JP5611821B2 - 肺癌に対する素因をスクリーニングするための方法およびマーカーの組み合わせ - Google Patents
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Description
本願は、2005年12月22日に出願された米国特許出願60/753,331号の優先権を主張する2006年12月21日に出願された米国出願11/644,365号の一部継続出願である2007年6月29日に出願された米国出願11/771,727号の優先権を主張する(全ての内容が、参照により、本明細書中に組み込まれる。)。
本発明は、肺癌を有することが疑われる対象中の肺癌の検出を補助するための迅速で感度が高い方法は、バイオマーカーのある種の組み合わせおよびバイオマーカー並びにバイオメトリックパラメータのある種の組み合わせに基づき得るという発見に部分的に基づくものである。
b.前記パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
b.各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して、前記少なくとも1つのバイオメトリックパラメータの値を比較し、該比較に基づいて各バイオメトリックパラメータに対してスコアを割り当てること;
c.対象から得られた検査試料中において、少なくとも1つの抗体と少なくとも1つの抗原を含むパネル中の2つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量すること;
d.前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
e.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程dにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを工程bにおいて決定された各バイオメトリックパラメータに対して割り当てられたスコアを合計すること;
f.工程eにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
g.工程fにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
b.前記パネル中の定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
b.前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
b.前記パネル中の定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて定量された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定すること。
b.前記パネル中の定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて定量された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定すること。
b.前記パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて決定された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
b.前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定すること。
b.定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること;および
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること。
b.定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合計すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が医学的症状を発症するリスクを有するかどうかを決定すること。
本願において使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。他の全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている方法において使用することができる抗体を産生し、又は検査する(又はより一般的には、結合する)ための免疫原又は抗原として使用することができる、単離された又は精製された免疫反応性サイクリンE2ポリペプチド又は生物学的に活性なその断片に関する。本発明の免疫反応性サイクリンE2ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いて、細胞又は組織源から単離することができる。あるいは、単離された又は精製された免疫反応性サイクリンE2ポリペプチドおよび生物学的に活性なその断片は、組換えDNA技術によって作製することが可能であり、又は化学的に合成することが可能である。本発明の単離された又は精製された免疫反応性サイクリンE2ポリペプチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号4および配列番号5に示されているアミノ酸配列を有する。配列番号1は、ヒトサイクリンE2のcDNA発現された形態のアミノ酸配列である(Genbank受付番号BC007015.1)。配列番号3は、BC007015.1のC末端に1つのアミノ酸(システイン)が加わった38アミノ酸配列であり、本明細書において「E2−1」とも称される。配列番号4は37アミノ酸長であり、配列番号4が配列番号3の最も最初のシステインをそのアミノ酸末端に含有しないことを除き、配列番号3と同じである。配列番号5は、BC007015.1のC末端を含む19アミノ酸配列であり、本明細書において、「E2−2」と称される。実施例中により詳しく記載されているように、配列番号1の免疫反応性は配列番号2の免疫反応性と比較された。配列番号2は、ヒトサイクリンE2の別のcDNA発現された形態である(Genbank受付番号BC020729.1)。配列番号1は、癌試料の幾つかのプールと強い免疫反応性を示すことが見出され、良性および正常な(非癌)プールとずっと低い反応性を示した。これに対して、配列番号2は、あらゆる癌又は非癌のプールされた試料とほとんど反応性を示さなかった。配列番号1の免疫反応性は、配列番号2には存在しない配列番号1のC末端に存在する最初の37アミノ酸の結果であることが決定された。配列番号3および5(何れも、配列番号1のC末端に由来する。)は、癌又は非癌プールの間で強い免疫反応性を示すことが見出された。従って、配列番号1、配列番号3、配列番号4および配列番号5又はこれらの配列のあらゆる組み合わせに対して作製された抗体(配列番号1および配列番号3に対して作製された抗体、配列番号1および配列番号4に対して作製された抗体、配列番号1および配列番号5に対して作製された抗体、配列番号1、配列番号3および配列番号4に対して作製された抗体、配列番号1、配列番号3および配列番号5に対して作製された抗体、配列番号1、配列番号4および配列番号5に対して作製された抗体、配列番号1、配列番号3、配列番号4および配列番号5に対して作製された抗体、配列番号3および配列番号4に対して作製された抗体、配列番号3および配列番号5に対して作製された抗体、配列番号3、配列番号4および配列番号5に対して作製された抗体、配列番号4および配列番号5に対して作製された抗体(本発明において、全て「抗サイクリンE2」と総称される。)など)を、本明細書に記載されている方法において使用することができる。例えば、このような抗体は、配列番号1、配列番号3、配列番号4および配列番号5の何れか又はこれらの配列のあらゆる組み合わせに対して作製された主題抗体であり得る。このような抗体は、本明細書中に記載されている本発明の方法において使用するために1つ又はそれ以上のキット中に含めることができる。
別の実施形態において、本発明は、正常な対象と癌を有する対象又は医学的症状を発症するリスクを有する対象との識別を効果的に補助する方法に関する。医学的症状は、好ましくは癌、さらに好ましくは肺癌である。正常な対象は、何れかの医学的症状(癌など)を有すると診断されていない対象、より好ましくは肺癌を有すると診断されていない対象であると考えられる。
b.定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること;および
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合算すること。
b.定量された各マーカーの量を前記マーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各マーカーに対してスコアを割り当てること;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各マーカーに対して割り当てられたスコアを合算すること;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較すること;および
e.工程dにおいて決定された合計スコアの比較に基づいて、前記対象が医学的症状を発症するリスクを有するかどうかを決定すること。
本明細書中に前述されているように、出願人は、1つ若しくはそれ以上のバイオマーカー又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせの検出および定量が患者中の肺癌を診断する上での補助として有用であることを見出した。さらに、出願人は、本明細書中に記載されている1つ又はそれ以上のバイオマーカーおよび1つ又はそれ以上のバイオマーカーと1つ又はそれ以上のバイオメトリックパラメータの組み合わせが、肺癌に対して、約0.5未満、好ましくは約0.4未満、より好ましくは約0.3未満、さらに好ましくは約0.2未満のDFIを有する。表25から29は、約0.5未満、約0.4未満、約0.3未満および約0.2未満であるDFIを示す様々なバイオマーカー又はバイオマーカーとバイオメトリックパラメータの組み合わせを含有するパネルの例を与える。
1つ又はそれ以上のバイオマーカー、免疫反応性サイクリンE2ポリペプチドの1つ又はそれ以上、バイオメトリックパラメータおよびこれらのあらゆる組み合わせが、本発明の方法を実施する上で使用するためのキット(パネルなど)の形成に適している。一態様において、キットは、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドを含むことができる。
本発明のバイオマーカーは、当業者に周知の技術によって、単離し、精製し、および同定することができる。これらには、クロマトグラフィー、電気泳動および遠心技術が含まれる。これらの技術は、「Current Protocols in Protein Science, J. Wiley and Sons, New York, NY, Coligan et al.(Eds) (2002)」および「Harris, E.L.V., S. Angal in Protein Purification Applications:A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY(1990)」およびその他の文献に論述されている。
患者の血清の臨床的試料を集め(実施例1)、イムノアッセイ抗原マーカーに関して(実施例2)、ビーズ(実施例3)又はスライド(実施例4)を用いたイムノアッセイ抗体マーカーに関して、並びに質量分析によって同定されたバイオマーカーに関して(実施例5)分析した。様々なアルゴリズムを用いて、同定されたマーカーを並べ替え、優先順位を決定した(実施例6)。臨床的有用性を評価するための予想モデルを同定するために(実施例8)スコアリング法(実施例7)を用いて、これらの優先順位が決定されたマーカーを組み合わせた。肺癌を有することが疑われる患者中の肺癌の検出を補助する方法の使用例が、実施例9に例示されている。組成および正体を決定するために、質量分析の関心領域によって同定されたバイオマーカーを分析した(実施例10)。実施例11は、イムノアッセイ技術および免疫質量分析技術を用いて、本発明に従って同定されたバイオマーカーをどのようにして検出および測定できるかについて記載する予見的な実施例である。
治験審査委員会によって承認されたプロトコールに基づいて、患者血清の臨床試料を集めた。試料を提供した全ての対象は、試料を収集され、このプロジェクトにおいて使用されることに関して、インフォームドコンセントを与えた。血清試料を血清分離管の中に引き込み、室温で15分間、凝血させた。凝血塊を遠心して沈降させ、試料を2mLへ分注した。24時間以内に、試料を−80℃で凍結させ、さらなる加工処理を行うまで、その温度に維持した。受領した時点で、試料を融解し、便宜のために、より小さな容量へ再び分取し、再度凍結した。次いで、分析の直前に、試料を最後に融解した。従って、セット中の全ての試料は、分析前に、2回凍結および融解された。
A.Abbott Laboratories(Abbott Park, IL, hereinafter「Abbott」)ArchitectTMアッセイ
以下の抗原に対して、ArchitectTMキットを獲得した。CEA、CA125、SCC、CA19−9およびCA15−3。全てのアッセイは、製造業者の指示に従って実行した。試料中の分析物の濃度は、ArchitectTM装置によって与えられた。これらの濃度は、下表1中に示されているAUCデータを作製するために使用した。
製造業者の指示書に従って、ElecsysTM2010システム(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)に対して、Cyfra21−1(サイトケラチン19、CK−19)測定を行った。Cyfra21−1の濃度は、ElecsysTM装置によって与えられた。大きなコホートと小さなコホートに対するデータとAUCを用いてROC曲線を作成し、下表2中に報告されている。
以下のELISAキットを購入した。Advanced Life Science Institute, Inc. (Japan)からプロGRP、IDL Biotech AB(Bromma, Sweden)からTPS(サイトケラチン18、CK−18)およびIBL Immuno Biological Laboratories (Minneapolis, MN, USA)からパラインフルエンザ1/2/3 IgG ELISA。アッセイは、製造業者の指示に従って実行した。分析物の濃度は、製造業者のプロトコール中に指示され、提供された計算から求めた。各アッセイに対して得られたAUCが、下表3に示されている。
A.市販のヒトタンパク質(表4、下記参照)をLuminexTMSeroMapTMビーズ(Austin,Texas)に付着させ、試薬を調製するために、各ビーズセットを合わせた。存在する全ての抗体がタンパク質に結合できる条件下で、試薬の一部をヒト血清試料に曝露させた。結合していない物質を洗浄除去し、次いで、ヒトIgGに特異的に結合する抗体に連結されたR−フィコエリトリンの蛍光性連結物へビーズを曝露させた。洗浄後、ビーズの内部色素に従って各ビーズを特定するLuminexTM100装置にビーズを通過させ、ビーズに結合された蛍光(ビーズに結合された抗体の量に対応する。)を測定した。このようにして、21のヒトタンパク質および対照用の7つの非ヒトタンパク質(ウシ血清アルブミン(BSA)および破傷風トキシン)に対する772の試料(肺癌251、正常244、良性277)の免疫応答を評価した。
Omega10K限外ろ過プレート(Pall Corporation, Ann Arbor, Michigan)のウェルに、水50μLを添加した。10分後、プレートを真空上に配置した。ウェルが空になったら、水分を保持するために水10μLを添加した。5mMモルホリノエタンスルホン酸(MES)pH5.6の50から100μL、表記されているLuminexTMSeroMAPTMビーズ50μLおよび表4中に示されている各抗原10から20μgに対応する適切な容量を各ウェルに添加した。ピペットで、ビーズを懸濁した。ビーズに、EDAC(5mMMESpH5.6の1.0mL中2.0mg)10μLを添加した。プレートに蓋い、暗所で振盪装置上に置いた。14時間後、プレートを真空によって吸引し、水で洗浄し、最後に、20mMトリエタノールアミン(TEA)pH5.6の50μL中にビーズを再懸濁した。暗所で、振盪装置によってプレートを撹拌した。各ウェルに、EDAC(5mMMESpH5.6の1.0mL中2.0mg)10μLをさらに添加し、暗所で1時間、プレートを振盪装置上に配置した。洗浄後、1%BSAおよび0.08%アジ化ナトリウムを含有するPBS緩衝液(PBN)200μLを各ウェルに添加した後、プローブとともに音波処理し、暗所に配置した。
マイクロプレート当り80の試料を用いて、PBN中へ1:20希釈して、血清試料をマイクロプレート中に調製した。上記ビーズセット50μLに、(ここで検査されている抗原とは無関係の抗原で免疫されたウサギから得た)ウサギ血清5μLを添加した。ビーズセットを渦巻き撹拌し、37℃に配置した。35分後、5%ウサギ血清および1%CHAPS(BRC)を含有するPBN1mLを添加した。ビーズセットを渦巻き撹拌し、遠心によって沈殿させ、BRC1.05mL中に再懸濁した。Supor1.2μフィルタープレート(Pall Corporation)のウェルをPBN100μLで洗浄した。各ウェルに、BRC50μL、それぞれ1:20の血清試料10μLおよび再懸濁されたビーズ10μLを添加した。暗所にて室温で1時間、プレートを振盪し、ろ過し、次いで、BRC100μLで10分間、3回洗浄した。(BRC5.0mL中のRPE抗ヒトIgG20μL)の検出連結物50μLを添加し、ピペットによって、ビーズを再懸濁した後、プレートを暗所で30分間振盪させた。次いで、BRC100μLを添加し、ピペットによってビーズを撹拌し、LuminexTM100装置上で試料を分析した。
A.抗原の調製
InvitrogenのUltimateORFCollectionTM(Invitrogen,Grand Island, NY)から得られた約5,000のタンパク質を、完全長ヒトタンパク質とのグルタチオン−S−転移酵素(GST)配列の組換え融合物として調製した。GSTタグによって、タンパク質の他の特徴とは独立して、アレイに結合された各タンパク質の量を評価することが可能となった。
ProtoArrayは、上記の約5,000タンパク質が点状に付与されたニトロセロロースで被覆されたガラス表面(スライド)および数多くの調節機構からなる。
まず、4℃で1時間、PBS/1%BSA/0.1%Tween20でアレイをブロックした。次いで、これを、4℃で90分間、プロファイリング緩衝液(本明細書中に論述されている「プロファイリング緩衝液」は、PBS、5mMMgCl2、0.5mMジチオスレイトール、0.05%TritonX−100、5%グリセロール、1%BSAを含有した)中の1:120希釈された血清試料に曝露した。次いで、洗浄ごとに8分間、プロファイリング緩衝液でアレイを3回洗浄した。次いで、44℃で90分間、プロファイリング緩衝液中において、0.5μg/mLのAlexaFluorが連結された抗ヒトIgGにアレイを曝露した。次いで、洗浄ごとに8分間、プロファイリング緩衝液でアレイを3回洗浄した。遠心装置上で乾燥させた後、Axon GenePix 4000B蛍光マイクロアレイスキャナ(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて走査した。
正常な患者から得られた血清の陽性シグナルの分布と癌患者から得られた血清の陽性シグナル分布を比較することによって、癌患者に特徴的な自己抗体を示すタンパク質の正体を決定した。アレイの限られた数を用いて癌特異的自己抗体を発見する確率を増加させるために、試料の以下のプールを使用した。それぞれ4又は5人の肺癌患者から得られた血清を含有する10のプール、それぞれ4又は5人の正常な患者から得られた血清を含有する10のプール、それぞれ良性肺疾患を有する4又は5人の患者から得られた血清を含有する10のプール。上記のように処理するために、これらのプールをInvitrogenに送った。各プールに対する各タンパク質に対応する蛍光強度をスプレッドシート中に与えた。各タンパク質は、2回提示された(アレイ上の2つ組みのスポットに対応する。)。
サイクリンE2の2つの形態が、ProtoArrayTM上に存在することが見出された。Genbank受付BC007015.1(配列番号1)として同定された形態が癌試料のプールの幾つかと強い免疫反応性を示し、良性および正常(非癌)プールとずっと低い反応性を示した。これに対して、Genbank受付番号BC020729.1(配列番号2)として同定された形態は、癌又は非癌のプールされた試料の何れともほとんど反応性を示さなかった。以下に示されているように、2つの形態の配列の並置は、259アミノ酸にわたって同一性を示し、N末端およびC末端の両領域中が異なっていた。BC020729.1は、110個のアミノ酸をN末端に有しており、BC007015.1中に存在しない7個のアミノ酸をC末端に有する。BC007015.1は、BC020729.1中に存在しない37のアミノ酸をC末端に有する。形態BC007015.1のみが免疫反応性を示すので、これは、C末端の37個のアミノ酸部分が原因である。
A.混合された時期ビーズ(MMB)の逐次溶出による試料の調製
血清試料を融解し、InvitrogenのSolB緩衝液の等容量と混合した。混合物を渦巻き撹拌し、さらなる処理の前に、清澄化し、破砕物を除去するために、0.8μmフィルター(Sartorius,Goettingen,Germany)を通してろ過した。Dynal(R)(Invitrogen)強陰イオン交換およびAbbottLaboratories(Abbott, Abbott Park, IL)の弱陽イオン交換磁気ビーズの混合物を用いて、96ウェルプレートKingFisher(R)(ThermoFisher, Scientific, Inc., Waltham, MA)上で、自動化された試料の調製を行った。典型的には、陰イオン交換ビーズは、機能的な末端基としてアミンをベースとする炭化水素−四級アミン又はジエチルアミン基を有し、弱陽イオン交換ビーズは、典型的には、スルホン酸(カルボン酸)ベースとする官能基を有する。Abbottの陽イオン交換ビーズ(CXビーズ)は2.5%(質量/容積)の濃度であり、Dynal(R)強陰イオン交換ビーズ(AXビーズ)は10mg/mLの濃度であった。試料調製の直前に、20mMTris・HCl、pH7.5、0.1%の還元されたTritonX100(Tris−Triton緩衝液)で陽イオン交換ビーズを一回洗浄した。この試料調製において使用された他の試薬20mMTris・HCl、pH7.5(Tris緩衝液)、0.5%トリフルオロ酢酸(以下、「TFA溶液」)および50%アセトニトリル(以下、「アセトニトリル溶液」)は、社内で調製した。 試薬および試料は、以下のようにして、96ウェルプレート中に設定した。
血清試料をSOLB緩衝液と混合し、実施例5Aに記載されているように、フィルターで清澄化した。100MB−HIC8として知られるCLINPROT精製キット(Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA)を用いて、96ウェルプレートKingFisher(R)上で、自動化された試料調製を行った。キットは、C8磁気ビーズ、結合溶液および洗浄溶液を含む。別段の記載がなければ、他の全ての試薬はSigmaChem.Co.から購入した。試薬および試料は、以下のようにして、96ウェルプレート中に設定した。
以下の試薬を使用した。
この装置の取得範囲は、m/z400から100,000までに設定された。2から17kDaの質量範囲に及ぶBrukerの較正標準を用いて、線形モードで、この装置を外部から較正した。高品質スペクトルを収集するために、レーザーを除き、ファジー調節をオンにして、取得は完全に自動化した。レーザー出力が実験の間に一定に保たれるように、レーザーのファジー調節を停止させた。一般に、固定されたレーザー出力で装置を較正するので、一定のレーザー出力を維持することが、精度にとって有益である。他のファジー調節設定は、2から10kDaの質量範囲中のピークの分離およびS/Nを調節した。これらの値を各取得前に最適化し、試料ごとの又はスポットごとの取得の失敗数を最小限に抑えながら、スペクトルの品質を最大化するように選択した。低分子量イオン(<400m/z)を偏向させて、マトリックスイオンでの検出装置の飽和および試料から生じたシグナルの最大化を抑制するために、偏向装置も作動させた。さらに、レーザー光線が試料表面を横切ってラスターデータ化されるので、あらゆる過剰なマトリックスを除去するために、各取得の前に、5つの加温ショット(LP閾値の約5から10%以上)を発火させた。各質量スペクトルに関して、上で設定されている分解およびS/N基準を満たした場合にのみ、600のレーザーショットを同時に添加した。質が劣る全ての他のスペクトルは無視および廃棄し、生のスペクトルの取得の間に、ベースライン補正又は円滑化アルゴリズムは使用しなかった。
この装置の取得範囲はm/z1000から20,000までに設定させ、感度および分離能に関して最適化した。各質量スペクトルに対して、400のレーザーショットを同時添加したことを除き、他の全ての取得パラメータおよび較正法は、実施例5dに上述されているように設定した。
0から50,000Daの間の質量範囲に対して最適化されたパラメータを用いて、Ciphergen4000MALDI飛行時間質量分析装置上にBioprocessorを搭載した。イオン電流対質量/電荷(m/z)の単一スペクトルを得るために、スポット当り530の取得にわたって、データをデジタル化し、平均した。各スペクトルをサーバにエクスポートし、続いて、取得後分析のために、ASCIIファイルとして読み出した。
質量スペクトルデータは、0から50,000までの質量/電荷値および対応する強度値からなる。癌および非がんデータセットを構築した。癌データセットは、全ての癌試料から得られた質量スペクトルからなるのに対して、非癌データセットは、全ての非癌試料(正常対象および良性肺疾患を有する患者を含む。)から得られた質量スペクトルからなる。以下のことを実行するソフトウェアプログラム中に、癌および非癌データセットを別個にアップロードした。
イムノアッセイバイオマーカーおよび関心領域に対して、多変量解析を実施した。全ての異なる分析は、JMP統計パッケージを用いて実施した。単純化のために、本明細書において、判別分析(DA)、主成分分析(PCA)および決定木(DT)は、全般的に、多変量法(MVM)と称される。PCAでは、データ中の全変動性の90%超に相当する最初の15の主成分のみが抽出されたことを述べることに価値がある。各主成分に最も寄与する1つの因子(バイオマーカー)のみを抽出するために、因子加重および/又は平等分配を使用した。因子加重の二乗は各主成分中の各因子の相対的寄与を反映するので、各主成分に対して最も寄与するマーカーを選択するための基礎として、これらの値を使用した。従って、最初の15の主成分に最も寄与する15の因子(バイオマーカー)を抽出した。DAでは、さらなるマーカーの付加が分類結果に対して影響を及ぼさなくなるまで、マーカーを選択するプロセスを実施した。一般に、DAは、5と8バイオマーカーの間を使用した。DTの場合には、約5つのバイオマーカーを有する6結節点の木を構築し、評価した。
A.改善された分離およびスコア法(SSM)
Microsoft(C)Windosの下で実行するために、Mor他(PNAS, 102(21):7677 (2005)参照)によって記載されている分離点(カットオフ)スコアリング法を実施する双方向的ソフトウェアを記述した。このソフトウェアは、一群の試料に対するマーカー(バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータ)分析の結果を保存するための通常の手段であるMicrosoft(C)Excelスプレッドシートを読み取る。データは、試料の疾病を表記するためのフィールドを有する単一のワークシート上に保存し、2つのワークシート(一方は罹病試料に対するものであり、他方は非罹病試料に対するものである。)上に保存し、又は4つのワークシート(一方は罹病および非罹病試料を訓練するためのペア並びに他方は罹病および非罹病試料を検査するためのペア)上に保存することができる。最初の2つの事例では、使用者は、無作為に選択された訓練および検査対を入力から自動的に作製するためにソフトウェアを使用し得る。最後の事例では、複数のExcelファイルを一度に読み取り、単一の実行で分析し得る。
本明細書中に先述されているように、この方法は、1つのマーカーの測定を多くの潜在的スコアの1つへ変換することを含む重み付けられたスコアリング法である。スコアは、以下の方程式を用いて得られる。
スコア=0.70*3/(1−0.90)
スコア=21
A.イムノアッセイバイオマーカーのSSM
実施例2に論述されているように、免疫学的アッセイによって、幾つかのバイオマーカーを検出した。これらには、サイトケラチン19、CEA、CA125、SCC、プロGRP、サイトケラチン18、CA19−9およびCA15−3が含まれた。これらのデータは、SSMを用いて評価した。一緒にされたこれらのバイオマーカーは、限定された臨床的有用性を示した。良性肺疾患および肺癌を呈する小さなコホートでは、陽性の結果として4又はそれ以上の閾値を有する8バイオマーカーパネルの精度は、10の小コホート検査セットにわたって64.8%の平均精度(AUC0.69)を達成した。正常並びに良性肺疾患および肺癌を呈する大きなコホートでは、陽性の結果として4又はそれ以上の閾値を有する8バイオマーカーパネルの精度は、10の大コホート検査セットにわたって77.4%の平均(AUC0.79)を達成した。
多変量統計法を用いてバイオマーカー候補が同定された実施例6とは異なり、この事例では、バイオマーカー候補を同定するために、ROC/AUC解析を用いる単純なノンパラメトリック法を使用した。この方法を適用することによって、許容され得る臨床成績(AUC>0.6)を有する各マーカーをさらなる解析のために選択した。上位15のバイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータ(パック・年)のみを選択し、以下、このグループは16AUC群(小および大)と称される。これらのマーカーは、下表19に列記されている。
1つの多変量法の例は、決定木解析である。決定木解析のみを用いて同定されたマーカーを統合し、SSMにおいて使用した。バイオマーカーのこの群は、16AUCと表記されるバイオマーカーの群と同様の臨床的有用性を示した。一例として、バイオメトリックパラメータであるパック・年なしで、(10のうちの)検査セット1が0.90のAUC(検査)を有し、バイオメトリックパラメータであるパック・年ありで0.91のAUC(検査)を有する。
続く工程において、両コホートに対するAUCおよびMVM両群から得られるマーカーを含有するマーカーの第二のリストを作成するために、(10の訓練セット中の)5以上の頻度を有する全てのマーカー(バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータ)を組み合わせた。SSMの結果から、5以上の頻度を有する特有のマーカーを小さんコホートから16、大きなコホートから15選択した。下表22は、選択されたマーカーを要約する。
小さなコホートに対する13バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータのリストのサブセット(上記表23a参照)は、優れた臨床的有用性を与える。例えば、分離およびスコア法において、パネルとして一緒に使用された上位8つの高頻度バイオマーカーおよびバイオメトリックパラメータは、検査サブセット1に対して、0.90のAUCを有する(上記表23b参照)。
A.HPLC分画
表22中のMSバイオマーカー候補を特定するために、標準的なプロトコールを用いる逆相HPLCによって、プールされた血清試料および/又は個別の血清試料をまず分画することが必要であった。ゲル電気泳動およびMS分析に対して十分な材料を得るには、複数の分画サイクルが必要であった。MALDI−TOFMSによって、各画分の特性を決定し、目的ピークを含有する画分を一緒にプールし、speedvac中で濃縮した。全ての他のバイオマーカーの候補を上述のように処理した。
濃縮後、候補バイオマーカーに対応する分子量を有する所望のタンパク質/ペプチドを単離するために、候補バイオマーカーを含有する画分をSDS−PAGEに供した。製造業者によって提供された標準的な方法を用いて、ゲル電気泳動(SDS−PAGE)を実施した。要約すれば、操作は、候補バイオマーカーと分子量公知の標準タンパク質を含有する試料を、図3に示されているように、同じゲル中の異なるウェル中に搭載することを含んだ。標準タンパク質の移動距離を「未知の」試料の移動距離と比較することによって、所望の分子量を有するバンドを同定し、ゲルから切り出した。
バイオマーカーの候補を完全に性質決定するために、バイオマーカーが由来したタンパク質を同定することが不可欠であった。未知のタンパク質の同定には、ゲル内消化に続く、トリプシン断片の直列質量分析法が含まれた。源タンパク質を同定するために、MS/MSプロセスから得られた生成物イオンを、Swiss−Protタンパク質データベースに対して検索した。低分子量を有するバイオマーカー候補に関しては、直列質量分析後のデノボ配列決定およびデータベース検索が、源タンパク質を同定するために選択した方法であった。検索は、ホモ・サピエンスのゲノムのみを検討し、前駆体イオンに対する質量精度は±1.2Daおよび生成物イオンに対する質量精度は±0.8Da(MS/MS)であった。トリプシンに関しては、1つの喪失した切断のみが許容された。データベース検索に関して許容された唯2つの可変的修飾は、カルバミドメチル化(C)および酸化(M)であった。最終タンパク質IDは、Mascot検索エンジンの結果を編纂し、関連するMSおよびMS/MSスペクトルを手動で解釈した後に帰属させた。結果の精度は、反復測定によって確認した。
A.ペプチド又はタンパク質に対するイムノアッセイ:上記実施例9に記載されているバイオマーカーは、イムノアッセイ技術によって検出および測定することができる。例えば、本発明のバイオマーカーを含有していることが疑われる試料中における未知の物質の自動アッセイのために、Abbott DiagnosticsのArchitectTMイムノアッセイシステムが使用される。本分野において公知であるように、このシステムは、目的のバイオマーカーに結合することができる抗体で被覆された磁性微粒子を使用する。機器制御下で、試料の一部を抗体被覆された磁気微粒子の等量並びに緩衝液、塩、界面活性剤および可溶性タンパク質を含有する試料希釈液の2倍容量と混合する。温置後、緩衝液、塩、界面活性剤および防腐剤を含む洗浄緩衝液を用いて、微粒子を洗浄する。試料希釈液の等量とともにアクリジニウム標識された連結物の分取試料を添加し、粒子を再分散する。混合物を温置し、次いで、洗浄緩衝液で洗浄する。微粒子からアクリジニウム連結物を解離させるために、硝酸および過酸化水素を含有する酸性プレトリガー中に、洗浄された粒子を再分散する。次いで、化学発光反応を惹起するために、NaOHの溶液を添加する。光増倍管によって光を測定し、標準曲線を構築するために使用されたバイオマーカーペプチドの既知量を含有する試料の系列によって発せられた光との比較によって、未知の結果を定量する。次いで、同様に処理された臨床試料中のバイオマーカーの濃度を推定するために、標準曲線を使用する。結果は、単独で、又は以下に記載されているような他のマーカーと組み合わせて使用することができる。
データ積算の中央値倍数(MoM;multiple of median)法は、バイオマーカーのパネルのスコア付けを可能とする。中央値倍数法では、正常コホート中の各バイオマーカーの中央値を求める。その特定のバイオマーカーの全ての測定を標準化するために、この中央値を使用する。MoMは、血清抗体および血清抗原の両者のレベルを解析するために使用されてきた。W.Kuttechら(Obstet Gynecol.84;811−815(1994))は、患者中の抗リン脂質抗体レベルを報告するために、MoMを使用した。さらに、G.Palomakiら(Clinc.Chem.Lab.Med.) 39:1137−1145(2001))は、血清タンパク質レベルを解析するためにMoMを使用した。従って、測定されたあらゆるバイオマーカーのレベルが正常群の中央値によって除され、中央値の倍数が得られる。これらの中央値の倍数値は、パネル中の各バイオマーカーに関して合算され(すなわち、合計又は加算され)、各試料に対してパネルMoM値又はMoMスコアが得られる。臨床目的のために、疾病の存在又はリスクを示唆するパネルMoM値に対してカットオフを決定することができる。
A.市販のヒトタンパク質(表31、下記参照)をLuminexTMSeroMapTMビーズ(Austin,Texas)に結合し、試薬を調製するために、各ビーズセットを合わせる。存在する全ての抗体がタンパク質に結合できる条件下で、試薬の一部をヒト血清試料に曝露させた。結合していない物質を洗浄除去し、次いで、ヒトIgGに特異的に結合する抗体に連結されたR−フィコエリトリンの蛍光性連結物へビーズを曝露させた。洗浄後、ビーズの内部色素に従って各ビーズを特定するLuminexTM100装置にビーズを通過させ、ビーズに結合された蛍光(ビーズに結合された抗体の量に対応する。)を測定した。このようにして、21のヒトタンパク質および対照用の7つの非ヒトタンパク質(ウシ血清アルブミン(BSA)および破傷風トキシン)に対する772の試料(肺癌251、正常244、良性277)の免疫応答を評価した。
本研究のためのビーズは、実施例3Bに記載されている直接法、実施例4Eに記載されている事前活性化法又はここで記載されている受動吸着によって示されるとおりに被覆した。
マイクロプレート当り80の試料を用いて、PBN中へ1:30希釈して、血清試料をマイクロプレート中に調製した。プロトコール:1.2μSuporフィルタープレートのウェルに、PBN/Tween100μLを添加した。約5分後、真空にした。ウェルが空になった時点で、プレートの底を紙タオルで吸収し、ウェル当り1XMasterMix50μLを添加した。各ウェルに、1;30試料20μLを試料プレートから添加し、次いで、最大振盪数で振盪装置上において60分間温置した。全ての液体を除去するために、真空にした。PBN/Tween100μLを添加し、全ての液体を除去するために真空にした。PBN/Tween100μLを添加し、振盪装置上に10分間配置し、次いで、全ての液体を除去するために真空にした。PBN/Tween100μLを添加し、振盪装置上に10分間配置し、全ての液体を除去するために真空にした。1:500連結物(PBN/Tween10.4mL中のRPE抗ヒトIgG20.8μL)100μLを各ウェルに添加し、ピペットで撹拌し、振盪装置上に30分間配置し、全ての液体を除去するために真空にした。PBN/Tween100μLを添加し、ピペットで撹拌し、マイクロプレートに移し、Luminex上で走行させた。
a.ROC解析
各試料を用いて検査された各自己抗原に対して記録された生の結果は、中央値であった。これらの結果を受信者動作特性(ROC)解析に供し、癌を非癌群から区別するために、曲線下面積(AUC)を計算した。下表31は、各自己抗原に対するAUC値を報告する。
癌を非癌群から識別する際のバイオマーカーの複数パネルを評価するために、二分スコアリング法を使用した。下表32は、各バイオマーカーに対して使用された分離点(カットオフ)を列記する。下表33は、各パネル中の各マーカーおよび各パネルに対するAUCを特定する。
「正常」群の中央値で除することによって、各バイオマーカーに対する生データを中央値の倍数へ変換した。各パネルに対して中央値の倍数を合計して、各試料に対する中央値の倍数のパネルを得る。これらの中央値の倍数のパネルを、受信者動作特性分析に供し、下表33aおよび33b中にAUCが報告されている。
チモシンβ4EIAキットは、ALPCODiagnostics(Salem, NH)から購入した。
アッセイは、製造業者の指示に従って実行した。血清試料は、希釈せずに直接使用した。正常、良性および癌患者試料を含有する118の試料の選択された群を実施した。分析物の濃度は、製造業者のプロトコール中に指示されているとおりに、既知の標準濃度の4−パラメータロジスティック曲線の適合(4PLC)から得た。全ての計算は、JMP5.0統計パッケージ中に提供されている非線形曲線フィッティングアルゴリズムを用いて行った。Tβ4アッセイに対して得られたAUCが図10に示されている。
Claims (16)
- a.対象から得られた検査試料中において、少なくとも1つの抗体と少なくとも1つの抗原を含むパネル中の2つ又はそれ以上のバイオマーカーの量を定量する工程;
b.前記パネル中で定量された各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する所定のカットオフと比較し、該比較に基づいて、各バイオマーカーに対してスコアを割り当てる工程;
c.前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対して割り当てられたスコアを合算する工程;
d.工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程;および
e.工程dにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌のリスクを有するかどうかを決定する工程;
を含む、肺癌と疑われる対象の診断を補助する方法であって、
前記パネルは、少なくとも4つの自己抗原p53、NY−ESO−1、MAPKAPK3およびサイクリンE2を全て含む、前記方法。 - (i)パネルが、抗TMP21、抗HDJ1、抗NPC1L1Cドメイン、抗TMOD1、抗CAMK1、抗RGS1、抗PACSIN1、および抗RCV1からなる群から選択される少なくとも1つの抗体をさらに含む;
(ii)パネルが、サイトケラチン8、サイトケラチン19、サイトケラチン18、CEA、CA125、CA19−9、CA15−3、SCC、プロGRP、血清アミロイドA、α−1−アンチトリプシン、アポリポタンパク質CIIIおよびチモシンβ4からなる群から選択される少なくとも1つの抗原をさらに含む;
(iii)パネルが、Acn6399、Acn9459、Pub11597、Pub4789、TFA2759、TFA9133、Pub3743、Pub8606、Pub4487、Pub4861、Pub6798、Pub6453、Pub2951、Pub2433、Pub17338、TFA6453およびHIC3959からなる群から選択される少なくとも1つの関心領域をさらに含む;
(iv)パネルが、TMP21、HDJ1、NPC1L1Cドメイン、TMOD1、CAMK1、RGS1、PACSIN1、およびRCV1からなる群から選択される少なくとも1つの抗原をさらに含む;
(v)パネルが、抗サイトケラチン8、抗サイトケラチン19、抗サイトケラチン18、抗CEA、抗CA125、抗CA19−9、抗CA15−3、抗SCC、抗プロGRP、抗血清アミロイドA、抗α−1−アンチトリプシン、抗アポリポタンパク質CIIIおよび抗チモシンβ4からなる群から選択される少なくとも1つの抗体をさらに含む;又は
(vi)パネルが、Acn6399、Acn9459、Pub11597、Pub4789、TFA2759、TFA9133、Pub3743、Pub8606、Pub4487、Pub4861、Pub6798、Pub6453、Pub2951、Pub2433、Pub17338、TFA6453およびHIC3959からなる群から選択される少なくとも1つの関心領域を定量するための試薬をさらに含む、
請求項1の方法。 - 肺癌に関するバイオマーカーのDFIが0.4未満であり、前記DFIは、[(1−感受性) 2 +(1−特異性) 2 ] 1/2 である、請求項1の方法。
- 工程bが、パネル中の各バイオマーカーの量を、前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、および該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、工程cが、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを合算することを含み、工程dが、工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、および工程eが、工程dにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む、請求項1の方法。
- 対象の少なくとも1つのバイオメトリックパラメータに対して値を取得する工程;および
各前記バイオメトリックパラメータに対する所定のカットオフに対して、前記少なくとも1つのバイオメトリックパラメータの値を比較し、および該比較に基づいて各バイオメトリックパラメータに対してスコアを割り当てる工程;
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - バイオメトリックパラメータが対象の喫煙歴、年齢、発癌性物質への曝露および性別からなる群から選択される、請求項5の方法。
- バイオメトリックパラメータが喫煙のパック・年である、請求項6の方法。
- 前記方法が、各バイオメトリックパラメータの値を、前記バイオメトリックパラメータに対する多数の所定のカットオフに対して比較し、該比較に基づいて各前記バイオメトリックパラメータに対して多数の可能なスコアの1つを割り当てることを含み、
工程bが、パネル中の各バイオマーカーの量を前記バイオマーカーに対する多数の所定のカットオフと比較し、および該比較に基づいて各バイオマーカーに対してスコアを割り当てることを含み、
工程cが、前記対象に対する合計スコアを得るために、工程bにおいて定量された各バイオマーカーに対する割り当てられたスコアを、バイオメトリックパラメータに対する割り当てられたスコアと合計することを含み、
工程dが工程cにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアと比較することを含み、および
工程eが、工程dにおける合計スコアの比較に基づいて、前記対象が肺癌を有するかどうかを決定することを含む、請求項5の方法。 - サイクリンE2が、配列番号3、配列番号4又は配列番号5である、請求項1の方法。
- a.検査試料中の1つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも1つの抗体を含有する試薬(前記抗原は、サイトケラチン8、サイトケラチン19、サイトケラチン18、CEA、CA125、CA15−3、SCC、CA19−9、プロGRP、血清アミロイドA、α−1−アンチトリプシン、アポリポタンパク質CIII又はチモシンβ4である。)、
b.検査試料中の少なくとも1つの抗体を定量するための1つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬(前記抗体は、抗p53、抗NY−ESO−1、抗MAPKAPK3および抗サイクリンE2である。);並びに
c.検査試料中の定量された各抗原および抗体の量を合算し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原および抗体に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合算し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するためのアルゴリズム;
を含む、キット。 - Acn6399、ACN9459、Pub11597、Pub4789、TFA2759、TFA9133、Pub3743、Pub8606、Pub4487、Pub4861、Pub6798、Pub6453、Pub2951、Pub2433、Pub17338、Tfa6453およびHic3959からなる群から選択される1つ又はそれ以上の関心領域を定量するための試薬をさらに含む、請求項10のキット。
- a.検査試料中の1つ又はそれ以上の抗原を定量するための少なくとも1つの抗体を含有する試薬(前記抗原は、サイトケラチン19、CEA、CA125およびプロGRPである。);
b.検査試料中の少なくとも1つの抗体を定量するための1つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬(前記抗体は、抗p53、抗NY−ESO−1、抗MAPKAPK3および抗サイクリンE2である。);並びに
c.検査試料中の定量された各抗原および抗体の量を合算し、所定のカットオフに対して比較し、並びに該比較に基づいて、定量された各抗原および抗体に対するスコアを割り当て、合計スコアを得るために、定量された各抗原および抗体に対する割り当てられたスコアを合算し、合計スコアを所定の合計スコアと比較し、および対象が肺癌を有するかどうかを決定する上での補助として前記比較を使用するためのアルゴリズム;
をさらに含む、請求項10のキット。 - 検査試料中のサイトケラチン19、CEA、CA125およびプロGRPの各々を定量するための試薬を含有する、請求項12のキット。
- 検査試料中の抗p53、抗NY−ESO−1、抗MAPKAPK3および免疫反応性サイクリンE2に対する少なくとも1つの抗体の各々を定量するための試薬を含有する、請求項12のキット。
- 検査試料中のサイトケラチン19、CEA、CA125、プロGRP、抗p53、抗NY−ESO−1、抗MAPKAPK3および抗サイクリンE2の各々を定量するための試薬を含有する、請求項12のキット。
- 検査試料中の少なくとも1つの抗体を定量するための1つ又はそれ以上の抗原を含有する試薬をさらに含み、前記抗体が、抗TMP21、抗NPC1L1Cドメイン、抗TMOD1、抗HDJ1、抗CAMK1、抗RGS1、抗PACSIN1、または抗RCV1である、請求項10に記載のキット。
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