ES2599635T3 - Inmunoanálisis para la cuantificación de un antígeno inestable seleccionado de BNP y proBNP - Google Patents

Inmunoanálisis para la cuantificación de un antígeno inestable seleccionado de BNP y proBNP Download PDF

Info

Publication number
ES2599635T3
ES2599635T3 ES08736833.8T ES08736833T ES2599635T3 ES 2599635 T3 ES2599635 T3 ES 2599635T3 ES 08736833 T ES08736833 T ES 08736833T ES 2599635 T3 ES2599635 T3 ES 2599635T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
bnp
probnp
order
antibody
immunocomplex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08736833.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Natalia N. Tamm
Alexey G. Katrukha
Vladimir L. Filatov
Olga V. Kolosova
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hytest Ltd
Original Assignee
Hytest Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hytest Ltd filed Critical Hytest Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2599635T3 publication Critical patent/ES2599635T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format
    • G01N2470/06—Second binding partner specifically binding complex of analyte with first binding partner

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método de inmunoanálisis para la detección de una proteína de BNP o proBNP en una muestra, que comprende (a) poner en contacto la proteína con un primer anticuerpo específico para un epítopo situado en el fragmento de proteína BNP o proBNP, que tiene la secuencia de aminoácidos FGRKMDRISSSS, representada en la SEQ ID nº: 3, para obtener un inmunocomplejo de primer orden, (b) poner en contacto el inmunocomplejo de primer orden obtenido en la etapa (a) con un segundo anticuerpo que reconoce dicho inmunocomplejo de primer orden, y que es específico para un epítopo situado en el inmunocomplejo de primer orden, formando el epítopo cuando el primer anticuerpo se une a la proteína BNP o proBNP o a uno de sus fragmentos que consiste en la SEC ID nº: 3, para obtener un inmunocomplejo de segundo orden, en donde dicho segundo anticuerpo es incapaz de reconocer BNP libre, proBNP libre o primer anticuerpo libre, o los reconoce con afinidad significativamente menor - veces o menos - de lo que los reconoce el inmunocomplejo de primer orden, y (c) detectar la formación del inmunocomplejo de segundo orden, en donde la proteína analizada ha mejorado la estabilidad aparente en comparación con la de una proteína analizada utilizando anticuerpos específicos para epítopos situados a distancia de BNP o proBNP.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
DESCRIPCION
Inmunoanalisis para la cuantificacion de un antlgeno inestable seleccionado de BNP y proBNP Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a inmunoanalisis, y proporciona un metodo de inmunoanalisis para la detection de antlgenos inestables. El metodo es especialmente adecuado para la deteccion de BNP, proBNP y uno de sus fragmentos.
Antecedentes de la invencion
BNP y proBNP son marcadores fiables de la insuficiencia cardlaca (IC), ampliamente utilizado en la practica cllnica. Varios tipos de inmunoanalisis de tipo sandwich (analisis convencionales) que utilizan dos anticuerpos monoclonales o policlonales, especlficos para diferentes epltopos de BNP o fragmentos de BNP de la molecula de proBNP se describen en la bibliografla.
La molecula de BNP es conocida como una molecula sumamente inestable que pierde rapidamente su actividad inmunologica en soluciones acuosas. Esta perdida de actividad esta relacionada generalmente con la degradation proteolltica del peptido. Los inmunoanalisis de tipo sandwich frecuentemente utilizado para inmunodeteccion cualitativa o cuantitativa de antlgenos utilizan dos o mas anticuerpos especlficos para dos o mas epltopos diferentes. Cuanto mayor es la distancia entre los epltopos, mayor es la probabilidad de que los puntos de proteolisis esten situados entre los epltopos de los anticuerpos, aumentando as! la sensibilidad del ensayo a la degradacion proteolltica del antlgeno. Y viceversa, cuanto mas proximos esten los epltopos entre si, menor es la probabilidad de la escision proteolltica de la molecula entre los epltopos.
Se han descrito metodos de inmunoanalisis para moleculas muy pequenas, incluida la aplicacion de los llamados anticuerpos antimetatipo. Dichos metodos estan descritos, p. ej., para la deteccion de digoxina (Self et al., 1994, Clin. Chem. 40:2035-2041) y angiotensina II (Towbin et al., 1995, J. Immunol. Meth. 181:167-176 ).
Sin embargo, no es una tarea facil aplicar este tipo de metodo a diferentes analitos, ya que se requieren anticuerpos monoclonales muy especlficos en dicho metodo.
En tecnicas relacionadas existen varias publicaciones cientlficas y tambien de patente que describen anticuerpos NT-proBNP, proBNP y BNP e inmunoanalisis.
Karl et al. (Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1999, vol. 59, supl. 230, pags. 177-181) describen un inmunoanalisis muy sensible y especlfico que utiliza dos anticuerpos, el primero que es especlfico para el peptido 1-21 NT-proBNP y el segundo especlfico para el peptido 30-38 NT-proBNP.
Teramura et al., (Anal. Biochem., 2006, vol. 357, pags. 208-215) describen la deteccion de BNP utilizando un inmunoanalisis de tipo sandwich y utilizando un anticuerpo monoclonal primario y secundario, reconociendo los aminoacidos 30-32 y 14-21 de BNP.
Ala-Kopsala et al. (Clin. Chem., 2004, vol. 50, pags. 1576-1588) describen quince peptidos sinteticos, que abarcan la secuencia de NT-proBNP, y se utiliza como epltopos para producir anticuerpos.
Matsuura et al. (Anal. Chem., 2005, vol. 77, pags. 4235-4240) describen un enzimoinmunoanalisis para la determinacion de BNP, utilizando anticuerpos dirigidos a toda la secuencia de BNP.
Collinson et al., (European J. of Heart Failure, 2004, vol. 6, pags. 365-368) describe un metodo de inmunoanalisis para la determination de NT-proBNP usando anticuerpos policlonales dirigidos contra los restos 1-21 y 39-50 del NT-proBNP.
Shimizu et al., (Clin. Chim. Acta, 2003, vol. 334, pags. 233-239) investigan por radioinmunoanalisis las formas de proBNP en sangre, utilizando anticuerpos contra cuatro peptidos proBNP sinteticos.
El documento WO 2006/088700 describe anticuerpos BNP anular, especlficos humanos e inmunoanalisis que utilizan dichos anticuerpos.
La patente EP 1 016 867 describe un inmunoanalisis para la determinacion de BNP, utilizando anticuerpos, que se dirigen al fragmento del terminal C y al del terminal N de BNP, as! como la estructura anular de BNP.
Los documentos WO 2007/056507 y WO 2007/138163 se publicaron despues de la fecha de prioridad de la presente solicitud. Ambos describen anticuerpos que son especlficos para la secuencia del terminal N de BNP.
10
15
20
25
30
35
40
45
Descripcion de la invencion
En la presente memoria los autores estan describiendo un inmunoanalisis para la cuantificacion de BNP y proBNP en la sangre humana. Los autores han denominado el ensayo "sandwich desigual". Este ensayo es aplicable a la inmunodeteccion de todos los antlgenos inestables.
El inmunoanalisis descrito en la presente solicitud utiliza dos anticuerpos monoclonales diferentes. En la deteccion de BNP o proBNP el primer anticuerpo monoclonal (MAb 24C5) es especlfico de la region (o una parte de esta region) que comprende los restos de aminoacidos 11-22 (11FGRKMDRISSSS22) de BNP (que corresponden a los restos de aminoacidos 87 a 98 de proBNP) (Fig. 1). El segundo anticuerpo (es decir, los MAb Ab-BNP2 y Ab-BNP4), o uno de sus fragmentos, marcado con un componente que produce la senal, reconoce un inmunocomplejo del primer anticuerpo con el antlgeno (BNP, proBNP o uno de sus fragmentos que comprende los restos de aminoacidos 11FGRKMDRISSSS22 o una parte de esta secuencia que comprende al menos tres restos de aminoacidos de dicha secuencia). El segundo anticuerpo no reconoce (o reconoce con muy baja afinidad 10 veces o menos) el antlgeno libre o sus fragmentos, o MAb 24C5 libre. Por lo tanto el inmunocomplejo primario que comprende MAb 24C5 y BNP (o proBNP, o uno de sus fragmentos) sirve como un antlgeno para el segundo anticuerpo (los Ab-MAb BNP2 y Ab-BNP4).
Por consiguiente, el objeto general de la presente invencion es un metodo de inmunoanalisis para la deteccion de un antlgeno inestable en una muestra, que comprende
(a) poner en contacto un antlgeno de interes con un primer anticuerpo especlfico para un primer epltopo de la molecula de antlgeno, para obtener un inmunocomplejo de primera orden,
(b) poner en contacto el inmunocomplejo de primer orden obtenido en la etapa (a) con un segundo anticuerpo, que reconoce dicho inmunocomplejo de primer orden y es especlfico para un segundo epltopo formado por el antlgeno de interes y el primer anticuerpo, para obtener un inmunocomplejo de segundo orden, en donde dicho segundo anticuerpo es incapaz de reconocer al antlgeno libre o uno de sus fragmentos o al primer anticuerpo libre, o los reconoce con afinidad significativamente menor - 10 veces o menos - que reconocen al inmunocomplejo de primer orden, y
(c) detectar la formation de inmunocomplejos de segundo orden.
Un objeto especlfico de la invencion es un metodo de inmunoanalisis para detectar un antlgeno seleccionado del grupo que consiste en BNP, proBNP y uno de sus fragmentos en una muestra, que comprende
(a) poner en contacto el antlgeno con un primer anticuerpo especlfico para el fragmento 11FGRKMDRISSSS22 de la molecula BNP o para una parte de este peptido que comprende al menos tres restos de aminoacidos de dicha secuencia, para obtener un inmunocomplejo de primer orden,
(b) poner en contacto el inmunocomplejo de primer orden obtenido en la etapa (a) con un segundo anticuerpo que reconoce dicho inmunocomplejo de primer orden, para obtener un inmunocomplejo de segundo orden, en donde dicho segundo anticuerpo es incapaz de reconocer BNP libre, proBNP o uno de sus fragmentos o al primer anticuerpo libre, o los reconoce con afinidad significativamente menor - 10 veces o menos - que lo reconoce el inmunocomplejo de primer orden, y
(c) detectar la formacion de inmunocomplejos de segundo orden.
Los autores han logrado producir anticuerpos monoclonales especlficos aplicables en el procedimiento de la invencion. Estos anticuerpos son objetos especlficos de la presente invencion.
El sandwich desigual descrito en la presente memoria demuestra extraordinaria insensibilidad a la degradation proteolltica del antlgeno en comparacion con los ensayos que utilizan anticuerpos especlficos para epltopos situados a distancia.
Tambien dicha estrategia podrla ser util en los casos donde se desarrolla el ensayo para la inmunodeteccion del antlgeno que es similar a uno u otros antlgenos mas; tiene numerosos epltopos diferentes en su superficie, pero tiene solo uno (o mas, pero en numero muy limitado) de epltopos unicos, que distingue a ese antlgeno concreto de todos los demas.
Breve descripcion de los dibujos
Fig. 1. Estructuras de BNP y proBNP y especificidad de epltopo del MAb 24C5.
MAb 24C5 reconoce fragmentos de la molecula BNP que comprende los restos de aminoacidos 11-22 y fragmentos de proBNP que consiste en restos de aminoacidos 87-98 (marcados en oscuro).
Fig. 2A, 2 B y 2 C. Los anticuerpos Ab-BNP2 y Ab-BNP4 no reconocen a BNP ni a proBNP que no forman complejos con MAb 24C5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Los MAb marcados con Eu 24C5, Ab-BNP2, Ab-BNP4 (200 ng/pocillo) se incubaron en placas recubiertas con:
A. 50 ng/pocillo de BNP
B. 100 ng/pocillo de proBNP
C. anticuerpos policlonales anti-BNP (2 mg/pocillo) preincubados con BNP (0,5 ng/pocillo)
Fig. 3. Los anticuerpos Ab-BNP2 y Ab-BNP4 pueden reconocer a inmunocomplejos de BNP (o peptido 11-22) con MAb 24C5
Protocolo de ensayo en tres etapas:
Primera etapa: las placas se recubrieron previamente con MAb 24C5 de captura
Segunda etapa: Despues de lavar las placas se incubaron con antlgenos (BNP o peptido 11-22);
Tercera etapa: Despues de lavar las placas se incubaron con anticuerpos (Ab-BNP2, Ab-BNP4 o 57H3) de deteccion (marcados con Eu3+).
Despues del lavado se anadio solucion de mejora y se midio la senal.
Fig. 4. Los anticuerpos Ab-BNP2 y Ab-BNP4 pueden reconocer a proBNP, que forma inmunocomplejos con MAb 24C5
Protocolo de ensayo en tres etapas:
Primer etapa: Las placas se recubrieron previamente con MAb 24C5 de captura Segunda etapa: Despues de lavar las placas se incubaron con proBNP (5 ng/ml)
Tercera etapa: Despues de lavar las placas se incubaron con anticuerpos de deteccion (Ab-BNP2, Ab-BNP4 o 57H3).
Despues del lavado se anadio solucion de mejora y se midio la senal.
Fig. 5. Estabilidad de BNP en plasma humano normal.
Se anadio BNP sintetico a una mezcla de plasma humano normal (2 ng/ml), se incubo a +4°C durante diferentes perlodos. La actividad inmunologica se puso a prueba en tres ensayos diferentes: uno convencional y dos de tipo sandwich desiguales.
Fig. 6. Determinaciones de BNP/proBNP en la sangre de pacientes con IC y donantes sanos. Las muestras de plasma de 6 pacientes con insuficiencia cardlaca (IC 1 - IC 6) y las muestras de plasma de donantes sanos (NP1- NP4) se analizaron en tres ensayos. Se utilizo BNP sintetico (Bachem) como calibrador en todos los ensayos.
Fig. 7A, 7 B y 7 C. Curvas de calibracion para dos sandwiches desiguales (24C5 - Ab-BNP2, 24C5 - Ab-BNP4) y un ensayo convencional (50E1 - 24C5-UE). Antlgeno: BNP sintetico (Bachem).
Experimentacion
Observaciones: estable En todos los experimentos se utilizaron como anticuerpos de deteccion anticuerpos marcados con quelato de Eu. Los anticuerpos monoclonales 24C5, Ab-BNP2, Ab-BNP4, 57H3 y 50E1 utilizados en los experimentos estan disponibles en Hytest Ltd, Turku, Finlandia.
Ejemplo 1. Los anticuerpos Ab-BNP2 y Ab-BNP4 no reconocen a BNP ni a proBNP que no forman complejos con MAb 24C5 (Fig. 2 )
En el experimento presentado en la Fig. 2A y Fig. 2B se utilizaron antlgenos (BNP y proBNP, respectivamente) para el recubrimiento de placas y anticuerpos marcados con Eu se ensayaron con el antlgeno en inmunoanalisis directo. El anticuerpo 24C5 reconoce ambas formas de antlgeno, mientras que los MAb Ab-BNP2 y Ab-BNP4 no dan ninguna respuesta (senal comparable con el fondo) con ninguno de los dos antlgenos.
En el experimento presentado en la Fig. 2C las placas se recubrieron con anticuerpos policlonales especlficos para diferentes epltopos en la molecula de BNP. En la segunda etapa, las placas se incubaron con BNP y a continuacion con anticuerpos marcados con Eu. Este metodo ayuda a obtener orientacion variable del antlgeno contra la superficie de la placa, asegurando que la orientacion de la molecula en la superficie de la placa no tiene influencia en los resultados experimentales. En este experimento se obtuvieron los mismos resultados que los descritos anteriormente: los MAb Ab-BNP2 y Ab-BNP4 no fueron capaces de reconocer el antlgeno, que no esta formando complejo con MAb 24C5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 2. Los anticuerpos Ab-BNP2 y Ab-BNP4 puede reconocer a BNP y al peptido 11-22, que se estan formando inmunocomplejo con MAb 24C5 (Fig. 3)
MAb 24C5 es especlfico para el fragmento 11 a 22 de la molecula de BNP o para la region correspondiente 87-98 de proBNP. Para demostrar que el inmunocomplejo 24C5-BNP y 24C5-peptido 11-22 podrla ser reconocido por los MAb Ab-BNP2 y Ab-BNP4 se utilizo el MAb 24C5 para el revestimiento de placas, a continuacion se incubaron las placas con BNP o peptido sintetico correspondiente a los aminoacidos 11- 22 de la secuencia de BNP (peptido 1122). Una vez formado el inmunocomplejo entre MAb 24C5 y antlgenos, las placas se incubaron con anticuerpos marcados con Eu Ab-BNP2, Ab-BNP4 y 57H3, especlficos para la region 26-32 de la molecula de BNP.
sandwich desigual reconoce BNP y el peptido casi con la misma eficiencia. Los anticuerpos de ensayo que utilizan 24C5 (recubrimiento) -57H3-UE no reconocen (senal comparable con el fondo) peptido 11-22.
Ejemplo 3. Los anticuerpos Ab-BNP2 y Ab-proBNP BNP4 puede reconocer, que forma complejo inmunologico con MAb 24C5 (Fig. 4)
El sandwich desigual reconoce a proBNP y al peptido con la misma eficacia que un ensayo convencional. Los autores utilizaron MAb 24C5 para el recubrimiento de placas y a continuacion incubaron las placas en primer lugar con proBNP recombinado (5 ng/ml) y en segundo lugar con anticuerpos marcados con Eu Ab-BNP2, Ab-BNP4 y 57H3 especlficos para la region 26-32 de la molecula de BNP. Las senales obtenidas en los inmunoanalisis del sandwich desigual y convencionales son comparables. Los autores llegaron a la conclusion de que los nuevos ensayos se podrlan utilizar para la inmunodeteccion cuantitativa de proBNP.
Ejemplo 4. Estabilidad aparente del antlgeno (Fig. 5)
Se anadio BNP sintetico (Bachem) a una mezcla de plasma humano normal (2 ng/ml), se incubo a +4°C durante diferentes perlodos y se determino la actividad inmunologica en tres ensayos diferentes - uno convencional y dos sandwiches desiguales.
La estabilidad aparente del antlgeno, que se determina en sandwiches desiguales, descrita en la presente memoria es significativamente mayor en comparacion con la estabilidad determinada por los ensayos de BNP convencionales que utilizan dos MAb especlficos para diferentes partes de molecula de BNP. Como ejemplo de ensayo convencional se utilizo el ensayo que utiliza MAb 50E1 especlfico para la region 26-32 de la molecula de BNP y MAb 24C5 especlfico para la region 11-22 de la molecula de BNP. Se observo aproximadamente el 70% de actividad inmunologica despues de 24 horas de incubacion a + 4°C (69,8% y 68% para los ensayos que utilizan Ab-BNP2 y Ab-BNP4, respectivamente) en el caso en el que se utilizo sandwich desigual para determinar la inmunorreactividad y solo el 28% en el caso del ensayo convencional. Seis dlas despues del comienzo de la incubacion no se observo inmunorreactividad en el caso de ensayos convencionales, mientras que aproximadamente % de la inmunorreactividad inicial se observo en el caso de sandwiches desiguales.
Ejemplo 5. Determinaciones de BNP/proBNP en la sangre de pacientes con insuficiencia cardlaca (pacientes con IC) y la sangre de donantes sanos (Fig. 6)
Los ensayos en sandwich desigual, as! como de BNP convencionales son capaces de detectar en la sangre humana ambas formas del antlgeno que presentan "inmunorreactividad a BNP", es decir BNP y proBNP. Muestras de sangre de varios pacientes con IC y donantes sanos se analizaron en tres ensayos - uno convencional, utilizando MAb 50E1 de captura, especlfico para el fragmento 26-32 de la molecula BNP y deteccion de MAb 24C5-Eu y dos sandwiches desiguales. Todos los ensayos se calibraron usando BNP sintetico. Como se desprende de la Fig. 6, Los resultados de la prueba en los tres ensayos son muy similares. En algunas muestras los resultados de las pruebas en el ensayo convencional son menores que en los sandwiches desiguales. Esta observation puede explicarse por el hecho de que en dichas muestras bNp se degrada parcialmente, pero por el hecho de que el antlgeno presenta mejor estabilidad aparente en sandwiches desiguales, los valores de antlgeno determinados por estos ensayos son mayores que en un ensayo convencional.
Ejemplo 6. Curvas de calibration (Fig. 7)
Las curvas de calibracion para dos sandwiches desiguales y un ensayo convencional con BNP sintetico usado como antlgeno se presentan en la Fig. 7 (A, B y C). Ambos sandwiches desiguales demuestran gran sensibilidad, comparable con la sensibilidad del ensayo convencional y podrlan utilizarse para la deteccion precisa de inmunoreactividad de BNP y proBNP en la sangre humana.

Claims (3)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de inmunoanalisis para la deteccion de una protelna de BNP o proBNP en una muestra, que comprende
    (a) poner en contacto la protelna con un primer anticuerpo especlfico para un epltopo situado en el fragmento de protelna BNP o proBNP, que tiene la secuencia de aminoacidos FGRKMDRISSSS, representada en la SEQ ID n°: 3, para obtener un inmunocomplejo de primer orden,
    (b) poner en contacto el inmunocomplejo de primer orden obtenido en la etapa (a) con un segundo anticuerpo que reconoce dicho inmunocomplejo de primer orden, y que es especlfico para un epltopo situado en el inmunocomplejo de primer orden, formando el epltopo cuando el primer anticuerpo se une a la protelna BNP o
    proBNP o a uno de sus fragmentos que consiste en la SEC ID n°: 3, para obtener un inmunocomplejo de segundo orden, en donde dicho segundo anticuerpo es incapaz de reconocer BNP libre, proBNP libre o primer anticuerpo libre, o los reconoce con afinidad significativamente menor - 10 veces o menos - de lo que los reconoce el inmunocomplejo de primer orden, y
    (c) detectar la formacion del inmunocomplejo de segundo orden,
    en donde la protelna analizada ha mejorado la estabilidad aparente en comparacion con la de una protelna analizada utilizando anticuerpos especlficos para epltopos situados a distancia de BNP o proBNP.
  2. 2. Un anticuerpo monoclonal, que es especlfico para un epltopo situado en el inmunocomplejo de primer orden obtenido segun la etapa (a) de la reivindicacion 1, formando el epltopo cuando el primer anticuerpo se une a la protelna BNP o proBNP o a uno de sus fragmentos que consiste en la SEQ ID n°: 3, en donde dicho segundo anticuerpo reconoce a dicho inmunocomplejo de primer orden, pero es incapaz de reconocer a BNP libre, proBNP libre o al primer anticuerpo libre, o los reconoce con afinidad significativamente menor - 10 veces o menos - que lo reconoce el inmunocomplejo de primer orden.
  3. 3. Un equipo de inmunoanalisis para la deteccion de una protelna BNP o proBNP en una muestra, que comprende
    (a) un primer anticuerpo especlfico para un epltopo situado en el fragmento de la protelna BNP o proBNP, que tiene la secuencia de aminoacidos FGRKMDRISSSS, representada en la SEQ ID n°: 3, siendo capaz el anticuerpo de formar un inmunocomplejo de primer orden con la protelna, y
    (b) un segundo anticuerpo, que es especlfico para un epltopo situado en dicho inmunocomplejo de primer orden, formando el epltopo cuando el primer anticuerpo se une a la protelna BNP o proBNP o a uno de sus fragmentos que consiste en la SEC ID n°: 3, y es capaz de formar un inmunocomplejo de segundo orden con dicho inmunocomplejo de primer orden, en donde dicho segundo anticuerpo reconoce a dicho inmunocomplejo de primer orden, pero es incapaz de reconocer a BNP libre, proBNP libre o al primer anticuerpo libre, o los reconoce con afinidad significativamente menor - 10 veces o menos - que reconoce al inmunocomplejo de primer orden.
ES08736833.8T 2007-04-13 2008-04-14 Inmunoanálisis para la cuantificación de un antígeno inestable seleccionado de BNP y proBNP Active ES2599635T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91160307P 2007-04-13 2007-04-13
FI20075251 2007-04-13
US911603P 2007-04-13
FI20075251A FI20075251A0 (fi) 2007-04-13 2007-04-13 Immunomääritys epästabiilien antigeenien määrittämiseksi
PCT/FI2008/050184 WO2008125733A1 (en) 2007-04-13 2008-04-14 Immunoassay for quantification of an unstable antigen selected from bnp and probnp

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2599635T3 true ES2599635T3 (es) 2017-02-02

Family

ID=38009904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08736833.8T Active ES2599635T3 (es) 2007-04-13 2008-04-14 Inmunoanálisis para la cuantificación de un antígeno inestable seleccionado de BNP y proBNP

Country Status (9)

Country Link
US (3) US9034591B2 (es)
EP (1) EP2135087B1 (es)
JP (1) JP5686593B2 (es)
CN (1) CN101842707B (es)
CA (1) CA2683911C (es)
DK (1) DK2135087T3 (es)
ES (1) ES2599635T3 (es)
FI (1) FI20075251A0 (es)
WO (1) WO2008125733A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2919611B1 (fr) 2007-08-03 2009-10-23 Bio Rad Pasteur Sa Nouvel epitope du bnp (1-32) et anticorps diriges contre cet epitope
CA2807240A1 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Idexx Laboratories, Inc. Detection of degradation products of canine nt-probnp
JP2012140331A (ja) * 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp タグペプチド
US9244073B2 (en) 2011-02-25 2016-01-26 Wellstat Diagnostics, Llc Assays for detecting enzymatic activity
AU2012262154B2 (en) 2011-05-31 2016-08-04 Idexx Laboratories, Inc. Detection of degradation products of feline NT-proBNP
IN2014CN02113A (es) 2011-09-21 2015-05-29 Fujirebio Kk
CN102608335A (zh) * 2012-04-19 2012-07-25 协和生物制药（天津）有限公司 NT-proBNP时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法
EP4014041A1 (en) 2019-08-13 2022-06-22 Gentian AS Highly sensitive particle enhanced assay for the quantification of nt-probnp
CN113956355B (zh) * 2021-07-26 2023-06-23 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗人脑利钠肽(bnp)兔单克隆抗体及其应用
WO2023052642A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Gentian As Novel method for determining a concentration of n-terminal pro-hormone bnp (nt-probnp) in a sample

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5583003A (en) * 1989-09-25 1996-12-10 Agen Limited Agglutination assay
CA2072758A1 (en) 1990-09-14 1992-03-15 Kenneth Francis Buechler Antibodies to complexes of ligand receptors and ligands and their utility in ligand-receptor assays
US6828107B2 (en) * 1997-09-11 2004-12-07 Shionogi & Co., Ltd. Immunoassay method for BNP
US20030219734A1 (en) 2001-04-13 2003-11-27 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
CA2430889A1 (en) 2002-06-19 2003-12-19 Bayer Corporation Stabilization of brain natriuretic peptide (bnp) in blood samples, methods and compositions related thereto
FI20022048A0 (fi) * 2002-11-18 2002-11-18 Valtion Teknillinen Ei-kompetetiivinen immunomääritys pienille analyyteille
KR100771999B1 (ko) * 2004-05-20 2007-10-31 김상돈 그레이팅
US7731965B2 (en) * 2005-02-17 2010-06-08 Abbott Lab Human ring specific BNP antibodies
CA2629438C (en) * 2005-11-09 2014-02-25 Abbott Laboratories Human bnp immunospecific antibodies
EP2021369A2 (en) 2006-05-26 2009-02-11 Hytest Ltd. Antibodies and standard for nt-probnp and probnp immunoassays
US20080064045A1 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Huaiqin Wu Biomarker fragments for the detection of human BNP

Also Published As

Publication number Publication date
CN101842707B (zh) 2016-11-09
EP2135087B1 (en) 2016-09-14
WO2008125733A8 (en) 2009-07-30
WO2008125733A1 (en) 2008-10-23
EP2135087A1 (en) 2009-12-23
US9034591B2 (en) 2015-05-19
EP2135087A4 (en) 2011-06-22
FI20075251A0 (fi) 2007-04-13
DK2135087T3 (en) 2016-11-14
JP5686593B2 (ja) 2015-03-18
US20130071949A1 (en) 2013-03-21
US9034592B2 (en) 2015-05-19
JP2010523994A (ja) 2010-07-15
CN101842707A (zh) 2010-09-22
US20100203560A1 (en) 2010-08-12
US20150219675A1 (en) 2015-08-06
CA2683911A1 (en) 2008-10-23
CA2683911C (en) 2017-01-10
US9145459B2 (en) 2015-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2599635T3 (es) Inmunoanálisis para la cuantificación de un antígeno inestable seleccionado de BNP y proBNP
ES2346550T3 (es) Determinacion de probnp felino o canino.
US20050244904A1 (en) Diagnostics based on signal peptide detection
US20070249005A1 (en) Gastrin hormone immunoassays
US11719697B2 (en) Immunoassay and antibodies for the detection of chromogranin A
US20230032690A1 (en) New tau species
WO2016140063A1 (ja) オキシトシンの高感度測定法
JP7434144B2 (ja) ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法
WO2007007792A1 (ja) 抗体の検出法及び検出キット
KR20220063139A (ko) 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 펩티드 및 이를 이용한 분석 방법
WO2018220108A1 (en) Biomarker molecules for sarcopenia and uses thereof
WO2014029816A1 (en) Anti-c1q epitope elisa