ES2600789T3 - Tratamiento de infecciones por VIH-1 latentes usando auranofina o trióxido de arsénico - Google Patents

Abstract

Un inductor de estres oxidativo para su uso en el tratamiento de una infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) latente, en donde dicho inductor de estres oxidativo es la auranofina o el oxido de arsenico que es As2O3 o As4O6; en donde la auranofina o el oxido de arsenico inducen la activacion del VIH-1 desde la quiescencia y son un modulador epigenetico; y en donde el tratamiento incluye, ademas, la terapia antirretroviral

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de infecciones por VIH-1 latentes usando auranofina o trioxido de arsenico

La presente solicitud se refiere al uso de ciertos compuestos o combinaciones de compuestos en el tratamiento de reservorios virales latentes, especialmente el VIH-1. El tratamiento de los reservorios virales es mediante el aprovechamiento del estres oxidativo: un enfoque de reposicionamiento de farmacos. Los compuestos incluyen compuestos que contienen oro, tales como auranofina, compuestos que contienen arsenico, tales como trioxido de arsenico, e inhibidores de HDAC en combinacion con BSO.

Introduccion a la invencion

La erradicacion de la infeccion por VIH-1 en el cuerpo ha encontrado dificultades excepcionales en presencia del reservorio viral latente, representado principalmente por los linfocitos T CD4+ de memoria, a los que no pueden dirigirse las terapias antirretrovirales actuales (TAR) ni pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario. Para este fin, se han propuesto estrategias denominadas "golpear y destruir" [Hamer, 2004], basadas en a) la estimulacion de la expresion de antigeno viral en las celulas infectadas de forma latente (es decir, la fase de "golpear"), en presencia de TAR intensificado para suprimir la propagacion viral debido a la expresion del virus y b) la destruccion de las celulas infectadas de forma latente por el sistema inmunitario u otros medios (es decir, la fase de "destruir"). Para cada una de estas fases, se estan buscando exhaustivamente medicamentos eficaces.

El descubrimiento de farmacos clasico implica el descubrimiento y la validacion de dianas, la identificacion de cabezas de serie mediante el cribado de alto rendimiento y la optimizacion de cabezas de serie mediante la quimica medica. Una estrategia de desarrollo de farmacos alternativa es el aprovechamiento de farmacos establecidos que ya que ya se han aprobado para el tratamiento de enfermedades no infecciosas y cuyas dianas son particularmente interesantes para la enfermedad cuya cura se esta buscando [Duenas-Gonzalez et al., 2008]. Esta estrategia tambien se denomina reposicionamiento de farmacos o cambio de indicacion [Duenas-Gonzalez et al., 2008]. Un ejemplo exitoso de reposicionamiento de farmacos es proporcionado por la cloroquina. Ademas de su uso en el arsenal contra la malaria, la cloroquina se ha utilizado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide y ahora esta en ensayos clinicos como un posible agente para el tratamiento de ciertos tipos de cancer e infecciones virales [Savarino et al., 2006; Savarino et al., 2007]. Para la fase de "golpear" de las estrategias de erradicacion del VIH-1, se ha propuesto a los inhibidores de la histona desacetilasa (HDACI, del ingles histone deacetylase inhibitors), actualmente en ensayos clinicos como agentes antineoplasicos [Demonte et al., 2004; Mai et al., 2009]. Desafortunadamente, los efectos de los compuestos disponibles en la actualidad sobre la activacion del VIH-1 desde la quiescencia se asocian a toxicidad [Duverger et al., 2009]. Recientemente se han descubierto nuevos HDACI, que son farmacos epigeneticos que inducen al VIH-1 de escapar de la latencia y que son especificos de clase y de isoforma [Mai et al., 2009]. Estos compuestos inhiben especificamente las histona desacetilasas (HDAC) que pertenecen a la agrupacion de clase I, que estan involucradas especificamente en el mantenimiento de la latencia del VIH-1. Sin embargo, la toxicidad sigue siendo una preocupacion de gran importancia. Ademas, de manera similar a los HDACI no especificos de clase de la generacion anterior, estos farmacos no son capaces de inducir la activacion del VIH-1 en todas las celulas dentro de una poblacion de celulas infectadas de forma latente. Esto indica que existen diferentes entornos de cromatina que mantienen la latencia del VIH-1 en diferentes celulas. Por tanto, se necesitaran diversos estimulos para purgar eficazmente el VIH-1 de los reservorios.

En este sentido, se cree que el estres oxidativo es un area importante para la interaction virus/hospedador. Los iones metalicos y otras especies quimicas reactivas al tiol, pueden desempenar un papel importante en la genesis de estres oxidativo. Se descubrio que el hierro, un ion metalico que se demostro que genera radicales hidroxilo a traves de la reaction de Fenton, esta aumentado en las celulas infectadas por VIH-1 productivamente y promueve la replication del VIH-1 in vitro [Savarino et al., 1999]. Sin embargo, en la actualidad es poco probable que este metal encuentre un lugar entre las estrategias de reactivation del VIH-1, debido a los efectos secundarios y la complejidad de su administration in vivo. Dada la mala adsorcion y biodistribucion de los transportadores de hierro, es poco probable que este metal alcance los niveles plasmaticos suficientes para la activacion eficiente del VIH-1 de los reservorios latentes.

Metales distintos del hierro pueden provocar estres oxidativo. Uno de dichos metales es el oro [Sannella et al., 2009]. Los compuestos que contiene oro han demostrado ser utiles en el tratamiento de la artritis reumatoide [Patai, 1999] y se han tenido en cuenta en las estrategias contra el cancer. Su utilidad propuesta en tratamientos contra el cancer se debe a sus propiedades antiproliferativas. La cabeza de serie principal para complejos de oro con actividad antitumoral activo es la auranofina (Fig. 1), que se caracteriza por su atomo central de oro (I), asi como una trietilfosfina y un ligando hidrato de carbono.

Sumario de la invencion

En las reivindicaciones adjuntas se exponen aspectos de la presente invencion.

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Es bien sabido que la activacion de la replicacion del VIH-1 provoca estres oxidativo, que a su vez potencia la replicacion del VIH-1. La base comun para los compuestos de la presente invencion es: A) la capacidad de reactivar el VIH-1 desde la latencia y B) la capacidad para contrarrestar la maquinaria celular que se activa con el fin de limitar los efectos del estres oxidativo. De esta manera, puede potenciarse el estres oxidativo y se despierta una especie de "reaccion en cadena". Esta "reaccion en cadena" induce una reactivacion mas eficiente del VIH-1 desde la latencia y, en algunos casos, induce la destruccion selectiva de las celulas infectadas. Las acciones A) y B) puede realizarse ya sea mediante un farmaco que ejerce ambos efectos u obtenerse mediante el uso combinado de farmacos distintos. Existen dos maquinarias celulares principales que contrarrestan el estres oxidativo, es decir, el sistema tiorredoxina (Trx) tiorredoxina reductasa (TrxR) y el glutation. En el presente documento, los inventores presentan estrategias farmacologicas capaces de ejercer la accion B) mediante el bloqueo de cualquiera de las dos maquinarias.

Los inventores han realizado experimentos para ensayar si la auranofina podria activar el VIH-1 en los modelos de estirpe celular para la quiescencia del VIH-1 y como. Sorprendentemente, se ha demostrado que el compuesto que contiene oro (I), auranofina, es un potente inductor de la activacion del VIH-1 desde la quiescencia y es por tanto util en la erradicacion del VIH-1. La auranofina muestra una actividad notable en la activacion de reservorios de retrovirus latentes. En combinacion con la terapia o el tratamiento antirretrovirales conocidos (TAR), este puede usarse entonces en la terapia para reducir o eliminar la infeccion por retrovirus. Los efectos de la auranofina sobre la reactivacion del VIH-1 son particularmente sorprendentes porque se creia que este farmaco actuaba de forma opuesta (silenciando el VIH), como se analiza en otro lugar.

Especificamente, se ha descubierto que la auranofina estimula la reproduccion de retrovirus desde reservorios latentes (de dichos retrovirus) y esto puede usarse para reducir o eliminar estos reservorios en combinacion con la terapia antirretroviral convencional. Ademas, se ha descubierto que cada uno de los inhibidores de la histona desacetilasa (HDACi), el nitrilotriacetato de hierro y la butionina sulfoximina potencia sustancialmente la capacidad de auranofina para combatir la latencia del VIH-1.

Los inventores tambien han descubierto sorprendentemente que los compuestos que contienen arsenico y las combinaciones de un inhibidor de la histona desacetilasa con un inhibidor de la sintesis de glutation tales como butionina sulfoximina (BSO) tambien son eficaces en el tratamiento de celulas infectadas de forma latente. En particular, los agentes activos son capaces de dirigirse a las celulas infectadas y selectivamente destruirlas, pero no a las celulas sin infectar.

Por tanto, ciertos inductores del estres oxidativo son utiles en el tratamiento de la infeccion retroviral latente.

Por tanto, en un primer aspecto, se proporciona un inductor del estres oxidativo para su uso en el tratamiento de la infeccion por virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) latente, en el que dicho inductor del estres oxidativo es auranofina u oxido de arsenico (As2O3 o As4O6), en el que la auranofina o el oxido de arsenico inducen la activacion del VIH-1 desde la quiescencia y son un modulador epigenetico y en el que el tratamiento incluye, ademas, la terapia antirretroviral.

Se desvela un inductor que es un metalofarmaco modulador epigenetico que no tiene hierro, por ejemplo los compuestos que contienen oro o las combinaciones de un inhibidor de histona desacetilasa con un inhibidor de la sintesis de glutation tales como butionina sulfoximina. El cisplatino, por ejemplo, es un metalofarmaco pero no tiene propiedades epigeneticas. El inductor del estres oxidativo puede ser una molecula pro-oxidante.

El metalofarmaco es un compuesto que comprende un ion metalico y que tienen actividad biologica. Estos metalofarmacos incluyen metales capaces de inducir una redisposicion de perfiles de expresion genica en una celula. Esto puede aprovecharse para inducir la activacion del VIH-1 desde la latencia. Los metalofarmacos tambien pueden tener propiedades quimicas particulares. En general, se prefiere que sean capaces de liberar un ion que lleve una carga positiva. Opcionalmente, tambien pueden cumplir con requisitos estericos particulares.

Por ejemplo, los compuestos que contienen oro (I) cumplen plenamente con estos criterios. Estos compuestos pueden consistir en un transportador organico y un ion de oro (I), que se libera. Aunque la presente invencion no esta ligada a ningun mecanismo particular, el tamano atomico del oro (aproximadamente 174 pm) permite la insercion en el sitio activo de TrxR para formar un complejo con cistemas/selenocistemas fundamentales para la actividad biologica de esta proteina. Puede verse una estructura de tres dimensiones en el Banco de Datos de Proteinas (numero de registro: 3H4K). De esta manera, se inhibe la actividad de la TrxR.

El ion activo de los metalofarmacos tambien puede ser un ion no metalico capaz de imitar el ion de oro (I). En este contexto, algunos farmacos que contienen metaloides, tales como el trioxido de arsenico (As2O3) se consideran como metalofarmacos epigeneticos. El trioxido de arsenico libera un ion de monoxido de arsenico que lleva una carga positiva y cumple con los requisitos estructurales para formar aductos covalentes con las cisteinas o selenocisteinas presentes en las reductasas (tamano atomico del arsenico: 115 pm; tamano atomico del oxigeno: 60 pm). Puede verse una estructura de oxido de arsenico en complejo con un miembro de la superfamilia de Trx en el Banco de Datos de Proteinas (numero de registro: 1J9B). Esta estructura indica fuertemente que se forma un aducto similar con tiorredoxina reductasa.

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El ion liberado por el metalofarmaco puede, por tanto, no ser derivado del platino, cuya oxidacion solo puede dar como resultado iones PT(II) o Pt(IV), o hierro, del que derivan los iones Fe(II) o Fe(III) y tiene un tamano atomico menor en comparacion con el oro. Por tanto, se excluyen los metalofarmacos que comprenden iones de hierro o iones de platino y se tienen en cuenta solamente si estan combinados con uno de los metalofarmacos anteriormente mencionados. Son ejemplos de los mismos los compuestos que comprenden oro, preferentemente los iones de oro (I) o arsenico. Los compuestos que contienen oro incluyen las sales de oro o los derivados de oro. Los compuestos que contienen arsenico incluyen los arsenicales tales como oxidos de arsenico, que incluyen arsenico blanco (As2O3, pero tambien puede encontrarse como As4O6). Otra actividad comun compartida por los compuestos que contienen oro (I) y el trioxido de arsenico es la capacidad de actuar como mimeticos de la superoxido dismutasa, facilitando de este modo la produccion intracelular de especies radicales de oxigeno (ERO). Es ampliamente sabido que las ERO activan el VIH-1 desde la latencia.

Se sabe en la tecnica que los moduladores epigeneticos desempenan un papel en la metilacion del ADN y la remodelacion de la cromatina, es decir, en el enrollamiento y/o desenrollamiento del ADN, modulando de este modo la expresion genica.

El metalofarmaco modulador epigenetico sin hierro es capaz de inducir el estres oxidativo. Tambien es preferentemente capaz de inhibir la tiorredoxina reductasa (TrxR) y/o actuar como un mimetico de la superoxido dismutasa (SOD). El metalofarmaco inhibe la tiorredoxina reductasa mediante el bloqueo de su sitio activo. Esto puede conseguirse mediante la complejacion directa con el resto de selenocisteina que se sabe que es importante para la actividad reductora de estas proteinas. El metalofarmaco tambien puede suprimir la sintesis de TrxR.

Tambien se preven moleculas pro-oxidantes, en particular inhibidores de la gamma-glutamil cisteina sintetasa, una enzima limitante en la via de sintesis del glutation [Anderson, 1998]. Los inhibidores preferidos de esta enzima incluyen la butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor irreversible. La BSO es, por tanto, un inhibidor de la sintesis del glutation y tambien se prefieren dichos inhibidores. El inhibidor se proporciona mas preferentemente en combination con un inhibidor de la histona desacetilasa (HDACi).

Los compuestos de la presente invention (que pueden incluir combinaciones tales como un inhibidor de la sintesis de glutation) tienen capacidad de destruction selectiva. Esta es la capacidad para dirigirse y destruir las celulas infectadas de forma latente, pero no las celulas no infectadas. En otras palabras, las celulas que comprenden reservorios virales son dianas, pero las celulas no infectadas no se destruyen, conduciendo a una reduction ventajosa en los efectos secundarios. Se prefiere que las celulas diana sean linfocitos T-CD4+ de memoria transitoria (Ttm) o linfocitos T CD4+ de memoria central (Tcm). Estos son el principal reservorio para la latencia del VIH-1 en individuos con terapia antirretroviral (TAR) y que presentan un recuento bajo de CD4 [Chomont et al., 2009]. Los linfocitos T CD4+ de memoria central (Tcm) son precursores de los Ttm y representan un reservorio de VIH-1 mas estable. Por tanto, la presente invencion es particularmente util en el tratamiento de pacientes con reservorios virales, especialmente de los pacientes que presentan un recuento bajo de CD4. Dichos pacientes deberian estar sometidos, o haber sido sometidos, a terapia antirretroviral (TAR) ya que esto puede ayudar a impedir que el virus recien formado infecte otras celulas.

Tambien se desvela un metodo de tratamiento de un paciente con sospecha de infection retroviral latente, que comprende administrar a dicho paciente un inductor del estres oxidativo tal como se define en el presente documento, que puede incluir un metalofarmaco modulador epigenetico sin hierro o un HDACi junto con un inhibidor de la sintesis de glutation, tal como butionina sulfoximina. El metodo puede comprender adicionalmente la administration de al menos uno de entre un inhibidor de la histona desacetilasa (HDACi) (adicional), BSO y un compuesto que contiene oro, tal como la auranofina, un compuesto que contiene arsenico, tal como trioxido de arsenico (As2O3) y/o nitrilotriacetato de hierro o sulfato ferroso.

Los inventores desvelan en el presente documento un metodo de direction selectiva a las celulas infectadas de forma latente por un retrovirus, comprendiendo dicho metodo poner en contacto las celulas con dicho inductor del estres oxidativo.

Por tanto, los inventores proporcionan estrategias capaces no solo de activar el VIH-1 desde la latencia, sino tambien de contrarrestar la maquinaria antioxidante celular manteniendo el VIH-1 en un estado quiescente. En el caso de los metalofarmacos epigeneticos, ambas actividades son realizadas por el mismo farmaco (induction de la replication del VIH-1 activada por ERO e inhibition de la proteina antioxidante celular TrxR). En el caso de la combinacion de HDACI mas bSo, estos efectos son ejercidos por farmacos separados (un HDACi que induce la reactivation epigenetica del VIH-1 y BSO que inhibe la sintesis del peptido reductor celular, glutation).

Breve descripcion de la invencion

Figura 1. La estructura de la auranofina [oro(1+); 3,4,5-triacetiloxi-6-(acetiloximetil)oxano-2-tiolato; trietilfosfanio].

Figura 2. Estimulacion dependiente de la dosis de la replicacion del VIH-1 por auranofina en celulas ACH-

2. El grafico muestra la estimulacion dependiente de la concentration de la produccion de p24 de VIH-1 en

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celulas ACH-2 en el Dia 3 de la incubacion con los farmacos. Eje X: Concentracion del farmaco; eje y: aumento de p24 de VIH-1 (transformacion logaritmica del porcentaje de los niveles basales en los cultivos sin tratar). Se muestra la linea o curva que mejor se ajusta a los puntos de datos.

Figura 3. Efectos combinados de auranofina (0,25 uM) y MC2113 (1 uM) sobre la replicacion del VIH-1 en celulas U1. Se incubaron celulas U1 con cualquiera de los farmacos solos o en combinacion y se evaluo la produccion de p24 a las 24 h de tratamiento. En este caso, el efecto sinergico era tan evidente que no necesito analisis usando superficies de porcentaje-de-sinergia.

Figura 4. Induccion dependiente de la dosis de la expresion controlada por LTR de proteina verde fluorescente (GFP) por auranofina. Se uso un clon de celula Jurkat linfoide T infectado en reposo, establecido por Jordan et al. (2003). Este clon, es decir, 8.4, contiene todo el genoma del VIH-1 bajo el control del LTR y presenta el gen GFP en reemplazo de nef. Las celulas 8.4 muestran niveles basales no significativos de expresion de GFP. Las celulas se incubaron con los diferentes tratamientos y se controlo la expresion de GFP en las celulas vivas seleccionadas a las 72 h por medio de tecnicas de citometria de flujo convencionales. Los resultados se presentan como histogramas de fluorescencia. Cada histograma presenta el porcentaje de celulas fluorescentes mas alla de un valor umbral establecido usando celulas Jurkat no infectadas.

Figura 5. Induccion de la expresion controlada por LTR de proteina verde fluorescente (GFP) por auranofina y un inhibidor de histona desacetilasa de clase I (MC2113). Se trataron celulas Jurkat 8.4 infectadas con una concentracion clinicamente pertinente de auranofina (0,25 microM) o 1 microM de MC2113 o ambos. Los datos se presentan como en la Fig. 4.

Figura 6. Induccion de transporte nuclear de NF-kappaB (p65/p50) por auranofina en diferentes tiempos de incubacion. Se incubaron celulas Jurkat 8.4 infectadas en reposo con una concentracion clinicamente pertinente de auranofina (0,25 microM) y se cuantifico la presencia de p65 en extractos nucleares mediante un ensayo colorimetrico de factor nuclear. Los resultados se presentan como un porcentaje de la senal obtenida en los extractos nucleares de celulas incubadas con TNF-alfa durante 1,5 h.

Figura 7. Efectos combinados de auranofina y nitrilotriacetato de hierro (FeNTA) que dan como resultado la estimulacion sinergica de la replicacion de VIH-1 en celulas ACH-2. Superficie 3D que muestra el sinergia entre farmacos. Ejes x, y: concentracion del farmaco; eje z: porcentaje de sinergia entre los dos farmacos. Los valores de porcentaje de sinergia representan la diferencia porcentual entre los efectos de la combinacion de farmacos y la suma de los efectos de la auranofina y FeNTA administrados por separado a concentraciones emparejadas, calculados como se indica a continuacion:

PS — 100 ■ [Efarmaco A + farmaco B - (Efarmaco A + Efarmaco b)] / (Efarmaco A + Efarmaco b)

donde PS es el porcentaje de sinergia y E es el efecto de la concentracion del farmaco, expresado como el aumento de la produccion de p24.

Figura 8. Efectos combinados de auranofina y butionina sulfoximina (BSO) que dan como resultado la estimulacion sinergica de la replicacion del VIH-1 en celulas ACH-2. Para la interpretacion de la figura se remite al lector al trtulo de la figura 7.

Figura 9. Destruccion celular por inhibidores de histona desacetilasa (HDACi). Paneles A-B: Correlacion entre la produccion de p 24 de VIH-1 en celulas ACH-2 (panel A) y U1 (panel B) infectadas de forma latente tratadas con HDACi y la inhibicion de la viabilidad de celulas infectadas. Las celulas se incubaron con los compuestos de ensayo (1 |jM) y la produccion de p24 se midio mediante ELISA en sobrenadantes de cultivo celular. Despues de la recoleccion de los sobrenadantes, la viabilidad celular se midio mediante el metodo altamente normalizado del metil tetrazolio (MTT). Eje X: aumento de p24 de VIH-1; los datos se presentan como una transformacion logaritmica del porcentaje de los niveles basales en los cultivos sin tratar. Eje y: reduction porcentual de la viabilidad celular en comparacion con los controles no tratados incubados en condiciones similares. Paneles C-D: destruccion selectiva de cultivos celulares linfociticos (panel C) y monociticos (panel D) infectados por VIH-1 mediante MC 1855. Se incubaron celulas no infectadas H9 y U937 y celulas infectadas por VIH-1 H9iiib, ACH-2 y U1, con los compuestos de ensayo durante siete dias y la viabilidad celular se midio como se ha descrito anteriormente. Eje X: concentracion de farmaco. Eje y: reduccion porcentual de la viabilidad celular en comparacion con los controles sin tratar.

Figura 10. Estimulacion dependiente de la dosis de la replicacion de VIH-1 por MS 275 en celulas ACH-2.

El grafico muestra la estimulacion dependiente de la concentracion de la produccion de p24 de VIH-1 en celulas ACH-2 en el Dia 3 de la incubacion con el farmaco. Eje X: Concentracion del farmaco; eje y: aumento de p24 de VIH-1 (transformacion logaritmica del porcentaje de los niveles basales en los cultivos sin tratar). Se adoptaron transformaciones apropiadas para normalizar los datos en caso necesario. Se muestra la linea o curva que mejor se ajusta a los puntos de datos.

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Figuras 11 y 12. Sinergia de los inhibidores de histona desacetilasa (HDACI) con butionina sulfoximina (BSO). El grafico tridimensional (3D) muestra la superficie 3D de la sinergia entre cada HDACi y BSO. Ejes x, y: concentracion del farmaco; eje z: porcentaje de sinergia entre los dos farmacos. Los valores de porcentaje de sinergia representan la diferencia porcentual entre los efectos de la combinacion de farmacos y la suma de los efectos de MS 275 y BSO administrados por separado a concentraciones emparejadas, calculados como se indica a continuacion:

PS — 100 ■ [Efarmaco A + farmaco B - (Efarmaco A + Efarmaco b)] / (Efarmaco A + Efarmaco b)

donde PS es el porcentaje de sinergia y E es el efecto de la concentracion del farmaco, expresado como el aumento de la produccion de p24.

Figura 13. Estimulacion de la expresion controlada por LTR de VIH-1 de la protema fluorescente verde (GFP) por MS-275 y butionina sulfoximina (BSO), solos o en combinacion en un clon de celula Jurkat (A1). El clon de celula A1, derivado de celulas Jurkat linfoides T, establecido por Jordan et al. como un modelo para la infeccion por VIH-1 latente. Este clon tiene una construccion integrada GFP/Tat bajo el control del LTR de VIH-1 y muestra una proporcion basal de celulas que expresan GFP, que aumentan siguiendo los estimulos que activan el promotor del VIH-1. Las celulas A1 se incubaron durante 72 h con los diferentes tratamientos y la expresion de GFP se controlo mediante tecnicas de citometria de flujo convencionales y se evaluo como el porcentaje de celulas fluorescentes (indicado para cada histograma) mas alla del valor umbral establecido usando celulas Jurkat no transfectadas de control. Un experimento de tres con resultados similares. Se descubrio que los histogramas derivados de tratamientos con doble farmaco eran significativamente diferentes (P < 0,01) de los derivados de los tratamientos con los farmacos individuales a concentraciones emparejadas (estadistica de Kolmogorov-Smirnoff).

Figura 14. Efectos del inhibidor de HDAC, MS-275 y butionina sulfoximina (BSO), solos o en combinacion.

Se proporcionan valores de viabilidad de celulas a 72 h de incubacion, segun se determina mediante el metodo del metil tetrazolio (MTT): celulas ACH-2 (A), celulas 6.3 Jurkat (B), celulas Jurkat no infectadas (C). Los resultados se presentan como porcentajes de la absorbancia (A = 550) en controles sin tratar restando el nivel de fondo (medias ± ETM, 3 experimentos). Los asteriscos indican las diferencias significativas encontradas entre los tratamientos con BSO y los tratamientos equivalentes en ausencia de BSO (* P < 0,05; ** P < 0,01; *** P <0,001). La significacion estadistica se calculo usando medidas repetidas, ANOVA de dos vias y post-ensayo de Bonferroni, despues de una transformacion apropiada para restablecer la normalidad, en caso necesario.

Figura 15. Induccion dependiente de la dosis de la expresion controlada por LTR de protema verde fluorescente (GFP) por trioxido de arsenico. En este experimento, los inventores usaron el clon A1 de celula Jurkat linfoide T, que tiene una construccion integrada GFP/Tat bajo el control del LTR de VIH-1. Las celulas se incubaron con los diferentes tratamientos y la expresion de GFP se monitorizo en celulas vivas seleccionadas a las 72 h mediante tecnicas de citometria de flujo convencionales. Los resultados se presentan como histogramas de fluorescencia. Cada histograma presenta el porcentaje de celulas fluorescentes mas alla de un valor umbral establecido usando celulas Jurkat no infectadas.

Descripcion detallada de la invencion

Se desvela un compuesto que contiene oro para su uso en el tratamiento de una infeccion retroviral latente. El compuesto que contiene oro puede ser capaz de inducir la replication retroviral en un modelo reconocido de una infeccion latente de dicho retrovirus. En el caso del VIH-1, este modelo puede seleccionarse entre el U1 y ACH-2, por ejemplo. Se prefiere que los compuestos de la presente invencion tengan una actividad minima en el ensayo U1 que se describe a continuacion en el presente documento en la section Experimental de aproximadamente un aumento del 500 % (%).

El retrovirus puede ser un lentivirus de simio o humano, tal como el VIH. El VIH-1 es la diana de la presente invencion. El compuesto que contiene oro de la presente invencion es auranofina (Fig. 1), que se caracteriza por su atomo de oro (I) central, asi como una trietilfosfina y un ligando de hidrato de carbono. Otros complejos de oro relacionados incluyen, por ejemplo, el analogo de cloro: Et3PAuCI y tiomalato de oro. Estos pueden tener multiples modos de action que aun estan siendo explorados. Se ha demostrado recientemente que la auranofina induce un cambio hacia el lado pro-oxidante del potencial redox intracelular [Sannella et al., 2008]. La especie activa es probablemente el oro en si mismo y los ligandos son mas relevantes para las propiedades de biodistribucion y cineticas de los agentes. Los candidatos ideales para las estrategias de erradicacion del VIH-1 no deben inducir la activation inmunitaria (perjudicial para los individuos infectados por VIH-1 [Savarino et al., 2000]). Es, por tanto, ventajoso que las sales de oro organicas esten dotados de propiedades antiinflamatorias.

El ion de oro (I) o (II) es, por tanto, biodisponible. Se apreciara que el compuesto que contiene oro tambien puede denominarse un complejo. El compuesto que contiene oro puede comprender oro en su estado de oxidation (I) o (II), prefiriendose en particular el (I). Los compuestos que contienen oro pueden ser compuestos quimicos ionicos de oro o compuestos de organooro.

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Preferentemente, el compuesto que contiene oro puede usarse ya sea solo o en combinacion con al menos uno de entre un HDACi, BSO y/o nitriloacetato de hierro. Se prefieren combinaciones con BSO y se prefieren en particular combinaciones con al menos un HDACi.

Se desvela un inductor de estres oxidativo, que es un metalofarmaco modulador epigenetico sin hierro, en combinacion con al menos un HDACi para su uso en el tratamiento de la infeccion retroviral latente. El inductor el estres oxidativo es un compuesto que contiene oro o arsenico, tal como auranofina o trioxido de arsenico, o un inhibidor de la sintesis de glutation, tal como BSO. Tambien se preve el nitroloacetato de hierro en combinacion con un HDACi.

En la medida en que los HDACi pueden considerarse inductores de estres oxidativo, el inductor de estres oxidativo mencionado anteriormente es un inductor de estres oxidativo no HDACi. En otras palabras, se desvela al menos un HDACi en combinacion con al menos otro inductor de estres oxidativo (no-HDACi) para su uso en el tratamiento de la infeccion retroviral latente. Dicho otro inductor de estres oxidativo (no-HDACi) puede ser auranofina o BSO, nitrilotriacetato de hierro o sulfato ferroso, por ejemplo. Tambien se desvelan metodos de tratamiento, que corresponden a los presentes usos.

Se demostro que el estres oxidativo esta vinculado a la replicacion del VIH-1 por interacciones binarias, provocando la replicacion del VIH-1 estres oxidativo y activando el estres oxidativo la activacion del VIH-1 desde la quiescencia [Israel y Gougerot-Pocidalo, 1997]. Los mecanismos detras de la activacion del VIH-1 desde la quiescencia inducida por estres oxidativo son numerosos y todavia estan poco explorados. Se demostro que el estres oxidativo conduce el equilibrio entre las actividades de las histona desacetilasas (HDAC) y las histona acetil transferasas (HAT) hacia un aumento de la actividad HAT [Rahman et al., 2004]. Esto favorece el desenrollamiento del ADN y la transcripcion de varios genes, incluyendo los provirus de VIH-1. Sin embargo, el uso de inductores de estres oxidativo en combinacion con HDACi no se ha tenido en cuenta.

La auranofina puede no necesariamente inducir la reactivacion del VIH-1 a traves del estres oxidativo, puede actuar a traves de un mecanismo alternativo. Los inventores han demostrado que la auranofina induce la activacion del VIH-1 desde la quiescencia, probablemente mediante un mecanismo novedoso. Los indicios de que este farmaco activa el VIH-1 desde la quiescencia derivan de sus efectos reproducibles en cuatro estirpes celulares diferentes en las que la expresion genica impulsada por LTR es inducible. La opinion de que la auranofina activa la expresion genica del VIH-1 mediante un mecanismo novedoso se sugiere por sus efectos en combinacion con farmacos que se sabe que activan la transcripcion genica del VIH-1 por mecanismos diferentes y bien caracterizados y es apoyada por la bibliografia existente sobre sus dianas intracelulares [Rigobello et al., 2002; Rigobello et al., 2005; Omata et al., 2006; Talbot et al., 2008].

Se ha demostrado que la auranofina es un inhibidor de los TrxR, que son selenoproteinas involucradas en el mantenimiento de la homeostasis redox intracelular [Rigobello et al., 2002; Rigobello et al., 2005; Omata et al., 2006]. Tambien se ha demostrado que la auranofina inhibe la sintesis de TrxR [Talbot et al., 2008]. Los TrxR se encuentran en dos isoformas principales, una citosolica (TrxR1) y una mitocondrial (TrxR2) [Lu y Holmgren, 2009]. Los TrxR tienen varios sustratos, de los cuales el principal es la tiorredoxina (Trx1 es la isoforma celular; Trx2 es la isoforma mitocondrial). Los TrxR mantienen la Trx en un estado reducido, que a su vez reduce varias proteinas intracelulares. Aparte de la Trx, los TrxR tambien reducen otras dianas incluyendo el Tat del VIH-1, que se inactiva por accion del TrxR (Kalantari et al., 2008).

A la luz de esta evidencia, se podria suponer que los efectos de la auranofina sobre la reactivacion de la VIH-1 podrian estar mediados por Tat. La auranofina, sin embargo, realizo efectos que inducen el VIH-1 en estirpes celulares tales como ACH-2 y U1, que tienen un eje Tat/TAR defectuoso, lo que indica que otros objetivos estan involucrados en los efectos de la auranofina que inducen el VIH-1. Se demostro, de hecho, que la auranofina actua sobre multiples dianas intracelulares. Aparte de sus efectos sobre las selenoproteinas, se descubrio que este farmaco inhibe algunas cinasas tales como la proteina cinasa C [Daniel et al., 1995] y las catepsinas [Chircorian y Barrios, 2004].

En el estudio, la auranofina potencio potentemente los efectos de activacion del VIH-1 del FeNTA, que genera especies reactivas de oxigeno (ERO) a traves de la reaccion de Fenton. Ademas, los efectos de la auranofina se potenciaron por BSO, un compuesto que induce el agotamiento de glutation y, por tanto, disminuyen la capacidad de las celulas para contrarrestar el estres oxidativo. Si, como informan otros autores (Sannella et al., 2009), la auranofina induce efectos pro-oxidantes, su mecanismo puede ser distinto del de otras moleculas pro-oxidantes tales como FeNTA y BSO. El efecto de activacion del VIH-1 de la auranofina sola es apoyado, en el presente documento, por sus efectos activadores de NF-kappaB. Se ha demostrado que el estres oxidativo induce la translocacion nuclear de NF-kappaB (p65/p50) [Rahman et al., 2004]. Este factor nuclear se une a sitios especificos en el LTR del VIH-1 y promueve la transcripcion del genoma proviral [Williams et al., 2007].

En este sentido, los inventores han descubierto en el presente estudio que la auranofina induce la translocacion nuclear NF-kappaB y la union al ADN en condiciones similares a aquellas en las que se induce la replicacion del VIH-1. Este fue un hallazgo realmente sorprendente, a la luz de los informes anteriores [Jeon et al., 2000; Traber et al., 1999]. Pueden conciliarse las discrepancias aparentes entre nuestros resultados y los de estudios anteriores que

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muestran un efecto inhibidor de la auranofina y otros compuestos que contienen oro sobre la activacion de NF- kappaB [Jeon et al., 2000; Traber et al., 1999], al tener en cuenta las diferentes concentraciones adoptadas de los farmacos. Las concentraciones de auranofina adoptadas en los estudios previos para demostrar la inhibicion de NF- kappaB eran aproximadamente dos ordenes de magnitud superiores a las adoptadas en el presente estudio. Dichas concentraciones de farmacos, que son superiores a las que pueden conseguirse clinicamente en el tratamiento de la artritis reumatoide, fueron toxicas para nuestras estirpes celulares (datos no mostrados). En lugar de ello, los inventores han demostrado que la auranofina puede tener el efecto contrario al silenciamiento del VIH, es decir, la activacion. Este es en particular el caso a concentraciones adecuadas, como se determinara facilmente por el experto en la materia. A modo de guia, sin embargo, se prefiere el uso de un intervalo de concentraciones de 0,1250,5 microM, aproximandose a los niveles plasmaticos medios observados durante el tratamiento de la artritis reumatoide [Benn et al., 1991]. Otros intervalos preferidos incluyen 0,1-0,6, 0,125-0,3, 0,2-0,6, 0,2-0,7, 0,125-0,2 y 0,125-0,175 microM.

El experto apreciara que estos pueden aumentarse a escala a dosis humanas, pero se prefiere uno cualquiera de los siguientes intervalos: 0,025-0,2 mg/kg/dia, 0,02-0,3 mg/kg/dia, 0,01-0,3 mg/kg/dia, 0,005-0,3 mg/kg/dia, 0,030,2 mg/kg/dia, 0,03-0,4 mg/kg/dia, 0,025-0,4 mg/kg/dia y 0,02-0,5 mg/kg/dia. Se prefiere en particular un intervalo de dosificacion de 0,025-02 mg/kg/dia.

La translocacion nuclear de NF-kappaB inducida por auranofina, aunque apoya adicionalmente la opinion de que la auranofina activa el VIH-1 desde la quiescencia mediante la induccion de un estres oxidativo, no puede considerarse como un indicio que apunta a NF-kappaB como el efector principal de los efectos de la auranofina sobre la replicacion del VIH-1. Varios otros factores de transcripcion potencialmente activos sobre el LTR del VIH-1 se activan por estres oxidativo [Wu et al., 2004]. Ademas, el estres oxidativo cambia el equilibrio entre las actividades de HDAC y HAT hacia un aumento de la actividad de HAT. En este sentido, se descubrio un efecto sinergico de la auranofina y los HDACI.

Aunque los iones de oro (I y II) solos son malos catalizadores de Fenton, los complejos organicos de oro pueden potenciar la reaccion de Fenton catalizada por Fe2+ actuando como mimeticos de superoxido dismutasa (SOD) [Huang et al., 2005]. Los mimeticos de SOD, al catalizar la conversion de superoxido/peroxido, pueden reponer las reservas de peroxido de hidrogeno intracelular consumidas por el catalizador de Fenton, proporcionando por tanto nuevo sustrato para la reaccion de Fenton. El mimetismo de SOD y la inhibicion de TrxR no son necesariamente excluyentes entre si y pueden tener un entorno comun. Por tanto, es posible plantear la hipotesis de que ambos mecanismos cooperan para activar el VIH-1 desde la quiescencia. Por ultimo, no se puede excluir que otros mecanismos aun sin explorar puedan reforzar el efecto activador del VIH-1 de la auranofina.

Los resultados del presente estudio senalan una nueva aplicacion para los farmacos existentes en la induccion de la activacion del VIH-1 desde la quiescencia. Tambien senala estrategias novedosas basadas en combinaciones de dos farmacos que activan el VIH-1 a concentraciones de farmaco no toxicas. Se descubrio en el presente estudio que la auranofina, un farmaco utilizado satisfactoriamente para el tratamiento de la artritis reumatoide y la leucemia, induce la activacion del VIH-1 desde la quiescencia a concentraciones que pueden alcanzare clinicamente, que tienen un perfil de toxicidad que esta bien caracterizado y que se ha demostrado que no pone en peligro la salud humana. Ademas, los inventores demuestran que las concentraciones de auranofina eficaces pueden reducirse adicionalmente por el uso concomitante de otros agentes de activacion del VIH-1 tales como los HDACI, actuando mediante diferentes mecanismos.

Los resultados mostraron que la auranofina indujo una reactivacion del VIH-1 dependiente del tiempo y de la dosis (P = 0,0295, ensayo t para la regresion; Fig. 5) en el intervalo de concentraciones de 0,125-0,5 microM, aproximandose a los niveles medios en plasma observados durante el tratamiento de la artritis reumatoide [Benn y otros, 1991]. En linea con su capacidad de inducir la activacion del VIH-1, la translocacion nuclear de NF-kappaB, un importante factor de transcripcion del VIH-1, inducida por auranofina. Los efectos de la auranofina sobre la activacion del VIH-1 desde la quiescencia eran aditivos o sinergicos con los de otros compuestos potenciadores de la replicacion del VIH-1. Estos inclman los inhibidores de histona desacetilasa (HDACI), que favorecen la transcripcion del VIH-1 por la regulacion epigenetica del enrollamiento del ADN, el nitrilotriacetato de hierro, que promueve la transcripcion del VIH-1 por la generacion intracelular de especies reactivas de oxigeno (ERO) y la sulfoximina butionina, un inhibidor de la sintesis de glutation que deteriora la capacidad de la celula para contrarrestar el estres oxidativo. Estos efectos combinados permiten tanto el uso de la auranofina como el de cada uno de los farmacos mencionados anteriormente a concentraciones que no son toxicas para las celulas no infectadas.

Encontrar posibles curas para el VIH-1/SIDA, capaces de erradicar el virus del cuerpo, es un importante reto cientifico para el siglo 21. Una via de investigation adicional esta dirigida a la investigation de posibles farmacos y combinaciones de farmacos utiles para la elimination de reservorios de VIH-1 latente que persisten a pesar de la terapia antirretroviral (TAR). Esto implica superar la barrera latente mediante la induccion de la replicacion del VIH en los linfocitos T infectados de forma latente, previniendo al mismo tiempo la propagation de los viriones recien producidas a celulas no infectadas proporcionando TAR simultaneamente. Se ha postulado que los inhibidores de la histona desacetilasa (HDACi) son herramientas potencialmente utiles en las estrategias de erradicacion del VIH-1

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[Demonte et al., 2004], y se demostro que el acido valproico (AV), un HDACi relativamente debil, promueve el escape del VIH-1 de la latencia in vitro y reduce el numero de linfocitos CD4+ de memoria infectados de forma latente in vivo en combinacion con la terapia antirretroviral [Lehrman et al., 2005; Smith, 2005]. Dichas estrategias se han denominado "golpear y destruir" [Hamer, 2004]. Es probable que la baja potencia del VA (CE50 en el intervalo milimolar) haya contribuido a su incapacidad para inducir la erradicacion del VlH-1.

Se han desarrollado HDACi nuevos y mas potentes para inducir la diferenciacion en tumores [Mottet y Castronovo, 2008]. Muchos de los nuevos agentes, sin embargo, son inhibidores no especificos para todos los tipos de HDAC, que desempenan diversas funciones importantes en el ciclo celular [Dokmanovic et al., 2007]. Las hDaC de clase I comprenden HDAC1-3 y 8, son predominantemente enzimas nucleares y se expresan de forma ubicua [Annemieke et al., 2003]. Las HDAC de clase II comprenden HDAC4-7, 9 y 10 y se transportan entre el nucleo y el citoplasma [Annemieke et al., 2003]. La HDAC1 probablemente mantiene la latencia del VIH-1 actuando en un complejo multimolecular con c-Myc y los LTR [Williams et al., 2006; Jiang et al., 2007].

Se han explorado otras estrategias para la induccion de escape del VIH-1 de la latencia, incluyendo el uso de la sustancia natural prostratina (cuyos mecanismos estan, hasta ahora, en gran parte sin explorar) y diacil glicerol lactonas que interfieren con la activacion de linfocitos T [Hezareth, 2005; Hamer, 2004].

El estres oxidativo es otro medio potente que promueve la replicacion del VIH-1 [Hulgan et al., 2003; Savarino et al.; 1999; Garaci et al., 1997; Palamara et al., 1996]. Los intermedios reactivos de oxigeno promueven la activacion y translocacion nuclear del factor nuclear kappaB (NF-kappaB) [Bowie y O'Neill, 2000], un factor de transcripcion que potencia la transcripcion y replicacion del VIH-1, que puede ser inhibida por altas concentraciones de glutation y otros antioxidantes [Palamara et al., 1996]. Los moduladores del estado redox de molecula pequena, hasta ahora, se han explorado poco para determinar su potencial de erradicacion del VIH-1.

Los inventores han descubierto ahora, sorprendentemente, que dos tipos de inhibidor HDACi, las benzamidas y los hidroxamatos, muestran una notable actividad en la activacion de los reservorios de retrovirus latente preferentemente en combinacion con el inhibidor de la sintesis de glutation, butionina sulfoximina (BSO). En combinacion con la terapia o el tratamiento antirretrovirales conocidos (ART), esto, puede usarse entonces en la terapia para reducir o eliminar la infeccion por retrovirus.

Especificamente, se ha descubierto que los inhibidores de histona desacetilasas benzamida y hidroxamato estimulan la reproduction del retrovirus desde reservorios latentes del mismo y esto puede usarse para reducir o eliminar estos depositos en combinacion con la terapia antirretroviral convencional. Ademas, se ha descubierto que la sulfoximina butionina (BSO) sustancialmente potencia la actividad antirretroviral de los HDACi de benzamida. Tambien se prefieren analogos de BSO.

Se desvela un inhibidor de histona desacetilasa (HDACi) ya sea de la variedad benzamida o hidroxamato para su uso en el tratamiento de la infeccion retroviral latente. El HDACi puede usarse en combinacion con BSO.

El inhibidor es capaz de inducir la replicacion retroviral en un modelo reconocido de una infeccion latente de dicho retrovirus. En el caso del VIH-1, este modelo puede seleccionarse entre U1 y ACH-2, por ejemplo. Se prefiere adicionalmente que los compuestos de la presente invention tengan una actividad minima en el ensayo de U1 descrito en el presente documento a continuation en la section Experimental adjunta, de un aumento de 800 veces (%).

Al igual que con los compuestos que contienen oro, el retrovirus es el VIH-1.

De este modo, los HDACi puedes usarse, por ejemplo, con inductores del estres oxidativo. El inductor del estres oxidativo es la auranofina y el trioxido de arsenico y puede incluir inhibidores de la sintesis de glutation, tales como BSO. A continuacion se describen HDACi.

Los HDI denominados "clasicos" actuan sobre las histonas desacetilasas de Clase I y Clase II. El HDACi clasico se unen al dominio catalitico que contiene cinc de la HDAC. Estos HDI clasicos pertenecen a varios grupos. Estos incluyen acidos hidroxamicos, tales como tricostatina A; tetrapeptidos ciclicos (tales como trapoxina B) y los depsipeptidos; benzamidas; cetonas electrofilas; y compuestos de acido alifatico tales como fenilbutirato y acido valproico. Los HDI denominados "de segunda generation" incluyen SAHA/Vorinostat, Belinostat/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994 y MGCD0103. Las HDAC de clase III de sirtuina son dependientes de NAD+ y, por tanto, son inhibidas por la nicotinamida, asi como por derivados de NAD, dihidrocumarina, naftopiranona y 2- hidroxinafaldehidos. Se prefiere en particular el acido suberoilanilida hidroxamico (SAHA), especialmente en combinacion con compuestos que contienen oro tales como la auranofina.

Se desvelan HDACi de benzamida. Estos pueden tener la formula:

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en la que Y comprende uno o dos anillos de seis miembros, estando cada uno insaturado o parcialmente insaturado y siendo heterodclico u homodclico, con dos a ocho atomos de union y en la que cualquiera de los atomos de union o un anillo comprende un grupo amino y un grupo carbonilo.

Algunas benzamidas son analogos de los compuestos identificados como MC 2211, MC2113 y MS 275 a continuacion.

MC 2211 es:

MC2113 es:

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Se desvela MS 275 o N-(2-aminofenil)-4-[N-(piridin-3-ilmetoxicarbonil)aminometil]benzamida), en el documento EP1626719 y tiene la estructura:

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en la que R es un enlace directo o un grupo etileno o etenileno, X es =CH- o =N-, R1 es arilo o heteroarilo y es mono- o bi-ciclico y R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido con un arilo o heteroarilo mono- o bi-dclico. R2 puede ser alquilo sin sustituir, preferentemente metilo, etilo o isopropilo. R1 puede ser fenilo o naftilo. R puede ser etenileno. X puede ser =CH-. Los HDACi pueden ser HDACi de Clase 1.

Tambien se desvelan HDACi de hidroxamato tales como acido suberoilanilida hidroxamico (SAHA). Esta es una molecula polar hibrida que contiene acido hidroxamico y se une a e inhibe espedficamente la actividad de la histona desacetilasa. Se sabe en la tecnica que SAHA presenta un efecto antitumoral mediante el aumento de la expresion de genes que regulan la supervivencia del tumor y que SAHA reduce la produccion de citocinas proinflamatorias in vivo e in vitro (Mascagni et al., "The antitumor histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid exhibits antiinflammatory properties via suppression of cytokines", PNAS, 5 de marzo de 2002, vol. 99 n.° 5 2995-3000).

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Tambien se preve un inhibidor de histona desacetilasa (HDACi) en el tratamiento de la infeccion retroviral latente. El inhibidor puede seleccionarse entre los HDACi analizados en el presente documento y los siguientes:

a) un inhibidor de HDAC de benzamida que tiene la formula:

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en la que Y comprende uno o dos anillos de seis miembros, estando cada uno insaturado o parcialmente insaturado y siendo heterodclico o homodclico, con dos a ocho atomos de union, y en la que ya sea los atomos de union o un anillo comprende un grupo amino y un grupo carbonilo; o b) un inhibidor de HDAC de hidroxamato que tiene la formula:

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en la que R es un enlace directo o un grupo etileno o etenileno, X es =CH- o =N-, R1 es arilo o heteroarilo y es mono- o bi-dclico y R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada, sustituido opcionalmente con un arilo o heteroarilo mono- o bi-dclico. El HDACi puede ser un HDACi de clase I.

El inhibidor puede ser capaz de inducir la replicacion retroviral en un modelo reconocido de una infeccion latente de dicho retrovirus. El retrovirus puede ser un virus VIH, preferentemente el VIH-1 y el modelo puede seleccionarse entre los modelos celulares U1 y ACH2.

La benzamida puede ser un analogo de uno de los compuestos identificados como MC 2211 y MS 275 en el presente documento. El inhibidor puede ser un compuesto que tiene la formula:

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R2 puede ser un grupo alquilo sin sustituir, preferentemente metilo, etilo o isopropilo. R1 puede ser fenilo o naftilo. R puede ser etenileno. X puede ser =CH-.

El inhibidor puede ser un inhibidor de Clase 1 y no inespedfico. El tratamiento puede incluir, ademas, la terapia antirretroviral.

Tambien se desvela un inhibidor de la histona desacetilasa (HDACI), en particular de la variedad benzamida, en combinacion con un inhibidor de la sintesis de glutation, tal como BSO (butionina sulfoximina), para su uso en el tratamiento de la infeccion retroviral latente. El inhibidor puede ser N-(2-aminofenil)-4-[N-(piridin-3- ilmetoxicarbonil)aminometil]benzamida). La BSO y el HDACi de benzamida pueden administrarse juntos.

El Ejemplo 2 adjunto proporciona tecnicas adecuadas para establecer que clase de HDAC inhiben los compuestos. Los HDACi no son HDACi inespedficos.

Los HDACi de pueden usarse en el tratamiento de pacientes con sospecha de tener reservorios latentes de retrovirus. Dichos retrovirus se denominaran en el presente documento como VIH-1.

El tratamiento puede eliminar cualquier reservorio latente de retrovirus. Sin embargo, se apreciara que dichos tratamientos tambien pueden usarse, menos preferentemente, para controlar retrovirus latentes. Esto puede ser ventajoso cuando un individuo es particularmente susceptible de repetir las infecciones a partir de los reservorios, por ejemplo.

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Un reservorio latente es una celula o celulas que contienen el retrovirus ya sea en quiescencia o replicandose a tasas bajas, tales como a menos del 5 % de la tasa normal, de manera que la celula puede actuar para proteger el virus durante un periodo de tiempo, y con frecuencia solo libera viriones viables semanas o meses despues de que el tratamiento antirretroviral normal se haya detenido, requiriendo de este modo la continuacion del tratamiento del individuo, en caso de que la infeccion reaparezca a traves de un reservorio de este tipo.

El tratamiento antirretroviral "normal" mencionado anteriormente y que se administra a individuos infectados con VIH-1, generalmente consiste en una combinacion de al menos tres farmacos diferentes que pertenecen a diferentes clases y normalmente se seleccionan entre inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosidicos/nucleotidicos (NRTI, del ingles nucleosidic/nucleotidic reverse transcriptase inhibitors), los inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosidicos (NNRTI, del ingles non-nucleosidic reverse transcriptase inhibitors) y los inhibidores de la proteasa (Pi). Un inhibidor de la fusion tambien puede formar parte del tratamiento. Recientemente, se ha anadido una clase adicional de farmaco, los inhibidores de la integrasa, al arsenal de farmacos antirretrovirales. Las combinaciones de farmacos antirretrovirales, en general, muestran la capacidad de bloquear la replicacion viral en curso, pero no tienen posibilidades de erradicar el virus del cuerpo.

Para la eliminacion de los reservorios retrovirales, las estrategias actuales postulan el uso de HDACi, especialmente los HDACi de clase 1, junto con la terapia antirretroviral convencional, como se sabe bien en la tecnica y como se ha descrito anteriormente, por ejemplo [Savarino et al. 2009].

El documento WO2007/121429 (Gladstone Institute) y el documento WO 03/053468 (Univ Libre Bruxelles) se refieren a los usos de HDACi. Se desvelna HDACi de diversas estructuras en el documento WO 2004/069823 (MetilGene, Inc) y en el documento WO 2004/103369 (Schering AG). Munier S et al. (Retrovirology, 23, noviembre de 2005, 2:73) describe la caracterizacion de dos genes candidatos, NCoA3 y IRF8, que pueden estar implicados en el control de la latencia del VIH-1. Garaci et al. (Journal of Leukocyte Biology, julio de 1997, Vol 62, n.° 1, pags. 5459) describe ciertos usos de BSO.

El HDACi puede administrarse directamente al paciente en cualquier vehiculo farmaceuticamente aceptable adecuado, y por cualquier via adecuada, como puede determinarse por un experto o un medico. El HDACi puede administrarse como una inyeccion o por parche transdermico, por ejemplo, y puede estar en solucion libre o unido a un vehiculo. Otras formulaciones, tales como comprimidos, supositorios, cremas y pulverizaciones seran en general menos utiles, aunque pueden usarse si se considera apropiado.

Los vehiculos adecuados pueden incluir liposomas dirigidos, que llevan anticuerpos adecuados, pero las celulas infectadas latentes se asocian en gran medida a la circulacion, por lo que la administration por inyeccion intravenosa es una via particularmente preferida.

Tambien se desvelan los compuestos novedosos de la Tabla 1 e, independientemente, metodos para preparar los mismos, como se ilustra en la section Experimental adjunta.

Los inventores desvelan en el presente documento formulaciones farmaceuticamente aceptables de los nuevos compuestos de la invention.

Los inventores desvelan en el presente documento un metodo para la eliminacion selectiva de celulas infectadas de forma latente, en el que las celulas son infectadas de forma latente por un lentivirus, especialmente el VIH-1, comprendiendo dicho tratamiento poner en contacto dichas celulas con un HDACi de la invencion en combinacion con la terapia antirretroviral.

Lo que es particularmente sorprendente es que se ha descubierto que los HDACi de benzamida son potenciados por la butionina sulfoximina (BSO) a niveles de hasta el 800 %. Esto es especialmente sorprendente ya que la BSO no tiene ninguna actividad anti-VIH-1 apreciable, pero es susceptible de una action sinergica con MS 275, por ejemplo, para aumentar muy sustancialmente su capacidad de destruir celulas que tienen una infeccion por VIH-1 latente.

Esta potenciacion tiene la ventaja anadida de reducir la cantidad de HDACi y BSO necesaria para el tratamiento del paciente. Por ejemplo, tanto MS 275 como BSO ya se han ensayado para determinar la seguridad en seres humanos y las cantidades de MS 275 tal como se usan para el tratamiento del cancer son generalmente mayores que las necesarias para el tratamiento proporcionado por la presente invencion. El intervalo de dosificacion para MS 275 esta en un intervalo de aproximadamente 0,05-0,1 mg/kg una vez por semana o segun lo prescrito por el medico. La BSO puede administrarse simultaneamente con MS 275, a una dosificacion de 0,1-0,3 mg/kg y las dosis posteriores, de tres a cinco en numero, pueden administrarse una vez o dos veces al dia, por ejemplo, cada 12 h.

Se desvela un inhibidor de histona desacetilasa, tal como la variedad de benzamida, en combinacion con butionina sulfoximina, para su uso en el tratamiento de la infeccion retroviral latente.

El metodo descrito anteriormente para la eliminacion selectiva de las celulas infectadas de forma latente pueden comprender adicionalmente poner en contacto dichas celulas con BSO en combinacion con dicho HDACi, en los

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tiempos que se describen en el presente documento.

Aunque BSO y HDACi trabajan sinergicamente, ninguno es toxico y los dos pueden administrate juntos o por separado, a condicion de que ambos esten presentes in vivo, preferentemente en particular en cantidades sinergicas. La BSO puede formularse con la benzamida o puede administrarse por separado si existe algun problema en la formulacion de los dos principios activos o si las condiciones de estabilidad para uno no son compatibles con el otro, por ejemplo.

Como se ha senalado anteriormente, en general, se ha descubierto que el HDACi selectivo de clase I muestra menor toxicidad que los compuestos no selectivos, e induce la destruccion selectiva de las celulas U1, ACH-2 y H9 IIIB infectadas por VIH-1, en comparacion con sus homologas no infectadas (P < 0,01, ensayo t para determinar la pendiente).

Los inventores compararon la toxicidad de la combination BSO + HDACi en estirpes celuladas no infectadas y en estirpes celulares infectadas de forma latente. Los resultados mostraron que, usando BSO en combinacion con HDACi, hubo una marcada citotoxicidad a las 72 h de incubation en los cultivos de celulas infectadas de forma latente, pero no en los cultivos de celulas no infectadas (Figura 14). Ademas de amplificar el efecto de los inhibidores de histona desacetilasa, los resultados del presente estudio permiten a los inventores plantear la hipotesis de que la estrategia de uso de agentes pro-oxidantes tales como BSO en combinacion con HDACi es capaz de inducir la destruccion selectiva de las celulas infectadas de forma latente.

Esta estrategia puede considerarse como uno de las largamente codiciadas estrategias "golpear y destruir" estrategias. Estas estrategias consisten en inducir, a traves de farmacos, la activation del VIH-1 desde la quiescencia (es decir, la fase de "golpear"), en presencia de TAR (para bloquear la propagation viral), seguido de la elimination de las celulas infectadas (es decir, la fase de "destruir"), a traves ya sea de medios naturales (por ejemplo, respuesta inmunitaria, citopatogenicidad viral) o medios artificiales (por ejemplo, farmacos, anticuerpos monoclonales, etc.) [Hamer DH, 2004]. De hecho, la estrategia se basa en un HDACi, que activa la replication del VIH-1 en las celulas infectadas de forma latente (es decir, la fase de "golpear"), en combinacion con un agente pro- oxidante tal como BSO, que amplifica la respuesta del HDCAi y provoca dano celular debido a la disminucion inducida por VIH-1 de los niveles intracelulares de glutation reducido (es decir, la fase de "destruir"). La busqueda de una combinacion de farmacos capaces de ejercer dichos efectos, hasta el momento, ha sido un "Santo Grial" en la investigation del SIDA.

Los inventores han demostrado en el presente documento que los compuestos que contienen oro son utiles en los tratamientos de la presente invention. Sorprendentemente, tambien han descubierto que los compuestos que contienen arsenico son utiles de forma similar.

Por tanto, la invencion tambien proporciona un compuesto que contiene arsenico para su uso, en el tratamiento de la infection retroviral latente. Preferentemente, el compuesto es capaz de inducir la replicacion retroviral en un modelo reconocido de una infeccion latente de dicho retrovirus. El retrovirus es el VIH-1 y el modelo puede seleccionarse entre los modelos celulares U1 y ACH-2. El compuesto que contiene arsenico es un oxido de arsenico, tal como As4Os, aunque se prefiere en particular el trioxido de arsenico (As2O3).

Preferentemente, la invencion puede comprender adicionalmente al menos otro inductor del estres oxidativo, tal como un metalofarmaco modulador epigenetico sin hierro, por ejemplo compuestos que contienen oro, tales como la auranofina; una molecula pro-oxidante, por ejemplo, un inhibidor de la sintesis de glutation tal como BSO; y/o nitrilotriacetato de hierro o sulfato de 5945301-1 JTOCHER ferroso. El HDACi puede ser cualquiera de los definidos anteriormente y en particular de los HDACi de clase I.

Los HDACi pueden ser:

un HDACi de benzamida que tiene la formula:

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en la que Y comprende uno o dos anillos de seis miembros, estando cada uno insaturado o parcialmente insaturado y siendo heterociclico o homociclico, con dos a ocho atomos de union y en la que cualquiera de los atomos de union o un anillo comprende un grupo amino y un grupo carbonilo; o un HDACi de hidroxamato que tiene la formula:

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en la que R es un enlace directo o un grupo etileno o etenileno, X es =CH- o =N-, R1 es arilo o heteroarilo y es mono- o bi-dclico y R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido con un grupo arilo o heteroarilo mono- o bi-dclico.

Tambien se desvela un metodo de tratamiento de un paciente con sospecha de tener un reservorio retroviral, que comprende administrar a dicho paciente el compuesto que contiene arsenico, que tambien puede incluir la administracion de al menos otro inductor del estres oxidativo, tal como un metalofarmaco modulador epigenetico sin hierro, por ejemplo compuestos que contienen oro, tales como la auranofina; un inhibidor de histona desacetilasa (HDACi); una molecula pro-oxidante, por ejemplo, un inhibidor de la sintesis de glutation tal como BSO; y/o nitrilotriacetato de hierro o sulfato ferroso. Se prefieren pacientes que presentan un recuento bajo de CD4. Dichos pacientes pueden estar sometidos o haber sido sometidos a terapia antirretroviral (TAR).

Todos los aspectos de la presente invencion pueden usarse en el tratamiento de los reservorios latentes de los retrovirus, que estan presentes en cada infeccion retroviral. La presente invencion puede usarse en el tratamiento de pacientes con sospecha de reservorios latentes de retrovirus. Dichos retrovirus se denominaran en el presente documento VIH-1.

El tratamiento tiene por objeto eliminar cualquier deposito latente del VIH-1. Sin embargo, se apreciara que dichos tratamientos tambien pueden usarse, menos preferentemente, para controlar retrovirus latentes. Esto puede ser ventajoso cuando un individuo es particularmente susceptible de reiniciar las infecciones a partir de los reservorios, por ejemplo. La destruccion selectiva de las celulas infectadas de forma latente descrita anteriormente es particularmente ventajosa.

Un reservorio latente es una celula o celulas que contienen el retrovirus ya sea en quiescencia o replicandose a tasas bajas, tales como a menos del 5 % de la tasa normal, de manera que la celula puede actuar para proteger el virus durante un periodo de tiempo, y con frecuencia solo libera viriones viables semanas o meses despues de que el tratamiento antirretroviral normal se haya detenido, requiriendo de este modo la continuacion del tratamiento del individuo, cuando la infeccion reaparece a traves de un reservorio de este tipo.

El tratamiento antirretroviral "normal" mencionado anteriormente y que se administra a individuos infectados con VIH-1, generalmente consiste en una combinacion de al menos tres farmacos diferentes que pertenecen a diferentes clases y normalmente se seleccionan entre inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosidicos/nucleotidicos (NRTI, del ingles nucleosidic/nucleotidic reverse transcriptase inhibitors), los inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosidicos (NNRTI, del ingles non-nucleosidic reverse transcriptase inhibitors) y los inhibidores de la proteasa (Pi). Un inhibidor de la fusion, o un bloqueante del receptor de quimiocinas tambien pueden formar parte del tratamiento. Recientemente, se ha anadido una clase adicional de farmaco, los inhibidores de la integrasa, al arsenal de farmacos antirretrovirales. Las combinaciones de farmacos antirretrovirales, en general, muestran la capacidad de bloquear la replicacion viral en curso, pero no tienen posibilidades de erradicar el virus del cuerpo.

En el presente documento se hace referencia a activos. Se apreciara que esto se refiere a los inductores de estres oxidativo, que se analizan en el presente documento.

Para la eliminacion de reservorios retrovirales, el tratamiento desvelado en el presente documento usa los presentes activos, junto con una terapia antirretroviral convencional, como es bien sabido en la tecnica y como se ha descrito anteriormente, por ejemplo.

Los activos pueden administrarse directamente al paciente en cualquier vehiculo farmaceuticamente aceptable adecuado, y por cualquier via adecuada, como puede determinarse por un experto o un medico. Los activos pueden administrarse por via oral o como una inyeccion o por parche transdermico, por ejemplo y pueden estar en solucion libre o unidos a un vehiculo. Otras formulaciones, tales como comprimidos, supositorios, cremas y pulverizaciones seran generalmente menos utiles, aunque pueden usarse si se considera apropiado.

La administracion adecuada puede ser simultanea o mediante entrega por separado. Los vehiculos adecuados pueden incluir liposomas dirigidos, que llevan anticuerpos adecuados, pero las celulas infectadas latentes se asocian en gran medida a la circulacion, por lo que la administracion por inyeccion intravenosa tambien se considera, aunque la via de administracion preferida para todos los compuestos de la presente invencion es la oral.

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Los inventores desvelan en el presente documento un metodo para la eliminacion selectiva de celulas infectadas de forma latente, en el que las celulas son infectadas de forma latente por un lentivirus, especialmente el VIH-1, dicho tratamiento comprende poner en contacto dichas celulas con un HDACi en combinacion con la terapia antirretroviral.

Se ha demostrado potenciacion (sinergia) entre muchos de los compuestos de la presente invencion con los HDACi. Esto tiene la ventaja anadida de reducir la cantidad de activos necesarios para el tratamiento del paciente.

Ademas, muchos de estos activos ya han sido aprobados para la administracion a seres humanos o han pasado la fase I de ensayos clinicos para determinar la seguridad.

Por tanto, la presente invencion proporciona adicionalmente el uso de los presentes activos en el tratamiento de la infeccion por VIH-1 latente y para la eliminacion selectiva de las celulas infectadas de forma latente.

Tambien se preve que los inhibidores de la sintesis de glutation tales como butionina sulfoximina (BSO) pueden usarse solos en el tratamiento de los reservorios retrovirales, es decir, en el tratamiento de celulas infectadas de forma latente, preferentemente dirigiendose y destruyendo selectivamente las celulas infectadas, pero no las no infectadas.

Pueden usarse combinaciones de cualquiera de los inductores de estres oxidativo (metalofarmacos moduladores epigeneticos sin hierro) e inhibidores de la sintesis de glutation descritos en el presente documento.

Los HDACi pueden ser HDACi de clase I. Los ejemplos de los mismos incluyen los descritos en Mai et al. 2009.

La siguiente seccion experimental es solo para ilustracion y no es limitante de la presente invencion.

Ejemplo 1 - Auranofina

METODOS

Induccion de VIH-1 en celulas U1 y ACH-2. Se incubaron celulas ACH-2 forma infectadas por VIH 1 de forma latente con los compuestos en placas de 96 pocillos en condiciones de cultivo convencionales (medio RPMI, suero bovino fetal al 10 %/FBS y antibioticos apropiados, que se cambiaron de tanto en tanto con el fin de evitar la selection de bacterias contaminantes resistentes a farmacos) y se midio el contenido de antigeno de nucleo de p24 de VIH-1 en el sobrenadante a las 24 y 72 h de incubation mediante kits ELISA de p24 de VIH-1 (Perkin elmers, Boston, MA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La viabilidad celular se ensayo para cada tratamiento despues de la recoleccion de los sobrenadantes, como se indica a continuation.

Ensayo de viabilidad celular. La viabilidad celular se cuantifico usando el procedimiento de metil tetrazolio (MTT). Los valores de absorbancia se generaron a una longitud de onda de 550 nm usando lectores de ELISA de 96 pocillos y se restan los valores de blanco usando medios de cultivo celular en ausencia de celulas. La viabilidad celular en presencia de los compuestos de ensayo se expreso como un porcentaje de la viabilidad celular de cultivos celulares control sin tratar.

Ensayo para la deteccion de los efectos combinados de dos farmacos. Para la detection de sinergia/antagonismo/aditividad, las celulas se incubaron con diferentes concentraciones ya sea de cualquiera de los farmacos solos o ambos farmacos en combinacion, y, de nuevo, la replication viral se cuantifico a los tres dias de incubacion mediante ensayos ELISA.

Citometna de flujo. Para determinar la expresion controlada por el LTR del VIH-1 de la proteina fluorescente verde (GFP) en los clones de celulas Jurkat, las celulas se agruparon y se lavaron tres veces en PBS enfriado con hielo con NaN3 (0,02 %) y albumina de suero bovino (2 %; PBS A/A). Despues, las celulas se fijaron en paraformaldehido al 1 % durante 20 min, se lavaron y se resuspendieron en PBS A/A. Despues, la fluorescencia se obtuvo mediante un citometro de flujo (FACScalibur, Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Los datos de fluorescencia se recogieron en una escala logaritmica 4-decada y la intensidad de fluorescencia relativa se expreso como el porcentaje de celulas fluorescentes mas alla del valor umbral establecido usando celulas Jurkat no transfectadas.

Deteccion de translocacion nuclear de NF-kappaB. Se obtuvieron extractos nucleares de celulas 8.4 Jurkat de control y celulas tratadas con auranofina en diferentes momentos de incubacion usando un kit de extraction nuclear (Chemicon International), siguiendo las instrucciones del fabricante. La translocacion nuclear de NF-kappaB se detecto usando un ensayo de factor de transcription colorimetrico (Millipore) para la subunidad p65. Los resultados se expresaron como un porcentaje de la senal obtenida en las celulas incubadas con la citocina estimulante potente de NF-kappaB, TNF-alfa (5 ng/ml) durante 1,5 h, momento en el que se alcanza el pico de la translocacion nuclear de NF-kappaB.

Analisis de los datos. Los experimentos se realizaron en, al menos, dos ocasiones diferentes con resultados similares y los resultados se muestran como medias. Los analisis se realizaron usando el software GraphPad. Para

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las curvas de dependencia de la concentration, los valores de porcentaje de control se representaron frente a las diferentes concentraciones de farmaco. Se aplico una transformation apropiada para restablecer la normalidad en caso necesario. Las lineas, o curvas, que mejor ajustan los puntos de datos se generaron mediante el metodo de minimos cuadrados. Se considera que el umbral para la signification era P = 0,05, en caso de regresion lineal, o R2 = 0,7, en caso de regresion no lineal. Se prefirio la regresion no lineal sobre la regresion lineal (tambien en el caso de que esta ultima fuera significativa), donde el R2 era superior. Las diferencias entre las respuestas a la concentracion de farmaco se analizaron mediante el ensayo t para determinar la pendiente.

La sinergia se analizo por medio de los valores de porcentaje de-sinergia, que representan la diferencia porcentual entre los efectos de la combination de farmacos y la suma de los efectos de cualquiera de los farmacos administrados por separado a concentraciones emparejadas, calculada como se indica a continuation:

PS — 100 ■ [Efarmaco A + farmaco B - (Efarmaco A + Efarmaco b)] / (Efarmaco A + Efarmaco b)

donde PS es el porcentaje de sinergia y E es el efecto del farmaco, expresado como el aumento de la production de p24. Se generaron graficos x, y.z tridimensionales (3D) mediante el trazado de los valores de porcentaje de sinergia (eje z) frente a las concentraciones los farmacos emparejados empleados (en los ejes x e y). Las superficies 3D se generaron usando Microsoft Excel. Las superficies altamente convexas indican sinergia. Las superficies planas indican un efecto aditivo, mientras que las superficies concavas muestran antagonismo.

RESULTADOS

Activacion del VIH-1 por auranofina en celulas U1 y ACH-2

Para evaluar preliminarmente los efectos activadores del VIH-1 de la auranofina en estirpes celulares en las que las etapas posteriores a la integration de la replication del VIH-1 son inducibles, se incubaron celulas ACH-2 linfoides T y U1 monociticas infectadas por VIH-1 con concentraciones crecientes del compuesto y la replicacion del VIH-1 se midio a las 24 h (datos no mostrados) y a las 72 h de incubation (La Fig. 2 muestra los datos de celulas ACH-2). Se usaron 5 ng/ml de TNF-alfa, una citocina que promueve potentemente la replicacion del VIH-1 mediante la induction de la activacion de NF-kappaB (p65/p50) como control positivo. Los resultados mostraron que la auranofina aumento la replicacion del VIH-1 en una forma dependiente del tiempo y de la dosis (P = 0,0295, ensayo t para la regresion; Fig. 5B) en el intervalo de concentraciones de 0,125-0,5 |jM, aproximandose a los niveles medios en plasma observados durante tratamiento de la artritis reumatoide [Benn et al., 1991].

Ha de observarse que el efecto activador del VIH-1 de la auranofina fue sinergico con el de MC2113, un HDACI de clase I de la biblioteca institucional de los inventores dotado con poca toxicidad [Rotili et al., 2009]. Esto se demostro en experimentos en los que la auranofina se administro conjuntamente con MC 2113 a las celulas U1 (Fig. 3). El efecto fue visible tan pronto como a las 24 h de incubacion.

La base celular para la respuesta a auranofina

Para evaluar la respuesta a la auranofina dentro de una poblacion celular, se uso el clon 8.4 de celulas Jurkat linfoides T infectadas de forma latente, establecido por Jordan et al. [Jordan et al., 2003]. Este clon de celula contiene la totalidad del genoma del VIH-1 bajo el control del LTR y presenta el gen GFP que reemplaza a nef. A diferencia de las celulas U1, estas celulas muestran niveles basales no significativas de expresion de VIH-1 y tienen un eje funcional Tat/TAR. En las celulas 8.4, la auranofina induce un cambio dependiente de la dosis en la fluorescencia (Fig. 4), que fue evidente sobre todo en las concentraciones mas altas adoptadas. Tambien se exploro la base celular para los efectos aditivos de la combinacion HDACI/auranofina. Los inventores descubrieron que la adicion de auranofina recluto las celulas que no respondian a HDACI a la poblacion de celulas que responden (Fig. 5).

Se obtuvieron resultados similares en otras estirpes celulares que expresan GFP bajo el control del LTR del VIH-1 y usando otras HDACi tales como el acido suberoilanilida hidroxamico (SAHA). Las celulas Jurkat A1 tienen un gen de proteina fluorescente verde (GFP) bajo el control del LTR del VIH-1, que esta quiescente en una portion de la poblacion celular. Estas celulas se trataron con una concentracion clinicamente relevante de auranofina (0,25 jM) o 1 jM de MC2113 o ambos. Los datos se presentan como el porcentaje de celulas fluorescentes mas alla de un umbral establecido usando celulas Jurkat que no expresan GFP. Estos datos demostraron la induccion de la expresion controlada por LTR de proteina verde fluorescente (GFP) por auranofina y un inhibidor de la histona desacetilasa no especifico de clase (SAHA).

Translocacion nuclear de NF-kappaB inducida por auranofina

Es bien sabido que el estres oxidativo provoca la activacion y la localization nuclear del heterodimero de NF-kappaB Rel A (p65)/p50 [Rahman et al., 2004], que es importante para la transcription y la replicacion del VIH-1 [Williams et al., 2007]. Si la auranofina activa el VIH-1 desde la quiescencia mediante la induccion de un estres oxidativo en las celulas diana, entonces, la translocacion nuclear de NF-kappa B (p65/p50) debe ser visible. Para ensayar esta hipotesis, alicuotas de extractos nucleares de celulas 8.4 Jurkat tratadas con auranofina (250 jM) se sometieron a

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un ensayo colorimetrico para la subunidad p65 (EREA) de NF-kappaB. Los resultados mostraron una acumulacion de NF-kappaB dependiente del tiempo dentro de los nucleos (Fig. 6). Se concluye que la auranofina induce la activacion de NF-kappaB (p65/p50) en condiciones similares a aquellas en las que se activa el VIH-1 a partir de la quiescencia.

Efectos sinergicos de la auranofina con otras estrategias pro-oxidantes

Para conseguir algo de conocimiento sobre la activacion del VIH-1 inducida por auranofina desde la quiescencia, los efectos del farmaco se ensayaron en presencia de algunas moleculas pro-oxidantes bien caracterizadas, es decir, nitrilotriacetato de hierro (FeNTA) [Savarino et al., 1999], que promueve el estres oxidativo a traves de la reaccion de Fenton, y butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor irreversible de la gamma-glutamil cisteina sintetasa, una enzima limitante en la v^a de sintesis de glutation [Anderson, 1998]. Los resultados mostraron que, de manera similar a la auranofina, FeNTA indujo de forma dependiente de la dosis la replication del VIH-1 en celulas ACH-2 (datos no mostrados), mientras que la BSO sola no tuvo ningun efecto sobre los efectos de la induction del VIH-1 a concentraciones de hasta 500 |jM (datos no mostrados). Cuando se coadministra con cualquiera de los dos agentes, la auranofina ejerce efectos sinergicos en la activacion del VIH-1, como se muestra por las superficies altamente convexas en los graficos de porcentaje de sinergia (Fig. 7 y 8). Se concluye que la auranofina potencia la activacion del VIH-1 inducida por hierro y que los efectos de este farmaco se ven reforzados por el agotamiento del glutation.

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EJEMPLO DE REFERENCIA 1 - HDACI

Las celulas ACH-2 linfodticas y las celulas U1 monodticas infectadas por VIH (mostrando ambas bajos niveles basales de replicacion de VIH-1) son modelos de estirpe celular bien establecidos para determinar la latencia del VIH-1 [Munier et al., 2005]. Se incubaron con los compuestos de ensayo en placas de 96 pocillos en condiciones de cultivo convencionales y la replicacion del VIH-1 se midio a las 72 h de incubacion mediante ensayo ELISA. La potencia de los compuestos sobre la induccion del VIH-1 se evaluo como el aumento en la replicacion del VIH-1 en presencia de una concentration convencional de 1 |jM del compuesto de ensayo (esta concentration se utiliza generalmente como un umbral para la selection de compuestos cabezas de serie), en comparacion con los niveles de referencia observados en los controles sin tratar. Los inventores descubrieron varios compuestos capaces de inducir la replicacion del VIH-1 en las celulas infectadas de forma latente y, en general, existe una buena concordancia entre los resultados en las celulas ACH-2 y U1.

Varios compuestos (HDACi selectivo o no selectivo de Clase I) mostraron una notable actividad estimulante del VIH- 1 (Tabla 1), que se relaciono con la destruction de celulas infectadas (celulas U1: P = 0,0378; ACH-2 celulas: P = 0,0017; ensayo no parametrica de Spearman (Figura 9 A,B)). Los compuestos selectivos de clase I, en general, mostraron menor toxicidad que los compuestos no selectivos (datos no mostrados). Ademas, algunos HDACi selectivos de Clase I que promueven la reactivation del VIH-1 indujeron la destruccion selectiva de las celulas infectadas por VIH-1. Esto se ejemplifica por los datos usando MC1855 (P < 0,01; ensayo t para la pendiente; Figura 9C, D).

A partir de las relaciones estructura/actividad, surgen requerimientos particulares para la induccion eficiente del escape del VIH-1 de la latencia. En general, los HDACi muestan un modelo farmacoforico general, que comprende un grupo caperuza (CAP) capaz de interactuar con el borde del tunel catalitico, con frecuencia con una unidad de conexion polar (UC), que une el CAP a un espaciador hidrofobo (EH), que permite que la molecula se extienda en el tunel [Mai et al., 2005b]. Por ultimo, el EH lleva en el extremo un grupo de union Zn2+ (GUC) que es capaz de de complejar el Zn2+ de la parte inferior de la cavidad [Mai et al., 2005b]. En general, el GUC consiste en un hidroxamato, carboxilato o una benzamida.

MS 275 es un HDACi selectivo de Clase I en ensayos clinicos para el tratamiento del cancer [Nishioka et 2008.; Hauschild et al., 2008]. Este compuesto fue el inductor mas potente del escape del de VIH-1 desde la latencia entre los compuestos ensayados, mostrando actividad en el intervalo nanomolar en las celulas ACH-2 (Figura 10) y U1 (no se muestra), dentro de las concentraciones plasmaticas que se pueden alcanzar in vivo [Zhao et al., 2007]. Los estudios SAR de los inventores no estan destinados a limitar los tipos quimicos de HADACi administrable con butionina sulfoximina (BSO) y los efectos sinergicos (vease a continuation) de HDACi con BSO son extensibles a toda la clase de HDACi.

La BSO, que induce el estres oxidativo, tambien se ensayo. BSO, un inhibidor de la gamma glutamil cisteina sintetasa [Garaci et al., 1996] (una enzima limitante en la sintesis de glutation), promueve el estres oxidativo indirectamente por la disminucion de la defensa antioxidante celular [Anderson, 1998]. Este compuesto se ensayo, ya que podria favorecer la activation de NF-kappa B, que se ve reforzada en un ambiente oxidativo. Los resultados mostraron que BSO no indujo significativamente la replicacion del VIH-1, en ninguna de las celulas ACH-2 o U1 (datos no mostrados). A pesar de esto, la BSO se ensayo para determinar si se podrian potenciar los efectos de HDACi. Los resultados mostraron que la BSO sorprendentemente aumento efectos de promover el VIH-1 de dos HDACi de benzamida, a saber, MS 275 y MC2211, como se muestra en las figuras 11 y 12. Las superficies 3D

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altamente convexas de la grafica de porcentaje de sinergia en las celulas ACH-2 apuntan a un efecto sinergico de las combinaciones de farmacos. Las concentraciones de BSO que muestran el efecto sinergico se pueden alcanzar terapeuticamente [Lacreta et al., 1994]. Se obtuvieron resultados similares en celulas U1 (datos no mostrados).

El descubrimiento de que la inhibicion de HDAC de clase I, que es por si misma suficiente para la reactivacion del VIH-1, es particularmente ventajosa.

Metodos

Quimica. Se determinaron los puntos de fusion en un aparato de punto de fusion Buchi 530 y estan sin corregir. se registraron espectros Infrarrojos (IR) (KBr) en un instrumento Perkin-Elmer Spectrum One.; los espectros de RMN 1H se registraron a 400 MHz en un espectrometro Bruker AC 400; los desplazamientos quimicos se presentan en unidades 5(ppm) con relacion a la referencia interna, tetrametilsilano (Me4Si). Todos los compuestos se comprobaron sistematicamente por TLC y RMN 1H. La TLC (cromatografia en capa fina) se realizo sobre placas de gel de silice con dorso de aluminio (Merck DC, Alufolien Kieselgel 60 F254) con las manchas visualizadas mediante luz UV. Todos los disolventes fueron de calidad de reactivo y, en caso necesario, se purificaron y se secaron por metodos convencionales. La concentracion de las soluciones despues de las reacciones y extracciones implico el uso de un evaporador rotatorio funcionando a una presion reducida de aproximadamente 2,66 kPa (20 Torr). Las soluciones organicas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. Los resultados analiticos estan dentro de ± 0,40 % de los valores teoricos. Una muestra de SAHA para ensayos biologicos se preparo tambien de acuerdo con metodos convencionales. Todos los productos quimicos se adquirieron de Aldrich Chimica, Milan (Italia) o de Lancaster Synthesis GmbH, Milan (Italia) y eran de la mas alta pureza [Mai et al. 2006].

Procedimiento general para la smtesis de esteres etilicos de acidos 4-(3,4-dihidro-4-oxo-6-sustituido-2- pirimidiniltio)metilcinamicos. Ejemplo: ester etfiico del acido 4-(3,4-dihidro-4-oxo-6-bencil-2- pirimidiniltio)metilcinamico. Una mezcla de 6-bencil-4-hidroxi-2-mercaptopirimidina (6,87 mmol, 1,5 g), 4- bromometilcinamato de etilo en bruto (7,56 mmol, 2,2 g) y carbonato de potasio anhidro (7,56 mmol, 1,0 g) en 3 ml de DMF anhidro se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Despues del tratamiento con agua fria (100 ml), la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (40 ml, 3 veces). La fase organica se lavo con salmuera (40 ml, 3 veces), se seco y se evaporo a sequedad para proporcionar el compuesto deseado en bruto, que se purifico mediante cromatografia en una columna de gel de silice, eluyendo con una mezcla acetato de etilo/hexano (1:1) para proporcionar el producto deseado en forma de un solido de color blanco (1,2 g). RMN 1H (CDCfe) 51,33 (t, 3H, CH2CH3), 3,83 (s, 2H, PhCH>), 4,26 (c, 2H, CH2CH3), 4,38 (s, 2H, CH2s), 5,98 (s, 1H, C5H), 6,40 (d, 1 H, CH = CHCO), 7,33 (m, 9H, dos anillos de benceno), 7,61 (d, 1H, CH=CHCO), 13,20 (s, 1H, NH). Anal. C, H, N, S [Mai et al. 2006].

Procedimiento General para la Smtesis de acidos 6-(3,4-dihidro-4-oxo-6-(no)sustituido-2-pirimidmiltio)- hexanoicos y acidos 4-(3,4-dihidro-6-sustituido-4-oxopirimidin-2-iltio)metilcmamicos. Ejemplo: acido 6-(3,4- dihidro-4-oxopirimidin-2-iltio)hexanoico. Una mezcla del ester de etilo apropiado (1,1 mmol, 0,3 g), KOH 2 N (8,8 mmol, 0,49 g) y EtOH (5 ml) se agito a temperatura ambiente durante 18 h. La solucion se vertio en agua (50 ml) y se extrajo con acetato de etilo (20 ml, 2 veces). Se anadio HCl (2 N) a la capa acuosa hasta que pH 5 y el precipitado se filtro y se recristalizo para producir el compuesto del fitulo (0,23 g) en forma de un solido puro. RMN 1H (DMSO-cfe) 81,32 (m, 2H, CH2CH2CH2S), 1,49 (m, 2H, CH2CH2CO), 1,61 (m, 2H, CH2CH2S), 1,93 (t, 2H, CH2CO), 3,06 (t, 2H, CH>s), 6,07 (s, 1 H, C5H), 7,83 (s, 1 H, CsH), 12,2 (s, 1 H, COOH). Anal. C, H, N, S [Mai et al. 2006].

Procedimiento General para la Smtesis de N-hidroxi-6-(3,4-dihidro-4-oxo-6-(no)sustituido-2- pirimidiniltio)hexanamidas y W-Hidroxi-4-(3,4-dihidro-6-sustituido-4-oxopirimidin-2-iltio)-metilcmamolamidas. Ejemplo: N-hidroxi-6-(3,4-dihidro-4-oxopirimidin-2-iltio)hexanamida A una solucion enfriada a 0 °C del acido carboxilico apropiado (0,9 mmol, 0,22 g) en tetrahidrofurano seco (5 ml enfria), se le anadieron cloroformiato de etilo (2,2 mmol, 0,21 ml) y trietilamina (2,3 mmol, 0,33 ml) y la mezcla se agito durante 10 min. El solido se retiro por filtracion y al filtrado se le anadio O-(2-metoxi-2-propil)hidroxilamina (5,4 mmol, 0,4 ml). La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 h, despues se evaporo a presion reducida y el residuo se diluyo en MeOH (5 ml). Se anadio resina de intercambio ionico Amberlyst 15 (0,18 g) a la solucion del O-hidroxamato protegido y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Despues, la reaccion se filtro y el filtrado se concentro al vacio para proporcionar el producto final en bruto, que se purifico por cristalizacion. RMN 1H (DMSO-cfe) 81,30 (m, 2H, CH2CH2CH2S), 1,46 (m, 2H, CH2CH2CO), 1,60 (m, 2H, CH2CH2S), 1,90 (t, 2H, CH2CO), 3,02 (t, 2H, CH2S), 6,10 (s, 1H, C5H), 7,85 (s, 1H, CsH), 8,66 (s, 1H, NHOH), 10,33 (s, 1H, NHOH), 12,5 (s, 1H, uracilo NH). Anal. C, H, N, S [Mai et al. 2006].

Procedimiento general para la smtesis de 3-(4-acilaminofenil)-N-hidroxi-2-propenamidas. Ejemplo: 3-[4-(2,3- Difenilpropionilamino)fenil]-N-hidroxi-2-propenamida (MC1895). Se anadieron cloroformiato de etilo (1,26 mmol, 0,12 ml) y trietilamina (1,37 mmol, 0,19 ml) a una solucion enfriada (0 °C) de acido 3-[4-(2,3-difenilpropionilamino) fenil]-2-propenoico (1,05 mmol, 0,39 g) en THF seco (10 ml) y la mezcla se agito durante 10 min. El solido se separo por filtracion, y se anadio O-(2-metoxi-2-propil)hidroxilamina (3,15 mmol, 23 ml) al filtrado. La solucion se agito durante 15 min a 0 °C, despues se evaporo a presion reducida y el residuo se diluyo en metanol (10 ml). Se anadio resina de intercambio ionico Amberlyst 15 (105 mg) a la solucion del O-hidroxamato protegido y la mezcla se agito a

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temperatura ambiente durante 1 h. Despues, la reaccion se filtro y el filtrado se concentro al vado para proporcionar el MC1895 en bruto que se purifico por cristalizacion. RMN 1H (DMSO-cfe) 5 3,05 (m, 1H, PhCH2), 5 3,60 (m, 1 H, PhCH2), 5 3,75 (m, 1 H, PhCHCO), 5 6,36 (d, 1 H, PhCH = CHCOOEt), 5 7,15-7,70 (m, 15H, protones de benceno y PhCH = CHCOOEt), 5 9,00 (s, 1H, OH), 5 10,23 (s, 1H, CONHPh), 5 10,85 (s, 1H, NHOH). Anal. C, H, N, O.

Inhibicion de enzimas de ma^z HD2, HD1-B y HD1-A in vitro. Se usaron histonas del nucleo de pollo marcadas radiactivamente como sustrato de la enzima de acuerdo con los procedimientos establecidos [referencia en: Mai et al., 2006]. La enzima libero acido acetico tritiado del sustrato, que se cuantifico por recuento de centelleo. Los valores de CI50 son los resultados de triples determinaciones. Una muestra de 50 |jl de enzima de maiz (a 30 °C) se incubo (30 min) con 10 microlitros histonas de reticulocitos de pollo premarcadas con [3H] (2 mg/ml) totales. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 36 microlitros de HCl 1 M/acetato 0,4 M y 800 microlitros de acetato de etilo. Despues de la centrifugacion (10000 g, 5 min), una parte alicuota de 600 microlitros de la fase superior se conto para determinar la radiactividad en 3 ml de coctel de centelleo liquido. Los compuestos se ensayaron a una concentracion de partida de 40 microM y sustancias activas se diluyeron adicionalmente. TSA y SAHA se utilizaron como los compuestos de referencia y se usaron disolventes blanco como controles negativos [Mai et al., 2006].

Ensayo de enzima HDAC1 de raton. Para el ensayo de inhibicion, se uso HDAC1 parcialmente purificado de higado de raton (cromatografia de intercambio anionico) como fuente de enzima. La actividad de HDAC se determino usando histonas de reticulocitos de pollo de premarcadas con [3H] como sustrato. Se incubo HDAC1 de raton (50 microlitros) con diferentes concentraciones de compuestos durante 15 min en hielo y se anadieron 10 jl de las histonas de reticulocitos de pollo de premarcadas con [3H] totales (2 mg/ml), dando como resultado una concentracion de 41 microM. La mezcla se incubo a 37 °C durante 1 h. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 50 microlitros de HCl 1 M/acetato de acetilo 0,4 M y 1 ml de acetato de etilo. Despues de la centrifugacion a 10000 g durante 5 min, una parte alicuota de 600 microlitros de la fase superior se conto para determinar la radiactividad en un coctel de centelleo liquido de 3 ml [Mai et al. 2006].

Ensayos celulares. Estirpes celulares y cultivos. La estirpe celular U937 se cultivo en RPMI con suero fetal de ternero al 10 %, 100 U/ml de penicilina, 100 microg/ml de estreptomicina y 250 ng/ml de anfotericina-B, HEPES 10 mM y glutamina 2 mM. Las celulas U937 se mantuvieron a la concentracion constante de 200000 celulas por mililitro de medio de cultivo. Se propagaron celulas de cancer de mama humano ZR-75.1 en medio DMEM complementado con suero fetal de ternero al 10 % y antibioticos (100 U/ml de penicilina, 100 microgramos/ml de estreptomicina y 250 ng/ml de anfotericina-B).

Ligandos y Materiales. Se disolvio SAHA en DMSO y se uso a 1 o 5 microM. Se disolvio MS-275 (regalo de Schering AG) en etanol y se uso a 5 microM. Se disolvieron compuestos de UBHA 1d y 1j en DMSO y se usaron a 1 o 5 microM.

Ensayos basados en celulas de HDAC1 y HDAC4 humanas. Se lisaron celulas (celulas U937 para el ensayo de HDAC1 y celulas ZR75.1 para el ensayo de HDAC4) en tampon IP (Tris-HCl 50 mM a pH 7,0, NaCl 180 mM, NP-40 al 0,15 %, glicerol al 10 %, MgCl2 1,5 mM, NaMO4 1 mM y NaF 0,5 mM) con un coctel inhibidor de proteasa (Sigma), DTT 1 mM y PMSF 0,2 mM durante 10 min en hielo y se centrifugaron a 13000 rpm durante 30 min. Despues, se diluyeron 1000 microgramos de extractos en tampon IP hasta 1 ml y se pre-aclararon mediante incubacion con 20 microlitros de A/G mas agarosa (Santa Cruz) durante 30 min a 1 h en una mesa oscilante a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a un nuevo tubo y se anadieron los anticuerpos (aproximadamente 3 a 4 jg) y se dejo proceder al IP durante la noche a 4 °C en una mesa oscilante. Los anticuerpos utilizados fueron HDAC1 (Abcam) y HDAC4 (Sigma). Como control negativo, la misma cantidad de los extractos de proteinas se inmunoprecipito con la correspondiente IgG purificada (Santa Cruz). El dia siguiente, se anadieron 20 microlitros de A/G y agarosa (Santa Cruz) a cada IP y la incubacion continuo durante 2 h. Las perlas se recuperaron por centrifugacion breve y se lavaron con tampon IP frio varias veces. Las muestras se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 20 microlitros de PBS esteril. El ensayo de HDAC se realizo de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Upstate). Brevemente, las muestras inmunoprecipitadas con HDAC4 y HDAC1 o con IgG purificada se agruparon por separado para homogeneizar todas las muestras. Despues, se incubaron 10 microlitros de IP con un peptido H4 marcado previamente con 3H-histona unido a perlas de estreptavidina agarosa (Upstate). En detalle, se usaron 120000 CPM de 3H-acetil-peptido H4 para cada tubo y se incubaron en tampon de HDAC 1* con 10 microlitros de la muestra en presencia o ausencia de inhibidores de HDAC con un volumen final de 200 jl. Las muestras se incubaron durante la noche a 37 °C en rotacion lenta. Al dia siguiente, se anadieron 50 jl de una solucion de inactivacion y 100 microlitros de las muestras se contaron por duplicado despues de una breve centrifugacion en un contador de centelleo. Los experimentos se han realizado por cuadruplicado [Mai et al., 2006].

Conservacion del compuesto. Los compuestos se conservaron en forma de polvos secos y se resuspendieron en dimetilsulfoxido (DMSO) en el momento de su uso. Las concentraciones iniciales en soluciones de DMSO se ajustaron con el fin de obtener concentraciones adecuadas de farmaco con menos de DMSO 2/1000 (v/v) en los medios de cultivo celular finales.

Ensayo de deteccion de reactivacion de VIH-1. Se incubaron celulas ACH-2 infectadas por VIH-1 de forma latente con los compuestos en placas de 96 pocillos en condiciones de cultivo convencionales (medio RPMI, suero fetal

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bovino al 10 %/FBS y los antibioticos apropiados, cambiados de tanto en tanto con el fin de evitar la seleccion de bacterias contaminantes resistentes a farmacos) y se midio el contenido de antigeno de nucleo de p24 de VIH-1 en el sobrenadante a las 72 h de incubacion mediante kits ELISA de p24 de VIH-1 (Perkin elmers, Boston, MA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La potencia de los compuestos sobre la induccion de escape del VIH-1 desde la latencia se evaluo como el aumento (%) en la replication del VIH-1 en presencia de una concentration patron de 1 microM, en comparacion con los niveles de referencia observados en los controles sin tratar. Se eligio la concentracion 1 |jM porque en general se considera que es un umbral para la seleccion de compuestos cabezas de serie. La viabilidad celular se ensayo para cada tratamiento despues de la recoleccion de los sobrenadantes, como se indica a continuation.

Ensayo de viabilidad celular: La viabilidad celular se cuantifico usando el procedimiento del metil tetrazolio (MTT) altamente normalizado (descrito en detalle en: Savarino A, Calosso L, Piragino A, Martini C, Gennero L, Pescarmona GP, Pugliese A. Modulation of surface transferrin receptors in lymphoid cells de novo infected with human immunodeficiency virus type-I.Cell Biochem Funct. Marzo de 1999; 17(1):47-55). Los valores de absorbancia se generaron a una longitud de onda de 450 nm usando lectores de ELISA de 96 pocillos y se restan los valores de blanco usando medios de cultivo celular en ausencia de celulas. La viabilidad celular en presencia de los compuestos de ensayo se expreso como un porcentaje de la viabilidad celular de cultivos celulares control sin tratar. Para los ensayos de destruction selectiva, se incubaron celulas H9 y U937 no infectadas y celulas H9iiib, ACH-2 y U1 infectadas por VIH-1 con los compuestos de ensayo durante siete dias y la viabilidad celular se midio como se ha descrito anteriormente.

Curvas de concentracion-respuesta. Se generaron curvas de concentracion-respuesta para los compuestos con las mejores actividades, mediante la incubacion de las celulas con concentraciones decrecientes de los compuestos (0,001-1 jM).

Ensayo para la deteccion de efectos de farmacos combinados. Para la detection de sinergia/antagonismo, las celulas se incubaron con diferentes combinaciones de BSO sola, el inhibidor de la histona desacetilasa solo, o ambos, y, de nuevo, la replicacion viral se cuantifico a los tres dias de incubacion mediante ensayos ELISA.

Analisis de los datos. Los experimentos se realizaron en al menos dos ocasiones diferentes con resultados similares y los resultados se muestran como medias. Los analisis se realizaron usando el software GraphPad. La correlation entre la destruccion celular/reactivacion del VIH-1 se evaluo trazando, para cada compuesto, el porcentaje de inhibition de la viabilidad de las celulas frente al aumento en la replicacion del VIH-1. La signification de la correlacion se evaluo mediante los coeficientes de correlacion de Spearman usando un umbral de significacion de P = 0,05. Para las curvas de concentracion-dependencia, los valores de aumento se representaron frente a las diferentes concentraciones. Se aplico una transformation apropiada para restablecer la normalidad en caso necesario. Se generaron las lineas, o curvas, que se ajustan mejor a los puntos de datos mediante el metodo de minimos cuadrados. Se considero que el umbral para la significacion era de P = 0,05, en el caso de la regresion lineal, o R2 = 0,7, en el caso de la regresion no lineal. La sinergia se analizo por medio de los valores de porcentaje de sinergia, que representan la diferencia porcentual entre los efectos de la combination de farmacos y la suma de los efectos del inhibidor de histona desacetilasa y el farmaco pro-oxidante administrados por separado a concentraciones emparejadas, calculada como se indica a continuacion:

PS — 100 ■ [Efarmaco A + farmaco B - (Efarmaco A + Efarmaco b)] / (Efarmaco A + Efarmaco b)

donde PS es el porcentaje de sinergia y E es el efecto de la concentracion de farmaco, expresado como el aumento de la production de p24.

Se generaron graficos x, y.z tridimensionales (3D) mediante el trazado de los valores de porcentaje de sinergia (eje z) frente a las concentraciones los farmacos emparejados empleados (en los ejes x e y). Las superficies 3D se generaron usando Microsoft Excel. Las superficies altamente convexas indican sinergia. Las superficies planas indican un efecto aditivo, mientras que las superficies concavas muestran antagonismo.

Tabla 1: Estructuras y potencias de diferentes compuestos en la induccion de la replicacion del VIH-1 en ______________________celulas linfociticas ACH-2 y celulas monociticas U1.______________________

Compuesto

Estructura HDAC inhibidas Clase qmmica Aumento (%) de p24 de VIH-1 a 1 pM (a menos que se especifique lo contrario)

Celulas ACH-2

Celulas U1

MC1855

0 Cj ^ Clase I Hidroxamatos 699 817

MC2111

0 £^nhoh Clase I Hidroxamatos 2.460 2.960

MC2113

0 Clase I Hidroxamatos 3.304 2.846

MC2195

0 UkAV Clase I Hidroxamatos 3.427 4.076

MC1895

o J H Clase I Hidroxamatos 2.981 3.747

MC1857

0 NE Hidroxamatos 1.655. 880

MC1864

O NE Hidroxamatos 1.145 995

MS275

0 ___, 0 QnViHp h2n Clase I Benzamidas 23.162 1.835

MC2211

0 Ij^NH u l-yI3 Clase I Benzamidas 2.025 4.811

Tabla 2: Actividad de inhibicion HDAC de los compuestos MC citados

Compuesto

Ref. Valores de CI50, nM % inhibicion a 5 |jM

HD1-B de maiz

HD1-A de maiz HDAC1 de raton IP HDAC1 IP HDAC4

MC1855

162 55 128 78,7 0

MC2111

58 42 620 73,6 0

MC2113

62 69 560 64,9 22,4

MC2195

11 8 69 46,7 93,1

MC2211*

Mai et al,, 2008

MC1857

72 80 291 79,3 N.D.

MC1864

89 64 305 55,0 60,4

MC1895

133 74 83 72,5 16,1

MS 275**

65,4 0

N.D., No determinado

* ensayado en HDAC1 y 4 recombinantes humanas.

** confirmado por los datos de la literatura que usando ensayos en HDAC recombinantes humanas.

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EJEMPLO DE REFERENCIA 2 - Trabajo adicional sobre HDACI + BSO

Para investigar las bases celulares de la sinergia entre HDACi y BSO, se utilizo el modelo de Jurkat para la quiescencia de VIH-1. Estos resultados se han obtenido a partir del clon de celulas Jurkat A1, que tiene una construccion integrada GFP/Tat bajo el control del LTR del VIH-1, que es inactivo en la mayoria de las celulas y por tanto permite examinar, por citometria de flujo, la activacion del promotor LTR en un nivel de una sola celula [Jordan a, et al. 2003]. Los resultados mostraron que la BSO reclutaron celulas insensibles a HDACI a la poblacion de celulas que responden (Figura 13). A diferencia de los resultados obtenidos para las mediciones de p24 en las celulas ACH-2 y U1, BSO sola indujo la activacion de LTR en una pequena proportion de las celulas.

Los cultivos celulares que replican VIH-1 muestran una disminucion de los niveles de glutation reducido [Simon G, et al 1994]. Se comparo la toxicidad de la combination BSO + HDACi en estirpes celulares no infectadas e infectadas de forma latente. Los resultados mostraron que, usando la BSO en combinacion con HDACi, hubo una citotoxicidad marcado a las 72 h de incubation en las celulas infectadas de forma latente, pero no en los cultivos celulares no infectados (Figura 14).

Esto esta apoyado por experimentos en celulas Jurkat no infectadas y clones de celulas Jurkat (6.3 y 8.4), que contienen un genoma de VIH-1 quiescente (con el gen GFP) bajo el control del LTR [Jordan a, 2003, infra]. Se descubrio que el clon de celulas 6.3 sucumbio mas facilmente a la combinacion MS-275/BSO que su homologo no infectado (Figura 14). Se obtuvieron resultados similares con el clon 8.4 (datos no mostrados).

En conclusion, los efectos de la BSO permiten amplificar la proporcion de celulas que responden a un tratamiento de reactivation del VIH-1 basado en HDACi. En general, el estres oxidativo inclina la balanza de la actividad HAT/HDAC hacia el aumento de la actividad HAT y el enrollamiento del ADN, facilitando de este modo la union de varios factores de transcription [Rahman I, et al 2004]. Esto sugiere usos clinicos importantes, porque un fenotipo abigarrado despues de la activacion, con solo una fraction de la poblacion de celulas activandose en respuesta a una senal global, tambien se demostro por Jordan et al. 2004 [se cita a continuation], quien atribuye este fenomeno a los diferentes entornos de cromatina locales.

Ademas de amplificar el efecto de los inhibidores de la histona desacetilasa, los resultados del presente estudio permiten la hipotesis de que la estrategia de utilization de agentes pro-oxidantes tales como la BSO en combinacion con HDACi es capaz de inducir la destruction selectiva de las celulas infectadas de forma latente. Esta estrategia puede ser considerada como una de las estrategias largamente codiciadas "golpear y destruir". Estas estrategias consisten en la induction, a traves de farmacos, de la activacion del VIH-1 desde la quiescencia (es decir, la fase de "golpear"), en presencia de TAR (para bloquear la propagation viral), seguido de la elimination de las celulas infectadas (es decir, la fase de "destruir"), ya sea a traves de medios naturales (por ejemplo, la respuesta inmunitaria, la citopatogenicidad viral) o medios artificiales (por ejemplo, farmacos, anticuerpos monoclonales, etc.) [Hamer DH, 2004]. De hecho, la estrategia de los inventores se basa en un HDACi, que activa la replication del VIH- 1 en las celulas infectadas de forma latente (es decir, la fase de "golpear"), en combinacion con un agente pro- oxidante tal como la BSO, que amplifica el dano celular debido al descenso inducido por VIH-1 en los niveles intracelulares de glutation reducido (es decir, la fase de "destruir"). La busqueda de una combinacion de farmacos capaces de ejercer dichos efectos, hasta el momento, ha sido un "Santo Grial" en la investigation del SIDA.

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Referencias para el ejemplo de referencia 2

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EJEMPLO 2 - Trioxido de arsenico

Las sales de oro y los arsenicales comparten una serie de efectos biologicos y ahora se estan mostrando prometedores como metalofarmacos potencialmente epigeneticos con varias aplicaciones en medicina. Su uso terapeutico en otras patologias tiene una tradicion antigua, por supuesto. Aunque el arsenico se considera que es un elemento que muestra tanto propiedades metalicas como no metalicas, se comporta como un metal en muchos aspectos. En su forma elemental mas comun (arsenico gris), que tiene una naturaleza de tipo metalica y conduce la electricidad. Al igual que las sales de oro, los arsenicales se han empleado terapeuticamente desde el siglo 5° antes de Cristo. Hipocrates usaba rejalgar (As2S2) y oropimente (As2S3) como remedio para las ulceras. La medicina tradicional china usaba arsenicales, en combinacion con oro para el tratamiento de diversas afecciones. Olimpiodoro de Tebas (siglo 5° dC) asaba sulfuro de arsenico y obtenia arsenico blanco (As2O3, pero tambien puede encontrarse como As4Os). Tanto las sales de oro como los compuestos de arsenico descubiertos mas tarde, entre otros usos, tienen aplicaciones como antirreumaticos, antisifiliticos y antitumorales [vease Eisler, 2003, Giordano, 1844, Christison y Griffith, 1848, Cutler y Bradford, 1878, Waxman et al., 2001, Park et al., 2008]. El arsenico tambien es conocido como un veneno, cuando se usa en dosis mas altas.

El uso de sales de trioxido de arsenico y oro fue abandonado poco a poco en el siglo pasado, limitando el uso del trioxido de arsenico a la leucemia promielocitica cronica y las sales oro a la artritis reumatoide. En la ultima decada, sin embargo, el interes de estos tipos de medicamentos se ha reavivado a la luz del descubrimiento de sus efectos epigeneticos, es decir, la capacidad de inducir modificaciones en la estructura del ADN sin alterar la secuencia de bases. Las modificaciones estructurales del ADN tales como el enrollamiento/desenrollamiento regulan la expresion genica. La investigacion adicional demostro que las sales de trioxido de arsenico y oro comparten similitudes importantes en sus efectos a nivel celular, lo que podria explicar las aplicaciones terapeuticas similares que ambos tipos de farmacos han encontrado durante su historia. Tanto las sales de trioxido arsenico como las de oro inducen especies reactivas del oxigeno (ERO).

Se sabe que el estres oxidativo inclina el equilibrio de la actividad HAT/HDAC hacia el aumento de la actividad HAT y el desenrollamiento del ADN, lo que facilita la union de varios factores de transcripcion [Rahman et al., 2004]. Curiosamente, tanto los compuestos que contienen trioxido de arsenico como los que contienen oro inhiben la tiorredoxina reductasa y actuan como mimeticos de la superoxido dismutasa (SOD). Por tanto, a la luz de estos efectos y los efectos epigeneticos habituales, tales como la induccion de la actividad HAT, los compuestos de oro y los arsenicales estan empezando a ser considerados como un unico tipo de farmaco [Talbot et al., 2008].

Esta clase de farmacos, que comprenden arsenicales y compuestos de oro, se denominaran en adelante "metalofarmacos epigeneticos", es decir metalofarmacos que tienen efectos epigeneticos. Otros metalofarmacos que se sabe que activan el VIH-1 desde la latencia, tales como los compuestos que contienen hierro y cisplatino [Savarino et al., 1998; Spandidos et al., 1990], no muestran los efectos prodiferenciadores de los compuestos de oro y los arsenicales.

Ademas, los iones de oro y arsenico comparten la capacidad de bloquear el sitio activo de la tiorredoxina reductasa (TrxR) formando complejos directamente con el residuo selenocisteina importante para la actividad reductora de estas proteinas. Esta actividad de la auranofina es compartida con el trioxido de arsenico [Liu et al. 2007]. Los derivados de oro (I) y el trioxido de arsenico aparecen como muy buenos inhibidores de la tiorredoxina reductasa, presentando unos valores de CI50 en el intervalo nanomolar (CI50 < 300 nM), mientras que los iones metalicos y los complejos metalicos son activos en el intervalo micromolar (de 19 a 80 |jM) [Bragadin et al., 2004; Lu et al., 2007]. Otra actividad compartida por el trioxido de arsenico y un derivado de oro (I) tal como la auranofina es la capacidad unica de suprimir la sintesis de TrxR [Talbot et al., 2008].

Los inventores han demostrado en el Ejemplo 1 que el compuesto que contiene oro, auranofina, es capaz para inducir el escape del VIH-1 desde la latencia in vitro a concentraciones que imitan las que se encuentran en el plasma de los seres humanos con artritis reumatoide. Si la teoria de los inventores es correcta, los efectos del compuesto que contiene oro, auranofina, en el escape del VIH-1 desde la latencia tambien deberian ser ejercidos por los arsenicales.

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El trioxido de arsenico tiene un potencial epigenetica bien documentado, un perfil de toxicidad bien descrito y su uso clmico es relativamente seguro en ciertas dosis.

Los inventores ensayaron primero la respuesta al trioxido de arsenico en clones de celulas Jurkat con un gen integrado que codifica la proteina de fluorescencia verde (GFP) bajo el control del LTR del VIH-1 [Jordan et al., 2003].

Los experimentos se realizaron de acuerdo con las tecnicas descritas exhaustivamente en el Ejemplo 1. En estos clones de celulas Jurkat, la induccion de GFP por HDACI fue evidente solo en una fraccion de las celulas y aumento en respuesta al trioxido de arsenico de una manera dependiente de la concentracion (Figura 15).

Para evaluar la respuesta al trioxido de arsenico dentro de una poblacion celular que contiene el genoma entero del VIH-1, se han utilizado clones de celulas Jurkat linfoides T 6.3 y 8.4 infectados de forma latente, establecidos por Jordan et al. [Jordan et al., 2003]. Estos clones de celulas contienen el genoma del VIH-1 bajo el control del LTR y presentan el gen GFP que reemplaza a nef. A diferencia de las celulas U1, estas celulas muestran niveles basales no significativos de expresion de VIH-1 y tienen un eje Tat/TAR funcional. En las celulas 8.4, el trioxido de arsenico induce un cambio dependiente de la dosis en la fluorescencia (datos no presentados), que fue evidente sobre todo en las concentraciones mas altas adoptadas.

Los inventores llegan a la conclusion de que el efecto del trioxido de arsenico reproduce exactamente los de la auranofina en modelos de estirpe celular para la latencia del VIH 1. De forma similar a la auranofina, el cisplatino fue capaz de activar el VIH-1 latente a concentraciones en el intervalo nanomolar. La auranofina y el trioxido de arsenico no comparten sus efectos con otros metalofarmacos tales como el cisplatino, que activa el VIH-1 quiescente en el intervalo de concentraciones micromolar en lugar de en el intervalo nanomolar [Spandidos et al., 1990]. Los resultados de los inventores apoyan la idea de que los derivados de oro (I) y el trioxido de arsenico deben considerarse como pertenecientes a una unica clase de farmacos moduladores epigeneticos. De forma similar a la auranofina, el trioxido de arsenico puede encontrar una aplicacion en estrategias de "ahuyentado" para purgar el VIH-1 de los reservorios.

Los inventores han demostrado en los ejemplos 2 y 3 que puede obtenerse un efecto "golpear y destruir" en modelos de estirpes celulares para la latencia del VIH-1 mediante la combinacion de los inhibidores de histona desacetilasa de clase I (HDACI) con butionina sulfoximina, un inhibidor de la gamma-glutamil cisteina sintetasa, es decir, una enzima limitante para la sintesis del glutation [Savarino et al., 2009].

El glutation es sin duda una defensa antioxidante importante, sin embargo, la BSO sola era incapaz de inducir el escape del VIH-1 desde la latencia, solo escasamente. Es probable que esto se explique por el hecho de que la BSO no provoca en si misma un estres oxidativo, sino que mas bien deteriora la capacidad de una poblacion de celulas para contrarrestar el estres oxidativo inducido por los HDACI [Palamara et al., Datos no publicados]. En este contexto, la auranofina y el trioxido de arsenico son capaces por si mismos de inducir estres oxidativo probablemente a traves de sus efectos mimeticos de la superoxido dismutasa y son capaces de contrarrestar la defensa antioxidante mediante la inhibicion de los TrxR. Estos efectos podrian representar un paso adelante en el aprovechamiento del estres oxidativo como un medio para combatir la latencia del VIH-1.

Recientemente, Chomont et al. identificaron a los linfocitos T CD4+ de memoria transitorios (Ttm) como el principal reservorio para la latencia del VIH-1 en individuos en tratamiento antirretroviral (TAR) y que presentan un recuento bajo de CD4 [Chomont et al., 2009]. Los Ttm son precursores de los linfocitos T CD4+ de memoria (Tcm), que representan un reservorio de VIH-1 mas estable y sobreviven durante anos. En comparacion con los Tcm, los Ttm presentan un fenotipo menos diferenciado y proliferan en respuesta a la IL-7, una citocina que induce la proliferacion de celulas madre. Con el fin de obtener la erradicacion del VIH-1 de individuos tratados con TAR y con recuentos bajos de CD4, Chomont et al. abogan por el tratamiento con una "quimioterapia dirigida inteligente", que, en combinacion con el TAR, sea capaz de inhibir la proliferacion de linfocitos T y disminuir las celulas madre con el fin de evitar la generacion de un reservorio de Tcm de larga duracion. Los autores, sin embargo no pudieron identificar farmacos candidatos adecuados. Sin embargo, los efectos inductores del VIH-1 del trioxido de arsenico (que permite la eliminacion de las celulas infectadas mediante la citopatogenicidad viral o el sistema inmunitario), anadidos a sus efectos antiblasticos bien conocida sobre los linfocitos, asi como su marcada actividad prodiferenciadora harian de este farmaco un candidato ideal para los ensayos clinicos de erradicacion del VIH-1.

Referencias para el Ejemplo 2

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Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un inductor de estres oxidativo para su uso en el tratamiento de una infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) latente, en donde dicho inductor de estres oxidativo es la auranofina o el oxido de arsenico

   5 que es As2O3 o As4O6; en donde la auranofina o el oxido de arsenico inducen la activacion del VIH-1 desde la quiescencia y son un modulador epigenetico; y en donde el tratamiento incluye, ademas, la terapia antirretroviral.
2. 2. Un inductor de estres oxidativo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente el 10 uso de butionina sulfoximina (BSO) y/o nitrilotriacetato de hierro o sulfato ferroso.