proliferan de forma autonoma.

Hasta la fecha, las LMA se dividen en diferentes grupos de pronostico basados en analisis citogeneticos y en la biologfa molecular, para programar el mejor tratamiento. Actualmente, la terapia para la LMA se basa principalmente en la administracion secuencial de diferentes farmacos quimioterapeuticos contra las celulas leucemicas.

Existen diferentes etapas en el tratamiento de las LMA. La primera etapa, denominada terapia de induccion, esta dirigida a destruir la mayor parte de celulas leucemicas con el objetivo de que los pacientes consigan lo que se conoce por remision hematologica completa, es decir la desaparicion de las celulas leucemicas con normalizacion de los datos hematologicos medulares y perifericos. La destruccion de las celulas leucemicas que permanecen despues de esta primera etapa de terapia (denominada enfermedad minima residual) puede lograrse mediante la continuacion de la quimioterapia (mantenimiento o intensificacion o reinduccion), seguida o no de un trasplante autologo o alogenico (segun la presencia o ausencia de factores de pronostico negativos y la disponibilidad de un donante). Desafortunadamente, debido a la agresividad de estos tumores malignos, el tratamiento es decisivo unicamente para el 30 % de los pacientes. Existen tres aproximaciones utilizables principales para mejorar el diagnostico y supervivencia de los pacientes afectados por LMA: i) proporcionar pruebas diagnosticas rapidas y especfficas para lograr un diagnostico mas preciso y poder controlar la denominada “enfermedad minima residual”; ii) identificacion de los factores de pronostico biologicos que permiten estratificar el tratamiento terapeutico de acuerdo con “categorfas de riesgo” y iii) desarrollo de nuevas formas de terapia mas dirigida que permiten interferir con los mecanismos de transformacion neoplasica inducida por algunas lesiones geneticas.

Se han perseguido algunos de estos objetivos en algunos subtipos de LMA, tales como en aquellos subtipos con translocacion t (8;21) o inv (16), que pueden ser identificados/controlados con extrema precision utilizando tecnicas citogeneticas/FISH o RT-PCR y que muestran un mejor pronostico que otras formas de leucemia. Incluso en algunos subtipos de LMA como la leucemia promielocftica con translocacion (15; 17), su empleo en combinacion con la quimioterapia y el acido trans-retinoico o ATRA (un agente que directamente actua sobre la lesion genetica) ha conducido a una mejora evidente en la supervivencia de estos pacientes.

Sin embargo, estas mejoras diagnosticas/terapeuticas afectan unicamente a una minorfa de las LMA. De hecho, en una parte importante de la LMA, aproximadamente un 40 % de los casos, el analisis citogenetico muestra un cariotipo normal (Grimwade et al., 1998) y representa clfnica y biologicamente una categorfa heterogenea (Grimwade et al., 1998; Schnittger et al., 2002; Byrd et al, 2002).

El analisis de la expresion genica de la LMA con cariotipo normal, ha sido propuesto como un medio para caracterizar los diferentes subgrupos de pronostico (Bullinger et al, 2004; Valk et al, 2004), pero no ha permitido identificar lesiones geneticas especfficamente asociadas con el cariotipo normal. Hasta ahora se han asociado lesiones geneticas unicas con el mapa de cariotipo normal a nivel de los genes FLT3 (Schnittger et al., 2002; Frohling et al., 2002), CEBPa (Pabst et al., 2001) y MLL (Steudel et al., 2003). No obstante no pueden considerarse especfficas del cariotipo normal ya que estan tambien presentes en casos de LMA con mayores translocaciones cromosomicas (Carnicer et al., 2004), ademas de en la leucemia mieloide secundaria aguda (Christiansen et al., 2001).

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Por lo tanto, hasta ahora, no existen ensayos diagnosticos/pronosticos o marcadores moleculares que permitan detectar y distinguir de manera espedfica las LMA de cariotipo normal primarias, cuya caracterizacion y clasificacion todavfa se basa en criterios morfologicos equivocados. Ademas, el desconocimiento sobre la lesion genetica representa un impedimento para el control de la enfermedad minima residual (con dificultad relevante en las opciones terapeuticas) y para el desarrollo potencial de nuevas formas de terapia molecular para esta categona de LMA.

A partir de lo anterior, queda clara la necesidad de proporcionar nuevos marcadores diagnosticos y pronosticos para la leucemia mieloide aguda primaria con cariotipo normal y nuevas dianas moleculares para la terapia espedfica de este tipo de leucemia.

Los autores de la presente invencion han identificado actualmente mutantes del gen de la nucleofosmina (NPM) y protema nucleofosmina codificada a partir del mismo, asociados espedficamente a la LMA de cariotipo normal.

La nucleofosmina (NPM) es una protema ampliamente restringida en el nucleolo (Cordell et al., 1999) que actua como un transportador del nucleo al citoplasma (Borer et al., 1989). Es una molecula “chaperona” (Dumbar et al., 1989), probablemente implicada en la prevencion de la agregacion de las protemas en el nucleolo y la regulacion del ensamblaje y transporte de las estructuras pre-ribosomicas a traves de la membrana nuclear. Es tambien una diana de la CDK2/ciclina E en la duplicacion del centrosoma (Okuda et al., 2000) y esta implicada en la regulacion del mecanismo de supresion tumoral mediado por Arf-p53 (Bertwistle et al., 2004; Colombo et al., 2002; Kurki et al., 2004). En el modelo murino (raton con un gen inactivado o raton “knock-out”), el gen de la NPM parece desempenar un papel fundamental en la regulacion de la hematopoyesis (Grisendi et al., 2005).

El gen de NPM esta implicado en las translocaciones cromosomicas de las leucemias y linfomas que dan como resultado la formacion de protemas de fusion, tales como, por ejemplo, NPM-ALK (Morris et al., 1994), NPM RARa (Redner et al, 1996) y NPM-MLF1 (Yoneda-Kato et al., 1996), que conservan unicamente la region N-terminal de la molecula de NPM (Falini et al., 1999; Falini et al., 2002). Se supone que la nucleofosmina contribuye a la oncogenesis activando el potencial oncogenico del companero de fusion (ALK, MLF1, RARa) (Bischof et al, 1997).

Ya que se supone que la NPM cumple una funcion en la supresion tumoral mediada por Arf/p53, las alteraciones del trafico fisiologico desde el nucleo al citoplasma podnan ser cruciales durante la transformacion. Las alteraciones en la distribucion sub-celular de la NPM y/o protemas de fusion que contienen NPM pueden ser reveladas por estudios de inmuno-histoqmmica. Por ejemplo, en los denominados linfomas ALK positivos con t(2;5) (Falini et al., 1999) y leucemia aguda con t(3;5) se observa una deslocalizacion citoplasmatica de la protema NPM (Falini et al., 1999; Falini et al., 2002) con respecto a la localizacion del nucleolo que se espera de la misma NPM (Cordell et al., 1999). Este hallazgo se debe a la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-NPM con la protema de fusion NPM-ALK [producto de la t(2;5)] o NPM-MLF1 [producto de la t(2;5)] o NPM-MLF1 [producto de la t(3;5)] y/o con la protema NPM deslocalizada en el citoplasma, probablemente a traves de la formacion de heterodfmeros con NPM-MLF1.

Los autores de la presente invencion han mostrado en la actualidad que aproximadamente un tercio de las LMA en adultos en el examen inmunohistoqmmico muestra una distribucion citoplasmatica aberrante de la protema NPM (NPMc+) (normalmente restringida al nucleo), y que tal hallazgo inmunohistoqmmico esta correlacionado con la presencia en las celulas leucemicas de mutaciones espedficas al nivel del exon 12 del gen de NPM (GenBank NM_002520), en la parte que codifica la estructura C-terminal de la protema NPM (GenBank NP_002511).

La leucemia aguda que expresa los mutantes de la protema NPM y las correspondientes secuencias genicas, denominadas por los autores LMA NPMc+ (Falini et al., 2005), representa una entidad facilmente distinguible que se caracteriza por un amplio espectro morfologico, cariotipo normal, elevada frecuencia de mutaciones del gen FLT3 (“duplicacion interna en tandem”) y una buena respuesta a la terapia de induccion. Las mutaciones del gen de la NPM y la consiguiente distribucion de la protema NPM mutada en el citoplasma de las celulas leucemicas representan los eventos mas espedficos y frecuentes observados hasta ahora en la LMA de cariotipo normal. Los autores de la presente invencion tambien han mostrado que las mutaciones de la NPM representan un excelente marcador para el pronostico (Schnittger et al., 2005) y el control de las LMA de cariotipo normal con enfermedad minima residual.

Por lo tanto los autores de la presente invencion han identificado secuencias mutantes de la protema nucleofosmina (NPM) y mutantes del gen de la NPM que los codifica, que pueden emplearse de manera ventajosa como: marcadores en la preparacion de kits diagnosticos y marcadores de pronostico y para el control de la enfermedad minima residual, y como dianas terapeuticas en las LMA primarias de cariotipo normal.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo espedfico para el diagnostico, dentro de la categona heterogenea de las LMA de cariotipo normal, de un nuevo subtipo, denominado LMA NPMc+, mediante estudios inmunohistoqmmicos con anticuerpos anti-NPM (identificacion de NPM citoplasmatico) y/o el analisis de las mutaciones del gen de NPM. Esta observacion tiene implicaciones diagnosticas importantes, porque, hasta ahora, la LMA de cariotipo normal se clasificaban en base a criterios morfologicos erroneos (Jaffe et al., 2001). En particular, los autores han utilizado anticuerpos monoclonales contra epftopos resistentes a los fijadores de la molecula de

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NPM (Cordell et al., 1999; Falini et al., 2002) que los hace aplicables al analisis de muestras de biopsia habituales fijadas e incluidas en parafina tales como, por ejemplo, biopsias osteomedulares o coagulos de medula osea. Debido a que las mutaciones de la NPM son siempre heterocigotas, las celulas leucemicas contienen protefna NPM tanto mutada como de tipo silvestre. Estos dos tipos de protefnas no pueden distinguirse entre si utilizando los anticuerpos monoclonales anti-NPM habituales.

Mas especfficamente, para estudiar la distribucion sub-celular de los mutantes de NPM sin la interferencia de la protefna NPM de tipo silvestre (WT), los autores han producido un anticuerpo policlonal (denominado Sil-C) que es capaz de reconocer mutantes de NPM especfficos.

La localizacion citoplasmatica de la NPM (y la mutacion del gen de la NPM) se asocia especfficamente al cariotipo normal. Por lo tanto, representa un marcador inmunohistoqufmico excelente para el pronostico, ya que permite su asignacion a la categorfa de LMA de “riesgo intermedio” (en la que se incluyen los pacientes con cariotipo normal) de los pacientes leucemicos que no pueden ser clasificados citogeneticamente de otro modo debido a material insuficiente, deterioro de la muestra biologica, ausencia de mitosis, y dificultad para interpretar con seguridad el cariotipo.

Ademas, la prueba inmunohistoqufmica para la demostracion de NPM citoplasmatica (NPMc+) (predictiva en el 100 % de las mutaciones del exon 12 del gen de la NPM), puede ser considerada como un factor predictivo para el pronostico en las LMA de cariotipo normal, identificando las diferencias de supervivencia en los casos de LMA NPMc+ en comparacion con NPMc-. Mas especfficamente, la presencia de mutaciones del exon 12 de la NPM en ausencia de mutaciones del gen FLT3, nos ha permitido identificar un nuevo grupo de leucemias mieloides de pronostico bueno con cariotipo normal (Schnittger et al., 2005).

Ademas, la identificacion inmunohistoqufmica de la NPM citoplasmatica (NPMc+) puede considerarse como un factor predictivo para una buena respuesta a la terapia de induccion en las LMA de cariotipo normal.

Los ensayos de NPM a nivel citoplasmatico o para la mutacion a nivel genico, proporcionados por los autores de la presente invencion, son ensayos sumamente sensibles, especfficos, sencillos, economicos y de diagnostico rapido (48-72 horas para lograr el resultado) y son tecnicas inmunohistoqufmicas y biomoleculares bien conocidas para los expertos en la tecnica. Ademas, tales ensayos pueden emplearse de manera ventajosa para controlar la enfermedad minima residual en una situacion (cariotipo normal) para la que, hasta el dfa de hoy, no se encuentran disponibles marcadores moleculares o inmunofenotfpicos.

Ademas, los resultados del estudio realizado por los autores de la presente invencion sugieren la provision de nuevos tratamientos terapeuticos de LMA NPMc+ mediante el uso de oligonucleotidos anti-sentido o ARN pequenos, que, empaquetados en partfculas lipfdicas o virus (Downward J., 2004), son capaces de interferir en los procesos de traduccion y transcripcion de los genes que llevan a cabo las mutaciones que codifican las protefnas nPm mutadas de acuerdo con la invencion. Entre las posibles aplicaciones terapeuticas se encuentra el empleo de anticuerpos intracelulares (“intracuerpos”) (Stocks MR, 2005) dirigidos especfficamente contra la parte C-terminal de los mutantes de NPM, o el uso de moleculas pequenas (peptidos o similares) capaces de inhibir la region C-terminal especffica de los mutantes de NPM.

Entre las posibles aplicaciones terapeuticas deben incluirse aquellas que interfieren con los cambios post- traduccionales (acetilacion, fosforilacion, ubiquitinacion, etc.) de la molecula de NPM (mutada y de tipo silvestre), y las moleculas que interaction con ellos o alteraciones de las vfas de senalizacion celular especfficamente asociadas con la presencia de protefnas de NPM mutadas.

Ademas, la administracion de la protefna NPM mutante o partes de la misma (por ejemplo, peptidos), o secuencias de nucleotidos que codifican la protefna o partes de la misma para la induccion de inmunidad anti-tumoral, puede ser empleada de manera ventajosa para un uso preventivo o terapeutico.

Por lo tanto, son objeto de la presente invencion protefnas nucleofosmina humana (NPM) mutadas, caracterizadas por que tienen una localizacion citoplasmatica y comprenden una secuencia de aminoacidos mutada a nivel de los restos de triptofano 288 y 290 y un motivo de senal de exportacion nuclear (NES), presente en la region C-terminal de la secuencia de la nucleofosmina humana (NP 002511).

En la protefna de la presente invencion, dicho motivo de senal de exportacion nuclear (NES) comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de LxxxVxxVxL (SEQ ID No 1), LxxxLxxVxL (SEQ ID No 2), LxxxFxxVxL (SEQ ID No 3), LxxxMxxVxL (SEQ ID No 4) o LxxxCxxVxL (SEQ ID No 5). Preferiblemente LxxxVxxVxL (SEQ ID No 1) (el motivo NES mas frecuente se selecciona de LCLAVEEVSL (SEQ ID No 6); LCMAVEEVSL (SEQ ID No 7); LCVAVEEVSL (SEQ ID No 8); LSQAVEEVSL (SEQ ID No 9); LCTAVEEVSL (SEQ ID No 10); LSQAVEEVSL (SEQ ID No 11); LCHAVEEVSL (SEQ ID No 12); LCRAVEEVSL (SEQ ID No 13); LCRGVEEVSL (SEQ ID No 14); LCQAVEEVSL (SEQ ID No 15); LCAAVEEVSL (SEQ ID No 16) o LCKAVEEVSL (SEQ ID No 17). Preferiblemente, LxxxLxxVxL (SEQ ID No 2) se selecciona de LWQSLAQVSL (SEQ ID No 18); LWQSLEKVSL (SEQ ID No 19); LWQSLSKVSL (SEQ ID No 20) o LCTFLEEVSL (SEQ ID No 21). Aun mas preferiblemente LxxxFxxVxL (SEQ ID No

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3) se selecciona de LWQCFAQVSL (SEQ ID No 22); LWQCFSKVSL (SEQ ID No 23); LWQRFQEVSL (SEQ ID No 24) o LWQDFLNRL (SEQ ID No 25). En una realizacion preferida de la presente invencion LxxxMxxVxL (SEQ ID No

4) es LWQSMEEVSL (SEQ ID No 26) o LWQRMEEVSL (SEQ ID No 27). En otra realizacion preferida LxxxCxxVxL (SEQ ID No 5) es LWQCCSQVSL (SEQ ID No 28).

Preferiblemente, la region C-terminal de las protefnas mutadas de acuerdo con la invencion incluye el peptido VSLRK (SEQ ID No 29), en la que el L-aminoacido representa el ultimo aminoacido de los motivos NES segun se define anteriormente.

En una realizacion preferida las secuencias de aminoacidos del motivo NES, segun se define anteriormente, pueden comprender un D-aminoacido adicional aguas arriba del L-aminoacido en el extremo N-terminal de dicho motivo NES (por ejemplo, DLCLAVEEVSLRK (SEQ ID No 30); DLCMAVEEVSLRK (SEQ ID No 31); DLCVAVEEVSLRK (SEQ ID No 32); DLCLAVEEVSLRK (SEQ ID No 33); DLWQSLAQVSLRK (SEQ ID No 34); DLWQSLEKVSLRK (SEQ ID No 35).

De acuerdo con un aspecto particular de la presente invencion, las protefnas NPM mutadas, segun se describe anteriormente, pueden fusionarse a una protefna indicadora que a su vez puede ser seleccionada del grupo que consiste en EGFP, p-galactosidasa, luciferasa, GFP. Las protefnas de fusion pueden ser preparadas fundiendo ADN que codifica las anteriores protefnas, disponibles comercialmente, con el peptido de la presente invencion y a continuacion expresando el producto preparado de este modo.

La presente invencion se refiere a una protefna NMP mutada o de fusion tal como se ha descrito anteriormente, conjugada con una nanopartfcula (es decir, punto cuantico o Quantum dot).

En la presente memoria se divulgan tambien las secuencias de oligonucleotidos que codifican las protefnas mutadas o fragmentos y variantes de las mismas, tal como se ha definido anteriormente. Las secuencias de oligonucleotidos de acuerdo con la invencion pueden ser secuencias de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, o sus secuencias complementarias.

Segun una realizacion preferida de la presente invencion, las secuencias de desoxirribonucleotidos pueden incluir una de las secuencias que tienen los siguientes numeros de deposito del GenBank: AY740634, AY740635, AY740636, AY740637, AY740638, AY740639.

En una realizacion particular de la invencion, las secuencias de oligonucleotidos pueden marcarse con un agente seleccionado del grupo que consiste en una sustancia fluorescente, biotina, radioisotopo o una nanopartfcula. El marcaje puede ser tambien de utilidad para el uso de las secuencias de oligonucleotidos mencionadas anteriormente como marcadores para el diagnostico in vitro y/o control de la enfermedad minima residual y/o el pronostico de las LMA caracterizadas por un cariotipo normal. En particular, el marcador consiste en al menos una pareja de cebadores, que pueden marcarse o no en uno o en ambos cebadores con un agente seleccionado del grupo que consiste en una sustancia fluorescente, biotina, un radioisotopo, nanopartfcula (Quantum dot). En otra realizacion, el marcador consiste en al menos una sonda de oligonucleotidos que puede marcarse con un agente seleccionado del grupo que consiste en una sustancia fluorescente, biotina, radioisotopo o nanopartfcula.

En la presente memoria se divulgan tambien los cebadores que tienen las siguientes secuencias:

i) NPM1_25F: NPM1_1112R:

ii) NPM1_390F: NPM1_1043_R;

iii) NPM_940F_mutA NPM1_1112R

iv) NPM_940F_mutB NPM1_1112R

v) NPM_940F_mutC NPM1_1112R

vi) NPM_940F_mutD NPM1_1112R

vii) NPM1-F:

NPM1-R:

viii) NPM1_89F_BamHI: NPM1_1044R_EcoRI:

ix) cNPM-F: y

cNPM mut.A-R: o

cNPM mut.B-R:

5'-GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC-3';

5'-CCT GGACAACATTT AT CAAACACGGT A-3'; 5'-GGTCTTAAGGTT GAAGT GTGGT-3';

5'-T CAACT GTT ACAGAAAT GAAATAAGAC G-3'; 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGTCT-3';

5 '-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3'; 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCAT3'; 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA3'; 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCGT-3';

5 '-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3'; 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCT-3';

5 '-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3';

5'-TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3';

5'-CCAGACTATTTGCCATTCCTAAC-3';

5'-GCCACGGATCCGAAGATTCGATGGAC-3'

5'ATCAAGAATTCCAGAAATGAAATAAGACG-3';

5'-GAAGAATT GCTTCCGGAT GACT-3'

5'-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3'

5'-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3'.

(SEQ ID No 36) (SEQ ID No 37) (SEQ ID No 38) (SEQ ID No 39) (SEQ ID No 40) (SEQ ID No 41) (SEQ ID No 42) (SEQ ID No 43) (SEQ ID No 44) (SEQ ID No 45) (SEQ ID No 46) (SEQ ID No 47) (SEQ ID No 48) (SEQ ID No 49) (SEQ ID No 50) (SEQ ID No 51) (SEQ ID No 52)

(SEQ ID No 53)

(SEQ ID No 54)

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En particular, los cebadores i) pueden ser empleados para la amplificacion, preferiblemente mediante RT-PCR, de la region codificante del gen de la NPM (NM 002520). Los cebadores ii) pueden ser utilizados en solitario para la amplificacion que produce una construccion con un vector pCRII-de raton (Invitrogen). Los cebadores iii), iv), v), vi) mencionados anteriormente han sido designados respectivamente para la amplificacion mediante RT-PCR de las secuencias de oligonucleotidos que codifican las protefnas mutadas:

A) DLCLAVEEVSLRK (SEQ ID No 30) - cebador iii);

B) DLCMAVEEVSLRK (SEQ ID No 31) - cebador iv);

C) DLCVAVEEVSLRK (SEQ ID No 32) - cebador v);

D) DLCLAVEEVSLRK (SEQ ID No 33) - cebador vi);

caracterizadas por tener como mutacion una duplicacion de un tetranucleotido. Finalmente, los cebadores vii) se emplean para la amplificacion mediante ADN genomico del exon 12 de la region C-terminal de la protefna NPM; mientras que los cebadores viii) se utilizan para la introduccion en un vector de expresion de las secuencias de acuerdo con la invencion.

En la presente memoria se divulga tambien un plasmido que comprende una de las secuencias de oligonucleotidos descritas anteriormente. Preferiblemente, dicho plasmido puede ser seleccionado del grupo que consiste en pGEM-T y pGEM-T Easy (Promega).

Otro objeto esta representado por un vector de expresion (tal como, por ejemplo, un vector viral o pEGFP-c1) que comprende una de las secuencias de nucleotidos descritas anteriormente. En un modo de realizacion preferida de la presente invencion dicho vector es pEGFP-c1, que comprende la secuencia del gen indicador EGFP.

En la presente memoria se divulga tambien una celula hospedadora capaz de expresar al menos una de las protefnas mutadas descritas anteriormente, donde dicha celula comprende el plasmido con las caracterfsticas anteriormente definidas. Preferiblemente, la celula hospedadora es procariotica.

En la presente memoria se divulga tambien una lfnea celular, preferiblemente de mamffero (aunque aun mas preferiblemente murina, tal como NIH 3T3 y BaF3), que comprende el vector de expresion a ser empleado como un modelo de estudio experimental de LMA NPMc+ o como un modelo de cribado para ensayar las nuevas moleculas que van a ser utilizadas como farmacos potenciales para dicho tipo de leucemia.

En la presente memoria se divulga tambien un metodo para la preparacion de protefnas nucleofosmina (NPM) mutadas que comprende las siguientes etapas de:

a) amplificacion de la secuencia de oligonucleotidos por RT-PCR mediante al menos una pareja de cebadores;

b) introduccion de la secuencia de oligonucleotidos amplificada en la etapa a) en el vector pGEM-T Easy vector y transferencia en un vector de expresion mediante enzimas de restriccion;

c) transfeccion del vector de expresion en una lfnea celular competente de mamffero seleccionada de entre las lfneas celulares murinas NIH 3T3 y BaF3;

d) extraccion y purificacion de las protefnas mutadas.

En una forma preferida del metodo, dicha, al menos, pareja de cebadores de la etapa a) es:

NPM1_89F_BamHI:

5'-GCCACGGATCCGAAGATTCGATGGAC-3' (SEQ ID No 50)

NPM1_1044R_EcoRI:

5'-ATCAAGAATTCCAGAAATGAAATAAGACG-3'(SEQ ID No 51)

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal, o a un fragmento del mismo (tal como, por ejemplo, un fragmento scFv), capaz de reconocer y unirse de manera selectiva a al menos una protefna NPM mutada de acuerdo con la invencion.

De acuerdo con un particular aspecto de la presente invencion los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden conjugarse con un agente seleccionado de una sustancia fluorescente, enzima, radioisotopo, nanopartfcula o medicamento.

Es otro objeto de la presente invencion el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales como marcadores para el diagnostico y el pronostico in vitro, para el control de la enfermedad minima residual y/o la preparacion de un farmaco para la terapia de las LMA de cariotipo normal. En una realizacion preferida, la presente invencion contempla el uso de anticuerpos intracelulares (“intracuerpos”) dirigidos especfficamente contra epftopos de la parte C-terminal de los mutantes como un medicamento para inhibir la actividad de las protefnas NPM mutadas.

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Es un objeto de la presente invencion un kit diagnostico para la deteccion de las LMA de cariotipo normal, partiendo de una muestra biologica, que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo. Dicho anticuerpo o fragmento puede ser dirigido contra epftopos resistentes a los fijadores de la protefna NPM nativa, o contra la parte C-terminal mutada de la NPM. Dicha deteccion puede lograrse mediante ensayos inmunohistoquimicos, inmunoenzimaticos, inmunotransferencia, inmunoprecipitacion o una combinacion de los mismos.

La presente invencion proporciona ademas un metodo de diagnostico o pronostico in vitro de la LMA de cariotipo normal y/o control de la enfermedad minima residual que comprende medios seleccionados de sondas de oligonucleotidos, cebadores, epftopos o anticuerpos para detectar la protefna nucleofosmina mutada (NPM) de la invencion.

Un objeto particular de la presente invencion esta representado, por consiguiente, por el epftopo antigenico especffico de la leucemia que se crea a nivel de la region C-terminal de las protefnas nucleofosmina mutadas, caracterizado por comprender el peptido VSLRK y/o la mutacion de los restos de triptofano 288 y 290 y/o el motivo NES segun se ha definido anteriormente.

Otro objeto de la presente invencion esta constituido por un kit diagnostico para la deteccion de las LMA de cariotipo normal en una muestra biologica y/o para controlar la enfermedad minima residual, que comprende al menos una de las secuencias de oligonucleotidos que codifica la protefna nucleofosmina mutada (NPM) de la invencion o una parte de la misma. Dicha deteccion puede realizarse mediante PCR, RT-PCR, hibridacion en tiempo real o in situ, transferencia puntual inversa (RBD, Reverse Dot Blot), tecnicas de matrices de tejidos multiples (My) o una combinacion de las mismas.

En particular, en la presente memoria se divulga un kit diagnostico por PCR en tiempo real para controlar la enfermedad minima residual que comprende los siguientes componentes:

i) la pareja de cebadores

cNPM-F: 5'-GAAGAATT GCTTCCGGAT GACT-3' (SEQ ID No 52) y cNPM mut.A-R: 5'-

CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3' (SEQ ID No 53) o

cNPM mut.B-R: 5'-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3' (SEQ ID No 54)

ii) y la sonda 5'FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3' (SEQ ID No 55).

En la presente memoria se divulga tambien un soporte solido, tal como por ejemplo una membrana, o una matriz, que comprende al menos una de las secuencias de oligonucleotidos que codifica la protefna nucleofosmina mutada (NPM) de acuerdo con la invencion.

En la presente memoria se divulga tambien un metodo in vitro para la deteccion de secuencias de oligonucleotidos que codifica las protefnas nucleofosmina mutadas descritas anteriormente que comprenden las siguientes etapas de:

a) extraccion de ARN de la muestra biologica de ensayo;

b) retro-transcripcion y amplificacion por RT-PCR o PCR en tiempo real mediante el uso de cebadores especfficos de la secuencia de NPM (Gen Bank NM 002520), segun se ha definido anteriormente;

c) purificacion y secuenciacion de los productos de la PCR utilizando cebadores.

En una realizacion preferida del metodo anterior, los cebadores empleados en la etapa b) son las parejas de cebadores directos y cebadores inversos de i) a ix) detallados anteriormente. Preferiblemente, los cebadores de la etapa c) se seleccionan del grupo que consiste en:

NPM1_25F:

NPM1_1112R:

NPM1_390F:

NPM1_1043_R;

5'-GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC-3'(SEQ ID No 36); 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3'(SEQ ID No 37); 5'-GGTCTTAAGGTTGAAGTGTGGT-3' (SEQ ID No 38);

5'-TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3' (SEQ ID No 39)

Los mismos cebadores i) tomados por separado al igual que los cebadores ii), pueden ser utilizados en la etapa c) del metodo anterior (para la secuenciacion).

En particular, en el caso en el que se emplea un metodo en tiempo real para la deteccion, el sistema de “sonda de hibridacion” o “deteccion con verde SYBR” o “sonda de hidrolisis” puede emplearse de forma alternativa.

En una realizacion preferida la etapa b) emplea un sistema de PCR en tiempo real especffico dela mutacion. Los cebadores utilizados son

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cNPM-F: 5'-GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3' (SEQ ID No 52) y cNPM mut.A-R: 5'-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3' (SEQ ID No 53) o cNPM mut.B-R: 5'-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3' (SEQ ID No 54)

y la sonda 5'FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3' (SEQ ID No 55) tal como se muestra en la Figura 13 (ver tambien el Ejemplo 5).

En la presente memoria se divulga tambien una sonda de oligonucleotidos que tiene la siguiente secuencia de oligonucleotidos 5'FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3' (SEQ ID No 55).

En la presente memoria se divulga tambien un metodo para la deteccion de secuencias de oligonucleotidos que codifican las protefnas nucleofosmina mutadas descritas anteriormente que comprende las siguientes etapas de:

a) extraccion de ARN de la muestra biologica de ensayo;

b) amplificacion mediante el uso de cebadores especfficos para la secuencia de la NPM de (Gen Bank NPM_002520);

c) deteccion de los productos de la PCR.

Preferiblemente, la amplificacion tiene lugar mediante PCR diagnostica o PCR en tiempo real. En particular, en el caso en el que se emplea un metodo en tiempo real para la deteccion, puede emplearse de forma alternativa el sistema de “sonda de hibridacion” o “deteccion con verde SYBR” o “sonda de hidrolisis”.

En una realizacion preferida del metodo anterior los cebadores empleados en la etapa b) se seleccionan del grupo que consiste en:

i) NPM_940F_mutA: NPM1 1112R:

5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGTCT-3' (SEQ ID No 40); 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3'(SEQ ID No 41);

o

NPM1_390F:

NPM1_1043_R;

ii) NPM_940F_mutB: NPM1_1112R:

iii) NPM_940F_mutC NPM1_1112_R

iv) NPM_940F_mutD NPM1 1112 R

5'-GGTCTTAAGGTTGAAGTGTGGT-3' (SEQ ID No 38); 5'-TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3' (SEQ ID No 39);

5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCAT 3' (SEQ ID No 42); 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA 3' (SEQ ID No 43);

5'-GAGGCT ATT CAAGAT CT CT GCGT-3' (SEQ ID No 44); 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3' (SEQ ID No 45);

5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCT-3' (SEQ ID No 46); 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3' (SEQ ID No 47).

En particular, en el caso en el que para la deteccion se emplee un metodo en tiempo real, puede emplearse de forma alternativa el sistema de “sonda de hibridacion” o “deteccion con verde SYBR” o “sonda de hidrolisis”.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion tiene como objeto un metodo in vitro para la deteccion de la localizacion citoplasmatica de la NPM en una muestra biologica que comprende las siguientes etapas de:

a) poner en contacto la muestra biologica con al menos un anticuerpo dirigido contra un epftopo resistente a los fijadores de la protefna NPM, adecuado para detectar la localizacion citoplasmatica de la NPM;

b) deteccion del enlace anticuerpo-epftopo antigenico, mediante tecnicas estandar de inmunofluorescencia o inmunoenzimaticas.

Dicha muestra biologica de la etapa a) del metodo anterior se selecciona del grupo que consiste en: cortes de tejido incluido en parafina, preferiblemente de medula osea (biopsia osteomedular o coagulo hematico) o frotis medulares y muestras para citologfa sangufnea o lfquida.

Preferiblemente, dicho anticuerpo de la etapa a) del metodo es un anticuerpo monoclonal. En particular, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales dirigidos contra epftopos resistentes a fijadores de la NPM (Cordell et al., 1999; Falini et al., 2002) que son capaces de detectar la localizacion citoplasmatica de la protefna.

En una realizacion preferida el metodo anterior puede incluir posteriormente otra etapa c) para la deteccion de protefnas de NPM mutadas en las muestras patologicas descritas anteriormente (cortes, frotis, muestras citologicas) mediante anticuerpos capaces de reconocer y unirse de forma selectiva a al menos un epftopo antigenico de protefnas de NPM mutadas de acuerdo con la invencion, o c1) para la deteccion de secuencias de oligonucleotidos mutadas, por ejemplo, mediante metodos de amplificacion con cebadores especfficos. Los cebadores de la etapa

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c1) pueden ser:

NPM_940F_mutA;

NPM1_1112R NPM_940F_mutB NPM1_1112R NPM_940F_mutC NPM1_1112R NPM_940F_mutD NPM1_1112R

para la identificacion de las mutaciones A-D.

En el metodo de acuerdo con la invencion, el epftopo antigenico de la etapa c) comprende preferiblemente el peptido VSLRK.

En la presente memoria se divulgan tambien oligonucleotidos anti-sentido capaces de hibridar con al menos una de las secuencias de oligonucleotidos que codifican las protefnas nucleofosmina mutadas de acuerdo con la invencion y de interferir con sus procesos de transcripcion. En una realizacion preferida, es un objeto de la presente invencion el uso de oligonucleotidos anti-sentido para la preparacion de un farmaco para el tratamiento de LMA primarias.

En la presente memoria se divulgan tambien una secuencia de ribonucleotidos (ARNi) capaz de hibridar de forma selectiva con al menos una de las secuencias de oligonucleotidos que codifican las protefnas nucleofosmina mutadas de acuerdo con la invencion, e interferir con su expresion. El ARNi es una molecula de ARN de doble cadena, que comprende una combinacion de cadenas de oligonucleotidos sentido y anti-sentido, que evita la traduccion de los ARNm diana.

De acuerdo con un aspecto en particular, la secuencia de ribonucleotidos, ARNi, ademas en la forma de microARN, se usa para la preparacion de un farmaco para el tratamiento de LMA primarias.

Ademas, entre las posibles aplicaciones terapeuticas, se contemplan, de acuerdo con la invencion, las moleculas que interfieren con los procesos de cambios post-traduccionales (acetilacion, fosforilacion, ubiquitinacion) de la molecula de NPM (mutada y de tipo silvestre), o con alteraciones de las vfas de senalizacion celular especfficamente asociadas con la presencia de una de las protefnas NPM mutadas que son objeto de la presente invencion. Ademas, en la presente memoria se divulga el uso de inhibidores especfficos de la parte C-terminal de las protefnas NPM mutantes mediante moleculas pequenas (peptidos u otras), identificadas utilizando “SAR por RMN” (Shuker et al., 1996) u otros metodos.

Es otro objeto de la presente invencion el uso de secuencias de protefnas nucleofosmina de acuerdo con la invencion, o partes (peptidos) de las mismas, o una combinacion de las mismas, para la preparacion de una vacuna anti-tumoral. De hecho, las protefnas o peptidos de nucleofosmina se pueden utilizar como vacunas contra las leucemias LMA NPMc+.

Otro objeto de la presente invencion esta representado por una composicion farmaceutica que comprende al menos una de las protefnas nucleofosmina de acuerdo con la invencion, o partes (peptidos) de las mismas, junto con excipientes y adyuvantes farmacologicamente aceptables.

Es otro objeto de la presente invencion una vacuna anti-tumoral que comprende al menos una de las protefnas nucleofosmina de acuerdo con la invencion, o fragmentos (peptidos) de las mismas, junto con excipientes y adyuvantes farmacologicamente aceptables. Dichas vacunas anti-tumorales son especfficas para el tratamiento preventivo y terapeutico de la LMA NPMc+.

La presente invencion finalmente tiene tambien como objeto un animal transgenico no humano que comprende una protefna nucleofosmina mutada segun se ha descrito anteriormente. Dicho animal transgenico no humano puede ser empleado como un modelo de estudio experimental para el estudio de nuevos farmacos para el tratamiento de la LMA NPMc+.

La presente invencion sera descrita a continuacion, de forma ilustrativa y no limitativa, de acuerdo con sus realizaciones preferidas, con particular referencia a las figuras de los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1A muestra los histogramas que hacen referencia a la expresion de nucleofosmina subcelular en la LMA, respectivamente, NPMc+ y NPMC- en el panel izquierdo y derecho, respectivamente; en el panel izquierdo las flechas indican celulas leucemicas mientras que la punta de flecha indica una celula hematopoyetica residual con una positividad de NPM restringida al nucleo (x 1.000) esperada; las flechas en el panel derecho indican una celula mitotica con expresion citoplasmatica de NPM (x 1.000) esperada;

La Figura 1B muestra la expresion citoplasmatica de NPM en 1706 tumores humanos, que es especffica de las

5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGTCT-3' (SEQ ID No 40); 5'-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3' (SEQ ID No 41); 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCAT 3' (SEQ ID No 42); 5'-CCT GGACAACATTTAT CAAACACGGTA 3' (SEQ ID No 43); 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCGT-3' (SEQ ID No 44); 5'-CCT GGACAACATTTAT CAAACACGGTA-3' (SEQ ID No 45); 5'-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCT-3' (SEQ ID No 46); 5'-CCT GGACAACATTTAT CAAACACGGTA-3' (SEQ ID No 47);

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LMA primarias, no siendo detectable en otros tumores hematopoyeticos y extra-hematopoyeticos, tales como las LMA secundarias; leucemia linfoide aguda (LLA); leucemia mieloide cronica (LMC); sfndromes mielodisplasicos (SMD); linfomas no Hodgkin (LNH) y tumores solidos extra-hematopoyeticos (ExTRA-HEMOP);

La Figura 1C muestra los histogramas que hacen referencia a la correlacion entre la expresion y la morfologfa subcelular de NPM en 591 LMA primarias del estudio de GIMEMA/EORTC mas 70 LMA del subtipo M3 con t(15; 17); las LMA-NPMc+ pueden pertenecer a todos los subgrupos FAB, pero son mas frecuentemente del tipo M4- M5, la forma FAB-15 M5b casi siempre contiene mutaciones de NPM.

La Figura 1D muestra la expresion citoplasmatica de NPM en el linaje de celulas leucemicas mieloides y eritroides (“implicacion multilinaje”); en el panel izquierdo se muestra la medula infiltrada por blastos mieloides (punta de flecha) y eritroides (flecha); en el panel central se indican precursores eritroides anomalos (flecha) y grupos de blastos mieloides (flechas dobles), donde ambos expresan la NPM a nivel citoplasmatico y nuclear; la punta de flecha indica una celula hematopoyetica residual con la prevista NPM restringida al nucleo esperada; en el panel de la derecha se indican las celulas con la expresion de nucleolina (C23) restringida al nucleo esperada; las flechas en los paneles central y derecho indican celulas leucemicas tenidas doblemente de marron para glicoforina (superficie) y tenidas de azul para la NPM (citoplasma mas nucleo) o para C23 (restringida al nucleo); todas las cifras han sido obtenidas utilizando la tecnica inmunoenzimatica APAAP; x 1.000;

La Figura 2 muestra los histogramas que hacen referencia a la asociacion entre la expresion de la NPM citoplasmatica y la presencia de CD34: las figuras 2A-C muestran que en la mayorfa de los casos la expresion de NPM citoplasmatica se asocia con negatividad en CD34, mientras que los casos de NPMc-LMA muestran un comportamiento opuesto; la Figura 2D muestra una NPMc+ de LMA de cariotipo normal y ausencia de expresion de CD34 (biopsia osteomedular, tecnica APAAP x 1.000); la Figura 2E muestra una NPMc-LMA con cariotipo normal y positividad intensa de CD34 (biopsia osteomedular, tecnica APAAP x 1.000); la figura F representa analisis FACS de una LMA NPMc+; panel izquierdo: control; panel central: CD34 (FITC) y CD133 (PE) que carece de celulas leucemicas; panel derecho: CD33(FITC) y CD13(PE) que co-expresan celulas leucemicas;

La Figura 3A hace referencia al analisis de 493 pacientes con LMA del estudio GIMEMA/EORTC y muestra que los casos de NPMc+ se asocian exclusivamente al cariotipo normal (NK: cariotipo normal; AK: cariotipo anomalo);

La Figura 3B muestra el analisis del estudio GIMEMA/EORTC de 493 LMA, mas 109 pacientes no incluidos en el estudio (70 leucemias promielocfticas agudas con t(15; 17) y 39 LMA con reordenamientos cromosomicos importantes); 24 NPMc+ (columna “otros”) no se asocian nunca con anomalfas cromosomicas importantes y muestran unicamente anomalfas de menor importancia; ninguna de las LMA NPMc+ se asocia con anomalfas cromosomicas importantes; 24 casos de NPMc+ (columna “otros”) muestran unicamente anomalfas de menor importancia;

Las Figuras 3C y 3D muestran la localizacion prevista de la NPM a nivel nuclear en la LMA NPMc+ de tipo M3 y M4eo (tecnica APAAP; x 1.000);

La Figura 3E muestra que, en el contexto de las LMA de cariotipo normal (NK), las mutaciones del FLT3-ITD (duplicacion interna en tandem, ITD) ocurren mas frecuentemente en las LMA NPMc+ en comparacion con las LMA NPMc- (U = no mutada; M = mutada);

La Figura 3F muestra que, en el contexto de las LMA de cariotipo normal (NK), tienen lugar formas NPMc+ mas frecuentemente en intervalos de edad mas avanzada;

La Figura 3G muestra un modelo de regresion logfstica multivariable que establece la asociacion independientes entre la NPM citoplasmatica y el FLT3-ITD; Var Indep: variable independiente; GL: grado de libertad; Sig: significancia; OR: medidas de riesgo; *: cariotipo normal frente a anomalo (quedan excluidos eventos geneticos mayores); M: mutado; U: no mutado;

La Figura 4A es una representacion esquematica del gen de la NPM; los bloques oscuros indican secuencias de codificacion; los bloques no coloreados indican 3'- y 5'-UTR; MB es el dominio de union a metales; Ac: es el domino acido; NLS representa la senal de localizacion nuclear; NAB representa el dominio de union a acido nucleico; las flechas oscuras indican la posicion en el mapa de los cebadores para el ADN genomico y las flechas no tenidas indican los cebadores para la amplificacion de ADNc;

La Figura 4B muestra una secuencia de la NPM de tipo silvestre (nucleotidos 952-989) alineada con seis variantes mutantes, denominadas de A a F; las letras en mayusculas indican las introducciones de nucleotidos; la secuencia de la protefna mutada con restos de triptofano (W) subrayados en su extremo C-terminal esta representada a la derecha, mientras que la secuencia de aminoacidos nueva comun a todas las protefnas mutadas se indica en el area delimitada con un recuadro; para cada variante, se proporciona el numero total de casos afectados;

La Figura 4C muestra la secuenciacion de la NPM de un paciente que muestra una mutacion A, segun se obtiene mediante secuenciacion directa (en la parte superior) y despues de la clonacion y la secuenciacion de los dos alelos de la variante (centro, tipo silvestre, inferior, alelo mutado); las flechas indican la posicion en donde el alelo diverge;

La Figura 4D muestra la reconstruccion tridimensional de la microscopfa confocal de celulas NIH 3T3 transfectadas con plasmidos que codifican alelos de NPM marcada con EGFP de tipo silvestre (parte superior) y mutante (parte inferior); la protefna de tipo silvestre se localiza en los nucleolos y membrana nuclear, mientras que la NPM mutada muestra una localizacion citoplasmatica aberrante;

La Figura 5A muestra analisis de transferencia Western (anticuerpos Sil-C vs 376) de la totalidad de las celulas lisadas de celulas leucemicas de NPMc+ o NPMc-; el anticuerpo Sil-C reconoce de manera especffica la protefna NPM mutada unicamente en los casos de LMA con mutacion de la NPM (NPMc+);

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La Figura 5B muestra el analisis de transferencia Western (anticuerpo Sil-C) de una fraccion nuclear (N) y citoplasmatica (C) de un paciente leucemico con la mutacion A de la NPM: el Sil-C reconoce de manera especffica la protefna NPM mutada en la fraccion citoplasmatica de celulas leucemicas primarias NPMc+; los resultados representan 3 experimentos independientes;

Las Figuras 5C-5E muestran biopsias osteomedulares de celulas leucemicas NPMc+ con la mutacion A: (5C) imagen tfpica de la leucemia mieloide aguda FAB-M5; la flecha indica una celula leucemica grande con un nucleo en forma de rinon; (5D) el anticuerpo Sil-C que reconoce de manera especffica el mutante (NPMm), muestra una positividad restringida al citoplasma (flecha); T indica una trabecula osea; (5E) el anticuerpo monoclonal anti- NPM 376 reconoce tanto la protefna NPM de tipo silvestre como la NPM mutada y tine las celulas leucemicas en el citoplasma y en el nucleo (flecha);

Las Figuras 5F-5G muestran biopsias osteomedulares de mutaciones de la NPM que no corresponden a leucemia promielocftica (NPMc-): (5F) morfologfa tfpica de una LMA-M3 (hematoxilina-eosina, x 400); (5G) el anticuerpo Sil-C no tine las celulas leucemicas M3 y tine unicamente la pared del vaso mediante reactividad cruzada; el asterisco indica el lumen del vaso (tecnica APAAP; contra-tincion en hematoxilina; x 400);

La Figura 6 muestra los cambios en el triptofano 288 y 290 y la creacion de un motivo NES en protefnas NPM mutantes identificadas en pacientes leucemicos; Cit: citoplasmatico; nd: no disponible; IH: inmunohistoqufmica; aminoacidos en los paneles: motivo NES; aminoacidos subrayados: restos de triptofano;

Las Figuras 7A-B muestran celulas HI299 transfectadas con ADNc que codifican los mutantes NPMwt y NPM de A a D, en ausencia (7A) y en presencia (7B) de leptomicina B (LMB). El eGFP-NPMwt se localiza en los nucleolos tanto en presencia como en ausencia de LMB. En ausencia de LMB, todos los mutantes asociados con las GFP (de A a D) muestran la localizacion citoplasmatica aberrante (7A), mientras que los mismos mutantes asociados con la eGFP se recolocan por completo en el nucleo en presencia de LMB (7B);

Las Figuras 7C-E muestran el analisis en diversos intervalos de tiempo de los efectos de la LMB en el mutante A unido a la eGFP (eGFP-NPMmutA) en celulas N1H-3T3: (7C) imagenes de microscopio confocal de celulas NIH- 3T3 en los tiempos indicados en los que los cfrculos blancos representan las regiones (regiones de interes, ROI) en las que la intensidad de fluorescencia de la eGFP-NPMmutA ha sido calculada; (7D) medicion de fluorescencia en areas seleccionadas (ROI) de celulas NIH-3T3; (7E) analisis de transferencia Western de la distribucion sub-celular de la eGFP-NPMmutA en celulas N1H-3T3 utilizando el anticuerpo monoclonal anti-GFP; Las Figuras 8 A-B muestran experimentos con microscopio confocal para verificar la relocalizacion de los mutantes de la NPM en el nucleoplasma con leptomicina B (LMB): (8A) imagen de microscopio confocal de celulas NIH-3T3 transfectadas con GFP-mutA o con GFP-NPMwt en presencia o en ausencia de LMB; en condiciones basales, el mutante se localiza unicamente en el citoplasma (parte superior izquierda), pero se reposiciona en el nucleoplasma (parte superior derecha) despues de la incubacion con LMB; GFPNPMwt se localiza en los nucleolos tanto en presencia como en ausencia de LMB (panel central, izquierdo y derecho); el panel inferior muestra celulas tratadas con LMB y transfectadas con GFP-mutA y tenidas en los nucleolos con un anticuerpo monoclonal anti-nucleolina (C23) (flecha); el mutante de la protefna NPM (verde) se localiza en el nucleoplasma, mientras que la nucleolina/C23 (rojo) esta restringida a los nucleolos, la membrana nuclear esta tenida en azul; (8B) imagen de microscopio confocal de la medula osea de una leucemia NPMc+ con mutacion A de la NPM (panel superior); las celulas leucemicas muestran diferenciacion mieloide en el aspirado medular (parte superior izquierda, flecha) y biopsia osea (parte superior central); las celulas leucemicas, en su mayorfa cerca de una trabecula osea (T), muestran expresion de la NPM citoplasmatica (y nuclear) (parte superior derecha); en los paneles centrales e inferiores, se muestran celulas leucemicas purificadas tenidas con anticuerpo monoclonal anti-NPM 376, y se observan en imagen de microscopio confocal en ausencia (panel central) y en presencia (panel inferior) de leptomicina B; las imagenes han sido reconstruidas en 3-D y se ha realizado un corte electronico sobre la superficie nuclear para observar mejor la localizacion de la NPM. En condiciones basales el anticuerpo monoclonal 376 que no distingue entre la nPm de tipo silvestre y el mutante A, marca tanto los nucleolos como el citoplasma (panel central); despues del tratamiento con leptomicina B, la NPM se encuentra en el nucleo de nuevo (panel inferior);

La Figura 9A muestra la relocalizacion nuclear del mutante de NPM mediante leptomicina B en celulas OCI/AML3: (9A) en ausencia de LMB, el anticuerpo anti-NPM 376 subraya tanto los nucleolos como el citoplasma (izquierda); la incubacion con LMB determina una relocalizacion de la NPM en el nucleoplasma (derecha);

La Figura 9B muestra la inmunoprecipitacion (IP) de celulas lisadas de celulas OCI-AML3 y celulas U937 con IgG de control o anticuerpos anti-NPMm de conejo (Sil-C) y anticuerpo anti-NPM murino: los analisis de transferencia Western con anticuerpos anti-Crm1 se muestran en los paneles superiores, mientras que aquellos con anticuerpos anti-NPMm (Sil-C) y anti-NPM (CI-376) se muestran en los paneles central e inferior; WCL indica celulas OCI-AML3 lisadas incluidas como control; la figura muestra la interaccion ffsica entre la protefna NPM mutada y Crm1:

La Figura 10 muestra un analisis con microscopio confocal de celulas N1H-3T3 transfectadas con eGFP-NPM de tipo silvestre o eGFP-NPM mutante, y muestra que las mutaciones de NES y triptofano son ambas necesarias para exportar los mutantes de NPM; la destruccion de la estructuras de NES en el mutante A de NPM (NPM mut A no- NES) evita la exportacion del nucleo, de manera que el mutante aparece localizado en el nucleoplasma tanto en presencia como en ausencia de LMB; el mutante E de la NPM que posee triptofano 288 pero carece del 290, se reposiciona parcialmente en los nucleolos despues del tratamiento con LMB; la reintroduccion del triptofano 290 (NPMmutA, A290W) produjo aproximadamente el mismo efecto; cuando ambos triptofanos (288 y 290) se habfan introducido nuevamente en el mutante A (C288W + A290W) la correspondiente protefna

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fusionada con la eGFP, a pesar de la presencia de NES, se localiza exclusivamente en los nucleolos, tanto en presencia como en ausencia de LMB;

La Figura 11A muestra experimented de co-transfeccion de celulas murinas con el mutante A de GFP-NPM y HA- NPM de tipo silvestre; el mutante de NPM actua como un dominante negativo frente a la NPM de tipo silvestre que determina su desplazamiento parcial en el citoplasma;

La Figura 11 B muestra un analisis de transferencia Western con a-NPM o a-HA (panel izquierdo) e inmunoprecipitacion con un anticuerpo anti-Flag y transferencia Western con a-NPM o a-HA (panel derecho); los datos bioqufmicos confirman los del marcaje con protefnas fluorescentes;

La Figura 11C muestra un esquema hipotetico del mecanismo de la localizacion nucleo-citoplasma alterada del mutante A de la NPM y de la NPM de tipo silvestre, puntos blancos no tenidos: restos de triptofano; puntos oscuros: triptofanos mutados; cuadrado: senal de exportacion nuclear (NES);

La Figura 12 muestra el esquema de un enfoque de inmunotincion de la NPM para estudiar la leucemia mieloide aguda en la que los casos se dividen, respectivamente, en dos grupos para la expresion de NPM citoplasmatica (NPMc+) o nuclear (NPMc-);

La Figura 13 ilustra la sonda y los cebadores utilizados en RQ-PCR; se muestran dos sistemas especfficos para las mutaciones A y B; la estrategia de amplificacion utiliza un cebador directo (cNPM1-F) y una sonda (c.Probe) comun para ambos sistemas; el cebador directo se posiciona en el exon 11, mientras que la sonda se posiciona en la union entre el exon 11 y el exon 12; los dos inversos son cNPM-mut.A-R y cNPM-mut.B-R especfficos a la mutacion y ambos se disenan en el exon 12; la tabla indica secuencias de cebadores y de la sonda;

La Figura 14 muestra el grafico de amplificacion en la RQ-PCR plasmfdica en relacion con 5 diluciones plasmfdicas ensayadas por duplicado; el plasmido contiene la secuencia del gen de la NPM1 con la mutacion A; la tabla muestra la reproducibilidad de los datos en 4 experimentos adicionales;

La Figura 15 muestra el grafico de amplificacion del ADNc en RQ-PCR en relacion con seis diluciones en serie en base a una potencia de factor 10 de una muestra de LMA NPMc+ con mutacion A en el diagnostico; la curva estandar subraya la “inclinacion”, el coeficiente de correlacion y el corte con eje Y; la tabla muestra los resultados de diagnostico logrados en 4 muestras con la mutacion A y en 1 con la mutacion B; en todas las muestras se ha obtenido una “sensibilidad reproducible maxima” de 10-4;

La Figura 16 muestra el control del numero de copias mutadas de NPM, en el diagnostico y despues del tratamiento de induccion en 13 pacientes con LMA NPMc+ con mutacion A (numero de copias expresada como numero de copias de NPM con mutacion A/10000 copias de ABL);

(Abreviatura: Cr= remision completa, PR= remision parcial, NR = No Responde);

La Figura 17 muestra el control del numero de copias mutadas de NPM, en el diagnostico despues del tratamiento de induccion y durante el seguimiento en 3 pacientes con LMA NPMc+ con mutacion A; la RQ-PCR muestra una cinetica diferente en la disminucion del numero de copias; a los 50 dfas de terapia todos los pacientes mostraron remision hematologica completa, pero mostraron un numero diferente de copias mutadas de NPM1; el paciente I (cuadrado) muestra una remision hematologica persistente; un numero mfnimo de copias mutadas se alcanza 90 dfas despues de la terapia y permanece igual durante el seguimiento; en el paciente II (rombo) el numero de copias mutadas de NPM1 alcanza un mfnimo aproximadamente 100 dfas despues de la terapia; un aumento determinante del numero de copias es evidente durante el seguimiento, junto con la recafda hematologica alrededor de 200 dfas despues de la terapia; en el paciente III (triangulo) el numero de copias mutadas de NPM1 alcanza un mfnimo alrededor de 140 dfas despues de la terapia; un aumento determinante del numero de copias es evidente durante el seguimiento junto con la recafda hematologica (no representada en la figura) que tuvo lugar aproximadamente un mes despues (no existe el dato molecular de la recafda); (abreviatura: CR = remision completa).

EJEMPLO 1: Estudio de la expresion genica de NPM y del valor diagnostico y pronostico de la misma en las LMA

Se ha realizado un estudio que permitio identificar un gran subgrupo de leucemias mieloides agudas (alrededor de un tercio de las LMA en el adulto), caracterizado por la localizacion de la NPM citoplasmatica en blastos leucemicos, mutaciones del gen de la NPM, elevada frecuencia de cariotipo normal y buena respuesta a la quimioterapia de induccion.

MATERIALES Y METODOS Muestras de tumores y pacientes

Los estudios inmunohistoqufmicos han sido realizados en 1845 muestras de tumores incluidos en parafina. Las LMA incluyen: 591 LMA primarias (edad 15-60, queda excluido el subgrupo M3) del estudio de GIMEmA/EORTC, 12 LMA y 70 leucemias promielocfticas agudas, 69 LMA primarias y 135 secundarias fuera de protocolo. Las muestras restantes representan tumores hematopoyeticos y extra-hematopoyeticos distintos de la LMA.

Con consentimiento informado, la biopsia osteomedular de cada paciente con LMA se ha fijado en B5, transferida en alcohol al 70 %, descalcificada e incluida en parafina.

Anticuerpos

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Se han empleado anticuerpos monoclonales contra la NPM (Cordell et al., 1999; Falini et al., 2002), que permiten la identificacion de la protema en cortes incluidos en parafina habituales. Las muestras de biopsia tambien se han tenido con anticuerpos monoclonales contra las siguientes moleculas: nucleolina (C23) (Saint Cruz Biotechnology Inc., CA, EE.UU.), glicoforina, CD34 (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), CD133 (Miltenyi Biotech, Bologna, Italia), yALK (Falini et al., 1999).

Tincion inmunohistoqufmica

Se ha realizado inmunotincion utilizando la tecnica APAAP (Cordell et al., 1984). La distribucion subcelular de la NPM (nucleo frente citoplasma) se ha evaluado sin conocer el subtipo FAB, la citogenetica o la biologfa molecular. Los casos han sido clasificados como NPMc+ (positivos para citoplasma) o NPMc- (negativos para citoplasma). Todos los casos han sido tenidos en paralelo para nucleolina (C23) que, segun era de esperar, en el caso de NPMc+, ha mostrado una expresion nuclear restringida.

Analisis molecular y citogenetico

Se han realizado estudios citogeneticos despues de cultivos a corto plazo. Los cariotipos se han analizado despues de bandeo G y han sido descritos segun la Nomenclatura citogenetica humana del sistema internacional (Mitelman, 1995). Se han realizado estudios con FISH segun se ha descrito previamente (Crescenzi et al., 2000).

Se han llevado a cabo RT-PCR para los principales transcritos (PML-RAR a, AML1-ETO. CBFB-MYH11, BCR-ABL y DEKCAN), analisis de transferencia Southern, analisis FISH para reordenamientos de MLL y analisis para las mutaciones FLT3 (ITD y D835) y MLL-ITD, tal como se ha descrito previamente (Van Dongen et al., 1999; Soekarman et al., 1992; Noguera et al., 2002; tip et al., 1995).

Analisis de mutaciones de la NPM

En el presente estudio, el analisis de la mutacion del gen de la NPM se ha realizado en 161 casos de tumores malignos linfo-hematopoyeticos: 52 LMA NPMc+, 56 LMA NPMc-, 9 leucemias mieloides cronicas (LMC), 7 leucemias linfoblasticas agudas (LLA) y 37 neoplasias linfoides. Se han analizado cinco pacientes con LMA NPMc+ tanto en la etapa de diagnostico como en la de remision completa despues de la quimioterapia.

Para el analisis de la region de codificacion de la NPM, un microgramo de ARN se retro-transcribio utilizando la RT- PCR, Thermoscript System (de Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.), y se amplificaron secuencias de ADNc con los cebadores NPM1-25F, 5'-GGT TGT TCT CTG GAG GAG CGT TC-3' (SEQ ID No 36) y NPM1-1112R, 5'-CCT GGA CAA CAT TTA TCA AAC ACG GTA-3', utilizando un sistema de PcR Expand High-Fidelity Plus (de Roche Applied Science, Mannheim, Alemania).

Para amplificar las secuencias del exon 12 del ADN genomico, se disenaron dos oligonucleotidos que hibridan de manera espedfica con las regiones de la secuencia flanqueadora del intron (NPM1-F: 5'-TTA ACT CTC TGG TGG TAG AAT GAA-3' y NPM1-R: 5'-CM GAG TAT TTG CCA TTC CTA AC-3'). Los productos de la PCR fueron purificados de acuerdo con metodos estandar y secuenciados directamente desde ambos extremos. Todas las mutaciones fueron confirmadas en productos de PCR independientes y, en casos representativos, mediante clonacion en pGEM-T Easy (de Promega, Madison, Wl, EE.UU.) y secuenciacion.

Relaciones entre mutaciones de la NPM y otras mutaciones

Los casos de LMA de cariotipo normal con mutaciones de NPM del protocolo AMLCG 99 se analizaron para la presencia de otras mutaciones, en particular de FLT3-ITD, FLT3-D835, MlL-PTD, CEBPA, NRAS, y KIT.

Vectores de expresion: construccion de plasmidos

Para seguir el destino subcelular de la protema NPM mutada y de tipo silvestre en experimentos de transfeccion, se generaron plasmidos que expresan alelos de NPM de tipo silvestre (pEGFPd-NPMwt) o mutante (pEGFPd-NPMmA) fusionados a la protema verde fluorescente mejorada (EGFP). Para este fin, se amplificaron las secuencias de ADNc de la NPM de un paciente de LMA NPMc+ (codigo 497A/30) que porta una mutacion heterocigotica en el exon 12 del gen con los cebadores NPM189F_BamHI, 5'GCC ACG GAT CCG AAG ATT CGA TGG AC3' y NPM1-1044R_EcoRI, 5'ATC AAG AAT TCC AGA AAT GAA ATA AGA CG3' y se clonaron dentro del marco del vector pEGFP-C1 (de BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.). El analisis de la secuenciacion confirmo la ausencia de errores introducidos porTaq en ambos plasmidos.

Experimentos de transfeccion transitoria

Fueron transfectadas de forma transitoria celulas NIH 3T3 con pEGFPd-NPMwt, pEGFPd-NPMmA y un vector pEGFP-C1 vacfo utilizando reactivos de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). La eficacia de la transfeccion se controlo mediante analisis de transferencia Western. Se obtuvieron imagenes con un microscopio confocal BioRad MRC

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1024 despues de la contra-tincion de los nucleos con yoduro de propidio. Se obtuvieron cortes confocales con una estacion de trabajo SCI Octane, y se realizo la reconstruccion de las imagenes partiendo de los cortes confocales, utilizando un modulo de “proyeccion de sombras” del software Imaris (de Bitplane, Zurich, Suiza).

Analisis estadfstico

El analisis de chi-cuadrado en tablas de contingencia de dos vfas, revela la asociacion entre variables categoricas. Las diferencias estadfsticas entre los medios se analizaron mediante la prueba t. La relacion entre la localizacion de la NPM y las mutaciones de FLT3-ITD/D835, ajustada por edad y citogenetica, se investigo aplicando un modelo de regresion logfstica con estos factores como variables independientes y NPM como variable dependiente. Los casos con translocaciones importantes fueron excluidos porque su absoluta asociacion con la expresion de NPM restringida al nucleo, no proporciona una estimacion valida de los parametros.

La asociacion entre las caracterfsticas clfnicas y biologicas (recuento de globulos blancos en la presentacion, expresion subcelular de NPM, mutaciones de FLT3) y la respuesta a la terapia de induccion se valoro en 126 LMA de cariotipo normal (79 NPMc+ y 47 NPMc-) tratadas de acuerdo con el protocolo GIMEMA LAM99P. Se aplico un modelo logfstico multivariante. En todos los analisis estadfsticos de dos vfas, dos valores de p<0,05 se consideraron de relevancia estadfstica.

RESULTADOS

Localizacion citoplasmatica de NPM

Se observo expresion de NPM citoplasmatico, definida como NPMc+ (Figura 1A), en 208/591 (35,2 %) casos de LMA primaria del estudio GIMEMA/EORTC (Figura 1B). Tal hallazgo parece especffico para las LMA primarias, no siendo detectable en las LMA secundarias ni en otros tumores humanos que muestran siempre una expresion de NPM nuclear exclusiva (Figura 1 B). En celulas leucemicas NPMc+, la nucleolina (C23), otro antfgeno nucleolar, mantiene su localizacion restringida al nucleo tal como se muestra en la Figura 1A. En las LMA NPMc+, la expresion de NPM anomala se observa habitualmente en casi todas las celulas leucemicas; excepto en casos de M5b (leucemia monocftica), donde la NPM citoplasmatica se expresa unicamente en un porcentaje variable de la poblacion neoplasica, concretamente del 30-60 % de celulas leucemicas, preferencialmente las mas inmaduras (monoblastos). Por el contrario, las LMA NPMc- raramente contienen celulas leucemicas NPMc+, en su mayorfa elementos mitoticos segun se muestra en la Figura 1A en la derecha.

La expresion anomala de la NPM citoplasmatica de celulas leucemicas debe considerarse un evento a largo plazo, segun se documenta por su comparacion en 25 pacientes con LMA NPMc+ en una recafda de la enfermedad hasta 3 anos despues del diagnostico inicial.

Morfologia de la LMA NPMc+

La expresion de la NPM citoplasmatica anomala se observo en todas las categorfas FAB, excepto M3 (leucemia promielocftica aguda), M4e (leucemia mielomonocftica aguda con eosinofilia), y M7 (leucemia megacariocftica aguda) segun se muestra en la Figura 1C. En particular, la figura muestra la correlacion entre la expresion subcelular de la NPM y la morfologia en 591 LMA primarias del estudio GIMEMA/EORTC mas 70 leucemias promielocfticas agudas con t(15; 17) (fuera de protocolo). La frecuencia de la expresion de NPM citoplasmatica se encontro en un intervalo desde 13,6 % en MO (LMA mfnimamente diferenciada) hasta un 93,7 % en M5b (leucemia monocftica aguda). La mayorfa de las LMA NPMc+ de tipo M5b y M6 (leucemia eritroide aguda) y aproximadamente un 30 % de casos de NPMc+ M1 (LMA sin maduracion), M2 (LMA con maduracion) y M4, se caracterizan por la presencia de NPM citoplasmatica, no solamente en blastos mieloides sino tambien en precursores eritroides, en particular en los proeritroblastos (Figura 1 D) y, menos frecuentemente, en los megacariocitos (datos no mostrados).

La presencia de NPM citoplasmatica en diferentes linajes hematopoyeticos condujo al analisis de la expresion de algunas moleculas, como los antfgenos CD34 y CD133, que tienen lugar en las celulas madre hematopoyeticas. Se detecto positividad en CD34 (definida como un 20 % de celulas positivas) en 12/159 (7,5 %) de LMA NMPc+ y en 227/317 (71,6 %) de LMA NMPc- (p < 0,001), segun se muestra en las Figuras 2A-2E. Por lo tanto, la NPMc+ parece mutuamente excluyente con la expresion de CD34 y CD133. Las LMA NMPc+ negativa para CD34 carecen de forma caracterfstica tambien de CD133, segun se muestra en la Figura 2F.

El amplio espectro morfologico y la implicacion de diversos linajes hematopoyeticos de la LMA NPMc+ refleja un posible origen del mismo a partir de celulas madre hematopoyeticas raras de CD34-/CD38-, que fueron identificadas en diversas especies animales, incluyendo las especies murina y humana (Goodell et al., 1997; Engelhardt et al., 2002). De forma alternativa, la CD34 podrfa verse aumentada de manera no regulada como un efecto de la transformacion leucemica.

Cariotipo de LMA NPMc+

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Se dispone de datos citogeneticos en 493/591 casos de LMA (166 NPMc+ y 327 NPMc-). Mas de un 85 % (142/166) de LMA NPMc+ presenta un cariotipo normal, segun se muestra en la Figura 3A. En comparacion, unicamente el 26,9 % (88/327 casos) de LMA NpMc- presenta cariotipo normal (p <0,001). En general, el 61,7 % de las LMA de cariotipo normal son NPMc+ (142/230 casos), segun se muestra en la Figura 3B. 24 casos de LMA NPMc+ muestran la presencia de translocaciones cromosomicas de poca importancia y, entre estas, 12 (un 50 %) casos tienen ambas metafases normal y anomala.

Ninguno de los casos de LMA que portan anomalfas geneticas importantes es NPMc+, segun se muestra en las figuras 3B, 3C y 3D.

FLT3-ITD y otras mutaciones genicas en LMA NPMc+

Las mutaciones FLT3, ITD o D835 se detectaron en 59/219 (26,9 %) y 13/202 (6,4 %) casos de LMA con cariotipo normal, respectivamente; un caso es portador de ambas mutaciones ITD y D835. La mutacion FLT3-ITD fue 2,5 veces mas frecuente en casos de NPMc+ que en casos NPMc- (p<0,003), segun se muestra en los histogramas de la Figura 3E. Un modelo de regresion logfstica multivariante ajustado por edad y citogenetica permite establecer una asociacion independiente entre la NPM citoplasmatica (variable dependiente) y el FLT3-ITD, segun se muestra en la Figura 3G. No se observa ninguna asociacion estadfstica entre las mutaciones FLT3-D835 y la localizacion subcelular de NPM (p=0,5), posiblemente por el bajo numero de casos de la mutacion D835.

En un estudio posterior de casos del protocolo AMLCG 99 (Schnittger et al., 2005), se confirmo un aumento en la frecuencia de la mutacion FLT3-ITD en casos de LMA con mutacion de NPM. Por el contrario, la mutacion de la NPM raramente se asocia a las mutaciones MLL (MLLPTD) y CEPBA.

Respuesta a la terapia de induccion de la LMA NPMc+

Se evaluo la respuesta a la terapia de induccion en 126 casos de LMA con cariotipo normal (79 NPMc+ y 47 NPMc-) tratados segun el protocolo GIMEMA LAM99P. En la Tabla 1 se muestra el modelo de regresion logfstica de la respuesta a la terapia de induccion en 126 pacientes.

Tabla 1

Evaluacion del analisis de maxima verosimilitud

Evaluacion de razon de probabilidades (OR)

Parametro

D F Evaluacion Error estandar Chi cuadrado de Wald Pr>chi cuadrado OR Intervalo de confianza OR 95

Corte

Corte

1 0,9596 0,3761 6,5112 0,0107

FLT3 (M vs U)*

1 0,4020 0,4541 0,7836 0,3760 0,669 0,2

NPM (Cit vs Nucl)#

1 1,0946 0,4647 5,5486 0,0185 2,988 1,2

WBC (<80 vs>80)

1 1,3123 0,4748 7,6399 0,0057 0,269 0,1

Edad (< vs>48)

1 0,3405 0,4498 0,5732 0,4490 0,711 0,2

*M = mutado; U = no mutado; WBC: numero de globulos blancos; #Cit. = positividad citoplasmatica; Nucl. = positividad restringida al nucleo.

El modelo multivariante para lograr una respuesta completa incluye el recuento de globulos blancos (categorizado en el percentil 75), edad (categorizado en el valor de la mediana), la expresion subcelular de la NPM y mutaciones de FLT-3. El analisis se muestra en la tabla 1 y muestra que el recuento de globulos blancos y NPM son factores de pronostico independientes. En particular, un recuento de globulos blancos por encima de 80 x 109/l (p<0,006; OR=0,269; Cl 95 %: 0,1-0,6) incide como factor de pronostico negativo y como factor de pronostico positivo el hecho de que las celulas leucemicas tengan NPM citoplasmatica (p<0,019; OR=2,988; Cl 95 %: 1,2-7,4).

Mutaciones de NPM como factor de pronostico en las LMA de cariotipo normal

De acuerdo con la presencia del gen de la NPM y de las mutaciones genicas FLT3-ITD, las LMA de cariotipo normal pueden dividirse en 4 sub-grupos: NPM mutada/FLT3 mutado, NPM mutada/FLT3 no mutado, NPM no mutada/FLT3 mutado y NPM no mutada/FLT3 no mutado. El analisis llevado a cabo por los autores en 401 casos de LMA con cariotipo normal (Schnittger et al, 2005), muestra que la presencia de una mutacion de NPM en ausencia de mutacion de FLT3 identifica un subgrupo de leucemias con un pronostico mas favorable. Resultados similares se publicaron posteriormente en otros dos estudios (Dhoner et al., 2005; Verhaak et al., 2005).

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Analisis de mutaciones de NPM en las LMA y en otros tumores

La LMA NPMc+ no expresa las protefnas de fusion NPM-ALK, NPM-RAR a, NPM-MLF, u otras protefnas de fusion que contengan NPM, segun se muestra por la ausencia de respectivos genes de fusion tras un analisis FISH, ausencia de transcritos de fusion respectivos tras RT-PCR, ausencia de dichas protefnas de fusion tras aplicar inmunohistoqufmica, presencia exclusiva de un polipeptido de NPM de 38 kDa tras transferencia Western y demostracion de NPM citoplasmatica mediante cuatro anticuerpos monoclonales anti-NPM diferentes.

En el presente estudio, el analisis de la region de codificacion de NPM, realizado mediante RT-PCR y secuenciacion directa, revelo mutaciones que afectaban al exon 12 en todos los casos excepto en un caso NPMc+. La Figura 4A es una representacion esquematica del gen de la NPM y las mutaciones se resumen en la Figura 4B. En total, se observaron seis variantes de secuencias diferentes, donde todas ellas conducen al marco de lectura en la region de codificacion del dominio carboxilo-terminal de la protefna NPM. La mutacion mas frecuente (tipo A: gatctctgTCTGgcagtggagga agtctctttaagaaaatag), es una duplicacion de un tetranucleotido TCTG en las posiciones 956-959 de la secuencia de oligonucleotidos de referencia NM 002520 (GenBank), segun se muestra en la Figura 4C; se predice que el desplazamiento resultante en el marco de lectura altera la porcion C-terminal de la protefna NPM sustituyendo los ultimos siete aminoacidos (WQWRKSL) con 11 restos diferentes (CLAVEEVSLRK). Tres mutaciones adicionales (tipo B: gatctctgCATGgcagtggaggaagtct cttaagaaaatag, tipo C:

gatctctgCGTGgcagtggaggaagtct ctttaagaaaatag y tipo D:

gatctctgCCTGgcagtggaggaagtct ctttaagaaaatag) incluyen una introduccion distinta de 4 pares de base en la posicion 960, dando todo ello como resultado el mismo marco de lectura que la mutacion A. En las ultimas dos mutaciones (tipo E: gatctctggcagtCTCTTGCCC aagtctctttaagaaaatag y tipo F: gatctctggcagtCCCT GGAGAaagtctctttaagaaaatag), los nucleotidos 965-969 (GGAGG) se eliminan y en su lugar, se introducen dos secuencias diferentes de 9 pares de bases, sin modificar el marco de lectura y creando un dominio nuevo del carboxilo-terminal de 9 aminoacidos. Independientemente del tipo especffico de mutacion, los mutantes se caracterizan por el reemplazo de al menos uno de los dos restos de triptofano (W) que en la secuencia de tipo silvestre estan en la posicion 288 y 290. Los resultados obtenidos son de acuerdo con las evidencias previas en estudios realizados en ratones que muestran la importancia del aminoacido triptofano para la localizacion nucleolar (Nishimura et al., 2002). Ademas, todas las protefnas mutantes compartfan los mismos ultimos 5 restos de aminoacidos VSLRK (SEQ ID No 29). Por tanto, a pesar de la heterogeneidad genetica, todas las mutaciones genicas de NPM dan como resultado una secuencia novedosa en el lugar del C-terminal de la protefna NPM.

La presencia de mutaciones en el exon 12 de la NPM y su asociacion especffica con la LMA NPMc+ fue confirmada en 11 muestras tambien mediante el analisis de secuenciacion del ADN genomico. Las mutaciones de NPM son heterocigoticas y ocurren unicamente en el clon maligno, ya que no estan presentes en las muestras de medula osea de pacientes en remision completa (N=5) despues de la quimioterapia. Las mutaciones se observan en la LMA NPMc+ de todas las categorfas FAB, incluyendo los casos de NPMc+ con cariotipo anomalo o expresion de CD34. Al contrario, los 56 casos de LMA NPMc-, ademas de los 53 casos de neoplasias malignas que no son LMA y NPMc- presentan secuencias de NPM de tipo silvestre tal como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

Tipo de tumor

N. FAB CD34 + Mut. FLT3 Mut. NPM

LMA NPMc+

52

cariotipo normal

49 Todos* 2/49 25/46 48/49

cariotipo anormal

3 M1, M5b 1/3 1/3 3/3

LMA NPMc-

56

cariotipo normal

12 M1-M6 8/10 4/12 0/12

cariotipo anormal**

44 M1-M6 5/8 3/8 0/44***

LMC

9 n.a. 0/9 n.d. 0/9

Neoplasias linfoides

44# n.a. n.d. n.d. 0/44

*Excepto para M3, M4eo y M7. **incluye 7 t(15;17s); 12 t(8;21s); 13 lnv(16); 1 reordenamiento de MLL; 1 inv(3; 1 t(6;9), un cariotipo complejo; ***Caso con Inv 16 que muestra una delecion de tres nucleotidos en el exon 6 de NPM1 en las posiciones 583-585, sin implicar el extremo 3' terminal. #incluye: 7 leucemias linfoblasticas agudas; 7 leucemias linfaticas cronicas de linfocitos B; 5 linfomas de celulas del manto; 5 linfomas foliculares; 10 linfomas de linfocitos B grandes; 5 linfomas de Burkitt; 5 mielomas multiples. Mut.: mutado; n.a.: no aplicable; n.d.: no realizado.

En estudios posteriores, los autores confirmaron los resultados descritos anteriormente para 1009 casos de LMA sometidos a secuenciacion del gen de la NPM. La Figura 6 muestra 40 mutaciones de NPM hasta ahora individualizadas.

Transfeccion del gen de la NPM mutado

Para confirmar si las mutaciones del exon 12 de la NPM responden a la deslocalizacion citoplasmatica de la protefna

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NPM, se transfectaron de forma transitoria celulas NIH 3T3, con vectores de expresion que codifican el alelo de tipo silvestre y mutante fusionado con EGFP. La imagen de microscopio confocal mostro la localizacion nucleolar esperada para la protefna de tipo silvestre EGFP-NPM, mientras que la isoforma del mutante de NPM se encuentra claramente deslocalizada en el citoplasma tal como se muestra en la Figura 4D.

Estos resultados indican claramente una correlacion causal entre el evento genetico (mutaciones de NPM) y la localizacion citoplasmatica de la protefna NPM. Ademas, el hecho de que la NMP mutada este estrechamente asociada con el cariotipo normal y no se observe en leucemias con anomalfas citogeneticas importantes sugiere que la mutacion de NPM es el evento leucemogeno primario. La mutacion podrfa interferir con la funcion normal de la NPM, tal como, por ejemplo, la interaccion con la protefna Arf o p53, (Colombo et al., 2002; Kurki et al., 2004; Hom et al., 2004). Las mutaciones podrfan ademas perturbar otras funciones de la NPM que han sido mapeadas dentro del dominio C-terminal, tal como la union de acidos nucleicos (Hingorani et al., 2000), ATP (Chang et al., 1998), actividad alfa-estimulante de la ADN-polimerasa, o union con el gen supresor tumoral Arf (Bertwistle et al, 2004).

EJEMPLO 2: Production de anticuerpos especfficos contra secuencias polipeptfdicas del C-terminal de la NPM especffica de la leucemia

Las secuencias polipeptfdicas representan inmunogenes ideales para la produccion de anticuerpos especfficos que incluyen todos los tipos de anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos monoclonales humanos, y anticuerpos humanizados producidos mediante tecnicas de recombinacion genetica.

Los peptidos correspondientes a las secuencias A, B, C, D, E y F de la Figura 4B pueden ser sintetizados qufmicamente de acuerdo con procedimientos estandar.

Pueden emplearse todas las especies animales para la preparacion de anticuerpos. Los metodos para la produccion de anticuerpos y procedimientos de inmunizacion de la especie animal (vfas de inoculacion del antfgeno, uso del adyuvante de Freund para aumentar la inmunogenetica de la mezcla inyectada, frecuencia de inmunizaciones, etc), se describen ampliamente en la literatura cientffica.

Monoclonales

Se pueden inocular ratones Balb/c por via intraperitoneal con peptidos especfficos unidos a KLH (3 inmunizaciones de 150 microgramos de peptido cada 10 dfas). Tal programa de inmunizacion es seguido por un refuerzo intravenoso (150 microgramos), tres dfas antes de la fusion, con el proposito de aumentar la respuesta inmunitaria al maximo.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse con el “metodo del hibridoma” (Goding J., 1983), que consiste en la formacion de celulas hfbridas que son el resultado de celulas normales del bazo con celulas de mieloma. Los autores de la presente invencion utilizan el linaje de mieloma P3-NS1-Ag-4-1 (abreviado como NS-1), proporcionado por el laboratorio del Prof. David Y Mason, Oxford y obteniendolas a partir del linaje P3K, que sintetiza unicamente cadenas ligeras k que no se secretan sino que se degradan internamente y carecen de la enzima HGPRT.

A continuacion de la fusion celular, la seleccion del hfbrido se realiza con adicion de hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT) al medio. Las unicas celulas capaces de sobrevivir en estas condiciones poseen:

1. la caracterfstica neoplasica del mieloma de crecer in vitro:

2. la enzima hipoxantina guanidina fosforribosil transferasa (HGPRT) de celulas del bazo que les permiten utilizar hipoxantina y timidina para sintetizar nucleotidos y por lo tanto ADN.

La celulas del mieloma fusionado mueren por la carencia de la enzima HGPRT y por lo tanto no pueden utilizar la hipoxantina para la biosfntesis de nucleotidos, mientras que las celulas del bazo mueren (incluso si son HGPRT+), porque no son capaces de crecer in vitro.

Para los propositos del presente estudio, el sobrenadante del hibridoma puede ensayarse directamente en muestras citologicas o en cortes incluidos en parafina de muestras de LMA que contengan la forma mutada de NPM (LMA NPMc+) y la forma normal (tipo silvestre) de NPM (LMA NPMc-). El criterio racional de cribado es la identificacion de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales especfficos contra peptidos de la invencion (correspondiente al C-terminal de la NPM), es decir, anticuerpos que reaccionan con LMA NPMc+ pero no con NPMc-. Tales anticuerpos presentan la ventaja de que pueden ser utilizados tanto en muestras citologicas (frotis y citocentrifugados) como en cortes de tejido incluidos en parafina y, ademas, tanto para propositos de diagnostico como para el control de la enfermedad minima residual leucemica. Despues de la identificacion, los hfbridos pueden clonarse de acuerdo con metodos bien conocidos (“dilucion limitante”) y cultivarse in vitro en grandes cantidades. Los clones pueden ser entonces crioalmacenados en nitrogeno lfquido para tener disponible un “banco” de los anticuerpos anteriormente mencionados.

Anticuerpos policlonales

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Los anticuerpos policlonales contra los peptidos de la presente invencion (secuencias especfficas del C-terminal de la NPM mutada) pueden ser producidos en diversas especies animales. Los anticuerpos policlonales hacen referencia tanto al suero del animal completo que contiene tales anticuerpos como a fracciones del suero enriquecidas en anticuerpo.

En particular, las fracciones de IgG o IgM que contienen unicamente los anticuerpos especfficos para los peptidos de la presente invencion, pueden obtenerse eluyendo suero a traves de una columna que contiene peptidos unidos de la presente invencion (cromatograffa de afinidad), y posteriormente purificando esta fraccion mediante una columna que contiene protefna A o protefna G. Estos anticuerpos tienen la ventaja de que tambien pueden ser utilizados en muestras citologicas (frotis y citocentrifugados), y no unicamente en cortes de tejido incluidos en parafina, y para controlar la enfermedad minima residual leucemica ademas de un proposito diagnostico.

Production del anticuerpo policlonal Sil-C

Materiales y metodos

El anticuerpo Sil-C fue producido mediante inmunizacion de los conejos con un peptido sintetico de 11 aminoacidos (NHCOCH3-CLAVEEVSLRK-COOH) (SEQ ID No 59)) (Inbio Ltd, Tallin, Estonia), que comprende dos triptofanos mutados, una parte NES y el peptido VSLRK del mutante A. Los sueros de conejo fueron purificados mediante cromatograffa de afinidad utilizando columnas que contienen el peptido utilizado como inmunogeno (elucion con Tris 0,23 M, Na2HPO4 0,2 M, pH 0,8). La reactividad contra el peptido se mostro mediante la tecnica ELISA. En particular, las placas de ELISA fueron adsorbidas durante la noche a 4 °C con 50 pl del peptido a una concentracion de 10 pg/ml in TBS. Despues del bloqueo con PBS que contiene suero fetal bovino al 3 %, se anadieron los sueros de conejo en diluciones crecientes a los pocillos (desde 1/100 hasta 1/72900). Despues de lavar en PBS-Tween 20 (0,05 %), se anadieron a cada pocillo 50 pl de un anticuerpo de cabra secundario conjugado con peroxidasa (dilucion 1/5000 en PBS).

La reaccion anticuerpo-antigeno fue observada anadiendo a cada pocillo 50 pl de diclorhidrato de O-fenilendiamina. La lectura se realizo a 492 nm. Se utilizaron sueros pre-inmunes como control negativo. La caracterizacion bioquimica de anticuerpos fue realizada con tecnicas estandar de transferencia Western, inmunoprecipitacion y co- precipitacion.

Resultados

Se produjo un anticuerpo policlonal (denominado Sil-C), que reconocia especificamente un epftopo antigenico que comprendfa dos triptofanos mutados, una parte NES y el peptido VSLRK que pertenecfa a las protefnas de nucleofosmina (NPM) mutadas segun se define en las reivindicaciones adjuntas 1-6.

En los experimentos de transferencia Western, el anticuerpo Sil-C reconoce una banda especffica de 37 kDA unicamente en la totalidad de celulas lisadas de leucemias con mutaciones de la NPM (LMA NPMc+) (pacientes 1-3) pero no de los pacientes con LMA sin mutaciones de la NPM (NPMc-) (casos 4-6) (Figura 5A, en la parte superior a la izquierda). Por el contrario, el anticuerpo monoclonal anti-NPM 376 que reacciona tanto con la NPM de tipo silvestre como con la mutada, identifica una banda de 37 kDA en todos los pacientes leucemicos ensayados, independientemente de la presencia o no de mutaciones del gen de la NPM (Figura 5A, parte inferior a la izquierda). En el paciente N° 2, portador de una mutacion de tipo A de la NPM, el anticuerpo Sil-C reconoce una banda de 37 kDa unicamente en la fraccion citoplasmatica de las celulas leucemicas (Figura 5B, parte superior a la derecha). La imagen, tal como se esperaba, difiere de la del anticuerpo monoclonal 376, la cual identifica una banda con el mismo peso molecular tanto en la fraccion citoplasmatica lisada como en la de la fraccion nuclear (Figura 5B, en la parte inferior derecha).

Estos datos bioqufmicos tambien se confirmaron a nivel citologico mediante tincion inmunohistoqufmica de biopsias medulares de 10 pacientes con LMA NPMc+. En estas muestras, los anticuerpos monoclonales anti-NPM, que reconocen tanto la NPM normal como la mutada, identifican la NPM tanto en el nucleo como en el citoplasma (Figura 5E). Por el contrario, el anticuerpo Sil-C identifica exclusivamente una protefna NPM a nivel citoplasmatico (Figura 5D). La especificidad de esta reaccion se muestra claramente por el hecho de que: i) es completamente suprimido de la pre-incubacion del anticuerpo Sil-C con el peptido utilizado como inmunogeno; ii) el anticuerpo Sil-C no tine las muestras de biopsias de pacientes con LMA NPMc-, es decir, las que carecen de mutaciones de la NPM (Figuras 5F y 5G).

Estos resultados muestran que el anticuerpo Sil-C reconoce especificamente los mutantes de NPM y que los mutantes estan restringidos exclusivamente al citoplasma de celulas leucemicas que contienen mutaciones de NPM. La disponibilidad de anticuerpos especfficos contra mutantes de NPM leucemicos abre nuevas perspectivas desde un punto de vista diagnostico y terapeutico.

Desde un punto de vista diagnostico, estos reactivos podrfan ser empleados para el diagnostico al principio y ademas para controlar la enfermedad minima residual con tecnicas de PCR cuantitativa (ver mas adelante).

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Desde un punto de vista terapeutico, es de suponer el uso de anticuerpos intracelulares (“intracuerpos”) capaces de inhibir las protefnas de NPM mutadas leucemicas sin danar la funcion de la protefna NPM fisiologica.

EJEMPLO 3: Preparation de vacunas

Las vacunas pueden ser administradas en formulaciones reconocidas por “el receptor de linfocitos T” (celulas mononucleares de sangre periferica) o presentadas por las celulas de presentacion de antfgeno (por ejemplo, celulas dendrfticas, linfocitos B, macrofagos).

En este contexto, el termino “vacuna” significa cualquier sustancia o compuesto que sirve para inducir inmunidad anti-tumoral. Inmunidad anti-tumoral significa respuestas citotoxicas (linfocitos T), induccion de anticuerpos que reconocen celulas tumorales y produccion de citocinas con actividad anti-neoplasica. La actividad anti-tumoral puede ser medida in vitro (citotoxicidad) o in vivo en modelos animales experimentales.

Es conocido que la eficacia de las vacunas anti-tumorales se incrementa cuando se utilizan varios polipeptidos, en combinacion, que tienen diferentes estructuras. Por lo tanto, para ese fin las vacunas anti-LMA NPMc+ pueden contener diferentes polipeptidos de sfntesis con diferente especificidad y secuencias, a condicion de que induzcan el reconocimiento de celulas tumorales que contienen mutaciones del gen de la NPM.

La vacuna de la presente invencion puede ser conjugada con moleculas inmunogenicas conocidas universalmente como vehfculos.

Puede contener, en su formulacion, soluciones adecuadas para inoculo (suero salino fisiologico, diversas soluciones salinas) y excipientes.

Ademas, la vacuna puede contener o ser administrada con adyuvantes, es decir cualquier molecula con actividad inmunoestimulante. La administracion del adyuvante puede ser realizada en cualquier punto de tiempo precediendo o a continuacion del inoculo de la vacuna anti-tumoral.

La vacuna de la presente invencion puede ser administrada por via sistemica o local en una dosis unica o multiple.

La evaluacion de la respuesta inmunitaria se llevara a cabo de acuerdo con los metodos bien conocidos y descritos en la literatura cientffica. En particular, despues del inoculo de la vacuna, los epftopos anti-genicos se presentan a linfocitos B y T mediante celulas de presentacion de antfgeno.

Por lo tanto, la determinacion de las respuestas citotoxicas puede ser realizada tanto en linfocitos T CD4+ como CD8+, y todas las poblaciones celulares capaces de inducir la citolisis o apoptosis (por ejemplo, neutrofilos, celulas NK). Especfficamente, puede medirse la activacion, (inmunofenotipo), capacidad de proliferacion, (mediante metodos de incorporacion de marcadores radiactivos), capacidad citotoxica en dianas oportunamente preparadas y la capacidad para secretar citocinas (metodos ELISA, ELISPOT) de las mismas.

En cuanto a las respuestas de los anticuerpos, estas pueden medirse in vitro o in vivo con experimentos de transferencia de suero e inhibicion del crecimiento tumoral.

La eficacia in vivo en modelos animales puede ser medida de acuerdo con criterios de significancia estadfstica verificando la respuesta anti-tumoral en grupos de control disenados de manera oportuna.

El objeto de la evaluacion sera la supervivencia, medicion de biomarcadores tumorales, inhibicion del crecimiento de celulas tumorales, regresion de masas tumorales, reduccion de la habilidad de induccion tumoral.

EJEMPLO 4: Estudio del mecanismo de la acumulacion citoplasmatica de mutantes de la NPM

Los presentes solicitantes elucidaron el mecanismo molecular que conduce a la acumulacion aberrante citoplasmatica de NPM en la leucemia mieloide aguda NPMc+.

Materiales y metodos

Celulas para la transfeccion, muestras de LMA y linea celular OCI/AML3

Para los experimentos de transfeccion, se utilizaron celulas NIH-3T3 y H1299. Se aislaron celulas leucemicas de 5 pacientes leucemicos (3 de los cuales portaban la mutacion A de la NPM y 2 que portaban el gen de NPM de tipo silvestre), mediante separacion por Ficoll-Hypaque y se utilizaron para estudios bioqufmicos y analisis con microscopio confocal. Biopsias de la medula osea (n=373) y granulado de blastos de sangre periferica (n=20), de 393 pacientes con LMA del protocolo GIMEMA aMl 99P y GIMEMA AML12/EORTC, fueron fijadas en B5 y se incluyeron en parafina. La linea celular OCI/AML3, que identificamos como la unica que contiene la mutacion A en el exon 12 del gen de NPM (entre 79 lfneas humanas mieloides sometidas a ensayo) (Quentmeier et al., 2005), se

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cultivo en alfa-MEM con FBS al 10 % mas glutamina y antibioticos en concentraciones estandar.

Analisis mutacional del gen de NPM

Se realizaron estudios en celulas leucemicas de 393 pacientes adultos con LMA del protocolo GIMEMA AML99P y G1MEMA AML12/EORTC. La seleccion de casos para el analisis mutacional se realizo en base a la disponibilidad de material para la identificacion inmunohistoqufmica de NPM. Las mutaciones del exon 12 del gen de NPM se analizaron con RT-PCR y secuenciacion, tal como se ha descrito previamente o utilizando DHPLC (Wave™ System, Transgenomic Inc., Omaha, Nebraska; EE.UU.).

Construccion del plasmido

Los mutantes A, B, C, y D de la NPM fueron producidos mediante PCR utilizando NPMwt como molde; se utilizo el mismo cebador directo (5' CGC CAC GCT AGC GAA GAT TCG ATG GAC) y un cebador inverso diferente para cada mutante (mutante A-5': CTA TTT TCT TAA AGA GAC TTC CTC CAC TGC CAG ACA GAG ATC TTG AAT AGC CTC TTG G; mutante B-5': CTA TTT TCT TAA AGA GAC TTC CTC CAC TGC CAT GCA GAG ATC TTG AAT AGC CTC TTG G; mutante C-5': CTA TTT TCT TAA AGA GAC TTC CTC CAC TGC CAC GCA GAG ATC TTG AAT AGC CTC TTG G; mutante D-5': CTA TTT TCT TAA AGA GAC TTC CTC CAC TGC CAG GCA GAG ATC TTG AAT AGC CTC TTG G). Los productos de las respectivas PCR se clonaron en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO (Invitrogen, Carlbad, CA, EE.UU.), y se comprobaron con secuenciacion de insercion. Para producir la doble etiqueta flag-HA N-terminal en plasmidos con NPM de tipo silvestre y mutacion A, se realizo una PCR utilizando como molde la NPM de tipo silvestre o mutante A; como cebador directo e inverso se utilizaron respectivamente 5' CGC CAC GCT AGC gAa GAT TCG ATG GAC y 5' TCA AGA ATT CCA GAA ATG AAA TAA GAC. El producto de la PCR fue digerido utilizando Nhel y ECORI, y el fragmento fue sub-clonado en el vector PCIN4, que contiene la etiqueta Flag-HA en el extremo N-terminal del fragmento. La precision de las secuencias de Flag-HA-NPM-wt y Flag-HA-NPM-mutante A se confirmo mediante secuenciacion.

Los mutantes E, G y R de NPM fueron producidos mediante el kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange Fine (Stratagene, You Jolla, Calif.), utilizando como molde pEGFP-CI-A/PMwt, y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores fueron disenados en las siguientes secuencias:

NPM MUT E:

5'-GATCTCTGGCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAG-3'; NPM MUT G:

5'-GATCTCTGGCAGTGCTTCGCCCAAGTCTCTTTAAG-3'; NPM MUT R:

5'-GATCTCTGGCAGAGGATGGAGGAAGTCTCTTTAAG-3'.

Los plasmidos NPM_MUT_A A290W, NPM_MUT_A C288W+A290W, y NPM_MUT_A_NO_NES fueron producidos utilizando pEGFP-C1-NPMmA como molde, aprovechando la localizacion de los sitios de mutagenesis entre los sitios de corte de las enzimas Bglll y EcoRI. Al utilizar una pareja de cebadores complementaria, que contiene la mutacion deseada y extremos protruyentes compatibles con extremos producidos por la digestion con BglIl-EcoR, fue posible ligar la doble cadena de ADN producida por hibridacion de los cebadores con el vector pEGFP-C1- NPMmA previamente digerido utilizando las dos enzimas de restriccion anteriores.

Las secuencias de los cebadores utilizados son:

NPM_MUT_A A290W_FOR: 5'-GATCTCTGTCTGTGGGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGG-3'; NPM_MUT_A A290W_REV: 5'-AATTCCTATTTTCTTAAAGAGACTTCCT CCACCCACAGACAGA-3'; NPM_MUT_A C288W + A290W_FOR: 5'-GATCTCTGGCTGTGGGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGG-3'; NPM_MUT_A C288W + A290W_REV: 5'-AATTCCTATTTTCTTAAAGAGA CTTCCTCCACCCACAGCCAGA-3' NPM_MUT_A_NO_NES_FOR: 5'-GATCTCTGTGGAGCAGGGGAGGAAGGCT CTTTAAGAAAAT AGG-3';

NPM MUT A NO NES REV: 5'-AATTCCTATTTTCTTAAAGAGCCTT CCTCCCCTGCTCCACAGA-3'.

Cada construccion fue verificada mediante secuenciacion.

Inhibicion de la exportacion nuclear dependiente de CRM1

Las celulas H1299 fueron sembradas en la superficie de placas de seis pocillos 24 horas antes de la transfeccion. Se transfectaron 5 pg del vector de expresion para HA-NPM de tipo silvestre, GFP-NPM-mutante A, o ambos, utilizando el metodo de precipitacion con fosfato de calcio. Despues de 24 horas, las celulas fueron tratadas con

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leptomicina B 20 nM, un inhibidor especffico de Crm1 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 8 horas o no tratadas, respectivamente. Las celulas se fijaron a continuacion en paraformaldehfdo al 4 % para el estudio de inmunofluorescencia.

Se transfectaron celulas NIH-3T3 utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Despues de 24 horas, las celulas cultivadas en el porta se incubaron con cicloeximida (Merck Bioscences Ltd, Nottingham, RU) 10 microgramos/ml (30 minutos) y leptomicina B (Merck Bioscences Ltd, Nottingham RU) 20 ng/ml (5 horas), u otros inhibidores de Crm1 tales como Ratjadon A y C (Alexis Biochemicals, Carlsbad, CA, EE.UU.) 20 ng/ml (5 horas).

Las celulas fueron fijadas en paraformaldehfdo al 4 % (10 minutos) para analisis de inmunofluorescencia y microscopio confocal.

Para experimentos de “evolucion temporal”, se transfirieron celulas transfectadas dentro de una camara Attofluor 20 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) y se observaron utilizando un aparato confocal MRC-1024 (Biorad Cambridge, RU) ensamblado en un microscopio Olympus IMT-2. Las imagenes de un corte individual se registraron antes y despues de la adicion de leptomicina B, en intervalos de 60 segundos, utilizando la funcion de serie temporal del programa Laser-Sharp (BioRad). La longitud de onda de excitacion fue de 488 nm y las imagenes fueron detectadas utilizando un filtro de 505 a 550 nm en la PMT2.

Las imagenes fueron procesadas y analizadas utilizando el programa bien conocido ImageJ (Rasband WS, Image J, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,
http://rsb.info.nih.grov/ij/, 1997-2005).

Para los analisis de transferencia Western de la distribucion sub-celular de la protefna GFP-NPM mutante A, celulas N1H-3T3 transfectadas con el vector GFP o con GFP-NPM mutante A, segun se describe anteriormente, fueron incubadas con leptomicina B 20 ng/ml (o con metanol como control) sin cicloeximida durante 3 o 6 horas. A continuacion las celulas fueron cosechadas, se lavaron con PBS y se lisaron en tampon hipotonico, de acuerdo con el metodo de Schreiber et al. (1989). El sobrenadante se conservo como una fraccion citoplasmatica. El granulado, que contenfa nucleos, se lavo nuevamente con el tampon hipotonico, a continuacion se solubilizo en un tampon hipertonico y se llevo a ebullicion en una solucion con sDs antes de la carga.

Diluciones equivalentes (con el mismo numero de celulas) de fracciones citoplasmaticas y nucleares se cargaron, se transfirieron a nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-GFP (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.) para analisis de transferencia Western de la distribucion de la GFP-NPM mutante A.

Las celulas que se obtienen a partir de dos pacientes con LMA NPMc+ (portadores de la mutacion A) y de la lfnea celular OCI/AML3 se cosecharon en un medio (106 celulas/ml en placas de 24 pocillos), y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 5 horas. Despues de la incubacion durante toda la noche con leptomicina B (20 ng/ml), las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron. El granulado de celulas se fijo en B5 y parafina para la inmunotincion.

Procedimientos de inmunotincion

La tincion DAPI se utilizo para visualizar los nucleos de celulas H1299 transfectadas con GFP-NPM-mutante A y con GFP-NPM de tipo silvestre. Para los construcciones Flag-HA, las celulas fijadas se volvieron permeables con Triton- X 100 0,2 % (10 minutos) seguido del bloqueo con suero anti-cabra al 10 % (30 minutos). A continuacion, se anadio el anticuerpo anti-HA primario (1:1000, Roche Indianapolis, In, EE.UU.) durante 1 hora seguido de la incubacion durante 30 minutos con el anticuerpo secundario Alexa-568 (1:1000, Molecular Probes, Oregon, EE.UU.). Las imagenes se tomaron utilizando una camara digital con el programa Spot 4.09 (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EE.UU.).

Los nucleos de las celulas NIH 3T3 transfectadas con GFP-NPMwt y GFP-NPM mutante A se tineron con yoduro de propidio. La tincion con nucleolina (C23) de las celulas NIH-3T3 se llevo a cabo con el anticuerpo anti-nucleolina adquirido de DakoCytomation (Glostrup, Denmark), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con rojo Texas (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL); los nucleos fueron contra-tenidos con TO-PRO-3 (Molecular Probes, Oregon, EE.UU.).

La tincion de la NPM de los cortes incluidos en parafina de los casos de LMA que contienen la mutacion A, se llevo a cabo con anticuerpos monoclonales anti-NPM, seguido por un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 (Molecular Probes, Oregon, EE.UU.); los nucleos fueron contra-tenidos con yoduro de propidio. Las imagenes se tomaron con un microscopio confocal Zeiss LSM 510 (Cari Zeiss, Jena, DE), utilizando longitudes de onda de excitacion laser a 488 nm (para ALexa 488), 543 nm (para rojo Texas y yoduro de propidio) y 633 nm (para TO- PRO-3), respectivamente. El ajuste de la intensidad del laser, diametro de los orificios de abertura y la configuracion de la deteccion de luz se ajustaron para lograr la mejor relacion senal/ruido y evitar una interferencia de la fluorescencia. Las imagenes se transfirieron a continuacion a una estacion de trabajo SGI Octane (Silicon graphics, Mountain View, CA, EE.UU.) para su posterior elaboracion; la reconstruccion en 3d se realizo con el metodo de sombras o iso-superficie, utilizando el programa Imaris (Bitplane, Zurich, CH).

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El estudio de cortes de NPM incluidos en parafina utilizando el metodo de la fosfatasa alcalina se realizo para 393 pacientes, tal como se ha descrito previamente. Las muestras fueron clasificadas como NPM citoplasmatica o nuclear, sin conocer los resultados de los analisis mutacionales.

Extractos celulares, transferencia (blot) Western y co-inmunoprecipitacion

Los extractos citoplasmaticos y nucleares se prepararon de acuerdo con el metodo de Schreiber et al. (1989). Para los experimentos de co-inmunoprecipitacion, las celulas fueron lisadas en 1 ml de tampon de lisis helado (NP-40 1 %, NaCl 150 mM, Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, Na3VO4 1 mM 1 pg/ml de leupeptina, 1 pg/ml de aprotinina y PMSF 1 mM). Despues de 20 minutos de incubacion en hielo, los productos lisados se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos 4 °C y se incubaron con 4 pg de una IgG de control no especffica, o un anticuerpo policlonal anti- NPM de conejo especffico, denominado Sil-C, o anticuerpo monoclonal anti-NPM de raton (Clone 376), respectivamente y 30 pl de la protefna A/G Plus-perlas de agarosa (Saint Cruz Biotechnology, Inc.) en incubacion durante la noche a 4 °C. Las perlas se lavaron a continuacion al menos tres veces con el tampon de lavado (NP-40 0,1 %, NaCl 150 mM, Tris, 25 mM pH 7,5, EDTA 1 mM e inhibidores). Las protefnas se separaron sobre SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana PVDF (Millipore), en la que se incubaron con anticuerpos primarios, concretamente, anticuerpo policlonal de conejo anti-Crm1 (Saint Cruz Biotechnology, Inc.) o un anticuerpo monoclonal anti-Crm1 (BD Transduction Laboratories); respectivamente; despues de la incubacion con un anticuerpo secundario conjugado con HRP, los peptidos reconocidos en el analisis de transferencia Western fueron detectados utilizando el metodo ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Bioscience).

Resultados

El analisis de 40 mutaciones del gen de la NPM hasta ahora identificadas en miles de pacientes leucemicos (Figura 6), muestra que, a pesar de su homogeneidad genetica, todas las mutaciones determinan algunas alteraciones comunes a nivel de la parte carboxiterminal de las correspondientes protefnas NPM mutadas.

La Figura 6 muestra los cambios en los triptofanos 288 y 290 y la creacion de un motivo NES en 40 protefnas NPM mutantes identificadas en pacientes leucemicos; la frecuencia de mutacion (%) esta presente solamente en 393 casos de LMA estudiados aquf para los que estaban disponibles, ademas de los datos moleculares, tambien los resultados de la tincion inmunohistoqufmica (IH). Las alteraciones son de dos tipos: i) la mutacion de ambos triptofanos 288 y 290 (o unicamente 290) y ii) la creacion de un nuevo motivo denominado NES (“motivo de senal de exportacion nuclear”). NES es una estructura proteica que es especfficamente reconocida por Crm1 (o Exportina 1), la protefna fisiologicamente delegada al transporte de otras protefnas desde el nucleo al citoplasma. Desde un punto de vista molecular, el motivo NES se define como una secuencia de aproximadamente 10 aminoacidos del tipo YxxxYxxYxY donde Y indica un aminoacido hidrofobo de leucina, isoleucina, metionina, valina o fenilalanina y x es equivalente a otros aminoacidos. En el NES, los aminoacidos hidrofobos Y estan separados por intervalos precisos (variando de 1 a tres espacios), donde el espaciado esta representado por otros aminoacidos que, en el esquema, estan indicados con la letra x.

El tipo de NES puede variar entre cada mutante de NPM. El tipo y la frecuencia de NES en los diversos mutantes de NPM leucemicos se ilustran en la Figura 6. El motivo NES mas frecuente, encontrado en aproximadamente un 65 % de mutantes, se denomina LxxxVxxVxL (donde L=leucina, V=valina y x es equivalente a otros aminoacidos). El restante 35 % de las protefnas NPM mutantes contiene variantes de NES menos frecuentes, en las que la valina en la segunda posicion de NES esta reemplazada con otro aminoacido hidrofobo. Ejemplos de este tipo, ilustrados en la Figura 6, son los NES de tipo LxxxVxxVxL, LxxxFxxVxL, LxxxMxxVxL, LxxxCxxVxL (donde L=Leucina; V=Valina; F=Fenilalanina; M=Metionina; C=Cistefna; y x es equivalente a otro aminoacido).

Relacion entre el tipo de NES y las mutaciones de los triptofanos en la posicion 288 y 290

A partir de la Figura 6 puede deducirse que el triptofano en la posicion 290 esta mutado en todos los 40 mutantes de NPM leucemicos. Por el contrario, 13 de los 40 mutantes (32,5 %) conservan el triptofano en la posicion 288. Un analisis cuidadoso de las estructuras proteicas de los 40 mutantes indica claramente que existe una relacion entre el tipo de NES y las mutaciones a nivel de triptofanos 288 y 290 (Figura 6 y Tabla 3). En particular, se muestra como el motivo NES mas frecuente, (es decir, el tipo LxxxVxxVxL) esta siempre asociado a mutaciones en ambos triptofanos 288 y 290, mientras que el triptofano 288 esta conservado unicamente en las protefnas mutantes de NPM que contienen una variante de NES del tipo indicado anteriormente, es decir aquellos en los que la valina en la segunda posicion de NES es reemplazada con otro aminoacido hidrofobo (Figura 6 y Tabla 3). La Tabla 3 muestra la correlacion entre el motivo NES y los triptofanos 288 y 290 en 40 protefnas mutantes de NPM de pacientes leucemicos.

Tabla 3

Variante NES

Motivo Mutantes NPM (n=)

1

L-XXX-V-XX-V-X- L 26/40

2

L-XXX-L-XX-V-X-L 6/40

Mut W (288) 26/26 1/6*

Mut W (290) 6/26 6/6

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Variante NES

Motivo Mutantes NPM (n=) Mut W (288) Mut W (290)

3

L-XXX-F-XX-V-X-L 3/40 0/3 3/3

4

L-XXX-M-XX-V-X-L 2/40 0/2 2/2

5

L-XXX-C-XX-V-X-L 2/40 0/2 2/2

6

L-XXX-F-XXX-L- FKKIV 1/40 0/1 1/1

*La mutacion Q de la Figura 6 causa una mutacion de ambos triptofanos 288 y 290 en presencia de la variante 2 de NES (L-xxx-L-xx-V-x-L); mutW: triptofano mutado

El motivo NES mas comun es la variante 1; las otras variantes de NES (tipo 2-6) son menos frecuentes y se diferencian de la variante 1 por la presencia, en el lugar de la Valina (V) en la segunda posicion de NES, de una Leucina (L), Fenilalanina (F), Metionina (M), o Cistefna (C).

La expresion citoplasmatica de mutantes de NPM es un evento dependiente de NES

El hecho de que todos los mutantes de NPM contienen un nuevo motivo de NES en su parte carboxilo-terminal sugiere que la eliminacion citoplasmatica de la NPM puede ser el resultado de un transporte activo de mutantes de NPM por parte del Crm1, el receptor especffico del transporte de protefnas del nucleo al citoplasma.

Los autores han realizado algunos experimentos para verificar si el transporte nucleo-citoplasma de los mutantes de NPM leucemicos se altera de alguna manera, en presencia de sustancias que, como ya es conocido, inhiben la actividad de Crm1/Exportina 1, ademas de la leptomicina B o los Ratjadon.

Los resultados de los experimentos son claros. La Figura 7 muestra como la exportacion nuclear de los mutantes de NPM es dependiente de NES. En condiciones basales, las celulas HI299 o NIH3T3c transfectadas con ADNc que codifican las protefnas mutantes NPM marcadas muestran la localizacion citoplasmatica aberrante esperada de los mutantes. Por el contrario, en presencia de leptomicina B (LMB), las protefnas mutantes NPM son relocalizadas del compartimento citoplasmatico al nuclear (nucleoplasma) (paneles 7A y 7B). La Figura 7C-E muestra el analisis en diferentes puntos de tiempo de los efectos de la LMB en el mutante A asociado a eGFP (eGFP-NPMmutA) en celulas NIH-3T3: la adicion de LMB da como resultado una reduccion de la fluorescencia en el citoplasma y en el area de Golgi y un aumento concomitante de la fluorescencia en el nucleoplasma.

Aproximadamente un 50 % del mutante tipo A (el mas comun) se re-localiza en el nucleo en 20 minutos y el proceso se completa en 1 hora (paneles C-D).

El analisis de transferencia Western de la distribucion subcelular del mutante de NPM tipo A, unido a GFP en celulas N1H-3T3 tratadas con leptomicina B, confirmo que, con el tiempo, el mutante A de la protefna GFP-NPM (peso molecular 64 kDa), al contrario que la protefna GFP (peso molecular 27 kDa), se acumula progresivamente en el granulado que contiene nucleos (Figura 7E). Por el contrario, en celulas NIH-3T3 sin tratar, ambas protefnas GFP- NPM y GFP se encuentran, tal como se esperaba, unicamente en la fraccion citoplasmatica. De hecho, el tratamiento con LMB induce una acumulacion dependiente del tiempo de eGFP-NPMmutA en las fracciones del granulado (P). La pureza de las fracciones subcelulares se midio mediante eliminacion del anticuerpo y transferencia con un anticuerpo anti-p-tubulina (panel inferior Figura 7E). Se midio una contaminacion no significativa para las protefnas sobre-expresadas (como queda claro en la transferencia de GFP) (panel central). En celulas no tratadas, la eGFP-NPMmutA se encontro unicamente en las fracciones citoplasmaticas (C). El experimento se realizo en ausencia de dicicloeximida, de manera que la continua presencia de GFP-NPMmA en las fracciones citoplasmaticas durante el tratamiento con LMB se ha mostrado en el tiempo.

El analisis con microscopio confocal de celulas transfectadas con varios construccions de NPM-EFG muestra claramente que los mutantes de NPM, despues del tratamiento con leptomicina B, se relocalizan en el nucleo y, especfficamente, en el nucleoplasma (Figura 8A, parte superior), mas que en los nucleolos, que es el lugar en el que se localiza fisiologicamente la protefna NPM de tipo silvestre (Figura 8A, centro). La relocalizacion nucleoplasmatica de los mutantes mediante la leptomicina B se muestra tambien a traves de doble tincion en el microscopio confocal que destaca la presencia de una exclusividad mutua entre los lugares de localizacion del mutante de NPM, desplazado en el nucleoplasma, y la nucleolina (C23) que, tal como es de esperar, se expresa de manera selectiva a nivel nucleolar (Figura 8A, parte inferior).

La relocalizacion nucleoplasmatica de la NPM despues del tratamiento con inhibidores de Crm1 tambien se confirmo en celulas de pacientes con LMA NPMc+ (Figura 8B).

Un efecto identico de los inhibidores de Crm1 en el mutante tambien se observo en la lfnea mieloide OCI-AML3 humana que incluye la mutacion de NPM de tipo A (Figura 9A). En estas celulas, mediante experimentos de co- precipitacion se mostro tambien una interaccion ffsica directa entre la protefna NPM mutada y el Crm1 (Figura 9B).

El papel fundamental desempenado por el motivo NES en el proceso de expulsion de los mutantes de NPM del

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nucleo, y su consecuente acumulacion en el citoplasma, se muestra tambien mediante experimentos de mutagenesis dirigida al sitio. De hecho, la sustitucion en el mutante de NPM de tipo A de dos valinas de NES por dos glicinas (NPM mutA no-NES), hace desaparecer la capacidad del mutante de ser exportado desde el nucleo al citoplasma (Figura 10).

La acumulacidn citoplasmatica de los mutantes depende de la accidn coordinada de NES y las mutaciones de los triptofanos 288 y 290

El papel de los dos triptofanos 288 y 290 en la acumulacion citoplasmatica de NPM fue evaluada utilizando mutantes de NPM silvestres (procedentes de pacientes leucemicos) y mutantes de NPM construidos mediante mutagenesis dirigida al sitio. Para evaluar el efecto sobre el enlace nucleolar de una unica mutacion a nivel del triptofano 290, utilizamos el mutante leucemico silvestre del tipo E que, como se ilustra en la Figura 6, mantiene el triptofano 288. A continuacion del tratamiento con leptomicina B, el mutante de NPM de tipo E se relocaliza a nivel nuclear. Sin embargo, al contrario que lo observado con el mutante A, la relocalizacion ocurre no solamente en el nucleoplasma, sino tambien a nivel del nucleolo (Figura 10). Una distribucion del compartimento nuclear muy similar a la del mutante E, se observa tambien con una construccion artificial del mutante de NPM de tipo A, en el que el triptofano mutado en la posicion 290 fue re-introducido mediante mutagenesis dirigida al sitio (A290W). Cuando ambos triptofanos 288 y 290 son reintroducidos en el mutante A (C288W+ A290W), la protefna mutante, a pesar de la presencia de NES, se localiza completamente en los nucleolos, independientemente de la presencia de leptomicina B. Los resultados de estos experimentos se ilustran en la Figura 10.

Estas observaciones muestran claramente que los triptofanos 288 y 290 contribuyen de forma significativa a la expulsion nuclear de mutantes mediada por NES. En conclusion, para que la acumulacion citoplasmatica aberrante de NPM tenga lugar, es necesario que NES y las mutaciones de dos triptofanos (o unicamente del triptofano 290) actuen en combinacion. En otras palabras, es imposible que se presente una acumulacion citoplasmatica de los mutantes de NPM cuando solo esta presente NES en ausencia de mutaciones de los dos triptofanos 288 y 290 (o unicamente del triptofano 290), o viceversa.

Los mutantes de NPM deslocalizan la protefna NPM de tipo silvestre desde su lugar fisiologico (nucleolo) al citoplasma

Debido a que todas las protefnas NPM mutadas leucemicas conservan el dominio de dimerizacion en la region N- terminal, se puede plantear la hipotesis de que pueden formar heterodfmeros con la protefna NPM de tipo silvestre, como entre las protefnas de fusion (NPM-ALK y NPM-MLF1) y la misma protefna NPM de tipo silvestre.

La Figura 11A muestra que, mediante el mecanismo de heterodimerizacion, los mutantes son capaces de unir y deslocalizar la protefna NPM de tipo silvestre en el citoplasma. De hecho, mediante co-transfeccion de celulas H1299 con vectores que codifican para la (tipo silvestre)-HA NPM y (mutante A)-eGFP NPM, se observa que la protefna NPM mutante y de tipo silvestre se co-localiza en el citoplasma. Aproximadamente un 30 % de celulas fueron transfectadas y para aproximadamente un 70 % de estas, el mutante de NPM causa un reclutamiento parcial de la forma de tipo silvestre de NPM de los nucleolos al nucleoplasma y citoplasma. Estos resultados se confirman tambien mediante experimentos de co-precipitacion de la NPM de tipo silvestre (marcada con HA) y NPM mutante (marcada con Flag) (Figura 11B). Para transfectar celulas H1299, se utilizaron plasmidos que codifican FH-NPMwt y FH-NPM mutante A. En el panel de la izquierda de la Figura 11B, un 5 % de la totalidad de las celulas lisadas obtenidas a partir de celulas transfectadas de manera estable con FH-NPMwt, FH-NPM mutante A o celulas de control H1299, fueron sometidas a analisis de transferencia Western con a-NPM o a-HA. En el panel de la derecha, el 95 % restante de las celulas lisadas fueron inmuno-precipitadas con un anticuerpo anti-Flag (M2), y utilizadas para una transferencia Western con a-NPM o a-HA.

El posible mecanismo alterado del transporte restringido nucleo-citoplasma de las NPM mutantes y de tipo silvestre se encuentra esquematizado en la Figura 11C.

Inmunohistoqufmica para predecir todas las mutaciones a nivel del exon 12 del gen de NPM

Tal como se ha ilustrado anteriormente, el mecanismo responsable de la acumulacion de protefnas mutantes de NPM en el citoplasma de celulas leucemicas, depende de las mutaciones de los triptofanos 288 y 290 y la creacion de NES. Debido a que estas alteraciones se encuentran presentes en todos los mutantes de NPM identificados hasta ahora, se plantea la hipotesis de que la tincion inmunohistoqufmica con anticuerpos anti-NPM es capaz de predecir, demostrando la deslocalizacion citoplasmatica de la NPM, todas las mutaciones que tienen lugar a nivel del exon 12 del gen de NPM.

Para verificar esta hipotesis, hemos comparado la expresion subcelular de la protefna NPM (nuclear frente citoplasmatica) con el estado mutacional del gen de NPM. El estudio se realizo en 393 pacientes con LMA del protocolo GIMEMA AML99P/AML 12/EORTC. Los resultados obtenidos muestran claramente que la presencia de una positividad citoplasmatica para NPM es predictiva con una especificidad absoluta de mutaciones a nivel del exon 12 de la NPM (Tabla 4).

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Tabla 4

AML (N = 373)

Localizacion de la protefna NPM* Mutaciones del gen de NPM (Exon 12)

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Citoplasmatica 191/191

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Nuclear 0/202

*Determinada en cortes incluidos en parafina con anticuerpos anti-NPM monoclonales

La prueba inmunohistoqufmica puede ser utilizada para un proposito de diagnostico, tal como se indica en la Figura 25. La prueba es rapida, economica, facilmente interpretable, sumamente sensible y especffica. Por todas estas razones, podrfa utilizarse como primera etapa en la caracterizacion molecular de las LMA. De hecho en las LMA NPMc+ no es necesario realizar analisis citogenetico, FISH y analisis molecular, para las alteraciones cromosomicas de mayor importancia, tales como t(15; 17), t(8;21), inv16, t(6;9) y 11q23/MLL ya que son cada una mutuamente excluyentes con la positividad citoplasmatica para NPM. Por el contrario, en las LMA NPMc, estos analisis son obligatorios. La citogenetica ayuda a la identificacion de translocaciones poco frecuentes con un impacto pronostico potencial en el 14 % de LMA NPMc+ con anomalfas cromosomicas menos importantes. Las mutaciones del gen FLT3 deberfan buscarse en todos los pacientes con LMA (independientemente de la NPM), ya que su correlacion con la expresion subcelular de la NPM puede ayudar a identificar nuevos subgrupos de pronostico en la LMA de cariotipo normal (Schnittger et al., 2005; Dohner et al., 2005; Verhaak et al., 2005). El uso de la inmunohistoqufmica para identificar las mutaciones de NPM tiene tambien una importancia clfnica, porque la distribucion citoplasmatica de NPM y las mutaciones genicas son predictivas de una buena respuesta a la terapia de induccion y un mejor pronostico a largo plazo, en comparacion con casos de leucemia aguda con cariotipo normal sin mutacion del gen de NPM (LMA NPMc-) (Schnittger et al., 2005; Dohner et al, 2005; Verhaak et al., 2005).

Los datos ilustrados anteriormente explican el mecanismo a traves del cual las mutaciones especfficas del exon 12 del gen de NPM alteran el transporte nucleo-citoplasma de las protefnas NPM mutadas y de tipo silvestre. El mecanismo es identico tanto en celulas transfectadas como en celulas leucemicas de pacientes con LMA NPMc+ y en la lfnea leucemica humana OCI/AML3. En particular, las mutaciones conducen a dos cambios fundamentales en la region carboxilo-terminal de los mutantes de NPM: 1) se produce un NES que potencia la expulsion de las protefnas mutantes por parte del Crm1; y 2) los dos triptofanos 288 y 290 (o unicamente el triptofano 290) se pierden, los cuales, en condiciones normales, son esenciales para la union de la protefna NPM a los nucleolos.

El analisis de secuencias primarias de la protefna NPM de tipo silvestre, permitio detectar un NES fisiologico hipotetico de tipo LxxPxxLxL, que esta localizado en la zona entre los restos 94 y 102 de la NPM (Wang et al.,2005). A pesar de la presencia de este NES, la protefna NPM de tipo silvestre, en condiciones fisiologicas, se localiza principalmente en los nucleolos y esto sugiere que el fragmento de la protefna NPM que es normalmente expulsado del nucleo hacia el citoplasma, a traves del NES fisiologico, es decididamente inferior al de la misma protefna que, mediante dos NLS (“senales de localizacion nuclear”), es capaz de regresar desde el citoplasma al nucleo. Debido a que los mutantes de NPM de tipo silvestre artificiales humanos y murinos sin los dos triptofanos 288 y 290 (diferentes con respecto al mutante de NPM de tipo A leucemico unicamente por la carencia del NES C-5 terminal), se localizan exclusivamente en el nucleoplasma (Nishimura et al., 2002), es muy probable que el NES adicional, creado por la mutacion a nivel de la region C-terminal, confiera al mutante de NPM leucemico una mayor habilidad para ser exportado hacia el exterior del nucleo; esto podrfa deberse al efecto aditivo y/o aumento de la afinidad con Crm1 del segundo NES.

Aunque ambos, 288 y 290, cumplen una funcion en la localizacion nucleolar de la NPM, el triptofano 290 podrfa ser mas importante, ya que se encuentra sistematicamente alterado en todos los mutantes de NPM leucemicos identificados hasta ahora. La mutacion de los dos triptofanos permite la maxima inhibicion del enlace nucleolar y la deslocalizacion nucleoplasmatica de mutantes lograda en celulas NPMc+ leucemicas. De gran importancia es la observacion de que el motivo NES que se encuentra mas comunmente en los mutantes de NPM (LxxxVxxVxL) esta siempre asociado a las mutaciones de ambos triptofanos. Por el contrario, el triptofano 288 parece mantenerse unicamente en aquellos mutantes de NPM que incluyen variantes menos comunes de NES, concretamente los caracterizados por la presencia de leucina, fenilalanina, cistefna o metionina en la segunda posicion de NES, en lugar de valina (Tabla 3). Estas dos observaciones indican una probable diferencia funcional entre los NES de la region C-terminal de los mutantes de NPM leucemicos.

Los resultados de nuestros estudios muestran tambien inequfvocamente que la acumulacion citoplasmatica aberrante de mutantes puede ocurrir unicamente debido a la accion coordinada de NES y triptofanos mutados. Es posible que la acumulacion anomala de mutantes de NPM tenga lugar de acuerdo con el siguiente mecanismo: i) las protefnas NPM leucemicas mutadas que conservan dos senales de localizacion nuclear (NLS), se introducen en el nucleo; ii) su capacidad para unirse a los nucleolos esta completamente inhibida cuando los triptofanos son mutados, o parcialmente inhibidos cuando unicamente el triptofano 290 es alterado, dando como resultado la acumulacion de mutantes en el nucleoplasma; iii) los mutantes nucleoplasmaticos son capturados por el Crm1 que determina la rapida expulsion de los mismos al citoplasma, donde se acumulan progresivamente.

La explicacion del mecanismo de transporte alterado de la NPM en la leucemia NPMc+ sugiere, como posible area de intervencion terapeutica, la “relocalizacion” de mutantes de NPM leucemicos y la protefna NPM de tipo silvestre en sus sitios fisiologicos, mediante el uso de inhibidores de Crm1 o moleculas sinteticas pequenas que interfieren

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con la union NPM mutante-Crml o protefna NPM de tipo silvestre u otras moleculas capaces de interactuar con NPM (ARF, etc.).

EJEMPLO 5: Desarrollo de un sistema de PCR cuantitativa para la evaluacion y control de la enfermedad minima residual

Diversas mutaciones de NPM 1 heterocigoticas sugieren la necesidad de un sistema especffico de la mutacion para el control de la enfermedad. En el desarrollo del sistema merece la pena considerar que las dos mutaciones mas frecuentes, denominadas mutacion A y B, incluyen mas del 95 % de todos los casos mutados.

Materiales y metodos

Un metodo de evaluacion especffica utiliza un cebador directo disenado en el exon 11 (cNPM1-F: 5'-5'- GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3'), una sonda en la union exon 11/exon 12 (c.Sonda: 5'-FAM-

ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3') y cebadores inversos especfficos de la mutacion (cNPM mut.A-R: 5'- CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3' y cNPM mut.B-R: 5'-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3'). El cebador directo y la sonda son los mismos, independientemente de las diferentes mutaciones (Figura 13).

Etapa 1 = Reaccion de retro-transcripcion de acuerdo con el protocolo EAC (Gabert et al., Leukaemia 2003). Etapa 2 = Reaccion de amplificacion que utiliza una mezcla que contiene 12,5 pl de Taq Man universal PCR Master 45 Mix (Applied Biosystem), 300 nM de cebadores, 200 nM de sonda y 5 pl de ADNc en un volumen total de 25 pl. Condiciones: 2 minutos a 50 °C (activacion enzimatica UNG), 10 min a 95 °C (inactivacion enzimatica UNG y activacion con AmpliTaq polimerasa) seguido de 50 ciclos a 95 °C durante 15 segundos, a 62 °C durante 1 minuto para la mutacion A y a 59° C durante 1 minuto para la mutacion B. Como control de ARN cuantitativo y cualitativo puede amplificarse el gen ABL. El ajuste para el analisis del instrumento (Sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM 7700, de Applied Biosystem) incluye un “umbral” de 0,1 con una “lfnea de referenda” de 3 a 15 tanto para ABL como NPM. La sensibilidad y especificidad del sistema se analizan utilizando diluciones secuenciales, en un factor de 10, mezclando el ARN extrafdo de celulas leucemicas medulares con una mutacion de la NPM de tipo A o B y ARN obtenido de un pool de celulas medulares de pacientes sin mutaciones de NPM (verificado mediante secuenciacion).

El grafico estandar de evaluacion cuantitativa absoluta para la mutacion A se construye utilizando una construccion plasmfdica. Tal construccion consiste en un vector plasmfdico pCRII-TOPO, (Invitrogen, Groningen, Netherlands) mas una parte del gen de NPM1 que contiene la mutacion A. La amplificacion de la mutacion A se obtiene mediante RT-PCR con los cebadores NPM1-390_F (5'-GGTCTTAAGGTTGAAGTGTGGT-3') y NPM1-1043_R (5'- TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3').

El plasmido es preparado en cinco diluciones secuenciales: 105, 104, 103, 101, 10 copias. Los resultados de la RQ- PCR para la mutacion A normalizados en los transcriptos ABL, se expresan como un numero de copias de NPM con mutacion A cada 104 copias de ABL.

La “sensibilidad maxima reproducible”, de acuerdo con las directrices sobre la enfermedad minima residual definidas por el Grupo de estudios Europeos (van der Velden VHJ et al, 2003), se define como la dilucion mas baja en la que todas las replicas de muestras son positivas dentro de un Ct (umbral de ciclo) de 1,5, y el Ct mas alto de las replicas es al menos 3,0 Ct menor que el valor de fondo mas pequeno. La “maxima sensibilidad” se define como una dilucion minima en la que al menos una muestra es positiva y al menos 1,0 Ct menor que el Ct mas pequeno de fondo. Con estas definiciones, un resultado se define como “positivo, no cuantificable” en presencia de amplificacion en 1 de 2 replicas por debajo del maximo de sensibilidad reproducible, pero aun asf 1,0 Ct menor que el valor de fondo mas pequeno.

Resultados

La sensibilidad y especificidad de la PCR “inversa cuantitativa” (RQ-PCR) se analizaron en la dilucion en serie de 105, 104, 103, 102, 10 copias de plasmidos. Los valores del Ct (umbral del ciclo) y la “pendiente” del grafico para el plasmido se muestran en la siguiente figura.

Los graficos de plasmidos estandar muestran una “pendiente media” de -0,38 y un “corte” de 39,5 ± 0,45 Ct. El coeficiente de correlacion es elevado (>0,99 en todos los experimentos) y demuestra la identificacion precisa de la presencia de copias de la mutacion A en muestras desconocidas. La sensibilidad maxima reproducible de la RQ- PCR corresponde a 10 moleculas de plasmidos (Figura 14).

Se realizaron diluciones secuenciales en base a un factor de 10 para simular la sensibilidad y reproducibilidad de la RQ-PCR en el control de la enfermedad minima residual en 5 pacientes diagnosticados como afectados por (leucemia mieloblastica aguda) LMA NPMc+ (4 pacientes con mutacion A y 1 con mutacion B).

El ARN extrafdo de las celulas leucemicas medulares con mutacion de la NPM de tipo A o B se diluyo con ARN

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obtenido a partir de un pool de celulas medulares de pacientes sin mutaciones de NPM.

La sensibilidad maxima reproducible igual a 10-4 se observo en los 5 pacientes con mutaciones A o B, mientras que la sensibilidad maxima fue de 10-6 en la muestra con la mutacion de tipo B y en 3 de 4 muestras con mutacion de tipo A. La sensibilidad maxima igual a 10-5 se observo en una de las muestras con mutacion A. La amplificacion de fondo se observo en un caso y en valores de Ct muy altos (Ct>48), lo que muestra la elevada especificidad del sistema (Figura 15).

Utilizando el grafico de calibracion plasmfdica 13 pacientes afectados con LMA con mutacion de NPM de tipo A se analizaron en el diagnostico y despues del tratamiento de induccion.

Los resultados fueron expresados como “numero de copias de NPM1 Mut.A/10000 copias de ABL”. En el diagnostico, todas las muestras mostraron >30000 copias. Despues del tratamiento de induccion el numero de copias disminuye notablemente en 10 pacientes que evidenciaban remision hematologica completa. En 5 pacientes el numero de copias alcanzada fue de <70, mientras que en los otros 5 pacientes se situaba en un intervalo entre 580 y 5046. No se observo ninguna o solo una pequena disminucion del numero de copias en 3 casos: 2 remisiones completas y 1 remision parcial (Figura16).

En 3 pacientes afectados con LMA con mutaciones del gen NPM1 de tipo A, el sistema anteriormente mencionado fue utilizado para controlar la enfermedad minima residual tanto durante la terapia como en el seguimiento.

La RQ-PCR especifica del ADNc mostro un numero de copias <10 despues del primer o el segundo ciclo de la terapia de consolidacion. Se observo una cinetica diferente en la disminucion del numero de copias en las tres muestras tal como se muestra en la Figura 17. Un numero pequeno pero persistente de copias mutadas esta asociado con la remision hematologica en un paciente (cuadrado). En uno de los casos restantes el numero de copias mutadas disminuye notablemente despues del tratamiento de consolidacion (rombos); tal disminucion es menos pronunciada en el segundo paciente (triangulo). En los ultimos dos pacientes el numero de copias aumenta nuevamente y en ambos casos tiene lugar una recaida hematologica (Figura 17).

En conclusion, el sistema tiene las mencionadas caracteristicas de sensibilidad, especificidad y reproducibilidad como para ser utilizado en pruebas clinicas.

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- Chang J H, Lin J Y, Wu M H, Yung B Y. Biochem J 1998; 329(Pt 3):539-44.

- Goding J. Monoclonal Antibodies. Academic Press 1983.

- Quentmeier H., Leukaemia 2005; 19:1760-67.

- Schreiber E, et al. Nucleic Acids Res. 1989; 17:6419.

- Wang W, et al. Nat Cell Biol 2005; 7:823-30.

- Gabert J, et al. Leukaemia 2003; 17:1013-1034

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Falini, Brunangelo Mecucci, Cristina

<120> Mutantes de la protefna nucleofosmina (NPM), secuencias genicas correspondientes y usos de los mismos

<130> PCT26212

<150> RM2004A000534 <151>

<160> 55

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (6)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Leu Xaa xaa xaa val xaa xaa val Xaa Leu 15 10

<210>2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (6)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 2

Leu xaa xaa Xaa Leu xaa xaa Val xaa Leu 1 5 10

<210>3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (6)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 3

Leu xaa xaa xaa Phe xaa xaa val xaa Leu 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (6)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 4

Leu xaa xaa xaa Met xaa xaa val xaa Leu 15 10

<210>5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <220>

<221> misc_feature <222> (2)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (6)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural <400> 5

Leu xaa xaa xaa Cys Xaa xaa Val xaa Leu 15 10

<210>6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Leu Cys Leu Ala val Glu Glu Val Ser Leu 15 10

<210>7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 7

Leu Cys Met Ala val Glu Glu Val Ser Leu 1 5 10

<210>8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 8

Leu Cys val Ala val Glu Glu Val Ser Leu 1 5 10

<210>9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 9

Leu Ser Arg Ala val Glu Glu val ser Leu

1 5 10

<210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 10

Leu Cys Thr Ala val Glu Glu Val Ser Leu

1 5 10

<210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Motivo NES <400> 11

Leu ser Gin Ala val Glu Glu val Ser Leu 1 5 10

<210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 12

Leu Cys His Ala val Glu Glu val ser Leu 1 5 10

<210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 13

Leu Cys Arg Ala Val Glu Glu val Ser Leu 15 10

<210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 14

Leu Cys Arg Gly val Glu Glu val Ser Leu 15 10

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 15

Leu Cys Gin Ala val Glu Glu val Ser Leu 15 10

<210> 16 <211> 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 16

Leu Cys Ala Ala val Glu Glu val Ser Leu 15 10

<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 17

Leu Cys Lys Ala val Glu Glu val Ser Leu 15 10

<210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 18

Leu Trp Gin Ser Leu Ala Gin val Ser Leu 1 5 10

<210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 19

Leu Trp Gin ser Leu Glu Lys val ser Leu 15 10

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Leu Trp Gin Ser Leu Ser Lys val Ser Leu 15 10

<210>21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 21

Leu Cys Thr Phe Leu Glu Glu val Ser Leu 15 10

<210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 22

Leu Trp Gin Cys Phe Ala Gin val Ser Leu 15 10

<210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 23

Leu Trp Gin Cys Phe Ser Lys val Ser Leu 1 5 10

<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 24

Leu Trp Gin Arg Phe Gin Glu Val Ser Leu 15 10

<210> 25 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> Motivo NES <400> 25

Leu Trp Gin Asp Phe Leu Asn Arg Leu

1 5

<210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 26

Leu Trp Gin Ser Met Glu Glu val Ser Leu 1 5 10

<210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES

<400> 27

Leu Trp Gin Arg Met Glu Glu val ser Leu 15 10

<210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Motivo NES <400> 28

Leu Trp Gin Cys Cys Ser Gin Val Ser Leu 1 5 10

<210> 29 <211>5 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Peptido C-terminal <400> 29

val Ser Leu Arg Lys

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia NPM C-terminal mutada <400> 30

Asp Leu Cys Leu Ala val Glu Glu val Ser Leu Arg Lys 15 10

<210>31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia NPM C-terminal mutada

<400> 31

Asp Leu Cys Met Ala val Glu Glu val Ser Leu Arg Lys 1 5 10

<210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia NPM C-terminal mutada

<400> 32

Asp Leu Cys val Ala val Glu Glu val Ser Leu Arg Lys 15 10

<210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia NPM C-terminal mutada

<400> 33

Asp Leu Cys Leu Ala val Glu Glu val ser Leu Arg Lys 1 5 10

<210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia NPM C-terminal mutada

<400> 34

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Asp Leu Trp Gin Ser Leu Ala Gin val Ser Leu Arg Lys 15 10

<210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia NPM C-terminal mutada <400> 35

Asp Leu Trp Gin Ser Leu Glu Lys val ser Leu Arg Lys 15 10

<210> 36 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM directo <400> 36

ggttgttctc tggagcagcg ttc 23

<210> 37 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso <400> 37

cctggacaac atttatcaaa cacggta 27

<210> 38 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM directo <400> 38

ggtcttaagg ttgaagtgtg gt 22

<210> 39 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso <400> 39

tcaactgtta cagaaatgaa ataagacg 28

<210> 40 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> Cebador NPM directo mutA <400> 40

gaggctattc aagatctctg tct

<210>41 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso mutA <400> 41

cctggacaac atttatcaaa cacggta

<210> 42 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM directo mut B <400> 42

gaggctattc aagatctctg cat

<210> 43 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso mut B <400> 43

cctggacaac atttatcaaa cacggta

<210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM directo mut C <400> 44

gaggctattc aagatctgcg t

<210> 45 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso mut C <400> 45

cctggacaac atttatcaaa cacggta

<210> 46 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

23

27

23

27

21

27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<223> Cebador NPM directo mut D <400> 46

gaggctattc aagatctctg cct

<210> 47 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso mut D <400> 47

cctggacaac atttatcaaa cacggta

<210> 48 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM1 directo <400> 48

ttaactctct ggtggtagaa tgaa

<210> 49 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM1 inverso <400> 49

ccagactatt tgccattcct aac

<210> 50 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM directo <400> 50

gccacggatc cgaagattcg atggac

<210>51 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso <400> 51

atcaagaatt ccagaaatga aataagacg

<210> 52 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

23

27

24

23

26

29

5

10

15

20

25

30

35

<220>

<223> Cebador NPM directo <400> 52

gaagaattgc ttccggatga ct

<210> 53 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM directo mut A <400> 53

cttcctccac tgccagacag a

<210> 54 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador NPM inverso mut B <400> 54

ttcctccact gccatgcag 19

<210> 55 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Sonda <400> 55

accaagaggc tattcaa 17

22

21

Claims (31)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Protefna nucleofosmina (NPM) mutada caracterizada por tener una ubicacion citoplasmatica y comprender una mutacion que tiene como resultado la perdida de los restos de triptofano en las posiciones 288 y 290 y la generacion de un motivo de senal de exportacion nuclear (NES) en la region C-terminal de la secuencia de la nucleofosmina humana (NP_002511), en el que dicho motivo de senal de exportacion nuclear (NES) comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de LxxxVxxVxL (SEQ ID No. 1), LxxxLxxVxL (SEQ ID No. 2), LxxxFxxVxL (SEQ ID NO. 3), LxxxMxxVxL (SEQ ID No. 4) o LxxxCxxVxL (SEQ ID No. 5), en la que x puede ser cualquier aminoacido.
2. 2. Protefna de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que LxxxVxxVxL (SEQ ID No 1) se selecciona de LCLAVEEVSL (SEQ ID No 6); LCMAVEEVSL (SEQ ID No 7); LCVAVEEVSL (SEQ ID No 8); LSRAVEEVSL (SEQ ID No 9); LCTAVEEVSL (SEQ ID No 10); LSQAVEEVSL (SEQ ID No 11); LCHAVEEVSL (SEQ ID No 12); LCRAVEEVSL (SEQ ID No 13); LCRGVEEVSL (SEQ ID No 14); LCQAVEEVSL (SEQ ID No 15); LCAAVEEVSL (SEQ ID No 16) o LCKAVEEVSL (SEQ ID No 17).
3. 3. Protefna de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que LxxxLxxVxL (SEQ ID No 2) se selecciona de LWQSLAQVSL (SEQ ID No 18); LWQSLEKVSL (SEQ ID No 19); LWQSLSKVSL (SEQ ID No 20) o LCTFLEEVSL (SEQ ID No 21).
4. 4. Protefna de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que LxxxFxxVxL (SEQ ID No 3) se selecciona de LWQCFAQVSL (SEQ ID No 22); LWQCFSKVSL (SEQ ID No 23); LWQRFQEVSL (SEQ ID No 24) o LWQDFLNRL (SEQ ID No 25).
5. 5. Protefna de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que LxxxMxxVxL (SEQ ID No 4) es LWQSMEEVSL (SEQ ID No 26) o LWQRMEEVSL (SEQ ID No 27).
6. 6. Protefna de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que LxxxCxxVxL (SEQ ID No 5) es LWQCCSQVSL (SEQ ID No 28).
7. 7. Protefna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha region C-terminal incluye el peptido VSLRK (SEQ ID No 29).
8. 8. Protefna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas un D-aminoacido aguas arriba del L-aminoacido en el extremo N-terminal del motivo NES como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. 9. Protefna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que esta fusionada a una protefna indicadora.
10. 10. Protefna de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dicha protefna indicadora se selecciona de EGFP, P- galactosidasa, luciferasa o GFP.
11. 11. Protefna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha protefna esta conjugada con una nanopartfcula.
12. 12. Anticuerpo capaz de reconocer y unirse selectivamente a una protefna nucleofosmina mutada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. 13. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que dicho anticuerpo es monoclonal o policlonal.
14. 14. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 12 o 13, en el que dicho anticuerpo esta conjugado con un agente seleccionado de una sustancia fluorescente, una enzima, un radioisotopo, una nanopartfcula o un medicamento.
15. 15. Uso del anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, solo o en combinacion con otros anticuerpos como marcador para el diagnostico, pronostico y control in vitro de la enfermedad minima residual y/o la preparacion de un farmaco para la terapia de la LMA NPMc+.
16. 16. Kit de diagnostico para la deteccion de las LMA NPMc+ en una muestra biologica, que comprende el anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
17. 17. Kit de diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que dicha deteccion se produce mediante un ensayo de inmunohistoqufmica, inmunoenzimatico, por inmunotransferencia, por inmunoprecipitacion o una combinacion de los mismos.
18. 18. Un metodo de diagnostico o pronostico in vitro de la LMA de cariotipo normal y/o de control de la enfermedad minima residual que comprende medios seleccionados de sondas de oligonucleotidos, cebadores, epftopos o

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    anticuerpos para detectar la protefna nucleofosmina (NPM) mutada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una secuencia de oligonucleotidos que codifica la misma.
19. 19. Kit de diagnostico para la deteccion de la LMA NPMc+ y/o control de la enfermedad minima residual en una muestra biologica, que comprende al menos una de las secuencias de oligonucleotidos que codifican las proteinas nucleofosmina (NPM) mutadas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
20. 20. Kit de diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 19, en el que dicha deteccion se produce mediante tecnicas de PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real, transferencia puntual inversa (RBD), matrices de tejidos multiples (My) o una combinacion de las mismas.
21. 21. Metodo para la deteccion in vitro de las proteinas nucleofosmina (NPM) mutadas citoplasmaticas en una muestra biologica, que comprende las etapas de:

    a) poner en contacto la muestra biologica con al menos un anticuerpo dirigido contra un epftopo resistente a agentes de fijacion de la protefna NPM, adecuado para detectar la localizacion citoplasmatica de la NPM; y

    b) detectar la union anticuerpo-epftopo antigenico.
22. 22. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 21, en el que dicha muestra biologica se selecciona de un corte de tejido o de una muestra citologica.
23. 23. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 21 o 22 que comprende ademas una etapa c) de detectar proteinas NPM mutadas utilizando anticuerpos adecuados para reconocer y unirse selectivamente a una protefna como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
24. 24. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 23, en el que dicha protefna de la etapa c) comprende el peptido VSLRK.
25. 25. Uso de las proteinas nucleofosmina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o combinaciones de las mismas, para la preparacion de una vacuna antitumoral.
26. 26. Uso de acuerdo con la reivindicacion 25, en el que dicha vacuna es una vacuna anti-LMA NPMc+.
27. 27. Composicion farmaceutica que comprende al menos una de las proteinas nucleofosmina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, junto con excipientes y adyuvantes farmacologicamente aceptables.
28. 28. Vacuna antitumoral que comprende al menos una de las proteinas nucleofosmina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con excipientes y adyuvantes farmacologicamente aceptables.
29. 29. Vacuna antitumoral de acuerdo con la reivindicacion 28, en la que dicha vacuna es especffica de la LMA NPMc+.
30. 30. Animal transgenico no humano que comprende una protefna nucleofosmina mutada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
31. 31. Uso de un animal transgenico de acuerdo con la reivindicacion 30 como un modelo de estudio experimental para el estudio de nuevos farmacos para el tratamiento de la LMA NPMc+.