ES2596807T3

ES2596807T3 - Métodos y combinaciones de marcadores para detectar la predisposición al cáncer de pulmón

Info

Publication number: ES2596807T3
Application number: ES08781113.9T
Authority: ES
Inventors: Tracey Colpitts; Eric L. Russell; Stephen Frost; Javier Ramirez; Bhawani Singh; John C. Russell
Original assignee: Abbott Molecular Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2028-06-27
Also published as: US20150168412A1; EP2171464A4; EP2650683A1; ES2633596T3; EP2650683B1; HK1163250A1; JP5611821B2; CA2691852A1; CA2691852C; JP6030101B2; WO2009006323A2; US20120071334A1; US20080160546A1; EP2171464A2; JP2015007645A; US9347945B2; US20160320393A1; WO2009006323A3; JP2017049263A; JP2010532480A

Abstract

Un método para ayudar en el diagnóstico de un sujeto sospechoso de padecer cáncer de pulmón, comprendiendo el método las etapas de: a. cuantificar en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto la cantidad de biomarcadores en un panel, comprendiendo el panel al menos los cuatro anticuerpos anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAP3 y anti-ciclina E2; b. comparar la cantidad de cada biomarcador cuantificado en el panel con un valor de corte predeterminado para dicho biomarcador y determinar una puntuación para cada biomarcador basándose en dicha comparación; c. combinar la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificada en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto; d. comparar la puntuación total determinada en la etapa c con una puntuación total predeterminada; y e. determinar si dicho sujeto tiene riesgo de padecer cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total en la etapa d.

Description

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f.: comparar la puntuación total determinada en la etapa e con una puntuación total predeterminada; y

g.: determinar si dicho sujeto tiene riesgo de cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa f.

En el método anterior, el DFI de los biomarcadores relacionados con el cáncer de pulmón es preferentemente menor de aproximadamente 0,4.

En el método anterior, el panel puede comprender al menos un anticuerpo que se selecciona de entre el grupo que consiste en: antip53, anti-TMP21, anti-NY-ESO-1, anti-HDJ1, anti-dominio-NPC1L1C, anti-TMOD1, anti-CAMK1, anti-RGS1, anti-PACSIN1, anti-RCV1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclinas E2 y al menos un antígeno que se selecciona de entre el grupo que consiste en: citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA125, CA15-3, SCC, CA 19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-anti-tripsins, apolipoproteína CIII y T4.

En el método anterior. El parámetro biométrico que se obtiene del sujeto se selecciona de entre el grupo que consiste de la historia de fumador del sujeto, la edad, exposición a carcinógenos y género. Preferentemente, el parámetro biométrico es el de paquetes años como fumador del sujeto.

Opcionalmente, el método puede comprender además la cuantificación de al menos una región de interés en la muestra de ensayo. Si una región de interés se va a cuantificar en la muestra de ensayo, entonces el panel puede comprender además una región de interés que se selecciona de entre el grupo que consiste en: Acn6399, Acn9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Pub6453, Pub2951, Pub2433, Pub17338, TFA6453 y HIC3959.

Opcionalmente. El método anterior puede emplear también un Método de Puntuación Compensada, para determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón. Si el método anterior emplea tal Método de Puntuación Compensada, entonces en dicho método, la etapa b comprendía la comparación del valor de al menos un parámetro biométrico con un número de puntos de corte predeterminados para dicho parámetro biométrico y la asignación de una puntuación para cada parámetro biométrico basándose en dicha comparación, la etapa d comprende la comparación de la cantidad de cada biomarcador en el panel con un varios puntos de corte predeterminados para dicho biomarcador y la asignación de una puntuación para cada biomarcador basándose en dicha comparación, la etapa e comprende la combinación de la puntuación asignada a cada parámetro biométrico en la etapa b con la puntuación asignada para cada biomarcador en la etapa d para llegar a una puntuación total para dicho sujeto, la etapa f comprende la comparación de la puntuación total determinada en la etapa e con una puntuación total predeterminada y la etapa g comprende determinar si dicho sujeto tiene cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa f.

En otro aspecto, el método de la presente divulgación puede comprender las etapas de:

a.: cuantificar en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto, la cantidad de dos o más biomarcadores en un panel, el panel comprende al menos un anticuerpo y al menos un antígeno;

b.: comparar la cantidad de cada biomarcador cuantificado en el panel con un punto de corte predeterminado para dicho biomarcador y asignar una puntuación para cada biomarcador basándose en dicha comparación;

c.: combinar la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificado en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto;

d.: comparar la puntuación total determinada en la etapa c con una puntuación total predeterminada; y

e.: determinar si dicho sujeto tiene riesgo de cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa d.

En el método anterior, el DFI de los biomarcadores relacionados con cáncer de pulmón es preferentemente menor de aproximadamente 0,4.

En el método anterior, el panel puede comprender al menos un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en: anti-p53, anti-TMP21, anti-NY-ESO-1, anti-HDJ1, anti-dominio-NPC1L1C, anti-TMOD1, anti-CAMK1, anti-RGS1, anti-PACSIN1, anti-RCV1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2. El panel puede comprender al menos un antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste en: citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina18, CEA, CA125, CA15-3, SCC, CA19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-anti-tripsina, apolipoproteína CIII y Tβ4.

Opcionalmente, el método puede comprender además la cuantificación de al menos una región de interés que se selecciona de entre el grupo que consiste en: Acn6399, Acn9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Pub6453, Pub2951, Pub2433, Pub17338, TFA6453 y HIC3959.

Opcionalmente, el método anterior puede emplear también un Método de Puntuación Ponderada, entonces en dicho método, la etapa b comprende la comparación de la cantidad de cada biomarcador del panel con varios puntos de corte para dicho biomarcador y la asignación de una puntuación para cada biomarcador basándose en dicha comparación, la etapa c comprende la combinación de la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificada en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto, la etapa d comprende la comparación de la

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puntuación total determinada en la etapa c con una puntuación total predeterminada y la etapa e comprende determinar si dicho sujeto tiene cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa d.

a.: cuantificar en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto, una cantidad de al menos un biomarcador del panel, el panel comprende al menos un anti-Ciclina E2;

b.: comparar la cantidad de cada biomarcador cuantificado del panel con un punto de corte predeterminado para dicho biomarcador y asignar una puntuación para cada biomarcador basándose en dicha comparación;

e.: determinar si dicho sujeto tiene un riesgo de cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa d.

Opcionalmente, el método anterior puede comprender además la cuantificación de al menos un antígeno en la muestra de ensayo, cuantificar al menos un anticuerpo en la muestra de ensayo, o cuantificar una combinación de al menos un antígeno y al menos un anticuerpo en la muestra de ensayo. Por consiguiente, si al menos un antígeno, al menos un anticuerpo o una combinación de al menos un antígeno y al menos un anticuerpo se van a cuantificar en la muestra de ensayo, entonces el panel puede comprender además al menos un antígeno que se selecciona de entre el grupo que consiste en: citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA125, CA15-3, SCC, CA19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-anti-tripsina, apolipoproteína CIII y T4, al menos un anticuerpo que se selecciona de entre el grupo que consiste en: anti-p53, anti-TMP21, anti-NY-ESO-1, anti-HDJ1, anti-dominio-NPC1L1C, anti-TMOD1, anti-CAMK1, anti-RGS1, anti-PACSIN1, anti-RCV1, anti-MAPKAPK3 o cualquier combinación de los mismos.

Opcionalmente, el método puede comprender además la cuantificación de al menos una región de interés en la muestra de ensayo. Si se va a cuantificar una región de interés, entonces, el panel puede comprender además a l menos una región de interés que se selecciona de entre el grupo que consiste en: Acn6399, Acn9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Pub6453, Pub2951, Pub2433, Pub17338, TFA6453 y HIC3959.

Opcionalmente, el método anterior también puede emplear un Método de Puntuación Ponderada para determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón. Si el método anterior emplea tal Método de Puntuación Ponderada, entonces en dicho método, la etapa b comprende la comparación de la cantidad de cada biomarcador del panel con varios puntos de corte predeterminados para dicho biomarcador y la asignación de una puntuación para cada biomarcador basándose en dicha comparación, la etapa c comprende la combinación de la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificado en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto, la etapa d comprende la comparación de la puntuación total determinada en la etapa c con una puntuación total predeterminada y la etapa e comprende determinar si dicho sujeto tiene cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa d.

Opcionalmente, el método anterior puede comprender además la etapa de obtención de un valor para al menos un parámetro biométrico de un sujeto. Un parámetro biométrico que se puede obtener de un sujeto se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en: la historia de fumador de un sujeto, edad, exposición a carcinógenos y género. Un parámetro biométrico preferido que se obtiene es el de paquetes años de fumador del sujeto. Si el método anterior comprende además la etapa de obtención de un valor para al menos un parámetro biométrico del sujeto, entonces el método puede además comprender la etapa de comparación del valor de al menos un parámetro biométrico con un punto de corte predeterminado para dicho parámetro biométrico y la asignación de una puntuación para cada parámetro biométrico basándose en dicha comparación, la combinación de la puntuación asignada para cada parámetro biométrico con la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificado en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto, comparando la puntuación total con una puntuación predeterminada total de la etapa c y determinar si dicho sujeto tiene un riesgo de cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total en la etapa d.

En otro aspecto, el método de la presente divulgación puede comprender los pasos de:

a.: cuantificar en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto al menos un biomarcador en un panel, el panel comprende al menos un biomarcador que se selecciona de entre el grupo que consiste en: citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA125, CA15-3, SCC, CA19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-antitripsina, apolipoproteína CIII y T4;

b.: comparar la cantidad de cada biomarcador cuantificado en el panel para un punto de corte predeterminado

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puntuación total predeterminada y utilizando dicha comparación como una ayuda para determinar si un sujeto tiene un cáncer de pulmón. Ejemplos de antígenos y regiones de interés que se pueden cuantificar son: (a) citoqueratina 19 y CEA y Acn9459, Pub11597, Pub4789 y Tfa2759; (b) citoqueratina 19 y CEA y Acn9459, Pub11597, Pub4789, Tfa2759 y Tfa9133; y (c) citoqueratina 19, CEA, CA125, SCC, citoqueratina 18, y ProGRP y ACN9459, Pub11597, Pub4789 y Tfa2759. En otro aspecto, un kit puede comprender (a) reactivos que contienen al menos un anticuerpo para cuantificar uno o más antígenos en una muestra de ensayo, donde dichos antígenos son citoqueratina 19, citoqueratina 18, CA 19-9, CEA, CA15-3, CA125, SCC y ProGRP; y (b) uno o más algoritmos para la combinación y comparación de la cantidad de cada antígeno cuantificado en la muestra de ensayo con un punto de corte predeterminado y asignar una puntuación para cada antígeno cuantificado basándose en dicha comparación, combinando la puntuación asignada para cada antígeno cuantificado para obtener una puntuación total, comparando la puntuación total con una puntuación total predeterminada y utilizando dicha comparación como ayuda para determinar si un sujeto tiene un cáncer de pulmón. Ejemplos de antígenos que se pueden cuantificar utilizando el kit son citoqueratina 19, citoqueratina 18, CA19-9, CEA, CA15-3, CA125, SCC y ProGRP. En otro aspecto, un kit puede comprender (a) reactivos para cuantificar uno o más biomarcadores, donde dichos biomarcadores son regiones de interés seleccionadas de entre el grupo que consiste en: ACN9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Tfa6453 y Hic3959; y (b) uno o más algoritmos para combinar y comparar la cantidad de cada biomarcador cuantificado en la muestra de ensayo con un punto de corte determinado y asignar una puntuación para cada biomarcador cuantificado basándose en dicha comparación, combinando la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificado para obtener una puntuación total, comparando la puntuación total con una puntuación total predeterminada y utilizando dicha comparación como una ayuda para determinar si un sujeto tiene cáncer de pulmón. Ejemplos de regiones de interés que pueden cuantificarse utilizando el kit se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en: Pub11597, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Tfa6453 e Hic3959. En otro aspecto más, un kit puede comprender (a) reactivos que contienen al menos un anticuerpo para cuantificar uno o más antígenos en una muestra de ensayo, donde dichos antígenos son: citoqueratina 19, CEA, CA125 y ProGRP; (b) reactivos que contienen uno o más antígenos para cuantificar al menos un anticuerpo en una muestra de ensayo; donde dichos anticuerpos son: anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2; y (c) uno o más algoritmos para combinar y comparar la cantidad de cada antígeno y anticuerpo cuantificado en la muestra de ensayo con un punto de corte predeterminado y asignar una puntuación para cada antígeno y anticuerpo cuantificados basándose en dicha comparación, combinando la puntuación asignada para cada antígeno y anticuerpo cuantificados para obtener una puntuación total, comparando la puntuación total con una puntuación total predeterminada y utilizando dicha comparación como ayuda para determinar si un sujeto tiene cáncer de pulmón. Opcionalmente, el kit puede comprender reactivos para cuantificar cada uno de citoqueratina 19, CEA, CA125 y ProGRP en una muestra de ensayo, reactivos para cuantificar cada uno de anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2 en una muestra de ensayo o reactivos para cuantificar cada uno de citoqueratina 19, CEA, CA125 ProGRP, anti-p53, anti-NY-ESO-.1. anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2 en una muestra de ensayo.+

La presente divulgación también se refiere a polipéptidos aislados o purificados. Los polipéptidos aislados o purificados contemplados en la presente invención son: (a) un polipéptido aislado o purificado que tiene (comprende) una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 3 y un polipéptido que tiene un 60% de homología con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; (b) un polipéptido aislado o purificado que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 3 y un polipéptido que tiene un 60% de homología con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; (c ) un polipéptido aislado o purificado que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; (d) un polipéptido aislado o purificado que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 4 y un polipéptido que tiene un 60% de homología con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; (f) un polipéptido aislado o purificado que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (g) un polipéptido aislado o purificado que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5 y un polipéptido que tiene un 60% de homología con la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 5; (h) un polipéptido aislado o purificado que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 5 y un polipéptido que tiene un 60% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; e (i) un polipéptido aislado o purificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

La presente invención también se refiere a un Método de Puntuación Ponderada único. Este método se puede utilizar para puntuar uno o más marcadores obtenidos de un sujeto. Este método puede comprender las etapas de:

a.: cuantificar la cantidad de un marcador obtenido de una muestra de ensayo de un sujeto;

b.: comparar la cantidad de cada marcador cuantificado con varios puntos de corte predeterminados para dicho marcador y asignar una puntuación a cada marcador basándose en dicha comparación; y

c.: combinar la puntuación asignada para cada marcador cuantificado en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto.

En el método anterior, los puntos de corte predeterminados se basan en curvas y la puntuación para cada marcador se calcula basándose en la especificidad del marcador. Adicionalmente, el marcador en el método anterior puede ser un biomarcador, un parámetro biométrico o una combinación de un biomarcador y un parámetro biométrico.

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Adicionalmente, la presente divulgación proporciona un método para determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar una afección médica utilizando el Método de Puntuación Ponderada. Este método puede comprender las etapas de:

a.: cuantificar en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto la cantidad de al menos un marcador.

b.: comparar la cantidad de cada marcador cuantificado con varios puntos de corte predeterminados para dicho marcador y asignar una puntuación para cada marcador basándose en dichas comparaciones;

c.: combinar la puntuación asignada para cada marcador cuantificado en la etapa b para obtener una puntuación total para dicho sujeto;

e.: determinar si dicho sujeto tiene riesgo de desarrollar una afección médica basándose en la comparación de la puntuación total determinada en la etapa d.

En el método anterior, los puntos de corte predeterminados se basan en curvas y la puntuación de cada marcador se calcula basándose en la especificidad del marcador. Adicionalmente, el marcador del método anterior puede ser un biomarcador, un parámetro biométrico o una combinación de un marcador y un parámetro biométrico.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama del flujo de trabajo bioinformático. Específicamente, se sometieron los datos de la MS e IA a varios métodos estadísticos. Se utilizó la regresión logísticas para generar curvas de Característica Operativa del Receptor (ROC) y para obtener el Área Bajo la Curva (AUC) para cada marcador. Los marcadores superiores con las AUC más altas se seleccionaron como marcadores candidatos. Los análisis multivariados (MVA) tales como Análisis Discriminatorio (DA), Análisis de Componente Principal (PCA) y Árboles de decisión (DT) identificaban los marcadores adicionales para introducirlos en el modelo. También se pueden incluir los parámetros biométricos. Los marcadores robustos que se producen en al menos el 50% de los grupos de entrenamiento se identifican por el método/algoritmo de división y puntuación (SSM) y se seleccionan como supuestos marcadores. El proceso se repite n veces hasta que se obtiene un número de marcadores adecuado para el modelo predictivo final. La Figura 2 es un perfil de MS MALDI-TOF que muestra el biomarcador candidato Pub11597 a) tras la concentración de fracciones HPLC agrupadas y b) antes del proceso de concentración. La muestra es una mezcla compleja incluso tras el fraccionamiento HPLC. La Figura 3 es un gel teñido que muestra los componentes de las distintas muestras cargadas en el gel. Las calles a, f y g muestran una mezcla de proteínas de referencia de masas moleculares conocidas con fines de calibración. Adicionalmente, las calles b y e muestran una forma altamente purificada de la proteína sospechosa conocida como amiloide A sérico humano (HSAA), que se obtuvo comercialmente. Las calles c y d muestran las muestras fraccionadas que contienen el supuesto biomarcador. Hay un componente en la mezcla que migra a la misma distancia que el HSAA de referencia. Las bandas que tenían la misma distancia de migración que el HSSA se extirparon del gel y se sometieron a digestión en gel y análisis MS/MS para confirmar su identidad. La Figura 4 es una LS-MS/MS de la digestión tríptica de Pub 11597. Los paneles a-d muestran la MS/MS de 4 iones precursores principales. Los productos iónicos b e y se anotaron y se dio la secuencia de aminoácidos derivada de cada uno de los cuatro iones precursores. La búsqueda en la base de datos utilizando las masas moleculares de los iones generados, b e y, identificaron la fuente proteica como HSAA. La secuencia completa del fragmento observado (PM = 11526,51) se proporciona en la SEQ ID NO: 6. La Figura 5 da las curvas generadas del panel de 8 inmunoensayos de biomarcadores en muestras de 751 pacientes que se describe en el Ejemplo 1. Los rombos sólidos representan la curva generada por la puntuación total utilizando el Método de Puntuación Ponderada. Los cuadrados representan la curva generada por la puntuación total utilizando el método de puntuación binario utilizando puntos de división (puntos de corte) de una gran cohorte. Los triángulos sólidos representan la curva que se genera de la puntuación total utilizando el método de puntuación binario utilizando puntos de división (puntos de corte) de una pequeña cohorte. La Figura 6 da el AUC de un panel de 7 autoanticuerpos ensayados en cáncer de pulmón, benignos, y sujetos normales y los valores de todas las mediciones determinadas utilizando el método múltiple de medias (MoM) y el método de división y puntuación (SSM). En la Figura 6, -0-es la puntuación SSM basándose en los puntos de división para dar la máxima precisión; -■-es la puntuación SSM basándose en los puntos de división para dar un 98% de especificidad; y -●-es la puntuación MoM. La Figura 7 da el AUC para un panel de 4 inmunoensayos y 4 autoantígenos ensayado en sujetos con una historia de fumador empedernido (más de 20 paquetes años), en sujetos con una historia de fumador menos intensa o no fumador (menos de 20 paquetes años) y en sujetos en los que se desconoce su historia de fumador. En la Figura 7, -es menos de 20 paquetes años (packyrs) como fumador; -□-es mayor de 20 packyrs; y -●-es packyrs desconocido. La Figura 8 da el AUC para el panel de 4 inmunoensayos y 4 autoantígenos ensayados en sujetos que tienen un estadio temprano de cáncer de pulmón y enfermedad pulmonar benigna. Esta Figura 8 muestra que la capacidad de cada biomarcador individual ensayado para diferenciar el cáncer de pulmón en estado temprano y tardío de los sujetos con enfermedad pulmonar benigna y normales. En esta Figura 8, -●-muestra temprano frente a norma; -○-muestra temprano frente a benigno; -muestra tardío frente a normal; y --------muestra tardío frente a benigno.

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La Figura 9 da el AUC de un panel de 4 inmunoensayos, 4 autoantígenos, 4 inmunoensayos y un marcador de respuesta inmunitaria (haptoglobina, amiloide sérico A, proteína C reactiva y apolipoproteína A), uno de 4 autoantígenos y uno de marcador de respuesta inmunitaria y uno de 4 inmunoensayos, 4 autoantígenos y uno de marcador de respuesta inmunitaria para la diferenciación de cáncer de pulmón en estadio temprano y tardío de la enfermedad pulmonar benigna. Para cada panel de biomarcadores, se presentan cuatro barras. La primera barra representa el AUC para discriminar los pacientes de cáncer de estadio temprano de la enfermedad pulmonar benigna; la segunda barra representa el AUC para discriminar el cáncer de pulmón en estadio temprano de los normales; la tercera barra representa el AUC para discriminar los pacientes de cáncer pulmonar en estado tardío de la enfermedad pulmonar benigna; y la cuarta barra representa el AUC para discriminar el cáncer de pulmón en estadio tardío de los normales. La Figura 10 da el AUC para el ensayo de T4 realizado en un total de 118 muestras (44 de cáncer de pulmón y 74 no cancerosas) que contiene muestras normales, benignas y de pacientes de cáncer. El AUC = 0,8393.

Descripción detallada de la invención

DEFINICIONES

Como se utiliza en la presente solicitud, los siguientes términos tienen los siguientes significados. Todos los demás términos técnicos o científicos tienen el significado que comprenden comúnmente los expertos en la técnica.

El término “adsorbente” se refiere a cualquier material que es capaz de acumular (unirse) a una biomolécula. El adsorbente típicamente reviste una superficie biológicamente activa y está compuesto por un material simple o una pluralidad de diferentes materiales que sean capaces de unirse a una biomolécula o una variedad de biomoléculas basándose en sus características físicas. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a, materiales de intercambio de aniones, materiales de intercambio de cationes, quelantes metálicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, péptidos, anticuerpos, polímeros (sintéticos o naturales), papel, etc.

Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina o una parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte de unión al antígeno. Ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab), y F(ab’)2 que se pueden generar tratando un anticuerpo con una enzima, tal como la pepsina. Ejemplos de anticuerpos incluyen pero no se limitan a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes, Fv de cadena sencilla (“scFv”), un anticuerpo de afinidad madura, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio sencillo, fragmentos F(ab), fragmentos F(ab’), Fv unidos por disulfuro (“sdFv”), y anticuerpos antiidiotípicos (“anti-Id”) y fragmentos de unión al epítopo funcionalmente activos de cualquiera de los anteriores. Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” también incluye autoanticuerpos (Los autoanticuerpos son anticuerpos que sintetiza un sujeto o paciente que se dirigen contra las proteínas propias normales (o antígenos propios) tales como, pero sin limitarse a, p53, calreticulina, alfaenolasa, y HOXB7. Los autoanticuerpos contra un amplio intervalo de antígenos propios son bien conocidos por los expertos en la técnica y se han descrito en muchas enfermedades malignas incluyendo el cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, y cáncer de páncreas, entre otros). Un anticuerpo es un tipo de biomarcador.

Como se utiliza en el presente documento, el término “antígeno” se refiere a una molécula capaz de unirse a un anticuerpo y que además es capaz de inducir que un animal produzca anticuerpos capaces de unirse al menos a un epítopo de ese antígeno. Adicionalmente, una región de interés también puede ser un antígeno (en otras palabras, puede en último término determinarse que es un antígeno). Un antígeno es un tipo de biomarcador.

El término “AUC” se refiere al Área Bajo la Curva de una curva ROC. Se utiliza como una figura de la ventaja de un ensayo sobre una población de muestras determinada y da valores que fluctúan entre 1 para un ensayo perfecto a 0,5 en el que el ensayo da una respuesta completamente aleatoria en la clasificación de sujetos de ensayo. Como el intervalo del AUC es solo de 0,5 a 1, un pequeño cambio en el AUC tiene un mayor significado que un cambio en un sistema métrico que varía de 0 a 1 o de 0 al 100%. Cuando se da el cambio del AUC en %, se calculará basándose en el hecho de que el intervalo completo del sistema métrico es de 0,5 a 1,0. El paquete estadístico JMP™ informa del AUC para cada curva generada. Las medidas del AUC son un medio valioso para comparar la precisión del algoritmo de clasificación a lo largo del intervalo de datos completo. Esos algoritmos de clasificación con un AUC mayor tienen por definición, una mayor capacidad para clasificar correctamente desconocidos entre los dos grupos de interés (enfermos y no enfermos). El algoritmo de clasificación puede ser tan simple como la medición de una única molécula o tan complejo como la medida e integración de múltiples moléculas.

La expresión “enfermedad pulmonar benigna” o “benigno” se refiere a una afección de una enfermedad asociada con el sistema pulmonar de un sujeto dado. En el contexto de la presente invención, una enfermedad pulmonar benigna incluye, pero no se limita a, trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD), inflamación aguda o crónica, nódulos benignos, neoplasias benignas, displasia, hiperplasia, atipia, bronquiectasia, histoplasmosis, sarcoidosis, fibrosis, granuloma, hematoma, enfisema, atelectasia, histiocitosis y otras enfermedades no cancerosas.

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0 para un ensayo con una actuación del 100% de sensibilidad y el 100% de especificidad y aumenta a 1,414 para un ensayo con el 0% de sensibilidad y el 0% de especificidad. A diferencia del AUC que utiliza el intervalo completo de datos para su determinación, el DFI mide la actuación de un ensayo en un punto particular de la curva ROC. Los ensayos con valores DFI más bajos actúan mejor que los de valores DFI más altos. La DFI se trata en detalle en la Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. Nº 2006/0211019A1.

Los términos “conjunto”, “árbol de conjunto” o “clasificador de conjunto” se pueden utilizar de manera intercambiable y se refieren a un clasificador que consiste en muchos clasificadores elementales más simples, por ejemplo, un conjunto de árboles de decisión es un clasificador que consiste en árboles de decisión. El resultado del clasificador de conjunto se obtiene combinando todos los resultados de sus clasificadores constituyentes, por ejemplo, por votación de la mayoría que sopesa todos los clasificadores constituyentes por igual. La votación de la mayoría es especialmente razonable cuando los clasificadores constituyentes se sopesan entonces naturalmente por la frecuencia con la que se generan.

El término “epítopo” quiere referirse a esa porción de un antígeno con la capacidad de unirse a un anticuerpo que también puede ser reconocido por ese anticuerpo. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas.

Los términos “característica” y “variable” se pueden utilizar de manera intercambiable y se refieren al valor de una medida de una característica de una muestra. Estas mediciones se pueden derivar de características físicas, químicas o biológicas de la muestra. Ejemplos de las mediciones incluyen pero no se limitan a un pico de espectro de masas, una señal de espectro de masas, una función de la intensidad de un ROL.

Los cálculos de la homología o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se utilizan de manera intercambiable en el presente documento) se realizan de la siguiente manera.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y se pueden ignorar las secuencias no homólogas para los fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es al menos un 30%, preferentemente al menos un 40%, más preferentemente al menos un 50%, incluso más preferentemente al menos un 60%, e incluso más preferentemente al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de la longitud de la secuencia de restos de aminoácidos de referencia que se alinean. Entonces se comparan los restos de aminoácidos

o nucleótidos con las posiciones de aminoácidos o nucleótidos correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido en la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en el presente documento “identidad” de aminoácidos o ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácidos o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función el número de posiciones idénticas compartidas por las dos secuencias, tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede conseguir utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando o una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de huecos de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o

6. En otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando un NWSgapdna. La matriz CMP y un peso de huecos de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Se debería aplicar un grupo particularmente preferido de parámetros (y el que se debería utilizar si el médico no sabe sobre qué parámetros se deberían aplicar para determinar si una molécula está en una limitación de identidad u homología de la secuencia de la invención) utilizan una matriz de puntuación Blossum 62 con una falta de hueco abierto de 12, una falta de hueco extendido de 4, y una falta de hueco de desplazamiento de lectura de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o ácido nucleico se pueden determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos de peso PAM 120, una falta de longitud de huecos de 12, y una falta de huecos de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteínas que se describen en el presente documento se pueden utilizar como una “secuencia de consulta” para llevar a cabo una búsqueda en las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990). Las

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El término “matriz” se refiere a una molécula que absorbe energía como fotones a partir de una fuente de luz apropiada, por ejemplo un UV/Vis o láser IR, en un espectrómetro de masas haciendo posible e esta manera la desorción de una biomolécula a partir de una superficie. Se utilizan frecuentemente derivados del ácido cinámico que incluyen el ácido -ciano cinámico, ácido sinapínico y ácido dihidroxibenzoico como moléculas que absorben energía en la desorción láser de biomoléculas. Las moléculas que absorben energía se describen en la Patente de EE. UU. Nº 5.719.060.

El término “normalización” y sus derivados, cuando se utilizan en conjunción con espectros de masas, se refiere a métodos matemáticos que se aplican a un grupo de espectros de masas para eliminar o minimizar las diferencias, debido primariamente a los parámetros del aparato, en las intensidades totales de los espectros.

El término “región de interés” o “ROI” se refiere a una adaptación estadística de un sujeto de un espectro de masas. Un ROI tiene una longitud mínima fija de señales consecutivas. Las señales consecutivas pueden contener huecos de longitud máxima fija dependiendo de cómo se elige el ROI. Las regiones de interés se refieren a los biomarcadores y pueden servir como sustitutos de los biomarcadores. Las regiones de interés pueden determinarse más tarde para representar una proteína, polipéptido, antígeno, anticuerpo, lípido, hormona, carbohidrato, etc.

La frase “Curva de Características Operativas del Receptor” o “curva ROC” se refiere a, en su aplicación más simple, un gráfico de la actuación de una característica particular (por ejemplo, un biomarcador o parámetro biométrico) para distinguir entre dos poblaciones (por ejemplo, casos (es decir, los sujetos que padecen un cáncer de pulmón) y los controles (es decir, lo sujetos que son normales o tienen cáncer de pulmón benigno)). Los datos de característica a través de la población entera (es decir, los casos y controles), se ordenan en orden ascendente basándose en el valor de una única característica. Entonces, para cada valor de cada característica, se calculan las tasas de falsos positivos y falsos negativos de los datos. Se determina la tasa de positivos verdaderos por recuento del número de casos por encima del valor de cada característica que se considera y entonces se divide por el número total de casos. La tasa de falsos positivos se determina por recuento del número de controles por encima del valor de esa característica que se considera y luego dividiendo por el número total de controles. Aunque esta definición describe un escenario en el que una característica está elevada en casos en comparación con los controles, esta definición también engloba un escenario en el que una característica se suprime en los casos en comparación con los controles. En este escenario, se contarían las muestras por debajo del valor para la característica que se considera.

Las curvas ROC se pueden generar para una característica única así como para otros resultados únicos, por ejemplo, una combinación de dos o más características se combinan entre ellas matemáticamente (tales como, sumándolas, restándolas, multiplicándolas, etc.) para proporcionar un único valor de la suma, este único valor de la suma se puede representar en una curva ROC. Además, se puede representar cualquier combinación de múltiples características, de manera que la combinación dé lugar a un único valor de resultado. Estas combinaciones de características pueden comprender un ensayo. La curva ROC es la representación de la tasa de positivos verdaderos (sensibilidad) de un ensayo respecto a la tasa de falsos positivos (1-especificidad) del ensayo. El área bajo la curva ROC es una figura de cualidad para la característica de una determinada población de muestras y da valores que varían desde 1 para un ensayo perfecto y 0,5 en el que el ensayo da una respuesta completamente aleatoria en la clasificación de los sujetos de ensayo. Las curvas ROC proporcionan otros medios para explorar rápidamente un grupo de datos. Las características que parecen ser diagnósticas se pueden utilizar preferentemente para reducir el tamaños de grandes espacios característicos.

El término “selección” se refiere a una decisión diagnóstica con respecto a la disposición del paciente hacia el cáncer de pulmón. Un paciente se determina que está en riesgo de un cáncer de pulmón con un “ensayo de selección” positivo. Como resultado, el paciente puede someterse a ensayos adicionales, por ejemplo, por imagen, análisis del esputo, ensayos funcionales del pulmón, broncoscopia y/o procedimientos de biopsia y se hace un diagnóstico final.

El término “señal” se refiere a cualquier respuesta que se genera por una biomolécula bajo investigación. Por ejemplo, el término señal se refiere a la respuesta generada por una biomolécula que golpea el detector de un espectrómetro de masas. La intensidad de la señal se correlaciona con la cantidad o concentración de la biomolécula. La señal se define por dos valores: un valor aparente de la masa molecular y un valor de intensidad generado como se ha descrito. El valor de masa es una característica elemental de la biomolécula, mientras que el valor de la intensidad concuerda con una cierta cantidad o concentración de la biomolécula con el valor de masa molecular aparente correspondiente. Por lo tanto, la “señal” siempre se refiere a las propiedades de la biomolécula.

La frase “Método de división y puntuación” se refiere a un método adaptado de Mor et al., PNAS, 102(21):7677-7682 (2005). En este método, se toman múltiples mediciones de todas las muestras. Se determina un valor de corte de cada medición. Este valor de corte se puede fijar para maximizar la precisión de las clasificaciones correctas entre los grupos de interés (por ejemplo, enfermo y no enfermo) o se puede fijar para maximizar la sensibilidad o especificidad de un grupo. Para cada medición, se determina si el grupo de interés, por ejemplo, enfermo, está por encima o por debajo del valor de corte. Para cada medición, se asigna una puntuación para la muestra independientemente de si el valor de las mediciones está en el lado enfermo del valor de corte. Después de tomarse todas las mediciones en una muestra, se suman las puntuaciones para producir una puntuación total para el panel de mediciones. Es normal igualar el peso de todas las mediciones tal que un panel de 10 mediciones puede tener

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POLIPÉPTIDOS DE CICLINA E2

La presente divulgación se refiere a polipéptidos Ciclina E2 inmunorreactivos aislados o purificados o fragmentos biológicamente activos de los mismos que se pueden utilizar como inmunógenos o antígenos para dar lugar o ensayar (o más generalmente, para unirse) anticuerpos que se pueden utilizar en los métodos que se describen en el presente documento. Los polipéptidos Ciclina E2 inmunorreactivos de la presente invención se pueden aislar de fuentes celulares o tisulares utilizando técnicas de aislamiento de proteínas de referencia. DE manera alternativa, los polipéptidos Ciclina E2 inmunorreactivos aislados o purificados y los fragmentos biológicamente activos de los mismos se pueden producir por técnicas de ADN recombinante o se sintetizan químicamente. Los polipéptidos Ciclina E2 inmunorreactivos aislados o purificados de la presente invención tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de una forma de ADNc expresado de la Ciclina E2 humana (Registro Genbank BC007015.1). La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de 38 aminoácidos que comprende el extremo C de BC007015.1 más un aminoácido (cisteína) y que también se designa en el presente documento como “B2-1”. La SEQ ID NO: 4 es de 37 aminoácidos de longitud y es idéntica a la SEQ ID NO: 3 excepto que la SEQ ID NO: 4 no contiene, en su extremo amino, la cisteína muy primera de la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de 19 aminoácidos que comprende el extremo C de BC007015.1 y que se le designa como “E2-2”. Como se describe con más detalle en los Ejemplos, se comparó la inmunorreactividad de la SEQ ID NO: 1 con la inmunorreactividad de la SEQ ID NO:

2. La secuencia SEQ ID NO: 2 es otra forma de ADNc que se expresa de ciclina E2 humana (Registro Genbank BC020729.1). Se descubrió que la SEQ ID NO: 1 mostraba una fuerte inmunorreactividad con varios grupos de muestras de cáncer y mostraba mucha menos reactividad con grupos benignos y normales (no cancerosos). Por el contrario, la SEQ ID NO: 2 mostraba poca reactividad con cualquier grupo de muestras de cáncer o no cancerosas. Se determinó la inmunorreactividad de la SEQ ID NO: 1 ser el resultado de los 37 primeros aminoácidos presentes en el extremo C de la SEQ ID NO: 1 que no está presente en la SEQ ID NO: 2. Las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 o cualquier combinación de estas secuencias (tales como, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, anticuerpos generados contra la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 (a todos los que se designa en el presente documento como "anti-Ciclina E2")) se pueden utilizar en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, tales anticuerpos se pueden someter a los anticuerpos generados contra cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 o cualquier combinación de estas secuencias. Tales anticuerpos se pueden incluir en uno o más kits para su uso en los métodos de la presente invención descrita en el presente documento.

La presente divulgación también engloba polipéptidos que se diferencian de los polipéptidos descritos en el presente documento (a saber, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5) por una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Adicionalmente, la presente invención también engloba polipéptidos que tienen una similitud de secuencia total (identidad) u homología de al menos el 60%, preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más, con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

USO DE BIOMARCADORES Y PARÁMETROS BIOMÉTRICOS PARA DETECTAR LA PRESENCIA O RIESGO DE CÁNCER DE PULMÓN

En otra realización, la presente invención se refiere a métodos que ayudan eficazmente a la diferenciación entre sujetos normales y con cáncer o que están en riesgo de desarrollar una afección médica. La afección médica preferentemente es el cáncer, incluso más preferentemente el cáncer de pulmón. Los sujetos normales se considera que son los que no han sido diagnosticados con cualquier afección médica, tal como el cáncer, más preferentemente los que no han sido diagnosticados de cáncer de pulmón.

La presente divulgación proporciona ventajosamente métodos rápidos, sensibles y fáciles de utilizar para ayudar al di agnóstico de una afección médica, preferentemente, el cáncer, e incluso más preferentemente, cáncer de pulmón. Además, la presente divulgación se puede utilizar para identificar individuos en riesgo de desarrollar una condición médica, para seleccionar sujetos con riesgo de una condición médica y para controlar pacientes diagnosticados de o que se están tratando para una afección médica. La divulgación se puede utilizar para controlar la eficacia del tratamiento de un paciente que se está tratando para una afección médica. Preferentemente, la afección médica es un cáncer e incluso más preferentemente, el cáncer de pulmón. Como se utiliza en toda la presente identificación, particularmente en conexión con los métodos descritos en el presente documento, los sujetos que tienen una afección médica de interés (tal como los sujetos que tienen un cáncer de pulmón) se considera que son las mismas que las de los sujetos que tienen un riesgo de una afección médica de interés (tal como los sujetos que tienen alto riesgo de cáncer de pulmón).

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coeficientes de correlación unas con otras) con otras ciertas regiones de interés y por lo tanto son capaces de sustituirse unas por otras en el contexto de la presente invención, Específicamente, estas regiones de interés altamente correlacionadas se han unido en ciertas familias o “grupos” de correlación. La región de interés que están contenidas en estos “grupos” se pueden sustituir por otra en los métodos y kits de la presente invención. Estas familias o “grupos” de correlación de regiones de interés se describen a continuación:

Grupo A: Las regiones de interés: Pub3448 y Pub3493. Grupo B: Las regiones de interés: Pub4487 y Pub4682. Grupo C: Las regiones de interés: Pub8766, Pub8930, Pub9142, Pub9216, Pub9363, Pub9433, Pub9495, Pub9648 y Pub9722. Grupo D: Las regiones de interés: Pub5036, Pub5139, Pub5264, Pub5357, Pub5483, Pub5573, Pub5593, Pub5615, Pub6702, Pub6718, Pub10759, Pub11066, Pub12193, Pub 13412, Acn10679 y Acn1877. Grupo E: Las regiones de interés: Pub6391, Pub6533, Pub6587, Pub6798, Pub9317 y Pub13571. Grupo F: Las regiones de interés: Pub7218, Pub7255, Pub7317, Pub7413, Pub7499, Pub7711, Pub14430 y Pub15599. Grupo G: Las regiones de interés: Pub8496, Pub8546, Pub8606, Pub8662, Pub8734, Pub17121 y Pub17338. Grupo H: Las regiones de interés: Pub6249, Pub12501 y Pub12717. Grupo I: Las regiones de interés: Pub5662, Pub5777, Pub5898, Pub11597 y Acn11559. Grupo J: Las regiones de interés: Pub7775, Pub7944, Pub7980, Pub8002 y Pub15895. Grupo K: Las regiones de interés: Pub17858, Pub18422, Pub18766 y Pub18986. Grupo L: Las regiones de interés: Pub3018, Pub3640, Pub3658, Pub3682, Pub3705, Pub3839, Hic2451, Hic2646, Hic3035, Tfa3016, Tfa3635 y Tfa4321. Grupo M: Las regiones de interés: Pub2331 y Tfa2331. Grupo N: Las regiones de interés: Pub4557 y Pub4592. Grupo O: Las regiones de interés: Ace4631, Acn5082, Ace5262, Acn5355, Acn5449 y Acn5455. Grupo P: Las regiones de interés: Acn6399, Acn6592, Acn8871, Acn9080, Acn9371 y Acn9662. Grupo Q: Las regiones de interés: Acn9459 y Acn9471. Grupo R: Las regiones de interés: Hic2506, Hic2980, Hic3176 y Tfa2984. Grupo S: Las regiones de interés: Hic2728 y Hit3276. Grupo T: Las regiones de interés: Hic6381, Hic6387, Hic6450, Hic6649, Hic6816 y Hic6823. Grupo U: Las regiones de interés: Hic8791 y Hic8897. Grupo V: Las regiones de interés Tfa6453 y Tfa6652. Grupo W: Las regiones de interés: Hic6005 y Hic5376. Grupo X: Las regiones de interés: Pub4713, Pub4750 y Pub4861.

Los paneles preferidos que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención, incluyen, pero no se limitan

a:

1.: Un panel que comprende al menos dos biomarcadores, donde dichos biomarcadores son al menos un anticuerpo y al menos un antígeno. Este panel puede además comprender biomarcadores adicionales tales como al menos una región de interés.

2.: Un panel que comprende al menos un biomarcador, donde dicho biomarcador comprende anti-Ciclina E2. Adicionalmente, el panel puede también comprender opcionalmente biomarcadores adicionales, tales como, (a) al menos un antígeno; (b) al menos un anticuerpo, (c ) al menos un antígeno y al menos un anticuerpo; (d) al menos una región de interés; (e) al menos un antígeno y al menos una región de interés; (f) al menos un anticuerpo y al menos una región de interés; o (g) al menos un antígeno, al menos un anticuerpo y al menos una región de interés.

3.: Un panel que comprende al menos un biomarcador, donde el biomarcador se selecciona de entre el grupo que consiste en citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA 125, SCC, CA 19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-anti-tripsina y apolipoproteína CIII. El panel puede comprender opcionalmente además biomarcadores adicionales, tales como, al menos un anticuerpo, al menos una región de interés y al menos una región de interés y al menos un anticuerpo de la muestra de ensayo.

4.: Un panel que comprende al menos un biomarcador, donde el biomarcador es al menos una región de interés que se selecciona de entre el grupo que consiste en: Acn6399, Acn9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Pub6453, Pub2951, Pub2433, Pub17338, TFA6453 y HIC3959. El panel puede opcionalmente comprender además biomarcadores adicionales, tales como, al menos un antígeno, al menos un anticuerpo y al menos un antígeno y al menos un anticuerpo de la muestra de ensayo.

5.: Un panel que comprende al menos un biomarcador en un panel, donde el al menos un biomarcador se selecciona de entre el grupo que consiste en: citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA 125, SCC, CA 19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-anti-tripsina y apolipoproteína CIII, Acn6399, Acn9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Pub6453, Pub2951, Pub2433, Pub17338, TFA6453 y HIC3959.El panel puede también opcionalmente comprender además biomarcadores adicionales tales como al menos un anticuerpo. Los paneles preferidos son paneles que comprenden: (a) citoqueratina 19, CEA, ACN9459, Pub11597, Pub4789 y TFA2759; (b) citoqueratina 19, CEA, ACN9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759 and TFA9133; (c) citoqueratina 19, CA 19-9, CEA, CA 15-3, CA125, SCC, citoqueratina 18 and ProGRP; (d) Pub11597, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Tfa6453 y

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Hic3959; y (e) citoqueratina 19, CEA, CA125, SCC, citoqueratina 18, ProGRP, ACN9459, Pub 115R7, Pub4789, TFA2759, TFA9133.

6. Un panel que comprende al menos dos biomarcadores en un panel, donde los al menos dos biomarcadores se seleccionan de entre el grupo que consiste en: anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAPK3, uno o más anticuerpos contra la Ciclina E2 inmunorreactiva, citoqueratina 19, CEA, CA 125 y ProGRP. El panel puede comprender también tres biomarcadores que se seleccionan de entre el grupo anterior, al menos cuatro biomarcadores que se seleccionan de entre el grupo anterior, al menos cinco biomarcadores que se seleccionan de entre el grupo anterior, al menos seis biomarcadores que se seleccionan de entre el grupo anterior, al menos siete biomarcadores que se seleccionan de entre el grupo anterior, los ocho biomarcadores que se han descrito anteriormente (a saber, cada uno de anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAPK3, uno o más anticuerpos contra la Ciclina E2 inmunorreactiva, citoqueratina 19, CEA, CA 125 y ProGRP). Preferentemente, el panel comprende los ocho biomarcadores descritos anteriormente.

La presencia y cantidad de uno o más biomarcadores en la muestra de ensayo se puede obtener y cuantificar utilizando técnicas de rutina conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para cuantificar antígenos o anticuerpos en muestras de ensayo son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la presencia y cuantificación de uno o más antígenos o anticuerpos en una muestra de ensayo se pueden determinar utilizando uno o más inmunoensayos que se conocen en la técnica. Los inmunoensayos comprenden típicamente:

(a) proporcionar un anticuerpo (o antígeno) que se une específicamente a un biomarcador (a saber, un antígeno o un anticuerpo); (b) poner en contacto una muestra de ensayo con el anticuerpo o antígeno; y (c) detectar la presencia de un complejo del anticuerpo unido al antígeno en la muestra de ensayo o un complejo del antígeno unido al anticuerpo en la muestra de ensayo.

Para preparar un anticuerpo que se una específicamente a un antígeno, se pueden utilizar antígenos purificados o sus secuencias de ácido nucleico. El ácido nucleico o las secuencias de aminoácidos se pueden obtener para posteriores caracterizaciones de estos antígenos. Por ejemplo, los antígenos pueden ser péptidos mapeados con varias enzimas (por ejemplo, tripsina, proteasa V8, etc.). Los pesos moleculares de los fragmentos de la digestión para cada antígeno se pueden utilizar para buscar en las bases de datos, tales como la base de datos SwissProt, secuencias que coincidirán con los pesos moleculares de los fragmentos de digestión generados por varias enzimas. Utilizando este método, se puede identificar el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de otros antígenos si estos antígenos son proteínas conocidas en las bases de datos.

De manera alternativa, las proteínas se pueden secuenciar utilizando la secuenciación proteica en escalera, por ejemplo, fragmentando las moléculas y sometiendo los fragmentos a la digestión enzimática u otros métodos que retiran un único aminoácido secuencialmente del extremo del fragmento. Los métodos para la preparación de escaleras proteicas se describen por ejemplo en la Publicación Internacional WO 93/24834 y la Patente de EE. UU. Nº 5.792.664. La escalera se analiza luego por espectrometría de masas. La diferencia entre las masas de los fragmentos en escalera identifican el aminoácido retirado del extremo de la molécula.

Si los antígenos no son proteínas conocidas en la base de datos, el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos se pueden determinar por conocimiento de incluso una parte de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Por ejemplo, se pueden hacer sondas de degeneración basándose en la secuencia de aminoácidos del extremo amino N del antígeno. Estas sondas se pueden utilizar entonces explorar un biblioteca genómica o de ADNc que se crea a partir de una muestra de la que se detectó inicialmente un antígeno. Los clones positivos se pueden identificar, amplificar, y sus secuencias de ADN recombinante se pueden subclonar utilizando técnicas que son bien conocidas. Véase por ejemplo, Current Protocols for Molecular Biology (Ausubel et al., Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, NY 1989).

Utilizando los antígenos purificados o su secuencias de ácido nucleico, se pueden preparar los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno utilizando cualquiera de los métodos adecuados que se conocen en la técnica (véase, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed. 1986); y Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)). Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a estas, preparación de anticuerpos por selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, así como la preparación de anticuerpo policlonales o monoclonales inmunizando conejos o ratones (véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)).

Después de que se proporciona el anticuerpo, se puede detectar y/o cuantificar un antígeno utilizando cualquiera de los ensayos inmunológicos de unión bien reconocidos (véase por ejemplo, las Patentes de EE. UU. números

4.366.241. 4.376.110. 4.517.288. y 4.837.168). Los ensayos que se pueden utilizar en la presente invención incluye, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), que se conoce también como “ensayo sándwich”, un inmunoensayo enzimático (EIA), un radioinmunoensayo (RIA), y fluoroinmunoensayo (FIA), un inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), un inmunoensayo de recuento (CIA), un inmunoensayo enzimático con medio de filtro (MEIA), un ensayo de inmunoabsorción ligado a fluorescencia (FLISA), inmunoensayos de aglutinación e inmunoensayos fluorescentes múltiplex (tales como el Luminex™ LabMAP), etc. Para una revisión de

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que los inmunoensayos descritos anteriormente, excepto por el hecho de que se invierten los papeles de los anticuerpos y antígenos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un tipo de inmunoensayo que es un ensayo con perlas de autoanticuerpos. En este ensayo, un antígeno, tal como el antígeno p53 disponible comercialmente (que se puede adquirir en BioMol International L.P., Plymouth Landing, Pennsylvania), se puede fijar en un soporte sólido, por ejemplo, una perla, una microplaca de plástico, un portaobjetos o cubreobjetos de microscopio o una membrana hecha de un material tal como la nitrocelulosa que se une a los antígenos proteicos, utilizando técnicas de rutina que se conocen en la técnica o utilizando técnicas y métodos descritos en el Ejemplo 3 en el presente documento. DE manera alternativa, si un antígeno no está disponible comercialmente, entonces el antígeno puede purificarse de líneas celulares cancerosas (preferentemente, líneas celulares de cáncer de pulmón) o los tejidos cancerosos propios de un sujeto (preferiblemente tejidos de cáncer de pulmón) (véase, S-H Hong, et al., Cancer Research 64: 5504-5510 (2004)) o se expresa a partir de un clon ADNc (véase, Y-L Lee, et al., Clin. Chim. Acta 349: 87-96 (2004)). Se pone entonces en contacto la perla que contiene el antígeno con la muestra de ensayo. Después de incubar la muestra de ensayo con la perla que contienen el antígeno unido, se lava la perla y se detecta cualquier complejo formado. Esta detección se puede llevar a cabo como se ha descrito anteriormente, a saber, incubando la perla lavada con un reactivo de detección. Este reactivo de detección puede ser por ejemplo, un segundo anticuerpo (tal como, pero sin limitarse a, inmunoglobulina G anti-humana (IgG), inmunoglobulina A anti-humana (IgA), inmunoglobulina M anti-humana (IgM), que está marcada con un marcador detectable. Después de la detección, se puede determinar la cantidad del complejo antígeno-anticuerpo comparando la señal con la generada por una referencia, como se ha descrito anteriormente. De manera alternativa, el complejo antígeno-anticuerpo se puede detectar aprovechando la naturaleza multivalente de las inmunoglobulinas. En vez de hacer reaccionar el complejo antígeno-anticuerpo con un anticuerpo anti-humano, el complejo antígeno anticuerpo se puede exponer a un antígeno soluble que está marcado con un marcador detectable que contiene el mismo epítopo que el antígeno adjuntado a la fase sólida. Cualquiera de los sitios de unión del anticuerpo sin ocupar se unirá al antígeno soluble (que está marcado con un marcador detectable). Tras el lavado, se detecta el marcador detectable utilizando técnicas de rutina que se conocen por los expertos en la técnica. Cualquiera de los métodos que se han descrito anteriormente permiten la cuantificación de la sensibilidad y la especificidad de un anticuerpo específico en la muestra de ensayo. El AUC del anticuerpo (y por tanto, la utilidad del anticuerpo, tal como un autoanticuerpo, para detectar el cáncer de pulmón en un sujeto) se puede entonces calcular utilizando técnicas de rutina conocidas para los expertos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, análisis ROC. De manera alternativa se puede calcular el DFI. Se el AUC es mayor que aproximadamente 0,5 o el DFI es menor de aproximadamente 0,5, el inmunoensayo se puede utilizar para discriminar entre sujetos enfermos o con riesgo de enfermedad (tal como cáncer, preferentemente, cáncer de pulmón) de sujetos normales (o benignos).

La presencia y cantidad de regiones de interés se puede determinar utilizando técnicas de espectrometría de masas. Utilizando espectrometría de masas, los solicitantes han encontrado 212 regiones de interés que son útiles como ayuda al diagnóstico y detección de cáncer de pulmón en muestras de ensayo. Específicamente, cuando se utilizan técnicas de espectrometría de masas para detectar y cuantificar uno o más biomarcadores en una muestra de ensayo, la muestra de ensayo se tienen que preparar primero para el análisis de espectrometría de masas. La preparación de la muestra puede tener lugar de varias maneras, pero la que se utiliza más comúnmente implica poner en contacto la muestra con uno o más adsorbentes unidos a una fase sólida. Los adsorbentes pueden ser grupos aniónicos o catiónicos, grupos hidrófobos, grupos quelantes metálicos con o sin un ligando metálico, anticuerpos, sean policlonales o monoclonales, o antígenos adecuados para unirse a sus anticuerpos afines. La fase sólida puede ser una superficie plana fabricada en metal, cristal, o plástico. La fase sólida también puede ser de naturaleza microparticulada, sean microperlas, particulados amorfos, o polímeros insolubles para aumentar el área de superficie. Además, los materiales microparticulados pueden ser magnéticos para el caso de manipulación. Los biomarcadores de interés se absorben en la fase sólida y las moléculas restantes se eliminan por lavado. Por análisis de masas, los biomarcadores de interés se eluyen de la fase sólida con un disolvente que reduce la afinidad del biomarcador por el adsorbente. Los biomarcadores se introducen luego en el espectrómetro de masas para su análisis. Preferentemente, los espectros periféricos se identifican y se omiten en la evaluación del espectro. Adicionalmente, se pueden utilizar también inmunoensayos tales como los que se han descrito anteriormente. Con la terminación de un inmunoensayo, el analito se puede eluir de la superficie inmunológica y se introduce en el espectrofotómetro para su análisis.

Una vez que se ha preparado la muestra de ensayo, se introduce en el analizador de masas. La desorción ionización por láser (por ejemplo, MALDI o SELDI) es una técnica común para las muestras que se presentan en forma sólida. En esta técnica,, la muestra se co-cristaliza en una placa diana con una matriz eficaz para absorber y transferir la energía del láser a la muestra. Los iones se separan, se cuentan, y se calibran contra los iones de masa y carga conocida. Los datos de masa recolectados por cualquier muestra es un recuento iónico con una relación específica de masa/carga (m/z). Se anticipa que diferentes métodos de preparación de la muestra y diferentes técnicas de ionización darán como resultado diferentes espectros.

Los ensayos de cualificación para los datos del espectro de masas típicamente implica un proceso rigurosos de análisis periférico con un mínimo pre-procesamiento de los datos originales. El proceso de identificar periféricos comienza con el cálculo de la corriente iónica total (TIC) del espectro bruto. No se aplican algoritmos de suavización

o corrección de la línea base a los espectros brutos antes del cálculo de la TIC. La TIC se calcula sumando la intensidades de cada valor m/z a través del intervalo de masa (m/z) detectado. Esto muestra los fallos del

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instrumento, los problemas de moteado de la muestra, y otros defectos similares. Además de la TIC, se calcula el %CV medio (porcentaje del coeficiente de variación) a lo largo del espectro completo para cada muestra. Utilizando el número de mediciones replicadas para cada muestra, se calcula un %CV para cada valor m/z a lo largo del intervalo de masa detectado. Estos %CV se promedian juntos para obtener un %CV medio que es representativo para esa muestra en particular. El %CV medio puede o no utilizarse como una primera etapa de filtrado para identificar periféricos. En general, los replicados con altos %CV medios (mayores del 30% o cualquier otro valor aceptable) indica baja reproductibilidad.

Como se ha descrito anteriormente, la TIC calculada y el %CV medio de cada espectro se podría utilizar como predictores para cualificar la reproductibilidad y la “bondad” de los espectros. Sin embargo, mientras estas mediciones proporcionan un buen descriptor para la propiedad en masa del espectro, no dan ninguna información sobre la reproductibilidad de las características destacadas de los espectros tales como las intensidades individuales en cada valor m/z. Este obstáculo se supera por una adaptación de los cálculos del Ángulo de Contraste Espectral (SCA) comunicados por Wan et. al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2002, 13, 85-88). En los cálculos del SCA, todo el espectro se trata como un vector cuyos componentes son los valores individuales de m/z. Con esta interpretación, el ángulo theta (p) entre los dos vectores se da por la fórmula matemática de referencia

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Theta será pequeño, cerca de cero, para espectros similares.

En la práctica, el número total de cálculos y comparaciones se reducen calculando primero un espectro medio para cada replicado de muestra o para todas las muestras en un grupo en particular (por ejemplo, cánceres). Luego se calcula un SCA entre cada espectro y el espectro medio calculado. Los espectros que difieren drásticamente del espectro medio se consideran periféricos, siempre que, cumplan los criterios que se describen posteriormente.

El uso de más de un predictor para seleccionar periféricos es preferible porque un predictor no es suficiente para describir completamente un espectro de masa. Se puede llevar a cabo un análisis de periféricos multivariado utilizando múltiples predictores. Estos predictores podían ser, pero no se limitan a, la TIC, el %CV medio, y SCA. Utilizando el paquete estadístico JMP™ (SAS Institute Inc., Cary, NC), se calculan las distancias Mahalanobis para cada medición de cada replicado en el grupo (por ejemplo, cáncer). Un valor crítico (no un límite de confianza) se puede calcular tal que aproximadamente el 95% de las observaciones caigan por debajo de este valor. El 5% restante que cae por encima del valor crítico se consideran periféricos y se descartan para análisis posteriores.

Tras la cualificación de los datos de masa espectral, los espectros habitualmente se normalizan, se escalan las intensidades de forma que la TIC sea la misma para todos los espectros del grupo de datos o se escalan las intensidades con respecto a un pico en todos los espectros.

Tras la normalización, los espectros de masas se reducen a un grupo de características de intensidad. En otras aplicaciones, estos se reducen a una lista de intensidades espectrales a valores m/z asociados con las biomoléculas. Preferentemente, se utiliza otro tipo de característica, la región de interés o ROI.

Las regiones de interés son productos de una comparación entre dos o más grupos de datos de interés. Estos grupos de datos representan los grupos de interés (por ejemplo, enfermedad y no enfermedad). Se lleva a cabo un ttest de los valores de intensidad a través de todas las muestras por cada m/z. Se identifican estos valores m/z con valores de p del t-test menores de un umbral especificado para un operador. De los valores m/z identificados, los contiguos se agrupan juntos y se definen como una región de interés. El número mínimo de valores m/z contiguos necesarios para formar una ROI y cualquier hueco permitido en ese grupo contiguo, se pueden definir por el usuario. Otro calificador para la ROI es el valor absoluto del logaritmo de la relación de las medias de los dos grupos. Cuando este valor es mayor que un valor de corte del umbral, digamos 0,6 cuando se utilizan logaritmos de base 10, la localización de masa a carga se convierte en un candidato de inclusión en una ROI. La ventaja de utilizar el método ROI es que no solo marca diferencias en el patrón de altas intensidades entre los espectros de las dos clases sino que encuentra más diferencias sutiles como hombros e intensidades muy bajas que se perderían por los métodos de encontrar picos.

Una vez que se ha determinado la región de interés, la media o valor m/z medio del intervalo de la ROI a menudo se utiliza como in identificador de la región. Cada región es un marcador potencial que diferencia los grupos de datos. Se pueden extraer una variedad de parámetros (por ejemplo, intensidad total, intensidad máxima, intensidad media,

o promedio e intensidad) de los datos de la muestra y asociarse con la ROI. Por lo tanto, cada espectro de una muestra se ha reducido desde muchos cientos de m/z, pares de intensidad para 212 ROI y su identificador, pares de función de intensidad. Estos descriptores se utilizan como variables de aportación para las técnicas de análisis de datos.

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Opcionalmente, sea antes de la obtención de una muestra de ensayo o tras obtener la muestra de ensayo y antes de identificar y cuantificar uno o más biomarcadores en una muestra de ensayo o tras identificar y cuantificar uno o más biomarcadores en una muestra de ensayo, los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de obtención de un valor para al menos un parámetro biométrico de un sujeto. Por ejemplo, se pueden obtener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., factores biométricos de un sujeto. El parámetro biométrico preferido que se obtiene de un sujeto es la historia de fumador del sujeto, específicamente, los paquetes-años de fumador del sujeto. Otros parámetros biométricos que se pueden obtener del sujeto incluyen, pero sin limitarse a estos, la edad, exposición a carcinógenos, género, historia familiar de fumadores, etc.

Como se ha mencionado anteriormente. En los métodos de la presente invención, la muestra de ensayo se analiza para determinar la presencia de uno o más biomarcadores contenidos en el panel. Si se determina que está presente un biomarcador en la muestra de ensayo, entonces se cuantifica la cantidad de cada tal biomarcador detectado (utilizando las técnicas descritas previamente en el presente documento). Una vez que la cantidad de cada biomarcador de la muestra de ensayo se cuantifica, entonces se compara la cantidad de cada biomarcador cuantificado con un punto de corte predeterminado (que es típicamente, un valor o un número, tal como un entero, y que se designa alternativamente en el presente documento como “punto de corte” o “punto de división”) para eses biomarcador específico. El punto de corte predeterminado que se emplea en los métodos de la presente invención se puede determinar utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica, tales como, pero sin limitarse a estas, análisis multi-variado (véase la Figura 1), regresión logística transformada, un método de división y puntación o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, cuando se utiliza el Método de división y Puntuación, el valor o número del punto de corte predeterminado dependerá del resultado deseado que se va a conseguir. Si el resultado deseado que se va a conseguir es para maximizar la precisión de calcificaciones correctas de cada marcador en un grupo de interés (a saber, identificación correcta de los sujetos en riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón y los que no están en riesgo de desarrollar un cáncer de pulmón), entonces se elegirá un valor o número específico para un punto de corte predeterminado para ese biomarcador basándose en ese resultado deseado. Por el contrario, si el resultado deseado es maximizar la sensibilidad de cada marcador, entonces se debe elegir un valor o número diferente para el punto de corte predeterminado para ese biomarcador basándose en el resultado deseado. De la misma manera, si el resultado deseado es maximizar la especificidad de cada marcador, entonces se puede escoger un valor diferente del punto de corte predeterminado para ese biomarcador basándose en ese resultado deseado. Una vez que se ha cuantificado la cantidad de cualquiera de los biomarcadores presentes en la muestra de ensayo, esta información se puede utilizar para generar curvas ROC, AUC y otra información que se puede utilizar por un experto en la técnica utilizando técnicas de rutina para determinar el punto de corte predeterminado adecuado para cada biomarcador dependiendo del resultado deseado. Después de que la cantidad de cada biomarcador se haya comparado con el punto de corte predeterminado, se le asigna entonces una puntuación (a saber, un número, que puede ser cualquier entero, tal como desde 0 a 100) a cada biomarcador basándose en la comparación. Además, si se obtienen además del uno o más biomarcadores, los valores de uno o más parámetros biométricos para un sujeto, entonces el valor de cada parámetro biométrico se compara con un punto de corte predeterminado para dicho parámetro biométrico. El punto de corte para cualquier parámetro biométrico se puede determinar utilizando las mismas técnicas que se han descrito en el presente documento con respecto a la determinación de puntos de corte predeterminados para uno o más biomarcadores. Como con la comparación de biomarcadores, se asigna entonces una puntuación (a saber, un número, que puede ser un entero, tal como 1 a 100) a ese parámetro biométrico basándose en dicha comparación.

De manera alternativa, en vez de utilizar el método de puntuación descrito anteriormente, se puede utilizar un Método de Puntuación Ponderada. Si se utiliza un Método de Puntuación Ponderada, entonces una vez que se ha cuantificado la cantidad de cada biomarcador en una muestra de ensayo, la cantidad de cada biomarcador detectado en la muestra de ensayo se compara con un número de puntos de corte predeterminados para ese biomarcador específico. A partir de todos los puntos de corte diferentes disponibles, se asigna entonces una única puntuación (a saber, un número, que puede ser cualquier entero, tal como de 0 a 100) a ese biomarcador. Este Método de Puntuación Ponderada también se puede utilizar con uno o más parámetros biométricos.

Una vez que se ha asignado una puntuación para cada uno de los biomarcadores cuantificados, y opcionalmente para cada uno de los parámetros biométricos obtenidos del sujeto, entonces la puntuación para cada biomarcador o cada biomarcador y cada parámetro biométrico se combinan para obtener una puntuación total para el sujeto. Esta puntuación total se compara entonces con una puntuación total predeterminada. Basándose en esta comparación, se puede hacer una determinación de si un sujeto está en riesgo de un cáncer de pulmón o no. La determinación de si un sujeto está o no en riesgo de un cáncer de pulmón se puede basar en si la puntuación es o no más alta o más baja que la puntuación total predeterminada. Por ejemplo, dependiendo del valor asignado respecto a la puntuación total predeterminada, un sujeto con una puntuación total que sea más alta que la puntuación total predeterminada se puede considerar que tiene un riesgo mayor y por lo tanto se puede remitir para ensayos posteriores o procedimientos de seguimiento. La puntuación total predeterminada (designada de manera alternativa en el presente documento como un “umbral”) que se va a utilizar en el método se puede determinar utilizando las mismas técnicas que se han descrito anteriormente con respecto a las puntuaciones predeterminadas para los biomarcadores. Por ejemplo, la Figura 5 proporciona tres curvas ROC. Cada una de estas curvas ROC representa el resultado único de marcadores combinados, sin embargo un único marcador produciría una curva ROC similar. Las curvas ROC abarcan desde baja sensibilidad y la tasa baja de falsos positivos (1-especificidad) en un extremo hasta la

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sensibilidad más alta y la tasa alta de falsos positivos en el otro extremo. La forma de la curva entre estos dos extremos puede variar significativamente. Si se necesitara un método para tener al menos un 90% de sensibilidad, entonces basándose en las curvas ROC que se muestran en la Figura 5, la tasa de falsos positivos sería del 60-70% dependiendo de la curva escogida. Si el método necesitara tener al menos un 10% de tasa de falsos positivos, entonces la sensibilidad sería del 40-55% dependiendo de la curva escogida. Ambos métodos se derivan del mismo panel de marcadores, sin embargo, con el fin de proporcionar la actuación de características clínicas diferentes, el umbral (o puntuación total predeterminada) del panel se ha cambiado. Por medio del cálculo, por debajo de cada punto de la curva ROC está un umbral (o puntuación total predeterminada) que se mueve de un extremo del intervalo de datos al otro extremo del intervalo de datos. Cuando el umbral (o puntuación total predeterminada) está en el extremo alto del intervalo de datos, entonces todas las muestras son negativas y esto produce un punto en la curva ROC con una baja sensibilidad y baja tasa de falsos positivos. A menudo se necesita un método para tener una característica clínica deseada, tal como un nivel mínimo de sensibilidad (es decir, el 90%), un nivel mínimo de especificidad (es decir, un 90%), o ambos. El cambio del umbral (o puntuación total predeterminada) de los marcadores puede ayudar a conseguir las características clínicas deseadas.

Las etapas descritas anteriormente de (a) comparar la cantidad de cada biomarcador de un panel con un punto de corte predeterminado (o varios puntos de corte si se utiliza el Método de Puntuación Ponderada), que asigna un puntuación (o una puntuación de una o varias puntuaciones posibles si se utiliza el Método de Puntuación Ponderada) para cada biomarcador basándose en la comparación, combinando la puntuación asignada a cada parámetro biométrico de un panel para obtener una puntuación total para el sujeto, comparando la puntuación total con una puntuación total predeterminada y determinando si un sujeto tiene riesgo de un cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total con la puntuación predeterminada; o (b) comparar el valor de al menos un parámetro biométrico con un punto de corte predeterminado (o varios puntos de corte predeterminados si se utiliza el Método de Puntuación Ponderada) para cada parámetro biométrico basándose en dicha comparación, comparar la cantidad de cada biomarcador de un panel con un punto de corte predeterminado, asignar una puntuación para cada biomarcador basándose en la comparación, combinar la puntuación asignada para cada parámetro biométrico con la puntuación asignada para cada biomarcador cuantificado para obtener una puntuación total para el sujeto, comparando la puntuación total con una puntuación total predeterminada y determinar si un sujeto tiene un riesgo de cáncer de pulmón basándose en la comparación de la puntuación total con la puntuación predeterminada pueden llevarse a cabo manualmente por una persona, o se pueden llevar a cabo completa o parcialmente con un programa de computadora o algoritmo, junto con el hardware necesario, tal como una entrada, memoria, procesador, pantalla y dispositivos de salida.

Con fines solamente ilustrativos, un ejemplo de cómo se puede llevar a cabo el método de la presente invención se da ahora. En este ejemplo, un paciente se ensaya para determinar la probabilidad del paciente de tener un cáncer de pulmón utilizando un panel que comprende 8 biomarcadores y el Método de División y Puntuación. Los biomarcadores del panel son citoqueratina 19, CEA, CA125, CA15-3, CA19-9, SCC, proGRP y citoqueratina 18. La puntuación total predeterminada (o umbral) para el panel es 3. Después de obtener la muestra de ensayo del paciente, se cuantifica la cantidad de cada uno de los 8 biomarcadores (citoqueratina 19, CEA, CA125, CA15-3, CA19-9, SCC, proGRP y citoqueratina 18) en la muestra del paciente. Para los fines de esta ejemplo, la cantidad determinada de cada uno de los 8 biomarcadores de la muestra de ensayo era: citoqueratina 19: 1,95, CEA: 2,75, CA125: 15,26, CA15-3: 11,92, CA19-9: 9,24, SCC: 1,06, proGRP: 25,29 y citoqueratina 18: 61,13. La cantidad de cada uno de estos biomarcadores se comparan con el correspondiente punto de corte predeterminado (o punto de división). Los puntos de corte de cada uno de los biomarcadores son: citoqueratina 19: 1,89, CEA: 4,82, CA125: 13,65, CA15-3: 13,07, CA19-9: 10,81, SCC: 0,92, proGRP: 14,62 y citoqueratina 18: 57,37. Para cada biomarcador que tiene una cantidad que es mayor de la del correspondiente punto de corte predeterminado (punto de división), se puede dar una puntuación de 1. Para cada biomarcador que tiene una cantidad que es menor o igual que su correspondiente punto de corte predeterminado, se puede dar una puntuación de 0. Por consiguiente, basándose en dicha comparación, se asignaría una puntuación a cada biomarcador como sigue: citoqueratina 19: 1, CEA: 0, CA125: 1, CA15-3: 0, CA19-9: 0, SCC: 1, proGRP: 1, y citoqueratina 18: 1. La puntuación para cada uno de los 8 biomarcadores se combinan entonces matemáticamente (es decir, sumando cada una de las puntuaciones de los biomarcadores juntos) para llegar a una puntuación total del paciente. La puntuación total del paciente es 5 (la puntuación total se calcula como sigue: 1 + 0 + 1 + 0 + 0 + 1 + 1 = 5). La puntuación total del paciente se compara con la puntuación total predeterminada, que es 3. Una puntuación total mayor que la puntuación total predeterminada de 3 indicaría un resultado positivo para el paciente. Una puntuación total menor o igual a 3 indicaría un resultado negativo para el paciente. En este ejemplo, debido a que la puntuación total del paciente es mayor de 3, el pacientes se consideraría que tiene un resultado positivo y por lo tanto se remitiría para posteriores ensayos por una indicación o sospecha de cáncer de pulmón, Por el contrario, si la puntuación total del paciente hubiera sido 2, el paciente se habría considerado que tenía un resultado negativo y no sería remitido para posteriores ensayos.

En un ejemplo más, el panel de 8 biomarcadores descrito anteriormente se utiliza de nuevo, sin embargo, en este ejemplo, se emplea el Método de Puntuación Ponderada. En este ejemplo. La puntuación total predeterminada (o umbral) para el panel es de 11,2 y las cantidades de biomarcadores cuantificados en la muestra de ensayo era la misma que se describe anteriormente. La cantidad de cada uno de los biomarcadores se compara n entonces con 3 puntos de corte predeterminados diferentes para cada uno de los biomarcadores. Por ejemplo, los puntos de corte predeterminados para cada uno de los biomarcadores se proporcionan posteriormente en la Tabla A.

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Tabla A

CEA: Citoqueratina 18 ProGRP CA15-3 CA125 SCC Citoqueratina 19 CEA19-9

Punto de corte predeterminado @ 50% especificidad: 2,02 47,7 11,3 16,9 15,5 0,93 1,2 10,6

Punto de corte predeterminado @ 75% especificidad: 3,3 92,3 18,9 21,8 27 1,3 1,9 21,9

Punto de corte predeterminado @ 90% especificidad: 4,89 143,3 28,5 30,5 38,1 1,98 3,3 45,8

Puntuación por debajo del 50% especificidad: 0 0 0 0 0 0 0 0

Puntuación por encima del 50% especificidad: 2,68 2,6 2,48 1,16 2,68 2,48 4,2 1,1

Puntuación por encima del 75% especificidad: 5,36 5,2 4,96 2,32 5,36 4,96 8,4 2,2

Puntuación por encima del 90% especificidad: 13,4 13 12,4 5,8 13,4 12,4 21 5,5

Por lo tanto, se pueden dar 4 posibles puntuaciones para cada biomarcador. La cantidad de cada biomarcador cuantificado se compara con los puntos de corte predeterminados (puntos de división) que se proporcionan en la Tabla A anterior. Por ejemplo para CEA, como la cantidad de CEA cuantificada en la muestra de ensayo era de 2,74, que cae entre el punto de corte predeterminado de 2,02 para el 50% de especificidad y el 3,3 para el 75% de especificidad de la Tabla A. Por lo tanto, se asigna una puntuación para CEA de 2,68. Estos se repite para el resto de los biomarcadores que se evalúan de manera similar y se asigna a cada uno las siguientes puntuaciones: Citoqueratina 18: 2,6, proGRP: 4,96, CA15-3: 0, CA125: 0, SCC: 2,48, citoqueratina 19: 8,4 and CA19-9: 0. La puntuación de cada uno de los 8 biomarcadores se combinan entonces matemáticamente (es decir, sumando cada una de las puntuaciones de los biomarcadores juntas) para llegar a la puntuación total para el paciente. La puntuación total para el paciente es 21,12 (la puntuación total se calcula de la siguiente manera 2,68 + 2,6 + 4,96 + 0

+ 0 + 2,48 + 8,4 + 0 = 21,12). La puntuación total del paciente se compara con la puntuación total predeterminada que es 11,2. Una puntuación total mayor que la puntuación total predeterminada de 11,2 indicaría un resultado positivo para el paciente. Una puntuación total menor o igual de 11,2 indicaría un resultado negativo para el paciente. En este ejemplo, debido a que la puntuación total del paciente era mayor de 11,2, el paciente se consideraría que tiene un resultado positivo y por lo tanto se remitiría para posteriores ensayos por una indicación o sospecha de cáncer de pulmón.

Además, en otra realización, también se puede utilizar el Método de Puntuación Ponderada descrito en el presente documento para puntuar uno o más marcadores obtenidos del sujeto. Preferentemente, tales marcadores, si son uno

o más biomarcadores, uno o más parámetros biométricos o una combinación de biomarcadores y parámetros biométricos se pueden utilizar como ayuda en el diagnóstico o la evaluación de si un sujeto está en riesgo de desarrollar una afección médica, tal como un cáncer o alguna otra enfermedad. El Método de Puntuación Ponderada se puede utilizar ampliamente en conexión con una afección médica en la que los marcadores se utilizan o se pueden utilizar para valorar si un sujeto está en riesgo de tal afección médica. Tal método comprende las etapas de:

a.: cuantificar en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto, la cantidad de al menos un marcador;

b.: comparar la cantidad de cada marcador cuantificado con varios puntos de corte predeterminados para dicho marcador y asignar una puntuación para cada marcador basándose en dicha comparación; y

Preferentemente, el método comprende las etapas de:

b.: comparar la cantidad de cada marcador cuantificado con varios puntos de corte predeterminados para dicho marcador y asignar una puntuación para cada marcador basándose en dicha comparación;

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DFI

Como se ha tratado anteriormente en el presente documento, los solicitantes han descubierto que la detección y cuantificación de uno o más biomarcadores y parámetros biométricos es útil como una ayuda en el diagnóstico del cáncer de pulmón en un paciente. Además, los solicitantes también han descubierto que el uno o más biomarcadores y las combinaciones del uno o más biomarcadores y uno o más parámetros biométricos que se describen en el presente documento tienen un DFI relacionado con el cáncer de pulmón menor de aproximadamente 0,5, preferentemente menor de aproximadamente 0,4, más preferentemente, menos de aproximadamente 0,3 e incluso más preferentemente, menos de aproximadamente 0,2. Las Tablas 25-29 proporcionan ejemplos de paneles que contienen varios biomarcadores o combinaciones de biomarcadores y parámetros biométricos que muestran un DFI que es menor de aproximadamente 0,5, menos de aproximadamente 0,4, menos de aproximadamente 0,3 y menos de aproximadamente 0,2.

KITS

Uno o más biomarcadores, uno o más de los polipéptidos Ciclina E2 inmunorreactiva, parámetros biométricos o cualquier combinación de los mismos son adecuados para la formación de kits (tal como paneles) para su uso en la realización de los métodos de la presente invención. En un aspecto, el kit puede comprender un péptido que se selecciona de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o combinaciones de las mismas.

En otro aspecto el kit puede combinar anti-Ciclina E2 o cualquier combinación de la misma.

En un aspecto más, el kit puede comprender (a) reactivos que contienen al menos un anticuerpo para cuantificar uno

o más antígenos en la muestra de ensayo, donde dichos antígenos son: citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA125, CA15-3, SCC, CA19-9, proGRP, amiloide sérico A, alfa-1-antitripsina, apolipoproteína CIII y T4; (b) reactivos que contiene uno o más antígenos para cuantificar al menos un anticuerpo en una muestra de ensayo; donde dichos anticuerpos son anti-p53, anti-TMP21, anti-NY-ESO-1, anti-HDJ1, anti-domino -NPC1L1C, anti-TMOD1, anti-CAMK1, anti-RGS1, anti-PACSIN1, anti-RCV1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2; y opcionalmente

(c ) uno o más algoritmos o programas informáticos para llevar a cabo las etapas de combinación y comparación de la cantidad de cada antígeno y anticuerpo cuantificados en la muestra de ensayo con un punto de corte predeterminado (o con varios puntos de corte predeterminados) y asignar una puntuación para cada antígeno y anticuerpo (o una puntuación de una o varias puntuaciones posibles) cuantificados basándose en dicha comparación, combinar la puntuación asignada para cada antígeno y anticuerpo cuantificado para obtener una puntuación total, comparar la puntuación total con una puntuación total predeterminada y utilizando dicha comparación como una ayuda para determinar si un sujeto tiene cáncer de pulmón. De manera alternativa, en lugar de uno o más algoritmos o programas de computadora, se pueden proporcionar una o más instrucciones para que una persona lleve a cabo manualmente las etapas anteriores.

En otro aspecto más, el kit puede contener: (a) reactivos que contienen al menos un anticuerpo para cuantificar uno

o más antígenos en una muestra de ensayo, donde dichos antígenos son citoqueratina 8, citoqueratina 19, citoqueratina 18, CEA, CA125, CA15-3, SCC, CA19-9, proGRP, amiloide sérico A, alpha-1-anti-tripsina, apolipoproteína CIII y T4; (b) reactivos que contienen uno o más antígenos para cuantificar al menos un anticuerpo en una muestra de ensayo; donde dichos anticuerpos son: anti-p53, anti-TMP21, anti-NY-ESO-1, anti-HDJ1, anti-dominio-NPC1L1C, anti-TMOD1, anti-CAMK1, anti-RGS1, anti-PACSIN1, anti-RCV1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2; (c ) reactivos para cuantificar una o más regiones de interés que se seleccionan de entre el grupo que consiste en: ACN9459, Pub11597, Pub4789, TFA2759, TFA9133, Pub3743, Pub8606, Pub4487, Pub4861, Pub6798, Tfa6453 y Hic3959; y opcionalmente, (d) uno o más algoritmos o programas de computadora para llevar a cabo las etapas de combinación y comparación de la cantidad de cada antígeno, anticuerpo y región de interés cuantificados en la muestra de ensayo con un punto de corte predeterminado (o con varios puntos de corte predeterminados) y asignar una puntuación para cada antígeno, anticuerpo y región de interés (o una puntuación de una de varias puntuaciones posibles cuantificados basándose en dicha comparación, combinar la puntuación asignada para cada antígeno, anticuerpo y región de interés cuantificados para obtener una puntuación total, comparar la puntuación total con una puntuación total predeterminada y utilizar dicha comparación como una ayuda para determinar si el sujeto tiene un cáncer de pulmón. De manera alternativa, en lugar de uno o más algoritmos o programas de computadora, se pueden proporcionar una o más instrucciones que una persona lleve a cabo las etapas anteriores manualmente. Los reactivos incluidos en el kit para cuantificar una o más regiones de interés pueden incluir un adsorbente que se una y retenga al menos una región de interés que esté contenida en un panel, soportes sólidos (tales como perlas) para usarse en conexión con dicho adsorbentes, uno o más marcadores detectables, etc. El adsorbente puede ser cualquiera de los muchos adsorbentes que se usan en química analítica e inmunoquímica,

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anteriores. El kit puede contener un anticuerpo para cuantificar cada uno de citoqueratina 19, CEA, CA125 y proGRP, un antígeno para cuantificar cada uno de anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2 o un anticuerpo para cuantificar cada uno de citoqueratina 19, CEA, CA125 y proGRP y un antígeno para cuantificar cada uno de anti-p53, anti-NY-ESO-1, anti-MAPKAPK3 y anti-Ciclina E2.

IDENTIFICACIÓN DE BIOMARCADORES

Los biomarcadores de la invención se pueden aislar, purificar e identificar por técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen técnicas cromatográficas, electroforéticas y de centrifugación. Estas técnicas se tratan en Current Protocols in Protein Science, J. Wiley and Sons, New York, NY, Coligan et al. (Eds) (2002) y Harris, E.L.V., S. Angal in Protein Purification Applications: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY (1990) y otros sitios.

A modo de ejemplo, y sin limitación, se proporcionarán ahora ejemplos de la siguiente invención.

Ejemplos

Las muestras clínicas de suero sanguíneo de los pacientes se recolectaron (Ejemplo 1) y se analizaron por inmunoensayos de marcadores antigénicos (Ejemplo 2), por inmunoensayos de marcadores anticuerpos utilizando perlas (Ejemplo 3) o portaobjetos (Ejemplo 4), y por biomarcadores identificados por espectrometría de masas (Ejemplo 5). Los marcadores identificados se ordenaron y priorizaron utilizando una variedad de algoritmos (Ejemplo 6). Esos marcadores priorizados se combinaron utilizando un método de puntuación (Ejemplo 7) para identificar modelos predictivos (Ejemplo 8) para evaluar la utilidad clínica. Ejemplos del uso de los métodos que ayudan a detectar el cáncer de pulmón en pacientes sospechosos de tener un cáncer de pulmón se ilustra en el Ejemplo 9. Los biomarcadores identificados por espectrometría de masas como regiones de interés se analizaron para determinar su composición e identidad (Ejemplo 10). El Ejemplo 11 es un ejemplo profético que describe cómo se pueden detectar medir los biomarcadores identificados de acuerdo con la presente invención utilizando técnicas de inmunoensayo y técnicas inmunitarias espectrométricas de masas.

Ejemplo 1. Especímenes clínicos

Las muestras clínicas de suero del paciente se recolectaron bajo el protocolo aprobado por la Oficina de Revisión Institucional. Todos los sujetos que contribuyeron con un especimen dieron su consentimiento informado para que se recolectaran los especímenes y se utilicen en este proyecto. Las muestras de suero se extrajeron en un tubo separador de suero y se permitieron coagular durante 15 minutos a temperatura ambiente. El coágulo se centrifugó y la muestra se vertió en alícuotas de 2 ml. A las 24 horas se congelaron las muestras a -80 ºC y se mantuvieron a esa temperatura gasta que se sometieran a otros procesos. Las muestras se descongelaron en el momento inmediatamente antes del análisis. Al recibirlas, las muestras se descongelaron y se volvieron a hacer alícuotas en volúmenes más pequeños por conveniencia y se recongelaron. Las muestras se descongelaron entonces en el momento inmediatamente anterior a los análisis. Por lo tanto, cada muestra del grupo se congeló y descongeló dos veces antes del análisis.

Se recolectaron y analizaron un total de 751 especímenes. El grupo se compuso de 250 biopsias de pacientes confirmados de cáncer de pulmón, 274 biopsias de pacientes confirmados con enfermedad pulmonar benigna, y 227 de sujetos aparentemente normales. Los pacientes con cáncer y benignos se confirmaron en su diagnóstico por una biopsia definitiva. Los sujetos normales no se sometieron a ningún procedimiento diagnóstico definitivo y se valoraron “normales” por falta de una enfermedad maligna manifiesta. Tras este procedimiento diagnóstico definitivo, solo se seleccionaron los pacientes  50 años. Tras esta selección, quedaron 231 cánceres, 182 benignos, y 155 normales. Esta gran cohorte de cáncer, enfermedad pulmonar benigna, y sujetos aparentemente normales se denominará “cohorte grande”. Un subgrupo de la gran cohorte se utilizó para enfocarla en la diferenciación entre enfermedad pulmonar benigna y cáncer de pulmón. Esta cohorte, denominada a partir de ahora “pequeña cohorte” consistía en 138 cánceres, 106 benignos, y 13 sujetos aparentemente normales. Tras retirar la “pequeña cohorte” en la “gran cohorte”, permanecían 107 cánceres, 74 benignos, y 142 sujetos aparentemente normales. Esta cohorte, denominada a partir de ahora denominada “cohorte de validación” es independiente de la pequeña cohorte y se utilizó para validar los modelos predictivos generados. Las muestras clínicas que se prepararon como se ha descrito se utilizaron en los Ejemplos 2-10.

Ejemplo 2. Inmunoensayo de detección de biomarcadores

A. Ensayos Architect™ de Abbott Laboratories (Abbott Park, IL, a partir de aquí "Abbott")

Se adquirieron los kits Architect™ para los siguientes antígenos CEA, CA125, SCC, CA19-9 y CA15-3. Todos los ensayos se ejecutaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de los analitos en las muestras se proporcionaron por el instrumento Architect™. Estas concentraciones se utilizaron para generar los datos AUC que se muestran a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1. Actuación clínica (AUC) de CA125, CEA, CA15-3, CA19-9, y SCC en las pequeña y gran cohortes. El nº obs se refiere al número total de individuos o muestras clínicas de cada grupo.

gran cohorte: pequeña cohorte

Marcador: nº obs AUC nº obs AUC

Ca19-9: 548 0,548 256 0,559

CEA: 549 0,688 257 0,664

Ca15-3: 549 0,604 257 0,569

Ca125: 549 0,693 257 0,665

SCC: 549 0,615 257 0,639

B. Ensayo Elecsys™ Roche

5 Se hicieron las mediciones Cyfra 21-1 (Citoqueratina 19, CK-19) con el sistema Elecsys™ 2010 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de Cyfra 21-1 se proporcionó por el instrumento Elecsys™. Se generó una curva ROC con los datos y el AUC para las cohortes grande y pequeña se comunica en la Tabla 2.

10 Tabla 2. Actuación clínica (AUC) de la citoqueratina 19

gran cohorte: pequeña cohorte

Marcador: nº obs AUC nº obs AUC

CK-19: 537 0,68 248 0,718

C. Ensayos en placa microtiter

15 Se adquirieron los siguientes kits ELISA: ProGRP en Advanced Life Science Institute, Inc. (Japón), TPS (Citoqueratina 18, C-18) en IDL Biotech AB (Bromma, Suecia) y Parainfluenza 1/2/3 IgG ELISA en IBL Immuno Biological Laboratories (Minneapolis, MN, EE. UU.). Se ejecutaron los análisis según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de los analitos se derivaron de los cálculos instruidos y proporcionados por el protocolo del

20 fabricante. El AUC obtenida por los ensayos individuales se muestran a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3. Actuación clínica (AUC) de Citoqueratina 18, proGRP, y parainfluenza 1/2/3

Gran cohorte: Pequeña cohorte

Marcador: nº obs AUC nº obs AUC

CK-18: 548 0,656 257 0,657

ProGRP: 548 0,698 257 0,533

Parainfluenza 1/2/3: 544 0,575 255 0,406

Ejemplo 3. Matriz de autoanticuerpos en perlas 25

A. Se unieron proteínas humanas disponibles comercialmente (véase, la Tabla 4, posteriormente) a perlas Luminex™ SeroMap™ (Austin, Texas) y se combinaron los grupos de perlas para preparar el reactivo. Se expusieron partes del reactivo a las muestras de suero humanas bajo condiciones que permitían que cualquier anticuerpo presente se uniera a las proteínas. El material que no se había unido se lavó y las perlas se 30 expusieron entonces a un conjugado fluorescente de R-ficoeritrina unido a un anticuerpo que se une específicamente a la IgG humana. Tras el lavado, las perlas se pasaron a través de un instrumento Luminex™ 100, que identificó cada perla de acuerdo con su colorante interno, y midió la fluorescencia unida a la perla, que correspondía con la cantidad de anticuerpo unido a la perla. De esta manera, se evaluaron las respuestas de 772 muestras (251 de cáncer de pulmón, 244 normales, 277 benignos) contra 21 proteínas humanas, así como varias

35 proteínas no humanas como controles (seroalbúmina bovina (BSA) y toxina tetánica). Se obtuvieron los antígenos MUC-1 (Fujirebio Diagnostics INC, Malvern, PA), Citoqueratina 19 (Biodesign, Saco, ME), y CA-125 (Biodesign, Saco, ME) como fracciones de intercambio iónico de los cultivos celulares (Véase la Tabla 4, posteriormente). Estas preparaciones relativamente en crudo se sometieron a más fragmentaciones por peso molecular utilizando HPLC con una columna de exclusión por tamaño (BioRad SEC-250, Hercules, CA) con

40 una fase móvil = PBS a 0,4 ml/minuto. Las fracciones se recolectaron comenzando a los 15 minutos con 1 minuto

para cada fracción para un total de 23 fracciones para cada antígeno. Para el MUC-1, se inyectaron 250 ul; para la Citoqueratina 19 y CA-125, se inyectaron 150 ul. Las tres muestras mostraron señales que indicaban varias concentraciones de de alto PM que se eluían de los 15-24 minutos, con señales demasiado altas para medirlas a tiempos mayores de 24 minutos, indicando altas concentraciones de materiales de bajo PM. Para el revestimiento de perlas se combinaron las siguientes fracciones: MUC-1-A fracciones 6,7; MUC-1-B fracciones 10,11; MUC-1-C fracciones 12,13; Citoqueratina 19-A fracciones 4, 5; Citoqueratina 19-B fracciones 8, 9; Citoqueratina 19-C fracciones 16, 17; CA125-A fracciones 5, 6; CA125-B fracciones 12, 13.

ID Perla: Antígeno Fuente

1: MUC-1-A Fujirebio Diagnostics INC

2: MUC-1-B Fujirebio Diagnostics INC

3: MUC-1-C Fujirebio Diagnostics INC

4: Citoqueratina 19-A Biodesign, Saco, ME

5: Citoqueratina 19-B Biodesign, Saco, ME

6: Citoqueratina 19-C Biodesign, Saco, ME

7: CA125-A Biodesign, Saco, ME

8: CA125-B Biodesign, Saco, ME

9: HSP27 US Biological, Swampscott, MA

10: HSP70 Alexis, San Diego, CA

11: HSP90 Alexis, San Diego, CA

12: Tétanos Sigma, St. Louis, MO

13: HCG Diosynth API, Des Plaines, IL

14: VEGF Biodesign, Saco, ME

15: CEA Biodesign, Saco, ME

16: NY-ESO-1 NeoMarkers, Fremont, CA

17: AFP Cell Sciences, Canton, MA

18: ERB-B2 Invitrogen, Grand Island, NY

19: PSA Fitzgerald, Concord, MA

20: P53 Lab Vision, Fremont, CA

21: JO-1 Biodesign, Saco, ME

22: Lactoferrina Sigma, St. Louis, MO

23: HDJ1 Alexis, San Diego, CA

24: Queratina Sigma, St. Louis, MO

25: RECAF62 BioCurex, Vancouver, BC Canadá

26: RECAF50 BioCurex, Vancouver, BC Canadá

27: Leche RECAF BioCurex, Vancouver, BC Canadá

28: BSA Sigma, St. Louis, MO

Tabla 4. Lista de proteínas

B. Revestimiento de perlas Luminex SeroMap™ con antígenos Se añadieron a los pocillos de una placa de ultrafiltración Omega 10K (Pall Corporation, Ann Arbor, Michigan) 50 ul de agua. Tras 10 minutos se colocó la placa al vacío. Cuando los pocillos estaban vacíos se añadieron 10 ul de agua para mantener la hidratación. Se añadieron a cada pocillo 50-100 ul de ácido morfolinoetanosulfónico

5 (MES) 5 mM, pH 5,6, 50 ul de las perlas indicadas Luminex™ SeroMAP™ y el volumen apropiado correspondiente con 10-20 ug de cada antígeno indicado en la Tabla 4. Las perlas se suspendieron con la pipeta. A las perlas se añadieron 10 ul de EDAC (2,0 mg en 1,0 ml de MES 5 mM pH 5,6). La placa se cubrió y se colocó en un agitador en oscuridad. Tras 14 horas, la placa se succionó por vacío, se lavó con agua, y finalmente se resuspendieron las perlas en 50 ul de trietanolamina (TEA) 20 mM pH 5,6. La placa se agitó con el agitador en

10 oscuridad. Se añadió a cada pocillo unos segundos 10 ul de EDAC (2,0 mg en 1,0 ml de MES 5 mM pH 5,6), y la placa se colocó en un agitador durante una hora en oscuridad. Tras el lavado, se añadieron a cada pocillo 200 ul de tampón PBS que contenía un 1% de BSA y un 0,08% de azida sódica (PBN), seguido por sonicación con sonda, y se colocó en oscuridad.

15 C. Ensayo de las muestras de suero con perlas revestidas Se prepararon las muestras en microplacas en una dilución de 1:20 en PBN, con 80 muestras por microplacas. A 50 ul del grupo de perlas descrito anteriormente se añadieron a 5 ul de suero de conejo (de un conejo inmunizado con un antígeno sin relación con los que se ensayan en el presente ensayo). El grupo de perlas se removió y se colocó a 37 ºC. Tras 35 minutos, se añadió 1 ml de PBN que contenía un 5% de suero de conejo y

20 un 1% de CHAPS (BRC). El grupo de perlas se removió, se centrifugó y se resuspendió en 1,05 ml de BRC. Se lavaron los pocillos de una placa filtro de 1,2 u Supor (Pall Corporation) con 100 ul de PBN. A cada pocillo se le añadieron 50 ul de BRC, 10 ul de la dilución 1:20 de muestra de suero y 10 ul de las perlas resuspendidas. La placa se agitó a temperatura ambiente en oscuridad durante 1 hora, se filtró y luego se lavó 3 veces durante 10 minutos con 100 ul de BRC. Se añadió el conjugado de detección 50 ul de (20 ul RPE anti-IgG humana en 5,0 ml

25 de BRC) y se agitó la placa en oscuridad durante 30 minutos después de que se resuspendieran las perlas con una pipeta. Se añadieron entonces 100 ul de BRC, se agitaron las perlas con una pipeta y se analizaron las muestras en un instrumento Luminex™ 100.

Los resultados (intensidad media de las perlas para cada muestra y antígeno) se evaluaron por análisis ROC con los 30 siguientes resultados para las cohortes grande y pequeña que se muestra en la Tabla 5:

Tabla 5. Actuación clínica de la matriz de perlas de autoanticuerpos que contenían las proteínas de la Tabla 4 en las cohortes grande y pequeña

Gran cohorte: Pequeña cohorte

Biomarcador: nº obs AUC nº obs AUC

MUC-1-A: 579 0,53 253 0,56

MUC-1-B: 579 0,55 253 0,59

MUC-1-C: 579 0,57 253 0,61

Citoqueratina 19-A: 579 0,57 253 0,58

Citoqueratina 19-B: 579 0,53 253 0,49

Citoqueratina 19-C: 579 0,62 253 0,65

CA125-A: 579 0,53 253 0,5

CA125-B: 579 0,62 253 0,59

HSP27: 579 0,56 253 0,56

HSP70: 579 0,49 253 0,51

HSP90: 579 0,54 253 0,53

Tétanos: 579 0,57 253 0,56

HCG: 579 0,54 253 0,5

VEGF: 579 0,53 253 0,51

CEA: 579 0,57 253 0,55

NY-ESO-1: 579 0,58 253 0,58

AFP: 579 0,51 253 0,55

5

10

15

20

25

30

35

40

Gran cohorte: Pequeña cohorte

Biomarcador: nº obs AUC nº obs AUC

ERB-B2: 579 0,61 253 0,57

PSA: 579 0,6 253 0,57

P53: 579 0,6 253 0,54

JO-1: 579 0,57 253 0,54

Lactoferrina: 579 0,49 253 0,49

HDJ1: 579 0,62 253 0,63

Queratina: 579 0,58 253 0,55

RECAP62: 579 0,54 253 0,53

RECAF50: 579 0,53 253 0,53

Leche RECAF: 579 0,54 253 0,62

BSA: 579 0,57 253 0,59

Ejemplo 4. Matriz de autoanticuerpos en portaobjetos

A. Preparación de antígenos

Se prepararon aproximadamente 5000 proteínas derivadas de la Ultimate ORF Collection™ de Invitrogen (Invitrogen, Grand Island, NY) como fusiones recombinantes de la secuencia de la glutatión-S-transferasa (GST) con una proteína humana de longitud completa. El marcador GST permite la evaluación de la cantidad de proteína que se une a la matriz independientemente de otras características de la proteína.

B. Portaobjetos revestidos de antígeno

La ProtoArray consiste en una superficie de cristal (portaobjetos) revestido con nitrocelulosa punteada con las aproximadamente 5000 proteínas mencionadas anteriormente, así como numerosas características de control.

C. Ensayo de las muestras de suero con portaobjetos revestidos

La matriz se bloqueó primero con PBS/1% BSA/0,1% de Tween 20 durante 1 hora a 4 ºC. Entonces se expuso a la muestra de suero diluida 1:120 en Tampón de Perfil (el “tampón de Perfil” que se trata en el presente documento contenía PBS, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de ditiotreitol, 0,05% Triton-X-100, 5% de glicerol, 1% BSA) durante 90 minutos a 4 ºC. La matriz se lavó entonces tres veces con el Tampón de Perfil durante 8 minutos por lavado. La matriz se expuso entonces al conjugado AlexaFluor anti-IgG humana a 0,5 ul/ml en Tampón de Perfil durante 90 minutos a 44 ºC. La matriz se lavó entonces tres veces con el Tampón de Perfil durante 9 minutos por lavado. Tras el secado en una centrífuga se exploró utilizando un escáner de micromatriz fluorescente Axon GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

D. Selección del biomarcador

Comparando la distribución de las señales positivas del suero de los pacientes de cáncer con las de los pacientes normales se determinaron las identidades de las proteínas que producían autoanticuerpos característicos de los pacientes de cáncer. Para aumentar la probabilidad de encontrar autoanticuerpos específicos de cáncer con un número limitado de matrices, se utilizaron los siguientes grupos de muestras: 10 grupos que contenían cada uno el suero de 4 o 5 pacientes de cáncer, 10 grupos que contenían cada uno el suero de 4 o 5 pacientes con enfermedad de pulmón benigna. Estos grupos se enviaron a Invitrogen para su procesamiento como se ha descrito anteriormente. Las intensidades de la fluorescencia que corresponden con cada proteína para cada grupo se presentaron en una hoja de cálculo. Cada proteína se representó dos veces, que corresponde con puntos duplicados en la matriz.

El fabricante (Invitrogen) suministró en un algoritmo para evaluar la especificidad para el cáncer de la respuesta inmunitaria de una proteína particular, un valor de punto de corte que distinguía mejor las intensidades de señal de las muestras de cáncer de las muestras no cancerosas. Se determinó el número de muestras de cada grupo con intensidades por encima de este punto de corte (recuento de cáncer y recuento no canceroso respectivamente) y se colocó en la hoja de cálculo como parámetros. Adicionalmente se calculó el valor de p, que representaba la

probabilidad de que no había aumento de señal en un grupo comparado con el otro. Los datos se ordenaron entonces para poner en lo más alto las proteínas con menos positivos en el grupo no canceroso y más positivos en el grupo de cáncer, y se ordenaron además por el valor de p de menor a mayor. Ordenando por esta fórmula se proporcionó la siguiente información proporcionada a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7. Lista de ID de Antígenos

Identificación del Antígeno: Recuento de cáncer Recuento no canceroso Valor de P

proteína vesícula acrosómica 1 (ACRV1): 6 0 0,0021

forkhead box A3 (FOXA3): 6 0 0,0072

factor general transcripción IIA: 6 0 0,5539

WW dominio que contiene E3 ubiquitina proteína ligasa 2: 5 0 0,0018

PDZ dominio que contiene 1 (PDZ1): 5 0 0,0018

ciclina E2: 5 0 0,0018

ciclina E2: 5 0 0,0018

dominio que contiene ácido fosfatídico fosfatasa tipo 2 3 (PPAPDC3): 5 0 0,0088

dominio que contiene motivo alfa repetido y estéril de anquirina 3: 5 0 0,0563

dedos de zinc: 5 0 0,0563

cisteinil-tARN sintetasa: 4 0 0,0077

cisteinil-tARN sintetasa: 4 0 0,0077

factor transcripción que se une al potenciador IGHM 3 (TFE3): 4 0 0,0077

WW dominio que contiene E3 ubiquitina proteína ligasa 2: 4 0 0,0077

Fase de lectura abierta 7 del Cromosoma 21: 4 0 0,0077

Fase de lectura abierta 7 del Cromosoma 21: 4 0 0,0077

IQ motivo que contiene F1 (IQCF1): 4 0 0,0077

proteína 1 citosólica de linfocitos (L-plastina) (LCP1): 4 0 0,0077

proteína vesícula acrosómica 1 (ACRV1): 4 0 0,0077

homólogo DnaJ (Hsp40): 4 0 0,0077

homólogo DnaJ (Hsp40): 4 0 0,0077

factor 2 de unión al receptor nuclear: 4 0 0,0077

factor 2 de unión al receptor nuclear: 4 0 0,0077

dominio que contiene PDZ 1 (PDZK1): 4 0 0,0077

Sustrato de proteína quinasa C y caseína quinasa in neuronas 2: 4 0 0,0077

LIM dominio quinasa 2: 4 0 0,0077

polipéptido D de polimerasa (ARN) III (ADN dirigido): 4 0 0,0077

Proteína del motivo de unión ARN: 4 0 0,0077

Asociado al ciclo de división celular 4 (CDCA4): 4 0 0,0312

factor de intercambio de nucleótido guanina Rho (GEF) 1: 4 0 0,076

LUC7-tipo 2 (S. cerevisiae): 4 0 0,2302

similar a RIKEN ADNc 2310008M10 (LOC202459): 4 0 0,2302

ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa: 3 0 0,0296

ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa: 3 0 0,0296

proteína 1 de unión a heme (HEBP1): 3 0 0,0296

proteína 1 de unión a heme (HEBP1): 3 0 0,0296

subfamilia C receptor de células citolíticas tipo lectina: 3 0 0,0296

subfamilia C receptor de células citolíticas tipo lectina: 3 0 0,0296

LATS: 3 0 0,0296

N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASH1): 3 0 0,0296

N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASH1): 3 0 0,0296

Paralemmina: 3 0 0,0296

Paralemmina: 3 0 0,0296

proteína 1que interactúa con PIN2: 3 0 0,0296

proteína quinasa S6 ribosómica: 3 0 0,0296

proteína quinasa S6 ribosómica: 3 0 0,0296

dominio que contiene SH3 y PX 3 (SH3PX3): 3 0 0,0296

dominio que contiene SH3 y PX 3 (SH3PX3): 3 0 0,0296

Pareja de fusión TCF3 (E2A) (en Leucemia infantil) (TFPT): 3 0 0,0296

Pareja de fusión TCF3 (E2A) (en Leucemia infantil) (TFPT): 3 0 0,0296

Factor de transcripción que se une al potenciador IGHM 3 (TFE3): 3 0 0,0296

Fase de lectura abierta 117 del cromosoma 1: 3 0 0,0296

Fase de lectura abierta 117 del cromosoma 1: 3 0 0,0296

Proteína sobre-expresada asociada a la resistencia al cisplatino: 3 0 0,0296

proteína de interacción con hsp70: 3 0 0,0296

proteína hipotética FLJ22795: 3 0 0,0296

proteína hipotética FLJ22795: 3 0 0,0296

Proteína transmembrana inducida por interferón 1 (9-27): 3 0 0,0296

Proteína transmembrana inducida por interferón 1 (9-27): 3 0 0,0296

IQ motivo que contiene F1 (IQCF1): 3 0 0,0296

motivo que contiene repeticiones ricas en leucina y IQ 2 (LRRIQ2): 3 0 0,0296

paralemmina 2: 3 0 0,0296

paralemmina 2: 3 0 0,0296

dominio que contiene RWD 1: 3 0 0,0296

familia 7 vehículo de solutos: 3 0 0,0296

familia 7 vehículo de solutos: 3 0 0,0296

tropomiosina 1 (alfa): 3 0 0,0296

tropomiosina 1 (alfa): 3 0 0,0296

Candidato subtransferible supresor de tumores 4: 3 0 0,0296

ubiquitina-tipo 4A: 3 0 0,0296

vestigial tipo 4 (Drosophila) (VGLL4): 3 0 0,0296

dominio 16 repetido WD: 3 0 0,0296

dominio 16 repetido WD: 3 0 0,0296

proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3: 3 0 0,0296

proteína quinasa asociada a muerte 1 (DAPK1): 3 0 0,0296

dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 (DDAH2): 3 0 0,0296

dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 (DDAH2): 3 0 0,0296

proteína de choque térmico de 70kDa 2: 3 0 0,0296

familia H antígeno melanoma: 3 0 0,0296

proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3 (MAPKAPK3): 3 0 0,0296

nei tipo 2 (E. coli) (NEIL2): 3 0 0,0296

Sustrato de proteína quinasa C y caseína quinasa en neuronas 2: 3 0 0,0296

SMAD: 3 0 0,0296

SMAD: 3 0 0,0296

proteína de unión a ARN asociada a gránulos citotóxicos TIA1: 3 0 0,0296

factor trefoil 2 (proteína espasmolítica 1) (TFF2): 3 0 0,0296

uroporfirinógeno III sintasa (porfiria eritropoyética congénita) (UROS): 3 0 0,0296

Proteína de 29 kDa inducida por citoquina (CIP29): 3 0 0,0296

proteína transmembrana 106C (TMEM106C): 3 0 0,0296

Fase de lectura abierta 11 del Cromosoma 9: 3 0 0,0296

O-6-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT): 3 0 0,0296

proteína 1asociada a PDGFA (PDAP1): 3 0 0,0296

proteína 1asociada a PDGFA (PDAP1): 3 0 0,0296

polipéptido D de polimerasa (ARN) III (dirigido a ADN): 3 0 0,0296

Rho-asociado: 3 0 0,0296

Rho-asociado: 3 0 0,0296

Motivo de proteína de unión a ARN: 3 0 0,0296

tetraspanina 17: 3 0 0,0296

Un segundo algoritmo calculaba la especificidad de cáncer de la respuesta inmunitaria para una proteína como la diferencia entre la señal media para las muestras de cáncer y la señal media para no cancerosas dividida por la desviación estándar de las intensidades de señal de las muestras no cancerosas. Esto tiene la ventaja de que las respuestas inmunitarias fuertes afectan al resultado más que las débiles. Los datos se ordenan entonces para poner en la parte superior las proteínas con los valores más altos. Los 100 más altos que se listaron identificados por este orden se muestra a continuación en la Tabla 8:

Tabla 8: Listado de ID de antígenos ordenados para poner en la parte superior las proteínas con la relación S/N más altas. El S/N se calculó dividiendo la diferencia de la intensidad media de la señal de los dos grupos (media de cáncer-media de no canceroso) por la desviación estándar del grupo no canceroso (DE no canceroso)

Identificación del Antígeno: Dif. de las medias / DE (no canceroso)

Pareja de fusión TCF3 (E2A) (en Leucemia infantil) (TFPT): 21,4

proteasa especifica de ubiquitina 45 (USP45): 16,1

proteasa especifica de ubiquitina 45 (USP45): 15,6

enzima de conjugación con ubiquitina E2O: 15,1

proteasa especifica de ubiquitin 45 (USP45): 13,9

enzima de conjugación con ubiquitina E2O: 12,3

Superenrrollamiento rico en prolina 1 (PRRC1): 11,5

Superenrrollamiento rico en prolina 1 (PRRC1): 10

CLL de células B/linfoma 10: 9,8

familia 7 vehículo de solutos: 8,8

CLL de células B/linfoma 10: 8,7

homólogo DnaJ (Hsp40): 8,2

homólogo DnaJ (Hsp40): 8

familia 7 vehículo de solutos: 7,9

vestigial tipo 4 (Drosophila) (VGLL4): 6,5

dominio que contiene SH3 y PX 3 (SH3PX3): 6,3

ciclina E2: 6,1

dominio que contiene SH3 y PX 3 (SH3PX3): 6,1

ciclina E2: 6

Clon de ADNc IMAGE:3941306: 5,9

Paralemmina: 5,8

Proteína transmembrana inducida por interferón 1 (9-27): 5,6

Paralemmina: 5,4

ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa: 5,4

motivo que contiene repeticiones ricas en leucina y IQ 2 (LRRIQ2): 5,3

ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa: 5,3

Asociado al ciclo de división celular 4 (CDCA4): 5,2

Proteína transmembrana inducida por interferón 1 (9-27): 4,8

motivo que contiene repeticiones ricas en leucina y IQ 2 (LRRIQ2): 4,7

proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3: 4,5

proteína quinasa dependiente del calcio/calmodulina I (CAMK1): 4,4

Proteína que interactúa con RAB3A tipo (rabin3) 1 (RAB3IL1): 4,3

dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 (DDAH2): 4,2

proteína de interacción con hsp70: 4,1

Fase de lectura abierta 11 del Cromosoma 9: 4,1

Identificación del Antígeno: Dif. de las medias / DE (no canceroso)

proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3: 4,1

proteína vesícula acrosómica 1 (ACRV1): 4,1

triosafosfato isomerasa 1: 4

triosafosfato isomerasa 1: 3,8

uroporfirinógeno III sintasa (porfiria eritropoyética congénita) (UROS): 3,7

subfamilia C receptor de células citolíticas tipo lectina: 3,7

receptor alfa relacionado con estrógeno (ESRRA): 3,6

proteína vesícula acrosómica 1 (ACRV1): 3,6

Asociado al ciclo de división celular 4 (CDCA4): 3,6

Proteína que interactúa con RAB3A tipo (rabin3) 1 (RAB3IL1): 3,5

proteína quinasa asociada a muerte 1 (DAPK1): 3,5

Sustrato de proteína quinasa C y caseína quinasa in neuronas 2: 3,5

Tropomodulina 1: 3,4

Tropomodulina 1: 3,4

Fase de lectura abierta 117 del Cromosoma 1: 3,4

dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 (DDAH2): 3,4

receptor alfa relacionado con estrógeno (ESRRA): 3,2

Dominio que contiene homología a la pleckstrina: 3,1

uroporfirinógeno III sintasa (porfiria eritropoyética congénita) (UROS): 3,1

proteína hipotética FLJ22795: 3,1

oncogén FYN relacionado con SRC: 3,1

proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3 (MAPKAPK3): 3,1

Homólogo 37 tipo 1 (S. cerevisiae) del ciclo de división celular CDC37: 3

Candidato subtransferible de supresión tumoral 4: 3

dominio que contiene RWD 1: 3

proteína hipotética FLJ22795: 3

Homólogo 37 tipo 1 (S. cerevisiae) del ciclo de división celular CDC37: 2,9

WW dominio que contiene E3 ubiquitina proteína ligasa 2: 2,9

Dominio que contiene PDZ 1 (PDZK1): 2,9

proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3 (MAPKAPK3): 2,9

factor de transcripción que se une a potenciador IGHM 3 (TFE3): 2,9

forkhead box A3 (FOXA3): 2,8

Fase de lectura abierta 117 del Cromosoma 1: 2,8

dominio que contiene motivo alfa repetido y estéril de anquirina 3: 2,8

Dominio que contiene OCIA 1 (OCIAD1): 2,8

Identificación del Antígeno: Dif. de las medias / DE (no canceroso)

polimerasa (DNA dirigida): 2,8

SMAD: 2,8

KIAA0157 (KIAA0157): 2,8

CLL de células B/linfoma 7C (BCL7C): 2,8

proteína quinasa ribosómica S6: 2,8

Fase de lectura abierta 11 del Cromosoma 9: 2,7

proteína quinasa ribosómica S6: 2,7

proteína inducida por citoquina de 29 kDa (CIP29): 2,7

Factor de unión al receptor nuclear 2: 2,7

regulador del factor de célula huésped C1 1 (XPO1 dependiente) (HCFC1R1): 2,7

quinasa tipo STE20 (levadura) (SLK): 2,7

Dominio que contiene OCIA 1 (OCIAD1): 2,6

Sustrato de proteína quinasa C y caseína quinasa in neuronas 2: 2,6

homólogo quaking: 2,6

clasificación nexina 16 (SNX16): 2,6

proteína citosólica de linfocitos 1 (L-plastina) (LCP1): 2,6

Fase de lectura abierta 7 del Cromosoma 21: 2,5

quinasa tipo STE20 (levadura) (SLK): 2,5

regulador del factor de célula huésped C1 1 (XPO1 dependiente) (HCFC1R1): 2,5

Proteína que interactúa con hsp70: 2,5

homólogo quaking: 2,5

factor transcripción que se une al potenciador IGHM 3 (TFE3): 2,5

SMAD: 2,4

WW dominio que contiene E3 ubiquitina proteína ligasa 2: 2,4

Fase de lectura abierta 7 del Cromosoma 21: 2,4

Dominio que contiene PDZ 1 (PDZK1): 2,4

acetilserotonina tipo O-metiltransferasa: 2,4

CLL de células B/linfoma 7C (BCL7C): 2,3

proteína ribosómica S19 (RPS19): 2,3

O-6-metilguanina-DNA metiltransferasa (MGMT): 2,3

Comparando los resultados de las Tablas 7 y 8 y examinando las señales generadas por las muestras de cáncer y no cancerosas para cada proteína, se seleccionaron las siguientes 25 proteínas que se muestran a continuación en la Tabla 9 para investigación posterior.

Tabla 9. Mejores 25 proteínas seleccionadas para investigación posterior

Clon: Identificación Antígeno

BC007015.1: ciclina E2

NM_002614.2: Dominio que contiene PDZ 1 (PDZK1)

Clon: Identificación Antígeno

NM_001612.3: proteína vesícula acrosómica 1 (ACRV1)

NM_006145.1: homólogo DnaJ (Hsp40)

BC011707.1: factor 2 de unión al receptor nuclear

BC008567.1: Fase de lectura abierta 7 del Cromosoma 21

BC000108.1: WW dominio que contiene E3 ubiquitina proteína ligasa 2

BC001662.1: proteína quinasa activada por Mitógeno -proteína quinasa activada 3

BC008037.2: Sustrato de proteína quinasa C y caseína quinasa in neuronas 2

NM_005900.1: SMAD

NM_013974.1: dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 (DDAH2)

NM_000375.1: uroporfirinógeno III sintasa (porfiria eritropoyética congénita) (UROS)

NM_145701.1: Asociado al ciclo de división celular 4 (CDCA4)

BC016848.1: Fase de lectura abierta 117 del Cromosoma 1

BC014307.1: Fase de lectura abierta 11 del Cromosoma 9

BC000897.1: Proteína transmembrana inducida por interferón 1 (9-27)

NM_024548.2: motivo que contiene repeticiones ricas en leucina y IQ 2 (LRRIQ2)

BC013778.1: familia 7 vehículo de solutos

BC032449.1: Paralemmina

NM_153271.1: dominio que contiene SH3 y PX 3 (SH3PX3)

NM_013342.1: Pareja de fusión TCF3 (E2A) (en Leucemia infantil) (TFPT)

NM_006521.3: factor transcripción que se une al potenciador IGHM 3 (TFE3)

BC016764.1: ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa

BC014133.1: Homólogo 37 tipo 1 (S. cerevisiae) del ciclo de división celular CDC37

BC053545.1: tropomiosina 1 (alfa)

E. Ciclina E2

Se encontraron dos formas de Ciclina E2 presentes en la ProtoArray™. La forma identificada como el registro en

5 Genbank BC007015.1 (SEQ ID NO: 1) que muestra una fuerte inmunorreactividad con varios de los grupos de muestras de cáncer y una reactividad mucho más baja con los grupos benigno y normal (no canceroso). Por el contrario, la forma identificada como registro de Genbank BC020729.1 (SEQ ID NO: 2) mostraba poca reactividad con cualquiera de las muestras de cáncer y no cancerosas. Como se muestra posteriormente, un alineamiento de secuencia de las dos formas mostraban una identidad por encima de 259 aminoácidos, con diferencias tanto en las

10 regiones del extremo N como del extremo C. El B020729.1 tiene 110 aminoácidos en el extremo N y 7 aminoácidos en el extremo C que no están presentes en BC007015.1. El BC007015.1. tiene 37 aminoácidos en el extremo C que no están presentes en B020729.1. Debido a que solo la forma BC007015.1. muestra inmunorreactividad, esto se atribuye a la parte de 37 aminoácidos del extremo C.

15 Se sintetizaron dos péptidos del extremo C de BC007015.1: E2-1 (SEQ ID NO: 3) que contienen los 37 aminoácidos del extremo C de BC007015.1. E2-2 (SEQ ID NO: 5) que contiene el extremo C de 18 aminoácidos de BC007015.1. Ambos péptidos se sintetizaron para incluir una cisteína en el extremo N para proporcionar un sitio reactivo para un enlace covalente para una proteína portadora o de superficie.

imagen17

Tabla 10. Resumen de las diferentes presentaciones de péptidos ciclina E2 y proteínas en las diferentes perlas

Columna: Fila ID de perlas antígeno Fuente Método de acoplamiento

1: A 25 BM-E2-1 39 mg/ml Preactivado

1: B 26 BM-E2-2 2,4 mg/ml Preactivado

1: C 28 E2-1 21 mg/ml Preactivado

1: D 29 E2-2 40 mg/ml Preactivado

1: E 30 BM-E2-1 3,9 mg/ml Directo

1: F 31 BM-E2-2 2,4 mg/ml Directo

1: G 33 E2-1 21 mg/ml Directo

1: H 34 E2-2 40 mg/ml Directo

2: A 35 CCNE2 (GenWay, San Diego, CA) 0,6 mg/ml Preactivado

2: B 37 MAPKAPK3 (GenWay, San Diego, CA) 05 mg/ml Preactivado

2: C 38 p53 (Biomol, Plymouth Meeting, PA) 0-25 mg/ml Preactivado

2: D 39 TMOD1 (GenWay, San Diego, CA) 0,8 mg/ml Preactivado

2: E 40 DNAJB1 (Axxora, San Diego, CA) 1 mg/ml Preactivado

Las perlas se ensayaron con sueros de pacientes de la siguiente manera: a 1 ml de PBN se añadieron 5 ul de cada preparación de perlas. La mezcla se sonicó y centrifugó, y las perlas aglomeradas se lavaron con 1 ml de BSA 1% 5 en PBS, y se resuspendieron en 1 ml del mismo tampón. Se añadieron a una placa filtro Supor de 1,2 u (Pall Corporation, East Hills, NY) 100 ul de PBN/Tween (1% BSA en PBS que contiene un 20% de Tween 20). Tras 10 minutos se filtró la placa, y se añadieron 50 ul de PBN 0,2% Tween (1% BSA en PBS que contiene un 0,2% de Tween 20). A cada pocillo se añadieron 20 ul de la mezcla de perlas y 20 ul de suero (1:50) como se muestra en la Tabla 11. El suero erra o suero de pacientes humanos o de suero de conejo anti-GST. La placa se colocó en un

10 agitador en oscuridad. Tras 1 hora, la placa se filtró y se lavó con 100 ul de PBN/Tween tres veces. Se añadieron 50 ul de RPE-anti-IgG humana (1:400) (Sigma, St. Louis, MO) para detectar anticuerpos humanos mientras que 50 ul de RPE-anti-IgG de conejo (1:200) se añadió para detectar los anticuerpos anti-GST de conejo. La placa se colocó en un agitador en oscuridad durante 30 minutos tras lo cual se filtraron las perlas, se lavaron y se procesaron en Luminex™.

15 Los resultados de seis muestras de suero y anti-GST de conejo se muestran en la Tabla 11 a continuación.

Tabla 11. Resultados del Luminex para las perlas revestidas con péptidos ciclina F2 y proteínas, expuestos a sueros de pacientes.

ID de perla

25: 26 28 29 35 30 31 33 34

Preactivado: Directo

ID del Suero: BM-E2-1 BM-E2-2 E2-1 E2-2 CCNE2 BM-E2-1 BM-E2-2 E2-1 E2-2

A2: 18 12 7 4 17 16 13 9 5

A4: 4 4 3 3 4 2 5 4 3

B2: 9 16 5 4 12 8 10 9 5

B4: 4380 172 1985 11 358 4833 132 2298 18

C4: 227 44 66 9 50 243 40 87 7

D4: 406 15 64 7 19 440 13 107 8

F4: 3721 156 1592 8 299 4034 140 1997 19

ID de perla

25: 26 28 29 35 30 31 33 34

Preactivado: Directo

ID del Suero: BM-E2-1 BM-E2-2 E2-1 E2-2 CCNE2 BM-E2-1 BM-E2-2 E2-1 E2-2

conej-antiGST: 13 14 40 21 1358 10 13 56 22

Es aparente en la Tabla 11 que las perlas 25 y 30, contienen el péptido E2-1 unido a BSA y acoplado directamente (utilizando el método directo) o por medio de preactivación (o el método preactivado) de perlas, respectivamente, daba las señales más fuetes. El péptido E2-1 acoplado sin el portador BSA también daba señales fuertes, aunque

5 solo aproximadamente la mitad de las que daba con el portador BSA. La proteína de longitud completa CCNE2 (que contiene el marcador de fusión GST en el extremo N) mostraba señales bastante por encima de cualquier forma de péptido E2-2, pero aún mucho menor que el del péptido E2-1, sugiriendo que contenía la parte inmunorreactiva de las secuencias, pero con una densidad más baja en las perlas. Su señal con el anti-GST de conejo muestra que esta proteína de fusión GST estaba acoplada satisfactoriamente a la microsfera.

10 Se revistieron las perlas Luminex SeroMap™ con las proteínas que se muestran en la Tabla 12, posteriormente, por método de preactivación y directo como se ha descrito anteriormente, y por revestimiento pasivo. Para el revestimiento pasivo, se añadieron 5 ug de la proteína, en solución tal cual se recibe del vendedor, a 200 ul de perlas SeroMap™, la mezcla se removió, y se incubó 5 horas a temperatura ambiente, a 18 horas a 4 ºC, entonces

15 se centrifugó para sedimentarlo, y el aglomerado se lavó y se resuspendió en PBN.

Tabla 12. Proteínas que revisten perlas Luminex SeroMap™ por métodos de preactivación y directo.

Revestimiento: Proteína Perla Fuente

Preactivado: TMP21-ECD 1 Abbott, North Chicago, IL

Preactivado: domino NPC1L1C 5 Abbott, North Chicago, IL

Preactivado: PSEN2(1-86aa) 14 Abbott, North Chicago, IL

Preactivado: IgG humana 22 Abbott, North Chicago, IL

Preactivado: BM-E2-2 26 Abbott, North Chicago, IL

Directo: BM-E2-1 30 Abbott, North Chicago, IL

Preactivado: TMOD1 39 Genway, San Diego, CA

Preactivado: DNAJB1 40 Axxora, San Diego, CA

Preactivado: PSMA4 41 Abnova, Taipei City, Taiwan

Preactivado: RPE 42 Abnova, Taipei City, Taiwan

Preactivado: CCNE2 43 Abnova, Taipei City, Taiwan

Preactivado: PDZK1 46 Abnova, Taipei City, Taiwan

Directo: CCNE2 49 Genway, San Diego, CA

Preactivado: Paxilina 53 BioLegend, San Diego, CA

Directo: AMPHIPHYSIN 54 LabVision, Fremont, CA

Preactivado: CAMK1 55 Upstate, Charlottesville, VA

Pasivo: DNAJB11 67 Abnova, Taipei City, Taiwan

Pasivo: RGS1 68 Abnova, Taipei City, Taiwan

Pasivo: PACSIN1 70 Abnova, Taipei City, Taiwan

Pasivo: SMAD1 71 Abnova, Taipei City, Taiwan

Pasivo: p53 72 Biomol, Plymouth Meeting, PA

Pasivo: RCV1 75 Genway, San Diego, CA

Revestimiento: Proteína Perla Fuente

Pasivo: MAPKAPK3 79 Genway, San Diego, CA

Se ensayaron muestras de suero de 234 pacientes (87 cánceres, 70 benignos, y 77 normales). Los resultados de estos ensayos se analizaron por curvas ROC. El AUC calculado para cada antígeno se muestra en la Tabla 13 a continuación.

Tabla 13. AUC calculada para antígenos derivados de muestras de suero.

Proteína: AUC

péptido ciclina E2 1: 0,81

proteína ciclina E2 (Genway): 0,74

péptido ciclina E2 2: 0,71

TMP21-ECD: 0,66

Dominio NPC1L1C: 0,65

PACSIN1: 0,65

p53: 0,63

protein quinasa activada por mitógeno proteína quinasa activada (MAPKAPK3): 0,62

Tropomodulina 1 (TMOD1): 0,61

PSEN2(1-86aa): 0,60

proteína de unión DNA J 1(DNAJB1): 0,60

proteína de unión DNA J 11(DNAJB11): 0,58

RCV1: 0,58

(proteína quinasa dependiente de calcio/calmodulina -1 CAMK1): 0,57

SMAD1: 0,57

AMPHIPHYSIN Lab Vision: 0,55

RGS1: 0,55

PSMA4: 0,51

ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa (RPE): 0,51

Paxilina: 0,51

proteína ciclina E2 (Abnova): 0,49

proteína que contiene el domino PDZ 1(PDZK1): 0,47

Ejemplo 5. Espectrometría de masas

10 A. Preparación de muestras por Elución Secuencial de una perla mixta magnética (MMB)

Las muestras de suero se descongelaron y se mezclaron con un volumen igual de tampón Sol B de Invitrogen. Se removió la mezcla y se filtró a través de un filtro de 0,8 m (Sartorius, Goettingen, Alemania) para clarificar y eliminar los residuos antes de más procesamientos. Se llevó a cabo la preparación automática de la muestra en una placa 15 KingFicher® de 96 pocillos (Thermo Fisher, Scientific, Inc., Waltham, MA) utilizando una mezcla de perlas magnéticas Dynal® (Invitrogen) de intercambio aniónico fuerte y Abbott Laboratories (Abbott, Abbott Park, IL) de intercambio catiónico débil. Típicamente las perlas de intercambio aniónico tienen hidrocarbonos basados en aminas-aminas cuaternarias o grupos dietil aminas – como grupos terminales funcionales y las perlas de intercambio catiónico débil típicamente tienen grupos funcionales basados en ácido sulfónico (ácido carboxílico). Las 20 perlas de intercambio catiónico Abbott (perlas CX) estaban en una concentración de 2,5% (masa/volumen) y las perlas de intercambio aniónico fuerte Dynal® (perlas AX) estaban a 10 mg/ml de concentración. Justo antes de la preparación de las muestras, las pelas de intercambio catiónico se lavaron una vez con 20 mM Tris. HCl, pH 7,5,

imagen18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

segundos. La unión a la muestra se llevó a cabo con el ajuste en “lento” durante 5 minutos. Al final de la etapa de unión, se recolectaron las perlas con un “recuento de recolección” de 3 y se transfirieron a la fila C para la primera etapa de lavado (ajuste de liberación = rápido con un tiempo = 10 segundos, ajuste de lavado = medio con un tiempo = 20 segundos). Al final de la primera etapa de lavado, las perlas se recolectaron con “recuento de recolección” de 3 y se transfirieron a la fila D para la segunda etapa de lavado con los mismos parámetros de la primera etapa de lavado. Al final de la segunda etapa de lavado, las perlas se recolectaron una vez más y se transfirieron a la fila E para la tercera y última etapa de lavado como se ha descrito anteriormente. Al final de la tercera etapa de lavado, se pausó el KingFisher® durante la etapa de transferencia de la Fila E a la Fila F y se añadieron 50 ul de acetonitrilo al 70% a la Fila F. Tras la adición de acetonitrilo, se reasumió el proceso. Las perlas recolectadas de la Fila se transfirieron a la Fila F para la etapa de elución (ajuste de liberación = rápido con un tiempo = 10 segundos, ajuste de elución = rápido con un tiempo = 2 minutos). Tras la etapa de elución, las perlas se retiraron y se dispusieron en la Fila G. Todas las muestras se procesaron por duplicado, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5A.

Se utilizó un robot CLINPROT (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA) para preparar las dianas MALDI antes de la interrogación por MS como se ha descrito en la sección anterior con solo mínimas modificaciones en la matriz MALDI que se utilizó. En este caso, en vez de SA se utilizó HCCA (1 mg/ml de HCCA en 40% de ACN /50% de MeOH /10% de agua, v/v/v). Todos los demás parámetros permanecieron igual.

C. Preparación de muestras utilizando el chip SELDI

Se utilizaron los siguientes reactivos:

1.: 100 mM de tampón fosfato, pH 7,0, preparado mezclando 250 ml de agua desionizada con 152,5 ml de solución de fosfato disódico 200 mM y 97,5 ml de solución de fosfato monosódico 200 mM.

2.: 10 mg/ml de solución de ácido sinapínico, preparado disolviendo una cantidad pesada de ácido sinapínico en una suficiente cantidad de una solución preparada mezclando volúmenes iguales de acetonitrilo y un 0,4% de ácido trifluoroacético acuoso (v/v) para dar una concentración final de 10 mg de ácido sinapínico por ml de solución.

3.: El agua desionizada, el ácido sinapínico y ácido trifluoroacético eran de Fluka Chemicals. El acetonitrilo era de Burdick y Jackson.

Las matrices Q10 ProteinChip en la configuración de ocho puntos y los Bioprocesadores utilizados para mantener las matrices en una matriz de 12 x 8 con una huella idéntica a las microplacas de referencia se obtuvieron en Ciphergen. La superficie activa Q10 es un intercambiador aniónico fuerte de amina cuaternaria. Se utilizó un Sistema Ciphergen ProteinChip, un espectrómetro de masas de desorción ionización por láser asistido por matriz con tiempo de vuelo (MALDI) Serie 4000 para analizar los péptidos unidos a la superficie del chip. Todos los productos Ciphergen se obtuvieron en Ciphergen Biosystems, Dumbarton, California.

Todas las transferencias de líquidos, diluciones, y lavados se llevaron a cabo por un pipeteador robótico STAR Hamilton Microlab de la Hamilton Company, Reno, Nevada.

Las muestras de suero se descongelaron a temperatura ambiente y se mezclaron removiendo suavemente. Los viales que contenían la muestra se cargaron en las 24 posiciones de porta muestras en el pipeteador Hamilton; se cargaron cuatro porta muestras con un total de 96 muestras. Se colocaron en la plataforma del pipeteador Hamilton dos bioprocesadores que tenían los chips Q10 (192 puntos en total). Se cargaron los contenedores con tampón fosfato 100 mM y agua desionizada en el pipeteador Hamilton. Las puntas de pipeta desechables se colocaron también en la plataforma del instrumento.

Todo el proceso de las muestras era totalmente automático. Cada muestra se diluyó 1 a 10 en dos alícuotas separadas mezclando 5 microlitros de suero con 45 microlitros de tampón fosfato en dos pocillos separados de una microplaca en la plataforma del pipeteador Hamilton. Los chips Q10 se activaron exponiendo cada punto a dos alícuotas de 150 microlitros de tampón fosfato. Se permitió que el tampón activara la superficie durante 5 minutos a continuación de cada adición. Después de que se aspirara la segunda alícuota de cada punto, se añadieron 25 microlitros de suero diluido en cada punto y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cada muestra se diluyó dos veces con una alícuota simple de cada dilución situada en un punto de un chip Q10. Después de la aspiración del suero diluido, cada punto se lavó cuatro veces con 150 microlitros de tampón fosfato y finalmente con 150 microlitros de agua desionizada. Los chips procesados se secaron con aire y se trataron con ácido sinapínico, la matriz utilizada capacitaba el proceso MALDI en el Ciphergen 4000. La solución matriz de ácido sinapínico se cargó en el pipeteador Hamilton colocando una microplaca de 96 pocillos, con cada pocillo lleno de solución de ácido sinapínico, en la plataforma del instrumento. Se utilizó un pipeteador de 96 cabezas para añadir 1 microlitro de matriz de ácido sinapínico a cada punto en un bioprocesador simultáneamente. Tras un periodo de secado de 15 minutos, se añadió una secunda alícuota de 1 microlitro a cada punto y se dejó secar.

imagen19

enfermos. Todas las muestras se procesaron utilizando un chip Q-10. Todos los espectros se recolectaron utilizando un espectrofotómetro de masas Ciphergen 4000 SELDI-TOF.

Tabla 14a.

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

2322,911: 2339,104 2331 tfa2331 538 0,66 236 0,52

2394,584: 2401,701 2398 tfa2398 538 0,68 236 0,55

2756,748: 2761,25 2759 tfa2759 538 0,65 236 0,60

2977,207: 2990,847 2984 tfa2984 538 0,69 236 0,52

3010,649: 3021,701 3016 tfa3016 538 0,63 236 0,48

3631,513: 3639,602 3636 tfa3635 538 0,61 236 0,54

4188,583: 4198,961 4194 tfa4193 538 0,60 236 0,56

4317,636: 4324,986 4321 tfa4321 538 0,61 236 0,51

5000,703: 5015,736 5008 tfa5008 538 0,70 236 0,57

5984,935: 5990,126 5988 tfa5987 538 0,70 236 0,49

6446,144: 6459,616 6453 tfa6453 538 0,74 236 0,65

6646,05: 6658,513 6652 tfa6652 538 0,72 236 0,71

6787,156: 6837,294 6812 tfa6815 538 0,71 236 0,53

8141,621: 8155,751 8149 tfa8148 538 0,62 236 0,64

8533,613: 8626,127 8580 tfa8579 538 0,71 236 0,58

8797,964: 8953,501 8876 tfa8872 538 0,68 236 0,52

9129,621: 9143,87 9137 tfa9133 538 0,63 236 0,60

12066,33: 12093,36 12080 tfa12079 538 0,66 236 0,63

Tabla 14b.

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

3022,726: 3026,825 3025 acn3024 519 0,63 244 0,51

3144,614: 3182,554 3164 acn3163 519 0,70 244 0,60

3183,395: 3188,023 3186 acn3186 519 0,63 244 0,54

4128,262: 4135,209 4132 acn4132 519 0,61 244 0,59

4152,962: 4161,372 4157 acn4157 519 0,65 244 0,65

4183,519: 4194,373 4189 acn4189 519 0,52 244 0,55

4627,389: 4635,759 4632 acn4631 519 0,74 244 0,68

5049,048: 5114,402 5082 acn5082 519 0,68 244 0,62

5229,648: 5296,428 5263 acn5262 519 0,68 244 0,61

5338,006: 5374,554 5356 acn5355 519 0,64 244 0,52

5375,101: 5383,848 5379 acn5378 519 0,67 244 0,62

5446,925: 5457,382 5452 acn5455 519 0,68 244 0,54

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

5971,68: 5981,476 5977 acn5976 519 0,64 244 0,58

6150,986: 6166,194 6159 acn6158 519 0,63 244 0,54

6314,273: 6338,877 6327 acn6326 519 0,62 244 0,58

6391,206: 6406,112 6399 acn6399 519 0,67 244 0,60

6455,723: 6461,713 6459 acn6458 519 0,56 244 0,65

6574,845: 6607,218 6591 acn6592 519 0,68 244 0,58

6672,509: 6689,568 6681 acn6681 519 0,53 244 0,70

8759,205: 8791,323 8775 acn8775 519 0,64 244 0,58

8850,827: 8888,382 8870 acn8871 519 0,69 244 0,55

9067,056: 9095,468 9081 acn9080 519 0,65 244 0,57

9224,586: 9277,996 9251 acn9251 519 0,64 244 0,59

9358,22: 9384,195 9371 acn9371 519 0,65 244 0,55

9453,639: 9467,414 9461 acn9459 519 0,66 244 0,76

9470,315: 9473,579 9472 acn9471 519 0,70 244 0,71

9651,055: 9674,867 9663 acn9662 519 0,66 244 0,52

10008,34: 10022,51 10015 acn10015 519 0,63 244 0,56

10217,84: 10221,98 10220 acn10216 519 0,64 244 0,55

10669,51: 10689,53 10680 acn10679 519 0,61 244 0,52

10866,73: 10886,56 10877 acn10877 519 0,63 244 0,50

11371,68: 11745,49 11559 acn11559 519 0,63 244 0,68

14293,87: 14346,94 14320 acn14319 519 0,62 244 0,58

22764,38: 22771,69 22768 acn22768 519 0,68 244 0,62

22778,44: 22788 22783 acn22783 519 0,68 244 0,63

22791,38: 23147,21 22969 acn22969 519 0,70 244 0,63

Tabla 14c.

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

2016,283: 2033,22 2025 hic2025 529 0,65 245 0,53

2304,447: 2308,026 2306 hic2306 529 0,64 245 0,66

2444,629: 2457,914 2451 hic2451 529 0,60 245 0,50

2504,042: 2507,867 2506 hic2506 529 0,65 245 0,53

2642,509: 2650,082 2646 hic2646 529 0,54 245 0,45

2722,417: 2733,317 2728 hic2728 529 0,61 245 0,56

2971,414: 2989,522 2980 hic2980 529 0,64 245 0,53

3031,235: 3037,804 3035 hic3035 529 0,54 245 0,45

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

3161,146: 3191,075 3176 hic3176 529 0,70 245 0,61

3270,723: 3280,641 3276 hic3276 529 0,64 245 0,57

3789,504: 3797,883 3794 hic3794 529 0,64 245 0,57

3942,315: 3975,73 3959 hic3959 529 0,74 245 0,59

4999,913: 5006,107 5003 hic5003 529 0,66 245 0,56

5367,59: 5384,395 5376 hic5376 529 0,68 245 0,48

6002,824: 6006,289 6005 hic6005 529 0,69 245 0,51

6181,86: 6195,934 6189 hic6189 529 0,72 245 0,51

6380,634: 6382,272 6381 hic6381 529 0,70 245 0,55

6382,569: 6392,1 6387 hic6387 529 0,71 245 0,54

6438,218: 6461,563 6450 hic6450 529 0,66 245 0,57

6640,279: 6658,057 6649 hic6649 529 0,62 245 0,59

6815,125: 6816,816 6816 hic6816 529 0,72 245 0,56

6821,279: 6823,896 6823 hic6823 529 0,71 245 0,58

8788,878: 8793,595 8791 hic8791 529 0,58 245 0,47

8892,247: 8901,211 8897 hic8897 529 0,61 245 0,52

8908,948: 8921,088 8915 hic8915 529 0,64 245 0,55

9298,469: 9318,065 9308 hic9308 529 0,68 245 0,59

Tabla 14d.

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

2327: 2336 2331 Pub2331 513 0,65 250 0,62

2368: 2371 2369 Pub2369 513 0,64 250 0,60

2384: 2389 2387 Pub2386 513 0,67 250 0,62

2410: 2415 2413 Pub2412 513 0,67 250 0,63

2431: 2435 2433 Pub2433 513 0,72 250 0,72

2453: 2464 2459 Pub2458 513 0,70 250 0,62

2672: 2682 2677 Pub2676 513 0,73 250 0,68

2947: 2955 2951 Pub2951 513 0,72 250 0,64

2973: 2979 2976 Pub2976 513 0,63 250 0,58

3016: 3020 3018 Pub3018 513 0,50 250 0,51

3168: 3209 3189 Pub3188 513 0,69 250 0,59

3347: 3355 3351 Pub3351 513 0,70 250 0,67

3409: 3414 3412 Pub3411 513 0,60 250 0,57

3441: 3456 3449 Pub3448 513 0,72 250 0,58

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

3484: 3503 3494 Pub3493 513 0,72 250 0,67

3525: 3531 3528 Pub3527 513 0,62 250 0,55

3548: 3552 3550 Pub3550 513 0,62 250 0,62

3632: 3650 3641 Pub3640 513 0,63 250 0,57

3656: 3662 3659 Pub3658 513 0,51 250 0,49

3678: 3688 3683 Pub3682 513 0,72 250 0,69

3702: 3709 3706 Pub3705 513 0,57 250 0,55

3737: 3750 3744 Pub3743 513 0,69 250 0,67

3833: 3845 3839 Pub3839 513 0,62 250 0,59

3934: 3955 3944 Pub3944 513 0,65 250 0,57

4210: 4217 4214 Pub4213 513 0,62 250 0,56

4299: 4353 4326 Pub4326 513 0,69 250 0,59

4442: 4448 4445 Pub4444 513 0,61 250 0,52

4458: 4518 4488 Pub4487 513 0,75 250 0,69

4535: 4579 4557 Pub4557 513 0,73 250 0,68

4590: 4595 4592 Pub4592 513 0,70 250 0,66

4611: 4647 4629 Pub4628 513 0,77 250 0,66

4677: 4687 4682 Pub4682 513 0,72 250 0,69

4698: 4730 4714 Push4713 513 0,73 250 0,70

4742: 4759 4751 Pub4750 513 0,76 250 0,73

4779: 4801 4790 Pub4789 513 0,70 250 0,72

4857: 4865 4861 Pub4861 513 0,72 250 0,75

4987: 4996 4992 Pub4991 513 0,67 250 0,57

5016: 5056 5036 Pub5036 513 0,65 250 0,54

5084: 5194 5139 Pub5139 513 0,61 250 0,51

5208: 5220 5214 Pub5213 513 0,57 250 0,52

5246: 5283 5265 Pub5264 513 0,59 250 0,56

5295: 5420 5357 Pub5357 513 0,64 250 0,54

5430: 5537 5484 Pub5483 513 0,62 250 0,54

5570: 5576 5573 Pub5573 513 0,59 250 0,57

5590: 5595 5593 Pub5592 513 0,60 250 0,54

5612: 5619 5615 Pub5615 513 0,55 250 0,53

5639: 5648 5644 Pub5643 513 0,68 250 0,63

5679: 5690 5685 Pub5684 513 0,66 250 0,59

5752: 5804 5778 Pub5777 513 0,71 250 0,63

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

5839: 5886 5862 Pub5862 513 0,73 250 0,67

5888: 5909 5898 Pub5898 513 0,63 250 0,56

6008: 6018 6013 Pub6013 513 0,61 250 0,57

6047: 6058 6053 Pub6052 513 0,64 250 0,63

6087: 6103 6095 Pub6094 513 0,59 250 0,54

6111: 6124 6118 Pub6117 513 0,70 250 0,67

6153: 6160 6156 Pub6156 513 0,57 250 0,51

6179: 6188 6183 Pub6183 513 0,65 250 0,60

6192: 6198 6195 Pub6194 513 0,57 250 0,49

6226: 6272 6249 Pub6249 513 0,66 250 0,63

6277: 6286 6281 Pub6281 513 0,62 250 0,65

6297: 6307 6302 Pub6302 513 0,71 250 0,67

6352: 6432 6392 Pub6391 513 0,65 250 0,56

6497: 6570 6534 Pub6533 513 0,63 250 0,59

6572: 6603 6587 Pub6587 513 0,60 250 0,55

6698: 6707 6702 Pub6702 513 0,57 250 0,52

6715: 6723 6719 Pub6718 513 0,64 250 0,57

6748: 6849 6799 Pub6798 513 0,77 250 0,69

7197: 7240 7219 Pub7218 513 0,73 250 0,65

7250: 7262 7256 Pub7255 513 0,72 250 0,65

7310: 7326 7318 Pub7317 513 0,71 250 0,65

7401: 7427 7414 Pub7413 513 0,73 250 0,69

7435: 7564 7499 Pub7499 513 0,76 250 0,73

7611: 7616 7614 Pub7613 513 0,67 250 0,60

7634: 7668 7651 Pub7651 513 0,70 250 0,63

7699: 7723 7711 Pub7711 513 0,72 250 0,66

7736: 7748 7742 Pub7742 513 0,69 250 0,65

7768: 7782 7775 Pub7775 513 0,63 250 0,57

7935: 7954 7945 Pub7944 513 0,64 250 0,61

7976: 7985 7981 Pub7980 513 0,62 250 0,59

7999: 8006 8003 Pub8002 513 0,58 250 0,60

8134: 8239 8186 Pub8186 513 0,73 250 0,62

8286: 8308 8297 Pub8297 513 0,69 250 0,62

8448: 8461 8455 Pub8454 513 0,61 250 0,59

8476: 8516 8496 Pub8496 513 0,69 250 0,64

ROI
ROI: Promedio ROI Gran cohorte Pequeña cohorte

comienzo m/z: final m/z ROI Nombre nº obs AUC nº obs AUC

8526: 8567 8547 Pub8546 513 0,73 250 0,66

8579: 8634 8606 Pub8606 513 0,80 250 0,70

8640: 8684 8662 Pub8662 513 0,80 250 0,71

8710: 8758 8734 Pub8734 513 0,74 250 0,67

8771: 8781 8776 Pub8776 513 0,56 250 0,59

8913: 8947 8930 Pub8930 513 0,68 250 0,64

8961: 8977 8969 Pub8969 513 0,65 250 0,57

9122: 9162 9142 Pub9142 513 0,66 250 0,66

9199: 9233 9216 Pub9216 513 0,59 250 0,62

9311: 9323 9317 Pub9317 513 0,57 250 0,60

9357: 9370 9364 Pub9363 513 0,58 250 0,63

9409: 9458 9434 Pub9433 513 0,67 250 0,65

9478: 9512 9495 Pub9495 513 0,61 250 0,63

9629: 9667 9648 Pub9648 513 0,62 250 0,64

9696: 9749 9722 Pub9722 513 0,70 250 0,67

9977: 10281 10129 pub10128 513 0,66 236 0,48

10291: 10346 10318 pub10318 513 0,66 236 0,56

10692: 10826 10759 pub10759 513 0,62 236 0,51

10867: 11265 11066 pub11066 513 0,61 236 0,55

11339: 11856 11597 pub11597 513 0,75 236 0,77

12080: 12121 12100 pub12100 513 0,63 236 0,54

12159: 12228 12194 pub12193 513 0,59 236 0,49

12422: 12582 12502 pub12501 513 0,66 236 0,64

12620: 12814 12717 pub12717 513 0,73 236 0,60

12839: 12854 12846 pub12846 513 0,72 236 0,56

13135: 13230 13182 pub13182 513 0,69 250 0,53

13386: 13438 13412 pub13412 513 0,54 250 0,56

13539: 13604 13572 pub13571 513 0,71 250 0,64

14402: 14459 14430 pub14430 513 0,74 250 0,67

15247: 15321 15284 pub15284 513 0,69 250 0,60

15414: 15785 15600 pub15599 513 0,76 250 0,71

15872: 15919 15896 pub15895 513 0,58 250 0,57

16366: 16487 16427 pub16426 513 0,66 250 0,60

16682: 16862 16772 pub16771 513 0,69 250 0,61

16984: 17260 17122 pub17121 513 0,68 250 0,60

imagen20

Grupo D (n=15)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub5036 Pub5139 Pub5264 Pub5357 Pub5483 Pub5573 Pub5593 Pub5615 Pub6702 Pub6718 Pub10759 Pub1066 Pub12193 Pub13412 acn10679 acn10877: 5036 0,65 5139 0,61 5265 0,59 5357 0,64 5484 0,62 5573 0,59 5593 0,6 5615 0,55 6702 0,57 6718 0,64 10759 0,62 11066 0,61 12194 0,59 13412 0,54 acn10679 0,61 acn10877 0,62 0,71 0,81 0,79 0,85 0,87 0,8 0,78 0,77 0,79 0,73 0,77 0,84 0,79 0,78 0,73 0,77

Grupo E (n=6)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub6391 Pub6533 Pub6587 Pub6798 Pub9317 Pub13571: 6392 0,65 6534 0,63 6587 0,6 6799 0,76 9317 0,57 13571 0,71 0,9 0,9 0,87 0,85 0,7 0,67

Grupo F (n=8)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub7218 Pub7255 Pub7317 Pub7413 Pub7499 Pub7711 Pub14430 Pub15599: 7219 0,73 7255 0,72 7318 0,71 7414 0,73 7499 0,76 7711 0,72 14430 0,74 15600 0,76 0,82 0,73 0,88 0,81 0,84 0,76 0,77 0,82

Grupo G (n=7)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub8496 Pub8546 Pub8606 Pub8662 Pub8734 Pub17121 Pub17338: 8496 0,69 8547 0,73 8606 0,8 8662 0,79 8734 0,74 17122 0,68 17339 0,81 0,78 0,88 0,84 0,77 0,45 0,78 0,54

Grupo H (n=3)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub6249 Pub12501 Pub12717: 6249 0,66 12502 0,66 12717 0,73 0,82 0,87 0,87

Grupo I (n=5)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub5662 Pub5777 Pub5898 Pub11597 acn11559: 5662 0,73 5777 0,71 5898 0,63 11597 0,75 acn11559 0,63 0,93 0,92 0,89 0,93 0,84

Grupo J (n=5)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub7775 Pub7944 Pub7980 Pub8002 Pub15895: 7775 0,63 7944 0,64 7980 0,62 8002 0,58 15895 0,58 0,39 0,83 0,72 0,77 0,75

Grupo K (n=4)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub17858 Pub18422 Pub18766 Pub18986: 17858 0,81 18422 0,13 18766 0,69 18986 0,65 0,84 0,92 0,89 0,91

Grupo L (n=12)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub3018 Pub3640 Pub3658 Pub3682 Pub3705 Pub3839 hic2451 hic2646 hic3035 tfa3016 tfa3635 tfa4321: 3018 0,5 3640 0,62 3658 0,51 3682 0,72 3705 0,57 3839 0,62 hic2451 0,6 hic2646 0,54 hic3035 0,54 tfa3016 0,63 tfa3635 0,61 tfa4321 0,61 0,78 0,82 0,81 0,77 0,79 0,75 0,78 0,7 0,72 0,78 0,78 0,74

Grupo M (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub2331 tfa2331: 2331 0,65 tfa2331 0,66 0,9 0,9

Grupo N (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub4557 Pub4592: 4557 0,73 4592 0,71 0,81 0,81

Grupo O (n=6)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

acn4631 acn5082 acn5262 acn5355 acn5449 acn5455: acn4631 0,74 acn5082 0,68 acn5262 0,68 acn5355 0,64 acn5449 0,7 acn5455 0,68 0,81 0,85 0,9 0,87 0,88 0,88

Grupo P (n=6)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

acn6399 acn6592 acn8871 acn9080 acn9371 acn9662: acn6399 0,67 acn6592 0,68 acn8871 0,69 acn9080 0,65 acn9371 0,65 acn9662 0,66 0,78 0,8 0,79 0,84 0,83 0,79

Grupo Q (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

acn9459 acn9471: acn9459 0,66 acn9471 0,7 0,91 0,91

Grupo R (n=4)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

hic2506 hic2980 hic3176 tfa2984: hic2506 0,65 hic2980 0,64 hic3176 0,69 tfa2984 0,69 0,82 0,87 0,8 0,78

Grupo S (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

hic2728 hic3276: hic2728 0,61 hic3276 0,64 0,81 0,81

Grupo T (n=6)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

hic6381 hic6387 hic6450 hic6649 hic6816 hic6823: hic6381 0,7 hic6387 0,71 hic6450 0,66 hic6649 0,62 hic6816 0,72 hic6823 0,71 0,83 0,84 0,81 0,73 0,81 0,79

Grupo U (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

hic8791 hic8897: hic8791 0,58 hic8897 0,61 0,8 0,8

Grupo V (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

tfa6453 tfa6652: tfa6453 0,74 tfa6652 0,72 0,84 0,84

Grupo W (n=2)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

hic6005 hic5376: hic6005 hic5376 0,69 0,68 0,74 0,74

Grupo X (n=3)

Nombre de ROI: Miembros AUCs Coef. Corr.

Pub4713 Pub4750 Pub4861: 4714 4751 4861 0,73 0,76 0,72 0,83 0,66 0,65

Ejemplo 6. Análisis multivariado de biomarcadores utilizando análisis discriminatorio, análisis de árboles de decisión y análisis de componente principal

5 Se llevaron a cabo los análisis multivariados en los biomarcadores del inmunoensayo y las Regiones de Interés. Todos los diferentes análisis se llevaron a cabo utilizando el paquete estadístico JMP. Para simplificar, los análisis discriminatorios (DA), el análisis de componente principal (PCA) y árboles de decisión (DT) se denominan en general en el presente documento métodos multivariados (MVM). Es digno de mención que en el PCA solo se extrajeron los

10 primeros 15 componentes principales, que supone más del 90% de la variabilidad total en los datos. Los factores de carga y/o comunitarios se utilizaron para extraer solamente el único factor (biomarcador) que contribuía a la mayoría de cada componente principal. Como el cuadrado de cargas del factor reflejan la contribución relativa de cada factor en cada componente principal, se utilizaron estos valores como base para seleccionar el marcador que contribuía con la mayoría de cada componente principal. Así, se extrajeron 15 factores (biomarcadores) que contribuían a la

15 mayoría de los 15 componentes principales. En el DA, el proceso de marcadores de selección se llevó a cabo hasta que la adición de más marcadores no tenía efecto en el resultado de la clasificación. En general, el DA se utilizó entre 5 y 8 marcadores. En el caso de los DT, se construyeron y evaluaron árboles de 6 nodos con aproximadamente 5 biomarcadores.

20 Los biomarcadores se evaluaron utilizando métodos de validación bien establecidos de bootstrapping y dejar uno fuera (Richard O. Duda et al. In Pattern Classification , 2ª Edición, pp. 485, Wiley-Interscience (2000)). Se utilizó un proceso de entrenamiento de 10 veces para identificar los biomarcadores robustos que se muestran regularmente. Los biomarcadores robustos se definieron como los marcadores que emergen en al menos un 50% de los grupos de entrenamiento. Por tanto, los biomarcadores con una frecuencia mayor o igual a 5 en nuestro proceso de

25 entrenamiento de diez veces se seleccionaron para posterior evaluación. La Tabla 16 a continuación resume los

biomarcadores que mostraban regularidad en cada método en cada cohorte.

La estrategia de descubrimiento de biomarcadores que utiliza varios métodos estadísticos ofrece una ventaja distintiva proporcionando un repertorio más amplio de biomarcadores candidatos (Figura 1). Mientras que algunos 5 métodos tales como DA y PCA funcionan bien con datos distribuidos normalmente, otros métodos no paramétricos tales como la regresión logística y los árboles de decisión funcionan mejor con datos que están separados, distribuidos no uniformemente o tienen variaciones extremas. Tal estrategia es ideal cuando los marcadores (tales como biomarcadores y parámetros biométricos) de diversas fuentes (espectrometría de masas, inmunoensayos, historia clínica, etc.) se van a combinar en un panel único aunque los marcadores pueden estar o no distribuidos

10 normalmente en la población.

Tabla 16. Marcadores identificados utilizando análisis multivariado (MVM). Solamente los marcadores que se muestran al menos un 50% de las veces se seleccionaron para consideración posterior. En la Tabla, no hay diferencias entre “x” y “X”.

pequeña cohorte: gran cohorte

AUC: Marcadores superiores DA PCA DT AUC Marcadores superiores DA PCA DT

1: 0.76 acn9459 x 1 0.81 pub17858 x x

2: 0.75 pub4861 x x 2 0.81 pub17338 x

3: 0.66 CEA x 3 0.8 pub8606 x

4: 0.65 pub9433 x 4 0.72 pub4861 x x

5: 0.64 pub9648 x 5 0.69 pub3743 x x

6: 0.64 pub2951 x 6 0.67 acn6399 x

7: 0.63 pub6052 x 7 0.66 tfa2331 x

8: 0.6 tfa2759 x 8 0.65 pub9433 x

9: 0.6 tfa9133 x 9 0.58 acn6592 x

10: 0.59 acn4132 x 10 0.56 pub4213 x

11: 0.58 acn6592 x 11 0.55 acn9371 x

12: 0.57 pub7775 x Total 4 6 4

13: 0.56 pub4213 x

14: 0.55 acn9371 x

Total: 6 6 3

15 Ejemplo 7. Método de división y puntuación (en adelante “SSM”)

A. Método de división y puntuación (SSM) mejorado

20 El Software interactivo que implementa el punto de división (punto de corte) del método de puntuación descrito por Mor et al. (véase, PNAS, 102(21):7b77 (2005)) se ha escrito para ejecutarse bajo Microsoft® Windows. Este software lee las hojas de cálculo de Microsoft® Excel que son los vehículos naturales para guardar los resultados del análisis del marcador (biomarcadores y parámetros biométricos) para un grupo de muestras. Los datos se pueden guardar en una única hoja de datos con un campo para designar la enfermedad de la muestra, se puede guardar en

25 dos hojas de cálculo, una para muestras enfermas y la otra para muestras no enfermas, o en cuatro hojas de cálculo, un par para muestras de entrenamiento, enfermas y no enfermas y el otro par para las muestras de ensayo, enfermas y no enfermas. En los primeros dos casos, el usuario puede utilizar el software para generar automáticamente aleatoriamente pares de entrenamiento y de ensayo de la entrada. En el caso final, se pueden leer múltiples archivos Excel una vez y analizarse en una sola ejecución.

30 El software presenta una lista de todos los marcadores recolectados en los datos. El usuario selecciona un grupo de marcadores de esta lista para utilizarlo en los análisis. El software calcula automáticamente puntos de división (puntos de corte) para cada marcador de los grupos de datos de entrenamiento enfermos y no enfermos así como determina si el grupo de enfermos está aumentado o disminuido con respecto al de no enfermos. El punto de

35 división (punto de corte) se elige para maximizar la precisión de cada marcador único. Los puntos de corte (o puntos

imagen21

imagen22

Incluyendo el parámetro biométrico de paquetes-años mejoraba la precisión predictiva de estos biomarcadores en casi el 5%. Por tanto, la precisión del panel de los 8 biomarcadores y 1 parámetro biométrico con un umbral de 4 o mayor como resultado positivo, alcanzaba un promedio del 69,6% (AUC 0,75) en los 10 grupos de ensayo de la pequeña cohorte.

Tabla 18. Puntos de división (puntos de corte) calculados para cada inmunoensayo de marcador individual utilizando el algoritmo SSM

pequeña cohorte: gran cohorte

Prom. punto de división (punto de corte predeterminado): Dev.est. Prom. punto de división (punto de corte predeterminado) Dev.est. grupo control

CEA: 4,82 0 9,2 0 norm <= punto de división

CK 19: 1,89 0,45 2,9 0,3 norm <= punto de división

CA125: 13,65 8,96 26 2,6 norm <= punto de división

CA15-3: 13,07 3,39 20,1 2,6 norm <= punto de división

CA19-9: 10,81 11,25 41,1 18,5 norm <= punto de división

SCC: 0,92 0,11 1,1 0,1 norm <= punto de división

proGRP: 14,62 8,53 17,6 0 norm <= punto de división

CK-18: 57,37 2,24 67,2 9,5 norm <= punto de división

parainfluenza: 103,53 32,64 79,2 9,8 norm >= punto de división

Pack-yrs: 30 30 Norm <= punto de división

B. SSM de biomarcadores y parámetros biométricos seleccionados por ROC/AUC

10 Al contrario que en el Ejemplo 6, en el que se identificaban supuestos marcadores utilizando métodos estadísticos multivariados, se utilizó en este caso un método no paramétrico que implicaba análisis ROC/AUC para identificar los supuestos biomarcadores. Aplicando este método, se escogieron marcadores individuales con actuación clínica aceptable (AUC > 0,6) para análisis posteriores. Solamente los 15 biomarcadores superiores y el parámetro

15 biométrico (paquetes años) se seleccionaron y se llamó a los grupos los grupos 16AUC (pequeño y grande) de aquí en adelante. Estos marcadores se enumeran en la Tabla 19 a continuación.

Tabla 19. Los 15 biomarcadores superiores y un parámetro biométrico (paquetes años)

gran cohorte: pequeña cohorte

Marcador: nº obs AUC Marcador nº obs AUC

pub17338: 513 0,813 pub11597 236 0,766

pub17858: 513 0,812 acn9459 244 0,761

pub8606: 513 0,798 pub4861 250 0,75

pub8662: 513 0,796 pack-yrs 257 0,739

pub4628: 513 0,773 pub4750 250 0,729

pub6798: 513 0,765 pub7499 250 0,725

pub7499: 513 0,762 pub2433 250 0,719

pub4750: 513 0,76 CK 19 248 0,718

pub15599: 513 0,757 pub4789 250 0,718

pub11597: 513 0,751 pub17338 250 0,718

pub4487: 513 0,747 pub8662 250 0,713

gran cohorte: pequeña cohorte

Marcador: nº obs AUC Marcador nº obs AUC

tfa6453: 538 0,744 acn9471 244 0,712

Paquetes años: 249 0,741 pub15599 250 0,711

pub8734: 513 0,741 tfa6652 236 0,71

pub14430: 513 0,741 pub8606 250 0,703

hic3959: 529 0,741 acn6681 244 0,703

Las combinaciones optimizadas (paneles) de la pequeña cohorte de 16AUC se determinaron utilizando el SSM de cada uno de los 10 subgrupos de entrenamiento. Este proceso se hizo tanto en ausencia (Tabla 20a) como en presencia (Tabla 20b) del parámetro biométrico de historia de fumador (paquetes años) utilizando el SSM. Así, se 5 introdujeron las variables de los 15 biomarcadores (excluyendo el parámetro biométrico pack-yrs) o los 15 biomarcadores y el 1 parámetro biométrico (paquetes años) (el 16 AUC) para el método de división y puntuación. Se determinó el panel óptimo de cada uno de los 10 grupos de entrenamiento basándose en la precisión total. Cada panel se ensayó contra las muestras remanentes sin ensayar y se registró las características estadísticas. Se compararon entonces los 10 paneles y se anotó la frecuencia de cada biomarcador. El proceso se ejecutó dos 10 veces, incluyendo y excluyendo el biométrico paquetes años. Los resultados de estos dos procesos se presentan en las Tablas 20a y 20b a continuación. Una vez más, los marcadores robustos con una frecuencia mayor o igual a 5 se seleccionaron para posteriores consideraciones. El proceso se repitió en la gran cohorte y los resultados se presentan en la Tabla 20c. Las Tablas 20a y 20b contenían una lista parcial de los resultados SSM de la pequeña cohorte, mostrando la frecuencia de los marcadores para a) los biomarcadores 15 AUC solos y b) los biomarcadores

15 15 AUC y el parámetro biométrico packyrs. Se señala que en la primera tabla (20a) solo 5 marcadores tienen frecuencias mayores o iguales a 5. En la tabla 20b, 7 marcadores cumplían ese criterio. La Tabla 20c contiene una lista parcial de los resultados SSM de la gran cohorte que muestra la frecuencia de los marcadores de los marcadores 15 AUC. Se señala que 11 marcadores tienen frecuencias mayores o iguales a 5.

20 Tabla 20a.

Grupo de entrenamiento nº: CK 19 pub4789 acn9459 Pub11597 tfa6652 pub2433 pub4713

1: x x x x

2: x x x x x

3: x x x x

4: x x x x

5: x x x x

6: x x x x

7: x x x x x

8: x x x x x x

9: x x x x x

to: x x x x x

Frecuencia: 10 10 9 6 5 3 3

Tabla 20b. Tabla 20c.

Grupo de entrenamiento nº: acn 9459 CK 19 packyrs Pub 11597 pub 4789 pub 2433 pub 4861 tfa 6652 acn 9471

1: x x x x x

2: x x x x x x

3: x x x x x x

4: x x x x x x x x

5: x x x x x x

6: x x x x x

7: x x x x x x x

8: x x x x x x

9: x x x x x x

10: x x x x x x

Frecuencia: 10 9 9 8 7 5 5 4 4

Grupo de entrenamiento nº: pub 11597 pub 4487 pub 17338 pub 8606 Pub 6798 Tfa 6453 pub 4750 hic 3959 pub 8662 pub 4628 pub 17858

1: x x x x x x x

2: x x x x x x x x x

3: x x x x x x x x

4: x x x x x

5: x x x x x x x x x

6: x x x x x x x x x

7: x x x x x x x x x

8: x x x x x x

9: x x x x x x

10: x x x x x x x x x x

Frecuencia: 10 9 7 7 7 7 7 7 6 6 5

C. SSM de biomarcadores seleccionados por MVM

5 Un ejemplo de un método multivariado es el análisis en árbol de decisión. Los biomarcadores utilizando el análisis en árbol de decisión solo se tomaron en conjunto y se utilizaron en el SSM. Este grupo de biomarcadores demostraron una utilidad clínica similar al grupo de biomarcadores llamado 16 AUC. Como ejemplo, el grupo de ensayo 1 (de 10) tenía una AUC de 0,90 (ensayo) sin el parámetro biométrico paquetes años, y 0,91 (ensayo) con el

10 parámetro biométrico paquetes años.

Los biomarcadores DT se combinaron con marcadores identificando que utilizaban PCA y DA para generar el grupo MVM. El grupo 14MVM se evaluó con y sin el parámetro biométrico de historia de fumador (paquetes años) utilizando el SSM. Una vez más, los marcadores robustos con una frecuencia mayor o igual a 5 se seleccionaron 15 para posterior consideración (resultados no mostrados). Como se puede ver en las tablas anteriores, los paquetes años (historia de fumador) tiene un efecto en el número y tipo de biomarcadores que emergen como biomarcadores robustos. Esto no es totalmente inesperado ya que algunos biomarcadores pueden tener efectos sinérgicos o perjudiciales sobre otros biomarcadores. Un aspecto de la invención implica el hallazgo de los marcadores que funcionan juntos como un panel mejorando la capacidad predictiva del modelo. Siguiendo la misma línea, los

20 biomarcadores que se identificaron que funcionaban sinérgicamente con el parámetro biométrico paquetes años en ambos métodos (AUC y MVM) se combinaron en un esfuerzo para identificar un panel superior de marcadores (véase el Ejemplo 8D).

Los marcadores multivariados identificados en la gran cohorte se evaluaron con el SSM. Una vez más, solo se 25 seleccionaron los marcadores con frecuencias mayores o iguales a 5 para posterior consideración. La Tabla 21 a continuación resume los resultados SSM para la gran cohorte.

Tabla 21. Lista parcial de los resultados SSM de la gran cohorte que muestra la frecuencia de los marcadores de los marcadores 11MVM. Se señala que 7 marcadores tienen frecuencias mayores o iguales a 5.

Grupo de entrenamiento nº: pub 3743 pub 4861 pub 8606 Pub 17338 pub 17858 acn 6399 tfa 2331

1: x x x x x x

2: x x x x x x

3: x x x x x

4: x x x x x

5: x x x x x

6: x x x x x

7: x x x x x x x

8: x x x x

9: x x x x x x

10: x x x x x

Frecuencia: 10 9 9 8 6 6 5

D. SSM de marcadores combinados (AUC + MVM + paquetes años)

5 En una etapa posterior, todos los marcadores (biomarcadores y parámetros biométricos) con frecuencias mayores o iguales a 5 (en los 10 grupos de entrenamiento) se combinaron para producir una segunda lista de marcadores que contenían marcadores de ambos grupos AUC y MVM para ambas cohortes. De los resultados SSM, se seleccionaron 16 únicos marcadores únicos de la pequeña cohorte y 15 marcadores únicos de la gran cohorte con 10 frecuencias mayores o iguales a cinco. La tabla 22 siguiente resume los marcadores que se seleccionaron.

Tabla 22. Marcadores combinados para ambos grupos AUC y MVM

pequeña cohorte: gran cohorte

AUC: Marcadores 16AUC 14MVM AUC Marcadores 15AUC 11MVM

1: 0,77 Pub11597 x 1 0,813 Pub17338 x x

2: 0,76 Acn9459 x x 2 0,812 pub17858 x x

3: 0,75 Pub4861 x x 3 0,798 pub8606 x x

4: 0,74 packyrs x x 4 0,796 pub8662 x

5: 0,72 Pub2433 x 5 0,773 pub4628 x

6: 0,72 CK 19 x 6 0,765 pub6798 x

7: 0,72 Pub4789 x 7 0,76 pub4750 x

8: 0,71 Tfa6652 x 8 0,751 pub11597 x

9: 0,66 cea x 9 0,747 pub4487 x

10: 0,64 Pub2951 x 10 0,744 tfa6453 x

11: 0,63 Pub6052 x 11 0,741 hic3959 x

12: 0,6 Tfa2759 x 12 0,72 pub4861 x

13: 0,6 Tfa9133 x 13 0,69 pub3743 x

14: 0,59 Acn4132 x 14 0,67 acn6399 x

15: 0,58 Acn6592 x 15 0,66 tfa2331 x

16: 0,57 Pub7775 x Total 11 7

imagen23

respecto al punto de división (punto de corte). Como un ejemplo, en la Citoqueratina 19, el grupo normal o el grupo control (no canceroso) es menor o igual que el valor 1,89 del punto de división /punto de corte).

Ejemplo 9. Validación de los modelos predictivos

5 Los subgrupos de la lista de 13 biomarcadores y parámetros biométricos de la pequeña cohorte (véase la Tabla 23a anterior) proporciona una buena utilidad clínica. Por ejemplo, los 8 biomarcadores y parámetros biométricos más frecuentes usados juntos en un panel en el método de división y puntuación tienen una AUC de 0,90 para el subgrupo de ensayo 1 (véase la Tabla 23b anterior).

10 Los modelos predictivos comprendían un panel de 7 marcadores (marcadores 1-7, Tabla 23b) y un panel de 8 marcadores (marcadores 1-8, Tabla 23b) se validaron utilizando 10 grupos de ensayo aleatorios. Las Tablas 24a y 24b a continuación resumen los resultados de los dos modelos. Todas las condiciones y parámetros de cálculo eran idénticos en ambos casos con la excepción del número de marcadores en cada modelo.

15 Tabla 24a.

Grupo de entrenamiento nº: AUC Precisión (%) Sensibilidad (%) Especificidad (%) Nº de Marcadores Umbral

1: 0,91 85 80,7 90,7 7 3

2: 0,92 85 78,2 93,3 7 3

3: 0,89 80 78,8 82,4 7
3

4: 0,89 82 78,0 86,0 7 3

5: 0,90 85 78,7 90,6 7 3

6: 0,89 83 76,9 89,6 7 3

7: 0,92 86 78,4 93,9 7 3

8: 0,89 83 79,6 87,0 7 3

9: 0,91 84 79,6 89,1 7 3

10: 0,92 86 81,8 91,1 7 3

Prom,: 0,90 83,9 79,1 89,4

Desv. Est.: 0,01 1,9 1,4 3,5

La Tabla 24b muestra la actuación clínica del panel de 7 marcadores con diez grupos de ensayo aleatorios. Los 7 marcadores y los puntos de división (puntos de corte) que se usaron en los cálculos se dieron en la Tabla 16b. Se

20 utilizó un valor umbral de 3 para separar el grupo enfermo del grupo no enfermo. El promedio del AUC para el modelo es 0,90, que se corresponde con un promedio de precisión del 83,9% y una sensibilidad y especificidad del 79,1% y 89,4% respectivamente.

Tabla 24b.

Grupo de entrenamien to nº: AUC Precisión (%) Sensibilidad (%) Especificidad (%) Nº de Marcadores Umbral

1: 0,90 81 91,2 67,4 8 3

2: 0,91 86 92,7 77,8 8 3

3: 0,89 83 90,9 67,6 8
3

4: 0,89 83 90,0 76,0 8 3

5: 0,91 83 91,5 75,5 8 3

6: 0,90 83 88,5 77,1 8 3

7: 0,92 88 92,2 83,7 8 3

8: 0,90 85 92,6 76,1 8 3

imagen24

imagen25

Tabla 25b.

pequeña cohorte

Marcadores: Modelo mezclado 6 Modelo mezclado 7 Modelo mezclado 8 Modelo mezclado 9 Modelo mezclado 10A Modelo mezclado 10B

CK 19: x x x x

CA 19-9

CEA: x x x x x

CA15-3

CA125: x x x

SCC: x x x

CK 18: x x x x

ProGRP: x x x

Parainflu

Packyrs: x x x

Acn9459: x x x x x

Pub11597: x x x x x x

Pub4789: x x x x x

TFA2759: x x x x x

TFA9133: x

pub3743: x

pub8606: x

pub4487: x

pub4861: x

pub6798: x

tfa6453: x

hic3959: x

Umbral*: 3/8 2/6 3/8 3/10 3/11 4/11

AUC: 0,90 (0,01)

Precisión: 80,2 (1,7)

Sensibilidad: 92,6 (2,0) 87,8 (2,3) 88,2 (3,3) 89,1 (3,4) 94,3 (1,2) 86,6 (4,40

Especificidad: 65,5 (2,7) 63,7 (4,9) 64,2 (3,7) 52,3 (3,9) 47,6 (4,9) 63,9 (4,0)

DFI: 0,35 0,38 0,38 0,49 0,53 0,39

*Puntuación total predeterminada. Las Tablas 25a y b. Resumen varios modelos predictivos.

De manera similar, se pueden optimizar varios modelos predictivos para la gran cohorte en cuento a la precisión, sensibilidad, o especificidad. Se resumen cuatro modelos potenciales en la Tabla 26 a continuación.

Tabla 26. Cuatro modelos potenciales

gran cohorte

Marcadores: Modelo 1 MS Modelo 2 MS Modelo 3 MS Modelo MS 4

acn6399: x x x x

pub3743: x x x x

pub8606: x x x x

pub11597: x x x x

tfa6453: x x x x

pub4487: x x x x

pub4861: x x x

pub6798: x x

hic3959: x

Umbral*: 3/9 3/8 3/7 2/6

AUC

Precisión: 75,7 (2,6) 80,0 (2,0) 84,2 (1,7) 78,9 (2,6)

Sensibilidad: 95,1 (2,0) 89,7 (2,6) 80,7 (4,4) 88,5 (4,0)

Especificidad: 67,7 (3,1) 76,0 (2,2) 85,7 (1,4) 74,9( 2,7)

DFI: 0,33 0,26 0,24 0,28

*Puntuación Total predeterminada. En la Tabla anterior, no hay diferencia entre "x" y "X".

De manera similar, los modelos predictivos de la cohorte de ciclina (subgrupo de individuos con anticuerpos medidos anti-proteína ciclina E2 y anticuerpos anti-péptido ciclina E2) se resumen en las Tablas 27a y 27b a continuación.

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

De manera similar, los modelos predictivos que utilizan anticuerpos se resumen en la Tabla 28 a continuación. Tabla 28. Modelos predictivos utilizando ensayos de autoAc.

Marcadores: Modelo Aab1 Modelo Aab2

TMP21: x x

NPC1L1C-domain: x x

CCNE2BM-E2-1: x x

TMOD1: x x

CAMK1: x x

RGS1: x x

PACSIN1: x x

p53: x x

RCV1: x

MAPKAPK3: x x

Umbral*: 1/10 1/9

Precisión: 82 82,9

Sensibilidad: 74,7 73,5

Especificidad: 86,4 88,4

DFI: 0,29 0,29

*Puntuación Total predeterminada.

Cinco de estos modelos se utilizaron contra la cohorte de validación. La Tabla 29 a continuación resume la actuación clínica para cada uno de los modelos predictivos para las cohortes independientes, pequeña cohorte y cohorte de validación.

Tabla 29.

Modelo Mezclado 7: Modelo Mezclado 1 Modelo 8 IA Modelo MS 5 Modelo Mezclado 9

CK 19: x x x x

CEA: x x x x

CA19-9: x

CA15-3: x

CA125: x x

SCC: x x

CK 18: x x

proGRP: x x

parainfluenza

acn9459: x x x

pub11b97: x x x x

pub4789: x x x

tfa2759: x x x

tfa9133: x

pub3743: x

pub8606: x

pub4487: x

pub4861: x

pub6798: x

tufa6453: x

hic3959: x

pack-yrs

Umbral*: 2/6 2/7 1/8 3/8 3/10

Pequeña Cohorte

AUC

Precisión

Sensibilidad: 87,8 91,3 90,2 88,2 89,1

Especificidad: 63,7 42,7 30,0 64,2 52,3

DFI: 0,38 0,58 0,71 0,38 0,49

Cohorte de Validación

AUC

Precisión

Sensibilidad: 75,6 87,2 94,2 82,5 88,4

Especificidad: 62,9 55,7 35,2 86,0 58,6

DFI: 0,44 0,46 0,65 0,22 0,43

Ejemplo 10. Identificación de biomarcadores

5 A. Fraccionamiento HPLC

Con el fin de obtener la identidad de los candidatos del biomarcador MS de la Tabla 22, era necesario fraccionar primero las muestras de suero agrupadas y/o individuales por HPLC de fase inversa utilizando protocolos de referencia. La obtención de material suficiente para la electroforesis en gel y para los análisis MS se necesitan varios

10 ciclos de fragmentación. Las fracciones individuales se perfilaron por MS MALDI-TOF y las fracciones que contenían los picos de interés se agruparon juntos y se concentraron en un speedvac. Todos los otros biomarcadores candidatos se procesaron como se ha descrito anteriormente.

La Figura 2 muestra un supuesto marcador (pub 11597) antes y después de la concentración. Se señala que el

15 biomarcador candidato de 11 kDa en la muestra de inicio está muy diluido. Tras la concentración la intensidad es más alta pero la muestra no es suficientemente pura para el análisis y se necesita una posterior separación por SDS-PAGE con el fin de aislar el biomarcador de interés.

B. Digestión en gel y análisis LC-MS/MS

20 Tras la concentración, las fracciones que contienen los biomarcadores candidatos se sometieron a SDS-PAGE para aislar el péptido/proteína deseados que tiene una masa molecular que corresponde al biomarcador candidato. Se llevó a cabo la electroforesis en gel (SDS-PAGE) utilizando la metodología de referencia proporcionada por el fabricante (Invitrogen, Inc.). En resumen, el procedimiento implica la carga de muestras que contienen los

25 biomarcadores candidatos y proteínas de referencia de masa molecular conocida en diferentes pocillos en el mismo gel como se muestra en la Figura 3. Comparando las distancias de migración de las proteínas de referencia con las de la muestra “desconocida”, se identifica la banda con masa molecular deseada y se escinde del gel.

La banda de gel escindida se sometió entonces a digestión automática tríptica en gel utilizando una estación Waters MassPREP™. Posteriormente, la muestra digerida se extrajo del gel y se sometió a ESI-LC-MS/MS de fase inversa 5 en línea. El espectro del producto iónico se utilizó entonces para la búsqueda en la base de datos. Si era posible, la proteína identificada se obtenía comercialmente y se sometía a SDS-PAGE y digestión en gel como se ha descrito previamente. La coincidencia en la electroforesis en gel, los resultados MS/MS y la búsqueda en la base de datos entre las dos muestras daba más pruebas de que el biomarcador se había identificado correctamente. Como se puede ver en la Figura 3, hay una buena coincidencia entre el amiloide sérico A humano (HSAA) disponible

10 comercialmente y el supuesto biomarcador en la muestra fraccionada a 11,5 kDa. El análisis MS/MS y la búsqueda en la base de datos confirmaron que ambas muestras eran la misma proteína. La Figura 4 mostró que los espectros MS/MS del biomarcador candidato Pub 11597. La secuencia de aminoácidos derivado de los iones b e y se anotaron en la parte superior de cada panel. El biomarcador candidato se identificó como un fragmento de la proteína del amiloide sérico humano (HSAA).

15 Los biomarcadores candidatos pequeños que no son adecuados para la digestión se sometieron a ESI-q-TOF y/o fragmentación MALDI-TOF-TOF seguida de la secuenciación de novo y la búsqueda en la base de datos (BLAST) para obtener información de la secuencia y el ID de la proteína.

20 C. Búsqueda en la base de datos e ID de la proteína

Con el fin de caracterizar completamente los biomarcadores candidatos era imperativo identificar las proteínas de las que se derivaron. La identificación de proteínas desconocidas implicaba la digestión en gel seguido por espectrometría de masas en tándem seguido por la secuenciación de novo y la búsqueda en la base de datos de los

25 fragmentos trípticos. Los productos iónicos resultantes del proceso MS/MS se buscaron en la base de datos de proteínas SwissProt para identificar la proteína fuente. Para los biomarcadores candidatos que tenían bajas masas moleculares, la espectrometría de masas en tándem seguida por la secuenciación de novo y la búsqueda en la base de datos era el método de elección para identificar la proteína fuente. Las búsquedas se consideraban solo del genoma de Homo sapiens y con precisiones de masa de  1,2 Da para iones precursores y  0,8 Da para los

30 productos iónicos (MS/MS). Solamente se permitió una escisión omitida por tripsina. Las únicas dos modificaciones variables permitidas para las búsquedas en la base de datos eran las carbamidometilación (C) y la oxidación (M). Se asignó un ID final de proteína tras el reconocimiento con la maquinaria de búsqueda Mascot resultante y la interpretación manual de los espectros de MS y MS/MS relacionados. La precisión de los resultados se verificó mediante mediciones replicadas.

35 Tabla 30

Marcador candidato: Nº de registro Nombre de la Proteína Secuencia peptídica observada Prom. de PM (Da)

Pub11597: Q6FG67 Proteína A Amiloide Humana SFFSFLGRAFDGARDMWRAYSDMRFA NYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGA WAAEVISDAREN IQRFFGHGAEDSLAD QAANFWGRSGKDPNHFRPAGLPEKY (SEQ ID NO: 7) 11526,51

ACN9459: P02656 ApoCIII1 SEAEDASLLSFMQGYMKIIATKTAKDA LSSVQRSQVAQQARGWVTDGFSSLKD YWSTVKDKFSEFWDLDPEVRP *(T) SAVAA(SEQ ID NO: 8) *(sitio Glicosilado) 9421,22

TFA9133: P02656 ApoCIII1 ApoCIII1 tras la pérdida de ácido siálico 9129,95

Pub4789: P01009 alfa-1 antitripsina LHAIPMSIPPEVKFN *(E) PFVFLMTDQ NTKSPLFMGKVVNPTQK (SEQ ID NO: 8) *(posible sustitución de K por E) 4776,69

TFA2759: Q56G89 Péptido Albúmina Humana DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL (SEQ ID NO: 10) 2754,10

La Tabla 30 anterior da la proteína fuente de los varios biomarcadores candidatos con su ID proteico. Los marcadores se identificaron por digestión en gel y LC-MS/MS y/o secuenciación de novo. Se señala que solo las 40 secuencias de aminoácidos de los fragmentos observados se muestran y el promedio de PM incluye el PTM donde se indica. Los números de registro se obtuvieron de la base de datos SwissProt y se dan solamente como referencia. Es interesante señalar que ACN9459 y TFA9133 eran los mismos fragmentos proteicos con la excepción

de que el último había perdido un ácido siálico (-291,3 Da) del resto glucosilado. Tanto ACN9459 y TFA9133 se identificaron como una variante de la apolipoproteína CIII. Los hallazgos de los investigadores concuerdan con la secuencia conocida publicada y la masa molecular de esta proteína (Bondarcnko et. al, J. Lipid Research, 40:543555 (1999)). El Pub4789 se identificó como la proteína alfa-1-antitripsina. El examen minucioso del espectro del producto iónico sugiere que podía haber una sustitución de K por E en el sitio indicado en la Tabla 30. La incertidumbre en la precisión de la masa excluye la asignación. Adicionalmente, los biomarcadores de la Tabla 30 anterior se conocen como proteínas de fase aguda (a las cuales también se denominan “respondedores de fase aguda (APR)) o “biomarcadores de respuesta inmunitaria”). Como se ha tratado anteriormente en el presente documento, las proteínas de fase aguda son miembros de la familia de proteína de inmunidad innata.

Ejemplo 11. Detección de Cáncer de pulmón

A. Inmunoensayo para péptidos o proteínas: Los biomarcadores descritos en el Ejemplo 9 anterior se pueden detectar y medir por técnicas de inmunoensayo. Por ejemplo, el sistema de inmunoensayo Architect™ de Abbott Diagnostics se utilizó para el ensayo automático de un desconocido en una muestra sospechosa de contener un biomarcador de la presente invención. Como se sabe en la técnica, el sistema utiliza micropartículas magnéticas revestidas con anticuerpos, que son capaces de unirse al biomarcador de interés. Bajo el control del instrumento, se mezcló una alícuota de la muestra con un volumen igual de micropartículas magnéticas revestidas de anticuerpos y dos veces el volumen del diluyente del especimen, que contenía tampones, sales, tensioactivos, y proteínas solubles. Tras la incubación se lavaron las micropartículas con un tampón de lavado que comprendía tampón, sal, tensioactivo y conservante. Se añadió una alícuota de conjugado marcado con acridinio junto con un volumen igual el diluyente del especimen y se redispersaron las partículas. La mezcla se incubó y luego se lavó con tampón de lavado. Las partículas lavadas se redispersaron en un predesencadenante ácido que contenía ácido nítrico y peróxido de hidrógeno para disociar el conjugado de acridinio de las partículas. Se añadió entonces una solución de NaOH para desencadenar la reacción quimioluminiscente. Se midió la luz con un fotomultiplicador y el resultado desconocido se cuantificó por comparación con la luz emitida por una serie de muestras que contenían cantidades conocidas del péptido biomarcador utilizado para construir una curva de referencia. La curva de referencia se utilizó entonces para estimar la concentración del biomarcador en una muestra clínica que se procesó de manera idéntica. El resultado se puede utilizar por sí mismo o en combinación con otros marcadores como se describe posteriormente.

B. Inmunoensayo multiplexado para péptidos o proteínas: Cuando se necesita la detección de múltiples biomarcadores en una muestra única, puede ser más económico y conveniente llevar a cabo un ensayo multiplexado. Para cada analito en cuestión, se necesitan un par de anticuerpos específicos y una micropartícula únicamente teñida para su uso en un analizador Luminex 100 ™. Cada anticuerpo de captura del par reviste individualmente una única micropartícula. El otro anticuerpo del par se conjuga con un fluoróforo tal como R-Ficoeritrina. Las micropartículas se agrupan y se diluyen a una concentración de aproximadamente 1000 partículas únicas por microlitro que corresponde a aproximadamente 0,01% p/v. El diluyente contiene tampón, sal, y tensioactivo. Si hay 10 marcadores en el panel, los sólidos totales serían aproximadamente 10.000 partículas por microlitro o aproximadamente 0,1% de sólidos p/v. Los conjugados se agruparon y se ajustaron a una concentración final de aproximadamente 1 a 10 nM de cada en el diluyente de micropartículas. Para llevar a cabo el ensayo, una alícuota de la muestra sospechosa de contener uno o más de los analitos se colocó en un pocillo de incubación seguido por un volumen a la mitad de micropartículas agrupadas. La suspensión se incubó durante 30 minutos seguida por la adición de una mitad de volumen de solución de conjugado agrupado. Tras una incubación adicional de 30 minutos, se diluyó la reacción por adición de dos volúmenes de solución tamponada que contenía una sal y un tensioactivo. La suspensión se mezcla y se aspira un volumen de aproximadamente el doble que el de la muestra por el instrumento Luminex 100 ™ para el análisis. Opcionalmente, las micropartículas se pueden lavar tras cada incubación y luego resuspenderse para análisis. Se midió la fluorescencia de cada partícula individual con 3 longitudes de onda; dos se utilizaron para identificar la partícula y su analito asociado y la tercera se utiliza para cuantificar la cantidad de analito unido a la partícula. Se midieron 100 micropartículas de cada tipo y se calculó la fluorescencia media para cada analito. Opcionalmente, 50 partículas o menos de cada tipo se pueden medir con una pequeña pérdida de precisión y sensibilidad concomitante. La cantidad de analito en la muestra se calcula por comparación con una curva de referencia que se genera llevando a cabo el mismo análisis en una serie de muestras que contenían cantidades conocidas del péptido o proteína y representando la fluorescencia media de las muestras conocidas contra la concentración conocida. Una muestra desconocida se clasificaba como que era de cáncer o no cancerosa basándose en la concentración de analito (si se elevaba o deprimía) con respecto a especímenes conocidos de cáncer o no cancerosos utilizando modelos tales como el método de división y puntuación o división y método de puntuación ponderada como se describe en el Ejemplo 7. Opcionalmente, se pueden utilizar otros métodos como el Múltiple y Medio, descrito en el Ejemplo 12, como método de puntuación para un panel de analitos. Por ejemplo, un paciente se puede ensayar para determinar la probabilidad del paciente detener un cáncer de pulmón utilizando el panel de 8 inmunoensayos (IA) de la Tabla 18 y el método de división y puntuación. Después de obtener una muestra de ensayo del paciente, se cuantifica la cantidad de cada uno de los 8 biomarcadores en la muestra del paciente (es decir, el suero) y la cantidad de cada uno de los biomarcadores se compara entonces con el correspondiente punto de división predeterminado (punto de corte predeterminado) para el biomarcador, tal como los enumerados en la Tabla 18 (es decir, el punto de corte predeterminado que se puede utilizar para la Citoqueratina 19 es 1,89 o 2,9). Para cada biomarcador que tenga una cantidad que sea

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Perla: Prep Revestimiento Nombre Fuente AUC

65: 12/05/06 Preactivado NRBF2 Invitrogen 0,59

66: 12/05/06 Preactivado C21orf7 Invitrogen 0,56

67: 12/05/06 Preactivado MAPKAPK3 Invitrogen 0,58

68: 12/05/06 Preactivado PKCCKS Invitrogen 0,58

69: 12/05/06 Preactivado SMAD1 Invitrogen 0,57

70: 12/05/06 Preactivado DDAH2 Invitrogen 0,55

71: 12/05/06 Preactivado UROS Invitrogen 0,59

72: 12/05/06 Preactivado CDCA4 Invitrogen 0,54

73: 12/05/06 Preactivado IITP Invitrogen 0,54

74: 12/05/06 Preactivado LRRIQ2 Invitrogen 0,56

75: 12/05/06 Preactivado SCF7m6os Invitrogen 0,60

76: 12/05/06 Preactivado SH3PX3 Invitrogen 0,57

77: 12/05/06 Preactivado TFPT Invitrogen 0,58

79: 12/05/06 Preactivado RPE Invitrogen 0,55

56: 12/11/06 Preactivado WW-E3 Invitrogen 0,60

57: 12/11/06 Preactivado C1orf117 Invitrogen 0,62

58: 12/11/06 Preactivado C9orf11 Invitrogen 0,60

59: 12/11/06 Preactivado paralemmina Invitrogen 0,61

60: 12/11/06 Preactivado CDC37-1 Invitrogen 0,60

78: 12/11/06 Preactivado TFE3 Invitrogen 0,56

80: 12/11/06 Preactivado CCNE2 Invitrogen 0,58

26: 02/13/07 Pasivo p53 Biomol 0,69

27: 02/13/07 Pasivo MAPKAPK3 Genway 0,70

30: 02/13/07 Directo BM-E2-1 Abbott 0,73

31: 02/13/07 Pasivo Aldolasa Sigma 0,62

36: 02/14/07 Preactivado TMOD-1 Lab Vision 0,67

32: 02/15/07 Directo NY-ESO-1 NeoMarkers 0,66

33: 02/15/07 Directo HDJ1 Alexis 0,64

23: 02/19/07 Directo IgG Abbott 0,53

38: 02/19/07 Directo BSA Sigma 0,60

40: 02/19/07 Directo H. Pylori Fitzgerald 0,81

b. Método de puntuación

Se utilizó un método de puntuación binario para evaluar paneles múltiples de biomarcadores en la discriminación de grupos de cáncer de no cancerosos. La Tabla 32 a continuación, enumera los puntos de división (puntos de corte) utilizado para cada biomarcador. La Tabla 33 posteriormente identifica los marcadores individuales en cada panel y el AUC para cada panel.

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Aac/IA/MS

Marcadores: 4/6/4 4/4/2 4/4/1 4/2/1 4/0/4 4/4/0 4/6/0 4/2/0 0/4/1 0/6/0 0/4/0 4/0/0 8/0/0 0/0/4

4 espec.masas: pub11597 x x x x x x x

pub4789: x x x

lfa2759: x x x

acn9459: x x x x

AUC: Puntuación binaria 0,88 0,88 0,87 0,85 0,85 0,84 0,83 0,81 0,81 0,77 0,77 0,77 0,75 0,78

MoM: 0,88 0,88 0,88 0,86 0,82 0,88 0,88 0,85 0,83 0,81 0,82 0,81 0,81 0,76

Tabla 33a.

Análisis dejar uno fuera en un panel de 14 marcadores utilizando datos MoM

Aac/lA/MS

Marcadores: 2/1/0 2/2/0 3/2/0 3/3/0 3/4/0 4/4/0 4/4/1 4/4/2 4/4/3 4/5/3 4/5/4 4/6/4

8 autoantígenos: Ciclina e2-l x x x x x x x x x x x x

mapkapk3: x x x x x x x

p53: x x x x x x x x x x x x

tmod-1

NY-ESO-1: x x x x x x x x x x

hdjl

npclllc

lmp21

6 Inmunoensayos: ckl9 x x x x x x x x

Cea: x x x x x x x x x x x

Ca125: x x x x x x x x x

Scc: x

Progrp: x x x x x x x x x x x x

Tps: x x x

Espec. masas: pub 11597 x x

pub4789: x x x x x

tra2759: x x x x x x

acn9459: x x x x

AUC: Puntuación binaria 0,76 0,79 0,82 0,83 0,83 0,84 0,86 0,87 0,88 0,88 0,88 0,88

MoM: 0,82 0,84 0,86 0,87 0,88 0,88 0,88 0,88 0,88 0,88 0,88 0,88

Tabla 33b.

Como se puede ver al comparar los paneles de las Tablas 33a y 33b anteriores con solo los autoantígenos como biomarcadores, el panel 4/0/0 que incluye NY-ESO-1, p53, mapkapk3, y péptido ciclina E2-1 era tan bueno como el 5 panel 8/0/0 que incluye cuatro autoantígenos más. Además, los valores del AUC más altos se obtenían cuando se incluían al menos tres autoantígenos en el panel, a saber, NY-ESO-1, p53, y péptido ciclina E2-1.

En el análisis dejar uno fuera (Tabla 33 b anterior), se alcanzaba el mismo AUC tanto en los métodos del Múltiplo de la Media (MoM) y el de puntuación binaria. Sin embargo, un panel mayor de biomarcadores era necesario con el 10 método de puntuación binaria al compararse con el método del análisis MoM. Este método Múltiplo de la Media determinó que el panel 3/4/0 que incluye autoanticuerpos contra NY-ESO-1, p53, y ciclina E2-1 y antígenos tumorales CK19, CEA, CA125 y proGRP proporcionaba el AUC más alta que se conseguía con menor biomarcadores. Añadiendo biomarcadores adicionales, al menos en este Ejemplo, no cambiaba el AUC. Sin embargo, utilizando el método de puntuación binario, el panel con el AUC más alto y menos biomarcadores era el 15 4/4/3 que incluye autoanticuerpos contra NY-ESO-1, p53, ciclina E2-1, y mapkapk3 y antígenos tumorales CK-19,

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El poder de estas combinaciones queda claro en la Figura 9 y la Tabla 36b. Combinando los antígenos tumorales con los marcadores de respuesta inmunitaria se proporciona un panel con una dependencia del estadio mejorada y con una persistente incapacidad de diferenciar el estadio temprano del cáncer de pulmón de la enfermedad pulmonar benigna (AUC 0,65-0,68). El cáncer en estadio temprano se diferencia de la cohorte normal con un AUC

5  0,75 -0,8.

Combinando los biomarcadores autoantígenos con los marcadores de respuesta inmunitaria se proporcionaba un panel con una mayor consistencia total en la diferenciación del cáncer del no canceroso incluyendo cáncer de estadio temprano y tardío de normal y enfermedad pulmonar benigna (Figura 9). El cáncer de pulmón en estadio

10 temprano se diferencia competentemente de los normales y enfermedad pulmonar benigna con un AUC de  0,75 0,82. El AUC para la enfermedad en estado tardío y normal y enfermedad pulmonar benigna es similar (0,75 -0,85) y no tan buena como cuando se utilizan antígenos tumorales.

La combinación de antígenos tumorales y autoanticuerpos se proporciona un buen panel. El panel 4/4/0 descrito

15 como 4 IA + 4 Aac de la Figura 9 diferencia cáncer de pulmón en estadio temprano de enfermedad pulmonar benigna con un AUC  0,82. Además, combinando marcadores de respuesta inmunitaria (proteína reactiva C, amiloide sérico A, o haptoglobina) tiene una poca mejora. Además, la adición de 3 marcadores de respuesta inmunitaria al panel 4/4/0 en realidad reduce la actuación del panel.

Grupo de caso: Cáncer de pulmón en estadio temprano Cáncer de pulmón en estadio tardío

Grupo control: benigno Normal benigno normal

Biomarcadores

Biomarcadoresde respuestainmunitaria: haptoglobina 0,56 0,65 0,69 0,76

SAA: 0,47 0,63 0.72 0,74

CRP: 0,56 0,64 0,73 0,8

apoCIII: 0,6 0,52 0.67 0,58

Biomarcadoresde espect. demasas: 4789 0,65 0,65 0,75 0,75

11597: 0,75 0,66 0,83 0,76

2759: 0,66 0,63 0,66 0,64

acn9459: 0,64 0,69 0.64 0,69

Autoanticuerpos: lmp21 0,6 0,64 0.59 0,63

npclllc: 0,59 0,58 0,61 0,6

p53: 0,63 0,67 0,69 0,73

mapkapk: 0,68 0,7 0.71 0,74

E2-1: 0,69 0,72 0.72 0,75

NYESO: 0,62 0,62 0.68 0,68

hdjl: 0,65 0,61 0.68 0,65

tmod: 0,61 0,64 0,71 0,73

E2 Abnova: 0,58 0,58 0,61 0,61

E2 Genway: 0,65 0,65 0,72 0,74

antígenos tumorales: CYFRA 0,6 0,63 0.76 0,79

19-9: 0,56 0,51 0,65 0,69

CEA: 0,61 0,7 0,72 0,78

15-3: 0,56 0,62 0,63 0,69

CA125: 0,61 0,68 0,78 0,83

SCC: 0,55 0,57 0,61 0,63

TPS: 0,6 0,64 0.72 0,75

proGRP: 0,55 0,69 0,59 0,69

Tabla 36b.

Grupo de caso: Cáncer de pulmón en estadio temprano Cáncer de pulmón en estadio tardío Todos los cánceres de pulmón

Grupo control: benigno Normal benigno normal benigno + normal

AUC AUC AUC AUC DFI AUC

4IA: 0,668 0,8 0,886 0,942 0,39 0,8

41A+CRP: 0,66 0,792 0,875 0,938 0,38 0,8

4IA+SAA: 0,681 0,769 0,859 0,9 0,81

4IA+hapto: 0,672 0,81 0,894 0,955 0,37 0,78

4IA+3APR: 0,666 0,772 0,855 0,904 0,78

4Aac: 0,793 0,83 0,781 0,808 0,36 0,8

AUC
AUC
AUC
AUC: DFI
AUC

4Aab+CRP: 0,779 0,833 0,812 0,856 0,34 0,81

4Aab+SAA: 0,767 0,8 0,806 0,832 0,81

4Aab+hapto: 0,798 0,836 0,789 0,824 0,8

4Aab+3APR: 0,767 0,817 0,815 0,85 0,37 0,81

4IA+4Aac: 0,816 0,87 0,893 0,93 0,28 0,87

4IA+4Aah+CRP: 0,803 0,87 0,885 0,923 0,3 0,86

4IA+4Aab+SAA: 0,786 0,832 0,866 0,895 0,28 0,87

4IA+4Aab+hapto: 0,818 0,877 0,892 0,929 0,33 0,84

4IA+4Aab+3APR: 0,782 0,841 0,865 0,9 0,34 0,84

(Las Tablas 36a y 36b tienen los valores del AUC tabulados que se muestran en las Figuras 8 y 9)

Ejemplo 14. Timosina 4 EIA (T4)

5 El kit timosina 4 EIA se adquirió en ALPCO Diagnostics, (Salem, NH). Los ensayos se ejecutaron según las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero se utilizaron directamente sin diluirlas. Se procesó el grupo seleccionado de 118 muestras que contenían muestras normales, benignas y de pacientes de cáncer. Las concentraciones de los analitos se derivaron del ajuste de la curva logística de 4 parámetros (4PLC) de concentraciones de referencia conocidas como instruye el protocolo del fabricante. Todos los cálculos se llevaron a

10 cabo utilizando el algoritmo de ajuste de la curva no lineal proporcionada en el paquete estadístico JMP 5.0. El AUC que se obtiene por el ensayo T4 se muestra en la Figura 10.

Como se ha mostrado anteriormente, la T4 por sí misma era capaz de discriminar entre los grupos enfermos y no enfermos relativamente bien. Sin embargo, a alta especificidad, su sensibilidad es relativamente poca como se 15 muestra en la Tabla 37, posteriormente (Especificidad = 90%, Sensibilidad = 53%). Aquí, se evaluó la mejoría de actuación de algunos paneles multimarcador preferidos cuando estaba incluida la T4 en los paneles. Se utilizaron tres grupos diferentes de paneles de marcadores (4IA (CK19, CEA, CA125 y ProGRP), 4Aab (Ciclina E2-1, MAPKAPK3, P53 y NY-ESO-1) y 3APR (Amiloide sérico A (pub 11597), proteína reactiva C, y haptoglobina (sospechoso de ser el 17858 de masas)). La tabla 37 a continuación compara la actuación de los paneles con y sin

20 T4. También se compararon el AUC y las sensibilidades con dos especificidades diferentes (Hspec y Lspec). La Hspec se fijó al 90% y Lspec al 70% con el fin de comparar la actuación de los paneles a alta y baja especificidad respectivamente.

Claims

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