WO2022168070A1 - Formulación antimicrobiana que comprende nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos sintetizados a partir de extractos vegetales - Google Patents

Formulación antimicrobiana que comprende nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos sintetizados a partir de extractos vegetales Download PDF

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Julián Mauricio GUERRERO RODRÍGUEZ
José Gabriel LÓPEZ ORTIZ
Maria Fernanda ROMERO PINEDA
Debora Alcida NABARLATZ
Leydy Paola BARRERA LEMUS
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Zumo Tecnología Zumotec S.A
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Definitions

  • the present invention is in the field of biotechnology and nanotechnology, specifically in the field of nanoparticle synthesis methodologies that are friendly to the environment.
  • Top-down routes have disadvantages in terms of homogeneity in the shape and size of the particles, as well as the use of large equipment that generally requires high energy consumption.
  • bottom-up routes turn out to be the most viable option to obtain homogeneous and small-sized nanoparticles (Campo Becerra, 2018).
  • These routes allow the chemical synthesis of nanoparticles based on the reduction of ionic species from a metal salt or precursor and a reducing agent and/or stabilizing agent, where the metal salt, considered as a precursor of the reaction, is gradually reduced. by action of the reducing agent to form atoms of the same metal, but with lower valence.
  • atoms act as small nuclei that agglomerate to form larger molecules, which continue to grow as other atoms continue to be added and this growth stops until the agglomeration of atoms reaches a nanometric level.
  • control of variables and reaction conditions during the nanoparticle synthesis process such as temperature, pH, solvents and/or reagents, among others, constitutes a set of critical parameters that can affect the toxicity derived from the use of reagents. hazards, environmental impact, production costs, scalability, final shape, size, particle size distribution and thus the physical and chemical properties of nanoparticles (Valdez Aguilar, J. 2015).
  • Such synthesis methods provide advantages over chemical and physical methodologies in terms of cost effectiveness, scalability, use of non-toxic chemical agents, and use of low pressures, temperatures, and reaction energies. Additionally, the matrix of the extracts used in the green synthesis methodologies sometimes acts as a stabilizer, which decreases the aggregation of metallic particles without the need to add dispersing agents. In addition, the use of different parts of the plant allows the valorization of biomass as it can be considered waste material from other agro-industrial processes or sub-processes (Nadagouda, M.N.; et al., 2010).
  • document US20070218555 discloses a formulation with an antimicrobial effect that contains silver nanoparticles stabilized with an aqueous solution of plant tissue, together with additional excipients such as surfactants, preservatives, Theological agents, polymers, among others. Additionally, this document discloses the method for obtaining said antimicrobial formulation.
  • document KR20190072716 discloses a biological method for preparing copper or copper-silver alloy nanoparticles in a colloidal state, using an aqueous plant extract of corn, currant, magnolia leaves and turmeric as a reducing agent.
  • Patent JP2017025383 teaches a composition of metallic nanoparticles, particularly gold, copper, platinum, palladium or silver, and a method for their preparation, where said formulation is used as an antibacterial, antiviral, catalyst or dye agent and uses alcoholic extracts from plants.
  • the present invention evaluates various extracts from various parts of different plants, with reducing and stabilizing activity for the green synthesis of metal nanoparticles and their use in a broad-spectrum biocide formulation.
  • the present invention relates to a biocidal composition
  • a biocidal composition comprising metal or metal oxide nanoparticles obtained by green synthesis.
  • extracts from different parts of plants are used as reducing and stabilizing agents, water, plant extract, precursor salt, surfactants and other additives. Thanks to the composition of the present invention, the provided biocidal effect exhibits broad-spectrum antimicrobial activity.
  • the method for the preparation of said metal nanoparticles or metal oxides mainly comprises mixing a solution of a first metal salt with an extract of particular plant material under conditions of time, agitation, temperature and pH, leaving the solution at rest Mix and take readings on the spectrophotometer.
  • FIG. 1 Characterization of the solution of copper (Cu) nanoparticles by Dynamic Light Scattering (DLS). The distribution of particle sizes can be evidenced.
  • the present invention relates to a biocidal composition
  • a biocidal composition comprising metal or metal oxide nanoparticles obtained by green synthesis. Additionally, the method for the preparation of said metal or metal oxide nanoparticles is described and claimed.
  • their usual meaning in the technical field should be taken into account, unless a particular definition is incorporated. Additionally, terms used in the singular form will also include the plural form.
  • the biocidal composition developed here comprises metal or metal oxide nanoparticles and a plant extract.
  • nanoparticles are understood as an agglomeration of metal atoms of a metal reduced by the action of a plant extract, but could include other components such as reducing compounds or not from the same extract used, conjugated or not with other substances, from the reduction of one or more metal salts, and have a size of less than 100 nanometers, preferably between 10 and 80 nm.
  • the metal of the metallic or metallic oxide nanoparticles is selected from the group of transition metals, XIII and XIV.
  • the metal of the nanoparticles is selected from, but not limited to, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, yttrium, zirconium, niobium, molybdenum, rhodium, palladium, silver, cadmium, tungsten, iridium, platinum, gold, aluminum, gallium, indium, tin, platinum, silicon, and germanium, and mixtures thereof.
  • the metal of the metal nanoparticles or metal oxides is selected from copper, silver, zinc, iron and copper-silver.
  • the nanoparticles are found in the biocidal composition in a concentration between 0.01 and 30% (p/v), preferably between 0.05% and 5% (p/v) and more preferably between 0.05 and 1%. (w/w).
  • the plant extract is understood as the product resulting from contacting any part of a plant with a solvent, so said extract is any of the aqueous or non-aqueous, polar or non-polar components or derivatives thereof. process.
  • This extract must be filtered or centrifuged to separate the residue or material, and it is the one that is part of the biocidal composition in a concentration between 0.01 and 30% (p/v), preferably between 10 and 25% (p/v).
  • the extracts of the present invention are selected from the group that includes, but is not limited to, extracts of the plant species Passiflora ligularis (granadilla), Sambucus mexicana (elderberry), Selenicereus megalanthus (yellow pitahaya), Solanum quitoense (lulo), Amona cherimola (cherimoya), Solanum bataceum (tree tomato), Cucurbita moschata (squash), Luff aegyptiaca (scouring pad), Arracada xanthorrhiza (arracacha), Fragaria ananassa (strawberry), Furcraea andina (fique), Alibertia patinoi (borojó), Pourteria sapota (sapote), Ficus carica (fig tree), Passiflora quadrangularis (badea), Vaccinium meridionale (agraz), Passiflora maliform
  • the plant extracts can be present as reducing agents, stabilizers or as adjuvants.
  • the biocidal composition also comprises a polymeric thickener that can be a gel colloid and is selected from, without limitation, cellulose gels, alginates, agar-agar, carrageenan, pectin, xanthan gum, gelatin and polyvinylpyrrolidone, and where the gels of cellulose are selected from carboxymethylcellulose, hydropropylcellulose, methylcellulose, hydroxyethylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose.
  • the polymeric thickener is hydroxypropylcellulose.
  • the concentration of the polymeric thickener in the biocidal composition is between 0.05 and 5% (w/v) and preferably between 0.2 and 0.9% (w/v).
  • the biocidal composition also comprises one or more surfactants, which can be anionic, nonionic, cationic and/or amphoteric and without limitation, are selected from polysorbate 80, polysorbate 20, glutaraldehyde, second-class quaternary ammonium generation and sodium sulfate launl ester.
  • the one or more surfactants are found in a concentration between 0.05 and 30% (w/v) in the biocidal composition, preferably between 3 and 6% (w/v).
  • the metallic or metallic oxide nanoparticles dry or in solution, are mixed with the extracts, where other optional elements such as surfactants and polymeric thickeners can also be incorporated in a liquid matrix that can be water, methanol, ethanol , glycerol, polyethylene glycol, among others, and their mixtures.
  • the biocidal composition of the present invention comprises a concentration of metal nanoparticles or metal oxides between 0.01 and 30% (w/v); surfactants between 0.05 and 30% (p/v); polymeric thickener between 0.05 and 5% (p/v); plant extract between 0.01 and 30% (p/v) and additives 0.5 and 2% (p/v), in an aqueous matrix.
  • the biocidal composition can be in liquid or gel form, which can be applied directly or diluted with water, ethanol or other solvents and solutions.
  • the composition has microbiocidal activity against Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus Aureus, Desulfotomaculum Nigrificans, Candida Albicans, Aspergillus Niger and Dengue Flavivirus, showing an effectiveness greater than 95%.
  • the present development is also aimed at the method of in situ production of metal nanoparticles with antimicrobial properties, which comprises mixing extracts from various parts of plants with reducing/antioxidant power and one or more metal salts.
  • the method of manufacturing the nanoparticles is a green synthesis method where the nanoparticles are produced in situ and comprises a) mix a poliménco thickener in a concentration between 0.05 and 5% (w/v), a solution of a first metal salt in a concentration between 0.05 M and 10 M and an extract of a plant material in a ratio Volumetric of the first metallic salt: extract between 2: 1 and 10: 1, for at least 2 hours, stirring at least 800 rpm, at a temperature between 25 and 100°C and a pH between 4 and 12; b) leave the mixture from step a) at rest for at least 2 hours at room temperature (25 °C) and without stirring; c) take readings of the mixture in a spectrophotometer at the end of step b), until the absorbance shows no variation; where the variation is understood as a change of ⁇ 5% of the absorbance at the beginning of the nucleation process, that is, at the beginning of step b).
  • the plant material of the extract is selected from the group consisting of Passiflorci ligularis, Sambucus mexicana, Selenicereus megalanthus, Solanum quitoense, Amona cherimola, Solanum bataceum, Cuc ⁇ rbita moschata, Luffa aegyptiaca, Arracada xanthorrhiza, Fragaria ananassa, Furcraea andina , Alibertia patinoi, Pourteria sapota, Ficus carica, Passiflora quadrangularis, Vaccinium meridionale, Passiflora maliformis, Bactris gasipaes, Cassia granáis, Vasconcellea pubescens, Melicoccus bijugatus and Mammea americana.
  • said plant material undergoes a previous treatment that includes drying in the open air, in a dryer or in a dark room, and its subsequent crushing or grinding, in order to obtain the largest contact surface and, finally, it is sieved.
  • a previous treatment that includes drying in the open air, in a dryer or in a dark room, and its subsequent crushing or grinding, in order to obtain the largest contact surface and, finally, it is sieved.
  • the crushed and sieved plant material is mixed with suitable solvents in a determined ratio, for a particular time, temperature and/or agitation.
  • the polymeric thickener can be a gel colloid and is selected from, without limitation, cellulose gels, alginates, agar-agar, carrageenan, pectin, xanthan gum, gelatin, and polyvinylpyrrolidone, and where cellulose gels are are selected from carboxymethylcellulose, hydropropylcellulose, methylcellulose, hydroxyethylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose.
  • the polymeric thickener is polyvinylpyrrolidone.
  • the concentration of the polymeric thickener in the biocidal composition it is between 0.05 and 5% (p/v) and preferably between 0.05 and 0.6% (p/v).
  • the solvents used in the preparation of the plant extract are selected from water, methanol, ethanol, propanol, butanol, ethyl acetate and their mixtures, more preferably an aqueous extract and the ethanolic one.
  • the temperature of the extraction process can be between 20°C and 130°C, preferably between 25°C and 60°C and the extraction pH can be between 3 and 10, preferably between 4 and 7.
  • the plant extract will act as the solution of the reducing and/or stabilizing agent in the synthesis of the metallic nanoparticles.
  • a second metal salt is added to the mixture of step a), where a first metal salt can be mixed with the plant extract at first, and a second metal salt can be mixed at a second moment after a period of time.
  • the first and second metal salts can be mixed with the extract of the plant material simultaneously.
  • the metal of the first and second metal salt that is incorporated in solution to the extract is selected from the group of transition metals, XIII and XIV.
  • said metal can be titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, yttrium, zirconium, niobium, molybdenum, rhodium, palladium, silver, cadmium, tungsten, iridium, platinum, gold, aluminum, gallium, indium, tin, gold, platinum, iridium, silicon, germanium, and mixtures thereof.
  • inorganic salts sulfates, nitrates, chlorides, phosphates and fluorides can be used, as well as organic salts such as acetates, citrates, oxalates and propanoates.
  • organic salts such as acetates, citrates, oxalates and propanoates.
  • a metal salt for use in any process of the present invention may be a salt of any of the aforementioned metals or mixtures thereof and acts as a precursor agent.
  • the solution of the first and/or second metal salt is incorporated in a concentration between 0.05M and 10M, preferably between 0.01M and 1M.
  • the extract of a plant material is incorporated in a concentration between 0.5 and 30% (w/v), preferably between 8 and 30% (w/v).
  • the amount of extract used in the processes described herein, as well as the amount of metal salts, is sufficient to convert substantially all of the dissolved and/or admixed metal ions to nanoparticles.
  • the solution of a first metal salt is mixed with the extract of a plant material in a volume ratio of between 2:1 and 10:1, respectively. In a preferred embodiment, said volume ratio is 5:1, respectively.
  • one or more surfactants are added to the extract of the plant material, which are selected from anionic, nonionic, cationic and/or amphoteric and without limitation, are particularly selected from polysorbate 80, polysorbate 20, glutaraldehyde, quaternary ammonium of second generation and sodium lauryl ester sulfate.
  • the one or more surfactants are found in a concentration between 0.05 and 30% (w/v), preferably between 3 and 10% (w/v).
  • the reaction time of step a) is at least 2 hours, preferably 2 hours; a temperature between 25 and 100°C, preferably between 50 and 65°C; agitation between 800 rpm and 3600 rpm, preferably 800 rpm; and a pH that comprises the range between 4 and 12, preferably 8 and 11.
  • stage a) occurs what for the purposes of the present invention is known as a nucleation process, which consists in that once the metal salt is reduced corresponding to the zerovalent metal atom, the concentration of the building units reaches the saturation level, producing the first stable solid entities acting as nucleation centers (primary particles), thus giving rise to continuous growth; This depends on the supply of atoms that occurs in the reaction until equilibrium is reached.
  • the nucleation stage must be short to achieve homogeneous particles in shape and size, and this stage clearly depends on the salt/solvent ratio, temperature and pH, for this reason it is of primary importance to control these variables.
  • step b Once the process of preparing the nanoparticles is finished, they are left to rest (room temperature and without agitation) for at least two hours, according to step b). As soon as the rest begins, a sample of the supernatant is taken to measure the initial absorbance and identify the nucleation process. After two hours, the sample is taken to the spectrophotometer to be analyzed a sample of the supernatant, this reading in the spectrum is made during the appropriate hours until a change of ⁇ 5% in the absorbance read from the beginning of the nucleation process (formation of particles by the continuous union of atoms). Once the absorbance shows no variation, it will be known that the reaction has finished. From now on, daily readings will be made in the spectrum to evaluate the stability over time of the nanoparticle solution.
  • the metallic nanoparticles of the present invention obtained through the method described above are mono or bimetallic and comprise the reduced metal or the oxides thereof, but could include other components, for example, other reducing or non-reducing compounds from the same extract of the plants used, conjugated or not with metals.
  • the nanoparticles can be of the metal and/or oxide of any of the salts involved in the process of the invention or their combinations.
  • the metal nanoparticle can be an iron nanoparticle, a gold nanoparticle, a platinum nanoparticle, a copper nanoparticle, a indium nanoparticle, a silver nanoparticle, a nanoparticle of any of the salts involved in the process of the invention or their combinations.
  • Metal nanoparticles can have zero valence or some oxidation state.
  • the nanoparticles synthesized by the method of the invention may have different surface charges depending on the biomolecular components of the extract that are associated with the nanoparticle.
  • extracts from different parts of plants such as fruits, seeds, leaves and flowers, are used as agents and/or stabilizers for the green synthesis of nanoparticles, but not all plant species have the same chemotypes: for example, there are materials They contain more flavonoids and phenolic acids that act as metal ion reducers. On the other hand, there are those that present stabilizing agents such as cyclodextrins, used to stabilize individual and hybrid copper or silver nanoparticles, in addition to controlling the growth and stabilization of nanoparticles from air oxidation.
  • stabilizing agents such as cyclodextrins
  • the activity carried out by the colloidal suspension of nanoparticles depends on the chemotype used in the synthesis.
  • the concentration of the precursor salt the concentration and reducing power of the extracts, the reaction time, the agitation, the temperature and the pH, in where a change in these variables can affect the morphology of the metal nanoparticles, which would lead to changes that can be significant in their properties.
  • the colloidal suspension of nanoparticles was not stable, because as time passed, two phases were generated, which was an indication of the formation of microparticles during the synthesis.
  • the ranges of the variables that affected the synthesis of the nanoparticles were varied, namely: - Temperature: in addition to stabilizing the colloidal suspension, this variable increases the reaction rate, generating more or fewer nanoparticles in a given reaction time.
  • the pH of the reaction medium plays an important role during the formation of nanoparticles, since with adequate ranges they improve the reducing and stabilizing capacity of the antioxidant compounds in the extract, in addition to presenting more or less absorbance, which is linked to the concentration of nanoparticles.
  • the salt concentration in addition to the stabilization of the colloidal suspension, the salt concentration can lead to an increase in the particle size of the nanoparticles, due to the agglomeration of said atoms and in this way microparticles can be generated, instead of nanoparticles.
  • the green nanoparticle synthesis method developed by the present invention allows the elimination of steps known by the state of the art, such as centrifugation. Due to the use of polymer in the biocidal composition and the control of the appropriate variables in the green synthesis process of the nanoparticles used, a separation into two phases of the suspension of nanoparticles is not generated, as was previously observed at the end of the reaction by what was necessary the centrifugation process.
  • Example 1 Synthesis of metallic copper-silver nanoparticles (Cu-Ag) from Passiflora ligularis
  • the metal salt CuSO4.5H 2 O (copper sulfate pentahydrate) was used as a precursor agent, and the extract of the leaves of the species Passiflora ligularis was used as a reducing agent.
  • a pretreatment was carried out on the Passiflora ligularis t leaf in which the leaf was dried for 7 days in a dark room. It was then ground in a roller mill until it reached a particle size of less than 0.358 mm.
  • Deionized water was added in a liquid/solid ratio of 2:1 (mL deionized water: g dry leaf), i.e. twice the volume of deionized water per gram dry leaf, and allowed to stand for 2 hours (this process is called swelling).
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the corresponding absorbances at different wavelengths; this process is carried out until the absorbance change has an uncertainty degree of ⁇ 5% in the sample scan.
  • the appropriate absorbance peak for copper nanoparticles occurs in a wavelength range of 250 to 400 nm.
  • Example 2 Synthesis of metallic copper-silver nanoparticles (Cu-Ag) from Passiflora ligularis
  • a procedure similar to that of Example 1 was carried out using the metal salt CuSO4.5H 2 O (pentahydrated copper sulfate) as a precursor agent and additionally AgNCf (silver nitrate), and as a reducing agent the extract of the fruit peel of the species Passiflora ligularis.
  • CuSO4.5H 2 O pentahydrated copper sulfate
  • AgNCf silver nitrate
  • the shell was dried for 7 days in a dark room. It was then ground in a roller mill to a particle size between 0.3 and 0.4 mm.
  • Deionized water was added in a liquid/solid ratio of 3:1 (mL deionized water: g of dry husk), i.e. three times the volume of deionized water per gram of dry husk, and allowed to stand for 2 to 3 hours. (this process is called swelling).
  • the extract For the preparation of the extract, sufficient deionized water was added to complete a liquid/solid ratio of 15: 1 (mL of deionized water/g of dry peel) and finally the pH was adjusted to 5 with 1 M citric acid. mixture was left to stand for 24 h. After the time, the extract was centrifuged at 2500 rpm for 5 min. The supernatant was extracted and in order to remove non-precipitated plant material, it was filtered through filter paper with a pore size of 4-12 pm. Finally, the extract obtained was stored under refrigeration.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the absorbance change has an uncertainty of ⁇ 5% on the sample side.
  • the appropriate absorbance peak for copper-silver nanoparticles occurs in a wavelength range of 400 to 500 nm.
  • the metal salt CuSO4.5H 2 O (copper sulfate pentahydrate) was used as a precursor agent, and Solanum betaceum fruit pulp extract was used as a reducing agent.
  • Solanum betaceum fruit pulp was to grind it to a puree consistency. Afterwards, it was dried in an oven at 60°C for 24 hours, to grind it again in a roller mill until it reached a particle size between 0.3 and 0.4 nm. Deionized water was added in a 4:1 ratio (mL deionized water: g dry pulp) and allowed to stand for 2-3 hours.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the change in absorbance has an uncertainty degree of ⁇ 5% in the sample scan.
  • the appropriate absorbance peak for copper nanoparticles occurs in a wavelength range of 250 to 400nm.
  • the metal salt Ag 2 SC>4 (silver sulfate) was used as a precursor agent, and the fruit peel extract of the Passiflora ligularis species was used as a reducing agent.
  • the size of the shell of Passiflora ligularis was reduced. It was then dried in an oven at a temperature of 60°C for 24 hours, then it was ground in a roller mill until it reached a particle size between 0.3 and 0.4 nm. Deionized water was added in a 4:1 ratio (mL deionized water: g of dry shell) and allowed to stand for 2-3 hours.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the change in absorbance has a degree of uncertainty of ⁇ 5% of the sample.
  • the appropriate absorbance peak for silver nanoparticles occurs in a wavelength range of 400 to 500 nm.
  • the metal salt ZnCóFLCfi (zinc acetate) was used as a precursor agent, and the fruit pulp extract of the species Selenicereus megalanthus was used as a reducing agent.
  • the pulp of the Selenicereus megalanthus fruit was ground to a puree. It was then dried in an oven at a temperature of 60°C for 24 hours, then it was ground in a roller mill until it reached a particle size between 0.3 and 0.4 nm. Deionized water was added in a 4:1 ratio (mL deionized water: g dry pulp), and left to stand for 2-3 hours.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the change in absorbance has a degree of uncertainty of ⁇ 5% in the sample scan.
  • the appropriate absorbance peak for zinc nanoparticles occurs in a wavelength range of 250 to 350nm.
  • the metal salt CuSO4.5H 2 O (copper sulfate pentahydrate) and AgNCf (silver nitrate) were used as precursor agent, and the fruit pulp extract of the Cucurbita moschata species was used as reducing agent.
  • the pulp of the Cucurbita moschata fruit was ground to a puree. It was then dried in an oven at a temperature of 60°C for 24 hours, then it was ground in a roller mill until it reached a particle size between 0.3 and 0.4 nm. Deionized water was added in a 4:1 ratio (mL deionized water: g of dry pulp), and it was allowed to stand for 2-3 hours.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the change in absorbance has a degree of uncertainty of ⁇ 5% in the sample scan.
  • the appropriate absorbance peak for copper-silver nanoparticles occurs in a wavelength range of 400 to 500 nm.
  • the metal salt FeSCfi (iron sulfate) was used as a precursor agent and the fruit pulp extract of the Alibertia patinoi species was used as a reducing agent.
  • the fruit pulp was crushed to a puree. It was then dried in an oven at a temperature of 60°C for 24 hours, then it was ground in a roller mill until it reached a particle size between 0.3 and 0.4 nm. Deionized water was added in a 4:1 ratio (mL deionized water: g dry pulp), and left to stand for 2-3 hours.
  • xanthan gum 0.05% (w/v) of xanthan gum was added and mixed with 82.05% (w/v) of a solution of FcSCfi at a concentration of 0.02M. 14.9% (w/v) of Alibertia fruit pulp extract and 3% (w/v) of polysorbate were added.
  • the optimal values of the process variables for this reaction are: temperature of 50°C, pH 8, precursor/extract volumetric ratio of 5:1 and agitation of 800 rpm.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the change in absorbance has a degree of uncertainty of ⁇ 5% in the sample scan.
  • the appropriate absorbance peak for iron nanoparticles occurs in a wavelength range of 300 to 400 nm.
  • Example 8 Synthesis of metallic copper (Cu) nanoparticles from Cucurbita moschata
  • the metal salt CuSCL.ótLO copper sulfate pentahydrate
  • the fruit pulp extract of the Cucurbita moschata species was used as a reducing agent.
  • the pulp of the Cucurbita moschata fruit was ground to a puree. It was then dried in an oven at a temperature of 60°C for 24 hours, then it was ground in a roller mill until it reached a particle size between 0.3 and 0.4 nm. Deionized water was added in a 4:1 ratio (mL deionized water: g dry pulp), and left to stand for 2-3 hours.
  • the colloidal solution of nanoparticles obtained is taken to UV-Vis spectrophotometry to perform the scan and obtain the absorbances corresponding to different wavelengths, this process is carried out until the change in absorbance has a degree of uncertainty of ⁇ 5% in the sample scan.
  • the appropriate absorbance peak for copper nanoparticles occurs in a wavelength range of 250 to 400nm.
  • the capacity or reduction power of a plant can vary according to the level of antioxidant biomolecules present.
  • the results of these tests may change depending on the conditions and/or areas of cultivation, harvesting and also depending on the plant species.
  • the production of nanoparticles can be confirmed by different characterization techniques. Each of them provides information of vital relevance for the invention.
  • the production of nanoparticles can be confirmed by surface plasmon resonance analysis using a UV-Vis spectrophotometer in a range of 200 to 600 nm.
  • XDR X-Ray Diffractometer
  • the valence of the nanoparticles can be determined.
  • the size distribution of the nanoparticles can be evaluated by Dynamic Light Scattering (DLS).
  • the morphology of the nanoparticles can be determined by Scanning Optical Microscopy (SEM) or Transmission Electron Microscopy (TEM). To evaluate the composition of the obtained solution, it can be determined by using a Pourier Transform Infrared Spectrophotometer (FTIR).
  • FTIR Pourier Transform Infrared Spectrophotometer
  • FIG. 1A shows the distribution of particle sizes, where the first peak on the left represents 56.2% of the total nanoparticles, which are 11.97 ⁇ 3.197 nm in size, while the second peak shows the missing 43.6% found with a particle size of 755 nm.
  • FIG IB shows that the first peak on the left represents 20.1% of the total nanoparticles, which they are 10 ⁇ 3 nm in size; the second peak represents 60% of the total nanoparticles, which is found with a particle size of 190 ⁇ 3.01 nm and the last peak which represents 19.9% of the total nanoparticles, with particle sizes of 730nm
  • FIG 1C shows that the entire solution of Example 6 has a nanoparticle size of 46 ⁇ 5.8 nm.
  • FIG ID shows that the solution of Example 7 presents 3 peaks, the first peak on the left represents 20.1% of the total nanoparticles, which have a size of 86 ⁇ 3 nm, the second peak represents the 60% of the total nanoparticles that are found with a particle size of 720 ⁇ 2.01 nm, and the last peak which represents 19.9% of the total nanoparticles, are found with particle sizes of 990 ⁇ 5 .02nm
  • FIG 1E shows that the first peak on the left represents 15% of the total nanoparticles, which are 90 ⁇ 4.01 nm in size; the second peak represents 45% of the total nanoparticles, which is found with a particle size of 900 ⁇ 2.01 nm, and the last peak represents 40% of the total nanoparticles, with particle sizes of 7000 ⁇ 5 .02nm
  • Example 2 the solution of nanoparticles obtained in Example 2 was characterized by a Fourier Transform Infrared Spectrophotometer (FTIR), where the presence of copper oxides is evident, due to the peaks in bands between 550 and 1083 cm ' 1 (Raul et al., 2014), and the presence of secondary alcohols and polyphenols due to the peaks observed in bands close to 1375 cm' 1 (Nasrollahzadeh, Sajadi, Rostami-Vartooni, & Hussin, 2016).
  • FTIR Fourier Transform Infrared Spectrophotometer
  • the sample contains a significant amount of copper oxides (CuO and Cu 2 O) and organic compounds (polyalcohols and polyphenols) that can help stabilize the NPs in the colloidal solution (Hame et al., 2012).
  • CuO and Cu 2 O copper oxides
  • organic compounds polyalcohols and polyphenols
  • nanoparticles are between 400nm and 500nm, copper nanoparticles between 250nm and 400nm, zinc between 250nm and 350nm. The fact that the nanoparticles emit in this range is due to the fact that the metal with zero valence emits in the ranges specified above.
  • the samples of the colloidal solution of nanoparticles obtained in Examples 1 to 8 were analyzed by transmission electron microscope TEM, which exhibited different forms that depended on the parameters used in the synthesis method described. It was possible to show that those samples that had a pH greater than 10 and a temperature above 50°C showed spherical shapes and rods, while for a pH below this, the nanoparticles had triangular or polygonal shapes.
  • the influence of temperature allowed to obtain small variations in the average crystalline size of the nanoparticles;
  • the concentration of added extract modifies the size of the nanoparticles, since the greater the extract, the smaller their size.
  • a composition with biocidal activity is made.
  • polysorbate 20 was added at a concentration of 3.6% (p/v), followed by hydropropylcellulose at 0.2% (p/v), stirring was started at 1000 rpm, then the pH was adjusted to 4 and 0.05% (p/v) of a colloidal solution of copper nanoparticles was slowly added, followed by the addition of 10% (p/v) of vegetable extract of Solanum betaceum, this solution was kept under stirring for at least 30 min. Finally, deionized water was added and the pH was adjusted to 8.
  • polysorbate 80 was added at a concentration of 3.6% (p/v), then hydroxyethylcellulose at 0.5% (p/v) was added, stirring was started at 1000 rpm and slowly adding 0.1% (w/v) of the colloidal solution of nanoparticles. Next, 15% (w/v) of Selenicereus megalanthus plant extract was added, this solution was kept under stirring for at least 30 min, finally, deionized water was added and the pH was adjusted to 8.
  • microbiological and virucidal tests were carried out using the bacterial strains Escherichia Coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus and Desulfotomaculum nigrificans, the fungal strains Candida albicans and Aspergillus niger and the Dengue flavivirus.
  • MBC Minimum Bactericidal Concentration
  • Example 15 Biocidal activity exhibited by the compositions of silver, copper, copper-silver and zinc nanoparticles
  • Escherichia coli (ATCC® 25922), donated by the University of Santander, was used, which was suspended in saline and glycerol (40%-Panreac) and preserved at 80°C. For its reactivation, two passes were made in nutrient agar (Merck).
  • chlorhexidine was used as a reference disinfectant, starting from a concentration of 4% (w/v). This method made it possible to determine the minimum concentration capable of inhibiting microbial growth by metallic nanoparticles, by means of macroscopic titrations of turbidity associated with microbial growth.
  • bactericidal concentration 10 pl of each of the concentrations in which inhibition of the visible growth of the microorganism was observed were taken, after which it was planted in Petri dishes with Mueller Hinton agar incubated at 35 ° C for 24 hours, considering as bactericidal, that concentration at which a number ⁇ 3 colony-forming units (CFU) is observed.
  • CFU colony-forming units
  • Example 16 Tests of effectiveness of the compositions of nanoparticles.
  • biocidal compositions developed in Examples 10 to 13 effectiveness tests were carried out with different bacterial strains during a contact time of 30 minutes between the biocide and the bacterial strain.
  • the bacterial strains used in the biocides were: Escherichia Coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Desulfotomacidum nigrificans, Candida albicans, Aspergillus niger and Pseudomonas aeruginosa.
  • Example 17 Biocidal activity of the composition comprising copper nanoparticles in Desulfovibrio desulfuricans
  • the biocidal activity in Desulfovibrio desulfuricans was evaluated by the Time Kill Test method in Starkey medium (maintenance medium).
  • Starkey medium maintenance medium
  • the biocidal agent comprising copper nanoparticles was put in contact with a known population of microorganisms for a certain time at a temperature of 37°C.
  • Starkey medium is a maintenance medium (used both for inoculum and for sample dilution and measurement).
  • the preparation of the medium was carried out with the following formulation:
  • inoculum 5 ml of inoculum of the ATCC Desulfovivrio desulfuricans strains were taken in 50 ml of Starkey medium, guaranteeing the desired amount of inoculum. It was incubated for 24 hours at 37°C.
  • biocidal composition of the present development allows maximum use of plant extracts as they act in the composition as stabilizing agents that functionalize the nanoparticles, placing themselves on their surface as a type of stabilizing coating, which allows the nanoparticles not to agglomerate and thus prevent particulate formation.
  • surfactants in the composition allows the control of the size of the metal nanoparticles or metal oxides. The control of the morphology of the nanoparticles in the biocidal composition of the development is important, since the properties that the compositions can have such as catalytic, optical, photonic, chemical and biological as well as biocidal properties depend on this.
  • Examples 1 to 8 show that there was a considerable reduction in the normal times of synthesis of nanoparticles known by a person skilled in the art of 25%, in addition, the pH used to carry out the reaction correspond to values more basic 8 and 12, in addition to the incorporation of polymer since this helps in the reduction of agglomerates which is favorable for different properties such as size, stability and biocidal activity.

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición biocida de amplio espectro, con actividad fungicida y bactericida, que contiene nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos, espesantes poliméricos, extractos vegetales, tensoactivos y aditivos en un solvente acuoso, así como el método para la producción in situ de dichas nanopartículas metálicas bajo condiciones controladas de operación: concentración, relación volumétrica, tiempo, agitación, temperatura y pH, utilizando como agente reductor extractos vegetales.

Description

FORMULACION ANTIMICROBIANA QUE COMPRENDE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS O DE ÓXIDOS METÁLICOS
SINTETIZADOS A PARTIR DE EXTRACTOS VEGETALES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra en el campo de la biotecnología y nanotecnología, específicamente en el campo de las metodologías de síntesis de nanopartículas que sean amigables con el medio ambiente. Además, la utilización de esas nanopartículas en composiciones con actividad biocida, por lo que la presente invención también se encuentra en el campo técnico de control de microorganismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En la industria de la nanotecnología se han descrito algunas rutas para la preparación de nanopartículas metálicas, una de ellas es conocida como descendente o top-down que consiste en la disminución de materiales de gran tamaño, y otra consiste en la construcción de las nanopartículas metálicas a partir de átomos y moléculas, denominada ascendente o bottom-up.
Las rutas top-down presentan desventajas en términos de homogeneidad en la forma y tamaño de las partículas, así como el uso de equipos de gran tamaño que generalmente requieren alto consumo de energía. Por otro lado, las rutas bottom-up resultan ser la opción más viable para obtener nanopartículas homogéneas y de tamaños pequeños (Campo Becerra, 2018). Dichas rutas permiten la síntesis química de nanopartículas con base en la reducción de especies iónicas a partir de una sal metálica o precursor y un agente reductor y/o agente estabilizante, en donde la sal metálica, considerada como precursor de la reacción, se va reduciendo por acción del agente reductor para formar átomos del mismo metal, pero con menor valencia. Estos átomos actúan como pequeños núcleos que se van aglomerando para formar moléculas de mayor tamaño, los cuales continúan su crecimiento a medida que se siguen agregando otros átomos y se detiene este crecimiento hasta que la aglomeración de átomos llegue a un nivel nanométrico. En este sentido, el control de variables y condiciones de reacción durante el proceso de síntesis de nanopartículas tales como temperatura, pH, disolventes y/o reactivos, entre otros, constituye un conjunto de parámetros críticos que pueden afectar la toxicidad derivada del uso de reactivos peligrosos, impacto medioambiental, costos de producción, escalabilidad, forma final, tamaño, distribución de tamaño de partícula y con ello las propiedades físicas y químicas de las nanopartículas (Valdez Aguilar, J. 2015).
Se han estudiado entonces estrategias alternativas dirigidas a la síntesis verde de nanopartículas empleando agentes fitoquímicos como extractos de plantas y/o enzimas microbianas, los cuales tienen propiedades o compuestos que exhiben actividad antioxidante, reductora y/o estabilizante. Entre los diferentes métodos verdes que existen, se encuentran el biológico, polisacárido, Tollens de irradiación y polioxometalatos de valencia mixta (M. Ramya & M. Sylvia Subapriya. 2012).
Dichos métodos de síntesis proporcionan ventajas sobre las metodologías químicas y físicas en términos de rentabilidad, escalabilidad, uso de agentes químicos no tóxicos y uso de presiones, temperaturas y energías de reacción bajas. Adicionalmente, la matriz de los extractos empleados en las metodologías de síntesis verde actúa en ocasiones como estabilizante, la cual disminuye la agregación de partículas metálicas sin necesidad de añadir agentes dispersantes. Además, el uso de diferentes partes de la planta permite la valorización de la biomasa en tanto puede ser considerada material de desecho proveniente de otros procesos o sub-procesos agroindustriales (Nadagouda, M.N.; et al., 2010).
Adicionalmente, para el control de microorganismos generalmente se emplean desinfectantes de amplio espectro, fungicidas y antibióticos; sin embargo, el uso no adecuado de los mismos, así como la propia capacidad de los microorganismos para desarrollar resistencia a los agentes químicos ha disminuido su eficiencia (Desselberger, U, 2000). En este sentido, el desarrollo de agentes antimicrobianos novedosos y eficientes basados en nanotecnología contra bacterias y hongos resistentes a múltiples fármacos y desinfectantes, es una de las áreas prioritarias en la investigación actual (Raí et al., 2012).
Por ejemplo, el documento US20070218555 divulga una formulación con efecto antimicrobiano que contiene nanopartículas de plata estabilizadas con una solución acuosa de tejido vegetal, junto con excipientes adicionales como tensioactivos, conservantes, agentes Teológicos, polímeros, entre otros. Adicionalmente, este documento divulga el método para obtener dicha formulación antimicrobiana.
De igual modo, el documento KR20190072716 divulga un método biológico para preparar nanopartículas de cobre o de aleación cobre-plata en estado coloidal, usando un extracto vegetal acuoso de hoja de maíz, grosella, magnolia y lo cúrcuma como agente reductor.
La patente JP2017025383 enseña una composición de nanopartículas metálicas, particularmente de oro, cobre, platino, paladio o plata y un método para su elaboración, en donde dicha formulación se usa como agente antibacteriano, antiviral, catalizador o colorante y emplea extractos alcohólicos de plantas.
Por lo tanto, persiste la necesidad de desarrollar un producto antimicrobiano eficaz y eficiente con efecto biocida de amplio espectro, que permita superar la resistencia a microorganismos que caracteriza a los productos antimicrobianos de sustancias químicas, así como la disminución en los efectos adversos que las mismas generan. Además, aún representa un desafío implementar metodologías eficientes para la obtención de nanopartículas metálicas que sean amigables con el medio ambiente para aplicaciones como agentes bioactivos.
Así entonces, la presente invención evalúa diversos extractos provenientes de varias partes de distintas plantas, con actividad reductora y de estabilización para la síntesis verde de nanopartículas metálicas y su utilización en una formulación biocida de amplio espectro. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a una composición biocida que comprende nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos obtenidas por síntesis verde. En dicha metodología de síntesis, que también es objeto de la invención, se utilizan extractos de diferentes partes de plantas como agentes reductores y estabilizantes, agua, extracto vegetal, sal precursora, tensoactivos y otros aditivos. Gracias a la composición de la presente invención, el efecto biocida proporcionado exhibe actividad antimicrobiana de amplio espectro.
Adicionalmente, se desarrolla el método para la elaboración de dichas nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos que principalmente comprende mezclar una solución de una primera sal metálica con un extracto de material vegetal particular bajo condiciones de tiempo, agitación, temperatura y pH, dejar en reposo la mezcla y tomar lecturas en el e spectrofotómetro .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Caracterización de la solución de nanopartículas de cobre (Cu) por Dispersión Dinámica de Luz (DLS por sus siglas en inglés). Se puede evidenciar la distribución de los tamaños de partícula. A. Nanopartículas de cobre-plata a partir de Passiflora ligularis, B. Nanopartículas de cobre a partir de Solarium betaceum, C. Nanopartículas de cobre-plata a partir de Cucúrbita moschata, D. Nanopartículas de hierro a partir de Alibertia patinoi, E. Nanopartículas de zinc a partir de Selenicereus megalanthus .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición biocida que comprende nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos obtenidas por síntesis verde. Adicionalmente, se describe y reclama el método para la elaboración de dichas nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos. Para propósitos de interpretar los términos usados a lo largo del presente documento se debe tener en cuenta su significado usual en el campo técnico, a menos que se incorpore una definición particular. Adicionalmente, los términos utilizados en forma singular también incluirán la forma plural.
Composición
La composición biocida aquí desarrollada comprende nanopartículas de metales o de óxidos metálicos y un extracto vegetal. Para efectos de la presente invención, las nanopartículas se entienden como una aglomeración de átomos metálicos de un metal reducido por acción de un extracto vegetal, pero podrían incluir otros componentes como compuestos reductores o no del mismo extracto empleado, conjugados o no con otras sustancias, provenientes de la reducción de una o varias sales metálicas, y tienen un tamaño menor a 100 nanómetros, preferiblemente entre 10 y 80 nm.
Sin constituir una limitante, el metal de las nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos se selecciona entre el grupo de metales de transición, XIII y XIV. Particularmente, el metal de las nanopartículas se selecciona, pero no se limita a, titanio, vanadio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc, itrio, circonio, niobio, molibdeno, rodio, paladio, plata, cadmio, wolframio, iridio, platino, oro, aluminio, galio, indio, estaño, platino, silicio y germanio, y mezclas de los mismos. En una modalidad específica, el metal de las nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos se selecciona entre cobre, plata, zinc, hierro y cobre-plata.
Además, las nanopartículas se encuentran en la composición biocida en una concentración entre 0,01 y 30% (p/v), preferiblemente entre 0,05% y 5% (p/v) y más preferiblemente entre 0,05 y 1% (p/v).
Por otro lado, el extracto vegetal se entiende como el producto resultante de poner en contacto cualquier parte de una planta con un solvente, por lo que dicho extracto es cualquiera de entre los componentes acuosos o no acuosos, polares o no polares o derivados de ese proceso. Este extracto debe ser filtrado o centrifugado para separar el residuo o material, y es el que hace parte de la composición biocida en una concentración entre 0,01 y 30% (p/v), preferiblemente entre 10 y 25% (p/v).
En una modalidad preferida, los extractos de la presente invención se seleccionan del grupo que comprende, pero no se limita a, extractos de las especies vegetales Passiflora ligularis (granadilla), Sambucus mexicana (saúco), Selenicereus megalanthus (pitahaya amarilla), Solanum quitoense (lulo), Amona cherimola (chirimoya), Solanum bataceum (tomate de árbol), Cucúrbita moschata (ahuyama), Luff a aegyptiaca (estropajo), Arracada xanthorrhiza (arracacha), Fragaria ananassa (fresa), Furcraea andina (fique), Alibertia patinoi (borojó), Pourteria sapota (zapote), Ficus carica (higuera), Passiflora quadrangularis (badea), Vaccinium meridionale (agraz), Passiflora maliformis (cholupa), Bactris gasipaes (chontaduro), Cassia granáis (cañandonga), Vasconcellea pubescens (papayuela), Melicoccus bijugatus (mamoncillo), Mammea americana (mamey) o mezclas de las mismas. Más preferiblemente, los extractos de dichas especies se obtienen a partir de cualquier parte de la planta tales como hojas, tallos, semillas, flores, frutos, látex, raíces o cáscaras.
En la formulación biocida desarrollada los extractos vegetales pueden estar presentes como agentes reductores, estabilizantes o como coadyuvantes.
La composición biocida además comprende un espesante polimérico que puede ser un coloide gel y se selecciona entre, sin limitarse a, geles de celulosa, alginatos, agar-agar, carragenanos, pectinas, goma xantana, grenetina y polivinilpirrolidona, y en donde los geles de celulosa se seleccionan entre carboximetilcelulosa, hidropropilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. En una modalidad preferida, el espesante polimérico es hidroxipropilcelulosa. La concentración del espesante polimérico en la composición biocida se encuentra entre 0,05 y 5% (p/v) y preferiblemente entre 0,2 y 0,9% (p/v).
La composición biocida además comprende uno o más tensoactivos, los cuales pueden ser aniónicos, no iónicos, catiónicos y/o anfotéricos y sin limitarse, se seleccionan entre polisorbato 80, polisorbato 20, glutaraldehído, amonios cuaternarios de segunda generación y launl éster sulfato de sodio. El uno o más tensioactivos se encuentran en una concentración entre 0,05 y 30% (p/v) en la composición biocida, preferiblemente entre 3 y 6% (p/v).
Para elaborar la composición biocida se mezclan las nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos, secas o en solución con los extractos, en donde adicionalmente se pueden incorporar otros elementos opcionales como los tensioactivos y espesantes poliméricos en una matriz líquida que puede ser agua, metanol, etanol, glicerol, polietilenglicol, entre otros, y sus mezclas.
En una modalidad preferida la composición biocida de la presente invención comprende una concentración de nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos entre 0,01 y 30 % (p/v); tensoactivos entre 0,05 y 30 % (p/v); espesante polimérico entre 0,05 y 5 % (p/v); extracto vegetal entre 0,01 y 30 % (p/v) y aditivos 0,5 y 2 % (p/v), en una matriz acuosa.
La composición biocida puede presentarse en forma líquida o gel, la cual puede ser aplicada directamente o en dilución con agua, etanol u otros solventes y soluciones. Además, la composición tiene actividad microbiocida contra Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus Aureus, Desulfotomaculum Nigrificans, Candida Albicans, Aspergillus Niger y Flavivirus del dengue, mostrando una efectividad mayor al 95%.
Método de elaboración in situ de nanopartículas
El presente desarrollo también se dirige al método de elaboración in situ de nanopartículas metálicas con propiedades antimicrobianas, que comprende mezclar extractos provenientes de diversas partes de plantas con poder reductor/antioxidante y una o varias sales metálicas.
Particularmente, el método de elaboración de las nanopartículas es un método de síntesis verde en donde las nanopartículas se producen in situ y comprende a) mezclar un espesante poliménco en una concentración entre 0,05 y 5 % (p/v), una solución de una primera sal metálica en una concentración entre 0,05 M y 10 M y un extracto de un material vegetal en una relación volumétrica de la primera sal metálica: extracto entre 2: 1 y 10: 1, durante al menos 2 horas, una agitación de al menos 800 rpm, a una temperatura entre 25 y 100°C y un pH entre 4 y 12; b) dejar en reposo la mezcla de la etapa a) por al menos 2 horas a temperatura ambiente (25 °C) y sin agitación; c) tomar lecturas de la mezcla en un espectrofotómetro al finalizar la etapa b), hasta que la absorbancia no muestre variación; en donde la variación se entiende como un cambio de ±5% de la absorbancia al principio del proceso de nucleación, es decir, al iniciar la etapa b).
En una modalidad particular, el material vegetal del extracto se selecciona entre el grupo que consiste de Passiflorci ligularis, Sambucus mexicana, Selenicereus megalanthus, Solanum quitoense, Amona cherimola, Solanum bataceum, Cucúrbita moschata, Luffa aegyptiaca, Arracada xanthorrhiza, Fragaria ananassa, Furcraea andina, Alibertia patinoi, Pourteria sapota, Ficus carica, Passiflora quadrangularis, Vaccinium meridionale, Passiflora maliformis, Bactris gasipaes, Cassia granáis, Vasconcellea pubescens, Melicoccus bijugatus y Mammea americana. Adicionalmente, dicho material vegetal sufre un tratamiento previo que comprende el secado al aire libre, en secadora o en cuarto oscuro, y su posterior trituración o molienda, con el fin de obtener la mayor superficie de contacto y, finalmente se tamiza. Para la extracción de los compuestos reductores/antioxidantes y la preparación del extracto, se mezcla el material vegetal triturado y tamizado con solventes adecuados en una relación determinada, por un tiempo, temperatura y/o agitación particular.
En una modalidad, el espesante polimérico puede ser un coloide gel y se selecciona entre, sin limitarse a, geles de celulosa, alginatos, agar-agar, carragenanos, pectinas, goma xantana, grenetina y polivinilpirrolidona, y en donde los geles de celulosa se seleccionan entre carboximetilcelulosa, hidropropilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. En una modalidad preferida, el espesante polimérico es polivinilpirrolidona. La concentración del espesante polimérico en la composición biocida se encuentra entre 0,05 y 5% (p/v) y preferiblemente entre 0,05 y 0,6% (p/v).
En una modalidad preferida, los solventes utilizados en la preparación del extracto vegetal se seleccionan entre agua, metanol, etanol, propanol, butanol, acetato de etilo y sus mezclas, más preferiblemente un extracto acuoso y lo etanólico. La temperatura del proceso de extracción puede estar entre 20°C y 130°C, preferiblemente entre 25°C y 60°C y el pH de extracción puede estar entre 3 y 10, preferiblemente entre 4 y 7.
El extracto vegetal actuará como la disolución del agente reductor y/o estabilizante en la síntesis de las nanopartículas metálicas.
En otra modalidad de la invención, se adiciona una segunda sal de metal en la mezcla de la etapa a), en donde una primera sal de metal puede mezclarse con el extracto de planta en un primer momento, y una segunda sal de metal puede mezclarse en un segundo momento después de un periodo de tiempo. En una modalidad preferida, la primera y la segunda sal de metal pueden mezclarse con el extracto del material vegetal simultáneamente .
El metal de la primera y segunda sal metálica que se incorpora en solución al extracto se selecciona del grupo de metales de transición, XIII y XIV. Preferiblemente, y sin ser una limitante, dicho metal puede ser titanio, vanadio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc, itrio, circonio, niobio, molibdeno, rodio, paladio, plata, cadmio, wolframio, iridio, platino, oro, aluminio, galio, indio, estaño, oro, platino, iridio, silicio, germanio y mezclas de los mismos.
Sin ser restrictivo, entre las sales inorgánicas se pueden emplear sulfates, nitratos, cloruros, fosfatos y fluoruros, así como sales orgánicas como acetatos, citratos, oxalatos y propanoatos. Durante el proceso de síntesis, las sales se presentan en disolución en forma de iones, separando su parte metálica de la no metálica. Una sal metálica para su uso en cualquier proceso de la presente invención puede ser una sal de cualquiera de los metales anteriormente mencionados o sus mezclas y actúa como agente precursor. En una modalidad pretenda, la solución de la pnmera y/o segunda sal metálica se incorpora en una concentración entre 0,05M y 10M, preferiblemente entre 0,01M y 1M.
En una modalidad preferida, el extracto de un material vegetal se incorpora en una concentración entre 0,5 y 30% (p/v), preferiblemente entre 8 y 30% (p/v).
La cantidad de extracto utilizado en los procesos descritos en la presente, al igual que la cantidad de sales metálicas, es suficiente para convertir sustancialmente todos los iones de metales disueltos y/o mezclados, en nanopartículas.
En una modalidad de la invención, la solución de una primera sal metálica se mezcla con el extracto de un material vegetal en una relación volumétrica de entre 2: 1 y 10: 1, respectivamente. En una modalidad preferida, dicha relación volumétrica es de 5: 1, respectivamente.
En otra modalidad opcional se adicionan uno o más tensioactivos al extracto del material vegetal, los cuales se seleccionan entre aniónicos, no iónicos, catiónicos y/o anfotéricos y sin limitarse, se seleccionan particularmente entre polisorbato 80, polisorbato 20, glutaraldehído, amonios cuaternarios de segunda generación y lauril éster sulfato de sodio.
El uno o más tensioactivos se encuentran en una concentración entre 0,05 y 30% (p/v), preferiblemente entre 3 y 10% (p/v).
El tiempo de reacción de la etapa a) es de al menos 2 horas, preferiblemente, 2 horas; una temperatura entre 25 y 100°C, preferiblemente entre 50 y 65°C; agitación entre 800 rpm y 3600 rpm, preferiblemente 800 rpm; y un pH que comprende el rango entre 4 y 12, preferiblemente 8 y 11.
En la etapa a) ocurre lo que para efectos de la presente invención se conoce como proceso de nucleación, que consiste en que una vez reducida la sal metálica correspondiente al átomo metálico cerovalente, la concentración de las unidades de construcción alcanza el nivel de saturación, produciendo las primeras entidades sólidas estables actuando como centros de nucleación (partículas primarias), para así dar lugar al crecimiento continuo; este depende del suministro de átomos que se da en la reacción hasta alcanzar el equilibrio.
La etapa de nucleación debe ser corta para conseguir partículas homogéneas en forma y tamaño y esta etapa depende netamente de la relación sal/solvente, temperatura y pH, por esta razón es de principal importancia controlar estas variables.
Una vez finalizado el proceso de preparación de las nanopartículas, estas se dejan en reposo (temperatura ambiente y sin agitación) durante al menos dos horas, de acuerdo con la etapa b). En cuanto empieza el reposo se toma una muestra del sobrenadante, para medir la absorbancia inicial e identificar el proceso de nucleación. Pasadas las dos horas, se lleva la muestra al espectrofotómetro para ser analizada una muestra del sobrenadante, esta lectura en el espectro se hace durante las horas adecuadas hasta que se deje de apreciar un cambio de ± 5% en la absorbancia leída desde el principio del proceso de nucleación (formación de partículas por la unión continua de átomos). Una vez la absorbancia no muestre variación, se sabrá que la reacción ha terminado. En adelante se van a realizar lecturas diarias en el espectro para evaluar la estabilidad en el tiempo de la solución de nanopartículas.
Las nanopartículas metálicas de la presente invención obtenidas a través del método anteriormente descrito son mono o bimetálicas y comprenden el metal reducido o los óxidos de los mismos, pero podrían incluir otros componentes, por ejemplo, otros compuestos reductores o no reductores provenientes del mismo extracto de las plantas utilizadas, conjugadas o no con los metales.
En una modalidad, las nanopartículas pueden ser del metal y /o óxido de cualquiera de las sales involucradas en el proceso de la invención o sus combinaciones. Preferiblemente, la nanopartícula de metal puede ser una nanopartícula de hierro, una nanopartícula de oro, una nanopartícula de platino, una nanopartícula de cobre, una nanopartícula de indio, una nanopartícula de plata, una nanopartícula de cualquiera de las sales involucradas en el proceso de la invención o sus combinaciones.
Las nanopartículas de metal pueden tener una valencia cero o algún estado de oxidación. Sin embargo, las nanopartículas sintetizadas mediante el método de la invención pueden tener cargas superficiales diferentes que dependen en los componentes biomoleculares del extracto que están asociados con la nanopartícula.
La utilización de extractos provenientes de distintas partes de plantas como frutas, semillas, hojas y flores, se utilizan como agentes y/o estabilizantes para la síntesis verde de nanopartículas, pero no todas las especies vegetales presentan los mismos quimiotipos: por ejemplo, hay materiales que contienen más flavonoides y ácidos fenólicos que actúan como reductores de iones metálicos. Por otro lado, se encuentran aquellas que presentan agentes estabilizantes como las ciclodextrinas, utilizadas para estabilizar nanopartículas de cobre o de plata, individuales e híbridas, además de controlar el crecimiento y estabilización de nanopartículas de la oxidación del aire.
En conclusión, la actividad que desempeña la suspensión coloidal de nanopartículas depende del quimiotipo utilizado en la síntesis.
Adicionalmente, entre los parámetros más influyentes en la síntesis de nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos se encuentran la concentración de la sal precursora, la concentración y poder reductor de los extractos, el tiempo de reacción, la agitación, la temperatura y el pH, en donde un cambio en estas variables puede afectar a la morfología de las nanopartículas de metal, lo que conllevaría cambios que pueden ser significativos en sus propiedades.
Durante el desarrollo del método de la presente invención, la suspensión coloidal de nanopartículas no era estable, pues a medida que pasaba el tiempo se generaban dos fases, lo cual era un indicio de formación de micropartículas durante la síntesis. En este sentido, se variaron los rangos de las variables que afectaban la síntesis de las nanopartículas, a saber: - Temperatura: además de la estabilización de la suspensión coloidal, esta variable aumenta la velocidad de reacción, generando más o menos nanopartículas en un tiempo de reacción determinado.
- pH: además de la estabilización de la suspensión coloidal, el pH del medio de reacción juega un papel importante durante la formación de nanopartículas, pues con rangos adecuados mejoran la capacidad reductora y estabilizadora de los compuestos antioxidantes en el extracto, además de presentar más o menos absorbancia, lo que va ligado con la concentración de nanopartículas.
- Concentración de sal: además de la estabilización de la suspensión coloidal, la concentración de sal puede acarrear un aumento en los tamaños de partícula de las nanopartículas, debido a la aglomeración de dichos átomos y de esta manera se pueden generar micropartículas, en lugar de nanopartículas.
Adicionalmente, el método de síntesis verde de nanopartículas que desarrolla la presente invención permite la eliminación de etapas conocidas por el estado de la técnica, como por ejemplo la centrifugación. Debido al uso de polímero en la composición biocida y el control de las variables adecuadas en el proceso de síntesis verde de las nanopartículas empleadas, no se genera una separación en dos fases de la suspensión de nanopartículas, como se observaba previamente al terminar la reacción por lo que era necesario el proceso de centrifugación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Síntesis de nanopartículas metálicas de cobre-plata (Cu-Ag) a partir de Passiflora ligularis
Se empleó como agente precursor la sal metálica CuSO4.5H2O (sulfato de cobre pentahidratado) y como agente reductor el extracto de las hojas de la especie Passiflora ligularis. Para la preparación del extracto, se realizó un pretratamiento sobre la hoja de Passiflora ligularis t en el cual la hoja se secó por 7 días en cuarto oscuro. Después se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula menor a 0,358 mm. Se agregó agua desionizada en una relación líquido/sólido de 2: 1 (mL agua desionizada: g de hoja seca), es decir, el doble de volumen de agua desionizada por gramo de hoja seca, y se dejó reposar durante 2 horas (este proceso se denomina hinchamiento).
Después, a esta solución se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación líquido/sólido igual a 12 (mL de agua desionizada/g de hoja seca) y finalmente se ajustó el pH a 4,3 con ácido cítrico 1 M. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 h. Transcurrido el tiempo, para separar el extracto líquido del residuo sólido, se centrifugó este extracto a 3000 rpm por 2 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material vegetal no precipitado, este se filtró con un papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Finalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,05% (p/v) de polivinilpirrolidona, a continuación, se mezcló con 69,95% (p/v) de una solución de CiiSCfi.ófLO a una concentración de 0,03 M y se agregó 30% (p/v) de extracto de hoja de Passiflora ligularis (relación volumétrica precursor: extracto de 2: 1). La mezcla se realizó a una temperatura de 59 ±1 °C, pH de 9,8 ±1 y 800 rpm, permitiendo obtener una conversión del precursor del 99,17% y 7,59 g de macropartículas.
Seguidamente, la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda; este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el barrido de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de cobre se presenta en un rango de longitud de onda de 250 a 400 nm.
Ejemplo 2. Síntesis de nanopartículas metálicas de cobre-plata (Cu-Ag) a partir de Passiflora ligularis Se llevó a cabo un procedimiento similar al del Ejemplo 1 empleando como agente precursor la sal metálica CuSO4.5H2O (sulfato de cobre pentahidratado) y adicionalmente AgNCf (nitrato de plata), y como agente reductor el extracto de la cáscara de fruta de la especie Passiflora ligularis.
Para el pre -tratamiento del material vegetal, la cáscara se secó por 7 días en cuarto oscuro. Después se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 mm. Se agregó agua desionizada en una relación líquido/sólido de 3: 1 (mL agua desionizada: g de cáscara seca), es decir, el triple de volumen de agua desionizada por gramo de cáscara seca, y se dejó reposar de 2 a 3 horas (este proceso se denomina hinchamiento).
Para la preparación del extracto, se procedió a agregar agua desionizada suficiente para completar una relación líquido/sólido de 15: 1 (mL de agua desionizada/g de cáscara seca) y finalmente se ajustó el pH a 5 con ácido cítrico 1 M. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 h. Transcurrido el tiempo, se centrifugó el extracto a 2500 rpm por 5 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material vegetal no precipitado, este se filtró con un papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Finalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Finalmente, para elaborar las nanopartículas metálicas se adicionó 0,05% (p/v) de polivinilpirrolidona, a continuación, se mezcló con 69,95% (p/v) de solución de CUSO4.5H2O a una concentración de 0,015M y 0,015M de AgNO . Se agregó 30% (p/v) de extracto de cáscara de fruta de Passiflora ligularis. La mezcla se agitó a una temperatura de 57°C ±1°C, pH de 10,5 ±1 y relación volumétrica precursor/extracto de 2: 1, respectivamente, y agitación de 800 rpm los cuales permiten obtener una conversión del precursor del 98% y 9 g de macropartículas.
Seguido a esto, la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el bamdo de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de cobre-plata se presenta en un rango de longitud de onda de 400 a 500 nm.
Ejemplo 3. Síntesis de nanopartículas metálicas de cobre (Cu) a partir de Solanum betaceum
Se empleó como agente precursor la sal metálica CuSO4.5H2O (sulfato de cobre pentahidratado) y como agente reductor el extracto de la pulpa de fruta de Solanum betaceum.
El pretratamiento de la pulpa de fruta Solanum betaceum fue molerla hasta alcanzar una consistencia de puré. Después, se secó en homo a 60°C por 24 horas, para volverla a moler en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 nm. Se agregó agua desionizada en una relación 4: 1 (mL agua desionizada: g de pulpa seca) y se dejó reposar por 2-3 horas.
Posteriormente, se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación de líquido/sólido 20: 1 (mL de agua desionizada: g de pulpa seca) y finalmente se ajustó el pH a 10 con NaOH. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se separó la fase sólida de la líquida por medio de centrifugación a 2500 rpm por 30 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material no precipitado, este se filtró con papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Finalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,5% (p/v) de polivinilpirrolidona, a continuación, se mezcló con 81% (p/v) de una solución de CuSCfrófEO a una concentración de 0,015 M. Se adicionó 15,5% (p/v) de extracto de pulpa de fruta de Solanum betaceum y 3% (p/v) de polisorbato. Los valores óptimos de las variables de proceso para esta reacción son: temperatura de 60°C, pH 9, relación volumétrica del precursor/extracto de 5: 1 y agitación de 800 rpm. Seguidamente, la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el barrido de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de cobre se presenta en un rango de longitud de onda de 250 a 400nm.
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Se empleó como agente precursor la sal metálica Ag2SC>4 (sulfato de plata) y como agente reductor el extracto de la cáscara de fruta de la especie Passiflora ligularis.
Se disminuyó el tamaño de la cáscara de la Passiflora ligularis. Después se secó en homo a temperatura de 60°C por 24 horas, posteriormente se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 nm. Se agregó agua desionizada en una relación 4: 1 (mL agua desionizada: g de cáscara seca) y se dejó reposar por 2-3 horas.
Después, se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación de líquido/sólido 21: 1 (mL de agua desionizada: g de cáscara seca) y finalmente se ajustó el pH a 7 con NaOH. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se separó la fase sólida de la líquida por medio de una centrífuga a 2500 rpm por 30 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material no precipitado, este se filtró con papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Finalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,05% (p/v) de polivinilpirrolidona, a continuación, se mezcló con 81,45% (p/v) de solución de Ag2SC>4 a una concentración de 0,01M. Se adicionaron 15,5% (p/v) de extracto de cáscara de Passiflora ligularis y 3% (p/v) de polisorbato. Los valores óptimos de las variables de proceso para esta reacción son: temperatura de 60°C, pH 12, relación volumétrica del precursor/extracto de 5: 1 y agitación de 800 rpm. Seguidamente la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de plata se presenta en un rango de longitud de onda de 400 a 500 nm.
Ejemplo 5. Síntesis de nanopartículas metálicas de zinc (Zn) a partir de Selenicereus megalanthus
Se empleó como agente precursor la sal metálica ZnCóFLCfi (acetato de zinc) y como agente reductor el extracto de la pulpa de fruta de la especie Selenicereus megalanthus .
La pulpa de la fruta Selenicereus megalanthus se trituró hasta quedar en puré. Después se secó en homo a temperatura de 60°C por 24 horas, posteriormente se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 nm. Se agregó agua desionizada en una relación 4: 1 (mL agua desionizada: g de pulpa seca), y se dejó reposar por 2-3 horas.
Seguidamente se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación de líquido/sólido 21: 1 (mL de agua desionizada: gramos de pulpa seca) y finalmente se ajustó el pH a 7 con NaOH. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se separó la fase sólida de la líquida por medio de una centrífuga a 2500 rpm por 30 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material no precipitado, este se filtró con papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Einalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,05% (p/v) de grenetina, a continuación, se mezcló con el 81,45% (p/v) de la solución de ZnCDHDOD a una concentración de 0,03M. Se adicionaron 15,5% (p/v) de extracto de pulpa de fruta de Selenicereus megalanthus y 3% (p/v) de polisorbato. Los valores óptimos de las variables de proceso para esta reacción son: temperatura de 60 C, pH 8, relación volumétrica del precursor/extracto de 5: 1 y agitación de 800 rpm.
Seguidamente la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el barrido de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de Zinc se presenta en un rango de longitud de onda de 250 a 350nm.
Ejemplo 6. Síntesis de nanopartículas metálicas de Cobre-Plata (Cu-Ag) a partir de Cucúrbita moschata
Se empleó como agente precursor la sal metálica CuSO4.5H2O (sulfato de cobre pentahidratado) y AgNCf (nitrato de plata) y como agente reductor el extracto de la pulpa de fruta de la especie Cucúrbita moschata.
La pulpa de la fruta Cucúrbita moschata se trituró hasta quedar en puré. Después se secó en homo a temperatura de 60°C por 24 horas, posteriormente se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 nm. Se agregó agua desionizada en una relación 4: 1 (mL agua desionizada: g de pulpa seca), y se dejó reposar de 2-3 horas.
Seguidamente se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación de líquido/sólido 20: 1 (mL de agua desionizada: gramos de pulpa seca) y finalmente se ajustó el pH a 7 con NaOH. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se separa la fase sólida de la líquida por medio de una centrífuga a 2500 rpm por 30 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material no precipitado, este se filtró con papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Einalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración. Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,6% (p/v) de pohvinilpirrolidona, se mezcló con 60,9% (p/v) de solución de CuSO4.5H2O a una concentración de 0,015M y 20,5% de solución de AgNO3 a una concentración de 0,015 M. Se adicionó 15% (p/v) de extracto de pulpa de Cucúrbita moschata y 3% (p/v) de polisorbato y se agregaron a las mezclas de las sales preparadas anteriormente. Los valores óptimos de las variables de proceso para esta reacción son: temperatura de 60°C, pH 8, relación volumétrica del precursor/extracto de 4: 1 y agitación de 800 rpm.
Seguidamente la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el barrido de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de cobre- plata se presentan en un rango de longitud de onda de 400 a 500 nm.
Ejemplo 7. Síntesis de nanopartículas metálicas de hierro (Fe) a partir de Alibertia patinoi
Se empleó como agente precursor la sal metálica FeSCfi (sulfato de hierro) y como agente reductor el extracto de la pulpa de fruta de la especie Alibertia patinoi.
La pulpa de la fruta se trituró hasta quedar en puré. Después se secó en homo a temperatura de 60°C por 24 horas, posteriormente se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 nm. Se agregó agua desionizada en una relación 4: 1 (mL agua desionizada: g de pulpa seca), y se dejó reposar por 2-3 horas.
Seguidamente se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación de líquido/sólido 20: 1 (mL de agua desionizada: g de pulpa seca) y finalmente se ajustó el pH a 7 con NaOH. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se separó la fase sólida de la líquida por medio de una centrífuga a 2500 rpm por 30 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material no precipitado, este se filtró con papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Finalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,05% (p/v) de goma xantana y se mezcló con 82,05% (p/v) de una solución de FcSCfi a una concentración de 0,02M. Se adicionaron 14,9% (p/v) de extracto de pulpa de fruta de Alibertia y 3% (p/v) de polisorbato. Los valores óptimos de las variables de proceso para esta reacción son: temperatura de 50°C, pH 8, relación volumétrica del precursor/extracto de 5: 1 y agitación de 800 rpm.
Seguidamente la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el barrido de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de hierro se presenta en un rango de longitud de onda de 300 a 400 nm.
Ejemplo 8: Síntesis de nanopartículas metálicas de Cobre (Cu) a partir de Cucúrbita moschata
Se empleó como agente precursor la sal metálica CuSCL.ótLO (sulfato de cobre pentahidratado) y como agente reductor el extracto de la pulpa de fruta de la especie Cucúrbita moschata.
La pulpa de la fruta Cucúrbita moschata se trituró hasta quedar en puré. Después se secó en homo a temperatura de 60°C por 24 horas, posteriormente se molió en un molino de rodillo hasta alcanzar un tamaño de partícula entre 0,3 y 0,4 nm. Se agregó agua desionizada en una relación 4: 1 (mL agua desionizada: g de pulpa seca), y se dejó reposar por 2-3 horas.
Seguidamente se agregó agua desionizada suficiente para completar una relación de líquido/sólido 20: 1 (mL de agua desionizada: gramos de pulpa seca) y finalmente se ajustó el pH a 7 con NaOH. Esta mezcla se dejó en reposo durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se separa la fase sólida de la líquida por medio de una centrífuga a 2500 rpm por 30 min. Se extrajo el sobrenadante y con el fin de retirar el material no precipitado, este se filtró con papel filtro con tamaño de poro de 4-12 pm. Finalmente, el extracto obtenido se almacenó bajo refrigeración.
Para la reacción de síntesis, se adicionó 0,05% (p/v) de polivinilpirrolidona, a continuación, se mezcló con 88,02% (p/v) de solución de CuSCfi.óFfiO a una concentración de 0,01M. Se adicionaron 8,93% (p/v) de extracto de pulpa de la fruta Cucúrbita moschata y 3% (p/v) de polisorbato. Los valores óptimos de las variables de proceso para esta reacción son: temperatura de 50°C, pH 10, relación volumétrica del precursor/extracto entre 10: 1, respectivamente y agitación de 800 rpm.
Seguidamente, la solución coloidal de nanopartículas obtenida es llevada a espectrofotometría UV-Vis para realizar el barrido y obtener las absorbancias correspondientes a diferentes longitudes de onda, este proceso se realiza hasta que el cambio de absorbancia tenga un grado de incertidumbre de ±5% en el barrido de la muestra. El pico de absorbancia adecuado para las nanopartículas de cobre se presenta en un rango de longitud de onda de 250 a 400nm.
Ejemplo 9: Caracterización de la solución coloidal de nanopartículas
Existen diferentes técnicas de caracterización fisicoquímica que son de ayuda y pueden emplearse como una guía cualitativa y/o cuantitativa para la identificación y determinación de los candidatos a extractos capaces de reducir los iones metálicos provenientes de las sales metálicas que faciliten la síntesis de nanopartículas metálicas. Estas técnicas son llamadas Pruebas de Capacidad o Poder Reductor o antioxidante. Entre las más destacadas se encuentran el poder antioxidante -reductor férrico (FRAP, por sus siglas en ingles), el parámetro antioxidante de atrapamiento de radicales totales, (TRAP, por sus siglas en ingles), el ensayo de capacidad antioxidante equivalente Trollox (TEAC, por sus siglas en ingles), capacidad atrapadora del radical DPPH, capacidad atrapadora del radical ABTS, poder antioxidante por reducción del Fe (III), entre otros. Estos métodos han sido empleados previamente para documentar el poder reductor de una diversidad de plantas, partes de plantas y productos de plantas.
La capacidad o poder de reducción de una planta puede variar según el nivel de biomoléculas antioxidantes presente. Los resultados de estas pruebas pueden cambiar según las condiciones y/o zonas de cultivo, recolección y también según la especie vegetal.
La producción de nanopartículas puede confirmarse mediante diferentes técnicas de caracterización. Cada una de ellas entrega información de vital relevancia para la invención. La producción de nanopartículas se puede confirmar mediante el análisis de la resonancia del plasmón superficial mediante el uso de un espectrofotómetro UV-Vis en un rango de 200 a 600 nm. Mediante el uso de un difractómetro de Rayos X (XDR por sus siglas en inglés), se puede determinar la valencia de las nanopartículas. La distribución de los tamaños de las nanopartículas se puede evaluar mediante Dispersión Dinámica de Luz (DLS por sus siglas en inglés). La morfología de las nanopartículas se puede determinar mediante Microscopía Óptica de Barrido (SEM por sus siglas en inglés) o mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés). Para evaluar la composición de la solución obtenida se puede determinar mediante el uso de un Espectrofotómetro de Infrarrojo por Transformada de Pourier (FTIR por sus siglas en inglés).
En este sentido, se caracterizó la solución de nanopartículas del Ejemplo 2 por Dispersión Dinámica de Luz (DLS por sus siglas en inglés). La FIG. 1A muestra la distribución de los tamaños de partícula, en donde el primer pico de la izquierda representa el 56,2% del total de nanopartículas, las cuales se encuentran con un tamaño de 11,97 ± 3,197 nm, mientras que el segundo pico muestra el 43,6% faltante que se encuentra con un tamaño de partícula de 755 nm. Con este resultado se verifica la generación de nanopartículas.
De igual modo se caracterizó la solución del Ejemplo 3. La FIG IB muestra que el primer pico de la izquierda representa el 20,1% del total de las nanopartículas, las cuales se encuentran con un tamaño de 10±3 nm; el segundo pico representa el 60% del total de las nanopartículas, que se encuentra con un tamaño de partícula 190 ± 3,01 nm y el último pico el cual representa el 19,9% del total de las nanopartículas, con tamaños de partícula de 730 nm.
Por otro lado, la FIG 1C muestra que toda la solución del Ejemplo 6 tiene un tamaño de nanopartícula de 46 ± 5,8 nm.
La FIG ID muestra que la solución del Ejemplo 7 presenta 3 picos, el primer pico de la izquierda representa el 20,1% del total de las nanopartículas, las cuales se encuentran con un tamaño de 86±3 nm, el segundo pico representa el 60% del total de las nanopartículas que se encuentran con un tamaño de partícula 720 ± 2,01 nm, y el último pico el cual representa el 19,9% del total de las nanopartículas, se encuentran con tamaños de partícula de 990 ±5,02 nm.
Por último, la solución del Ejemplo 5, FIG 1E muestra que el primer pico de la izquierda representa el 15% del total de las nanopartículas, las cuales se encuentran con un tamaño de 90±4,01 nm; el segundo pico representa el 45% del total de las nanopartículas, que se encuentra con un tamaño de partícula 900 ± 2,01 nm, y el último pico representa el 40% del total de las nanopartículas, con tamaños de partículas de 7000 ±5,02 nm.
Adicionalmente se caracterizó la solución de nanopartículas obtenidas en el Ejemplo 2 por un Espectrofotómetro de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR por sus siglas en inglés), donde se evidencia la presencia de óxidos de cobre, debido los picos en bandas entre 550 y 1083 cm'1 (Raul et al., 2014), y la presencia de alcoholes secundarios y polifenoles debido a los picos observados en bandas cercanas a 1375 cm'1 (Nasrollahzadeh, Sajadi, Rostami-Vartooni, & Hussin, 2016). Por lo tanto, se puede afirmar que la muestra contiene importante cantidad de óxidos de cobre (CuO y Cu2O) y de compuestos orgánicos (polialcoholes y polifenoles) que pueden ayudar a estabilizar las NPs en la solución coloidal (Hame et al., 2012). De igual modo se analizó el espectro UV-visible de las nanopartículas de cobre, plata, hierro, cobre-plata sintetizadas por extractos vegetales provenientes de la pulpa de Solanum betaceum con y sin tensoactivo, cáscara de Pasiflora ligularis, Alibertia patinoi, pulpa de Selenicereus megalanthus, Cucúrbita moschata, en donde se evidencia la presencia de nanopartículas, ya que la absorbancia se encuentra en las diferentes longitudes de onda adecuadas para cada nanopartícula sintetizada, según los valores reportados en la literatura. Las nanopartículas de plata se encuentran entre un rango de 400 nm y 500 nm, las nanopartículas de cobre entre 250 nm y 400 nm, las de zinc entre 250 nm y 350 nm. El hecho de que las nanopartículas emitan en ese rango se debe a que el metal con valencia cero emite en los rangos especificados anteriormente.
Así mismo, las muestras de la solución coloidal de nanopartículas obtenidas en los Ejemplos 1 a 8 se analizaron por microscopio electrónico de transmisión TEM, las cuales exhibieron diferentes formas que dependieron de los parámetros que se emplearon en el método de síntesis descrito. Se pudo evidenciar que aquellas muestras que tenían un pH mayor a 10 y temperatura sobre los 50°C arrojaron formas esféricas y varillas, mientras que para un pH por debajo de este las nanopartículas tenían formas triangulares o poligonales.
Por otro lado, la influencia de la temperatura permitió obtener pequeñas variaciones en el tamaño promedio cristalino de las nanopartículas; por su parte la concentración de extracto agregado modifica el tamaño de las nanopartículas, pues a mayor extracto menor es el tamaño de las mismas.
Ejemplo 10. Composición biocida de nanopartículas de cobre
Una vez sintetizadas las nanopartículas de cobre se procede a la realización de una composición con actividad biocida. En un tanque agitado en operación discontinua, se adicionó polisorbato 20 a una concentración de 3,6% (p/v), seguido a esto, se adicionó hidropropilcelulosa al 0,2% (p/v), se inició una agitación a 1000 rpm, a continuación se ajustó el pH a 4 y se agregó lentamente 0,05% (p/v) de una solución coloidal de nanopartículas de cobre, seguidamente se adicionó 10% (p/v) de extracto vegetal de Solanum betaceum, esta solución se mantuvo en agitación por lo menos 30 min. Finalmente, se agregó agua desionizada y se ajustó el pH a 8.
Ejemplo 11. Composición biocida de nanopartículas de cobre-plata
En un tanque agitado en operación discontinua, se adicionó glutaraldehído a una concentración de 5,6% (p/v), seguidamente se adicionó hidroxietilcelulosa al 0,2% (p/v), se inició una agitación a 1000 rpm y se fue agregando lentamente 0,05% (p/v) de la solución coloidal de nanopartículas de cobre-plata, seguidamente se adicionó 10% (p/v) de extracto vegetal de Passiflora ligularis.
Esta solución se mantuvo en agitación por lo menos 30 min; por último, se agregó agua desionizada y se ajustó el pH a 8.
Ejemplo 12. Composición biocida de nanopartículas de zinc
En un tanque agitado en operación discontinua, se adicionó polisorbato 80 a una concentración de 3,6% (p/v), seguidamente se adicionó hidroxietilcelulosa al 0,5% (p/v), se inició una agitación a 1000 rpm y se fue agregando lentamente 0,1% (p/v) de la solución coloidal de nanopartículas. Seguidamente se adicionó 15% (p/v) de extracto vegetal de Selenicereus megalanthus, esta solución se mantuvo en agitación por lo menos 30 min, por último, se agregó agua desionizada y se ajustó el pH a 8.
Ejemplo 13. Composición biocida de nanopartículas de hierro
En un tanque agitado en operación discontinua, se adicionó amonio cuaternario de quinta generación en una concentración de 3,6% (p/v), seguidamente se adicionó grenetina al 0,5% (p/v), se inició una agitación a 1000 rpm, se ajustó el pH a 4 y se fue agregando lentamente 0,8% (p/v) de la solución coloidal de nanopartículas; seguidamente se adicionó 15% (p/v) de extracto vegetal de Alibertia patinoi. Esta solución se debe mantener en agitación por lo menos 30 min, por último, se agregó agua desionizada y se ajustó el pH a 8. Ejemplo 14. Actividad biocida exhibida por nanopartículas de cobre y plata
Para las nanopartículas de cobre y plata preparadas en los Ejemplos 1, 2 y 4 se llevaron a cabo pruebas microbiológicas y virucidas empleando las cepas bacterianas Escherichia Coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y Desulfotomaculum nigrificans, las cepas fungicas Candida albicans y Aspergillus niger y el Flavivirus del dengue.
Los resultados se muestran en la siguiente tabla:
Figure imgf000028_0001
Tabla 1. Concentración Mínima Bactericida (MBC) y actividad biocida de las nanopartículas de cobre y plata sintetizadas a partir de Passiflora ligularis
Ejemplo 15. Actividad biocida exhibida por las composiciones de nanopartículas de plata, cobre, cobre-plata y zinc
Se cuantificó la actividad biológica y efectividad de la composición biocida desarrolladas en los Ejemplos 10 a 13 en términos de la concentración mínima inhibitoria (MIC), llevando a cabo el procedimiento descrito a continuación:
Se utilizó Escherichia coli (ATCC® 25922), donada por la Universidad de Santander, la cual estaba suspendida en solución salina y glicerol (40%-Panreac) y preservadas a 80°C. Para su reactivación se realizaron dos pases en agar nutritivo (Merck).
Se utilizó el método estandarizado por el Instituto de Estándares Clínicos de Laboratorio, CLSI M07-A10. Se preparó una suspensión de bacterias de 3-5 colonias de un cultivo fresco de microorganismo, ajustando su concentración a la turbidez 0,5 de la escala de McFarland en solución salina (0,85%); posteriormente, se realizó una dilución 1:50 y de esta 1:20 en caldo Mueller Hinton, ajustando a una concentración final de 1 o 2x104 células/ml. El inoculo fue expuesto a diferentes concentraciones de las nanopartículas de cobre, plata y zinc sintetizadas en extractos vegetales por 24 horas a 35°C.
Como controles positivos se utilizó la clorhexidina como desinfectante de referencia, partiendo de una concentración del 4% (p/v) Este método permitió determinar la concentración mínima capaz de inhibir el crecimiento microbiano por parte de las nanopartículas metálicas, por medio de valoraciones macroscópicas de la turbidez asociada al crecimiento microbiano.
Para determinar la concentración bactericida mínima, se tomó a partir de la MIC. Se tomaron 10 pl de cada una de las concentraciones en las que se haya observado inhibición del crecimiento visible del microorganismo, posterior a esto se sembró en cajas de Petri con agar Mueller Hinton incubados a 35°C por 24 horas, considerándose como bactericida, aquella concentración en la cual se observe un número < 3 unidades formadoras de colonias (UFC).
Figure imgf000029_0001
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Tabla 2. Concentración Mínima inhibitoria (MIC) y actividad biocida de las composiciones de plata, cobre, cobre-plata y zinc
Ejemplo 16. Pruebas de efectividad de las composiciones de nanopartículas.
Para las composiciones biocidas desarrolladas en los Ejemplos 10 a 13 se realizaron pruebas de efectividad con diferentes cepas bacterianas durante un tiempo de 30 minutos de contacto entre el biocida y la cepa bacteriana. Las cepas bacterianas utilizadas en los biocidas fueron: Escherichia Coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Desulfotomacidum nigrificans, Candida albicans, Aspergillus ni ger y Pseudomonas aeruginosas.
Figure imgf000030_0002
Tabla 3. Actividad biocida de las composiciones de nanopartículas de cobre, plata, zinc, hierro y cobre- plata
Ejemplo 17. Actividad biocida de la composición que comprende nanopartículas de cobre en Desulfovibrio desulfuricans
Se evaluó la actividad biocida en Desulfovibrio desulfuricans, por el método de Time Kill Test en el medio Starkey (medio de mantenimiento). En esta metodología el agente biocida que comprende nanopartículas de cobre fue puesto en contacto con una población conocida de microorganismos por cierto tiempo a temperatura de 37°C. El medio Starkey es un medio de mantenimiento (usado tanto para inoculo como para dilución y medición de las muestras). La preparación del medio se llevó a cabo con la siguiente formulación:
Figure imgf000031_0001
Tabla 4. Formulación del medio Starkey
Se realizó la mezcla de todos los elementos y se ajustó el pH a 7,5 ±0,2 con NaOH 1N y se calentó a 70°C.
Se dosificó en volúmenes de 9,0 mi, se introdujo una aguja sola y otra conectada al sistema de gases inyectando N2 y desplazando el oxígeno, permitiendo así un ambiente anaerobio, posterior a esto se autoclavo a 121°C y 15 psi durante 15 minutos.
Posteriormente, para la preparación del inoculo se tomaron 5 mi de inoculo de las cepas ATCC Desulfovivrio desulfuricans en 50 mi de medio Starkey garantizando la cantidad de inoculo deseado. Se incubó por 24 horas 37°C.
Para la evaluación del biocida, se tomó 1 ml del inoculo preparado y se adicionó en cada uno de los tubos que contenían 9 ml del medio Starkey, adicionalmente se agregó 200 ppm del biocida a evaluar y a continuación, se midió su absorbancia a 600 nm en el equipo TERMO GENESYS 5 a Oh, 2h, 4h, 24h, 36h, 72h y 192h.
Para el control positivo se empleó glutaraldehído y se realizó el mismo procedimiento descrito anteriormente para la muestra. Se registró el promedio de los recuentos microbiológicos transformados a logaritmo y se calculó la reducción logarítmica de las poblaciones para cada tiempo según la fórmula: log10 RL = log10 'Control positivo' — log10 'Biocida'
Exhibiendo el comportamiento demostrado en la Tabla 5
Figure imgf000032_0001
_ _ Tabla 5. Actividad biocida exhibida por el biocida con composición de nanopartículas de cobre
De los resultados obtenidos en los Ejemplos 15 a 17, se evidencia que la actividad biocida exhibida por las composiciones de la presente invención ante diferentes cepas presenta un recuento bacteriano de manera consistente por debajo de 3 UFC/ml. Esto se evidencia en las tablas presentadas anteriormente ya que todos los recuentos de cultivos en escalas de 3* 105 arrojan resultados negativos, esto significa por debajo de este número de colonias no hay crecimiento bacteriano. De igual manera las pruebas realizadas con la solución coloidal de nanopartículas del Ejemplo 14, presentan inhibición de las cepas valoradas.
Por otro lado, los resultados obtenidos a partir de Dispersión de Luz Dinámica (DLS) confirman la capacidad que poseen los diferentes extractos vegetales estudiados, como agentes reductores para la síntesis de nanopartículas metálicas y bimetálicas.
Finalmente se puede apreciar que la adición de diferentes aditivos como los espesantes poliméricos y tensoactivos ayudan a la estabilidad de la solución coloidal de nanopartículas, esto se evidencia mediante las lecturas periódicas de absorbancias, además de presenciarlo de manera cualitativa ya que sólo se observa la presencia de una fase. Adicionalmente, la composición biocida del presente desarrollo permite el máximo aprovechamiento de los extractos vegetales pues actúan en la composición como agentes estabilizantes que funcionalizan las nanopartículas, ubicándose en su superficie como un tipo de recubrimiento estabilizante, que permite que las nanopartículas no se aglomeren y así evitar la formación de partículas. De igual modo, el uso de tensioactivos en la composición permite el control del tamaño de las nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos. El control de la morfología de las nanopartículas en la composición biocida del desarrollo es importante, ya que de esta depende las propiedades que pueden tener las composiciones como lo son catalíticas, ópticas, fotónicas, químicas y biológicas además de biocidas.
Por otro lado, los Ejemplos 1 a 8 permiten evidenciar que hubo una reducción considerable en los tiempos normales de síntesis de nanopartículas conocidos por una persona versada en la materia del 25%, además los pH empleados para llevar a cabo la reacción corresponden con valores más básicos de 8 y 12, además de la incorporación de polímero ya que este ayuda en la disminución de aglomerados lo cual es favorable para diferentes propiedades como tamaño, estabilidad y actividad biocida.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición biocida que comprende: nanopartículas de metales o de óxidos metálicos; un extracto vegetal; en donde el metal de las nanopartículas se selecciona del grupo de metales de transición, XIII y XIV ; y en donde el extracto vegetal se selecciona entre un extracto de Passiflora ligularis, Sambucus mexicana, Selenicereus megalanthus, Solanum quitoense, Amona cherimola, Solanum bataceum, Cucúrbita moschata, Luffa aegyptiaca, Arracada xanthorrhiza, Fragaria ananassa, Furcraea andina, Alibertia patinoi, Pourteria sapota, Ficus carica, Passiflora quadrangularis, Vaccinium meridionale, Passiflora maliformis, Bactris gasipaes, Cassia grandis, Vasconcellea pubescens, Melicoccus bijugatus y Mammea americana.
2. La composición de la Reivindicación 1, en donde el tamaño de las nanopartículas es menor a 100 nm.
3. La composición de la Reivindicación 1, que además comprende un espesante polimérico y un tensi oactivo.
4. Un método para la producción in situ de nanopartículas metálicas que comprende: a) mezclar un espesante polimérico en una concentración entre 0,05 y 5% (p/v), una solución de una primera sal metálica en una concentración entre 0,05M y 10M y un extracto de un material vegetal en una relación volumétrica de la primera sal metálica: extracto entre 2: 1 y 10: 1, durante al menos 2 horas, una agitación de al menos 800 rpm, a una temperatura entre 25 y 100°C y un pH entre 4 y 12; b) dejar en reposo la mezcla de la etapa a) por al menos 2 horas a temperatura ambiente y sin agitación; c) tomar lecturas de la mezcla en un espectrofotómetro al finalizar la etapa b), hasta que la absorbancia no muestre variación;
33 en donde el material vegetal del extracto se selecciona entre el grupo que consiste de Passiflorci ligularis, Sambucus mexicana, Selenicereus megalanthus, Solanum quitoense, Amona cherimola, Solanum bataceum, Cucúrbita moschata, Luffa aegyptiaca, Arracada xanthorrhiza, Fragaria ananassa, Furcraea andina, Alibertia patinoi, Pourteria sapota, Ficus carica, Passiflora quadrangularis, Vaccinium meridionale, Passiflora maliformis, Bactris gasipaes, Cassia grandis, Vasconcellea pubescens, Melicoccus bijugatus y Mammea americana.
5. El método de la Reivindicación 4, en donde el extracto vegetal es acuoso y/o etanólico.
6. El método de la Reivindicación 4, en donde el extracto vegetal comprende un tensoactivo.
7. El método de la Reivindicación 4, en donde se adiciona una segunda sal de metal simultáneamente en la mezcla de la etapa a).
8. El método de la Reivindicación 7, en donde el metal de la primera o segunda sal se selecciona del grupo de metales de transición, XIII y XIV.
9. El método de la Reivindicación 4, en donde las nanopartículas obtenidas son mono o bimetálicas.
34
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