CN101160320B

CN101160320B - 核磷蛋白质(npm)突变体、其相应基因序列及其用途

Info

Publication number: CN101160320B
Application number: CN200580045036.0A
Authority: CN
Inventors: B·法利尼; C·梅库奇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-28
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2025-10-28
Also published as: US10487366B2; ES2607987T3; US20180119233A1; US20150184245A1; ES2755875T3; US20200032354A1; ES2654564T3; EP3284750A1; EP1944316A1; PT1944316E; WO2006046270A2; SI1944316T1; ES2542339T3; CN101160320A; US8501924B2; US20080299560A1; HK1247222A1; EP2319865B1; DK2319865T3; EP1944316B1

Abstract

本发明涉及新核磷蛋白(NPM)突变体，其相应的基因序列及其用于诊断、监测轻微后遗症；预测评价和治疗急性髓样白血病(AML)的用途。

Description

核磷蛋白质(NPM)突变体、其相应基因序列及其用途

技术领域

本发明涉及新的核磷蛋白质突变体，其相应基因序列及其监测轻微后遗症、预测评价和治疗急性髓性白血病(LAM)的诊断用途。

更具体而言，本发明涉及新的细胞质核磷蛋白质(nucleophosmin)(NPM)突变体和其相应基因序列及其作为诊断、预测和治疗具有正常核型的急性髓性白血病标记物的用途。

背景技术

原发性急性髓性白血病，成年人中最常见的白血病形式，为发病于骨髓的疾病，更常见发病于由已经定型(committed)为髓细胞(myelopoiesis)的多能(pluripotent)或multipotentl干细胞。致瘤性转化通过防止干细胞后代的成熟而改善了调节干细胞增殖和分化的机理。该事件的后果是累积的，主要累积在骨髓，然后累积在自发增殖的白血病细胞(或亚顶级(blastic))的周围血液和其它器官和组织中。

迄今为止，根据细胞遗传学分析和分子生物学，将LAMs分成不同的预测基团，以便拟出最佳治疗计划。目前，LAM治疗主要是基于连续给药不同的活性化学治疗药物来抗白血病细胞。

在LAMs的治疗中存在多个步骤。第一步，称为诱导治疗，旨在用能导致患者达到所谓的血液学完全缓解的目标物毁坏大部分白血病细胞，即，具有正常化外周和髓质的血液学数据的白血病细胞消失。在第一步治疗后剩余的白血病细胞(所谓的轻微后遗症)的破坏可通过继续化学治疗(保持或增强或再诱导)，然后使用或不使用自体移植或异体移植(根据存在或不存在供体的阴性预测因素和可利用性)来实现。不幸地是，因为这些恶性肿瘤的攻击性，治疗仅对30％的患者是决定性的。对于改善LAM患者的诊断和存活率而言，有三种方法是主要有效的方法：i)提供快速和特定的诊断性试验，以便获得更准确的诊断和能监测所谓的“轻微后遗症”；ii)鉴定根据“风险种类”能允许层化(stratify)治疗的生物学预测因素，和iii)研究新的更靶向的治疗形式，其能干涉通过某些遗传损害诱导的致瘤性转化机理。

在某些LAM亚型，如具有易位t(8；21)或inv(16)的那些中，这些目标物的某些已经被追踪，其可以用细胞遗传学方法/FISH或RT-PCR被非常精确地识别/监测，并显示出比对其它形式的白血病更好的预后。甚至，在某些LAM亚型如具有易位(15；17)的原髓细胞(promyelocytic)白血病中，与化学治疗和反式视黄酸或ATRA(一种直接对遗传学损害起作用的药剂)组合的应用已经引起这些患者存活率的明显改善。

然而，这些诊断/治疗的改善仅与少数LAMs有关。事实上，在细胞遗传学分析中较大部分的LAM，约40％的病例显示出正常核型(Grimwade等人，1998)，代表临床上和生物学上的异源分类(heterogeneous category)(Grimwade等，1998；Schnittger等，2002；Byrd等，2002)。

具有正常核型的LAM基因表达的分析已经被提议作为用于表征不同的预测亚群的工具(Bullinger等，2004；Valk等，2004)，但它不能识别与正常核型有关的特定遗传学损害。迄今为止，与正常核型有关的唯一遗传学损害作图(map)在FLT3(Schnittger等，2002；Frohling等，2002)、CEBPα(Pabst等，2001)和MLL(Steudel ef to the.，2003)基因水平上。然而，它们不能被认为是正常核型-特异的，因为它们也存在于具有更多染色体易位的LAM病例中(Carnicer等人.，2004)和急性继发性髓性白血病中(Christiansen等人，2001)。

因此，迄今为止，不存在能特别地检测和区别原发性正常核型LAMs的诊断/预测试验或分子标记物，所述LAMs的特性和分类仍然是基于不合理的形态学标准。另外，有关遗传学损害的无知代表用于监测LAM轻微后遗症的障碍(在治疗选择上具有相关的困难)和可能研究用于该种类LAM分子治疗的新形式的障碍。

从上述可清楚地是，需要提供用于具有正常核型的原发性急性髓性白血病的新的诊断和预测标记物，和用于这些亚型白血病的特定治疗的新的分子靶点。

现在，本发明的作者已经从相同的，特别是与正常核型LAM相关的蛋白质中鉴定出了编码的核磷蛋白基因(NPM)和核磷蛋白质的突变体。

核磷蛋白(NPM)为主要受限制在细胞核中的蛋白质(Cordell等人，1999)，其作为从细胞核至细胞质的梭起作用(Borer等人，1989)。其为“伴侣”分子(Dumbar等人，1989)，可能参与防止蛋白质在细细胞核中的聚集和调节前核醣体结构穿过核膜的装配和运输。其也是在中心体复制中CDK2/ciclin E.的靶点(Okuda等人，2000)，并参与Arf-p53介导的肿瘤抑制机理的调节(Bertwistle等人，2004；Colombo等人，2002；Kurki等人，2004)。在鼠科模型(“敲除(knock-out)”小鼠)中，NPM基因似乎在调节造血的中起主要的作用(Grisendi等人，2005)。

NPM基因参与白血病和导致融合蛋白质形成的淋巴瘤染色体易位，所述融合蛋白质比如，例如NPM-ALK(Morris等人，1994)，NPM RARα(Redner等人，1996)和NPM-MLF1(Yoneda-Kato等人，1996)，其仅仅保存在NPM分子的N-末端区域(Falini等人，1999；Falini等人，2002)。核磷蛋白被认为是通过活化融合配偶体(ALK，MLF1，RARα)的致癌潜能而有助于肿瘤发生(Bischof等人，1997)。

因为NPM被推测在通过Arf/p53介导的肿瘤抑制中起作用，所以，转化期间从细胞核至细胞质的生理学运输改变可能是决定性的。NPM和/或包含NPM的融合蛋白质在亚细胞分配中的改变可以通过免疫组织化学研究来揭示。例如，在具有t(2；5)所谓的ALK阳性淋巴瘤(Falini等人，1999)和具有t(3；5)的急性白血病中观察到NPM蛋白质的细胞质离域作用(Falini等人，1999；Falini等人，2002)和同样NPM的预期的细细胞核定位(Cordell等人，1999)。这一发现应归于抗-NPM单克隆抗体与NPM-ALK融合蛋白质[t(2；5)的产物]或NPM-MLF1[t(2；5)的产物]或NPM-MLF1[t(3；5)]和/或具有定位于细胞质中与NPM-MLF1形成异二聚体的NPM蛋白质的反应性。

现在，本发明的作者已经发现，约三分之一的成年人LAMs在免疫组织化学检查中显示出NPM蛋白质(NPMc+)的异常细胞质分布(正常的细胞核限制的)，并且，这些免疫组织化学的发现与特异性突变体的白血病细胞中存在的NPM基因的外显子12(GenBank NM_002520)水平和在用于编码NPM蛋白质的C末端结构的部分中NPM基因的外显子12(GenBankNP_002511)水平有关。

表达NPM蛋白质突变体和相应基因序列的急性白血病，作者称之为LAMNPMc+(Falini等人，2005)，表示以宽的形态学范围(morphological spectrum)、正常核型、提高的FLT3基因突变频率(“内部串连重复”)和对诱导治疗快速应答为特征的非常特殊(well-distinct)的实体。NPM基因的突变体和随后在白血病细胞的细胞质中突变的NPM蛋白质的分布表示迄今在正常核型LAM中发现的最特异的和常见分子事件。本发明的作者也已经发现NPM突变体代表用于预测(Schnittger等人，2005)和监测轻微后遗症正常核型LAMs的良好标记物。

发明内容

因此，本发明的作者已经鉴别了核磷蛋白质(NPM)的突变体序列和编码它们的NPM基因的突变型，其可有利地被用于作为：在制备诊断试剂盒中的预测标记物和用于监测轻微后遗症中的标记物，和作为在原发性正常核型LAMs中的治疗靶点。

因此，本发明提供了通过用抗NPM抗体(细胞质的NPM的鉴别)研究和/或NPM基因突变分析来诊断正常核型LAMs的异质种类，新的亚型，称为LAMNPMc+的特定方法。该观察具有重要的诊断含义，因为迄今为止，正常核型LAM仅仅基于不合理的形态学标准进行分类(Jaffe等人，2001)。特别地，本文作者已经使用单克隆抗体来抗对NPM分子的固定剂有抗性的表位(Cordell等人，1999；Falini等人，2002)，其使得它们适于分析固定并包括在石蜡内的常规活组织检查样品，比如，例如osteomedullary活组织检查或骨髓凝块。因为NPM突变总是杂合子，白血病细胞包含野生型和突变的NPM蛋白质两种。这两种蛋白质不能使用现有的抗NPM单克隆抗体互相区分。

更特别地，为了研究没有野生型NPM蛋白质的干涉的NPM突变体的亚细胞分布，作者制备了能识别特定的NPM突变体的多克隆抗体(命名为Sil-C)。

NPM(和NPM基因的突变)的细胞质定位与正常核型特别相关。因此，其表示用于预后的优良免疫组织化学标记物，因为其将因为物质不足、生物样品衰退(deterioration)、没有有丝分裂、难于确定地说明核型而不能另外按细胞遗传学分类的那些白血病患者归属于“中度危险(intermediary risk)”LAM种类(其中包括具有正常核型的患者)。

而且，用于证实细胞质的NPM(NPMc+)的免疫组织化学试验(预言性NPM基因的外显子-12100％突变)可被认为是通过确定LAM NPMc+病例与NPMc-病例相比的存活率差异来用于预测正常核型LAMs的预测因素。更具体而言，在不存在FLT3基因突变时，NPM的外显子12突变的存在使得我们能够鉴别良好预测具有正常核型的髓性白血病的新组群(Schnittger等人，2005)。

而且，细胞质的NPM(NPMc+)的免疫组织化学鉴定可以被认为是用于对正常核型LAMs中诱导治疗的良好应答的预测因素。

细胞质水平或用于基因水平突变的NPM试验，由本发明的作者提供，为高灵敏度的、特异的、简单的、经济的和快速的诊断试验(48-72小时至获得结果)，它们使用本领域那些技术人员熟知的免疫组化和生物分子学方法。而且，这些试验可以有利地被用于监测在直到今日仍没有有用的分子或immunophenotypical标记物的情况下(正常核型)的轻微后遗症。

而且，本发明作者进行的研究结果提出了LAMs NPMc+的新疗法：其通过利用包在脂质微粒或病毒(Downward J.，2004)中的反义寡核苷酸或小RNAs来干扰载有用于编码根据本发明突变的NPM蛋白质突变基因的翻译和转录过程。在可能的治疗应用中，存在使用特异定向抗NPM突变体C末端部分的细胞内抗体(“intrabodies”)(Stocks MR，2005)或使用能够抑制NPM突变体的特定C末端区域的小分子(肽等)。

在可能的治疗应用中，也包括干涉NPM分子(突变型和野生型)的翻译后改变(乙酰化、磷酸化、泛素化(ubiquitination)等)的那些，和与它们相互作用的分子或与突变的NPM蛋白质的存在有关的特定细胞信号途径改变的那些。

而且，给药突变体NPM蛋白质或其部分(例如肽)或编码蛋白质或其部分的核苷酸序列，以用于诱导抗肿瘤免疫性，而可以有利地用于预防或治疗用途。

因此，本发明的目的是突变核磷蛋白质(NPM)，特征在于其中它们具有细胞质定位，且包含在色氨酸残基288和/或290中至少一种突变的氨基酸序列，和/或存在于人核磷蛋白序列(NP_002511)的C末端区域的核输出的信号基序(NES)。在本发明蛋白质的优选实施方案中，突变与两种色氨酸288和290都有关(所有NPM突变体的67.5％)或仅与色氨酸290有关。

在本发明蛋白质的优选实施方案中，所述核输出的信号基序(NES)包括氨基酸序列YxxxYxxYxY，其中Y为通常选自亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸的疏水性氨基酸，x可以为任意氨基酸或其片段和变异体。优选地，序列YxxxYxxYxY选自LxxxVxxVxL(SEQ ID No 1)、LxxxLxxVxL(SEQ ID No 2)、LxxxFxxVxL(SEQ ID No 3)、LxxxMxxVxL(SEQID No 4)、LxxxCxxVxL(SEQ IDNo 5)。更优选LxxxVxxVxL(SEQ ID No 1)(最常见的NES基序)，其选自LCLAVEEVSL(SEQ ID No 6)；LCMAVEEVSL(SEQ ID No 7)；LCVAVEEVSL(SEQ IDNO 8)；LSRAVEEVSL(SEQ ID No 9)；LCTAVEEVSL(SEQ ID NO 10)；LSQAVEEVSL(SEQ ID No11)；LCHAVEEVSL(SEQ ID NO 12)；LCRAVEEVSL(SEQ ID NO 13)；LCRGVEEVSL(SEQ ID No14)；LCQAVEEVSL(SEQ ID No 15)；LCAAVEEVSL(SEQ ID No 16)；LCKAVEEVSL(SEQ IDNO17)。优选地，LxxxLxxVxL(SEQ ID No 2)选自LWQSLAQVSL(SEQ ID No 18)；LWQSLEKVSL(SEQ ID NO 19)；LWQSLSKVSL(SEQ ID No 20)；LCTFLEEVSL(SEQ ID NO 21)。然而更优选地，LxxxFxxVxL(SEQ ID No 3)选自LWQCFAQVSL(SEQ ID No 22)；LWQCFSKVSL(SEQ ID NO23)；LWQRFQEVSL(SEQ ID No24)；LWQDFLNRL(SEQ ID No 25)。在本发明的优选实施方案中，LxxxMxxVxL(SEQ ID No 4)为LWQSMEEVSL(SEQ ID No 26)或LWQRMEEVSL(SEQ IDNO 27)。在另一个优选的实施方案中，LxxxCxxVxL(SEQ ID No 5)为LWQCCSQVSL(SEQ ID No 28)。

优选地，根据本发明的突变蛋白质的C末端区域也可包括VSLRK肽(SEQ IDNo 29)，其中L-氨基酸表示如上定义的NES基序的最后一个氨基酸。

在优选实施方案中，如上定义的NES基序的氨基酸序列，可以进一步包括在所述NES基序N-末端的L-氨基酸的上游区的D-氨基酸(例如DLCLAVEEVSLRK(SEQ ID No 30)；DLCMAVEEVSLRK(SEQ ID No 31)；DLCVAVEEVSLRK(SEQID No 32)；DLCLAVEEVSLRK(SEQ IDNo 33)；DLWQSLAQVSLRK(SEQ ID No34)；DLWQSLEKVSLRK(SEQ ID NO 35)。

根据本发明的一个特别的方面，如上述的突变的NPM蛋白质，可以与依次选自EGFP、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、GFP的受体蛋白质融合。融合蛋白质可以通过融合(melting)编码上述市售获得的蛋白质，与本发明的肽的DNA，然后表达如此制备的融合产物来制备。

本发明涉及如上述的与纳米颗粒结合(即量子点(Quantum Dot))的突变的或融合NPM蛋白质。

本发明的进一步目的是用于编码如上定义的突变蛋白质或其片段和变异体的寡核苷酸序列。根据本发明的寡核苷酸序列可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列或它们的互补序列。

根据本发明的优选实施方案，脱氧核糖核苷酸序列可以包括一种具有下述GenBank的保藏号(GenBank deposit numbers)的序列：AY740634、AY740635、AY740636、AY740637AY740638、AY740639。

在本发明的一个特别的实施方案中，寡核苷酸序列可以用选自荧光物质、生物素、放射性同位素、纳米颗粒的试剂标记。该标记可以用于利用上述的寡核苷酸序列作为用于体外诊断和/或监测轻微后遗症和/或预测以正常核型为特征的LAMs的标记物。特别地，标记物包括至少一对引物，其可以在一个或两个引物中被选自荧光物质、生物素、放射性同位素、纳米颗粒(Quantumdot)的试剂进行标记或不进行标记。在在另一个实施方案中，标记物包括至少一个寡核苷酸探针，其可以用选自荧光物质、生物素、放射性同位素、纳米颗粒的试剂标记。

本发明进一步目的是具有下述序列的引物：

i)NPM1_25F：5′-GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC-3′(SEQ ID No 36)；

NPM1_1112R：5′-CCTGGACAAATTTATCAAACACGGTA-3’(SEQ ID No37)；

ii)NPM1_390F：5′-GGTCTTAAGGTTGAAGTGTGGT-3′(SEQ ID No 38)；

NPM1_1043_R；5′-TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3′(SEQ IDNo 39)；

iii)NPM_940F_mutA 5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGTCT-3′(SEQ ID No40)；

NPM1_1112R 5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ IDNo 41)；

iv)NPM_940F_mutB 5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCAT 3′(SEQ ID No42)；

NPM1_1112R 5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA3′(SEQ IDNo 43)；

v)NPM_940F_mutC 5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCGT-3′(SEQ ID No44)；

NPM1_1112R 5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ IDNo 45)；

vi)NPM_940F_mutD 5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCCT3′(SEQ ID No46)；

NPM1_1112R 5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ ID No47)；

vii)NPM1-F：5′-TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3′(SEQ ID NO 48)；

NPM1-R：5′-CCAGACTATTTGCCATTCCTAAC-3′(SEQ ID No 49)；

viii)

NPM1_89F_BamHI：

5′-GCCACGGATCCGAAGATTCGATGGAC-3′(SEQ ID No 50)

NPM1_1044R EcoRI：

5′ATCAAGAATTCCAGAAATGAAATAAGA CG-3′(SEQ ID NO 51)；

ix)cNPM-F：5′-GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3′(SEQ ID NO 52)和

cNPM mut.A-R：5′-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3′(SEQ ID NO 53)

或cNPM mut.B-R：5′-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3′(SEQ ID No 54)。

特别地，引物i)可用于扩增NPM基因的编码区域(NM_002520)，优选使用RT-PCR。引物ii)可单独用于扩增产生具有pCRII-小鼠载体(Invitrogen)的构建体。上述的引物iii)、iv)、v)、vi)已经分别经设计用于通过RT-PCR扩增编码突变蛋白质的寡核苷酸序列：

A)DLCLAVEEVSLRK(SEQ ID NO 30)-引物iii)；

B)DLCMAVEEVSLRK(SEQ ID No 31)-引物iv)；

C)DLCVAVEEVSLRK(SEQ ID NO 32)-引物v)；

D)DLCLAVEEVSLRK(SEQ ID No 33)-引物vi)；

特征在于具有四核苷酸重复(duplication)的突变。最后，引物vii)被用于扩增NPM蛋白质C末端区域外显子12的基因组DNA；引物viii)被用于插入到根据本发明的序列的表达载体中。

本发明的进一步目的是质粒，包括一种上述的寡核苷酸序列。优选地，所述质粒可以选自pGEM-T和pGEM-T Easy(Promega)。

本发明的进一步目的表示为表达载体(比如，例如病毒载体或pEGFP-c1)，包括一种上述的寡核苷酸序列。在本发明的优选实施方案中，所述载体为pEGFP-c1，其包括EGFP受体基因序列。

本发明也涉及能表达至少一种如上述蛋白质突变体的宿主细胞，所述细胞包括具有上述定义的特征的质粒。优选地，宿主细胞为原核的。

而且，本发明的目的为细胞系，优选哺乳动物细胞系(然而更优选鼠科的例如NIH3T3和BaF3)，包括作为LAM NPMc+实验性研究模型或作为测试用于作为这种类型白血病的可能药物的新分子的筛选模型使用的表达载体。

本发明的进一步目的为用于制备突变核磷蛋白质(NPM)的方法，包括下述步骤：

a)用至少一对引物通过RT-PCR扩增根据本发明的寡核苷酸序列：

b)将步骤a)中扩增的寡核苷酸序列插入pGEM-T Easy载体中，并通过限制内切酶转移至表达载体中；

c)在选自鼠科细胞系NIH 3T3或BaF3的哺乳动物感受态(competent)细胞系中转染表达载体；

d)提取和纯化突变蛋白质。

在根据本发明的方法的优选形式中，步骤a)中所述至少一对引物为：

NPM1_89F_BamHI：5’-GCCACGGATCCGAAGATTCGATGGAC-3’(SEQ ID No50)；

NPM1_1044R_EcoRI：5’-ATCAAGAATTCCAGAAATGAAATAAGACG-3’(SEQ ID No 51)。

根据进一步的方面，本发明涉及能识别和选择性结合至少一个根据本发明突变的NPM蛋白质C末端区域(其可以包括VSLRK)的抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体或其片段(比如，例如scFv片段)。

根据本发明一个特别的方面，单克隆和多克隆的抗体可以与选自荧光物质、酶、放射性同位素、纳米颗粒、药物的试剂结合。

特别地，根据本发明的单克隆抗体和多克隆的抗体特别地定向抗NPM的C末端的白血病-特异性表位，所述NPM的C末端可以包括肽VSLRK、和/或色氨酸残基288和290中至少一种的突变(优选地，两个色氨酸残基同时突变或仅仅色氨酸残基290突变)，和/或如上定义的NES基序。

本发明进一步的目的是单克隆抗体或多克隆的抗体作为用于体外诊断和预测、用于检测轻微后遗症的用途和/或在制备用于治疗正常核型LAMs的药物中的用途。在优选的实施方案中，本发明涉及特定地定向抗突变体C末端部分的表位的细胞内抗体(“细胞内抗体(intrabodies)”)作为抑制突变的NPM蛋白质活性的药物的用途。

本发明的一个目的为用于检测始自生物样品的正常核型LAMs的诊断试剂盒，其包括抗体或其片段。所述抗体或片段能定向地抗对天然NPM蛋白质的固定剂(Fixatives)有抗性的表位，或者抗NPM的C末端突变的部分。所述检测可以通过免疫组织化学的、免疫酶的、免疫印迹、免疫沉淀反应试验或其组合获得。

本发明的进一步目的表示为根据本发明的寡核苷酸序列或通过其编码的核磷蛋白质用于制备体外诊断或预测正常核型LAMs和/或监测轻微后遗症的工具的用途。用于诊断的这样的工具优选地选自寡核苷酸探针、引物、表位、抗体。

本发明的一个特别的目的表示为白血病特异性抗原表位，其在突变核磷蛋白质的C末端区域产生，特征在于包括VSLRK肽，和/或色氨酸残基288和290中至少一种的突变(优选地，两个色氨酸残基同时突变或仅仅色氨酸残基290突变)，和/或如上定义的NES基序。

本发明的进一步目的包括用于检测生物样品中正常核型LAMs和/或用于监测轻微后遗症的诊断试剂盒，包括至少一种根据本发明的寡核苷酸序列或其部分。所述检测可以通过PCR、RT-PCR、实时或原位杂交、反向斑点印迹(RBD)、多组织阵列(Multiple TissueArray)(My)技术或其组合进行。

特别地，本发明涉及用于监测轻微后遗症的实时PCR诊断试剂盒，包括下述组分：

i)引物对

cNPM-F：5′-GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-5′(SEQ ID No 52)和

cNPM mut.A-R：5′-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3′(SEQ ID No 53)

或cNPM mut.B-R：5’-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3’(SEQ ID No 54)

ii)和探针5’-FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3’(SEQ ID No 55)。

而且，本发明的目的为固体载体，比如，例如膜或阵列，包括至少一种根据本发明寡核苷酸。

根据进一步的方面，本发明涉及用于检测编码上述突变核磷蛋白质的寡核苷酸序列的体外方法，包括下述步骤：

a)从生物试验样品中提取RNA；

b)利用如上定义的NPM序列(Gen Bank NM_002520)特异的引物通过RT-PCR或实时PCR进行逆转录和扩增；

c)通过使用引物对PCR产物进行纯化和测序。

在上述方法的优选实施方案中，步骤b)中使用的引物为选自上述列出的i)至ix)的一对正反向引物。优选地，步骤c)的引物选自：

NPM1_25F：5’-GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC-3’(SEQ ID No 36)；

NPM1_1112R：5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ ID No37)；

NPM1_390F：5′-GGTCTTAAGGTTGAAGTGTGTGGT-3′(SEQ ID No 38)；

NPM1_1043_R：5′-TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3′(SEQ IDNo 39)。

单独使用的相同的引物i)以及引物ii)可用于上述方法的步骤c)中(用于测序)。

特别地，在其中使用实时来检测的情况下，也可以使用“杂交探针”或“SYBR绿色检测”或“水解探针”系统。

在优选实施方案中，本发明涉及本步骤b)中使用突变-特异性实时PCR系统的方法。使用的引物为

cNPM-F：5’-GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3′(SEQ ID NO 52)和

cNPM mut.A-R：5′-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3′(SEQ ID No 53)或

cNPM mut.B-R：5′-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3′(SEQ ID No 54)

和探针为5′FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3′(SEQ ID No 55)，如在图13所示(参见实施例5)。

进一步地，本发明涉及具有下述寡核苷酸序列的寡核苷酸探针：5′FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3′(SEQ ID No 55)。

本发明的进一步目的为用于检测编码上述突变核磷蛋白质的寡核苷酸序列的方法，包括下述步骤：

a)从生物试验样品中提取RNA；

b)通过利用特定的引物对NPM序列(Gen Bank NM_002520)进行扩增；

c)检测PCR产物。

优选地，扩增是通过诊断PCR或实时PCR来进行的。在其中使用实时来检测的情况下，也可以使用“杂交探针”或“SYBR绿色检测”或“水解探针”系统。

在上述方法的优选实施方案中，步骤b)中使用的引物选自：

i)NPM_940F_mutA：5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGTCT-3′(SEQ ID No40)；NPM1_1112R：5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ IDNo41)；或

NPM1_390F：5′-GGTCTTAAGGTTGAAGTGTGGT-3′(SEQ ID No 38)；

NPM1_1043_R：5’-TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3′(SEQ IDNo 39)；

ii)NPM_940F_mutB：5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCAT 3′(SEQ ID NO42)；NPM1_1112R：5’-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA 3′(SEQ ID NO43)；

iii)NPM_940F_mutC 5’-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCGT-3′(SEQ ID No44)；

NPM1_1112R 5’-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ ID NO45)；

iv)NPM_940F_mutD 5’-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCT-3′(SEQ IDNo 46)；

NPM1_1112R 5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ ID No47)。

根据进一步的方面，本发明具有作为目的的用于检测生物样品中NPM的细胞质定位的体外方法，包括下述步骤：

a)使生物样品与至少一种能检测NPM的细胞质定位的抗体或其片段接触；

b)通过标准免疫荧光或免疫酶方法检测抗体-抗原表位结合。

上述方法的步骤a)中的所述生物样品选自：埋入石蜡的组织切片，优选地骨髓(osteomedullary活组织检查或血块)或脊髓涂片和血液或溶液细胞学样品。

优选地，方法的步骤a)中所述抗体为单克隆抗体。特别地，可使用定向抗对NPM的固定剂有抗性的表位的单克隆抗体(Cordell等人，1999；falini等人，2002)，其能检测蛋白质的细胞质定位。

在优选实施方案中，上述方法随后可包括另一个步骤c)：用抗体来检测上述病理学标本(切片、涂片、细胞学标本)中的突变NPM蛋白，所述抗体能识别和选择性结合根据本发明的突变的NPM蛋白质的抗原表位，或c1)检测突变的寡核苷酸，例如，通过用特定性引物的扩增法得到的。步骤c1)的引物可以为：

NPM_940F_mutA 5’-GAGGCTATTCAAGATCTCTGTCT-3’(SEQ ID No 40)；

NPM1_1112R 5’-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3’(SEQ ID No41)；

NPM_940F_mutB 5’-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCAT 3′(SEQ ID No42)；

NPM1_1112R 5′-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA3′(SEQ ID 43)；

NPM_940F_mutC 5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCGT-3’(SEQ ID No44)；

NPM1_1112R 5′-CC T GGACAACATTTATCAAACACGGTA-3′(SEQ ID No45)；

NPM_940F_mutD 5′-GAGGCTATTCAAGATCTCTGCCT-3’(SEQ ID No46)；

NPM1_1112R 5’-CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA-3’(SEQ ID No47)；用于鉴定突变A-D。

在根据本发明方法的优选实施方案中，步骤c)的抗原表位可以包括VSLRK肽、和/或色氨酸残基288和290中至少一种的突变(优选地，两个色氨酸残基同时突变或仅仅色氨酸残基290突变)，和/或如上定义的NES基序。

本发明进一步的目的表示为能与至少一种编码根据本发明的突变核磷蛋白质的寡核苷酸序列杂交并干涉其转录过程的反义寡核苷酸。在优选实施方案中，本发明的一个目的是反义寡核苷酸在制备用于治疗原发性LAMs的药物中的用途。

本发明有进一步的目的：核糖核苷酸序列(RNAi)，其能选择性杂交至少一种编码根据本发明的突变核磷蛋白质的寡核苷酸序列并干涉它们的表达。RNAi为双链RNA分子，包括正义和反义寡核苷酸链的组合，其阻止了靶向mRNAs的翻译。

根据一个特别的方面，本发明涉及核糖核苷酸序列RNAi以及微小RNA(microRNA)形式在制备用于治疗原发性LAMs的药物中的用途。

而且，在根据本发明可能的治疗应用中，本发明的目的也包括干涉NPM分子(突变型和野生型)的翻译后改变方法(乙酰化、磷酸化、泛素化(ubiquitination)等)或与一种突变的NPM蛋白质的存在有关的特定细胞信号途径改变。

而且，本发明提出使用“SAR by NMR”(Shuker等人，1996)或其它方法确定小分子(肽或其它物质)作为突变体NPM蛋白质C末端部分的特定抑制剂的用途。

本发明进一步的目的是根据本发明的寡核苷酸序列或由它们编码的核磷蛋白质或其部分(肽)或其组合用于制备抗肿瘤疫苗的用途。实际上，核磷蛋白质或肽可用作抗LAMNPMc+白血病疫苗。

本发明进一步的目的表示为药物组合物，包括至少一种根据本发明的寡核苷酸序列或由它们编码的核磷蛋白质或其部分(肽)与药理学上可接受的赋形剂和助剂。

本发明进一步的目的为抗肿瘤疫苗，包括至少一种根据本发明的寡核苷酸序列或由它们编码的核磷蛋白质或其部分(肽)与药理学上可接受的赋形剂和助剂。所述抗肿瘤疫苗专门用于预防和治疗LAM NPMc+。

最后，本发明具有目的：非人类转基因动物，包括编码如上述的突变核磷蛋白质的寡核苷酸序列。所述非人类转基因动物可以用于作为研究用于治疗LAMNPMc+的新药的实验性研究模型。

附图说明

现在，本发明将根据其优选实施方案，特别是参照附图的图表，通过说明性的而非限定性的方式来描述，其中：

图1A显示了有关在LAM中亚细细胞核磷蛋白表达的矩形图(histogram)，NPMc+和NPMC-分别在左侧和右侧方形图中；在左侧方形图中，指针(arrow)指示白血病细胞，而箭头(arrowhead)指示具有预期的细胞核限制的NPM阳性的剩余造血细胞(x1,000)；在右侧方形图中的指针指示具有预期的NPM细胞质表达的有丝分裂细胞(x1,000)；

图1B显示了在1706例人类肿瘤中细胞质的NPM表达，其对原发性LAMs是特异的，不能在其它造血的和extra-haemopietic肿瘤例如继发性LAMs；急性淋巴性白血病(ALL)；慢性髓性白血病(CML)；骨髓增生异常综合征(MDS)；非霍杰金淋巴瘤(NHL)和extra-haemopietic实体瘤(EXTRA-HEMOP)中检测到；

图1C显示了有关在GIMEMA/EORTC研究的591例原发性LAMs和具有t(15；17)的M3亚型的70例LAMs中NPM亚细胞表达和形态学之间相关性的直方图；LAM-NPMc+s可以属于所有的FAB亚群，但是更通常为M4-M5类型的，FAB-M5b形式几乎总是包括NPM突变。

图1D显示了在红细胞和髓样白血病细胞谱系(“multilineage involvement”)中细胞质的NPM表达；在左侧方形图中，显示了通过脊髓的(箭头)和红细胞的胚细胞(erythroid blasts)(指针)浸润的骨髓；在中心方形图中，显示了异常的红细胞前体(指针)和脊髓的胚细胞群(myeloid blasts)(双指针)，两者都在细胞质和核中表达NPM；箭头指示具有预期的细胞核限制(nucleus-restricted)的NPM的剩余造血细胞；在右侧方形图中，显示了具有预期的细胞核限制的核仁素(C23)表达的细胞；在中间和右侧方形图中的指针显示白血病细胞，对于血型糖蛋白的(表面)两重染色为褐色，对于NPM(细胞质加细胞核)或对于C23(细胞核限制)的染色为蓝色；所有的图都已经使用APAAP免疫酶技术获得；x1,000；

图2显示了有关细胞质的NPM表达和CD34存在之间相关性的直方图；图2A-C显示了在大多数病例中，细胞质的NPM表达与CD34-阴性有关，而NPMc-LAM病例显示出相反的行为；图2D显示了NPMc+正常核型LAM，无CD34表达(osteomedullary活组织检查，APAAP方法x1,000)；图2E显示了具有正常核型和强CD34阳性的NPMc-LAM(osteomedullary活组织检查、APAAP方法x1,000)；图2F表示NPMc+LAM的FACS分析；左侧方形图：对照；中心方形图：CD34(FITC)和缺乏CD133(PE)的白血病细胞；右侧方形图：CD33(FITC)和CD13(PE)共表达白血病细胞；

图3A指493名患有GIMEMA/EORTC研究的LAM患者的分析，显示出NPMc+病例仅仅与正常核型有关(NK：正常核型；AK：异常核型)；

图3B显示了493名LAM GIMEMA/EORTC研究加109名未包括在研究中的患者(70名具有t(15；17)急性前髓细胞白血病和39名患有主染色体重排的LAMs)的分析；24名NPMc+(柱形“其它的”)从来不会与主染色体异常有关，仅显示出较小的异常；没有一个NPMc+LAMs与主染色体异常有关；24名NPMc+病例(柱形“其它的”)仅显示出较小异常；

图3C和3D显示出预期的NPM在M3和M4eo类型的NPMc+LAM中的定位(APAAP技术；x1,000)；

图3E显示出，在正常核型LAMs(NK)的情况下，与在NPMc-LAMs相比，FLT3-ITD突变(内部串连重复-ITD)更常发生在NPMc+LAMs中(U＝没有突变，M＝突变的)；

图3F显示出，在正常核型LAMs(NK)的情况下，NPMc+形式更常发生于老年人中；

图3G显示了建立在细胞质的NPM和FLT3-ITD之间的独立相关性的多变量对数回归模型；Indip Var：独立可获得的；GL：自由度；Sig；显著性；OR：风险测定；^＊：正常对异常核型(排除更多的遗传事件)；M：突变的；U：未突变的；

图4A为NPM基因略图；黑块表示编码序列；未着色的块表示3′-和5′-UTRs；MB为金属结合结构域；Ac：为酸结构域；NLS表示核定位信号；NAB表示核酸结合结构域；黑指针指示在用于基因组DNA的引物图上的位置，未着色的指针指示用于cDNA扩增的引物；

图4B显示了与六种命名为A至F的突变的变异体比对的野生型NPM序列(核苷酸952-989)；大写字母表示核苷酸插入；具有在C末端色氨酸残基(W)下划线的突变蛋白质序列在右侧表示，而对所有突变蛋白质通用的新氨基酸序列显示在方框区域；对于每种变异体，给出了感染的病例总数；

图4C显示了测序来自一名听说突变A的患者的NPM，通过直接测序获得(在上面)和在克隆后并测序两种变异体等位基因(中间，野生型；底部，突变的等位基因)；指针指示其中等位基因差异的位置；

图4D显示了在用编码EGFP-标记的野生型(在上面)和变异的NPM等位基因(在下面)的质粒转染的NIH 3T3细胞的共焦显微镜检查的立体重构；野生型蛋白质定位于细胞核和核膜，而突变的NPM显示出异常细胞质的定位；

图5A显示了整个NPMc+或NPMc-白血病细胞的溶解细胞的蛋白质印迹(抗体Sil-C对376)；Sil-C抗体特异性识别仅仅存在于具有NPM突变(NPMc+)的LAM病例中突变的NPM蛋白质；

图5B显示了患有NPM的突变A的白血病患者中核(N)和细胞质(C)成分的蛋白质印迹(sil-C抗体)：Sil-C特别地识别NPMc+原发性白血病细胞的细胞质成分中突变的NPM蛋白质；结果表示3个独立的试验；

图5C-5E显示了具有突变A的NPMc+白血病细胞的osteomedullary活组织检查：(5C)FAB-M5急性髓性白血病的典型图像；指针指示具有肾形的核的大白血病细胞；(5D)Sil-C抗体特异性识别突变体(NPMm)，显示出阳性的细胞质-受限制(positivity)(指针)；T指示骨小粱(trabecule)；(5E)抗-NPM 376单克隆抗体识别野生型NPM和突变的NPM蛋白质，其在白血病细胞的细胞质和细胞核(指针)中染色；

图5F-5G显示出无NPM突变的早幼粒细胞白血病(promyelocyticleukaemia)(NPMc-)的osteomedullary活组织检查：(5F)LAM-M3的典型形态学(苏木精-曙红，x400)；(5G)Sil-C抗体不会染色M3白血病细胞，其仅通过交叉反应染色血管壁；星号指示容器腔(APAAP技术；苏木精中复染法；x400)；图6显示在40名白血病患者中确定的突变体NPM蛋白质中288和290色氨酸中的改变和产生的NES基序；Cit：细胞质的；nd：不能利用的；IH：免疫组织化学；方形图中的氨基酸：NES基序；有下划线的氨基酸：色氨酸残基；

图7A-B显示出在不存在(7A)和存在(7B)来普霉素B(Leptomycin B)(LMB)下，用编码NPMwt和从A至D的NPM突变体的c-DNA转染的HI299细胞。在存在或不存在LMB两种情况下，eGFP-NPMwt定位于细细胞核。在不存在LMB下，所有与GFPs有关的突变体(从A至D)显示出异常胞质定位(7A)，而在存在LMB下，在与eGFP有关的相同突变体都被重新定位在细胞核中。

图7C-E显示出在N1H-3T3细胞中，各种时段的LMB作用于结合到eGFP(eGFP-NPMmutA)的突变体A的影响的分析：(7C)在指定时间下，NIH-3T3细胞共焦显微镜检查荧光强度图像，其中白色圆形表示其中eGFP-NPMmutA的荧光强度已经计算出的区域(感兴趣区，ROI)；(7D)在NIH-3T3细胞的选定区域(ROI)中荧光测定结果；(7E)使用抗-GFP单克隆抗体对在N1H-3T3细胞中eGFP-NPMmutA亚细胞分布的蛋白质印迹分析；

图8A-B显示了为了证实在来普霉素B(LMB)作用下的核质中NPM突变体重新定位的共焦显微镜检查试验：(8A)在存在或不存在LMB下，用GFP-mutA或用GFP-NPMwt转染NIH-3T3细胞的共焦显微镜检查；在基本条件下，突变体仅定位于细胞质中(左侧上面)，但是在用LMB孵育后，其在核质中复位(右侧上面)；在存在或不存在LMB两种情况下，GFP-NPMwt定位于细细胞核(中间方形图，左右侧)；较低的方形图显示了用LMB处理和用GFP-mutA转染，且用抗核仁素单克隆抗体(C23)(指针)染色核仁的细胞；突变体NPM蛋白质(绿色)定位于核质中，而核仁素/C23(红色)定位在细胞核的核仁中，核膜被染色为蓝色；(8B)具有NPM突变A的NPMc+白血病骨髓的共焦显微镜检查(较上的方形图)；在脊髓抽吸物(在左边上面，指针)和骨活组织检查(在中间上面)中，白血病细胞显示出脊髓分化；白血病细胞，大多数接近骨小梁(T)，显示出细胞质的(和核的)NPM表达(在右侧上面)；在中间和下面方形图中，显示了用抗-NPM 376单克隆抗体染色的和在不存在(中间方形图)和存在(下面方形图)来普霉素B的情况下共焦显微镜检查观察的纯化白血病细胞；图像已经在3-D中重构，并且已经在核表面上进行了电子截面，以便于更好地观察的NPM定位。在一般条件下，不能区分NPM野生型和突变体A的376单克隆抗体标记了细胞核仁和细胞质两者(中间方形图)；用来普霉素B处理后，NPM再次进入细胞核(较下的方形图)；

图9A显示了在OCI/AML3细胞中用来普霉素B处理后，突变体NPM的核重新定位；(9A)在不存在LMB下，抗-NPM 376抗体标注(underlines)了细胞核仁和细胞质两种(左侧)；用LMB孵育测定NPM在核质中的重定位(右侧)；

图9B显示了用对照IgG或抗NPMm兔子抗体(Sil-C)和抗-NPM鼠科抗体与OCI-AML3细胞和U937细胞的裂解细胞的免疫共沉淀反应(IP)：用抗-Crm1抗体的蛋白质印迹显示在上面方形图中，而具有抗NPMm(Sil-C)和抗-NPM(CI.376)抗体的那些显示在中间和下面方形图中：WCL显示作为对照的包括的OCI-AML3裂解细胞；该图显示突变的NPM蛋白质和Crm1之间的物理相互作用；

图10显示了用野生型eGFP-NPM或突变体eGFP-NPM转染的N1H-3T3细胞的共焦显微镜分析，显示出NES和色氨酸突变两者都是输出(exporting)NPM突变体所必需的；NPM突变体A中NES结构的破坏(NPM mut A，无-NES)阻止了从细胞核的输出，因此，在存在和不存在LMB两种情况下，突变体似乎都定位于核质；在用LMB处理后，含有色氨酸288但不含290一种的NPM突变体E部分地复位于细胞核仁中；色氨酸290的重新插入(NPMmutA，A290W)产生了几乎相同的效果；当两种色氨酸(288和290)两种都已经再次插入突变体A(C288W+A290W)中时，在存在和不存在LMB的两种情况下，相应融合至eGFP的蛋白质，无论是否存在NES，只定位于细胞核仁中；

图11A显示了用突变体A GFP-NPM和野生型HA-NPM的共转染鼠科细胞的实验；与确定其部分移入细胞质的野生型NPM相比，NPM突变体起阴性支配(negative dominant)作用；

图11B显示了用α-NPM或α-HA的蛋白质印迹(左方形图)和用抗Flag抗体的免疫共沉淀反应和用α-NPM或α-HA的蛋白质印迹(右方形图)；生物化学数据证实了用荧光蛋白标记的那些；

图11C显示了NPM突变体A和野生型NPM细胞核-细胞质改变的定位机理的假设方案，白色非着色点：色氨酸残基；黑点：突变的色氨酸；正方形：核输出信号(NES)；

图12显示了用于研究急性髓性白血病的NPM免疫染色法的方案，其中根据细胞质的(NPMc+)或核的(NPMc-)NPM表达将病例分别分成两组；

图13图解了在RQ-PCR中使用的探针和引物；显示用于突变A和B的两种特异系统；扩增策略使用了对两种系统通用的正引物(primer forward)(cNPM1-F)和探针(c.探针)；正引物定位于外显子11，而探针定位于外显子11和外显子12之间的接合处；两次逆转录(reverses)是cNPM-mut.A-R和cNPM-mut.B-R突变特异的，且都设计在外显子12；该表显示了引物和探针序列；

图14显示了与5份测试的plasmidic稀释液有关的Plasmidic RQ-PCR中的扩增曲线图，一式两份；质粒包含具有突变A的NPM1基因序列；表显示了在另外4个试验中的数据重现性；

图15显示了与依靠诊断中具有突变A的NPMc+LAM样品的强度(strength)系数等于10的六个连续稀释液有关的RQ-PCR中cDNA的扩增曲线图；标准曲线强调(underlines)了“倾斜(inclination)”，相关系数和Y-轴截距；该表显示出在4个具有突变A的样品和1个具有突变B的样品中获得的诊断结果；在所有样品中，已经获得“最大可重复的灵敏度”为10^-4；

图16显示了在13名患有具有突变A的NPMc+LAM患者中，在诊断中和在诱导治疗后，NPM的突变拷贝数的监测(拷贝数表示为具有突变A的NPM拷贝数/10000ABL的拷贝数)；(缩写：CR＝完全缓解，PR＝部份缓解，NR＝无应答)；

图17显示了在3名患有NPMc+LAM突变A的患者中，诊断在诱导治疗后及在随后期间，NPM的突变拷贝数的监测；RQ-PCR显示了在减少拷贝数中的不同动力学(differentkinetic)；在50天治疗内，所有的患者证实了完全的血液学缓解，但显示出NPM 1不同的突变拷贝数；患者I(正方形)显示出持续的血液学缓解；在治疗后90天，达到最低突变拷贝数，随后期间仍旧保持相同；在患者II(菱形)中，治疗后约100天，NPM1的突变拷贝数达到最低；在治疗后约200天的随后期间，拷贝数决定性增加是明显的，同时，血液学复发；在患者II(三角形)中，治疗后约140天，NPM1的突变拷贝数达到最低；在随后期间，拷贝数决定性增加是显然的，同时血液学复发(在图中没有表示)，其发生在约相隔一个月(不存在复发的分子学数据)；(缩写：CR＝完全缓解)。

具体实施方式

实施例1：NPM的基因表达和在LAMs中其诊断和预测值的研究

已经进行了用来确定急性髓性白血病大的亚群(在成年人中约占LAMs的三分之一)的研究，其特征在于白血病胚细胞(leukaemic blasts)中的细胞质NPM定位于、NPM基因突变、高频率正常核型和对诱导化学治疗的快速应答。

材料和方法

肿瘤样品和患者

已经在1845个包埋在石蜡的肿瘤样品中进行了免疫组织化学研究。LAMs包括：591例GIMEMA/EORTC研究AML12的原发性LAMs(年龄15-60，不包括M3亚群)和70例急性原髓性白血病(acute promyelocytic leukaemias)，69例原发性和135例继发性LAMs(69 primaryand 135secondary LAMs out protocol)。剩余样品表示造血和extra-haemopoietic肿瘤，而不是LAM。

在通知批准后，将已经固定在B5中的患有LAM的每名患者的osteomedullary活组织，转移到70％醇中，脱钙，并包被(included)在石蜡中。

抗体

使用抗NPM的单克隆抗体(Cordell等人，1999；Falini等人，2002)，其能够在包埋在常规石蜡中的切片上进行蛋白质鉴定。活组织检查样品也已经用抗下述分子的单克隆抗体染色：核仁素(C23)(Saint Cruz Biotechnology Inc.，CA，USA)、glicophorin、CD34(DakoCytomarion，Glostrup，Denmark)、CD133(MiltenyiBiotech，Bologna，Italy)和ALK(Falini等人，1999)。

免疫组织化学染色

使用APAAP方法进行了免疫染色(Cordell等人，1984)。已经评价了未知FAB亚型、细胞遗传学或分子生物学的亚细胞NPM分布(细胞核对细胞质)。将病例分类为NPMc+(阳性细胞质)或NPMc-(阴性细胞质)。所有的病例已经同时用核仁素(C23)染色，如所预期的，在NPMc+病例中，已显示出受限制的核表达。

分子和细胞遗传学分析

细胞遗传学研究在短期培养后进行。核型在G带显带技术后进行分析，并根据国际系统的人类细胞遗传学命名法描述(Mitelman，1995)。如前所述进行了FISH研究(Crescenzi等人，2000)。

如前所述进行了用于主融合转录本的RT-PCR(PML-RARα、AML1-ETO、CBFB-MYH11、BCR-ABL和DEK-CAN)、DNA印迹、用于MLL重排的FISH分析和用于FLT3(ITD和D835)和MLL-ITD突变的分析(Van Dongen等，1999；Soekarman等，1992；Noguera等，2002；tip等，1995)。

NPM突变分析

在本研究中，在161例淋巴-造血的恶性肿瘤中进行NPM基因突变分析：52例NPMc+LAMs、56例NPMc-LAMs(NPMc-56LAMs)、9例慢性髓性白血病(CML)、7例急性成淋巴细胞白血病(ALL)和37例淋巴瘤形成。在诊断中和在化学治疗后完全缓解步骤中，对五名患有NPMc+LAM的患者进行分析。

对于NPM编码区域的分析，使用RT-PCR Thermoscript系统(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA USA)逆转录一微克RNA，使用Expand High-FidelityPlus PCR 系统(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)用引物NPM1_25F、5′-GGT TGT TCT CTG GAG GAG CGT TC-3′和NPM1_1112R、5′-CCT GGA CAA CAT TTA TCAAAC ACG GTA-3′扩增cDNA序列。

为了扩增来自基因组DNA的外显子12序列，两个寡核苷酸经设计使其特异退火至内含子序列侧翼区域(NPM1-F：5′-TTA ACT CTC TGG TGG TAG AATGAA-3’和NPM1-R：5′-CAAGAG TAT TTG CCA TTC CTA AC-3′)。根据标准方法纯化PCR产物，并从两端直接测序。所有的突变在独立的PCR产物中，在代表性病例中，通过克隆入pGEM-T Easy(Promega，Madison，WI，USA)中证实，并测序。

NPM突变与其它突变之间的关系

AMLCG 99记录的具有NPM突变的正常核型LAM病例被用于其它的突变存在的分析，所述其它突变特别是FLT3-ITD、FLT3-D835、MLL-PTD、CEBPA、NRAS和KIT。

表达载体：质粒结构

为了跟踪转染实验中突变的和野生型NPM的亚细胞的命运，产生表达野生型(pEGFPd-NPMwt)或突变体(pEGFPd-NPMmA)NPM等位基因的质粒，所述等位基因融合至增加的绿色发荧光蛋白质(EGFP)。为此目的，用如下引物对来自患有在基因外显子12中杂合性突变的NPMc+LAM患者(编号497A/30)的NPM cDNA序列进行扩增：NPM1_89F_BamHI、5′GCCACG GAT CCG AAG ATT CGATGGAC3′和NPM1_1044R_EcoRI、5’-ATC AAG AAT TCC AGA AATGAA ATA AGACG3′，并且，以正确读码框克隆进入pEGFP-C1载体(BD BiosciencesClontech，Palo Alto，CA，USA)中。序列分析证实在两种质粒中不存在Taq-引进的误差。

瞬时转染实验

使用Lipofectamin 2000试剂(Invitrogen)，用pEGFPd-NPMwt、pEGFPd-NPMmA和空的pEGFP-C1载体瞬时转染NIH 3T3细胞。转染效率通过蛋白质印迹来检测。图像是在用碘化丙啶复染核之后，用BioRad MRC 1024共焦显微镜得到的。共焦部分(slice)是用SCIOctane工作站得到的，并且从共焦部分开始的图像的重构是使用Imaris软件的“ShadowProjection”(Bitplane，Zurich，CH)进行的。

统计分析

在两种方法的列联表中的卡方分析公开了分类变量(categorical variables)之间的关系。用t-检验分析平均数之间的统计学差异。NPM定位和FLT3-ITD/D835突变之间的关系，随年龄和细胞遗传学修正，被研究用于用这些因素作为独立变量和NPM作为因变量的对数回归模型(logistic regression model)。具有主易位的病例被排除，因为它们与细胞核限制的NPM表达的绝对联系不会提供有效的参数估计。

在126例根据GIMEMA LAM99P协议书方法治疗的正常核型LAM(79例NPMc+和47例NPMc-)中评价临床和生物学特征(目前的白血球数、NPM亚细胞表达、FLT3突变)和对诱导治疗的应答之间的联系。应用多变量对数模型。在两种方法的所有统计分析中，p＜0.05的两个值被认为是统计学重要的。

结果

NPM的细胞质定位

细胞质的NPM表达，定义为NPMc+(图1A)，发现于GIMEMA/EORTC研究的208/591(35，2％)原发性LAM病例中(图1B)。这些发现似乎对原发性LAMs是特异的，而在继发性LAMs中和在总是仅显示出核NPM表达的人类肿瘤中，其是无法检测到(图1B)。在NPMc+白血病细胞中，核仁素(C23)，另一种核仁抗原，保持如在图1A中所示的其细胞核限制的定位。在NPMc+LAMs中，异常NPM表达通常被发现于几乎所有的白血病细胞中；除了在M5b(单核细胞白血病)病例下，其中细胞质NPM仅仅在肿瘤人群中以可变的百分比表达，即30-60％的白血病细胞，优选那些更不成熟的(成单核细胞)细胞。相反，NPMc-LAMs很少包含NPMc+白血病细胞，主要的有丝分裂成分，如在图1A右侧所示。

白血病细胞的异常细胞质NPM表达必须被认为是长期事件，如通过在25名患有NPMc+LAM且在最初诊断后3年内疾病才复发的患者中比较来证实。

NPMc+LAM的形态学

在所有的FAB种类中都发现异常细胞质NPM表达，除了M3(急性前髓性白血病)、M4eo(具有嗜酸粒细胞增多的急性粒-单核细胞白血病)和M7(急性巨核细胞白血病)，如在图1C中所示。特别地，该图显示了在591例GIMEMA/EORTC研究的原发性LAMs和70例具有t(15；17)的急性前髓性白血病(out of protocol)中NPM亚细胞表达与形态学之间的相关性。细胞质NPM表达的频率从在MO(最少分化的LAM)的13.6％变为在M5b(急性单核细胞白血病)中的93.7％。大多数M5b和M6(急性红细胞白血病)类型的NPMc+LAM和约30％的NPMc+M1(不成熟的LAM)、M2(成熟的LAM)和M4病例具有特征：细胞质的NPM不仅存在于脊髓胚细胞中，而且存在于红细胞前体中，特别是存在于原红细胞(图1D)中，很少存在于巨核细胞中(数据没有显示)。

存在于不同造血谱系中的细胞质NPM引起某些分子，如CD34和CD133抗原的表达分析，其发生于造血干细胞上。在12/159(7.5％)NMPc+LAM和在227/317(71.6％)NMPc-LAM(p＜0.001)中检测到CD34-阳性(定义为20％阳性细胞)，如在图2A-2E中所示。因此，NPMc+似乎与CD34和CD133表达互相排斥。CD34-阴性的NMPc+LAMs特征性地也缺乏CD133，如在图2F中所示。

NPMc+LAM的宽的形态学范围和各种生血谱系的涉及反映出其可能源自CD34-/CD38-稀有造血干细胞，其在几种动物物种中被确定，包括鼠科和人类(Goodell等人，1997；Engelhardt等人，2002)。另外，CD34可以作为白血病转移的结果而是未调节的。

NMPc+LAM的核型

细胞遗传学数据为在LAM的493/591病例(166例NPMc+和327例NPMc-)中获得的。超过85％(142/166)的NPMc+LAM具有正常核型，如图3A所示。相反，仅26.9％(88/327例)的NPMc-LAM具有正常核型(p＜0.001)。总的来说，61.7％的正常核型LAM为NPMc+(142/230例)，如图3B所示。24例NPMc+LAM显示出存在较少染色体易位，在这些中，12(50％)例同时具有正常和异常细胞分裂中期。

患有主要的遗传异常的LAM病例中没有一个为NPMc+，如图3B、3C和3D所示。

NPMc+LAM中的FLT3-ITD和其它基因突变

FLT3、ITD或D835突变是分别在具有正常核型的59/219(26.9％)和13/202(6.4％)LAM病例中检测的；一个病例同时具有ITD和D835突变。在NPMc+病例中更常见的FLT3-ITD突变为在NPMc-病例中的2.5倍(p＜0.003)，如图3E的直方图所示。根据年龄和细胞遗传学调整的多变量对数回归模型使建立了细胞质的NPM(因变量)和FLT3-ITD之间的独立相关性，如图3G所示。FLT3-D835突变和NPM亚细胞定位之间没有观察到统计相关性(p＝0.5)，可能是因为D835-突变病例数量少。

在随后对AMLCG 99诊断记录(Schnittger等人，2005)病例的研究中，证实了在具有NPM突变的LAM病例中FLT3-ITD突变频率增加。相反，NPM突变几乎与MLL(MLL-PTD)和CEPBA突变无关。

对NPMc+LAM的诱导治疗的应答

在根据GIMEMA Iam99p方法治疗的126例具有正常核型的病例(79例NPMc+和47例NPMc-)中评价对诱导治疗的应答。在表1中显示了126患者对诱导治疗应答的对数回归模型。

表1

M＝突变的；U＝没有突变的；WBC：白血球数量；#Cit.＝细胞质阳性；Nucl.＝细胞核限制的阳性

用于完成完全应答的多变量模型包括白细胞计数(归类在75^#百分比)、年龄(归类在中间值(median value))、NPM亚细胞表达和FLT-3突变。分析显示在表1中，显示出白细胞计数和NPM都是独立的预测因素。特别地，将超过80x10⁹/L的白细胞计数(p＜0.006；OR＝0.269；CI 95％：0.1-0.6)作为阴性预测因素，将白血病细胞具有细胞质的NPM的事实(p＜0.019；OR＝2.988；CI 95％：1.2-7.4)作为阳性预测因素。

在正常核型LAMs中作为预测因素NPM突变

根据存在的NPM基因和FLT3-ITD基因突变，将正常核型LAMs分为4组：突变的NPM/突变的FLT3、突变的NPM/非突变的FLT3、非突变的NPM/突变的FLT3和非突变的NPM/非突变的FLT3。作者对401例具有正常核型的LAM病例进行的分析(Schnittger等，2005)显示出在不存在FLT3突变的情况下，NPM突变的存在可识别具有良好预后的白血病亚群。随后也在其它两项研究中报告了类似的结果(Dhoner等，2005；Verhaak等，2005).

在LAMs和其它肿瘤中NPM突变的分析

NPMc+LAM不表达NPM-ALK、NPM-RARα、NPM-MLF1融合蛋白质或其它包含NPM的融合蛋白质，如通过不存在各自的(respective)融合基因下用FISH、在不存在各自的融合转录本下用RT-PCR、在不存在所述融合蛋白质下用免疫组织化学、仅仅存在38kDa NPM多肽下用蛋白质印迹法所显示的，并通过四种不同的抗NPM单克隆抗体证实细胞质的NPM。

在本研究中，NPM编码区的分析通过RT-PCR和直接测序来进行，在除了一个NPMc+外的所有病例中都显示出影响外显子12的突变。图4A为NPM基因的图示，突变概括在图4B中。总的来说，观察到六种不同序列的变异体，它们都引起编码NPM蛋白质羧基端区域的区域移码。最常见的突变(类型A：gatctctgTCTGgcagtggagga agtctctttaagaaaatag)为参考寡核苷酸序列NM 002520(GenBank)的位置956-959中TCTG四核苷酸的重复，如图4C所示；预计读码框中产生的移动可通过用11个不同的残基(CLAVEEVSLRK)取代最后七个氨基酸(WQWRKSL)来改变NPM蛋白质本C末端部分。三种另外的突变(类型B：gatctctgCATGgcagtggaggaagtct ctttaagaaaatag，类型C：gatctctgCGTGgcagtggaggaagtct ctttaagaaaatag，和类型D：gatctctgCCTGgcagtggaggaagtct ctttaagaaaatag)包括插入到位置960的不同的4个碱基对，所有的产生相同的移码，如突变A。在最后的两种突变(类型E：gatctctggcagtCTCTTGCCC aagtctctttaagaaaatag和类型F：gatctctggcagtCCCTGGAGAaagtctctttaagaaaatag)，核苷酸965-969(GGAGG)缺失和替代它们，嵌入两种不同的9-碱基对序列，而没有改变移码和产生新的9个氨基酸羧基末端结构域。不考虑突变的特定类型，突变体的特征在于在野生型序列中，在位置288和290的两个色氨酸残基(W)中的至少一个被置换。根据在小鼠中进行的研究中的上述证据得到结果，其显示出色氨酸氨基酸对于核仁定位的重要性(Nishimura等人，2002)。而且，所有的突变体蛋白质共享相同的最后5个氨基酸残基VSLRK。因此，不考虑遗传异质性，所有的NPM基因突变都引起新的序列代替NPM蛋白质C-末端。

在11个样品中，也通过基因组DNA的序列分析证实了在NPM外显子12中存在的突变和它们与NPMc+LAM的特定相关性。NPM突变为杂合的，仅仅发生于恶性克隆中，如它们不会存在于来自化学疗法后完全缓解的患者中的骨髓样品(N＝5)。在所有FAB种类的NPMc+LAM中观察到突变，所述FAB种类包括具有异常核型或CD34表达的NPMc+病例。相反地，所有的56例NPMc-LAMs以及53例不同于LAM的恶性肿瘤和NPMc-显示出野生型NPM序列，如表2所示。

表2

肿瘤类型	N.	FAB	CD34+	Mut.FLT3	Mut.NPM
						LAM NPMc+	52
正常核型	49	所有的^＊	2/49	25/46	48/49
						异常核型	3	M1，M5b	1/3	1/3	3/3
LAM NPMc-	56
						正常核型	12	M1-M6	8/10	4/12	0/12
异常核型^＊＊	44	M1-M6	5/8	3/8	0/44^＊＊＊
						LMC	9	n.a	0/9	n.b	0/9
淋巴瘤形成	44#	n.a	n.b	n.b	0/44

^＊除了M3、M4eo和M7。^＊＊包括7t(15；17s)；12t(8；21s)；13Inv(16)；1MLL重排；1inv(3；1t(6；9)，一种复合核型；^＊＊＊具有Inv 16的病例显示出在NPM 1外显子6中583-585位缺失三个核苷酸，不包括3′末端。#包括：7例急性成淋巴细胞白血病；7例淋巴细胞B慢性淋巴细胞增多症；5例mantellari淋巴瘤；5例滤泡性淋巴瘤；10例巨细胞B淋巴瘤；5例伯基特淋巴瘤；5例多发性骨髓瘤。Mut.：突变的；n.a.：没有应用的；n.d.：未进行。

在随后的研究中，作者证实了前述接受NPM基因测序的1009例LAM病例结果。图6显示了迄今可见的40种NPM突变。

突变NPM基因的转染

为了证实NPM外显子12突变是否对NPM蛋白质的细胞质的转位应答，NIH3T3细胞瞬时被编码与EGFP融合的野生型和突变体等位基因的表达载体转染。对EGFP-NPM野生型蛋白质的共焦显微镜检查显示预期的核仁定位，而NPM突变异构体清楚地定位于细胞质中，如图4D所示。

这些结果清楚地表明NPM蛋白质的遗传事件(NPM突变)和胞质定位之间的因果相关性。而且，突变的NPM与正常核型密切相关性和不能在具有主要细胞遗传学异常的白血病中看到的事实表明NPM突变是原发性leukaemogenic事件。该突变可干涉NPM的正常功能，比如，例如与Arf或p53蛋白质相互作用(Colombo等，2002；Kurki等，2004；Horn等，2004)。突变也可扰乱其它的定位在C末端域的NPM功能，所述功能例如核酸结合(hingorani等人，2000)、ATP(Chang等人，1998)、DNA聚合酶α-刺激活性、或结合肿瘤抑制基因Arf(Bertwistle等，2004)。

实施例2：抗白血病特异性NPM C末端的多肽序列的特异性抗体的产生

多肽序列代表用于产生特异性抗体的理想免疫基因，所述特异性抗体包括各种类型的多克隆抗体和单克隆抗体、人单克隆抗体和通过遗传重组方法产生的人源化抗体。

与图4B中A、B、C、D、E和F序列相对应的肽可以根据标准的方法化学合成。

每种动物种类都可用于抗体的制备。用于抗体产生的方法和动物种类的免疫方法(抗原的接种途径、用于增加注射混合物的免疫遗传性的弗氏佐剂的使用、免疫频率等)都大量描述在科学文献中。

单克隆

Balb/c小鼠可以用结合至KLH的特异性肽通过腹腔途径接种(每10天用150微克的肽免疫，共3次)。这样的免疫程序后，在融合前三天，注射静脉加强剂量(150微克)，目的是增加免疫反应至最大。

单克隆抗体可以用”杂交瘤法”(Goding J.，1983)产生，该方法包括用脾正常细胞与骨髓瘤细胞形成杂交细胞。本发明的作者使用的P3-NS1-Ag-4-1骨髓瘤谱系(缩写为NS-1)，其由Prof.David Y Mason Iaboratory，Oxford提供，源自P3K谱系，其仅仅合成K轻链，其不是分泌的而是在内部降解的，并缺乏HGPRT酶。

细胞融合后，将次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)加入至介质中进行杂交选择。能在这样的条件下幸存的仅有的细胞具有：

1.体外生长的骨髓瘤肿瘤特性；

2.脾细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)，其使它们能利用次黄嘌呤和胸苷用来合成核苷酸和DNA。

未融合的骨髓瘤细胞死亡，因为缺乏HGPRT酶，因此，不能使用次黄嘌呤用于生物合成核苷酸，而脾细胞死亡(即使它们为HGPRT+)是因为它们不能在体外生长。

对于目前的研究而言，可以直接对细胞学样品的或包埋在石蜡中的包含NPM的突变形式(NPMc+LAM)和NPM的正常形式(野生型)(NPMc-LAM)的LAM样品切片进行杂交瘤上层清液试验。筛选的合理性标准是杂交瘤产生抗本发明肽(相当于NPM的C末端)的特异性单克隆抗体的鉴定，即抗体与NPMc+LAM反应，而不与NPMC-反应。这些抗体具有以下优点：其可用在细胞学样品(涂片和细胞离心法)和包埋在石蜡的组织切片两者上，而且，可用于诊断目的和用于监测白血病轻微后遗症。在鉴定后，杂交瘤可根据众所周知的方法(“有限稀释”)克隆，并在体外大量生长。然后，克隆物可以冷冻储存在液氮中，从而获得上述抗体可利用的“储存库”。

多克隆抗体

抗本发明肽(突变的NPM的C末端的特异性序列)的多克隆抗体可以在几种动物中产生。多克隆抗体涉及包含这些抗体的整个动物血清和富集抗体的血清成分。

特别地，仅包含用于本发明肽的特异性抗体的IgG或IgM血清成分可通过如下方法得到：使血清洗脱过包含有被结合的本发明肽的柱(亲合色谱法)，然后用包含A蛋白或G蛋白的柱纯化该成分。这些抗体具有以下优点：其不仅可用于包埋在石蜡的组织切片上，而且可用于细胞学样品(涂片与细胞离心法)上，而且，其除了用于诊断目的，还可以用于监测白血病轻微后遗症。

SiI-C多克隆抗体物质的产生

材料和方法

Sil-C抗体是通过用合成的具有11个氨基酸的肽(NHCOCH3-CLAVEEVSLRK-COOH)免疫兔子产生(Inbio Ltd，Tallin，Estonia)，其包含两个突变的色氨酸、NES部分和突变体A的VSLRK肽。通过亲合色谱法使用包含用作免疫原的肽的柱纯化兔子血清(用0.23M Tris、0.2M Na₂HP0₄、pH0,8洗脱)。抗肽的反应性通过ELISA方法显示。特别地，将ELISA板在4℃下用TBS中的浓度为10μg/ml 50μl的肽吸附过夜。在用包含3％胎牛血清的PBS封闭后，以增加稀释度的方式将兔子血清加入孔中(从1/100至1/72900)。在PBS-吐温20(0.05％)中洗涤后，给每孔中加入50μl的第二种与过氧化物酶结合的山羊抗体(PBS中的稀释度为1/5000)。

给每孔中加入50μl邻苯二胺二盐酸化物，观察到抗体-抗原反应。在492nm进行读数。免疫前血清被用作阴性对照。用标准蛋白质印迹法、免疫共沉淀反应和共同沉淀法进行抗体的生物化学特征鉴定。

结果

产生多克隆抗体(称为Sil-C)，其特异性识别属于突变核磷蛋白质(NPM)的包括两个突变的色氨酸、NES部分和VSLRK肽的抗原表位，如在所附的权利要求1-6中定义的。

在蛋白质印迹实验中，Sil-C抗体识别37kDa特异带，其仅仅存在于来自具有NPM突变的白血病人(NPMc+LAM)的整个的裂解的细胞中(患者1-3)，但不存在于来自没有NPM突变(NPMc-)的LAM的患者裂解的细胞中(病例4-6)(图5A，在左侧上面)。相反，与野生型和突变的NPM都反应的单克隆抗NPM 376抗体，识别所有试验的白血病患者中的37kDA带，与存在或不存在NPM基因突变无关(图5A，在左侧底部)。在No.2患者中，NPM突变类型A的载体，Sil-C抗体仅识别白血病细胞的细胞质成分中的37kDa带(图5B，在右侧上面)。如所预期的，该图与单克隆376抗体的图不同，所述376抗体识别存在于裂解的细胞质成分和细胞核成分的具有相同的分子量带(图5B，在右侧底部)。

这些生物化学的数据在细胞学水平通过免疫组织化学染色来自10名患有NPMc+LAM的患者的脊髓活组织检查得到证实。在这些样品中，单克隆抗NPM抗体，可识别正常和突变的NPM，识别细胞核和细胞质两者中的NPM(图5E)。相反，Sil-C抗体仅识别细胞质中的NPM蛋白质(图5D)。该反应的特异性可通过下述事实清楚地表明：i)其通过用作免疫原的肽，可完全地从预孵育的Sil-C抗体中清除；ii)Sil-C抗体不会染色来自患有NPMc-LAM(即没有NPM突变)患者的活组织检查样品(图5F和5G)。

这些结果表明Sil-C抗体识别特定的NPM突变体，且突变体仅仅在定位在包含NPM突变的白血病细胞的细胞质中。特异性抗白血病NPM突变体的抗体的利用打开了诊断和治疗观点的新前景。

从诊断的观点来说，这些试剂可以与定量的PCR(见下文)技术一起用于开始时的诊断，也可用于监测轻微后遗症。

从治疗的观点来看，可假定利用细胞内抗体(“intrabodies”)能抑制白血病NPM突变蛋白质，而不会损害NPM蛋白质的生理学功能。

实施例3：疫苗的制备

疫苗可以以被“T细胞受体”(来自周围血液的单核细胞)识别的或用抗原-存在细胞(例如树状细胞、细胞B、巨噬细胞)存在的制剂给药。

在上下文中，术语“疫苗”指起诱导抗肿瘤免疫性作用的任意物质或化合物，抗肿瘤免疫性指细胞毒素应答(T细胞的)，诱导的抗体能识别肿瘤细胞，产生具有抗肿瘤活性的细胞因子。抗肿瘤活性可以在体外(细胞毒性)或在实验动物模型体内测定。

已知当与具有不同结构的各种多肽组合使用时，抗肿瘤疫苗的效果会增加。因此，为此，抗LAM NPMc+疫苗可以包含具有不同特异性和序列的各种合成多肽和使它们诱导识别包含NPM基因突变的肿瘤细胞。

本发明的疫苗可以结合普遍被称为载体的免疫原性分子。

其可在其制剂中包含用于接种物的适宜溶液(生理盐水、各种盐溶液)和赋形剂。

而且，疫苗可以包含佐剂或与佐剂一起给药，所述佐剂即具有免疫刺激剂活性的任意分子。给药佐剂可以在给药抗肿瘤疫苗接种物前或后的任意时间点进行。

本发明可以以单一剂量或多次剂量通过全身或局部途径给药。

免疫反应的评价将根据众所周知的和科学文献中描述的方法进行。特别地，在疫苗接种后，抗原表位被抗原呈递细胞呈递给B和T细胞。

因此，细胞毒素应答的测定可以在CD4+和CD8+细胞两者上进行，所有的细胞群都能诱导细胞裂解或细胞凋亡(例如嗜中性粒细胞、NK细胞)。特别地，可以测定其活化作用、(免疫表型)、增殖能力、(用结合放射性标记物的方法)、对适宜制备的靶点的细胞毒素能力、分泌细胞因子(ELISA ELISPOT法)的能力。

至于抗体应答，这些可以在体外或体内用传递和抑制肿瘤生长的血清实验来测定(experiments of serum transfer and inhibition of the tumourgrowth)。

动物模型体内的功效可以根据统计显著性标准检验适宜设定的对照组中抗肿瘤应答来测定。

评价的对象将为存活率、肿瘤生物标记的测定、肿瘤细胞的生长抑制、肿瘤块的退化、肿瘤诱导能力的降低。

实施例4：NPM突变体的细胞质累积的机理研究

目前的应用阐述了在NPMc+急性髓性白血病中NPM的异常细胞质累积的分子机制。

材料和方法

用于转染细胞、AML样品和OCI/AML3细胞系

对于转染实验，使用NIH-3T3和H1299细胞。通过用Ficoll-Hypaque分离来自5名白血病患者(其中的3名含有突变A的NPM，2名含有野生型NPM基因)的白血病细胞，将其用于生物化学研究和共焦显微镜分析。骨髓(n＝373)的活组织检查和周围血液胚细胞小球(n＝20)，来自393名患有GIMEMA AML 99P和GIMEMAAML12/EORTC方法(protocol)的AML患者，固定在B5中，并包封在石蜡中。在含有10％FBS加标准浓度的谷氨酰胺和抗生素的α-MEM中生长OCI/AML3细胞系，我们认为其仅在NPM基因的外显子12中包含突变A(其在79个测试的人类脊髓系中)(Quentmeier等人，2005)。

NPM基因的突变分析

研究是在393名成年GIMEMAAML99P和G1MEMAAML12EORTC方法中的ALM患者的白血病细胞上进行的。用于突变分析的病例的选择是基于NPM免疫组织化学鉴定的材料可获得性进行的。用RT-PCR和如前述测序或使用DHPLC(Wave^TM System，Transgenomic Inc.，Omaha，Nebraska；USA)分析NPM基因外显子12的突变。

质粒构建

NPM的突变体A、B、C和D是使用NPMwt作为模版通过PCR产生的；使用相同的正向引物(5′CGC CAC GCT AGC GAA GAT TCG ATG GAC)和用于每种突变体的不同反向引物(突变体A-5′：CTA TTT TCT TAA AGA GACT TCCTC CAC TGC CAG ACA GAG ATC TTG AATAGC CTCTTG G；突变体B-5′：CTA TTT TCT TAA AGA GAC TTC CTC CAC TGC CAT GCA GAG ATCTTGAAT AGC CTC TTG G；突变体C-5′：CTA TTT TCT TAA AGA GAC TTC CTCCAC TGC CACGCA GAG ATC TTG AATAGC CTC TTG G；突变体D-5′：CTATTT TCT TAA AGA GAC TTC CTCCAC TGC CAG GCA GAG ATC TTG AATAGC CTC TTG G)。在pcDNA3.1/NT-GFP TOPO(Invitrogen，Carlbad，CA，USA)中克隆各个PCRs的产物，并用插入序列检查。为了在具有wtNPM和突变A的质粒中产生双链N-末端flag-HA标记物，使用野生型NPM或突变体A作为模版进行PCR；如正反向引物将分别使用5′CGC CAC GCT AGC GAA GAT TCGATG GAC和5’-TCAAGA ATT CCA GAA ATG AAA TAA GAC。使用Nhel和ECO RI消化PCR产物，亚克隆片段到PCIN4载体中，PCIN4载体包含在片段的N-末端的Flag-HA标记物。Flag-HA-NPM-wt和Flag-HA-NPM-突变体A序列的准确性通过测序来证实。

NPM突变体E，G和R是使用pEGFP-C1-A/PMwt作为模版，根据生产商的使用说明，通过QuikChange Fine Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，You Jolla，CA)产生的。引物被设计为下述序列：

NPM_MUT_E：5′-GATCTCTGGCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAG-3′；

NPM_MUT_G：5′-GATCTCTGGCAGTGCTTCGCCCAAGTCTCTTTAAG-3′；

NPM_MUT_R：5′-GATCTCTGGCAGAGGATGGAGGAAGTCTCTTTAAG-3′.

NPM_MUT_A A290W、NPM_MUT_A C288W+A290W、eNPM_MUT_A_NO_NES质粒是使用pEGFP-C1-NPMmA作为模版，利用BgIII和Eco RI酶的剪切部位之间的诱变部位的定位产生的。通过使用部分互补的引物对，该引物对包含想要的突变和与BgIII EcoR消化产生的末端相容的突出端，有可能连接通过将引物退火至之前使用两种上述限制性内切酶消化的pEGFP-C1-NPMmA载体产生的双链DNA。

使用的引物序列为：

NPM_MUT_AA290W_FOR：

5′-GATCTCTGTCTGTGGGTGGAGGAAGTCTC TTTAAGAAAATAGG-3′；

NPM_MUT_AA290W_REV：

5′-AATTCCTATTTTCTTAAAGAGACTTCCT CCACCCACAGACAGA-3′-；

NPM_MUT_A C288W+A290W_FOR：

5′-GATCTCTGGCTGTGGGTGGAGG AAGTCTCTTTAAGAAAATAGG-3′；

NPM_MUT_A C288W+A290W_REV：

5’-AATTCCTATTTTCTTAAAGAGACTTCCTCCACCCACAGCCAGA-3′

NPM_MUT_A_NO_NES_FOR：

5′-GATCTCTGTGGAGCAGGGGAGGAAGGCTCTTTAAGAAAATAGG-3′；

NPM_MUT_A_NO_NES_REV：

5′-AATTCCTATTTTCTTAAAGAGCCTTCCTCCCCTGCTCCACAGA-3′.每种构建体都通过测序来检验

CRM 1-依赖的核输出的抑制

在转染24小时前，将H1299细胞接种在六孔板的表面上。使用磷酸钙沉淀法，用5μg编码野生型HA-NPM、GFP-NPM-突变体A或两者的表达载体转染细胞。在24小时后，将细胞分别用20nM来普霉素B、Crm1特异性抑制剂(Sigma，St.Louis，MO，USA)处理8小时或不处理。然后，将细胞固定在4％多低聚甲醛中，用于免疫荧光研究。

按照生产商的使用说明使用Lipofectamin 2000(Invitrogen Carlsbad，CA，USA)转染NIH-33细胞。24小时后，用cycloeximide(Merck Bioscences Ltd，Nottingham UK)10微克/ml(30分钟)和来普霉素B(Merck Bioscences Ltd，Nottingham UK)20ng/ml(5小时)或其它的Crm1抑制剂例如ratjadons A和C(Alexis Biochemicals，Carisbad，CA，USA)20ng/ml(5小时)孵育在载玻片上生长的细胞。

将细胞固定在4％多聚甲醛中(10分钟)，用于免疫荧光和共焦显微镜分析。

对于“时程”实验，将Attofluor室(Attofluor chamber)转染至转染细胞(分子探针，Eugene，OR，USA)的内部，使用安装有Olympus IMT 2显微镜的MRC-1024共焦装置(Biorad Cambridge，UK)观察。在加入来普霉素B之前和之后、每60秒间隔，使用Laser-Sharp程序(BioRad)的时间-序列功能纪录单个切片的图像。激发波长为488nm，在PMT2上使用从505至550nm的滤光镜检测图像。

使用众所周知ImageJ程序(Rasband WS，Image J，U.S.National InstitutesofHealth，Bethesda，Maryland，USA，http://rsb.info.nih.gov/ij/，1997-2005)处理和分析图像。

为了进行GFP-NPM突变体A蛋白质的亚细胞分布的蛋白质印迹分析，如上所述，用Ieptomicin B 20ng/ml(或者用甲醇作为对照)而不用cycloeximide孵育用GFP载体或用GFP-NPM突变体A转染的N1H-3T3细胞。然后根据Schreiber等人(1989)的方法收集细胞、用PBS洗涤，并裂解在高渗缓冲剂中。保存上层清液，作为细胞质成分。再次用高渗缓冲剂洗涤包含细胞核的沉淀物，然后溶解在高渗缓冲剂中，并在加样前，在包含SDS的溶液中煮沸。

将细胞质成分和核成分的等量稀释液(具有相同的细胞数)加样，印迹在硝化纤维上，用抗-GFP单克隆抗体(Roche，Indianapolis，IN，USA)孵育，用于GFP-NPM突变体分布的蛋白质印迹分析。

将源自两名患有NPMc+AML(载有突变A)的患者的细胞和在培养基中收集的OCI/AML3细胞系的细胞(在24孔板上，10⁶细胞/ml)，在37℃用5％CO₂孵育5小时。在用来普霉素B(20ng/ml)孵育过夜后，将细胞用PBS洗涤并离心。将细胞沉淀物固定在B5和石蜡中，用于免疫染色。

免疫染色法

DAPI染色被用于使GFP-NPM-突变体A和GFP-NPM wt转染的H1299细胞的细胞核可见。对于FIag-HA构建体，先用Triton-X 100透化固定的细胞(10分钟)，使固定细胞成为可渗透的，然后用10％抗-山羊血清封闭(blocking)(30分钟)。然后，加入抗-HA一抗(1∶1000，Roche Indianapolis，In，USA)1小时，然后用第二种Alexa-568抗体(1∶1000，MolecularProbes，Oregon，USA)孵育30分钟。使用数字摄象机用Spot 4.09程序(DiagnosticInstruments，Sterling Heights，MI，USA)抓取图像。

用碘化丙啶染色用GFP-NPMwt和GFP-NPM突变体A转染的NIH 3T3的细胞核。先用购自DakoCytomation(Glostrup，Denmark)的第一种抗核仁素抗体，然后用Texas Red结合的第二种抗体(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)进行NIH-3T3细胞的核仁素染色(C23)；对细胞核用TO-PRO-3(Molecular Probes，Oregon，USA)反染色。

包埋在石蜡中包含突变A的AML病例的切片的NPM染色是先使用单克隆抗-NPM抗体，然后使用Alexa 488结合的第二种抗体(Molecular Probes，Oregon，USA)进行的；将细胞核用碘化丙啶反染色。用共焦显微镜Zeiss LSM 510(CarlZeiss，Jena，DE)，分别使用488nm(用于ALexa 488)、543nm(用于Texas Red和碘化丙啶)和633nm(用于TO-PRO-3)的激光激发波长抓取图像。设定激光强度调节、针孔的直径、光探测的配置(configuration)用于获得最好的信号/噪声比和避免荧光交叉。然后，将图像转入SGI Octane工作站(Silicongraphics，Mountain View，CA，USA)用于进一步加工；使用Imaris程序(Bitplane，Zurich，CH)用渐变或等面的(shade or iso-surface)方法进行3D重建。

如前述，对393名患者进行使用碱性磷酸酶法对包埋在石蜡中的切片的NPM研究。在不清楚突变分析结果下，将样品分类为细胞质的或核的NPM。

细胞提取、蛋白质印迹法和共免测沉淀法

根据Schreiber等人(1989)的方法制备核的和细胞质的提取物。对于免疫共沉淀法实验，将细胞裂解在1ml冰冷的裂解缓冲剂中(1％NP-40、150mM NaCl、25mM Tris、pH7.5、1mM EDTA、1mM Na3VO41μg/ml抑(蛋白)肽酶(leupeptine)，1μg/ml抑(蛋白)肽酶(aprotinin)和1mM PMSF)。在冰上孵育20分钟后，在4℃，以14,000xg离心裂解的产物10分钟，并在4℃中，分别用4μg非特异性对照IgG或特异性多克隆的兔子抗NPM(称为Sil-C)或者单克隆小鼠抗NPM(克隆376)抗体，和30μl蛋白A/G Plus-琼脂糖珠粒(SaintCruzBiotechnology，Inc.)孵育过夜。然后，用洗涤缓冲剂(0.1％NP-40、150mM NaCl，25mMTris pH7.5，1mM EDTA和抑制剂)洗涤珠粒至少三次。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上分离蛋白质，转移到PVDF膜(Millipore)上，其中分别用第一种抗体，即兔子多克隆的抗-Crm1(Saint Cruz Biotechnolog y，Inc.)或小鼠单克隆抗-Crm1(BD TransductionLaboratories)孵育；用HRP-结合的第二种抗体孵育后，根据生产商的使用说明(AmershamBioscience)使用ECL方法检测在蛋白质印迹中识别的肽。

结果

迄今为止，在许许多多白血病患者中确定的40个NPM基因突变的分析(图6)显示出，不论它们的遗传异质性如何，所有的突变都测定出相应突变的NPM蛋白质的羧基端部分的某些常见的改变。

图6显示出色氨酸288和290的改变和在白血病患者中确定的40个突变体NPM蛋白质中NES基序的产生；突变频率(％)仅仅是对本文研究的393例AML病例提出的，对于该研究，除了分子数据是可获得的外，免疫组织化学(IH)染色结果也是可获得的。有两种类型的改变：i)色氨酸288和290(或者仅290)的突变，和ii)称为NES(“核输出信号基序”)的新基序的产生。NES为特定地被Crm1(或Exportin 1)识别的蛋白质结构，该蛋白质在生理学上用于将其它蛋白质从细胞核运送至细胞质。从分子观点来说，NES基序定义为类型YxxxYxxYxY的约10个氨基酸序列，其中Y表示疏水性氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸类型，X等于其它的氨基酸。在NES中，疏水性氨基酸Y被精确的间隔隔开(从1个至三个间隔改变)，其中间隔由其它氨基酸表示，在该方案中，间隔用X字母表示。

NES类型可以在每个NPM突变体之间变化。在各种白血病NPM突变体中NES的类型和频率图解在图6中。更常见的NES基序，发现于约65％的突变体中，命名为LxxxVxxVxL(其中L＝亮氨酸、V＝缬氨酸和x等于其它氨基酸)。剩余35％的NPM突变体蛋白质包含更少见的NES变异体，其中在NES第二个位置的缬氨酸被另一个疏水性氨基酸替换。该类型的实例，图解在图6中，为下述类型的NESs：LxxxLxxVxL，LxxxFxxVxL，LxxxMxxVxL，LxxxCxxVxL(其中L＝亮氨酸；V＝缬氨酸；F＝苯丙氨酸；M＝甲硫氨酸；C＝半胱氨酸；和X等于另一个氨基酸)。

NES类型和在位置288和290的色氨酸的突变之间的关系

从图6可以推导出，在所有40个白血病NPM突变体中，在位置290的色氨酸都为突变的。相反，40个突变体中的13个(32.5％)保留在位置288的色氨酸。40个突变体的蛋白质结构的仔细分析清楚地表明了存在于NES类型和色氨酸288和290中的突变之间关系(图6和表3)。特别地，已经表明更常见的NES基序，(即LxxxVxxVxL类型)总是与色氨酸288和290两者的突变有关，而色氨酸288仅保留在包含上述指出类型的NES变异体的NPM突变体蛋白质中，所述上述指出类型的NES变异体即其中在NES的第二个位置的缬氨酸被另一个疏水性氨基酸替换(图6和表3)。表3显示出在40个白血病患者的NPM突变体蛋白质中NES基序和色氨酸288和290之间的相关性。

表3

^＊在存在NES的变异体2(L-xxx-L-xx-V-x-L)的情况下，图6的突变Q引起两个色氨酸288和290都突变；mutW：突变的色氨酸。

最常见的NES基序为变异体1；其它的NES变异体(类型2-3)为较少见的，它们与变异体1不同在于用亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)或Cisteine(C)代替了NES第二个位置的缬氨酸(V)。

NPM突变体的细胞质表达为NES依赖事件

所有的NPM突变体在其羧基末端部分包含新NES基序的事实表明NPM的细胞质移动可以通过Crm1主动运转NPM突变体引起，Crm1为被用于将其它蛋白质从细胞核运送至细胞质的受体。

作者已经进行了某些实验，其是用来检验在存在物质，如已知的抑制Crm1/Esportin 1活性的来普霉素B或Ratjadons的情况下，NPM白血病突变体的细胞核-细胞质运输是否以某种方式改变。

实验的结果是清楚的。图7表明NPM突变体的核输出为NES依赖的。在一般条件下，用编码标记的NPM突变体蛋白质的cDNAs转染的HI299或NIH3T3细胞显示出预期的突变体的异常胞质定位。相反，在存在来普霉素B(LMB)的情况下，NPM突变体蛋白质从细胞质中重定位至细胞核的(核质)(方形图7A和7B)。图7C-E显示出在NIH-3T3细胞中，LMB的不同时间点的分析对突变体A与eGFP的组合(eGFP-NPMmutA)的作用：LMB的加入引起细胞质和Golgi区域中荧光的减少和相应的核质中荧光增加。

约50％的突变体类型A(较常见的一种)在20分钟内重定位在细胞核中，整个过程在1小时内完成(方形图C-D)。

在来普霉素B处理的N1H-3T3细胞中结合GFP的类型A的NPM突变体的亚细胞分布的蛋白质印迹分析证实GFP-NPM蛋白质突变体A(分子量64kDa)(与GFP蛋白质(分子量27kDa))不同)随着时间逐渐在包含细胞核的沉淀物中累积(图7E)。相反，在未处理的NIH-3T3细胞中，GFP-NPM和GFP蛋白质两者都如预期的仅存在于细胞质成分中。实际上，LMB处理诱导eGFP-NPMmutA在沉淀物成分(P)中的时间-相关性累积。亚细胞成分的纯度可通过除去抗体和用抗β微管蛋白抗体印迹来测定(图7E下方的方形图)。对于过表达的蛋白质，没有测定出明显的杂质(如其在GFP印迹中是纯净的)(中间方形图)。在未处理的细胞中，eGFP-NPMmutA仅仅发现于细胞质成分(C)中。实验是在不存在dicycloeximide下进行的，因此在用LMB处理期间，在细胞质成分中GFP-NPMmA的连续存在随时间显示。

用各种NPM-EFG构建体转染细胞的共焦显微镜分析清楚地表明在来普霉素B处理后，NPM突变体重定位在细胞核中，具体地，定位于核质中(图，在上面)，而不是定位于细胞核仁中，即野生型NPM蛋白质生理学地定位于其中(图8A，中间)。用来普霉素B使得突变体的核质重定位也可在共焦显微镜中通过双染色法显示，其突出了NPM突变体的定位位置之间的互斥性：转移至核质中和核仁素(C23)，如所预期的，在核仁中选择性表达(图8A，在底部)。

在用Crm1抑制剂处理后NPM的核质重定位也可在患有NPMc+AML患者的细胞中证实(图8B)。

Crm1抑制剂对突变体的同样的效果也可在包括类型A的NPM突变的OCI-AML3人脊髓系中观察到(图9A)。在这些细胞中，通过共沉淀实验，也显示出突变的NPM蛋白质和Crm1之间直接的物理相互作用(图9B)。

在NPM突变体从细胞核中排出和随后在细胞质中累积的过程中，NES所起的基本作用也可通过定位诱变实验来显示。实际上，在类型A的NPM突变体的NES的两个缬氨酸被两个甘氨酸取代(NPM mutA no-NES)消弱了突变体从细胞核运送至细胞质的能力(图10)。

突变体的细胞质累积取决于NES和色氨酸288和290突变的协同作用

使用天然的NPM突变体(来自白血病患者)和通过定位诱变的NPM突变体构建体评价在NPM细胞质累积中两个色氨酸288和290的作用。为了评价色氨酸290单突变的核仁结合的作用，我们使用了天然的白血病突变体类型E，其保留色氨酸288，如在图6中图解的。在用来普霉素B处理后，类型E NPM突变体重定位于核中。然而，与用突变体A观察的不同，重定位不仅发生在核质中，而且发生在细胞核仁中(图10)。核区室的分布非常类似于突变体E，其也可用类型A的NPM突变体的人工构建体观察到，其中在位置290中突变的色氨酸为用定位诱变再嵌入的(A290W)。当两种色氨酸288和290都被再嵌入突变体A(C288W+A290W)中时，突变体蛋白质，尽管存在NES，完全地定位于细胞核仁中，与来普霉素B的存在无关。这些实验的结果图解在图10中。

这些观察结果清楚地显示出色氨酸288和290显著地有助于NPM突变体的NES-介导的核排出。最后，为了进行NPM的异常细胞质累积，NES和两个色氨酸(或仅仅是色氨酸290)的突变联合起作用是必要的。换句话说，当不存在两个色氨酸288和290(或仅仅是色氨酸290)的情况下，仅仅存在NES时，NPM突变体的细胞质累积是不可能的，或反之亦然。

NPM突变体使NPM野生型蛋白质从其生理学位置(细胞核仁)移位至细胞质

因为所有白血病NPM突变蛋白质保存在N-末端部位的二聚体化功能结构域，假设它们可以与NPM野生型蛋白质，如融合蛋白质中(NPM-ALK和NPM-MLF1)和相同的NPM野生型蛋白质，形成异二聚体。

图11A显示出，通过异二聚化机理，突变体能结合NPM野生型蛋白质并使其移位至细胞质中。实际上，通过与编码(野生型)-HA的NPM和(突变体A)-eGFPNPM的载体共转染H1299细胞，可以观察到突变体和野生型NPM蛋白质共同定位于细胞质中。约30％的细胞被转染，对于这些的约70％，NPM突变体引起NPM的野生型部分从细胞核仁重定位于核质和细胞质中。这些结果也可通过野生型NPM(HA标记的)和突变体NPM(Flag标记的)共沉淀实验证实(图11B)。为了转染H1299细胞，使用编码FH-NPMwt和FH-NPM突变体A的质粒。在图11B的左侧方形图中，5％的源自用FH-NPMwt、FH-NPM突变体A稳定转染细胞或H1299对照细胞的全部裂解的细胞接受使用α-NPM或α-HA的蛋白质印迹。在右侧方形图中，95％剩余的裂解的细胞被用抗Flag抗体(M2)的免疫沉淀，并被用于使用α-NPM或其α-HA的蛋白质印迹。

突变体和野生型NPMs的改变的细胞核-细胞质限制运输的可能机理在图11C中图示。

用于预测NPM基因的外显子12的所有突变的免疫组织化学

如上图解的，NPM突变体蛋白质在白血病细胞的细胞质中累积的可信机理取决于色氨酸288和290的突变和NES的产生。因为这些改变存在于所有迄今为止确定的NPM突变体中，假定用抗NPM抗体的免疫组织化学染色是能通过证实NPM的细胞质离域作用来预测所有的发生于NPM基因的外显子12中的突变。

为了证实该假设，我们用突变态的NPM基因比较NPM蛋白质(核的对细胞质的)的亚细胞表达。研究是在393名患有GIMEMAAML99P/AML 12EORTCs方法的AML患者中进行的。得到的结果清楚地显示出NPM细胞质阳性的存在是可用NPM的外显子12突变的绝对专一性来预测的(表4)。

表4

LAM(N＝373)	NPM蛋白质定位	NPM基因突变(外显子-12)
			191	细胞质	191/191
202	核	0/202

^＊用单克隆抗NPM抗体在包埋在石蜡中的切片上测定

免疫组织化学测试可用于为诊断目的，如在图12中指出的。该测试是快速的、经济的、易说明的、高灵敏度的和特异的。因为所有这些原因，其可被用于作为AMLs的分子表征的第一步。实际上在NPMc+AMLs中，对于主染色体改变，例如t(15；17)、t(8；21)、inv16、t(6；9)和11q23/MLL进行细胞遗传学、FISH和分子分析是不必要的，因为它们与NPM的细胞质阳性互相排斥。相反，在NPMcAMLs中，这些分析是必需的。细胞遗传学有助于鉴定在14％的具有较少染色体异常的NPMc+AML中具有可能预测影响的少见易位。FLT3基因的突变应当在所有的AML患者AML(在NPM上独立)中研究，因为其与NPM亚细胞表达的相关性可有助于鉴定正常核型AML中新的预测亚群(Schnittger等，2005；Dohner等，2005；Verhaak等，2005)。免疫组织化学用于鉴定NPM突变的用途也具有临床重要性，因为NPM的细胞质分布和基因突变是对诱导治疗的良好应答的预兆，与具有正常核型而没有NPM基因突变的急性白血病病例(NPMc-AML)相比，其也是较长期的预测(Schnittger等，2005；Dohner等，2005；Verhaak等，2005)。

上述阐述了解释NPM基因的外显子12特异性突变改变了突变的和野生型NPM蛋白质的细胞核-细胞质运输的机理的数据。该机理在转染的细胞和具有NPMc+AML的患者的白血病细胞和在OCI/AML3人白血病系两者中是相同的。特别地，该突变引起NPM突变体的羧基末端域的两种根本改变：1)产生了NES，其通过Crm1增强了突变体蛋白质的排出；和2)在标准情况下，丧失了两个色氨酸288和290(或仅仅色氨酸290)，其对NPM蛋白键合至细胞核仁是必需的。

野生型NPM蛋白质的一级结构序列分析使能够检测LxxPxxLxL类型的推测的生理学NES，其定位于NPM的残基94和102之间区域(Wang等人，2005)。无论是否存在该NES，野生型NPM蛋白质，在生理条件下，主要定位于细胞核仁中，这点表明NPM蛋白质部分，其通常通过生理学NES从细胞核排出至细胞质中，显然比通过两个NLSs(“核定位信号”)能从细胞质返回至细胞核的相同的蛋白质更差。因为没有两个色氨酸288和290的鼠科动物和人类人工的野生型NPM突变体(仅仅不含C末端NES而与白血病类型A的NPM突变体不同)仅仅定位于核质中(Nishimura等人，2002)，另外的NES，由C末端区域突变产生，有可能赋予白血病NPM突变体从核输出的更大能力；这可能应归于第二种NES的叠加效应和/或增加的Crm1亲合力。

尽管288和290两者都在NPM的核仁定位中起作用，色氨酸290可能更重要，因为其在所有迄今鉴定的白血病NPM突变体是基本改变的。两个色氨酸的突变使能够在白血病NPMc+细胞中获得的突变体的核仁结合和核质离域作用受到最大抑制。更重要的是观察到更通常发现于NPM突变体的NES基序(LxxxVxxVxL)总是与两个色氨酸的突变有关。相反，色氨酸288似乎仅仅保存在包括NES的较不常见变异体的那些NPM突变体中，即那些NPM突变体的特征在于在NES第二个位置的亮氨酸苯丙氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸替换缬氨酸(表3)。这两个观察结果表明白血病NPM突变体的C末端区域的NESs间可能有功能差异。

我们的研究结果也清楚地地显示出突变体的异常细胞质累积可以仅仅由NES和突变的色氨酸的协同作用引起。NPM突变体的异常累积有可能根据下述机理发生：i)突变的白血病NPM蛋白质防止(preserving)两个核定位信号(NLS)中进入细胞核；ii)当色氨酸被突变时，它们结合细胞核仁的能力完全地被抑制，或者当仅仅色氨酸290被改变时，所述能力被部分抑制，导致突变体在核质中累积；iii)用Crm1捕集核质突变体，其决定突变体的迅速排出而到细胞质中，并在那里逐渐累积。

在NPMc+白血病中NPM的改变的运送机理的说明表明，作为可能的治疗介入范围，白血病NPM突变体和野生型NPM蛋白在它们的生理学部位的“重定位”，是通过使用Crm1抑制剂或干涉NPM突变体-Crm1结合的小的合成分子或野生型NPM蛋白质或能影响NPM的其它分子实现的(ARF，等)。

实施例5：用于评价和监测轻微后遗症的定量POR系统的研究

一些杂合子NPM 1突变表明了突变-特异系统对于疾病监测的必要性。在系统的研究中，值得考虑两个最常见的突变，所谓的突变A和B，包括超过所有突变病例的95％。

材料和方法

特定的评价方法使用了设计在外显子11上的正向引物(cNPM1-F：5′-5′-GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3′)、外显子11/外显子12接合处的探针(c.探针：5′-FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3’)和突变-特异性反向引物(cNPM mut.A-R：5′-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3′和cNPMmut.B-R：5′-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3′)。正向引物和探针是相同的，与不同突变无关(图13)。

步骤1＝根据EAC方法的逆转录反应(Gabert等，Leukaemia 2003).

步骤2＝扩增反应：使用包含12.5μl Taq Man通用的PCR Master Mix(AppliedBiosystem)、300nM引物、200nM探针和5μl cDNA的混合物，总体积为25μl。条件：在50℃下2分钟(UNG酶活化)、在95℃下10分钟(UNG酶失活和AmpliTaq聚合酶活化)，然后在95℃下15秒、对于突变A在62℃下1分钟，对于突变B在59℃下1分钟循环50次。如定量和定性RNA对照ABL基因可以被扩增。对于ABL和NPM两者，仪器(ABI PRISM 7700 SequenceDetectionSystem，Applied Biosystem)的分析设置包括0.1的“阈值”和从3至15的“基线”。通过因数等于10，通过混合来自具有NPM突变类型A或B的脊髓白血病细胞的RNA提取物与得自不具有NPM突变的患者的髓细胞池的RNA，使用连续稀释分析系统灵敏度和特异性。

用于突变A的绝对定量评价的标准曲线图是使用质粒构建体作图的。因此，该构建体包括质粒载体pCRII-TOPO(Invitrogen，Groningen，Netherlands)加包含突变A的NPM1基因的一部分。突变A的扩增是通过RT-PCR用引物NPM1_390_F(5′-GTCTTAAGGTTGAAGTGTGGT-3′)和NPM1_1043_R(5′-TCAACTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3′)获得的。

质粒是在五次连续稀释液中制备的：10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝(copies)。以ABL转录产物标准化的突变A的RQ-PCR的结果可以表示为每10⁴拷贝的ABL的含有突变A的NPM拷贝数。

根据有关欧洲研究组定义的轻微后遗症的准则(van der Velden VHJ等，2003)，“最大可重复的灵敏度”，定义为其中在1.5的Ct(循环阈值)内，所有的样品复制都为阳性的最低稀释度，复制的最高Ct为至少3,0Ct，其低于背景的最低值。“最大灵敏度”定义为最低稀释度，其中至少一种样品是阳性的，至少1.0Ct低于背景的最小Ct。用这些定义，在低于最大可重复的灵敏度，但是1.0 Ct仍然低于最低的背景的2次复制的1次的扩增存在的情况下，结果被定义为“阳性、不可计量的”。

结果

在10⁵、10⁴、10³、10²、10质粒拷贝的稀释系列中测试“反向定量的”PCR(RQ-PCR)的灵敏度和特异性。对于质粒的Ct值(循环阈值)和曲线图的“斜率”显示在下图中。

标准质粒曲线图显示“平均斜率”为-0.38，“截距”为39.5±0.45 Ct。相关系数是高的(在所有实验中＞0.99)，证实了在未知样品中存在突变A的拷贝的精确鉴定。RQ-PCR的最大可重复的灵敏度相当于10个质粒分子(图14)。

进行基于系数等于10的连续稀释来模拟在监测5名诊断为遭受(急性成髓细胞白血病)NPMc+AML(4名患有突变A的患者，和1名患有突变B的患者)痛苦的患者中RQ-PCR的灵敏度和重现性。

用从未患有NPM突变的患者的髓细胞池中获得的RNA稀释从具有类型A或B的NPM突变的脊髓白血病细胞中提取到的RNA。

在所有5名患有突变A或B的患者中发现最大可重复的灵敏度等于10^-4，而在具有类型B突变的样品中和在4个类型A突变样品的3个中最大灵敏度为10^-6在具有A突变的一个样品中观察到最大灵敏度等于10^-5。仅仅在一个病例并且在非常高的Ct值(Ct＞48)中观察到背景扩增，显示出系统的高特异性(图15)。

使用plasmidic校准曲线，分析在诊断时和诱导治疗后13名遭受具有NPM突变类型A的AML痛苦的患者。

结果表示为“ABL的NPM1 Mut.A/10000拷贝的拷贝数”。在诊断中，所有的样品显示＞30000拷贝。在诱导处理后，在10名患者中的拷贝数明显减少，证实了完全的血液学缓解。在5名患者中，得到的拷贝数＜70，而在其它5名患者中，得到的拷贝数在580至5046之间。在3个病例中，证实拷贝数很少减少或没有减少：2例完全缓解和1例部分缓解(图16)。

在3名遭受类型A的NPM1基因突变的AML痛苦的患者中，上述系统被用于监测治疗期间和治疗后的轻微后遗症。

在第一和第二周期的联合治疗后，cDNA特异性RQ-PCR显示出拷贝数＜10。在三个样品中观察到拷贝数减少中的不同动力学，如图17所示。突变的拷贝数小但恒定是与患者中血液学缓解相关的(正方形)。在剩余病例的一个中，在联合治疗后，突变的拷贝数明显减少(菱形)；这样的减少在第二名患者中是不显著的(三角形)。在最后两名患者中，拷贝数再次增加，并出现两个病例的血液学复发(图17)。

最后，对于在临床试验使用来说，系统具有这样的灵敏度、特异性和重现性特征。

参考书目

-Grimwade D，Walker H，Oliver F，et al.Blood 1998；92：2322-33.

-Schnittger S，Schoch C，Dugas M，et al.Blood 2002；100：59-66.

-Byrd JC，Mrozek K，Dodge RK，et al.Blood 2002；100：4325-36.

-Bullinger L，Dohner K，Bair E，et al.N Engl J Med 2004；350：1605-16.

-Valk PJ，Verhaak RG，Beijen MA，et al.N Engl J Med 2004；350：1617-28.

-Frohling S，Schlenk R F，Breitruck J，et al.Blood 2002；100：4372-80.

-Pabst T，Mueller BU，Zhang P，et al.Nat Genet 2001；27：263-70.

-Steudel C，Wermke M，Schaich M，et al.Genes Chromosomes Cancer2003；37：237-51.

-Carnicer MJ，Nomdedeu JF，Lasa A，et al.Leuk Res 2004；28：19-23.

-Christiansen DH，Pedersen-Bjergaard J.Leukaemia 2001；15：1848-51.

-Falini B.，et al.N Engl J Med 2005；352：254-66.

-Cordell JL，Pulford KA，Bigerna B，et al.Blood 1999；93：632-42.

-Borer RA，Lehner CF，Eppenberger HM，Nigg EA.Cell 1989；56：379-90.

-Dumbar TS，Gentry GA，Olson MO.Biochemistry 1989；28：9495-501.

-Okuda M，Horn H F，Tarapore P，et al.Cell 2000；103：127-40.

-Gabert J.Beillard E，van der Velden VHJ.et al.Leukaemia 2003；17：2318-2357.

-Bertwistle D，Sugimoto M，Sherr CJ.Mol Cell Biol 2004；24：985-96.

-Colombo E，Marine JC，Danovi D，Falini B，Pelicci PG.Nat Cell Biol2002；4：529-33.

-Kurki S，Peltonen K，Latonen L，et al.Cancer Cell 2004；5：465-75.

-Grisendi S.，et al.Nature 2005；437：147-53.

-Morris SW，Kirstein MN，Valentine MB，et al.Science 1994；263：1281-4.

-Redner RL，Rush EA，Faas S，Rudert WA，Corey SJ.Blood 1996；87：882-6.

-Yoneda-Kato N，Look AT，Kirstein MN，et al.Oncogene 1996；12：265-75.

-Falini B，Pileri S，Zinzani PL，et al.Blood 1999；93：2697-706.

-Falini B，Mason DY.Blood 2002；99：409-26.

-Bischof D，Pulford K，Mason DY，Morris SW.Mol Cell Biol 1997；17：2312-25.

-Falini B，Pulford K，Pucciarini A，et al.Blood 1999；94：3509-15.

-Schnittger S，et al.Blood(online August 2，2005).

-Jaffe E，Harris N，Stein H，et al.Lyon：IARC Press；2001.

-Downward J.BMJ 2004；328：1245-48.

-Stocks MR.Drug Discov Today 2004；9：960-66.

-Shuker SB，et al.Science 1996；274：1531-34.

-Dohner K，et al.Blood(online July 28，2005).

-Verhaak RG，et al.Blood(online August 18，2005).

-Cordell JL，Falini B，Erber WN，et al.J Histochem Cytochem 1984；32：219-29.

-Mitelman F.Basel：Karger；1995.

-Crescenzi B，Fizzotti M，Piattoni S，et al.Cancer Genet Cytogenet2000；120：25-9.

-Van Dongen JJ，Macintyre EA，Gabert JA，et al.Leukaemia 1999；13：1901-28.

-Soekarman D，von Lindern M，Daenen S，et al.Blood 1992；79：2990-7.

-Van der Velden VHJ.Hochhaus A，Cazzaniga G，et al Leukaemia 2003；17：1013-1034.

-Noguera NI，Breccia M，Divona M，et al.Leukaemia 2002；16：2185-9.

-Cimino G，Rapanotti MC，Elia L，et al.Cancer Res 1995；55：1625-8.

-Goodell MA，Rosenzweig M，Kim H，et al.Nat Med 1997；3：1337-45.

-Engelhardt M，Lubbert M，Guo Y.Leukaemia 2002；16：1603-8.

-Nishimura Y，Okhubo T.，Furuichi Y，Umekawa H.Biosci BiotechnolBiochem2002；66：2239-42.

-Horn HF，Vousden KH.Nature 2004；427：110-1.

-Hingorani K，Szebeni A，Olson MO.J Biol Chem 2000；275：24451-7.

-Chang JH，Lin JY，Wu MH，Yung BY.Biochem J 1998；329(Pt3)：539-44.

-Goding J.Monoclonal Antibodies.Academic Press 1983.

-Quentmeier H.，Leukaemia 2005；19：1760-67.

-Schreiber E，et al.Nucleic Acids Res.1989；17：6419.

-Wang W，et al.Nat Cell Biol 2005；7：823-30.

-Gabert J，et al.Leukaemia 2003；17：1013-1034.

Claims

1.突变的人核磷蛋白质(NPM)，其特征在于具有细胞质定位，并且其中未突变的人NPM的序列是GenBank NP_002511，并且第290位的野生型色氨酸残基被突变为另一种氨基酸，并且所述突变的人核磷蛋白质(NPM)包含存在于人核磷蛋白序列C末端区域的核输出信号(NES)基序，其中所述核输出信号基序(NES)的氨基酸序列是LCLAVEEVSL(SEQ ID No 6)、LCMAVEEVSL(SEQ ID No 7)、LCVAVEEVSL(SEQ ID No 8)、LSRAVEEVSL(SEQ ID No 9)、LCTAVEEVSL(SEQ ID No 10)、LSQAVEEVSL(SEQ ID No 11)、LCHAVEEVSL(SEQ ID No 12)、LCRAVEEVSL(SEQ ID No 13)、LCRGVEEVSL(SEQ ID No 14)、LCQAVEEVSL(SEQ ID No 15)、LCAAVEEVSL(SEQ ID No 16)、LCKAVEEVSL(SEQ ID No 17)、LWQSLAQVSL(SEQ ID No 18)、LWQSLEKVSL(SEQ ID No 19)、LWQSLSKVSL(SEQ ID No 20)、LCTFLEEVSL(SEQ ID No 21)、LWQCFAQVSL(SEQ ID No 22)、LWQCFSKVSL(SEQ ID No 23)、LWQRFQEVSL(SEQ ID No 24)、LWQDFLNRL(SEQ ID No 25)、LWQSMEEVSL(SEQ ID No 26)、LWQRMEEVSL(SEQ ID No 27)或LWQCCSQVSL(SEQ ID No 28)。

2.根据权利要求1的突变的人核磷蛋白质，其中野生型色氨酸残基288和290都是突变的。

3.根据权利要求1或2的突变的人核磷蛋白质，其中所述C末端区域包括VSLRK肽(SEQID No 29)。

4.根据权利要求1或2的突变的人核磷蛋白质，其特征在于所述突变的人核磷蛋白质被融合到报告蛋白。

5.根据权利要求4的突变的人核磷蛋白质，其中所述报告蛋白选自由EGFP、β-半乳糖苷酶、荧光素酶和GFP组成的组。

6.根据权利要求1或2的突变的人核磷蛋白质，其中所述突变的人核磷蛋白质与纳米颗粒结合。

7.编码如在权利要求1或2中定义的突变的人核磷蛋白质的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸标记有选自由荧光物质、生物素、放射性同位素和纳米颗粒组成的组的试剂。

8.根据权利要求7的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

9.包括如在权利要求7中定义的寡核苷酸的质粒。

10.包括如在权利要求7中定义的寡核苷酸的表达载体。

11.容纳权利要求1的突变的人核磷蛋白质的宿主细胞，所述细胞包含根据权利要求9的质粒。

12.根据权利要求11的宿主细胞，其中所述细胞为原核细胞。

13.包括根据权利要求10的表达载体的哺乳动物感受态细胞系。

14.根据权利要求13的哺乳动物感受态细胞系作为用于筛选药物的NPMc+LAM研究模型的用途。