ES2595952T3 - Análogos heterocíclicos de inhibidores enlazados a propargilo de la dihidrofolato reductasa - Google Patents

Análogos heterocíclicos de inhibidores enlazados a propargilo de la dihidrofolato reductasa Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula V**Fórmula** en la que R se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1 a C5, alcoxi C1 a C3, e hidroxi; en la que R1, R2, R3, R4, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y alquilo C1 a C5, cicloalquilo, alcoxialquilo, alcoxialcoxialquilo, arilalquilo, alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, alcoxialquilcarbonilo, alcoxialcoxialquilcarbonilo, arilcarbonilo, piridinilcarbonilo, ariloxialquilo, haloalquilcarbonilo, y cianoalquilcarbonilo; en la que A y B se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6; en la que uno de V y W es un grupo metoxi y el otro se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar independiente sustituidos opcionalmente una o más veces con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir C1 a C6, en la que dos de J, L y M, se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar independiente sustituidos opcionalmente una o más veces con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir C1 a C6, y en la que (a) el otro de J, L y M es un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol, y imidazol, en la que la propia piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol, o imidazol puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, o ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi o ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar independientemente sustituidos opcionalmente una o más veces con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir C1 a C6, o (b) el otro de J, L, y M se selecciona del grupo que consiste en fórmula VIA y fórmula VIB**Fórmula** en la que al menos uno de R32, R33, R34, R35 y R36 es N y cualquiera de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N es CRx, en la que para cada uno de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N, Rx está independientemente 5 seleccionado de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar independientemente sustituidos opcionalmente una o más veces con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir C1 a C6; en la que R37 es O, NH o NCH3; en la que R38 es N o CH, y cuando R38 es CH, R37 es NH o NCH3; y en la que R39 y R40 independientemente son hidrógeno o CH3 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Description

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Fórmula IVE Fórmula IVF
en la que R20, R23, R24 y R29 se selecciona del grupo que consiste en CH, CH2, O, N y NH de modo que la valencia para cada uno de estos sustituyentes es neutra (es decir, estos sustituyentes no están cargados ni positivamente ni 5 negativamente);
en la que R21, R22, R25, R27, R28, R30 y R31 se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, C1-5alquilo, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio
10 inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6.
15 En un modo de realización alternativo, los compuestos de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento están englobados por los compuestos de fórmula V
Fórmula V
20 en la que R, R1, R2, R3, R4, A, B, V y W se definen como anteriormente para la fórmula I; y en la que dos de J, L y M se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y
25 ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L y M es un sustituyente heterocíclico en la que al menos un heteroátomo es N, y en la que el propio sustituyente heterocíclico puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo
30 inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores
35 quiere decir alquilo C1 a C6.
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En algunos modos de realización, dos de J, L, y M, se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L, y M es un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol e imidazol, en la que la piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol, o imidazol por sí mismo puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi o ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6.
En algunos modos de realización, dos de J, L, y M se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6 alquilo, y el otro de J, L, y M se selecciona del grupo que consiste en fórmula VIA y fórmula VIB
Fórmula VIA Fórmula VIB
en la que al menos uno de R32, R33, R34, R35 y R36 es N y cualquiera de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N es CRx, en la que para cada uno de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N, Rx está independientemente seleccionado de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar independientemente sustituidos opcionalmente una o más veces con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores es C1 a C6;
en la que R37 es O, NH o NCH3;
en la que R38 es N o CH, y cuando R38 es CH, R37 es NH o NCH3; en la que R39 y R40 independientemente son hidrógeno o CH3.
En otro modo de realización, cualquiera de cualquiera de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N es CH.
En otro modo de realización, R es CH3 o CH2CH3; R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno; uno de A y B es hidrógeno y el otro de A y B es CH3; y V y W son cada uno independientemente hidrógeno o alcoxi C1 a C5.
En otro modo de realización, uno de V y W es metoxi y el otro es hidrógeno. En una variación de este modo de realización, V es metoxi y W es hidrógeno.
En otro modo de realización, al menos dos de R32, R33, R34, R35, y R36 son N y los otros son CH.
En otro modo de realización, R37 es O y R39 y R40 son iguales y son hidrógeno o CH3.
En otro modo de realización, R37 es NH o NCH3 y R39 y R40 son hidrógeno.
5 En otros modos de realización, dos de J, L, y M se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con
10 halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L, y M se selecciona del grupo que consiste en fórmula VIC, fórmula VID y fórmula VIE
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15 en la que uno de R41 y R42 es N y el otro es CH; en la que R43 es H o alquilo C1-C6; en la que uno de R44, R45 y R46 es N, un segundo de R44, R45 y R46 es O, S, NH, o N(alquilo C1 a C6), y el tercero de R44, R45 y R46 es CH; y en la que cualquier carbono de metino en el grupo heterocíclico puede servir como punto de unión del grupo heterocíclico al compuesto de fórmula V.
20 Un esquema de reacción general para generar los compuestos de fórmula I se muestra a continuación en el esquema I.
Esquema I
En el esquema I, se debe reconocer que puede ser necesario usar grupos protectores dependiendo de los sustituyentes que están representados por V, W, X, Y y Z. Además, se debe reconocer que se puede añadir A y/o B 5 al esquema anterior I (como se muestra en la fórmula I) para colocar un sustituyente en la funcionalidad metileno adyacente al triple enlace carbono-carbono.
Otro esquema de reacción posible que se puede usar para generar los compuestos de la fórmula I se muestra a continuación en el esquema II.
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Si se prefiere el ataque con orientación exo en la olefina, el etanol de la cadena lateral debe servir como elemento de control de modo que los grupos voluminosos se añaden al carbono distal de la olefina. En consecuencia, se espera que la hidroboración seguida de oxidación del organoborano intermedio suministre 33, que se puede reducir fácilmente al alcohol 30b. Asimismo, la epoxidación debe dar 34 donde se debe producir una abertura reductora con un dador de hidruro voluminoso extremo menos impedido para dar 35. Se sabe que en un compuesto altamente relacionado, el grupo hidroxilo exo se puede invertir fácilmente al alcohol endo a través del triflato derivado. Un protocolo similar dará 30b.
Si domina el modo endo alternativo, entonces la epoxidación debe dar 36 donde la abertura reductora del epóxido estaría controlada por el grupo de cabeza de puente para dar 30a. El otro isómero estaría disponible usando elementos de control similares. La mercuración en el lado endo estaría seguida por el ataque de agua en el lado menos impedido del ion mercurinio 37 para dar 38. La reducción del organomercúrico resultante y la inversión a través del triflato daría el isómero alternativo 30b.
El enfoque sintético a las tres estructuras bicíclicas divulgadas en la presente solicitud hace uso de química de cicloadición clave para ensamblar los compuestos con puentes. Aunque existe un precedente excelente del uso amplio de furanos y ciclohexadienos en procedimientos de cicloadición similares, las reacciones de cicloadición que usan pirroles son bien conocidas por ser un procedimiento más sensible. Para garantizar que se obtiene un acceso a todas las estructuras de partida, se puede preparar una vía alternativa a los compuestos con puentes aza clave a partir de intermedios conocidos a través de vías distintas a la cicloadición (véase el esquema 7).
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Los alcoholes endo 39 y 40 son conocidos y ambos se pueden preparar a través de secuencias cortas y de forma tanto racémica como enantiómera pura. Se pueden usar compuestos racémicos para preparar los compuestos específicos como enantiómeros individuales. La protección inicial del grupo hidroxilo libre como un éter silílico se seguirá de la semirreducción del éster de cabeza de puente a los correspondientes aldehídos 41 y 42. La clave para la preparación de las estructuras es la capacidad para homologar el aldehído. A continuación, se realizará una extensión de la cadena empleando el reactivo de Wittig de metoxi bien conocido que generará los aldehídos 43 y 44 tras una hidrólisis ácida sencilla. Una vez que está disponible el aldehído, se seguirá una segunda homologación para el acetileno terminal usando el protocolo de Ohira-Bestmann y una desprotección simultánea final de los grupos BOC y TBS en condiciones ácidas dará las dos estructuras clave 45 y 46 para la construcción de la colección.
Aunque la preparación de estas estructuras con puentes requiere varias etapas, la diversidad no se introduce hasta el final mismo de la síntesis, lo que significa que se necesitan realizar en paralelo muy pocas transformaciones o
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preparación racémica a una vía enantiómera usando un grupo TMS en 72 para imitar el diastereocontrol ejercido por el grupo metilo relacionado en 67. La preparación del alcohol α-silílico enantiopuro se puede lograr por reducción de CBS del correspondiente acilsilano. Con una vía para el bloque básico racémico y posiblemente quiral 71, se podrán preparar tres estructuras complementarias a partir de este intermedio común (véase el esquema 13).
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La oxidación de 74 dará el cetoaldehído 75 que se puede convertir en 76 por reacción del aldehído más reactivo con el reactivo de Ohira-Bestmann para dar la estructura 76. Se sabe que la reducción de las cetonas bicíclicas tales 10 como 76 se produce con altos niveles de diastereoselectividad ya que el agente reductor se aproxima desde el lado menos impedido con el puente olefínico. En consecuencia, la segunda estructura 77 se debe formar tras la reducción con una fuente de hidruro voluminosa. De forma alternativa, la reducción directa de 78 debe dar diol 79 con un estereocontrol similar que se convertirá en el sistema protegido en bis 80. Una secuencia de hidroboración/oxidación regioselectiva controlada por el grupo etanol de cabeza de puente debe dar la cetona 81. La
15 estructura 84 se generará a través de una secuencia análoga como 76. Estas tres estructuras clave permitirán la generación de pequeñas colecciones focalizadas de nuevos inhibidores usando procedimientos de diversificación más breves (véase el esquema 14).
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20 La diversificación de estas estructuras se puede lograr usando la ortogonalidad de los grupos hidroxilo y ceto. La diversificación del grupo ceto se producirá por condensación con diversas hidrazinas, sulfonilhidrazinas y acilhidrazinas usando una captura de resina para retirar el exceso de reactivos. Se usarán procedimientos de acilación estándar para elaborar la funcionalidad alcohol. La unión final a la diaminopirimidina completa la vía para
25 familias análogas 88-90.
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Tabla 1
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N.º compuesto
R R1 R2 R3 R4 A B V W X Y Z
14
H H H H H H H H OCH3 OCH3 OCH3 H
16
CH3 H H H H H H H OCH3 OCH3 OCH3 H
20
H H H H H CH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
21
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
24
H H H H H OH H H OCH3 OCH3 OCH3 H
25
CH3 H H H H OH H H OCH3 OCH3 OCH3 H
127
H H H H H OCH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
128
CH3 H H H H OCH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
137(R)
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
138(S)
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
15
H H H H H H H OCH3 H H OCH3 H
17
CH3 H H H H H H OCH3 H H OCH3 H
18
CH3 H H H H H H OCH3 H H OCH3 H
6
CH3 CH2 H H H H H H OCH3 H H OCH3 H
7
n-propil H H H H H H OCH3 H H OCH3 H
8
CH3 H H H H CH3 CH2 H H OCH3 OCH3 OCH3 H
(continuación)
N.º compuesto
R R1 R2 R3 R4 A B V W X Y Z
9
CH3 H H H H CH3 CH3 H OCH3 OCH3 OCH3 H
10
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H fenil H
11
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H 2-Mefenil H
12
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H 2,6-Mefenil H
13
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H Br H
116
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H fenil, OCH3
139
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H fenil H
140
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H 3,5-metil, fenil H
141
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H 4-metil, fenil H
142
CH3 CH2 H H H H H H OCH3 H H fenil H
143
CH3 CH2 H H H H H H H H H fenil H
144
CH3 CH2 H H H H H H H OCH3 H fenil H
145
CH3 H H H H CH3 H OCH3 H H fenil H
146
CH3 CH2 H H H H CH3 H OCH3 H H fenil H
147
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen20 H
148
CH3 CH2 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen21 H
149
CH3 CH2 H H H H H H OCH3 H H imagen22 H
150
CH3 CH2 H H H H H H H OCH3 H imagen23 H
(continuación)
N.º compuesto
R R1 R2 R3 R4 A B V W X Y Z
151
CH3 CH2 H H H H H H H H H imagen24 H
152
CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen25 H
153
CH3 CH2 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen26 H
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CH3 CH2 H H H H H H H H H imagen27 H
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CH3 CH2 H H H H H H H H H imagen28 H
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CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen29 H
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CH3 CH2 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen30 H
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CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen31 H
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CH3 H H H H CH3 H H OCH3 H imagen32 H
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en base a dos estructuras diferentes, en ensayos enzimáticos (tabla 3). Muchos de los compuestos fueron inhibidores muy potentes de CgDHFR con valores de CI50 menores de 100 nM; cuatro inhibidores (compuestos 5, 6, 9, 11) tienen valores de CI50 iguales a o menores de 25 nM. Además, cuando los compuestos de propargilo se sometieron a ensayo con DHFR humana, se observaron proporciones de selectividad tan altas como de 156 veces (tabla 3).
Tabla 3. Resultados de inhibición enzimática y ensayos antifúngicos para inhibidores enlazados a propargilo
Estructura A
Estructura B
Compuesto
Tipo de estructura R1 R2 CgDHFR CI50 (nM) hDHFR CI50(nM) Selectividad (h/CgDHFR) Actividad antifúngica, CIM (μg/ml)
1
A H H 33 1460 44 Inact*
2
A H CH3 36 1460 40,6 Inact
3
A H OH 2700 14300 5,3 328
4
A H OMe 450 1160 2,6 Inact
5
A CH3 H 17 400 23,5 20
6
A CH3 CH3 25 1380 55,2 21
7
A CH3 OH 39 5710 146 Inact
8
A CH3 OMe 30 1220 40,7 Inact
9
B H H 21 3200 152 71
10
B CH3 H 32 1300 40,6 56
11
B Et H 8,2 1280 156 78
*Inact: no activo a 2 mM (~ 600 μg/ml)
10 A continuación, los compuestos se sometieron a prueba como agentes antifúngicos en un ensayo antifúngico contra
C. glabrata. Varios de los compuestos, en particular los compuestos 5 y 6 de la tabla 3, presentaron propiedades antifúngicas.
Usando la información estructural anterior, se diseñó una segundo generación de inhibidores de CgDHFR que dio
15 como resultado una potencia subnanomolar y niveles muy altos de selectividad hacia la enzima de C. glabrata. También se descubrió que la segunda generación de inhibidores de CgDHFR destruía C. glabrata en cultivo a concentraciones que imitaban a las de los agentes antifúngicos usados clínicamente.
Los análogos heterocíclicos de tercera generación descritos previamente también se sometieron a prueba como
20 agentes antifúngicos. Los compuestos se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir CgDHFR y DHFR humana (hDHFR) y su capacidad para inhibir el crecimiento de C. glabrata. Estos compuestos presentan una inhibición enzimática ligeramente más débil en comparación con la serie de bifenilo de segunda generación, pero muestran una solubilidad significativamente potenciada e inhiben potencialmente el crecimiento de C. glabrata mientras que presentan valores de selectividad muy altos. Se descubrió que algunos derivados tienen una potencia
25 comparable a los agentes antifúngicos usados clínicamente.
Composiciones farmacéuticas
Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos como se divulga anteriormente
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65
combinados con uno o más diluyentes, excipientes, vehículos o sistemas de administración farmacéuticamente aceptables. Se pueden preparar uno o más de los compuestos en una formulación fisiológicamente aceptable, tal como en un vehículo farmacéuticamente aceptable, usando técnicas conocidas. Por ejemplo, el compuesto se combina con un excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición terapéutica.
En otro modo de realización, las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden administrar junto con, o además de, sulfamidas para formar composiciones farmacéuticas terapéuticas. Se reconoce en la técnica que las sulfamidas presentan una actividad alta contra bacterias patógenas. Los ejemplos no limitantes de sulfamidas y los procedimientos por los que se preparan las sulfamidas se proporcionan en la patente de los EE. UU. 3.091.610, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los fines.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden administrar en forma de un sólido, líquido o aerosol. Los ejemplos de composiciones sólidas incluyen pastillas, cremas y unidades de dosificación implantables. Las pastillas se pueden administrar por vía oral. Las cremas terapéuticas se pueden administra por vía tópica. Las unidades de dosificación implantables se pueden administrar por vía local, o se pueden implantar para una liberación sistemática de la composición terapéutica, por ejemplo, por vía subcutánea. Los ejemplos de composiciones líquidas incluyen formulaciones adaptadas para inyección por vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraarterial, y formulaciones para administración tópica e intraocular. Los ejemplos de formulaciones de aerosol incluyen formulaciones de inhalador para su administración a los pulmones.
Las composiciones se pueden administrar por vías de administración estándar. En general, la composición se puede administrar por vías tópica, oral, rectal, nasal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular). Además, la composición se puede incorporar en una matriz o matrices de liberación mantenida tales como polímeros biodegradables, estando implantados los polímeros en la proximidad de donde se desea la administración. El procedimiento incluye la administración de una única dosis, administración de dosis repetidas a intervalos de tiempo predeterminados, y administración mantenida durante un periodo de tiempo predeterminado.
Una matriz de liberación mantenida, como se usa en el presente documento, es una matriz fabricada de materiales, normalmente polímeros que son degradables por hidrólisis enzimática o ácida/básica o por disolución. Una vez insertada en el organismo, la matriz se ve afectada por enzimas y fluidos corporales. De forma deseable, la matriz de liberación mantenida se elige por materiales biocompatibles tales como liposomas, poliláctidos (poli(ácido láctico)), poliglicólido (polímero de ácido glicólico), poli(láctido-co-glicólido) (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), polianhídridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferente es una matriz de uno o cualquiera de poliláctido, poliglicólido, o poli(láctido-co-glicólido) (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).
Se debe entender que además de los ingredientes mencionados anteriormente de forma particular, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión.
La dosificación de la composición dependerá de la progresión de la infección o cáncer, la composición particular usada, y otros factores clínicos tales como peso y afección del paciente, y la vía de administración.
Procedimientos de tratamiento
Se proporcionan procedimientos de tratamiento de infecciones bacterianas, fúngicas y protozoicas y cáncer usando los compuestos descritos en el presente documento. De acuerdo con los procedimientos, una o más de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, que contienen una concentración terapéuticamente eficaz de compuesto, se administra a un individuo que necesita el tratamiento.
Los compuestos inhibidores de DHFR descritos en el presente documento son potentes y selectivos para muchos organismos patógenos diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, la enzima DHFR de bacterias tales como Bacillus anthracis y Staplylococcus aureus resistente a meticilina y Streptococcus pyogenes, hongos tales como Candida glabrata, Candida albicans y Cryptococcus neoformans y protozoos tales como Cryptosporidium hominis y Toxoplasma gondii. Estos compuestos y otros compuestos similares también son potentes contra la enzima de mamífero y pueden ser útiles como tratamientos antineoplásicos. En otras palabras, se ha demostrado que los compuestos de la presente invención tienen una fuerte actividad in vitro contra la enzima de mamífero y se ha demostrado que algunos de los compuestos de la presente invención tienen actividad contra líneas celulares de mamífero. Específicamente, se ha demostrado que el compuesto inhibidor 5-[3-(3-metoxi-2’6’-diisopropilbifenil-4il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina presenta toxicidad en células de mamífero y puede ser útil como tratamiento antineoplásico.
El tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad bacteriana, fúngica y protozoica o cáncer se puede llevar a cabo administrando al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que contiene uno o más de los
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C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior,
en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores es C1 a C6.
En un modo de realización, al menos uno de V, W, X, Y y Z es un grupo metoxi. En otro modo de realización, todos los W, X e Y son grupos metoxi. En otro modo de realización, al menos uno de V e Y es un grupo metoxi. En otro modo de realización, ambos V e Y son grupos metoxi. En otro modo de realización, al menos uno de A y B no es alquilo C1-5. 28.
En un modo de realización para el tratamiento de una infección protozoica, una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un individuo, en el que fórmula I es
Fórmula I
en la que R se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-5, alcoxi C1-3 e hidroxi;
en la que R1, R2, R3, y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y alquilo C1-5, cicloalquilo, alcoxialquilo, arilalquilo, alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, alcoxialquilcarbonilo, alcoxialcoxialquilcarbonilo, arilcarbonilo, piridinilcarbonilo, ariloxialquilo, haloalquilcarbonilo, y cianoalquilcarbonilo;
en la que A y B se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6;
en la que A y B junto con el carbono al que están conectados pueden formar un anillo de desde 3 a 7 miembros en la que los miembros de anillo se seleccionan del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, y alquinileno, en la que cualquiera de los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno puede estar interrumpido opcionalmente por uno o más heteroátomos del grupo que consiste en O, N, S y Se y el alquileno o alquenileno puede estar sustituido opcionalmente con uno o más de alquilo C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6;
en la que V, W, X, Y y Z se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi,
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fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior,
en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores es C1 a C6.
En un modo de realización, al menos uno de V, W, X, Y y Z es un grupo metoxi. En otro modo de realización, todos los W, X e Y son grupos metoxi. En otro modo de realización, al menos uno de V e Y es un grupo metoxi. En otro modo de realización, ambos V e Y son grupos metoxi. En otro modo de realización al menos uno de A y B no es alquilo C1-5.
En un modo de realización para el tratamiento de una infección protozoica, una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un individuo, en el que fórmula I es como se indica anteriormente.
En un modo de realización para el tratamiento de cáncer, una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un individuo, en el que fórmula I es
Fórmula I
en la que R se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-5, alcoxi C1-3, e hidroxi; en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y alquilo C1-5, cicloalquilo, alcoxialquilo, arilalquilo, alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, alcoxialquilcarbonilo, alcoxialcoxialquilcarbonilo, arilcarbonilo, piridinilcarbonilo, ariloxialquilo, haloalquilcarbonilo, y cianoalquilcarbonilo;
en la que A y B se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6;
en la que A y B junto con el carbono al que están conectados pueden formar un anillo de desde 3 a 7 miembros en la que los miembros de anillo se seleccionan del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, y alquinileno, en la que cualquiera de los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno puede estar interrumpido opcionalmente por uno o más heteroátomos del grupo que consiste en O, N, S y Se y el alquileno o alquenileno puede estar sustituido opcionalmente con uno o más de alquilo C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6;
en la que V, W, X, Y y Z se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior,
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en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores es C1 a C6.
En un modo de realización, al menos uno de V, W, X, Y y Z es un grupo metoxi. En otro modo de realización, todos los W, X e Y son grupos metoxi. En otro modo de realización, al menos uno de V e Y es un grupo metoxi. En otro modo de realización, ambos V e Y son grupos metoxi. En otro modo de realización al menos uno de A y B no es alquilo C1-5.
Las composiciones y procedimientos se ilustran adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes, que no se deben interpretar en modo alguno como limitaciones impuestas sobre el alcance de los mismos. Por el contrario, debe entenderse claramente que se puede recurrir a otros diversos modos de realización, modificaciones y equivalentes de los mismos que, tras leer la descripción en el presente documento, se les puedan ocurrir a los expertos en la técnica sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
En un modo de realización para el tratamiento de una infección bacteriana, una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula V o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un individuo, en el que fórmula V es
Fórmula V
en la que R, R1, R2, R3, R4, A, B, V y W se definen como anteriormente para la fórmula I; y en la que dos de J, L y M se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L y M es un sustituyente heterocíclico en la que al menos un heteroátomo es N, y en la que el propio sustituyente heterocíclico puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6.
En algunos modos de realización, dos de J, L, y M, se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L, y M es un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol e imidazol, en la que la piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol, o imidazol por sí mismo puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo
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En otro modo de realización, al menos dos de R32, R33, R34, R35, y R36 son N y los otros son CH.
En otro modo de realización, R37 es O y R39 y R40 son iguales y son hidrógeno o CH3.
5 En otro modo de realización, R37 es NH o NCH3 y R39 y R40 son hidrógeno.
En otros modos de realización, dos de J, L, y M se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior,
10 alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L, y M se selecciona del grupo que consiste en fórmula VIC, fórmula VID y fórmula VIE
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Fórmula VIC Fórmula VID
Fórmula VIE
en la que uno de R41 y R42 es N y el otro es CH; en la que R43 es H o alquilo C1-C6; en la que uno de R44, R45 y R46 es N, un segundo de R44, R45 y R46 es O, S, NH, o N(alquilo C1 a C6), y el tercero de R44, R45 y R46 es CH; y en la 20 que cualquier carbono de metino en el grupo heterocíclico puede servir como punto de unión del grupo heterocíclico al compuesto de fórmula V.
En un modo de realización para el tratamiento de cáncer, una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula V o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un individuo, en el que fórmula V es 25
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Fórmula V
en la que R, R1, R2, R3, R4, A, B, V y W se definen como anteriormente para la fórmula I; y en la que dos de J, L y M
30 se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior,
35 alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L y M es un sustituyente heterocíclico en la que al menos un heteroátomo es N, y en la que el propio sustituyente heterocíclico puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino
40 inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi
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pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6.
En algunos modos de realización, dos de J, L, y M, se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior, o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L, y M es un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol e imidazol, en la que la piperidina, perhidropirimidina, morfolina, piridina, pirimidina, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, tiazol, o imidazol por sí mismo puede estar opcionalmente sustituido una o más veces con alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi o ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6.
En algunos modos de realización, dos de J, L, y M se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar sustituidos opcionalmente con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores quiere decir alquilo C1 a C6, y el otro de J, L, y M se selecciona del grupo que consiste en fórmula VIA y fórmula VIB
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Fórmula VIA Fórmula VIB
en la que al menos uno de R32, R33, R34, R35 y R36 es N y cualquiera de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N es CRx, en la que para cada uno de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N, Rx está independientemente seleccionado de hidrógeno, alquilo C1 a C5, halógeno, hidroxi, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, nitro, aminocarbonilo, alquilsulfinilo inferior, alquilcarbonilamino inferior, alquilsulfonilamino inferior, alquiltio inferior, alquilsulfonilo inferior, formilo, alcoxicarbonilo inferior, dialquilsililoxi, fenilo, fenoxi, arilalcoxi, y ariloxialcoxi, en la que los sustituyentes fenilo, fenoxi, arilalcoxi y ariloxialcoxi pueden ellos mismos estar independientemente sustituidos opcionalmente una o más veces con halógeno, haloalquilo inferior, alquilo inferior, alcoxi inferior o alquilsulfonilo inferior, en la que "inferior" usado conjuntamente con cualquiera de los grupos anteriores es C1 a C6;
en la que R37 es O, NH o NCH3;
en la que R38 es N o CH, y cuando R38 es CH, R37 es NH o NCH3; en la que R39 y R40 independientemente son hidrógeno o CH3.
En otro modo de realización, cualquiera de cualquiera de R32, R33, R34, R35 y R36 que no sea N es CH.
En otro modo de realización, R es CH3 o CH2CH3; R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno; uno de A y B es hidrógeno y el otro de A y B es CH3; y V y W son cada uno independientemente hidrógeno o alcoxi C1 a C5.
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340 nm en una solución que contenía ácido tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico 50 mM pH 7,0, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 75 µM, 1 mg/ml de seroalbúmina bovina, dihidrofolato 1 mM (Eprova), y fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH) 100 µM (Sigma) y concentraciones limitantes de enzima. Se dejó que la enzima y el inhibidor se incubaran durante 5 min antes de añadir dihidrofolato para iniciar la reacción. Se realizaron ensayos enzimáticos al menos cuatro veces. Se calcularon los valores de CI50 y sus desviaciones estándar en presencia de concentraciones variables de inhibidor próximas a la concentración de CI50. Las desviaciones estándar están dentro del 10 % del valor informado.
Se realizaron ensayos antifúngicos usando C. glabrata como una suspensión en glicerol al 50 % a -78 ºC. Para la prueba de susceptibilidad, se realizó una tanda de cultivo de reserva en agar SDA y se hizo crecer a 30 ºC durante 48 h. Se recuperó una colonia pura del organismo de prueba de la placa, se suspendió en medio apropiado en un cultivo en matraz de agitación de 5 ml. Se diluyó una muestra del cultivo en matraz de agitación a 1 x 105 células/ml en el medio y se añadió a placas de prueba de 96 pocillos (100 μl por pocillo) que contenían los compuestos de prueba dosificados en DMSO (1 µl). Se usaron anfotericina y cetoconazol como controles. Después de un periodo de incubación determinado a partir del tiempo de duplicación específico para la cepa, se añadió Alamar Blue (10 µl), se dejó incubar; se puntuó cada pocillo para la reducción de colorante. Se tomó el valor de CIM como la menor concentración del compuesto de prueba que inhibe el crecimiento de modo que se observe una reducción de menos de un 1 % del componente de resazurina azul (λmáx 570 nm) del Alamar Blue a la resorufina rosa (λmáx 600 nm).
Cálculo de la eficacia de ligando
La eficacia de ligando se expresa como la energía de unión por átomo distinto de hidrógeno (¢G/N átomos distintos de hidrógeno) donde ΔG) -RT ln Kd, aunque los valores de CI50 se pueden sustituir por Kd.9 Por lo tanto, se calcularon las eficacias de ligando usando el cociente de ¢G) (1,99 cal K-1 mol-1)(300 K) (ln CI50)(0,001 kcal/cal) y el número de átomos distintos de hidrógeno.
Modelado computacional
Se crearon todos los ligandos en Sybyl (Tripos, Inc.) y se comprobaron para corregir las geometrías. Estos se protonaron selectivamente en el N1 del anillo 2,4-diaminopirimidina. Las cargas formales se calcularon automáticamente.
Se usaron conjuntos de receptores para modelar la flexibilidad proteica. Se prepararon los receptores añadiendo hidrógenos, retirando aguas y calculando las cargas formales. Se crearon grupos de conjuntos tomando instantáneas conformacionales de 500 fs a través de un ciclo de dinámica molecular de 10000 fs a 300 K usando el Amber Force Field en Sybyl. A continuación, se llevaron todas las estructuras a su mínimo de energía local con un gradiente de cambio de energía de 1000 iteraciones, bajo el supuesto de que no es probable que las conformaciones de energía alta sean las bioactivas. La movilidad se limitó a un sitio activo específico, como se define por todos los átomos que entran dentro de una esfera de un radio específico alrededor del ligando cocristalizado. Para ChDHFR, se usó la estructura 1SEJ con una esfera de 6 Å alrededor del núcleo tricíclico del ligando que define el sitio activo. Se usó 1KMV como la estructura de hDHFR. Se construyeron las cadenas laterales no resueltas Asp 21 y Lys 62 usando los ángulos de cadenas laterales más comunes de un diccionario Lovell. Se confinó el movimiento de 1KMV a una esfera de 6Å alrededor del ligando y los residuos de la región de bucle PEKN 59 -68. El residuo ácido conservado (Glu 30) se mantuvo rígido en todo el MD para preservar el contacto de unión de hidrógeno a N1H esencial. No fue necesario mantener el residuo ácido conservado rígido en el caso de ChDHFR ya que el contacto se preservó a lo largo de la evolución temporal.
El acoplamiento se llevó a cabo usando un Surflex-Dock implementado por Sybyl 7.3. Debido a la orientación conservada del resto 2,4-diaminopirimidina en el sitio activo, se pudo determinar la colocación correcta del ligando. Las puntuaciones informadas son las posturas de puntuación superior con su orientación conservada, determinada por el N1H que entra dentro de la distancia de unión a hidrógeno del residuo ácido conservado y el NH2 de C2 queentra dentro de los 4,3 Å del oxígeno de Thr conservado para preservar la orientación plana del anillo monocíclico. Las puntuaciones se promediaron en el conjunto.
Ejemplo 2
Química, modelado y evaluación biológica
Análisis estructural de DHFR de C. hominis y T. gondii.
Se ha informado previamente de la estructura cristalina de ChDHFR con diferentes ligandos, sin embargo, hasta la fecha, no se ha determinado experimentalmente la estructura de TgDHFR. Se han creado modelos de homología de TgDHFR en base a la estructura estrechamente relacionada de DHFR de Mus musculus (PDB ID: 1U7014). Se minimizó el modelo de TgDHFR, y un análisis de Ramachandran mostró una buena conservación de la morfología de modo que la geometría del esqueleto caiga fuera de las regiones permitidas para solo seis residuos en regiones de bucle. El modelo se validó adicionalmente acoplando once inhibidores con valores de CI50 determinados en el
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sitio activo y logrando una correlación de un 50,2 % con las constantes de inhibición medidas.
Las superposiciones de la estructura cristalina de ChDHFR y el modelo de homología de TgDHFR muestran que las dos enzimas son muy similares, tanto en el pliegue general como en la identidad y disposición de muchos residuos del sitio activo. Rodeando el sistema de anillo de pteridina de metotrexato, un inhibidor potente modelado en ambos sitios, están residuos que se conservan entre las dos especies: un residuo de ácido aspártico (aminoácido 32 en Ch, y aminoácido 31 en Tg) forma una interacción electrostática con el N1 protonado y un enlace de hidrógeno con el grupo amino en la posición, así como Thr (aminoácido 134 en Ch, y aminoácido 172 en Tg), Val (aminoácido 9 en Ch, y aminoácido 8 en Tg) y Phe (aminoácido 36 en Ch y aminoácido 35 en Tg) que forman interacciones de van der Waals. El enlazador entre la pteridina y el ácido para-aminobenzoico (pABA) está rodeado por un Thr conservado (aminoácido 58 en Ch y aminoácido 83 en Tg) Thr y un residuo no conservado: Cys 113 en Ch y Val 151 en Tg. El anillo de pABA se une en una cavidad hidrófoba menos bien conservada compuesta de Ile 62 en Ch (Met 87 en Tg), Leu 67 en Ch (Leu 94 en Tg) y Leu 33 en Ch (Phe 32 en Tg). En ambas especies, los modelos de TMP muestran interacciones electrostáticas y de enlace de hidrógeno entre el N1 protonado y el grupo amino en la posición C2 del anillo de pirimidina y el Asp conservado en el sitio activo. Esta interacción entre el 2,4-diaminopirimidina y un residuo ácido en el sitio activo se conserva en muchas especies de DHFR. Sin embargo, la región de enlazador de TMP parece que es demasiado corta para extender el anillo trimetoxifenilo completamente en la cavidad hidrófoba ocupada normalmente por el anillo pABA de MTX, lo que explica posiblemente la menor potencia in vitro de TMP contra estas especies. En base a estos análisis estructurales, surgió una estrategia relativamente simple para incrementar la potencia de TMP para los dos organismos diana extendiendo la longitud del enlazador entre los dos anillos aromáticos.
Ejemplo 3
Diseño y síntesis de análogos de TMP extendidos
Para probar la hipótesis de que la extensión de la distancia entre los anillos diaminopirimidina y fenilo de TMP lograría una mayor potencia contra ChDHFR y TgDHFR, se exploró el uso de un enlazador de dos carbonos en lugar del puente de metileno individual que se encuentra en TMP. Se ha informado previamente de la síntesis de varios derivados de 5-etinilpirimidina con restos no bencílicos y parece que estos compuestos inhiben T. gondii y dos especies de DHFR fúngica. Se acoplaron derivados de TMP que contienen enlazadores saturados alifáticos, cis y trans olefínicos, o acetilénicos en la estructura cristalina de ChDHFR, elegida porque se determinó a partir de datos experimentales. Los análogos de TMP con enlazadores olefínicos y acetilénicos rígidos permitieron que la diaminopirimidina se acoplara en la orientación apropiada pero estos enlazadores impidieron que el anillo trimetoxifenilo ocupara la cavidad hidrófoba biológicamente relevante. Sin embargo, parece que el alto grado de flexibilidad permitido por un puente de etileno saturado permitía que ambos anillos ocuparan sus respectivas cavidades. Se desarrolló una vía sintética directa y de alto rendimiento para un compuesto de pirimidinilo con un enlazador de etileno que permitía casualmente la preparación de toda la serie de análogos de TMP de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento.
La diaminopirimidina comercialmente disponible 4 se pudo yodar directamente en la posición C5 para dar 5yodopirimidina-2,4-diamina. La conversión directa al derivado tolano de 5-[(3,4,5-trimetoxifenil)etinil]pirimidin-2,4diamina se logró a través de una reacción de acoplamiento de reacción de acoplamiento de Sonagashira catalizada con paladio con trimetoxifenilacetileno, preparado por extensión de Corey-Fuchs del correspondiente aldehído. La hidrogenación catalítica de 5-[(3,4,5-trimetoxifenil)etinil]pirimidin-2,4-diamina se empleó a continuación para preparar el análogo totalmente saturado (es decir, 5-[2-(3,4,5-trimetoxifenil)etil]pirimidina-2,4-diamina). De forma interesante, en condiciones de hidrogenación estándar, se descubrió que la segunda reducción era muy lenta, y el enlazador Z olefínico se pudo aislar y purificar. La equilibración para el isómero E termodinámicamente más estable se llevó a cabo por tratamiento con yodo y permitió un fácil acceso a toda la serie de puentes de dos carbonos. El examen de estos TMP extendidos en ensayos de inhibición enzimática estándar reveló que los análogos eran inactivos. Se esperaba que los análogos que contenían un enlazador etinilo o grupo etenilo E o Z etenilo mostraran una actividad escasa de los estudios de acoplamiento, pero se esperaba lo contrario para el derivado totalmente saturado. Sin embargo, el enlazador de etileno totalmente saturado no mostró una buena actividad.
Ejemplo 4
Diseño y síntesis de la serie unida a propargilo
Se supuso que el fracaso en la obtención de compuestos activos que contienen un enlazador etinilo, un enlazador de grupo etenilo E o Z, o un enlazador etileno se debía a una mezcla de efectos entrópicos y conformacionales. Aunque un compuesto que contiene un enlazador etileno puede adoptar fácilmente una conformación que permita que ambos anillos aromáticos ocupen sus respectivas cavidades de unión, lo hace con una penalización entrópica significativa inducida por la organización alrededor del enlazador altamente flexible (existe un incremento de dos enlaces rotables en TMP a tres). Los otros tres compuestos de esta serie (es decir, el enlazador etinilo y enlazador de grupo etenilo E o Z) tienen una menor entropía interna pero no pueden llegar a las conformaciones que son productivas para la unión. El rediseño de esta serie apuntó hacia análogos con un número limitado de enlaces
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se describe en la síntesis racémica para dar los alquinos terminales 35 y 36. El acoplamiento cruzado con el derivado de yodopirimidina 5-yodo-6-metilpirimidina-2,4-diamina dio los dos enantiómeros 37 y 38 en un 90 y 95 % de ee, respectivamente, como se determinó por análisis de HPLC usando una columna de fase estacionaria quiral. Los dos enantiómeros presentaron ambos afinidades por las enzimas protozoicas con valores de CI50 inferiores a 100 µM.
Los compuestos de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento presentan una mejora en la potencia, así como una mejora en la eficiencia de ligando. El valor óptimo de CI50 para los compuestos anteriores fue de 13 nM dando todos los compuestos de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento valores de CI50 mejores que 100 µM.
Análisis general
Los espectros de 1H y 13C se registraron a 500 y 125 MHz, respectivamente, en un espectrómetro Inova 500 de Varian. Todos los puntos de fusión están sin corregir. La espectrometría de masas de alta resolución se realizó en un espectrómetro Kratos MS-50 por el laboratorio de espectroscopía de masas de la Universidad de Washington. Los análisis elementales se proporcionaron por Atlantic Microlabs, Inc. Todos los reactivos se usaron directamente a partir de fuentes comerciales a menos que se indique de otro modo.
Procedimiento general para acoplamientos de Sonagashira
A un tubo sellado se le añadió la yodopirimidina (1,0 mmol). Se añadió DMF (5,0 ml) y la mezcla se agitó hasta que se disolvieron todos los sólidos. Se añadió Pd-(PPh3)2Cl2 (49,0 mg, 0,07 mmol) seguido de CuI (13,3 mg, 0,07 mmol), Et3N (5,0 ml), y el arilacetileno (2,0 mmol). Se selló el tubo y se dispuso en un baño de aceite a 100 ºC. La reacción se agitó a 100 ºC durante 2 h y se enfrió a temperatura ambiente. El disolvente se retiró y el residuo se purificó por cromatografía flash (SiO2, 30 g) usando MeOH al 2 % en CHCl3 como eluyente para proporcionar los productos acoplados. Las muestras analíticas se prepararon por recristalización a partir de MeCN.
2,4-Diamino-5-yodopirimidina. A un matraz de fondo redondo de 100 ml secado a la llama se le añadió 2,4diaminopirimidina (1,0 g, 9,08 mmol) en MeOH (30 ml) seguido de la adición gota a gota de ICl (30 ml, 29,06 mmol). La solución se agitó a 25 ºC durante 15 h y después el disolvente se retiró a presión reducida. El aceite viscoso resultante se agitó en Et2O (40 ml) durante 45 min. El sólido resultante se separó por filtración y se lavó con Et2O (3 X 10 ml) para proporcionar la sal de HCl en forma de un sólido amarillo (3,14 g). La sal en bruto se suspendió en NaOH 1,0 N (100 ml) y se agitó a 25 ºC durante 2 h. Los sólidos se filtraron, se lavó con agua (2 X 10 ml) y se secó para proporcionar 2,4-diamino-5-yodopirimidina como un polvo marrón (1,71 g, 80 %). Se preparó una muestra analítica por recristalización en MeCN para dar 2,4-diamino-5-yodopirimidina en forma de cristales incoloros: Rf = 0,25 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 212-214 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 7,92 (s, 1H), 6,40 (s, 2H),6,10 (s, 2H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 162,8, 162,7, 162,0, 61,2; HREI[M+] 235,9559 (C4H5IN4 calculado: 235,9559); Anal. (C4H5IN4) C, H, N.
5-Etinil-1,2,3-trimetoxibenceno. A un matraz de fondo redondo de 50 ml secado a la llama se le añadió CBr4 (2,54 g, 7,65 mmol). Se añadió DCM (20 ml) y se enfrió la solución a 0 ºC. Se añadió Ph3P (4,01 g, 15,30 mmol) y se agitó la solución a 0 ºC durante 15 min. Se añadió gota a gota 3,4,5-trimetoxibenzaldehído (1,0 g, 5,10 mmol) en DCM (6,0 ml). Se agitó la solución a 0 ºC durante 5 min. Se retiró el disolvente a presión reducida, y se filtró el aceite resultante a través de un tapón de sílice y se lavó con Hex:EtOAc (9:1, 500 ml; 4:1, 500 ml). Se concentraron las capas orgánicas combinadas para dar la dibromo-olefina en bruto (2,31 g, 128 %), que se disolvió en THF (60 ml) y se enfrió a -78 ºC. Se añadió gota a gota n-BuLi (13,1 ml, 19,68 mmol, 1,5 M) y se agitó la solución a -78 ºC durante 30 min. Se añadió NH4Cl saturado (10 ml) y se calentó la solución a temperatura ambiente. Se separaron las capas y se lavaron las capas orgánicas con salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro, y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 80 g) usando EtOAc al 10 % en hexanos como eluyente para proporcionar 5-etinil-1,2,3-trimetoxibenceno como un aceite incoloro (0,770 g, 79 %): Rf = 0,30 (4:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,71 (s, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,83 (s, 6H), 3,03 (s, 1H); RMN de 13C (CDCl3) δ 153,1, 117,1, 109,4, 103,3, 83,8, 76,4, 61,0, 56,2, 56,1; HRFAB [M + Li] 199,0952 (C11H12O3Li calculado: 199,0946).
2,4-Diamino-5-(2-(3,4,5-trimetoxifenil)etinil)pirimidina Se dejó que 2,4-diamino-5-yodopirimidina (236 mg) reaccionara con 5-etinil-1,2,3-trimetoxibenceno (384 mg) como para el procedimiento general para proporcionar 2,4-diamino-5-(2(3,4,5-trimetoxifenil)etinil)pirimidina como un polvo blanco (270 mg, 90 %): Rf = 0,28 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 202204 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 7,94 (s, 1H), 6,90 (s, 2H), 6,37 (s, 2H), 3,79 (s, 6H), 3,67 (s, 3H); RMN de 13C (DMSOd6) δ 163,4, 162,2, 159,4, 159,2, 152,8, 137,6, 118,6, 108,3, 108,2, 94,7, 89,8, 83,4, 60,2, 60,1, 56,0, 55,9; Anal. (C15H16N4O3) C, H, N.
(Z)-2,4-diamino-5-(3,4,5-trimetoxistiril)pirimidina. (300 mg, 1,00 mmol) se dispuso en un matraz de agitación de 100 ml. Se añadió EtOH (30 ml), y la mezcla se agitó hasta que todos los sólidos se disolvieron. Se añadió Pd al 5 %/C (50 mg), y se dispuso la suspensión en un aparato de hidrogenación. Se dejó que la reacción se desarrollara a 45 psi H2 durante 5 h. La mezcla se filtró a través de Celite y se lavó con EtOAc (15 ml). El disolvente se retiró y el residuo se purificó por cromatografía flash (SiO2, 30 g) usando MeOH al 5 % en CHCl3 como eluyente para
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163,0, 162,3, 63,8, 28,4; HREI[M+] 249,9715 (C5H7IN4 calculado: 249,9715); Anal. (C5H7IN4) C, H, N.
2,4-Diamino-5-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-1-inil)-6-metilpirimidina. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodo-6-metilpirimidina (250 mg) reaccionara con 1,2,3-trimetoxi-5-(prop-2-inil)benceno (412 mg) al igual que para el procedimiento general para proporcionar 2,4-diamino-5-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-1-inil)-6-metilpirimidina como un polvo blanco (280 mg, 85 %): Rf = 0,31 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 164-166 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 6,72 (s, 2H), 6,42 (s, 2H), 3,85 (s, 2H), 3,76 (s, 6H), 3,63 (s, 3H), 2,24 (s, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 165,0, 164,3, 159,7, 152,8, 135,9, 132,8, 105,0, 96,3, 89,3, 75,8, 60,0, 55,8, 25,7, 21,7; HRFAB [M + Li] 335,1679 (C17H20N4O3Li calculado: 335,1695).
5-(But-3-in-2-il)-1,2,3-trimetoxibenceno. A un matraz de fondo redondo de 250 ml secado a la llama se le añadió bromuro de metoximetiltrifenilfosfonio (10,28 g, 30,0 mmol). Se añadió THF (100 ml) y la solución se enfrió a 0 ºC. Se añadió gota a gota n-BuLi (14,0 ml, 30,0 mmol, 2,2 M) y la solución se agitó a 0 ºC durante 30 min. Se añadió gota a gota 3,4,5-trimetoxiacetofenona (5,26 g, 25,0 mmol) en THF (25 ml). La reacción se agitó a 0 ºC durante 30 min, y después se añadió agua (30 ml). Las capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo con Et2O (3 X 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía flash (SiO2, 50 g) usando EtOAc al 5 % en hexanos como eluyente para proporcionar el éter enólico (4,35 g, 73 %). El éter enólico (4,35 g, 18,26 mmol) se disolvió en THF (37,0 ml). Se añadió HCl concentrado (3,0 ml) y la solución se calentó a reflujo. La solución se agitó a reflujo durante 3 h y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadió agua (10 ml), y las capas orgánicas se lavaron con NaHCO3 sat. (10 ml) y salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro, y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 50 g) usando EtOAc al 20 % en hexanos como eluyente para proporcionar 2-(3,4,5trimetoxifenil)propanal (3,82 g, 93 %): Los espectros fueron idénticos a los valores de la literatura. Se disolvió CBR4 (8,47 g, 25,55 mmol) en DCM (150 ml) y se enfrió a 0 ºC. Se añadió Ph3P (13,4 g, 51,09 mmol) y se agitó la solución a 0 ºC durante 5 min. Se añadió gota a gota 2-(3,4,5-trimetoxifenil)propanal (3,82 g, 17,03 mmol) en DCM (20 ml). La reacción se agitó a 0 ºC durante 30 min y después se vertió en Et2O enfriado con hielo (500 ml). Los sólidos se filtraron a través de Celite y se lavó con Et2O (3 X 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron. El residuo se filtró a través de un tapón de sílice y se lavó con hexanos (100 ml) seguido de EtOAc al 10 % en hexanos (5 X 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron para dar el dibromuro intermedio (4,86 g, 75 %) que se usó directamente para la siguiente reacción. Se suspendió Mg (0,621 g, 25,57 mmol) en THF (2,0 ml). Se añadió 1,2-dibromoetano (0,442 ml, 5,12 mmol) y la reacción se agitó a 25 ºC durante 30 min. Se añadió gota a gota el dibromuro (4,86 g, 12,79 mmol) en THF (11,0 ml) y la solución se calentó a reflujo donde se agitó durante 1 h. La solución se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se retiró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 150 g) usando EtOAc al 10 % en hexanos como eluyente para proporcionar 5-(but-3-in-2-il)-1,2,3trimetoxibenceno como un aceite incoloro (1,97 g, 70 %): Rf = 0,29 (4:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,62 (s, 2H), 3,88 (s, 6H), 3,84 (s, 3H), 3,74-3,69 (m, 1H), 2,29 (d, J ) 2,7 Hz, 1H), 1,52 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (CDCl3) δ 153,4, 138,5, 136,9, 104,0, 104,0, 87,2, 70,5, 61,0, 56,3, 32,1, 24,5; HRFAB [M + Li] 227,1243 (C13H16O3Li calculado: 227,1259).
2,4-Diamino-5-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-1-inil)pirimidina. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodopirimidina (236 mg) reaccionara con 5-(but-3-in-2-il)-1,2,3-trimetoxibenceno (440 mg) como para el procedimiento general para proporcionar 2,4-diamino-5-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-3-in-2-il)pirimidina como un polvo amarillo (295 mg, 90 %): Rf = 0,29 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 220-222 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 7,85 (s, 1H), 6,75 (s, 2H), 6,28 (s, 2H), 3,99 (q, J) 6,8 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,63 (s, 3H), 1,50 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 163,7, 152,8, 139,3, 136,0, 104,2, 104,1, 97,9, 76,2, 60,0, 60,0, 55,9, 55,8, 32,3, 24,3; Anal. (C17H20N4O3) C, H, N.
2,4-Diamino-5-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-1-inil)-6-metilpirimidina. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodo-6-metilpirimidina (250 mg) reaccionara con 5-(but-3-in-2-il)-1,2,3-trimetoxibenceno (440 mg) como para el procedimiento general para proporcionar 2,4-diamino-5-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-3-in-2-il)-6-metilpirimidina como un polvo blanco (294 mg, 86 %): Rf = 0,29 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 191-193 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 6,76 (s, 2H), 6,19 (s, 2H), 4,02 (q, J ) 7,1 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,63 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,51 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 167,0, 164,1, 161,0, 152,8, 139,4, 136,0, 104,0, 100,8, 88,6, 76,4, 60,0, 55,8, 32,5, 24,6, 22,5; Anal. (C18H22N4O3) C, H, N.
1-(3,4,5-Trimetoxifenil)prop-2-1-ol. A un matraz de fondo redondo de 250 ml secado a la llama se le añadió 3,4,5trimetoxibenzaldehído (3,92 g, 20,0 mmol). Se añadió THF (40 ml) y se enfrió la solución a 0 ºC. Se añadió gota a gota bromuro de etinilmagnesio (48,0 ml, 24,0 mmol, 0,5 M). La solución se agitó a 0 ºC durante 30 min, se calentó a 25 ºC, y se agitó durante 30 min. Se añadió NH4Cl saturado (5,0 ml), y se separaron las capas.
Se extrajo la capa acuosa con Et2O (3 X 5 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 100 g) usando EtOAc al 20 % en hexanos como eluyente para proporcionar 1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-in-1-ol como un aceite amarillo (4,22 g, 95 %): Rf = 0,25 (1:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,77 (s, 2H), 5,39 (dd, J) 5,5, 2,0 Hz, 1H), 3,86 (s, 6H), 3,82 (s, 3H), 2,76 (d, J ) 5,9 Hz, 1H); RMN de 13C (CDCl3) δ 153,4, 138,1, 135,9, 103,7, 83,6, 74,9, 64,5, 61,0, 56,2; HRFAB [M + Li] 229,1054 (C12H14O4-Li calculado: 229,1052).
3-(2,4-Diaminopirimidin-5-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-prop-2-in-1-ol. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodopirimidina (236 mg) reaccionara con 1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-in-1-ol (444 mg) al igual que para el procedimiento general para
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proporcionar 3-(2,4-diaminopirimidin-5-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-prop-2-in-1-ol como un polvo amarillo (257 mg, 78 %): Rf = 0,12 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 203-205 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 7,84 (s, 1H), 6,83 (s, 2H), 6,34 (s, 2H), 6,01 (d, J ) 5,6 Hz, 1H), 5,50 (d, J) 5,4 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,65 (s, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 163,8, 162,3, 158,2, 152,7, 138,3, 136,7, 109,3, 103,6, 96,3, 79,3, 63,4, 60,0, 55,8; Anal. (C16H18N4O4) C, H, N.
3-(2,4-Diamino-6-metilpirimidin-5-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil) prop-2-in-1-ol. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodo-6metilpirimidina (250 mg) reaccionara con 1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-in-1-ol (444 mg) al igual que para el procedimiento general para proporcionar 3-(2,4-diamino-6-dimetilpirimidin-5-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-prop-2-in-1-ol como un polvo amarillo (275 mg, 80 %): Rf = 0,12 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 174-176 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 6,85 (s, 2H), 6,27 (s, 2H), 5,98 (d, J) 5,6 Hz, 1H), 5,53 (d, J) 5,4 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,65 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,51 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 167,1, 164,3, 161,2, 152,7, 138,3, 136,7, 103,7, 99,1, 87,9, 79,5, 63,6, 60,0, 55,8, 22,5; HRFAB [M + Li] 351,1638 (C17H20N4O4Li calculado: 351,1645).
1,2,3-Trimetoxi-5-(1-metoxiprop-2-inil)benceno. A un matraz de fondo redondo de 100 ml secado a la llama se le añadió NaH (0,240 mg, 6,0 mmol) que se había lavado previamente con pentano (3 x 15 ml) y se secó. Se añadió THF (48 ml) y se enfrió la suspensión a 0 ºC. Se añadió gota a gota 1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-in-1-ol (1,11 g, 5,0 mmol) en THF (2,0 ml) y la reacción se agitó a 0 ºC durante 25 min. Se añadió Me2SO4 (0,571 ml, 6,0 mmol) y la reacción se agitó a 0 ºC durante 20 min. Se añadió agua (10 ml), y se separaron las capas. Se extrajo la capa acuosa con Et2O (20 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (20 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 20 g) usando EtOAc al 10 % en hexanos como eluyente para proporcionar 1,2,3-trimetoxi-5-(1-metoxiprop-2-inil)benceno como un aceite incoloro (1,06 g, 90 %): Rf = 0,18 (4:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,75 (s, 2H), 5,01 (d, J) 2,2 Hz, 1H), 3,88 (s, 6H), 3,84 (s, 3H), 3,45 (s, 3H), 2,68 (d, J) 2,2 Hz, 1H); RMN de 13C (CDCl3) δ 153,4, 138,2, 133,7, 104,4, 81,3, 76,0, 73,1, 61,0, 56,3, 56,2; HRFAB [M + Li] 243,1208 (C13H16O4Li calculado: 243,1209).
2,4-Diamino-5-(3-metoxi-3-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-1-inil)pirimidina. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodopirimidina (236 mg) reaccionara con 1,2,3-trimetoxi-5-(1-metoxiprop-2-inil)benceno (473 mg) al igual que para el procedimiento general para proporcionar 2,4-diamino-5-(3-metoxi-3-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-1-inil)pirimidina como un polvo naranja (310 mg, 90 %): Rf = 0,31 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 184-186 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 7,91 (s, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,40 (s, 2H), 5,30 (s, 1H), 3,79 (s, 6H), 3,66 (s, 3H), 3,35 (s, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 163,8, 162,3, 159,7, 152,8, 137,2, 134,8, 104,6, 92,6, 89,1, 81,9, 73,0, 60,0, 55,9, 55,4; Anal. (C17H20N4O4) C, H, N.
2,4-Diamino-5-(3-metoxi-3-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-1-inil)-6-metilpirimidina. Se dejó que 2,4-diamino-5-yodo-6metilpirimidina (250 mg) reaccionara con 1,2,3-trimetoxi-5-(1-metoxiprop-2-inil)benceno (473 mg) al igual que para el procedimiento general para proporcionar 2,4-diamino-5-(3-metoxi-3-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-1-inil)-6-metilpirimidina como un polvo amarillo (335 mg, 93 %): Rf = 0,29 (9:1, CHCl3:MeOH); pf = 127-129 ºC; RMN de 1H (DMSO-d6) δ 6,84 (s, 2H), 6,37 (s, 2H), 5,34 (s, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,66 (s, 3H), 3,35 (s, 3H), 2,23 (s, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 167,6, 164,3, 161,1, 152,8, 137,2, 134,8, 104,6, 95,7, 87,5, 81,8, 73,1, 60,0, 55,8, 55,3, 22,4; HRFAB [M + Li] 359,1701 (C18H22N4O4Li calculado: 359,1719). (R)-4-Isopropil-3-(2-(3,4,5-trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona. A un matraz de fondo redondo de 100 ml secado a la llama se le añadió ácido 3,4,5-trimetoxifenilacético (2,10 g, 9,29 mmol). Se añadió THF (25 ml) seguido de Et3N (1,42 ml, 10,22 mmol). Se enfrió la solución hasta -78 ºC. Se añadió gota a gota cloruro de pivaloílo (1,26 ml, 10,22 mmol) y la solución se calentó a 0 ºC y se agitó durante 1 h. En un matraz de fondo redondo de 50 ml secado a la llama separado se añadió (R)-4-isopropiloxazolidin 2-ona (1,0 g). Se añadió THF (20 ml) y la solución se enfrió a -78 ºC. Se añadió gota a gota n-BuLi (6,83 ml, 9,29 mmol, 1,36 M) y la solución se agitó a -78 ºC durante 15 min y después se calentó a 25 ºC donde se agitó durante 15 min. La solución de organolitio se transfirió a la solución del anhídrido mixto por medio de una cánula a -78 ºC. La reacción se agitó a -78 ºC durante 15 min, se calentó a 0 ºC, y se agitó durante 1 h. Se añadió agua (10 ml) y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 X 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secó sobre MgSO4 anhidro, y se concentró a presión reducida. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 30 g) usando EtOAc al 25 % en hexanos como eluyente para proporcionar trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona como un aceite incoloro (2,30 g, 88 %): Rf = 0,28 (1:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,55 (s, 2H), 4,44-4,41 (m,1H), 4,29-4,24 (m, 2H), 4,19 (dd, J ) 9,0, 3,0 Hz, 1H), 4,12-4,07 (m, 1H), 3,82 (s, 6H), 3,80 (s, 3H), 2,36-2,30 (m, 1H), 0,87 (d, J) 6,8 Hz, 3H), 0,78 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (CDCl3) δ 171,2, 154,1, 153,2, 129,4, 106,7, 63,4, 60,9, 58,6, 56,2, 41,6, 28,4, 18,0, 14,7, 14,3; HRFAB [M + Li] 344,1686 (C17H23NO6Li calculado: 344,1686).
(S)-4-Isopropil-3-(2-(3,4,5-trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona. (S)-4-Isopropil-3-(2-(3,4,5trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona se sintetizó de manera análoga a trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona usando (S)-4-isopropiloxazolidin-2-ona. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 30 g) usando EtOAc al 25 % en hexanos como eluyente para proporcionar (S)-4-Isopropil-3-(2-(3,4,5-trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona como un aceite incoloro (2,30 g, 88 %): Rf = 0,28 (1:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,54 (s, 2H), 4,44-4,41 (m, 1H), 4,29-4,24 (m, 2H), 4,19 (dd, J) 9,0, 3,0 Hz, 1H), 4,12-4,07 (m, 1H), 3,82 (s, 6H), 3,80 (s, 3H), 2,36-2,30 (m, 1H), 0,87 (d, J) 6,8 Hz, 3H), 0,78 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (CDCl3) δ 171,2, 154,1, 153,2, 129,4, 106,7, 63,4, 60,9, 58,6, 56,2, 41,6, 28,4, 18,0, 14,6, 14,3; HRFAB [M + Li] 344,1700 (C17H13NO6Li calculado: 344,1686).
(R)-3-((R)-2-(3,4,5-trimetoxifenil)propanoil)-4-isopropiloxazolidin-2-ona). A un matraz de fondo redondo de 200 ml secado a la llama se le añadió trimetoxifenil)acetil)oxazolidin-2-ona (2,77 g, 8,21 mmol). Se añadió THF (85 ml) y se
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enfrió la solución a -78 ºC. Se añadió gota a gota LHMDS (12,5 ml, 12,32 mmol, 1,0 M), y la reacción se dejó en agitación a -78 ºC durante 1 h. Se añadió MeI (1,54 ml, 24,63 mmol) y la solución se agitó a -78 ºC durante 1 h. Después, la solución se calentó a 0 ºC durante 1 h y se desactivó con NH4Cl sat. (10 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 X 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 25 g) usando EtOAc al 25 % en hexanos como eluyente para proporcionar (R)-3-((R)-2-(3,4,5-trimetoxifenil)propanoil)-4-isopropiloxazolidin-2-ona como un aceite incoloro (2,44 g, 85 %, 95:1 d.r): Rf = 0,37 (1:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,56 (s, 2H), 5,07 (q, J) 7,1 Hz, 1H), 4,14-4,13 (m, 2H), 3,81 (s, 6H), 3,77 (s, 3H), 2,42-2,36 (m, 1H), 2,12 (s, 1H), 1,47 (d, J) 7,1 Hz, 3H), 0,88 (t, J) 7,1 Hz, 6H); RMN de 13C (CDCl3) δ 174,6, 153,1, 135,8, 105,2, 63,1, 60,8, 59,1, 56,1, 42,8, 28,6, 19,7, 18,0, 14,7; HRFAB [M + Li] 358,1852 (C18H25NO6Li calculado:358,1842).
(S)-3-((S)-2-(3,4,5-Trimetoxifenil)propanoil)-4-isopropiloxazolidin-2-ona. Se preparó (S)-3-((S)-2-(3,4,5Trimetoxifenil)propanoil)-4-isopropiloxazolidin-2-ona de manera análoga a 31. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida (SiO2, 25 g) usando EtOAc al 25 % en hexanos como eluyente para proporcionar (S)-3((S)-2-(3,4,5-trimetoxifenil)propanoil)-4-isopropiloxazolidin-2-ona como un aceite incoloro (2,08 g, 87 %, 95:1 d.r): Rf = 0,37 (1:1, Hex:EtOAc); RMN de 1H (CDCl3) δ 6,58 (s, 2H), 5,09 (q, J) 7,1 Hz, 1H), 4,17-4,15 (m, 2H), 3,83 (s, 6H), 3,80 (s, 3H), 2,45-2,39 (m, 1H), 2,15 (s, 1H), 1,49 (d, J) 7,1 Hz, 3H), 0,90 (t, J) 7,1 Hz, 6H); RMN de 13C (CDCl3) δ 174,7, 153,2, 135,9, 105,3, 63,2, 60,9, 59,2, 56,2, 42,9, 28,6, 19,8, 18,1, 14,8; HRFAB [M + Li] 358,1856 (C18H25NO6Li calculado: 358,1842).
Procedimiento General para la síntesis de R y S 1,2,3-trimetoxi-5-(1-metilprop-2-in-1-il)benceno. A un matraz de fondo redondo de 200 ml secado a la llama se añadió la oxazolidinona deseada (1,0 equiv). Se añadió DCM (0,1 M), y la solución se enfrió a -78 ºC. Se añadió gota a gota DIBAL-H (2,0 equiv), y la reacción se dejó en agitación a 78 ºC durante 2 h. Se añadió NH4-Cl saturado (20 ml) y la solución se calentó a temperatura ambiente. Los sólidos se separaron por filtración y se lavó con DCM (3 X 5 ml). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 X 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró. Se tomó una medida de RMN del material en bruto, y el espectro coincidió con el del aldehído racémico (18). El material en bruto se usó sin purificación adicional. Se disolvió CBr4 (1,5 equiv) en DCM (0,1 M) y se enfrió a 0 ºC. Se añadió Ph3P (3,0 equiv) y la solución se agitó a 0 ºC durante 5 min. Se añadió gota a gota el aldehído en bruto (1,0 equiv) en DCM (5,0 ml). La reacción se dejó en agitación a 0 ºC durante 30 min y después se vertió en Et2O enfriado con hielo (200 ml). La reacción se filtró a través de gel de sílice y se lavó con hexanos (100 ml) seguido de EtOAc al 25 % en hexanos (300 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se concentraron a presión reducida. El material en bruto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Se suspendió Mg (2,0 equiv) en THF (1,0 ml). Se añadió dibromoetano (0,4 equiv), y la suspensión se agitó a 25 ºC durante 30 min. Se añadió gota a gota el dibromuro en bruto (1,0 equiv) en THF (6,0 ml), y la reacción se calentó a reflujo durante 30 min. La solución se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se retiró. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida para proporcionar los respectivos acetilenos enantioenriquecidos. Se tomaron espectros de RMN, y los espectros coincidieron con el del acetileno racémico (19).
2,4-Diamino-5-((R)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-1-inil)-6-metilpirimidina. (R)-3-((R)-2-(3,4,5-trimetoxifenil)propanoil)-4isopropiloxazolidin-2-ona) (2,44 g, 6,94 mmol) se sometió al procedimiento general para proporcionar R-1,2,3trimetoxi-5-(1-metilprop-2-in-1-il)benceno (460 mg, 30 %). Se dejó que 2,4-diamino-5-yodo-6-metilpirimidina (250 mg) reaccionara con R-1,2,3-trimetoxi-5-(1-metilprop-2-in-1-il)benceno (290 mg) como para el procedimiento de acoplamiento de Sonagashira general para proporcionar 2,4-diamino-5-((R)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-1-inil)-6metilpirimidina como un polvo marrón (280 mg, 82 %, 90 % ee): Rf = 0,29 (9:1, CHCl3:MeOH); RMN de 1H (DMSOd6) δ 6,76 (s, 2H), 6,19 (s, 2H), 4,02 (q, J) 7,1 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,63 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,51 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 166,9, 164,1, 160,9, 152,8, 139,4, 135,9, 104,0, 100,7, 88,6, 76,4, 60,0, 55,8, 32,5, 24,7, 22,5; HRFAB [M + Li] 349,1851 (C18H22N4O3Li calculado: 349,1851).
2,4-Diamino-5-((S)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)but-1-inil)-6-metilpirimidina (38). (S)-3-((S)-2-(3,4,5-trimetoxifenil)propanoil)4-isopropiloxazolidin-2-ona) (1,66 g, 4,72 mmol) se sometió al procedimiento general para proporcionar S-1,2,3trimetoxi-5-(1-metilprop-2-in-1-il)benceno (312 mg, 30 %). Se dejó que 2,4-diamino-5-yodo-6-metilpirimidina (250 mg) reaccionara con S-1,2,3-trimetoxi-5-(1-metilprop-2-in-1-il)benceno (290 mg) como para el procedimiento de acoplamiento de Sonagashira general para proporcionar 38 como un polvo amarillo (308 mg, 90 %, 95 % ee): Rf = 0,29 (9:1, CHCl3:MeOH); RMN de 1H (DMSO-d6) δ 6,76 (s, 2H), 6,19 (s, 2H), 4,02 (q, J) 7,1 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,63 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,51 (d, J) 7,1 Hz, 3H); RMN de 13C (DMSO-d6) δ 167,0, 164,1, 161,0, 152,8, 139,4, 136,0, 104,0, 100,8, 88,6, 76,4, 60,0, 55,8, 32,5, 24,6, 22,5; HRFAB [M+ Li] 349,1851 (C18H22N4O3Li calculado: 349,1851).
Ejemplo 6
Química y modelado
Análisis estructural de ChDHFR y hDHFR.
Basándose en la estructura de ChDHFR-TS, se desarrolló una serie novedosa de inhibidores de DHFR definidos por
5
15
25
35
45
55
65
un enlazador de propargilo entre un anillo 2,4-diaminopirimidina y un anillo arilo. A través de estos esfuerzos, se identificó un ligando altamente eficaz (compuesto X) con una constante de inhibición (CI50) de 38 nM y peso molecular de 342 Da. Posteriormente se desarrolló y se analizó una serie de análogos de propargilo de segunda generación inspirados por el análisis estructural que no sólo mantuvieron niveles altos de potencia contra la enzima parasitaria sino que también mostraron niveles extremadamente altos de selectividad. También se desarrolló y se analizó una tercera generación de análogos heterocíclicos de inhibidores enlazados a propargilo que presentan niveles altos de actividad y selectividad.
Análisis de las interacciones de los compuestos de bifenilo con ChDHFR.
Las conformaciones acopladas de ambas series de 5’ y 4' de los compuestos de bifenilo presentó un incremento sustancial en los contactos lipófilos entre el ligando y el receptor sobre UCP111A. Los resultados mostraron que los análogos no sustituidos y metilsustituidos en ambas familias son más potentes que el compuesto principal inicial, UCP111A, y son más potentes que los análogos de bifenilo con sustituciones de isopropilo.
El análisis computacional de los compuestos acoplados en ChDHFR explica la clara preferencia por los compuestos sustituidos en 5’ en lugar de los compuestos sustituidos en 4’. La ubicación preferente del 3'-OMe en el primer anillo bifenilo se dirige hacia arriba en la abertura del sitio activo a la cavidad formada por Leu 25, Gln 24, Gly 23 y Ser 61, con una oportunidad de unión de hidrógeno usando el esqueleto NH de Leu 25. También hay una interacción lipófila con las porciones alquilo de Leu 25 y Gln 24. Con el 3'-OMe en la orientación preferente, el segundo anillo fenilo se proyecta hacia abajo en la abertura en la serie de 5', o bien directamente fuera del sitio activo en la serie de 4' con contactos de ChDHFR mínimos. Como se ve en la figura 9, la región en la abertura del sitio activo es lipófila, y puede tener varios contactos con el segundo fenilo en la serie de 5', pero sólo tendría contacto limitado con el segundo anillo fenilo en la serie de 4'.
Curiosamente, un análisis de acoplamiento de los enantiómeros de UCP111D mostró una tendencia invertida para los resultados del ensayo de ChDHFR. El espacio alrededor de la región sustituida con propargilo está dictada en gran medida por Ile 62, que no explora mucho espacio conformacional a través del conjunto, pero tiene espacio para girar hacia la parte posterior del sitio activo. En la ubicación cristalizada, el grupo iso-metilo se proyecta en el sitio activo, creando una única cavidad lipófila por encima del residuo. En este caso, sólo hay espacio para que el metilo de propargilo se dirija a una región por encima del iso-metilo, dictando así la estereoquímica errónea. Si Ile 62 se hace girar hacia la parte posterior del sitio activo, habría espacio suficiente para que el metilo de propargilo se acople en la conformación hacia arriba o bien hacia abajo. Para probar esta teoría, se alteró Ile 62 usando un diccionario de Lovell de ángulos para volver a proyectar en la cavidad. Esta única estructura se usó para el acoplamiento, y mostró que la configuración R en el centro propargílico era preferente.
Análisis de las interacciones de los compuestos de bifenilo con hDHFR.
Los compuestos de bifenilo se acoplaron en DHFR humana usando el miembro del conjunto con la abertura 'más amplia' en el sitio activo, como se define por medidas comparativas en varios puntos. Este miembro del conjunto alcanzó un promedio de 0,25 Å más ancho que la estructura cristalina. Se eligió esta estructura ya que se presentaba el espacio más disponible para sustituciones voluminosas y el caso más difícil para lograr la selectividad. También presentó la oportunidad para explorar la flexibilidad de potencial de esta región.
Se observó una clara tendencia tanto en los resultados de acoplamiento como de ensayo para las series de 5’ y 4' en hDHFR. Como se ve en la figura 10, la abertura del sitio activo en hDHFR es sustancialmente más estrecha y menos lipófila que ChDHFR. El bucle PEKN se proyecta perpendicularmente desde el receptor en una conformación de tipo disco, creando una hendidura por debajo del bucle. Esta región es fácilmente accesible a la familia sustituida en 5’ en comparación con la familia de sustituida en 4'. UCP111D prefiere una orientación con el primer fenilo situado más arriba de la cavidad que UCP111A, proporcionando contactos lipófilos equivalentes. Al sustituir el segundo anillo fenilo, se desplaza la preferencia hacia la hendidura más lipófila bajo el anillo, produciendo un incremento sustancial de contactos lipófilos. La hendidura es un ajuste estrecho para las sustituciones de metilo pero está equilibrado por un incremento en los contactos lipófilos. Estas orientaciones también preservan el 3'-OMe en la ubicación "superior" ideal, imitando los contactos hechos con UCP111A 3'-OMe.
La serie de 4' presenta un modo diferente de unión. Para que se oriente correctamente la región de pirimidina y propargilo, el resto bifenilo necesita proyectarse directamente fuera de la cavidad, como con ChDHFR. Sin embargo, esta región se ve obstaculizada sustancialmente en hDHFR entre el bucle PEKN y la pared de receptor opuesta. Las orientaciones en la figura 10 son las posturas computacionalmente preferentes, pero presentan impedimento estérico sustancial. El análogo sustituido con di-metilo (mostrado en azul) prefiere una orientación con el 3’-OMe apuntando hacia abajo para limitar la interferencia estérica. Esta orientación también coloca el metilo de propargilo en una orientación más arriba en la cavidad con menores contactos, representando fácilmente la clara tendencia en la disminución de la afinidad. Se exploraron muchas orientaciones en la serie de 4’, pero no se descubrió ninguna que se pudiera beneficiar de la hendidura por debajo del bucle PEKN preservando al mismo tiempo el 3'-OMe y la orientación del metilo de propargilo. Es probable que la flexibilidad de hDHFR que puede alojar el volumen estérico creciente de la serie de 5’ por debajo del anillo PEKN no se extienda a las regiones en las que se proyectaría la serie
de 4', o al menos no de manera que pudiera alojar las conformaciones necesarias para alta afinidad.
Por sondeo del espacio flexible en la abertura del sitio activo en hDHFR es evidente que existe una flexibilidad claramente para explicar las sustituciones de metilo en la serie de UCP111Dx, especialmente en la región alrededor
5 de y por debajo del bucle PEKN. Sin embargo, esta flexibilidad es limitada, ya que el bucle no se puede mover lo suficiente para alojar el volumen de los grupos di-isopropilo de UCP111D26IPr. Se prevé que esta flexibilidad limitada será importante para explicar los esquemas de diseño de hDHFR en el futuro.
Análisis de las interacciones de análogos heterocíclicos de análogos enlazados a propargilo con SaDHFR: NADPH.
10 La comparación de las estructuras de DHFR de S. aureus:NADPH:142 y DHFR de S. aureus:NADPH:140 muestra cambios mínimos en la orientación de los tres anillos arilo presentes en ambos inhibidores. Sin embargo, una diferencia importante que explica la mejora de 18 veces en la potencia para el compuesto 142 contra DHFR de S. aureus es la presencia de un enlace de hidrógeno (3,5 Å) entre el sustituyente 2’-metoxi en el compuesto 142 y el
15 grupo hidroxilo de Ser 49, una interacción que se impide con el 3'-metoxi en el compuesto 140.
La comparación de las estructuras de DHFR de S. aureus:NADPH:148 y DHFR de S. aureus:NADPH:140 (figura 15C) revela una reorientación considerable de las regiones hidrófobas de la serie piridilo con relación a los análogos de bifenilo originales. De hecho, un enantiómero diferente de piridina 148 cristaliza preferentemente con relación al
20 enantiómero observado con 140. Esta nueva configuración fuerza un cambio en la conformación para el anillo nicotinamida de NADPH para mantener el apilamiento π-π, así como un cambio en la conformación de Ile 50 que interacciona con el anillo arilo proximal. La solvatación de estabilización del nitrógeno de piridilo en la abertura del sitio activo impulsa la reorientación del compuesto 148 con relación al compuesto 140. Una consecuencia de esta reorientación es la disminución de contacto entre los anillos B y C y los residuos del sitio activo, que se refleja en la
25 ligera atenuación en la inhibición enzimática.
Ejemplo 7
Evaluación biológica de ChDHFR y hDHFR
30 Se evaluaron los compuestos en ensayos enzimáticos espectrofotométricos usando ChDHFR-TS y hDHFR. Se midieron las constantes de inhibición (CI50) (véase la tabla 4). El compuesto principal, X, tiene una constante de inhibición de 38 nM y una selectividad modesta (8 veces). Todos los compuestos de bifenilo son más potentes que el compuesto principal inicial X y presentan una mayor selectividad para la enzima patógena. El compuesto racémico
35 más potente, D(rac), un derivado de 5'-bifenilo, también es el más selectivo de los compuestos racémicos (944 veces). El enantiómero R individual de este análogo de 5'-bifenilo es el más potente (1,1 nM) y el más selectivo (1273 veces) de todos los compuestos conocidos probados contra la enzima DHFR de Cryptosporidium. Las abreviaturas de compuestos en la tabla 4 se refieren a los siguientes compuestos:
40 111A: Compuesto X; D (rac): forma racémica de 5-[3-(5-metoxi-bifenil-3-il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina; D6M: 5-[3-(5-metoxi-6’-metilbifenil-3-il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina; D26M: 5-[3-(5-metoxi-2’6’dimetilbifenil-3-il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina; D26I: 5-[3-(5-metoxi-2’6’-diisopropilbifenil-3-il)but-1-in-1-il]6-metilpirimidin-2,4-diamina; F: 5-[3-(3-metoxi-bifenil-4-il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina; F2M: 5-[3-(3metoxi-2’-metilbifenil-4-il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina; F26M: 5-[3-(3-metoxi-2’6’-dimetilbifenil-4-il)but-1
45 in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4-diamina; F26I: 5-[3-(3-metoxi-2’6’-diisopropilbifenil-4-il)but-1-in-1-il]-6-metilpirimidin-2,4diamina; D(R): enantiómero R de D; y D(S): enantiómero S de D.
Tabla 4: Potencia inhibidora y selectividad de los ligandos de DHFR (valores de CI50 en nM)
Compuesto
CI50 (ChDHFR) (nM) CI50 (hDHFR) (nM) Proporción de selectividad (CI50 ChDHFR/CI50 hDHFR)
111A
169 ± 6 1380 ± 20 8
D (rac)
1,8 ± n.d. 1700 ± 10 944
D6M
2,1 ± 0,3 1360 ± 50 648
D26M
2,1 ± 0,5 1250 ± 6 595
D26I
10 ± n.d. 7200 ± 150 720
F
19 ± 3 1420 ± 12 75
F2M
36 ± 0,6 2770 ± 59 77
F26M
7,4 ± 1,9 3370 ± 15 455
F26I
16 ± n.d. 4200 ± 0,1 262
D (R)
1,1 ± n.d. 1360 ± 26 1273
D (S)
30 ± n.d. 1380 ± 26 46
n.d. -no determinado
generación en ensayos de inhibición enzimática, se evaluaron para la inhibición de S. aureus y S. pyogenes, y se evaluaron para toxicidad de células de mamífero. Las tablas 5 y 6 resumen la actividad biológica de estos inhibidores enlazados a propargilo heterocíclicos en comparación con análogos de bifenilo y TMP.
Tabla 5
Número
Ar R6 RP R2’ R3’ CI50/nM Selectividad
Saa
Spa humano a (h/Sa) b (h/Sp) b
140
imagen50 Me Me H OMe 42 ± 2 190 ± 15 750 ± 6 18 4
141
imagen51 Me Me H Ome 410 ± 36 350 ± 44 1400 ± 15 3 4
Número
Ar R6 RP R2’ R3’ CI50/nM Selectividad
Saa
Spa humano a (h/Sa) b (h/Sp) b
142
imagen52 Et H Ome H 2,4 ± 0,2 5,9 ± 0,2 300 ± 10 125 51
143
imagen52 Et H H H 28 ± 1,7 26 ± 1,7 290 ± 36 10 11
144
imagen53 Et H H Ome 59 ± 2,3 52 ± 1,7 140 ± 1,0 2,4 3
145
imagen52 Me Me Ome H 75 ± 4 23 ± 1,5 97 ± 10 1,3 4
146
imagen53 Et Me Ome H 67 ± 5,5 26 ± 2,5 100 ± 10 1,5 4
147
imagen54 Me Me H Ome 26 ± 2 160 ± 9 1500 ± 8 58 9,4
148
imagen55 Et Me H Ome 19 ± 1 180 ± 19 1300 ± 11 68 7,2
149
imagen55 Et H Ome H 21 ± 1,0 19 ±1,3 330 ± 12 16 17
150
imagen55 Et H H Ome 12 ± 2,4 28 ± 4,0 61 ± 5,7 5 2
151
imagen55 Et H H H 20 ± 0,5 30 ± 1,7 520 ± 23 26 17
152
imagen56 Me Me H Ome 29 ± 2 26 ± 4 400 ± 40 14 15
154
imagen57 Et H H H 33 ± 0,5 47 ± 4,6 290 ± 15 9 6
155
imagen58 Et H H H 35 ± 1,1 23 ± 1,2 160 ± 13 5 7
TMP
imagen59 23 13000 198000 8600 15
Se informa de los valores de CI50 contra las enzimas DHFR en nM y representan el promedio de al menos tres medidas. b Se calcula la selectividad como CI50 (humano)/CI50 (patógeno).
Tabla 6: Evaluación de la actividad antibacteriana y de citotoxicidad de antifolatos enlazados a propargilo
N.º comp.
CIM CIM CI50 CI50 Selectividadc Selectividad
SARMa
S. pyogenes MCF-10b HepG2 SARM S. pyogenes
140
5,76 0,097 47 ND 8 484
141
0,71 0,024 55 ND 77 2,292
142
0,18 0,006 67 ND 372 11,167
143
0,71 0,04 32 ND 45 842
144
0,08 0,33 199 ND 2500 603
145
0,716 0,04 38 94 53 950
146
0,744 0,08 54 77 72 675
147
0,09 0,012 220 233 2444 18,333
148
0,09 0,012 85 171 944 7083
149
0,01 0,09 217 199 >20.000 3,867
150
0,045 0,04 409 465 9,089 10,225
151
0,041 0,04 475 >500 11,585 11,875
152
2,9 0,024 462 494 159 19,250
154
0,041 0,08 >500 >500 >20.000 >20.000
155
0,15 0,019 >500 ND 3,333 26,316
TMP
0,625 0,6 ND ND ND ND
aSe informa de los valores de CIM para SARM y S. pyogenes en μg/ml. Se informa de los valores de CI50 para MCF10 y HepG2 en μM. Los valores de selectividad se calculan como CI50 (MCF10)/CIM (patógeno). ND: no determinado
5 Ensayos de inhibición enzimática
Se realizaron ensayos de inhibición enzimática realizando un seguimiento de la tasa de oxidación de NADPH por la enzima DHFR a una absorbancia de 340 nm. Se realizaron los ensayos en presencia de concentraciones de saturación de NADPH y se iniciaron con dihidrofolato. Se completaron todos los ensayos a 25 ºC en un tampón que
10 contenía TES 20 mM pH 7,0, KCl 50 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, EDTA 0,5 mM y 1 mg/ml de BSA. Se midió la inhibición al menos tres veces con concentraciones de inhibidor cercanas al valor de CI50 y se informa del valor de CI50 promedio con una desviación estándar.
imagen60
Tabla 7
imagen61
ID del compuesto
Anillo R CI50 (CgDHFR) (nM) CI50 (hDHFR) (nM) Selectividad CIM (Cg) (μg/ml) a
139
imagen62 Me 7,3 ± 1,8 1700 ± 10 230 ± 60 11
140
imagen63 Me 0,55 ± 0,3 750 ± 6 1400 ± 750 3,1
141
imagen64 Me 0,6 ± 0,3 1410 ± 15 2400 ± 1200 1,5
147
imagen65 Me 97 ± 9 1500 ± 83 15 ± 2 1,4
148
imagen66 Et 89 ± 8 1300 ± 11 15 ± 1 1,5
152
imagen67 Me 20 ± 3 400 ± 40 20 ± 4 12
153
imagen68 Et 22 ± 2 250 ± 4 11 ± 1 12
156
imagen69 Me 68 ± 5 330 ± 6 4,9 ± 0,4 6,3
157
imagen69 Et 38 ± 2 200 ± 4,5 5,0 ± 1 13
158
imagen70 Me 30 ± 3 280 ± 17 9 ± 1 95
159
imagen71 Me 143 ± 10 270 ± 46 1,9 ± 0,4 Inact
a Los valores de CIM para C. glabrata se determinaron usando medio YM
En general, la conversión del anillo fenilo en 139 a heterociclos aromáticos o bien alicíclicos da como resultado una
5 atenuación de la inhibición enzimática que varía de una pérdida de tres veces a veinte veces. De los tres, los análogos de morfolina mantienen la mayor potencia inhibidora enzimática, mientras que los análogos de piperazina sufren la mayor pérdida. Parece que la sustitución en C6 (R en la tabla 7) tiene un impacto mínimo sobre la potencia enzimática.
10 Aunque se había demostrado previamente que los sustituyentes hidrófobos en el anillo fenilo incrementan en gran medida la potencia, las sustituciones de análogos en los sistemas de morfolina y piperazina muestran más variación. La inclusión de sustituyentes metilo en la morfolina para imitar los del compuesto 140 reducen algo la potencia, reflejando posiblemente el posicionamiento de estos grupos metilo en centros hibridados sp3. De forma alternativa, el sustituyente de 4-metil piperazina incrementó la inhibición enzimática aproximadamente 5 veces. Los compuestos de
15 piridina son más selectivos, aproximadamente 15 veces, para la enzima patógena sobre el homólogo humano. Ambos análogos de morfolina y piperazina todavía muestran preferencia por la enzima fúngica, aunque con proporciones más modestas de 2-20 veces.
Los resultados de los ensayos de inhibición del crecimiento celular demuestran que los derivados de piridina, 147 y
20 148, presentan potencia en un intervalo (1,4-1,5 μg/ml) comparable a los agentes antifúngicos usados clínicamente. Aunque los derivados de piridina son inhibidores enzimáticos más débiles que el comparador directo, el compuesto 139, presentan una actividad antifúngica mejor en orden de magnitud. De hecho, el nivel de actividad mostrada por
los compuestos de piridina es comparable a los bifenilos 140 y 141, que tienen potencia enzimática subnanomolar. Esto sugiere que la actividad antifúngica de esta clase de compuestos se puede optimizar adicionalmente por modulación de las propiedades de compuestos más allá de la potencia enzimática. Esto puede sugerir además que mejorar la afinidad enzimática para estos heterociclos puede producir en última instancia agentes antifúngicos con
5 una actividad superior.
Los derivados de morfolina y piperazina que muestran una mayor potencia contra DHFR que los análogos de piridina funcionan mal por comparación en ensayos antifúngicos (CIM > 12 μg/ml). La atenuación de la actividad contra el organismo puede reflejar el incremento en la solubilidad, lo que puede dar lugar a una reducción en la
10 permeabilidad. En general, estos resultados sugieren la necesidad de un equilibrio óptimo en estas propiedades de los inhibidores.
También se evaluaron varios compuestos representativos en medio empobrecido en timidina. Se ha demostrado que los niveles altos de timidina interfieren con las pruebas de susceptibilidad precisas de antifolatos. Para compensar 15 esto, los antifolatos se evalúan con frecuencia en un medio mínimo controlado con una concentración de timidina baja. Como ha habido pocas investigaciones sobre la actividad de los antifolatos contra C. glabrata, se evaluaron compuestos prometedores en medio empobrecido de timidina. Se evaluaron tres análogos heterocíclicos representativos (148, 152 y 156) en medio IsoSensitest complementado con glucosa al 2 % (tabla 8). Además, también se evaluaron los compuestos para determinar la toxicidad en células de mamífero usando las líneas
20 celulares MCF-10 y HepG2. Se informa de la selectividad celular como el valor de CI50 para la línea celular humana MCF-10 dividido entre el valor CIM (μg/ml) (tabla 8).
Tabla 8
ID del compuesto
CIM C. glabrata (μg/ml)a CI50 MCF-10 (μM) CI50 HepG2 (μM) Índice de selectividadc (μg/ml)
148
0,36 85 171 236
152
1,4 462 NDb 330
156
2,9 314 193 108
a valores de CIM determinados en medio IsoSensitest b ND: no determinado c la selectividad se calcula como [CI50 (MCF-10) / CIM (C. glabrata)]
25 Estos resultados muestran que en presencia de niveles de timidina comparables a los encontrados en sangre y tejido humano, los antifolatos novedosos son inhibidores muy potentes de C. glabrata presentando los derivados de piridina valores de CIM de menos de 1 μg/ml. Además, a pesar de los niveles moderados de selectividad enzimática, los compuestos muestran niveles de entre 100 y 300 veces de selectividad a nivel celular. Basándose en la actividad
30 suscitante observada con estos compuestos, se determinaron estructuras cristalinas para caracterizar mejor la interacción de los inhibidores con CgDHFR.
Ejemplo 8
35 Química y modelado -Estructura B del CgDHFR
SE incubó CgDHFR con NADPH 1,5 mM y compuesto 11 1 mM durante dos horas a 4 ºC. Se hicieron crecer cristales adecuados (0,2 mm de cada lado) usando el procedimiento de difusión de vapor de gota colgante y mezclando volúmenes iguales de proteína:ligando con Tris 0,1 M (pH 8,5), PEG 4000 al 30 % y MgCl2 0,2 M. Antes
40 del enfriamiento ultrarrápido, se transfirieron los cristales a una solución que contiene la mezcla de cristalización y glicerol al 15 %. Se midieron todos los datos de difracción a 100 K. Se midió el conjunto de datos inicial usando un difractómetro Oxford Excalibur y se procesó usando el programa informático CrysAlis. Se midió el conjunto de datos de alta resolución a X25A de línea de haz en el Brookhaven National Laboratory usando un detector CCD de ADSC y se procesó con HKL2000. Se informa de las estadísticas de procesamiento y refinamiento de datos en la tabla 9.
45 Tabla 9. Estadísticas de recogida y refinamiento de datos
Grupo espacial
P41
Célula unitaria (a,b,c en Å)
a=b=42,69, c=230,4, α=90, β=90, γ=120
Resolución (Ǻ)
40-1,6
Completitud, % (última corteza*, %)
93 % (92 %)
Reflexiones únicas
47,676
imagen72
PEG 10000 al 15 %, acetato de sodio 150 mM, MES 100 mM pH 6,5, y butirolactona al 5 % (Sigma Aldrich). Todo el crecimiento de cristales siguió los mismos procedimientos y típicamente proporcionó cristales dentro de 5-7 días. Los cristales se incubaron en un tampón crioprotector que contenía glicerol al 15 %, a continuación se enfrió rápidamente con nitrógeno líquido. Los conjuntos de datos de alta resolución se recogieron en un Brookhaven NSLS
5 en X25 de línea de haz.
Los datos se indexaron y se escalaron usando HKL2000. Las estructuras cristalinas para todos los complejos se resolvieron usando un modelo de DHFR de S. aureus unida a folato. Los datos de difracción para el complejo SaDHFR:NADPH:140 y el modelo comparten el mismo grupo espacial hexagonal (P6122) y dimensiones de célula 10 unitaria, por lo tanto, se usaron diferentes procedimientos de Fourier para resolver el problema de fases para estos datos. Los cristales de SaDHFR:NADPH: 142 y SaDHFR:NADPH:148 pertenecen al grupo espacial P61 y hay dos moléculas en la unidad asimétrica. Por lo tanto, estas estructuras se determinaron por reemplazo molecular usando Phaser. Los programas COOT y Refmac5 se usaron para construir y refinar la estructura hasta que se logró un Rfactor y Rlibre aceptable. La geometría estructural se evaluó usando las representaciones de proCHECK y Ramachandran.
15 El disolvente no se incluyó en los modelos finales para las estructuras cristalinas de DHFR de S. aureus unida a NADPH y los compuestos 140 y 142.
Para dilucidar las interacciones de los compuestos 148 y 153 con CgDHFR, se determinaron dos nuevas estructuras cristalinas ternarias. Los cristales se hicieron crecer con la enzima, NADPH y un inhibidor, 148 o bien 153, usando
20 difusión de vapor de gota colgante. Los cristales obtenidos pertenecen al grupo espacial P41 y muestran amplitudesde difracción a la resolución 2,6 y 2,3 Å, respectivamente. Las estructuras se determinaron con procedimientos de reemplazo molecular usando la molécula de sonda 3CSE7. La densidad electrónica es evidente para los ligandos, lo que permite la colocación y el refinamiento de todas las coordenadas a los valores de Rlibre de 25,8 y 26,5, respectivamente (tabla 10).
25 Tabla 10
Parámetro
CgDHFR/148/NADPH CgDHFR/153/NADPH
PDB ID
3R09 3ROA
Grupo espacial
P41 P41
Célula unitaria (a, b, c en Ǻ)
a = 42,26,b = 42,26,c = 238,69 a = 42,71,b = 42,71,c = 229,47
N.º de monómeros en asu
2 2
Resolución (Ǻ)
41,63-2,60 42,72-2,30
Completitud, % (última corteza, %)
90,4 (95,9) 97,2 (100)
Reflexiones únicas
10629 16713
Rsim, % (última corteza)
5,1 (13,7) 8,0 (22,2)
I/σ (última corteza)
54,6 (21,9) 46,8 (6,6)
Estadísticas de refinamiento
factor R/Rlibre
0,2018, 0,2648 0,2042, 0.258
N.º de átomos (proteína, ligandos, disolvente)
3692, 152, 36 3692, 154, 73
Desviación MC, longitudes (Å), ángulos (grados) de enlace
0,006, 1,081 0,009, 1,273
Prom. factor B (Ǻ2)
31,756 36,053
Prom. factor B para ligandos (Ǻ2)
39,2 37,1
Prom. factor B para moléculas de disolvente (Ǻ2)
22,1 31,4
Estadística de representación de Ramachandran
Residuos en regiones más favorecidas (%)
91,2 93,2
Residuos en regiones permitidas adicionales (%)
8,3 6,3
imagen73
imagen74

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
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