ES2598531T3 - Nanoformulación antibacteriana y antifúngica a base de sílice - Google Patents

Abstract

Un método para sintetizar una nanoformulación a base de sílice que contiene agentes antibacterianos y antifúngicos usando un proceso sol-gel en un solo recipiente y catalizado por ácido, que comprende las etapas de: selección de un recipiente de reacción que contiene un medio de reacción ácido; adición de tetraetoxisilano (TEOS), agua, etanol y un agente antibacteriano o antifúngico que contiene iones de cobre en el recipiente de reacción, con el medio ácido para formar una mezcla I; permitir que la reacción de la mezcla I prosiga durante aproximadamente una hora para facilitar la formación de una pluralidad de nanopartículas a base de sílice; adición de un agente neutralizante después de la formación de una pluralidad de nanopartículas para ajustar el valor de pH de la mezcla de reacción a aproximadamente 7,0; permitir que la reacción neutralizada de la mezcla I prosiga durante aproximadamente 12 horas, preferentemente durante toda la noche, para permitir que se produzca la gelificación, y formar una estructura de nanogel que consiste en nanopartículas interconectadas; y recogida de un nanogel poroso a base de sílice que tiene agentes antibacterianos y antifúngicos unidos en una pluralidad de nanopartículas interconectadas del nanogel; en el que el agente antibacteriano o antifúngico es una pluralidad de iones de cobre (Cu) que proceden de un compuesto de cobre; caracterizado por que la pluralidad de nanopartículas interconectadas del nanogel contienen - una pluralidad de iones de Cu electrostáticamente unidos al núcleo de nanopartículas, - una pluralidad de nanocristales de Cu incorporados que incluyen al menos Cu2O, - una pluralidad de iones de Cu unidos covalentemente a una matriz de sílice con una superficie de la corteza hidratada, nanoporos de la nanopartícula y canales porosos de nanogel, y - una pluralidad de óxido/hidróxido de Cu como nanoagrupaciones/nanopartículas unidas a la superficie de la nanopartícula.

Description

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DESCRIPCION

Nanoformulacion antibacteriana y antifungica a base de s^lice Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a nanoformulaciones a base de silice, y en particular a composiciones y metodos para la fabrication de nanoparriculas a base de silice y nanogeles a base de silice, o una combination de los mismos, que proporcionan un nanoentorno unico para albergar agentes antibacterianos y antifungicos, a un metodo de sintesis y a su uso.

Antecedentes y tecnica anterior

Preocupacion mundial

La globalization de los negocios, los viajes y las comunicaciones atraen una mayor atencion a los intercambios internacionales entre comunidades y paises, incluyendo la globalizacion potencial del ecosistema bacteriano y patogeno. Se han desarrollado bactericidas y fungicidas para el control de enfermedades en el hombre, animales y plantas, y deben evolucionar para seguir siendo eficaces a medida que aparecen mas y mas bacterias y hongos resistentes a antibioticos, pesticidas e insecticidas en todo el mundo.

La resistencia bacteriana a agentes antimicrobianos tambien ha surgido, en todo el mundo, como una de las principales amenazas para el hombre y el estilo de vida agricola. La resistencia a los agentes antibacterianos y antifungicos se ha convertido en un problema agricola que requiere atencion y mejoras en los materiales de tratamiento en uso hoy en dia.

Por ejemplo, centrandose en las plantas, hay mas de 300.000 enfermedades que afectan a las plantas en todo el mundo, lo que resulta en miles de millones de dolares en perdidas de cultivos al ano. En 1990, se gastaron mas de 7300 millones de dolares en Estados Unidos en productos plaguicidas.

Los agentes antibacterianos y antifungicos (anti-B/F) incluyen, pero no se limitan a, cobre metalico (Cu), sales de cobre, complejos de cobre, zinc metalico (Zn), oxidos de zinc, sales de zinc, plata metalica (Ag), sales de plata, complejos de plata, dioxido de titanio (TiO2), oxidos de cerio, oxidos de magnesio, oxidos de circonio, polietilenimina (PEl), carbono, carbono u hollm mezclados, fulerenos, nanotubos de carbono y similares. Los compuestos anteriores son solo algunos ejemplos de agentes antibacterianos y antifungicos usados por el hombre en un intento por controlar o eliminar las enfermedades infecciosas en el medio ambiente mundial.

Los formulaciones antibacterianas/antifungicas (anti-B/F) existentes en la actualidad se podrian mejorar y ser mas eficaces si se incluyesen las siguientes funciones en la formulation. Por ejemplo, una formulation deseable tendria una mayor distribution uniforme sobre el area de superficie tratada, mejora de la adherencia a la superficie tratada, un medio para controlar y mantener la liberation de los ingredientes activos, y niveles de dosificacion que eviten cualquier impacto toxico sobre el medio ambiente y/o la superficie tratada.

La presente invencion proporciona una composition que aloja formulaciones antibacterianas/antifungicas y juntas, la composition hospedadora y los ingredientes antibacterianos/antifungicos proporcionan beneficios funcionales que resuelven muchos problemas y superan muchas limitaciones de la tecnica anterior.

Se informa de un metodo de sintesis para la preparation de una matriz de silice con particulas metalicas incorporadas en la Patente de Estados Unidos 6.548.264 de Tan et al., Estados Unidos 6.924.116 de Tan et al. y la Patente de Estados Unidos 7.332.351 de Tan et al.

Uso de fungicidas/bactericidas de cobre (Cu)

En la agricultura moderna, los compuestos de cobre (Cu) se usan ampliamente como fungicidas/bactericidas. Los compuestos de Cu, en una concentration relativamente baja, son bastante toxicos para organismos talofitas, tales como hongos, bacterias y algas. Esta caracteristica de toxicidad se ha usado durante mas de 100 anos para el control de enfermedades fungicas y bacterianas de las plantas. En 1761, se descubrio que los granos de semillas remojadas en una solution diluida de sulfato de cobre inhiben los hongos transmitidos por la semilla.

El mayor avance en las sales de Cu, sin duda, se produjo cuando el cientifico frances Millardet anuncio al mundo en 1885 que habia encontrado una cura para la temida plaga usando mezclas de sulfato de cobre, cal y agua (conocido como caldo bordeles). Los fungicidas/bactericidas a base de Cu se usan en todo el mundo, ya que los compuestos de Cu son relativamente seguros; el desarrollo de resistencia por los patogenos de las plantas ha sido minimo; en demanda de los paises en desarrollo del tercer mundo y las crecientes necesidades de alimentos que requieren una agricultura mas eficiente; y un aumento de las regulaciones y restricciones gubernamentales o la prohibition total de productos alternativos debido a su impacto toxicologico y medioambiental requiere formulaciones de tratamiento

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seguras, como describe H.W. Richardson en el Handbook of Copper Compounds and Applications, "Copper fungicides/bactericides" H. W. Richardson, Editor, 1997, Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, NY, paginas 93-122.

La toxicidad del Cu en gran parte es debida a su tendencia a alternar entre sus estados de oxidacion cuproso, Cu (I), y cuprico, Cu (II). En condiciones aerobicas, este ciclo redox da lugar a la generacion de radicales hidroxilo altamente reactivos que danan facil y eficientemente a biomoleculas tales como el ADN, proteinas y lipidos. Las reacciones subyacentes de tipo Fenton que afectan a especies reactivas de oxigeno se pueden describir como reacciones de Haber-Weiss catalizadas por Cu. Aunque la reaccion de peroxido de dihidrogeno con superoxido tiene principalmente una constante de velocidad insignificante como se muestra a continuation en la ecuacion 1, esta velocidad se acelera enormemente en presencia de Cu.

H2O2 + O2- ^ O2 + OH- + OH* (1)

Se cree que los iones de Cu catalizan esta reaccion como se muestra en las ecuaciones 2 y 3.

El Cu (II) se reduce inicialmente por superoxido como se muestra en la ecuacion 2,

Cu (II) + O2- ^ Cu (I) + O2 (2)

seguido de la reoxidacion por el peroxido de dihidrogeno como se muestra en la ecuacion 3,

Cu (I) + H2O2 ^ Cu (II) + O2 + OH- + OH* (3)

lo que resulta en una production neta del radical hidroxilo.

La mayoria de los fungicidas y bactericidas son poco eficaces para matar una infection ya establecida de hongos y bacterias, respectivamente, sino que actuan protegiendo al hospedador de la posibilidad de infeccion. Si se aplica el protector despues de la aparicion de los sintomas de la enfermedad, a menudo el control sera minirno. Del mismo modo, los compuestos de Cu inhiben la germination de la espora fungica o la celula bacteriana, las "semillas" principales responsables de la difusion y la reproduction del hongo o la bacteria. Debido a que las esporas o celulas retiradas del ciclo de infeccion actual no maduran, ni se reproducen en presencia de Cu, el hongo o la bacteria se matan con eficacia.

El valor fungicida/bactericida es una medida de la toxicidad de un material para el patogeno y generalmente se expresa como DL50, principalmente una medicion de la toxicidad in vitro en laboratorio, en la que DL significa dosis letal y DL50 es la cantidad de material o dosis que causa la muerte del 50 % de la poblacion objetivo.

El valor de protection es una medida de la capacidad de un material para proteger al organismo hospedador, por ejemplo, una planta, de la infeccion, que principalmente es una medida en condiciones de campo. Por ejemplo, el sulfato de Cu tiene una excelente capacidad para inhibir la germinacion de esporas fungicas o de celulas bacterianas en el laboratorio; sin embargo, en el campo que no presenta persistencia, debido a su solubilidad. Tiene un valor de proteccion limitado, ya que se elimina rapidamente de la superficie de la planta con la primera lluvia. Por otra parte, el sulfato de cobre puede producir suficiente Cu soluble para ser toxico para la planta (fitotoxico). Se debe seleccionar un compuesto de Cu que sea relativamente resistente a la intemperie y que proporcione suficiente Cu para ser toxico a las esporas de hongos y celulas bacterianas sin afectar negativamente a la planta.

Una consideration importante es si usar proteccion con fungicida o bactericida "soluble" o "insoluble" de cobre (Cu) a largo plazo. El Cu "soluble" se refiere a sales a base de Cu (tales como sulfato de Cu) que se hidrolizan completamente en agua, produciendo Cu ionico. Los compuestos de Cu "insolubles" (poco solubles) actuan como deposito desde el que se liberan iones de Cu a la superficie de la planta en la que se deposita tras su aplicacion.

La estimation del mercado mundial de fungicidas y bactericidas por el tipo de compuesto de Cu y el ano de introduction se muestra en la Tabla 1 a continuacion (datos publicados en 1988, Fuente: HW Richardson, Handbook of Copper Compounds and Applications, supra).

Tabla 1 - Estimacion del mercado mundial de fungicidas/bactericidas segun el tipo de compuesto de Cu

Compuesto de Cu

Cantidad (Toneladas/Ano) % del mercado Ano introducido

Oxicloruro de Cu (II)

71.000 51,1 1990

Sulfato de Cu (II)

48.000 34,6 1761

Sulfato de Cu (II) + cal (caldo bordeles)

1873

Sulfato de Cu (II) + ceniza de sosa (mezcla de Borgona)

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Sulfato basico de Cu (II)

6xido de Cu (I)

6.000 4,3 1932

Hidroxido de Cu (II)

11.000 7,9 1960

Otros: complejo de Cu (II) amoniaco, CO3 y PO4

1917

Esta claro que los fungicidas/bactericidas a base de Cu se han aplicado durante largo tiempo y tienen un alto impacto social y economico en la agricultura, en el tratamiento de aguas y en la vida domestica. Hay aproximadamente 2000 productos registrados que contienen compuestos de cobre como ingredientes activos.

En Estados Unidos hay registrados varios compuestos de Cu para la gestion de mas de 100 enfermedades en casi 50 cultivos alimentarios. Los compuestos de Cu presentan distintos grados de eficacia para cualquier organismo objetivo en cualquier hospedador dado. Las formas mas comunes del Cu que satisfacen estas condiciones en diversos grados son los productos de hidrolisis normales de las sales de Cu (I) y Cu (II) (tambien conocidas como compuestos de "Cu insoluble"): oxido de Cu (I) (Cu2O3), oxicloruro de Cu (II) (CuCl2 ■ 3 Cu(OH)2), sulfato tribasico de Cu (II) (CuSO4 ■ 3 Cu(OH)2, e hidroxido de Cu (Cu(OH)2). A mediados de los anos 1930, el caldo bordeles fue reemplazado en gran medida por el sulfato basico de Cu (II), el oxido de Cu (I), y el oxicloruro de Cu (II). Estos compuestos de Cu son faciles de manejar y relativamente menos fitotoxicos en comparacion con el caldo bordeles. El hidroxido de Cu se introdujo en 1960. Kocide® 3000 es el ultimo producto a base de hidroxido de Cu de la DuPont Company, Wilmington, DE, que es uno de los fungicidas/bactericidas mas populares.

Los compuestos de Cu usados actualmente poseen un conjunto unico de propiedades fisicas y quimicas. Se diferencian en su cantidad total de contenido metalico de Cu y solubilidad acuosa. Se entiende bien que la actividad antibacteriana dependera de la disponibilidad de los iones de Cu solubles en la formulacion. Entre los compuestos de Cu existentes, son menos solubles los sulfatos tribasicos de cobre y el oxido cuproso, mientras que los hidroxidos de Cu son mas solubles que el oxicloruro de Cu.

Una vez mas, el exceso de Cu provocara fitotoxicidad y afectara negativamente al medio ambiente mientras que los compuestos poco solubles de Cu seran menos eficaces, lo que requiere multiples aplicaciones, y por lo tanto mas mano de obra. Una formulacion de Cu robusta debe cumplir al menos los siguientes tres criterios: (i) la tasa de liberacion de Cu se debe mantener a un nivel optimo (mecanismo de liberacion sostenida mientras se reduce al minimo la fitotoxicidad) para proporcionar una proteccion a largo plazo contra el patogeno, (ii) el compuesto de Cu se debe adherir bien a la superficie de la planta para resistir la lluvia y el viento de manera que no se requeriran multiples aplicaciones y (iii) el compuesto de Cu no provoca toxicidad para el medio ambiente (es decir, medioambientalmente seguro). Sin embargo, debido a sus propiedades quimicas y fisicas inherentes, los compuestos de Cu existentes estan muy limitados para cumplir estos criterios.

Con respecto a los compuestos de cobre (Cu), la eficacia de un compuesto de Cu se puede mejorar considerablemente al reducir el tamano de parficula de acuerdo con Torgeson, DC, ed. Fungicides - An Advanced Treatise, Agricultural and Industrial Applications and Environmental Interaction. Vol. 1. (1967), Academic Press: Nueva York, N. Y, pagina 697. Cuanto menor sea el tamano de parficula mayor es el numero de parficulas por gramo y por lo tanto mayor es la actividad fungicida o bacteriana. Esto da la bienvenida a la nanociencia y la nanotecnologia que se ocupa de cuestiones a escala nanometrica, normalmente un rango nanometrico de 1-100.

Navarro, E., et al., en "Environmental behavior and ecotoxicity of engineered nanoparticles to algae, plants, and fungi," Ecotoxicology, 2008. 17(5): paginas 372-386 ensena que el area superficial especifica como se muestra en la Fig. 1a aumenta exponencialmente a medida que el tamano de parficula disminuye por debajo de 100 nanometros. Del mismo modo, Oberdorster, G. et al., en Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles, Environmental Health Perspectives, 2005. 113(7): paginas 823-839 ensena que el porcentaje de atomos de la superficie aumenta de forma exponencial a medida que el tamano de parficula disminuye por debajo de 100 nm como se muestra en la Fig. 1b. Por lo tanto, con parficulas mas pequenas se mejora la cobertura y significativamente hay mas area de superficie disponible por gramo de producto para liberar iones de Cu cuando esta presente la humedad.

Las parficulas mas pequenas tambien resisten un mejor desalojo, ya que son mas ligeras y tienen una mayor area de superficie en relacion con su peso; por lo tanto, una mayor area de contacto con la superficie de la planta, y el resultado es un aumento en la fuerza de adherencia total. Las formulaciones de Cu con parficulas mas pequenas por lo tanto producen mejoras en el control de la enfermedad a traves de una mejor cobertura, resistencia a la lluvia, y la longevidad del producto y la liberacion de los iones de Cu sobre la superficie de la planta. En este sentido, en la ultima decada se han realizado algunas mejoras en la calidad del producto sobre los compuestos de Cu. Hasta la fecha, sin embargo, no se ha realizado ningun gran avance que pudiera ser considerado revolucionario. Esto exige el desarrollo energico de una nueva generacion de fungicidas/bactericidas a base de Cu que cumpla con los criterios antes mencionados.

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Inhibicion del crecimiento de moho y hongos mildiu

El crecimiento de los hongos, como por ejemplo, el moho y los hongos mildiu es un problema serio en ambientes calidos y humedos, como en climas tropicales. En presencia de nutrientes que se encuentran en abundancia en los materiales de la casa/de construction tales como paredes secas, madera, lechada, base de alfombras y similares, el moho y los hongos mildiu prosperan.

El moho y los hongos mildiu tienen caracteristicas similares, pero son diferentes tipos de hongos microscopicos y a menudo son diferentes en color y textura y se pueden observar creciendo en objetos tanto en el interior como en el exterior de los edificios. La formation de moho y hongos mildiu no solo es perjudicial para la salud, sino que tambien presenta un aspecto antiestetico cuando se establecen colonias en las superficies interiores o exteriores de los edificios. El hongo mildiu se encuentra mas a menudo en duchas, baneras, lechada de baldosas de ceramica, papel y tela de cuartos de bano; el moho por lo general se encuentra en alimentos. Pueden ser dificiles de distinguir, ya que ambos usan esporas para su reproduction. El moho a menudo es de color negro, verde, rojo o azul, mientras que el hongo mildiu generalmente es gris o blanco. Los olores a humedad y a moho son producidos por los cambios quimicos que tienen lugar durante el proceso de la vida del moho y se designan cientificamente como compuestos organicos volatiles microbianos (mVOCs). Los productos de desecho son producidos por los mohos en crecimiento activo.

Las esporas del moho transportadas por el aire pueden comprometer seriamente la calidad del aire interior y causar alergia severa, asma y otros problemas inmunologicos. Efectos en la salud, tales como dolores de cabeza, mareos, nauseas y tos se han relacionado con la exposition a mVOCs. Tambien puede ocurrir irritacion de los ojos y de la garganta como resultado de la respiration de toxinas del moho. Los alimentos con moho no deben ser consumidos. La infestation por hongo mildiu sobre papel y algunas telas no se puede limpiar, pero por lo general un eliminador de hongo mildiu se puede deshacer del hongo mildiu en superficies mas duras, como por ejemplo, superficies de banos, cocinas y en las paredes exteriores.

Las esporas del moho son resistentes a alta temperatura, a la luz ultravioleta y a la desecacion. Las esporas son abundantes en el medio ambiente y permanecen latentes en condiciones desfavorables y germinan rapidamente en un ambiente favorable (calor, humedad y nutrientes). Las soluciones de lejia son eficaces para matar tanto el moho como el hongo mildiu y se consideran un tratamiento muy efectivo en todo el mundo. Sin embargo, la action de la lejia no dura mucho tiempo; se requieren multiples aplicaciones cada una o dos semanas.

La Patente de Estados Unidos 3.992.146 de Fazzalari describe un proceso de uso de soluciones biocidas que contienen sulfato de cobre y un agente tensioactivo para inhibir el crecimiento de hongos sobre superficies porosas duras, tales como lechada.

Es conveniente usar la nanotecnologia para ampliar el uso de formulaciones de nanoparticulas/nanogeles de silice cargadas de cobre (Cu) con una actividad antibacteriana superior para tratar areas que favorezcan y fomenten el crecimiento de moho y hongos mildiu; ademas, es conveniente que un solo tratamiento no pierda su eficacia durante, al menos, dos a seis meses debido a la liberation de Cu ionico de una manera lenta y sostenida y en cantidades que no violen la EPA Water Quality Standard Rule publicada el 1 de diciembre de 1992, que establece las normas de la calidad del agua para el cobre como contaminante toxico prioritario.

Tratamiento de enfermedades en plantas

El estado de la tecnica para los metodos y el tratamiento de enfermedades en plantas, y especificamente el cancro en plantas de citricos se encuentra en una muestra representativa de las patentes enumeradas a continuation:

La Patente de Estados Unidos 3.983.214 de Misato et al., ensena composiciones fungicidas y un metodo para la protection de plantas mediante el uso de composiciones que contienen acidos organicos como ingrediente activo, sales de metales alcalinos de estos acidos organicos, citrato ferrico, lactato ferrico, glicerina, cloruro de aluminio y esteres formados entre el azucar y acidos grasos superiores que tienen de 8 a 18 atomos de carbono. Las composiciones no tienen fitotoxicidad y no hay toxicidad para los mamiferos y no presentan ningun riesgo de contamination del suelo.

La Patente de Estados Unidos 5.462.738 de LeFiles et al., desvela un bactericida/fungicida fluido seco de hidroxido de cobre granular con actividad biologica mejorada y un metodo para su preparation y uso.

La Patente de Estados Unidos 5.939.357 de Jones et al., proporciona una composition fungicida que tiene un ingrediente de sal inorganica que contiene bicarbonato que mejora la eficacia de un ingrediente fungicida para el tratamiento de cultivos.

La Patente de Estados Unidos 6.471.976 de Taylor et al., desvela un bactericida/fungicida de complejo de cobre mejorado que contiene un acido policarboxilico parcialmente neutralizado y un metodo para su preparacion y uso.

La Patente de Estados Unidos 7.163.709 de Cook et al., desvela una composicion y un metodo para proporcionar formas o compuestos ionicos de cualquier combination de tres metales (cobre, oro y plata) para producir un producto que se puede usar como agente antimicrobiano, desinfectante de superficies duras,

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pulverizador foliar o tratamiento del agua. La composicion se pulveriza, nebuliza, vaporiza, o humidifica para producir partfculas micronizadas que son capaces de permanecer en suspension en el aire durante largos periodos de tiempo para actuar sobre las esporas de hongos y/o patogenos transportados por el aire. Esta seria una composicion enormemente cara.

La Patente de Estados Unidos 7.226.610 de Winniczuk ensena composiciones y metodos para el tratamiento y la prevencion de enfermedades en plantas, especialmente el cancro de los citricos, usando una composicion que incluye varias combinaciones de d-limoneno, cera y alcohol monohidrico.

La Publ. de Patente de EEUU n.° 200110051174 de Staats proporciona una composicion antimicrobiana que contiene compuestos de amonio cuaternario, un agente tensioactivo, un agente humectante, un agente de secado 10, un agente formador de pelicula hidrofila, un agente de impermeabilizacion hidrofobo y agua, que tiene propiedades antivirales, antibacterianas, y antifungicas, aplicada a plantas y arboles mediante revestimiento por pulverizacion y/o por administracion sistemica para proteger contra organismos nocivos y destructivos.

La Publ. de Patente de EE.UU. n.° US 2007/0087023 y la Publ. de Patente de EE.UU. n.° US 15 2007/0098806, ambas de Ismail et al., desvelan un agente antimicrobiano a base de polimero que incluye un polimero soluble en agua e iones metalicos oligodinamicos (por ejemplo, particulas de plata de tamano nanometrico) que interactuan con el polimero soluble en agua para tratar o prevenir el cancro de los citricos.

El documento de Estados Unidos 2004/0096421 A1 desvela materiales complejos de dominio organico/dominio inorganico que comprenden una composicion de acuerdo con el preambulo de la reivindicacion independiente 2, y un metodo para la sintesis de estos materiales segun el preambulo de la reivindicacion independiente 1. Los materiales hibridos conocidos se pueden usar como reactivos de hidrofilicidad y se aplican a las superficies de diversas sustancias, tales como una superficie de resina y una superficie recubierta. Los materiales hibridos tambien se pueden usar como reactivo antifungico/antibacteriano, que se puede usar especialmente en forma de una mezcla de los mismos con un cemento.

El documento de Estados Unidos 2007/0140951 A1 desvela nanoparticulas, sus procesos de fabricacion y sus composiciones. Las nanoparticulas son a base de oxido de metal. Un ejemplo de nanoparticulas a base de oxido metalico son nanocristales de oxido de cobre del sistema Cu/Cu2O/CuO. Los nanocristales de oxido de cobre se preparan por un proceso que implica la descomposicion termica de acetato de cobre (I) a temperatura elevada en presencia de un tensioactivo. Esto da lugar a nano particulas de Cu2O altamente mono dispersas y cristalinas. Las evidencias de Cu2+ en XPS y la caracterizacion optica de los nanocristales sugerian la existencia de una capa delgada de CuO amorfo en la interfaz nanocristal-ligando.

Por lo tanto, hay una amplia gama de composiciones fungicidas/bactericidas representadas en la literatura de patentes con formulaciones que incluyen acidos, compuestos polimericos, iones metalicos, 20 componentes poco convenientes tales como tensioactivos o aceites. Tambien se debe considerar el coste, la eficacia y la resistencia bacteriana o fungica al tratamiento.

Con respecto al cancro de los citricos, se ha desarrollado una situacion particularmente aguda y critica en Estados Unidos. El cancro de los citricos es una enfermedad bacteriana de los citricos que causa la caida prematura de hojas y frutos. Los sintomas de la enfermedad aparecen en las hojas y frutos por muchas lesiones marrones rodeadas de un margen aceitoso y empapado con agua y un anillo o halo amarillo. Las lesiones antiguas en las hojas pueden caerse, creando un efecto de agujero de bala.

El cancro de los citricos no hace dano a los seres humanos o a los animales o a plantas que no sean citricos. Sin embargo, el cancro de los citricos afecta a todos los tipos de citricos, como naranjas, naranjas amargas, pomelos, mandarinas, limones y limas. El cancro hace que la salud y la produccion de frutas de un arbol de citricos disminuyan continuamente. En ultima instancia, el arbol no producira ningun fruto.

El cancro de los citricos es muy contagioso y se puede propagar rapidamente por la lluvia arrastrada por el viento, las cortadoras de cesped y otros equipos de jardineria, personas que llevan la infeccion en sus manos, la ropa o el equipo, mover las plantas o partes de plantas infectadas o expuestas.

El Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) retiro la financiacion del programa de erradicacion debido a los impactos de las restricciones legales y los huracanes de 2004/2005 que causaron que el cancro se extendiese hasta un punto en que ya no era posible su erradicacion.

Florida se encuentra actualmente en cuarentena a nivel estatal por el USDA y ningun citrico puede salir del estado a menos que el USDA emita un permiso limitado. Ningun citrico cultivado en Florida pueden entrar en ningun estado o territorio productores de citricos. Ninguna planta o partes de plantas de citricos pueden entrar o salir de Florida.

En Florida, desde que el cancro se identifico por primera vez en Florida en 1910, han sido destruidos mas de 16 millones de arboles. El estado de Florida ha declarado dos veces que el cancro ha sido erradicado, en 1933 y nuevamente en 1994, solo para el resurgir de la enfermedad del cancro una tercera vez en 1995 cerca del aeropuerto internacional de Miami. En 2008, la industria de los citricos en Florida ahora esta en cuarentena a causa de la enfermedad del cancro que fue propagada por los huracanes de 2004/2005. Arboledas, tierra y arboles una

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vez productivos, ahora se estan volviendo improductivos a un costo enorme para el Estado y sus ciudadanos. El numero de plantaciones comerciales en Florida se redujo de aproximadamente 857.000 acres en 1996 a 621.000 acres en 2006, segun H. Florin en "The Sour State of Florida Citrus" publicado en linea en
http://www.time.com/time/nation/article/0,8599,1836766,00.html para la revista Time, el 28 de agosto de 2008.

A nivel mundial, el cancro de los citricos es una de las enfermedades mas devastadoras que ha afectado gravemente a la industria de los citricos en mas de treinta paises de Asia, el Pacifico y las islas del Oceano tadico, America del Sur, y el sureste de los EE.UU., segun informa A.K. Das en "Citrus Canker-A review," J. Appl. Hort. 2003, 5 (1), 52-60. Esta enfermedad es causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. Citri, una bacteria gram-negativa. El patogeno causa lesiones necroticas en las hojas, tallos y frutos. Las infecciones severas pueden causar defoliation, el manchado grave de la fruta, la caida prematura de la fruta, la muerte de las ramitas y el declive general del arbol, como se comenta por T.S. Schubert et al. en Plant Disease, 2001, 85 (4). La tenacidad de la enfermedad del cancro de los citricos y la infection se discute por C.H. Bock, et al. "Efficacy of Cankerguard(R) Sprays for Effective Decontamination of Citrus Canker." en Phytophology 2009, 99, (6), pagina S13-Abstract of Presentations, 2009 APS Annual Meeting. Bock et al. encontraron que despues del tratamiento, tuvo lugar la infeccion, en o muy poco despues de la inoculation puesto que la descontaminacion no redujo la incidencia o la gravedad de la enfermedad.

La consecuencia mas grave de la infestation por cancro de los citricos es el impacto en el comercio como consecuencia de las restricciones al transporte y la venta interestatal e internacional de frutas procedentes de areas infestadas, causando enormes perdidas economicas cada ano. Los productores de citricos estan buscando agresivamente un remedio robusto.

Sigue existiendo una necesidad continua y urgente para el desarrollo de fungicidas/bactericidas nuevos y mas eficaces que sean baratos y faciles de fabricar con actividad preventiva, curativa y sistemica para la protection no solo de los arboles de citricos, sino de todas las plantas cultivadas, con unos efectos secundarios fitotoxicos minimos. La presente invention usa la nanotecnologia para satisfacer la necesidad de un fungicida/bactericida barato y mas eficaz.

Otros desarrollos innovadores de la presente invencion se basan en nanogeles de silice cargados de Cu (CuSiNG). En comparacion con los productos disponibles en el mercado, la tecnologia de nanogeles del presente documento ha demostrado su superioridad en la mejora de la biodisponibilidad del Cu, la cobertura de la superficie y la longevidad de la planta y proporciona un medio para detectar cuando se debe volver a aplicar el CuSiNG para una proteccion maxima.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para sintetizar una nanoformulacion a base de silice segun la reivindicacion independiente 1, y una composition para el tratamiento y la prevention de enfermedades en una especie vegetal de acuerdo con la presente reivindicacion 2. Las reivindicaciones dependientes 3 a 5 estan dirigidas a realizaciones preferidas de la composicion de la presente invencion.

Un primer objetivo de la presente invencion es proporcionar una composicion y un metodo para fabricar una nanoformulacion a base de silice que proporciona un nanoentorno unico para albergar agentes antibacterianos y antifungicos.

Un segundo objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice que proporciona un nanoentorno unico para albergar agentes antibacterianos y antifungicos con una cinetica de liberation controlada, que establece un mecanismo de liberacion sostenida.

Un tercer objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice que proporciona un nanoentorno unico para albergar agentes antibacterianos y antifungicos (anti-B/F) para mejorar la eficacia de los agentes anti-B/F.

Un cuarto objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion que consiste en nanoparticulas de silice (SiNP), o nanogel de silice (SiNG) o una combination de SiNP y SiNG.

Un quinto objetivo de la presente invencion es proporcionar una fabrication o un metodo de sintesis sencillo y rentable para una nanoformulacion a base de silice con un contenido antibacteriano y antifungico que se puede preparar in situ, en unas pocas horas, en un metodo de sintesis en un solo recipiente, que no requiere etapas de purification.

Un sexto objetivo de la presente invencion es proporcionar una fabricacion o un metodo de sintesis sencillo y rentable para una nanoformulacion a base de silice concentrado con un contenido antibacteriano y antifungico que se puede preparar in situ, diluido para su aplicacion al suelo por una persona sin conocimientos tecnicos.

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Un septimo objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de s^lice con contenido antibacteriano y antifungico para el tratamiento de una superficie propensa a la enfermedad del cancro de los citricos, proporcionando una cobertura uniforme a la superficie, la adherencia superficial por un periodo de tiempo satisfactorio, la liberacion sostenida en el tiempo, un mejor control de liberacion de anti-B/F, y una reduccion de la toxicidad y del estres para el medio ambiente en la zona tratada.

Un octavo objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice con contenido antibacteriano y antifungico para el tratamiento de una superficie propensa a la enfermedad del cancro de los citricos con un gran numero de beneficios, incluyendo, pero no limitado a, la adherencia superficial durante un periodo de tiempo satisfactorio, la liberacion sostenida en el tiempo, el control de liberacion de anti-B/F, y menos toxicidad y estres para el medio ambiente en la zona tratada.

Un noveno objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice con contenido antibacteriano y antifungico para el tratamiento del cancro de los citricos y la prevention de la enfermedad del cancro durante un periodo de cinco a nueve meses.

Un decimo objeto de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice con contenido antibacteriano y antifungico para la industria agricola (hortalizas, flores, hierba y otras plantas), aplicaciones domesticas (telas, cuero, plasticos, pintura y similares).

Un undecimo objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice cargada de cobre (Cu) con propiedades fertilizantes residuales para el suelo en el que las hojas y las ramas de las plantas tratadas con la nanoformulacion siguen liberando nutrientes de Cu cuando las hojas y las ramas caen al suelo.

Un duodecimo objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice cargada de cobre (Cu) con propiedades fertilizantes residuales para el suelo en el que cuando las plantas y los arboles tratados con la nanoformulacion en este documento se recogen como abono o mantillo, el suelo se enriquece con iones de Cu residuales.

Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar una nanoformulacion a base de silice cargada de cobre (Cu) con propiedades antifungicas superiores para inhibir el crecimiento de moho y hongos mildiu durante al menos seis meses por la liberacion de un fungicida de una manera lenta y sostenida.

Ademas de los objetivos mencionados anteriores, desarrollos y mejoras innovadoras que usan nanogel de silice cargado de Cu (CuSiNG) incluyen el objetivo adicional de reducir las poblaciones de bacterias sobre las superficies de plantas y del follaje al mejorar la biodisponibilidad del cobre.

Otro objetivo de la presente invencion es optimizar la carga de cobre (Cu) de formas de valencias multiples (estados de Cu1+ y Cu2+), asi como sus formas cristalinas (oxido de Cu) y amorfas (complejadas con matriz de silice) de cobre dentro del nanogel de silice para controlar la cinetica de liberacion del cobre.

Tambien es un objetivo de la presente invencion proporcionar el cobre en una aplicacion de pulverization de CuSiNG con longevidad de residencia en la planta en el que el CuSiNG se difunde hacia fuera y cubre la superficie del tejido recien expuesto de frutos y hojas jovenes de crecimiento rapido, minimizando asi el numero de aplicaciones por temporada de crecimiento.

Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un nanogel de silice fluorescente, que incorpora un colorante a base de rutenio (RuCuSiNG) para proporcionar un medio para la medicion de las propiedades de difusion del CuSiNG, observando visualmente la propiedad de adherencia del CuSiNG y determinando cuando se justifica la reaplicacion del CuSiNG.

Un metodo preferido para sintetizar una nanoformulacion a base de silice que contiene agentes antibacterianos y antifungicos usando un proceso sol-gel en un solo recipiente catalizada por acido, incluye la selection de un recipiente de reaction que contiene un medio de reaction acido, la adicion de tetraetoxisilano (TEOS), agua, etanol y un agente antibacteriano o antifungico que contiene iones de cobre en el recipiente de reaccion con el medio acido para formar una mezcla I, permitiendo que continue la reaccion de la mezcla I durante aproximadamente una hora para facilitar la formation de una pluralidad de nanoparticulas a base de silice, la adicion de un agente neutralizante despues de la formacion de una pluralidad de nanoparticulas para ajustar el valor del pH de la mezcla de reaccion a aproximadamente 7,0, lo que permite que continue la reaccion neutralizada de la mezcla I durante aproximadamente 12 horas, preferentemente durante toda la noche, para permitir que se produzca la gelificacion, en el que la estructura del nanogel consiste en nanoparticulas interconectadas; y la recogida de un nanogel poroso a base de silice que tiene agentes antibacterianos y antifungicos unidos en una pluralidad de nanoparticulas interconectadas del nanogel.

El medio de reaccion acido preferido del metodo es una solution acuosa de un acido seleccionado entre uno de acido clorhidrico, acido sulfurico y acido nitrico. El agente antibacteriano o antifungico preferido es una pluralidad de

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iones de cobre (Cu) procedentes de un compuesto de cobre.

Tambien se prefiere que la reaccion de la mezcla I se produzca a temperatura y presion ambiente.

Se prefiere que la pluralidad de nanoparticulas interconectadas del nanogel contenga una pluralidad de iones de Cu electrostaticamente unidos al nucleo de las nanoparticulas, una pluralidad de iones de Cu unidos covalentemente a una superficie de la corteza hidratada y nanoporos de la nanoparticula, y una pluralidad de oxido/hidroxido de Cu como nanoagrupaciones/nanoparticulas unidas a la superficie de la nanoparticula.

Una composicion preferida y el metodo para el tratamiento y la prevention de enfermedades en una especie vegetal consiste en una nanoformulacion a base de silice, que contiene preferentemente una pluralidad de iones de cobre incorporados a una pluralidad de nanoparticulas de silice y, mas preferentemente, una pluralidad de iones de cobre incorporados a un nanogel de silice. Preferentemente, la pluralidad de iones de cobre procede de compuestos de cobre, tales como cobre metalico, oxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, hidroxido de cobre y sus mezclas.

Preferentemente, la planta enferma tratada por la composicion preferida es un miembro de la especie Citrus, en el que la enfermedad es el cancro de los citricos causada por cualquier especie de Xanthomonas.

Se prefiere que durante el tratamiento, la pluralidad de iones de cobre (Cu) se libere de una manera sostenida durante el tratamiento a largo plazo de la planta durante un periodo de tiempo de al menos seis meses.

Un metodo preferido para el tratamiento o la prevencion de enfermedades en una especie vegetal que comprende aplicar a la especie vegetal una composicion que comprende una nanoformulacion a base de silice, en la que la composicion preferida comprende ademas una pluralidad de iones de cobre incorporados a una pluralidad de nanoparticulas de silice, mas preferentemente, una pluralidad de iones de cobre incorporados a un nanogel silice.

La composicion incluye ademas una pluralidad de iones de cobre procedentes de compuestos de cobre, tales como, cobre metalico, oxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, hidroxido de cobre y sus mezclas.

Un metodo preferido para el tratamiento y la inhibition del crecimiento de moho y los hongos mildiu en una superficie que se selecciona del grupo que consiste en paredes interiores y exteriores de edificios, techos, lechada de baldosas de ceramica, y accesorios de bano que comprende la aplicacion a la superficie de una composicion que comprende una nanoformulacion a base de silice. La nanoformulacion a base de silice preferida es una pluralidad de nanoparticulas interconectadas del nanogel que contiene una pluralidad de iones de Cu electrostaticamente unidos al nucleo de nanoparticulas, una pluralidad de iones de Cu unidos covalentemente a una superficie y los nanoporos de la corteza hidratada de la nanoparticula, y una pluralidad de oxido/hidroxido de Cu como nanoagrupaciones/nanoparticulas unidas a la superficie de la nanoparticula.

La fuente preferida de la pluralidad de iones de Cu se selecciona entre cobre metalico, oxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, hidroxido de cobre y sus mezclas.

Un metodo preferido para la adicion de nutrientes al suelo incluye el tratamiento de la vegetation con una formulation de nanoparticulas de silice cargadas de cobre (Cu), permitiendo que las hojas y las ramas caigan al suelo, y dejando que las hojas y las ramas tratadas se biodegraden y fertilicen con ello el suelo con nutrientes de iones de Cu de manera no fitotoxica y con una liberation lenta.

Otro metodo preferido para la adicion de nutrientes al suelo incluye el tratamiento de la vegetacion con una formulacion de nanoparticulas de silice cargadas de cobre (Cu), la cosecha y la trituration de la vegetacion para formar mantillo o abono, y la difusion del mantillo o abono sobre el suelo para permitir la lixiviacion de los nutrientes de iones de Cu de una manera no fitotoxica con liberacion lenta, con la exposition a condiciones atmosfericas seleccionadas entre al menos una de lluvia, viento, nieve y luz solar.

Se proporciona una nanoformulacion a base de silice preferida en la que una matriz de silice tiene un nanogel de silice cargado con iones de cobre (CuSiNG) que aloja simultaneamente dos formas activas de cobre, en la que una primera forma de cobre es amorfa y una segunda forma de cobre es cristalina y el equilibrio establecido por las dos formas activas de cobre se puede ajustar para controlar la cinetica de liberacion de los iones de cobre y mejorar la biodisponibilidad de los iones de cobre.

Otra nanoformulacion a base de silice preferida presenta una propiedad en la que una pluralidad de iones de cobre se difunden hacia fuera desde su lugar de aplicacion sobre una superficie del tejido de la planta en un ambiente humedo y cubre la superficie del tejido expuesto de frutos y hojas de crecimiento rapido, minimizando asi la frecuencia de aplicacion por temporada de crecimiento y aumentando la cobertura de la superficie de la planta y la longevidad de la cobertura.

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Tambien se prefiere que la formulacion a base de silice de la presente invencion incluya ademas un compuesto precursor de silano para lograr una cobertura uniforme de la superficie de la planta, modular la tasa de liberacion de iones de cobre, mejorar la resistencia a la lluvia y aumentar la longevidad de la cobertura de la superficie de la planta. Un compuesto precursor de silano preferido es metilfosfonato de 3-(trihidroxisilil)propilo (THPMP).

Otra nanoformulacion a base de silice preferida incluye un colorante fluorescente a base de rutenio (RuCuSiNG) para evaluar las propiedades de adherencia del nanogel de silice (SiNG) a niveles microscopicos y un colorante fluorescente a base de rutenio preferido es tris(2,2'-bipiridilo diclororutenio) hexahidratado (Rubpy) y el colorante fluorescente a base de rutenio, tris(2,2'-bipiridilo diclororutenio) hexahidratado (Rubpy), se usa para controlar la liberacion de los iones de cobre a partir de nanogel de silice cargado de cobre (CuSiNG) en tiempo real.

Ademas, el colorante fluorescente a base de rutenio preferido, tris(2,2'-bipiridilo diclororutenio) hexahidratado (Rubpy), se usa para medir la cantidad de nanogel de silice cargado de cobre (CuSiNG) que queda sobre la superficie de una planta para determinar si es necesario repetir la aplicacion.

Se proporciona una nanoformulacion a base de silice hibrida mas preferida en la que una matriz de silice incluye una pluralidad de iones de cobre y un precursor de silano, metilfosfonato de 3-(trihidroxisilil)propilo (THPMP), cargado en el nanogel de silice cargado de cobre (CuSiNG) para lograr una cobertura uniforme de la superficie de la planta y proporcionar una cobertura de la superficie que se expande con el crecimiento de la planta.

Otros objetos y ventajas de esta invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de una realizacion preferida actualmente que se ilustra esquematicamente en los dibujos adjuntos.

Breve descripcion de las figuras

La Fig. 1a es un grafico que muestra el aumento exponencial de moleculas superficiales en funcion de la disminucion del tamano de particula. (De la tecnica anterior)

La Fig. 1b es un grafico de la relacion entre el area de superficie especifica de una particula esferica y el tamano de la particula (diametro en nm). (De la tecnica anterior)

La Fig. 2 es una representacion esquematica de la nanoformulacion a base de silice de la presente invencion que muestra nanoparticulas de silice cargadas de cobre (Cu) (CuSiNP).

La Fig. 3 es una imagen de microscopia electronica de transmision (TEM) de la formulacion de nanogel de silice cargado de cobre (CuSiNG) que consiste en nanoparticulas de silice de aproximadamente 10 nm de diametro que estan interconectadas.

La Fig. 4a muestra el material de nanogel de silice cargado de cobre (Cu) (SiNG) disperso en agua.

La Fig. 4b muestra el CuSiNG dispersable en agua despues de la centrifugacion con la separacion de residuo del liquido sobrenadante.

La Fig. 4c muestra una mezcla de CuSiNG dispersable en agua tratada con acido etilendiaminotetraacetico (EDTA, un agente quelante fuerte) que forma un complejo de Cu-EDTA soluble en agua.

La Fig. 4d muestra el complejo de Cu-EDTA soluble en agua despues de la centrifugacion con la separacion del complejo de Cu-EDTA y un residuo de nanogel de silice (SiNG).

La Fig. 5 es un patron de difraccion de rayos X (XRD) de una muestra de CuSiNG y un bactericida/fungicida disponible en el mercado, DuPont™ Kocide® 3000.

La Fig. 6a es el espectro de espectroscopia de fotoelectrones de alta resolucion de rayos X (XPS) de la muestra de CuSiNG que muestra picos de Cu 2p.

La Fig. 6b es la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) de una muestra de CuSiNG que muestra el espectro del nivel del nucleo 2p del Cu sin picos satelite.

La Fig. 6c es la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) del oxigeno (O) 1s en una muestra de CuSiNG.

La Fig. 6d es la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) del silicio (Si) 2p3 en una muestra de CuSiNG.

La Fig. 7a es un dibujo de un ensayo de difusion en disco de CuSiNG disperso en agua desionizada con un pH de aproximadamente 7.

La Fig. 7b es un dibujo de un ensayo de difusion en disco de una solucion de sulfato de cobre (CuSO4) en agua desionizada.

La Fig. 7c es un dibujo de un ensayo de difusion en disco de fungicida/bactericida DuPont™ 3000 Kocide® disperso en agua desionizada.

La Fig. 8 es una imagen digital de una hoja de limonero tomada 5 dias despues de la aplicacion inicial de una nanoformulacion a base de silice de la presente invencion (CuSiNG) que se expone a condiciones de fuertes lluvias, viento y tormenta en un entorno al aire libre.

La Fig. 9a muestra una imagen de campo digital de CuSiNG sobre la superficie de la hoja antes de que se pulverice el agua de lluvia sobre la superficie de la hoja.

La Fig. 9b es un dibujo de la imagen de fluorescencia de la hoja en la Fig. 9a que muestra la adhesion de CuSiNG antes que el agua de lluvia se pulverice sobre la superficie de la hoja.

La Fig. 9c muestra una imagen de campo digital de CuSiNG sobre la superficie de la hoja despues de aproximadamente 5 minutos de pulverizacion continua de agua de lluvia sobre la superficie de la hoja.

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La Fig. 9d es un dibujo de la imagen de fluorescencia de la hoja en la Fig. 9c que muestra la adhesion de CuSiNG despues de aproximadamente 5 minutos de pulverizacion continua de agua de lluvia sobre la superficie de la hoja.

La Fig. 10a muestra la formacion de una estructura de tipo reticular interconectada de CuSiNG.

La Fig. 10b muestra el aspecto de zonas oscuras dispersas en la matriz de silice, lo que confirma la presencia de materiales ricos en electrones en la matriz amorfa.

La Fig. 10c muestra el patron de difraccion de electrones del area seleccionada (SAED) del CuSiNG que indica la formacion de CuSiNG amorfo.

La Fig. 10d es una imagen de alta resolucion de microscopia electronica de transmision (HRTEM) que revela la formacion de particulas de contraste oscuro de cristalitos de Cu2O de 1-3 nanometros (nm), confirmada por la medicion del espaciado de la red, incorporado en una matriz de silice amorfa.

La Fig. 11a es una imagen de un disco de CuSiNG tratado (ensayo de difusion en disco) que muestra una superficie sin Xanthomonas alfalfa (X. alfalfae), un sustituto del cancro de los cftricos que crece rodeando el disco central.

La Fig. 11b es una imagen de un disco tratado con Kocide 3000® (ensayo de difusion en disco) que muestra un area sin crecimiento de X. alfalfae que rodea el disco central saturado con Kocide 3000®, en el que el area sin crecimiento de X. alfalfae que rodea el disco central es menor que el area sin crecimiento que rodea el disco tratado con CuSiNG de un contenido de Cu metalico identico al de la Fig. 11a.

La Fig. 11c es una imagen de un disco tratado con sulfato de Cu (ensayo de difusion en disco) que muestra un area sin crecimiento de X. alfalfae que rodea el disco central saturado con sulfato de Cu, en el que el area sin crecimiento de X. alfalfae que rodea el disco central es menor que el area sin crecimiento que rodea el disco tratado con CuSiNG de un contenido de Cu metalico identico al de la Fig. 11a y un disco tratado con Kocide 3000® de un contenido de Cu metalico identico al de la Fig. 11b.

La Fig. 11d es una imagen del disco tratado con nanogel de silice (SiNG) (ensayo de difusion en disco) que muestra el crecimiento de X. alfalfae que rodea completamente el disco central tratado con SiNG, confirmando asi que el SiNG no tiene propiedades antibacterianas.

La Fig. 12a es una imagen de fluorescencia de un disco en blanco en una placa de agar nutriente.

La Fig. 12b es una imagen de fluorescencia de un disco tratado con RuSiNG en la placa de agar nutriente de la Fig. 12a despues de la refrigeracion durante 7 dias.

La Fig. 12c es una imagen de fluorescencia de la placa de agar nutriente de la Fig. 12b cuando se elimina el disco tratado con RuSiNG.

La Fig. 13a es un dibujo de un material de SiNG (RuSiNG) cargado de colorante fluorescente (Rubpy) aplicado a una superficie de la hoja antes de lavar la hoja.

La Fig. 13b es un dibujo de una superficie de la hoja a la que se le aplica RuSiNG despues de lavar un minuto (1 min) debajo de un grifo abierto que corre rapido.

La Fig. 13c es un dibujo de una superficie de la hoja con una aplicacion de RuSiNG despues de lavar 6 minutos bajo un grifo abierto que corre rapido.

La Fig. 13d es un dibujo de una superficie de la hoja con una aplicacion de RuSiNG despues de lavar 16 minutos bajo un grifo abierto que corre rapido.

La Fig. 14a muestra un tubo de centrifugado de RuCuSiNG a la izquierda y a la derecha un tubo de ensayo de material de RuCuSiNG centrifugado tratado con EDTA como se ve a la luz ambiente.

La Fig. 14b muestra un tubo centrifugado de RuCuSiNG a la izquierda y a la derecha un tubo de ensayo de material de RuCuSiNG centrifugado tratado con EDTA como aparece bajo la iluminacion de una fuente manual de excitacion UV a 366 nm.

Descripcion de la realizacion preferida

Antes de explicar en detalle la forma de realizacion descrita de la presente invention, debe entenderse que la invention no esta limitada en su aplicacion a los detalles de la disposition particular mostrada, ya que en la invencion caben otras realizaciones. Ademas, la terminologia usada en este documento tiene la finalidad de describir y no de limitar.

Seria util describir los significados de algunas palabras y abreviaturas usadas en el presente documento para explicar la invencion con mayor detalle.

Cu representa el elemento metalico cobre.

CuSiNG representa nanogel de silice cargado de cobre.

CuSiNP significa nanoparticulas de silice cargadas de cobre.

Fungicida/bactericida Kocide® 3000; Kocide es una marca registrada de E.I. du Pont de Nemours and Company.

NG significa nanogel, que es la sustancia similar a un gel formada por la interconexion de nanoparticulas.

NP significa nanoparticulas que tienen un tamano de particula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente

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Ru significa Rubpy, un colorante fluorescente a base de rutenio, tris(2,2'-bipiridilo diclororutenio) hexahidratado [Ru(bpy)]. Cualquier colorante fluorescente o nanoparticula fluorescente (tales como los puntos cuanticos) que experimente extincion de la fluorescencia en presencia de Cu o cualquier otro agente/ingrediente activo antibacteriano/antifungico es adecuado para su uso en el presente documento.

"Si" se usa en el presente documento con el significado de dioxido de silicio, que tambien se conoce comunmente como "sNice".

La presente invention supone una aplicacion unica de nanociencia y nanotecnologia para desarrollar un material de ingenieria de nanogel de silice cargado de cobre Cu (II) (CuSiNG). La nanotecnologia permite la manipulation de un nanoentorno de silice alrededor del Cu, el establecimiento de un mecanismo de liberation sostenida de iones de Cu. El novedoso diseno de las CuSiNP que se muestra en la Fig. 2, permite la asociacion de cobre (Cu) a NG de silice en tres formas diferentes, lo que permite la liberacion sostenida del Cu. En primer lugar, los iones de Cu unidos electrostaticamente en el nucleo 10. En segundo lugar, el Cu unido covalentemente sobre la superficie de la particula hidratada 20 y los nanoporos 30. En tercer lugar, el Cu unido a la superficie como nanoagrupaciones/nanoparticulas de hidroxido/oxido 40. La estructura del nanogel se compone de nanoparticulas ultra-pequenas (CuSiNPs) de menos de aproximadamente 50 nm de diametro para proporcionar una mejor cobertura de la superficie vegetal y mejorar las propiedades de adherencia. Todas estas caracteristicas atractivas formaran una base solida para la protection a largo plazo de las plantas frente a patogenos usando el material de CuSiNG.

Debido a la ingenieria a nanoescala, el CuSiNG de la presente invencion tiene las siguientes ventajas sobre los compuestos a base de Cu existentes: una cobertura uniforme de la superficie de la planta debido al tamano ultra- pequeno de las particulas, mejores propiedades de adherencia debido a una nanoestructura similar a un gel, un perfil de liberacion de Cu sostenido (a largo plazo), un mejor control sobre la velocidad de liberacion de Cu (relation ajustable de Cu "soluble" a "insoluble"), mas actividad antibacteriana/antifungica con menos cantidad de contenido de Cu, efecto fitotoxico reducido debido a la relacion de Cu "soluble" a "insoluble" y ambiente seguro debido al menor contenido de Cu, formation de subproductos no perjudiciales, sintesis a base de agua, uso del exceso de CuSiNG como nutrientes de las plantas y minima posibilidad de tener una concentration local de Cu elevada que pudiera causar toxicidad ambiental.

El protocolo de sintesis tiene las siguientes ventajas: (i) simplicidad, (ii), a base de agua, (iii) escalable a aplicaciones de campo, (iv) metodo de sintesis en un solo recipiente, sin necesidad de etapas de purification y (v) el material de CuSiNG concentrado se podria diluir facilmente para su aplicacion en el campo. Una persona sin conocimientos tecnicos puede realizar esta tarea anadiendo una cantidad apropiada de agua, lo que reduce los costes de envio. El metodo tambien usa productos quimicos en bruto baratos y se produce facilmente de una manera rentable.

Ejemplo 1 - Sintesis de CuSiNG

La sintesis del nanogel de cobre/silice (CuSiNG) se llevo a cabo a temperatura ambiente a traves de un proceso de sol-gel catalizado por acido en una sola etapa usando tetraetoxisilano (TEOS), agua, etanol, y sulfato de Cu (II). La hidrolisis como se muestra a continuation en la ecuacion 4 y las reacciones de condensation en las ecuaciones 5 y 6 siguientes se tradujeron en la formacion de nanoparticulas de sNice ultra-pequenas cargadas de Cu (<10 nm de tamano) (CuSiNPs). Cuando se mantiene en condiciones acidas durante varias horas, tiene lugar la gelificacion. La Fig. 3 muestra la formacion de CuSiNG en la que las CuSiNP estan interconectadas.

(RO)3SiOR + H2O --> (RO)3SiOH + ROH (4)

2(RO)3SiOH --> (RO)3Si-O-Si(OR)3 + H2O (5)

(RO)3SiOH + ROSi(OR)3 --> (RO)3Si-O-Si(OR)3 + ROH (6)

El proceso de sintesis general implicara dos etapas simples: En primer lugar, la adicion de sales de Cu (II) al medio de reaction acido al comienzo de la sintesis de nanoparticulas y, segundo, la adicion de un agente neutralizante, tal como hidroxido de sodio (NaOH) despues de la sintesis para ajustar el pH a 7,0. El medio de reaccion acido se forma con cualquier acido inorganico, tal como acido clorhidrico (HCl), sulfurico (H2SO4), nitrico (HNO3) y similares. El agente neutralizante es cualquier compuesto con un pH alcalino, tal como hidroxido de sodio, hidroxido de amonio, hidroxido de potasio y similares.

La gelificacion de particulas de sol tiene lugar a lo largo del tiempo. La viscosidad del gel resultante se puede controlar facilmente mediante el ajuste del pH y el tiempo entre estas dos etapas de sintesis simples. Esta es una tecnica de sintesis sencilla en un solo recipiente en unas pocas horas que no requiere purificacion. Debido a esta simplicidad, es factible la production a gran escala de varias toneladas de CuSiNG. El proceso es medioambientalmente seguro, ya que es una tecnica de "sintesis verde" a base de agua, que no produce

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subproductos nocivos, tanto el silice como el Cu se encuentran de forma natural en el medio ambiente, el CuSiNG tendra niveles bajos de Cu "insoluble", y el CuSiNG no va a elevar los niveles locales de Cu en el suelo puesto que las plantas lo consumen como nutriente. El metodo tambien usa productos quimicos de bajo coste facilmente disponibles para la sintesis de CuSiNG.

Para estudiar la union de Cu ionico a SiNG, se sintetiza CuSiNG en medios de reaccion a pH acido, tal como una solucion de acido clorhidrico al 1 %; sin embargo, no se anade agente neutralizante. El material de CuSiNG se recoge por centrifugacion para eliminar el sobrenadante que contenga cualquier ion libre de Cu. El CuSiNG se lava varias veces con agua desionizada (DI). En este material de CuSiNG, la superficie de CuSiNP estara libre de hidroxido/oxido de Cu precipitado y el Cu se encuentra solo en su forma ionica y se identifica en el presente documento en adelante como "CuSiNP-limpio."

El CuSiNG (nanogel) consiste en CuSiNPs (particulas) de tamano uniforme ultra-pequenas interconectadas, como se muestra en la Fig. 2, formando una estructura similar a un gel, como se muestra en la Fig. 3. Estas CuSiNPs tendran una nanoestructura de nucleo-corteza. El nucleo 10 constara de silice cargada de iones de Cu y la corteza 20 soportara nanoagrupaciones de hidroxido de Cu/oxido de Cu 40 que se depositan sobre la superficie de la corteza 20. El tamano de las CuSiNP se puede ajustar y el tamano de particula se puede variar de 10 nm a 50 nm controlando el proceso de nucleacion y crecimiento. La razon para variar el tamano de particula es controlar la relacion de superficie a volumen. Un tamano de particula mas grande tendra menos superficie pero mas volumen del nucleo. Esto proporcionara una oportunidad unica para manipular la relacion de Cu ionico en el nucleo de las CuSiNP 20 al Cu ionico unido a la superficie 40. Tambien debe observarse que la silice amorfa es altamente porosa, que consta de numerosos nano-canales hidratados 30. El diametro del canal normalmente es de 1-2 nm. Las moleculas de agua y etanol pueblan la pluralidad de nano-canales (unido a traves de enlaces de hidrogeno) y proporcionan un nanoentorno unico de iones de Cu. Debe observarse que la polaridad y la capacidad de los puentes de hidrogeno se pueden ajustar facilmente dentro del nano-canal 30 variando la relacion de etanol a agua, proporcionando un buen control sobre la liberacion de iones de Cu de los canales. El nucleo 10 de la particula tiene un entorno polar reducido y se le priva de moleculas de disolvente. Este entorno facilita la formacion de nanocristales de sales de Cu, en el que estaran presentes tanto Cu como iones de sulfato en un entorno polar reducido, como se muestra en la Fig. 2.

En el CuSiNG, el Cu ionico unido a la superficie poblara la superficie de la particula, asi como la interfase particula- particula. Por lo tanto, el diseno unico de las CuSiNP proporciona tres nanoentornos de Cu diferentes, (i) el nucleo mantenido electrostaticamente de Cu 10; es decir, Cu ionico en el nucleo del NG, (ii) Cu ionico unido covalentemente dentro de nano-canales 30, sobre la superficie de la particula 20 y en la interfase y (iii) Cu depositado sobre la superficie de la particula en su forma de hidroxido/oxido 40; la forma superficial 40 del Cu estara muy expuesta al entorno circundante. El Cu presente en estos tres nanoentornos establecera diferentes cineticas de liberacion de Cu que se pueden controlar de manera sostenida. Se espera que el CuSiNG tenga una cobertura muy uniforme sobre la superficie de la planta debido al menor tamano de particula. Una vez mas, se espera una propiedad de adherencia superficial muy mejorada debido a la nanoestructura similar a un gel del CuSiNG (ya que tiene la ventaja de las propiedades de adhesion combinadas de CuSiNPs individuales en la red).

El novedoso diseno del CuSiNG ofrece Cu mas soluble ("libre y activo") para mejorar la actividad antifungica/antibacteriana a pesar de que tendra menos contenido de Cu metalico por gramo de material. Durante la aplicacion por pulverizacion en el campo, se depositara una cierta cantidad de CuSiNG en el suelo, que servira como nutriente a base de Cu para la planta. La reduccion del contenido de Cu en el CuSiNG se usa por tanto para dos fines; primero como micronutriente esencial y en segundo lugar, como fungicida/bactericida mientras se reduce al minimo la toxicidad relacionada con el Cu en el medio ambiente.

Ejemplo 2 - Union de cobre al nanogel de silice

La union de Cu al SiNG fue claramente evidente con la aparicion del color azul del producto que se muestra en la Fig. 4a. El producto es dispersable en agua. Tras la centrifugacion, se obtuvo un residuo azul y el sobrenadante era transparente como se muestra en la Fig. 4b. En contraste, cuando se prepara el NG de silice en ausencia de iones de Cu aparecia el color blanco caracteristico de la silice.

Para evaluar cuanto Cu se unia al NG de silice, el CuSiNG se trato con acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), un quelante fuerte de iones de Cu. En varios minutos, se forma un complejo de Cu-EDTA soluble en agua como se muestra en la Fig. 4c. Tras la centrifugacion, se obtuvo un residuo de color blanco del NG de silice y un sobrenadante de color azul del complejo de Cu-EDTA como se muestra en la Fig. 4d. Estos resultados demuestran claramente que la union de Cu a la silice no es tan fuerte como en el complejo de Cu-EDTA. Por lo tanto, el Cu cargado se podia liberar lentamente en su forma ionica del CuSiNG.

Caracterizacion del producto de CuSiNG

Las muestras se caracterizaron por microscopia electronica de transmision (TEM), difraccion de rayos X (XRD), espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS), y espectroscopia de dispersion de energia (EDS).

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Tamano

El tamano del CuSiNG se determino mediante microscopia electronica de transmision (TEM). El CuSiNG consistia en nanopartfculas (NPs) interconectadas de tamano ultra-pequeno (~10 nm), que forman una nanoestructura similar a un gel como se muestra en la Fig. 3. Se uso difraccion de rayos X (XRD) para determinar la cristalinidad (si la hubiera) para el CuSiNG y se compararon los datos con Kocide® 3000. El patron de XRD distingue claramente el CuSiNG del Kocide® 3000. Como se muestra en la Fig. 5, Kocide® 3000 era un material de hidroxido/oxido de Cu principalmente cristalino mientras que el CuSiNG era de naturaleza puramente amorfa. La microscopia electronica de barrido-espectroscopia de dispersion de energia (SEM-EDS, una tecnica de analisis elemental) mostraba que la cantidad de Cu (en porcentaje atomico, estimacion cualitativa) presente en el Kocide® 3000 y el CuSiNG es del 54 % at. y el 13 % at., respectivamente. El estado de oxidacion del Cu en el CuSiNG se determino por espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). La XPS es capaz de proporcionar informacion sobre el estado de oxidacion de cada componente en la muestra, asi como la composition de la superficie de la muestra.

Energia de enlace (eV)

Espectros de alta resolution regional de la composicion elemental clave proporcionan informacion detallada del componente individual tal como el desplazamiento quimico y cambios de intensidad, que indican cambios en la union entre los elementos individuales. Los espectros de XPS de alta resolucion de cobre (Cu) 2p, oxigeno (O) 1s y silice (Si) 2p3 se muestran en la Fig. 6. Los picos de Cu 2p a una energia de enlace de 933,3 eV se atribuyeron al entorno de Cu2+. Picos satelite amplios a energias de enlace mas altas tambien sugieren la presencia de estados ionicos de Cu2+. El componente de mayor energia de enlace situado a 935,2 eV se atribuyo a especies de Cu(OH)2. Los picos del O 1s y Si 2p3 se encuentran a una energia de enlace de 532,1 eV y 103,1 eV, respectivamente. La energia de enlace del Si 2p coincide muy bien con los datos publicados por el National Institute of Standard and Technology de EE.UU., es decir, el Si en la muestra del CuSiNG se encuentra en forma de SiO2.

Analisis de la composicion

El analisis semi-cuantitativo de la composicion es posible al comparar los datos de la XPS y la EDS, ya que la XPS es un metodo sensible de la superficie y EDS es un metodo en bruto de analisis de la composicion. Las relaciones atomicas de Si/Cu de XPS y EDS se determinaron integrando las areas de pico y dividiendo por los factores de sensibilidad. Las relaciones de Si/Cu a partir de los datos de EDS y XPS se identificaron como 2,3 y 7,3, respectivamente, lo que confirma que el Cu se distribuye por todo el CuSiNG.

Actividad antibacteriana

La evaluation de la actividad antibacteriana del CuSiNG se realizo usando E. coli como sistema modelo. Se uso el ensayo de difusion en disco, considerado como uno de los metodos microbiologicos mas comunes para la evaluacion de agentes antibioticos potenciales, para evaluar la actividad antimicrobiana del material de CuSiNG. Especificamente, E. coli (cepa 8739 de la ATCC) cultivadas en placas de agar nutriente se incubaron con discos de papel de filtro que contienen el mismo volumen y concentration de Cu de soluciones acuosas de Kocide® 3000 50, sulfato de Cu (pH 7) 60, CuSiNG (pH 7) 70 o nanoparticulas (NPs) de silice pura (pH 7) (no mostrado). Despues de incubar durante toda la noche a 37 °C, se comprobo que el CuSiNG presentaba una actividad antimicrobiana muy significativa, como se muestra en la Fig. 7a, e indicada por una zona de aclaramiento marcado que se extiende desde el disco correspondiente 70. En particular, la actividad del CuSiNG fue mas pronunciada que la de la solution de sulfato de Cu en el disco 60, como se muestra en la Fig. 7b y Kocide® 3000 en el disco 50, que se muestra en la Fig. 7c a pesar de que el contenido de Cu en el CuSiNG es aproximadamente 4 veces mas bajo que el contenido de Cu en Kocide® 3000 (segun lo determinado por las mediciones de SEM-EDS). La superficie sin crecimiento de E. coli que rodea el disco de papel de filtro 50 con Kocide® 3000 es aproximadamente la mitad del area sin crecimiento de E. coli para el disco 70 con CuSiNG, lo que confirma la eficacia de la formulation de CuSiNG con una cuarta parte del contenido de cobre; la formulacion de CuSiNG tiene el doble de actividad antimicrobiana que Kocide® 3000. Cabe senalar que el NG de silice pura, preparado sin los iones de Cu, no muestra ninguna actividad antibacteriana.

Propiedad de adherencia

La evaluacion de la propiedad de adherencia del CuSiNG se evaluo cualitativamente en una planta de limon. La planta se obtuvo de una tienda de Home Depot® en Orlando, FL. En un procedimiento experimental tipico, una primera pulverization de una suspension acuosa de CuSiNG y Kocide® 3000 se pulverizo uniformemente a una distancia de 6 pulgadas (15 cm) sobre media docena de hojas experimentales preseleccionadas, asignadas para cada muestra, usando una botella de pulverizador de mano. El exceso de liquido cayo por goteo de la superficie de la hoja. En esta etapa, se tomaron imagenes digitales de la superficie de la hoja pulverizada con Kocide® 3000, CuSiNP y CuSiNG, los resultados de la adherencia se registran en la Tabla II a continuation. Se dejo que el liquido pulverizado se secase por completo y se volvieron a tomar imagenes de la superficie de la hoja seca pulverizada con Kocide® 3000 y CuSiNG. Aproximadamente 2 horas mas tarde, se pulverizo agua de lluvia natural de forma continua durante 5 minutos aproximadamente sobre las mismas hojas experimentales y se dejo que las hojas sometidas a

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pulverizacion continua de agua de lluvia se secasen completamente. En esta etapa, se evaluan visualmente las imagenes digitales de las hojas secas con una primera pulverizacion de Kocide® 3000, CuSiNP y CuSiNG y una segunda pulverizacion de agua de lluvia para la adherencia del agente antibacteriano/antifungico a la superficie de la hoja. Se usa una escala de 1 a 5 para evaluar la adherencia.

1 = 1-5 % de la composicion antibacteriana/antifungica se encuentra sobre la superficie de la hoja;

2 = 6-15 % de la composicion antibacteriana/antifungica se encuentra sobre la superficie de la hoja;

3 = 16-40 % de la composicion antibacteriana/antifungica se encuentra sobre la superficie de la hoja;

4 = 41-75 % de la composicion antibacteriana/antifungica se encuentra sobre la superficie de la hoja;

5 = 76-95 % de la composicion antibacteriana/antifungica se encuentra sobre la superficie de la hoja.

Tabla II - Adhesion de la composicion antibacteriana/antifungica a la superficie de la hoja

PRODUCTO

KOCIDE® 3000 CuSiNP CuSiNG

Pulverizacion en primer lugar (producto aplicado)

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Secado

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Pulverizacion en segundo lugar (5 minutos con agua de lluvia)

- - -

Secado

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Producto sobre la hoja

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Los resultados indican claramente la propiedad de adherencia superior de la suspension de CuSiNG sobre Kocide® 3000. Como era de esperar, el CuSiNG mostraba una cobertura mas uniforme sobre la superficie de la hoja. Curiosamente, la aplicacion de CuSiNG a una hoja de limonero resistio muy bien la caida de lluvia fuerte y tormenta electrica que se experimento de forma continua durante cinco dias y que se muestra en la Fig. 8; imagen ampliada de una hoja del limonero con una cubierta protectora marmorea y visualmente discernible de CuSiNG. La mayor parte de la formulacion Kocide® 3000 fue arrastrada despues de un par de minutos de pulverizacion de agua de lluvia.

A fin de evaluar la propiedad de adherencia del CuSiNG, se uso una tecnica de fluorescencia. Hojas de limonero se marcaron con isotiocianato de fluoresceina (FITC), un colorante fluorescente de emision verde. El colorante esta unido covalentemente a la silice. El fin de la marcacion con fluorescencia era evaluar la propiedad de adherencia del SiNG con mayor sensibilidad usando mediciones de fluorescencia. En la hoja experimental que se muestra en la Fig. 9a se ha creado una matriz de puntos con el material de SiNG fluorescente y se deja secar completamente en un ambiente oscuro para evitar el fotoblanqueo de los colorantes de FITC.

Usando una fuente de luz UV de mano (excitacion multibanda a 366 nm), se apreciaron claramente manchas de fluorescencia verde en la superficie de las hojas antes de la pulverizacion de agua de lluvia. La Fig. 9b es un dibujo de la imagen de fluorescencia que muestra los puntos fluorescentes del CuSiNG en el mismo patron que la hoja de la Fig. 9a.

Despues de aproximadamente 3 horas, se pulverizo agua de lluvia natural durante aproximadamente 5 minutos a la hoja de la Fig. 9b, el pulverizado se dejo secar, de nuevo completamente en oscuridad, y la hoja seca se muestra en la Fig. 9c, con varios puntos de CuSiNG sobre la superficie. Usando una fuente de luz UV de mano (excitacion multibanda a 366 nm), se apreciaron claramente manchas de fluorescencia verde en la superficie de las hojas despues de la pulverizacion de agua de lluvia. La Fig. 9d es un dibujo de la imagen de fluorescencia que muestra el material fluorescente del CuSiNG que se adhiere a la hoja en la Fig. 9c en un patron similar, como se muestra en la hoja de la Fig. 9c. Las imagenes fluorescentes en las Figuras 9b y 9d confirman que el material de CuSiNG no se arrastra de la hoja cuando se somete a pulverizacion de agua de lluvia.

La enorme area de superficie de los materiales de nanogel (NG) es, de hecho, un factor que contribuye a la liberacion de una cantidad adecuada de Cu "soluble". La matriz de silice-nanogel (SiNG) es porosa y la superficie esta muy hidratada, como se describe por S. Santra et al. en "Fluorescence Lifetime Measurements to Determine the Core-Shell Nanostructure of FITC-doped Silica Nanoparticles: An Optical Approach to Evaluate Nanoparticle Photostability," Journal of Luminescence, 2006. 117 (1) paginas 75-82. Esta matriz de silice proporciona un entorno unico, lo que permite la incorporacion de diversos iones metalicos, como se describe en la patente de Estados Unidos 6.548.264 de Tan, et al., asi como moleculas sin un cambio significativo en las propiedades fisicas y quimicas. Los estudios de caracterizacion muestran claramente que los iones de Cu se incorporan con exito dentro de la matriz de silice y los iones de Cu incorporados se liberan de una manera sostenida.

La adherencia y la liberacion lenta y sostenida de iones de Cu proporcionan algunos otros beneficios para la presente invencion. En primer lugar, cuando se aplica a plantas, arboles y similares, las hojas y/o ramas que caen al suelo proporcionan cobre, un nutriente muy deseado para el suelo y a niveles muy bajos que no son perjudiciales para el medio ambiente. Ademas, cuando las plantas y arboles se cosechan o se retiran de la produccion agricola, la vegetacion tratada se puede usar para mantillo o abono y proporciona nutrientes de Cu adicionales como fertilizante.

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Se proporcionan nuevos datos, el rendimiento y las formulaciones de biocidas de nanogel a base de Cu. La nueva generacion de biocidas de nanogel a base de Cu presenta una mejor biodisponibilidad del Cu, un entorno de Cu en el material de CuSiNG que es unico y manipulable, una composicion a base de Cu con mejores propiedades de adherencia y propiedades que permiten evaluar y determinar si el biocida se tiene que volver a aplicar.

Recientemente se ha descubierto que la matriz de silice del nanogel de sNice es capaz de albergar simultaneamente dos formas activas de cobre, Cu+ (I) y Cu++ (II). El Cu (I) esta presente como Cu2O en forma nanocristalina (tamano de cristal de 1-3 nanometros (nm)) y el Cu (II) esta presente en forma amorfa (debilmente quelado por los grupos silanol). El equilibrio establecido por las dos formas activas del cobre afecta a la cinetica global de liberacion de los iones de Cu, por lo tanto, el nanogel de silice (SiNG) es capaz de albergar Cu tanto +1 (cuproso, forma cristalina) como +2 (cuprico, forma amorfa) en la misma matriz que contribuye a la liberacion sostenida del Cu y una mejor biodisponibilidad del Cu. A diferencia de cualquiera de los compuestos de Cu existentes, el entorno de Cu en el CuSiNG es unico y permite su manipulacion para mejorar el rendimiento de la composicion biocida.

Otro descubrimiento reciente es la propiedad del material de nanogel de silice cargado de Cu (CuSiNG) que se difunde lentamente desde la ubicacion de su aplicacion en ambientes humedos. Por lo tanto, en aplicaciones de pulverizacion, el CuSiNG se difunde hacia fuera y cubre las superficies de tejido recien expuesto de frutas y hojas jovenes de crecimiento rapido, reduciendo asi al minimo el numero de aplicaciones por temporada de crecimiento y el aumento de la longevidad y de la cobertura de la superficie de la planta.

Una nueva generacion de CuSiNG.

Como se describe en el Ejemplo 1 anterior, la gelificacion de particulas de sol tiene lugar con el tiempo. El proceso de gelificacion reune SiNPs ultra-pequenas (<10 nm de tamano) con un proceso de condensacion adicional en presencia de iones de Cu, formando asi el material de CuSiNG, que tiene una estructura similar a una red como se muestra en la Fig. 10a. La composicion del medio de reaccion, asi como el pH del medio, favorecen la formacion de nanoparticulas de oxido de Cu (I) altamente cristalino de 2-3 nm de tamano 115 que permanecen incorporadas a la matriz de nanogel de silice como se muestra en la Fig. 10b y la Fig. 10d. El patron de difraccion de electrones en el area seleccionada (SAED) en la Fig. 10c indica la formacion del CuSiNG amorfo. La Fig. 10d es una imagen de alta resolucion de microscopia electronica de transmision (HRTEM) que muestra la formacion de particulas de contraste oscuro de 1-3 nm 115, marcado por las lineas paralelas entre dos flechas opuestas, a medida que los cristalitos se incorporan a la matriz de silice amorfa. El espaciado reticular medido en la imagen de HRTEM ampliada es de aproximadamente 2,447 A, que indica la formacion de cristalitos Cu2O.

La estructura del nanogel de silice de la presente invencion esta cargada con dos estados de valencia del Cu que permanecen intactos. La relacion del Cu cristalino a amorfo se controla cambiando la composicion del medio de reaccion. Esto proporciona una excelente oportunidad para controlar la cinetica de liberacion del Cu. El cobre amorfo se libera rapidamente y libera lentamente cobre cristalino. Para la prevencion a largo plazo de la enfermedad del cancro de los citricos, es conveniente que la formulacion a base de Cu suministre iones de Cu de forma sostenida sin comprometer la eficacia antibacteriana, como por ejemplo, la biodisponibilidad del Cu con el tiempo.

Se ha sintetizado un nanogel de silice cargado de Cu hibrido (H-CuSiNG) en el que la matriz de SiNG se carga con un compuesto de silano para lograr una cobertura uniforme de la superficie de la planta. Se prepara un material de CuSiNG altamente disperso que incluye un precursor de silano, como por ejemplo metilfosfonato de 3- (trihidroxisilil)propilo (THPMP), en un procedimiento en dos etapas en un solo recipiente como se describe en el Ejemplo 1. El proceso en el Ejemplo 1 se modifica con la adicion del precursor de silano con los iones de cobre en la etapa uno, que implica la adicion de sales de Cu (II) al medio de reaccion antes de la sintesis de nanoparticulas/nanogel. Durante la formacion de la red de nanoparticulas/nanogel de silano, los iones de cobre (Cu) seran capturados. El THPMP es un silano altamente soluble en agua que contiene el grupo fosfonato cargado negativamente. Ademas de mejorar la dispersabilidad, el THPMP interactua con los iones de Cu y modula la velocidad de liberacion de los iones de Cu, mejorando asi la cobertura de la superficie, la resistencia a la lluvia y la longevidad de la cobertura. Los compuestos de silano adecuados para la presente invencion estan disponibles en el mercado de proveedores tales como Gelest, Morrisville, PA 19067.

La caracterizacion detallada de los materiales revela que el CuSiNG es un nanomaterial unico. A diferencia de otros compuestos de Cu existentes, incluyendo Kocide® 3000, el CuSiNG es un material principalmente amorfo tal como se confirma por el estudio de difraccion de rayos X (XRD) en el que Cu (II) se compleja con los grupos silanol de la silice tal como se confirma por el estudio de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). El estudio de HRTEM confirma que el material incorpora nanoparticulas de oxido de Cu (I) de tamano cristalino de 1-3 nm 115 que aparecen como zonas de contraste oscuras en la Fig. 10b. Las mediciones BET basadas en las isotermas de adsorcion/desorcion de nitrogeno confirmaron que el material de CuSiNG es altamente poroso con un tamano de poro de aproximadamente 7,4 nm y un volumen de poro de aproximadamente 1,023 cc/g y posee una enorme area superficial de aproximadamente 336,1 m2/g.

Propiedad antibacteriana del material de CuSiNG. La evaluacion de la propiedad antibacteriana del CuSiNG se llevo a cabo frente a X. Alfalfae como sistema modelo usando un "ensayo de difusion en disco" convencional. El

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cultivo de X. alfalfae crecido en placas de agar nutriente se incubo con discos que contienen un volumen igual de soluciones acuosas de Kocide® 3000, sulfato de cobre en agua desionizada (DI), CuSiNG a un valor de pH 7 y SiNG. El contenido de Cu metalico se mantuvo igual en todas estas soluciones acuosas a base de Cu. Despues de incubar durante toda la noche a 30 °C, se comprobo que el CuSiNG 100 en la Fig. 11a presenta una actividad antimicrobiana muy significativa para X. alfalfa. Esto se indica por una zona de marcado aclaramiento que se extiende desde el disco correspondiente. En particular, la actividad anti-bacteriana del CuSiNG fue mas pronunciada que la de Kocide® 3000 200 en la Fig. 11b y el sulfato de Cu 300 en la Fig. 11c a pesar de que el contenido de Cu metalico permanecio igual. Cabe senalar que, como se esperaba, el SiNG 400 no presentaba actividad antibacteriana alguna como se muestra en la Fig. 11d.

Los resultados experimentales anteriores sugieren que se mejora la biodisponibilidad del Cu cuando se cargan dos estados de valencia del Cu (Cu1+ y Cu2+) en una matriz de SiNG. Esta mejora de la eficacia no puede explicarse basandose en los datos de solubilidad notificados de los materiales probados. El valor del producto de solubilidad (Ksp) del hidroxido de Cu es de 2,20 x 10-20. Por lo tanto, se espera la liberacion lenta de iones de Cu2+ del Kocide® 3000. El sulfato de Cu, por otra parte, es una sal altamente soluble en agua con pH acido (pH ~3,0) y por lo tanto se espera una liberacion abundante de Cu2+. Se sabe que el agar, un material a base de azucar, se une a iones metalicos. Por tanto, se espera que se una a los iones de Cu y retarde la difusion del Cu con independencia de los materiales que contienen Cu probados tales como el sulfato de Cu, Kocide® 3000 y materiales de CuSiNG. Ademas, los materiales de CuSiNG deben tener Cu menos soluble en comparacion con el sulfato de Cu y Cu mas soluble en comparacion con el Kocide® 3000. Por lo tanto, la actividad anti-bacteriana inesperadamente alta del material de CuSiNG posiblemente se debe a su capacidad para migrar por difusion desde el disco, e interactuar directamente con las bacterias. Esta interaccion directa aumentara la concentracion local de Cu en la superficie celular bacteriana, matandolas asi eficazmente.

Difusion del material de CuSiNG. Para analizar las propiedades de difusion del CuSiNG, se cargo SiNG fluorescente con un colorante fluorescente metalorganico que emite rojo anaranjado, tris(2,2'-bipiridilo) diclororutenio (II) hexahidratado (Rubpy), un colorante altamente soluble en agua con excitacion a una longitud de onda de 455 nm y emision a una longitud de onda de 600 nm. El colorante fluorescente brillante y fotoestable anadido al material de SiNG se denomina en lo sucesivo RuSiNG. El RuSiNG se lavo varias veces en agua desionizada (DI) para asegurar la eliminacion de todo el Rubpy no unido. Se desarrollo una prueba cualitativa para evaluar la propiedad de difusion del SiNG cargado de Rubpy (RuSiNG) usando una placa de agar nutriente como sustrato. En un procedimiento tipico, se administran 200 |jl de RuSiNG (~1 mg/ml) a un disco de papel en blanco de 13 mm. A continuacion, el disco se coloca en el centro de una placa de agar nutriente. La placa se refrigera durante una semana antes de la toma de imagenes con un microscopio de fluorescencia (Olympus MVX10 equipado con camara a color DP72; juego de filtros: filtro de excitacion de paso de banda de 380-420 nm y filtro de emision de paso largo de 475 nm). Se ve claramente que el RuSiNG difunde fuera del disco como se muestra en las Figuras 12a-12c. En la Fig. 12a hay una imagen de fluorescencia de un disco en blanco en una placa de agar nutriente. La Fig. 12b, muestra una imagen de fluorescencia de un disco RuSiNG tratado en una placa de agar nutriente despues de su refrigeracion durante 7 dias. La Fig. 12c es una imagen de fluorescencia de la misma placa de agar de la Fig. 12b con el disco RuSiNG eliminado. Este estudio de difusion demuestra que el material de SiNG fue capaz de difundir sobre un sustrato de agar en condiciones refrigeradas.

En resumen, el estudio de difusion indica que el material de CuSiNG de la presente invencion es capaz de difundir en un ambiente humedo (por ejemplo, el clima humedo tipico de Florida) con el tiempo. Esta propiedad de difusion es fundamental para la proteccion de la amenaza del cancro de frutos y hojas jovenes de citricos en rapida expansion. Una vez aplicado al comienzo de la temporada, el material de CuSiNG se propaga lentamente con el tiempo para cubrir la superficie del tejido recien formado, lo que no deja espacio para que las bacterias del cancro causen la infeccion.

Evaluacion de la propiedad de adherencia del material de CuSiNG. Se observo visualmente que el material de CuSiNG tiene mejores propiedades de adherencia (determinadas despues de la aplicacion por pulverizacion de agua de lluvia continua durante 5 minutos) en comparacion con Kocide® 3000 cuando se estudia en una planta de limon. A fin de evaluar la propiedad de adherencia del material de SiNG a niveles microscopicos, se uso RuSiNG fluorescente como material modelo. Se administra una pequena alicuota (10 jl) de RuSiNG (~1 mg/ml) en forma de punto en una hoja de citricos limpia y fresca, y se deja secar. La hoja se observa bajo un microscopio de fluorescencia (microscopio Olympus MVX10 con gran distancia de funcionamiento) despues de la administracion inicial y despues de 3 lavados posteriores. Cada lavado se llevo a cabo manteniendo la hoja debajo de un grifo de agua corriente durante un periodo de tiempo determinado. Se tomaron una serie de imagenes de fluorescencia para el prelavado (Fig. 13a), despues de 1 minuto de lavado (Fig. 13b), despues de 6 minutos de lavado (Fig. 13c) y despues de 16 minutos (Fig. 13d) de lavado de las muestras. Las imagenes muestran claramente que el material de SiNG tiene una propiedad de adherencia extremadamente fuerte a la superficie de la hoja de los citricos. La propiedad de fuerte adherencia del material de SiNG refleja una fuerte interaccion de van der Waals (fuerzas intermoleculares) entre el CuSiNG y la superficie de la hoja. Una fuerte adherencia del material de SiNG de este tipo se debe a sus propiedades a escala nanometrica, tales como, alta area de superficie y la estructura de tipo reticular. Un estudio de las propiedades de adherencia del CuSiNG demuestra claramente el papel de la nanotecnologia en la mejora drastica de la propiedad de adherencia del material a base de SiNG a una superficie de la hoja de los

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Fluorescencia para medir la necesidad de aplicaciones repetidas de CuSiNG. Una tecnica de deteccion basada en la fluorescencia permite controlar la liberacion de Cu en tiempo real. El mecanismo de deteccion se basa en la extincion de la fluorescencia. Es bien sabido que los iones de Cu pueden extinguir eficazmente la fluorescencia de colorantes fluorescentes mediante procesos de transferencia de energia y/o transferencia de electrones. Por lo tanto, si un colorante fluorescente, tal como Rubpy, se incorpora en el material de CuSiNG, se extinguira la fluorescencia del colorante Rubpy. Tras la liberacion de los iones de Cu, se restaurara la fluorescencia de Rubpy. La viabilidad de este mecanismo se puso a prueba cuando se sintetizo material de CuSiNG cargado de Rubpy (RuCuSiNG) mediante mezcla simple. Como era de esperar, la fluorescencia de Rubpy se extinguio completamente debido a la presencia de iones de Cu. Sin embargo, la fluorescencia se restauro por completo cuando se elimino el Cu al tratar el RuCuSiNG con acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), un agente quelante fuerte como se muestra en las Figuras 14a y 14b. En la Fig. 14a se muestra un material de RuCuSiNG centrifugado como deposito pesado 180 en la parte inferior del tubo de la izquierda y en una fase dispersa 185 en el tubo de la derecha hay evidencias de fluorescencia bajo luz ambiente cuando se trata con EDTA. En la Fig. 14b el material de RuCuSiNG centrifugado 190 de la izquierda se trata con EDTA, un agente quelante que elimina el cobre de la solucion y bajo una luz manual de excitacion de una longitud de onda UV de 366 nm, se muestra fluorescencia brillante 195 en el tubo de la derecha. Esto ocurre despues de que el ion de Cu se extraiga del material como complejo de Cu-EDTA. Esto proporciona una base para usar una tecnica de deteccion altamente sensible basada en la fluorescencia para controlar la liberacion de Cu del material en tiempo real.

Debido a la alta sensibilidad de la tecnica de fluorescencia y la gran relacion senal a ruido, se preve la deteccion sensible de la liberacion de Cu. Basandose en este estudio de deteccion, seremos capaces de predecir la biodisponibilidad del Cu y de seleccionar una serie de materiales de CuSiNG al aumentar la relacion de las formas amorfas (Cu2+) a las formas cristalinas (Cu1+).

Otro de los beneficios de las nanoparticulas y el nanogel de silice cargados de Cu de la presente invencion consiste en controlar el crecimiento de moho y hongos mildiu. Las formulaciones de nanoparticulas/nanogel de silice cargadas de cobre (Cu) de la presente invencion tienen una actividad antifungica/antibacteriana superior para tratar areas que favorezcan y fomenten el crecimiento de moho y hongos mildiu; ademas, un solo tratamiento sigue siendo eficaz durante al menos dos meses a seis meses aproximadamente debido a que la liberacion de Cu ionico se produce de una manera lenta, sostenida y en cantidades que inhiben la germinacion de las esporas de los hongos, las "semillas" principales responsables de la difusion y reproduction del hongo o la bacteria. Debido a que las esporas o celulas retiradas del ciclo actual de infection no maduran ni se reproducen en presencia de cobre, el hongo o bacteria muere de manera eficaz. Los banos, cocinas, zonas interiores y exteriores de estructuras sometidas a condiciones de calor y humedad se mantienen libres de moho y hongos mildiu desagradables cuando se tratan con la nanoformulacion a base de silice de la presente invencion.

En conclusion, por primera vez, se proporciona un mecanismo de liberacion sostenida de Cu usando un diseno unico de cobre (Cu), que contiene la formulation de nanoparticulas/nanogel de silice (SiNP/NG). La nanoformulacion a base de silice tiene aplicaciones inmediatas para el tratamiento del cancro de los citricos. Los usos adicionales de composiciones antifungicas/antibacterianas que contienen SiNP/NG son como agentes antibacterianos/antifungicos para fines generales en agricultura y horticultura, incluyendo, pero no limitado a su uso en hortalizas, flores, hierba, otras plantas, aplicaciones domesticas, telas, cueros, plasticos, pinturas y similares. El diseno del CuSiNG, posible gracias a la nanotecnologia, es una "re-invencion revolucionaria" del Cu para la aplicacion segura en la agricultura moderna en el siglo XXI.

Claims (5)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para sintetizar una nanoformulacion a base de sNice que contiene agentes antibacterianos y antifungicos usando un proceso sol-gel en un solo recipiente y catalizado por acido, que comprende las etapas de:

   selection de un recipiente de reaction que contiene un medio de reaction acido;

   adicion de tetraetoxisilano (TEOS), agua, etanol y un agente antibacteriano o antifungico que contiene iones de cobre en el recipiente de reaccion, con el medio acido para formar una mezcla I;

   permitir que la reaccion de la mezcla I prosiga durante aproximadamente una hora para facilitar la formation de una pluralidad de nanoparticulas a base de silice;

   adicion de un agente neutralizante despues de la formacion de una pluralidad de nanoparticulas para ajustar el valor de pH de la mezcla de reaccion a aproximadamente 7,0;

   permitir que la reaccion neutralizada de la mezcla I prosiga durante aproximadamente 12 horas, preferentemente durante toda la noche, para permitir que se produzca la gelificacion, y formar una estructura de nanogel que consiste en nanoparticulas interconectadas; y

   recogida de un nanogel poroso a base de silice que tiene agentes antibacterianos y antifungicos unidos en una pluralidad de nanoparticulas interconectadas del nanogel;

   en el que el agente antibacteriano o antifungico es una pluralidad de iones de cobre (Cu) que proceden de un compuesto de cobre;

   caracterizado por que la pluralidad de nanoparticulas interconectadas del nanogel contienen

   - una pluralidad de iones de Cu electrostaticamente unidos al nucleo de nanoparticulas,

   - una pluralidad de nanocristales de Cu incorporados que incluyen al menos Cu2O,

   - una pluralidad de iones de Cu unidos covalentemente a una matriz de silice con una superficie de la corteza hidratada, nanoporos de la nanoparticula y canales porosos de nanogel, y

   - una pluralidad de oxido/hidroxido de Cu como nanoagrupaciones/nanoparticulas unidas a la superficie de la nanoparticula.
2. 2. Una composition para el tratamiento y la prevention de enfermedades en una especie vegetal, que comprende una nanoformulacion a base de silice que comprende una pluralidad de iones de cobre incorporados a una pluralidad de nanoparticulas de silice o que comprende una pluralidad de iones de cobre incorporados a un nanogel de silice, en donde la nanoformulacion a base de silice incluye una matriz de silice en un nanogel de silice cargado de iones de cobre (CuSiNG); y

   caracterizado por que la matriz de silice en el nanogel de silice cargado de iones de cobre (CuSiNG) alberga simultaneamente dos formas activas del cobre, en donde una primera forma del cobre es amorfa y una segunda forma del cobre es cristalina y el equilibrio establecido por las dos formas activas del cobre se puede ajustar para controlar la cinetica de liberation de los iones de cobre y mejorar la biodisponibilidad de los iones de cobre.
3. 3. La composicion de la reivindicacion 2, en la que la fuente de la pluralidad de iones de cobre procede de compuestos de cobre seleccionados del grupo que consiste en cobre metalico, oxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, hidroxido de cobre y sus mezclas.
4. 4. La composicion de la reivindicacion 2, que incluye ademas un compuesto precursor de silano para lograr una cobertura uniforme de la superficie de la planta, modular la tasa de liberacion de iones de cobre, mejorar la resistencia a la lluvia y aumentar la longevidad de la cobertura de la superficie de la planta.
5. 5. La composicion de la reivindicacion 4, en la que el compuesto precursor de silano es metilfosfonato de 3- (trihidroxisilil)propilo (THPMP).