ES2592428T3 - Procedimiento para el análisis de ácidos nucleicos fetales - Google Patents

Procedimiento para el análisis de ácidos nucleicos fetales Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la comprobación de ácidos nucleicos fetales a partir del líquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos celulares fetales de una fertilización in vitro, que comprende los pasos: a) extracción del líquido que sobrenada exento de células, que contiene ácido nucleico fetal, del medio de cultivo de fertilización in vitro del recipiente de cultivo empleado para cultivar el óvulo fertilizado, b) aislamiento de los ácidos nucleicos fetales contenidos en el líquido que sobrenada y c) realización de un análisis de los ácidos nucleicos presentes en el líquido que sobrenada exento de células.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para el analisis de acidos nucleicos fetales
La invencion se refiere a un procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos celulares fetales o a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, a partir del blastocele o partir de la cavidad blastodstica.
El ADN celular fetal se puede comprobar tanto durante el diagnostico preimplantacional (DPI) que se dedica al examen del embrion antes de su implantacion en el utero, como durante el diagnostico prenatal (DPN) que se dedica al examen del feto antes del parto.
En el diagnostico prenatal estan disponibles procedimientos invasivos como la biopsia corial, la amniocentesis y la puncion del cordon umbilical para examinar la informacion genetica del feto que se esta desarrollando y procedimientos no invasivos tales como examenes ecograficos. Los procedimientos invasivos requieren la introduccion de una aguja en el utero para extraer o bien lfquido amniotico o tejido de la placenta o sangre del feto. En este caso, se pueden producir complicaciones en el transcurso del embarazo que pueden conducir hasta al aborto.
La posibilidad de poder obtener y analizar el material genetico del feto con procedimientos no invasivos puede reducir el riesgo de un dano a la salud del feto y de una interrupcion no deseada del embarazo. En el plasma sangumeo de la madre, ademas de acidos nucleicos celulares maternas se encuentra tambien ADN libre circulante con un reducido tamano molecular. Una parte de este ADN libre circulante en el plasma sangumeo de mujeres embarazadas es de origen fetal. El diagnostico molecular prenatal no invasivo se basa, ademas de examenes ecograficos, en el analisis de este ADN fetal libre circulante. La parte del ADN fetal en la cantidad total de ADN en el plasma sangumeo maternal asciende a aproximadamente tres a seis por ciento y aumenta a medida que avanza el embarazo. En el primer trimestre, la concentracion de ADN fetal asciende en promedio a aproximadamente 25 equivalentes genomicos (EG) por mililitro de plasma y aumenta hasta aproximadamente 300 EG/ml en el tercer trimestre. Las concentraciones individuales del ADN fetal en el plasma vanan en hasta diez veces. Despues del parto, el nivel de ADN fetal en el plasma sangumeo cae rapidamente y ya al cabo de 24 horas ya no se pueden comprobar secuencias de ADN fetal libre circulante en la sangre de la madre y por tanto se elimina completamente antes de un parto siguiente. Se supone que el ADN libre circulante tiene como origen procesos apoptoticos en la placenta que conducen entre otras a una liberacion de ADN genomico degradado. De esta manera, sale continuamente ADN del feto a la via sangumea de la madre. Diversos estudios han demostrado que en el plasma de embarazadas el ADN fetal y el ADN materno se diferencian en cuanto a sus caractensticas moleculares, el ADN fetal esta presente principalmente en forma de fragmentos cortos con un tamano de hasta 300 pares de bases (bp), mientras que el ADN materno circula principalmente en forma de un peso molecular mas grande (1000 pb y mas). Estas diferencias de tamano entre el ADN fetal y el ADN maternal exentos de celulas se mantienen sustancialmente inalteradas en el transcurso del embarazo y permiten obtener a traves de procedimientos adecuados para la limpieza de ADN enriquecer fragmentos de ADN cortos y obtener de esta manera una muestra de ADN en la que la parte de ADN fetal esta aumentada frente al fondo dominante de las secuencias de DNA maternal. Este enriquecimiento de ADN fetal aumenta el valor informativo del diagnostico molecular del feto para la deteccion de alteraciones de secuencia / mutaciones y, en particular, para informaciones cuantitativas como por ejemplo para el diagnostico de trisoirnas.
Sin embargo, la comprobacion de ADN fetal en el plasma sangumeo materno no permite el analisis genetico molecular del embrion en una fertilizacion in vitro (FIV) antes de al transferencia del embrion al utero de la madre.
Pero para aumentar la cuota de exito en una fertilizacion in Vitro adquieren cada vez mas importancia tanto la identificacion morfologica como la identificacion genetica molecular de los mejores embriones antes de la transferencia, lo que es posible mediante un diagnostico preimplantacional.
Como diagnostico preimplantacional (DPI) se denominan los analisis de biologfa celular y de genetica molecular que sirven para la decision de si un embrion generado mediante fertilizacion in Vitro debe implantarse en el utero o no. El DPI se usa principalmente para la deteccion de determinadas enfermedades hereditarias y peculiaridades de los cromosomas. Pero tambien se puede emplear para generar un bebe apropiado como donante de organos para un hermano enfermo ("bebe salvador") o para elegir el sexo o determinadas caractensticas hereditarias del nino.
Para poder realizar un DPI es necesario previamente una fertilizacion in Vitro. El procedimiento de la FIV con DPI se puede dividir basicamente en cinco pasos: 1. estimulacion hormonal y obtencion de ovulo, 2. fertilizacion extracorporal, 3. biopsia embrionaria, 4. diagnostico genetico, 5. transferencia embrionaria o crioconservacion. Los pasos tres y cuatro son los que definen el DPI propiamente dicho.
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La biopsia embrionaria, es dedr, la separacion de uno o dos celulas de un embrion se realiza generalmente en el tercer dfa despues de la fertilizacion. En este momento, el embrion se compone habitualmente de seis a diez celulas y esta envuelto por una envoltura protectora (zona pelucida).
Segun un procedimiento mas reciente, la biopsia del embrion no se realiza hasta aproximadamente el quinto dfa de desarrollo. En este estadio de desarrollo, el embrion se compone de un grupo de celulas exterior, a partir del que se produce la placenta (trofoblasto), y la masa celular interior, a partir de la que se desarrolla el embrion o feto (embrioblasto), y se denomina blastocisto. Por lo tanto, tambien se habla de una biopsia de blastocisto. En una biopsia de blastocisto, generalmente se extraen varias celulas al trofoblasto y se examinan geneticamente. Solo aproximadamente de 20 a 40% de todos los ovulos fertilizados alcanzan el estadio del blastocisto expandido.
En una biopsia embrionaria, en primer lugar, con la ayuda de acido, luz laser o de manera mecanica se realiza un orificio en la envoltura de proteccion que envuelve al embrion. A continuacion, al embrion se extraen una o dos celulas por medio de una pipeta de aspiracion. Hay indicios de que la separacion de celulas puede reducir la capacidad de implantacion del embrion. Todavfa esta poco aclarada la cuestion de si la separacion podna tener otros efectos negativos sobre el desarrollo del embrion o del nino. El DPI constituye un procedimiento diffcil de realizar, no en ultimo lugar porque habitualmente estan disponibles como maximo dos celulas para el test y porque es imposible o diffcil repetir el procedimiento. Por ello no es despreciable el riesgo de diagnosticos erroneos. La probabilidad de que el resultado del test es correcto asciende aproximadamente a entre 90 y 95%. Para comprobar el resultado se recomienda a todas las parejas afectadas realizar durante el embarazo adicionalmente un DPN. El problema mas frecuente son los resultados de examen erroneamente negativos a causa de la contaminacion con ADN ajeno o a causa de la llamada "allelic dropout" (perdida alelica), es decir, el analisis de solo uno en lugar de los dos alelos. En el caso de un resultado de examen erroneamente negativo, el embrion es portador del defecto genetico, aunque el diagnostico no lo indica.
Otro problema consiste en el mosaicismo, entendiendose por un mosaico un embrion formado por celulas geneticamente distintas. Por tanto, ocurre que las celulas examinadas presentan otro genoma que las celulas restantes, lo que conduce a un diagnostico erroneo. El mosaicismo es relativamente frecuente y se debe a errores en la division celular.
Harper y col. 2011 (Human Genetics, 175 a 186) describe alguno de los procedimientos de diagnostico preimplantacional. Por lo tanto, la presente invencion tiene el objetivo de hacer posible un diagnostico preimplantacional sin peligro para el embrion, pero a pesar de ello con un alto valor informativo.
El objetivo de la invencion se consigue respectivamente de forma autonoma mediante un procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos celulares fetales de una fertilizacion in vitro, que comprende los pasos: a) extraccion del sobrenadante exento de celulas, que contiene acido nucleico fetal, del medio de cultivo de fertilizacion in vitro del recipiente de cultivo empleado para cultivar el ovulo fertilizado, b) enriquecimiento de los acidos nucleicos fetales contenidos en el sobrenadante y c) realizacion de un analisis de los acidos nucleicos presentes en el sobrenadante exento de celulas, asf como mediante un procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica, que comprende los pasos: a) extraccion del lfquido exento de celulas, que contiene acido nucleico fetal, a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto, b) enriquecimiento del acido nucleico contenido en dicho lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, o de los acidos nucleicos fetales contenidos en el blastocele o la cavidad blastodstica y c) realizacion de un analisis de los acidos nucleicos presentes en el sobrenadante exento de celulas.
El uso de ADN fetal exento de celulas, procedente del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos in vitro de la fertilizacion in vitro en lugar de celulas intactas presenta las ventajas de que a) no se reduce la capacidad de implantacion del embrion, b) se suprime el riesgo de una interrupcion no deseada del embarazo, c), no se dana al embrion, d) disminuye la fuente de error por mosaicismo, microquimerismo, contaminacion con ADN ajeno, e) se evitan diagnosticos erroneos, etc.
En el procedimiento segun la invencion resulta ventajoso que no es necesario extraer componentes celulares. Mediante el diagnostico preimplantacional no invasivo se pueden detectar aneuploidias cromosomicas fetales, enfermedades monogeneticas, el sexo, el grupo sangumeo, tipificaciones de HLA etc.
Ademas, resulta ventajoso que mediante los procedimientos de genetica molecular se dispone rapidamente de un resultado y, por lo tanto, antes de la transferencia del embrion al utero de la madre que habitualmente se realiza ya como muy tarde 6 dfas despues de la fertilizacion, si n o se realiza ninguna crioconservacion, es posible una
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decision.
El acido nucleico fetal puede ser ADN y/o ARN, especialmente ADN, resultando ventajoso que para el analisis subsiguiente se pueden usar procedimientos biomoleculares estandarizados.
Tambien resulta ventajoso que el sobrenadante de cultivo celular puede analizarse en medios de cultivo unicos y/o que forman parte de una secuencia, por lo que en caso de un resultado dudoso un analisis puede repetirse en el transcurso del diagnostico preimplantacional, porque en cualquier momento pueden aislarse de forma no invasiva acidos nucleicos fetales del cultivo celular y analizarse.
El sobrenadante exento de celulas, que contiene acido nucleico, puede analizarse el dfa 1 a 6 del cultivo in vitro, por lo que se dispone ya de un resultado del analisis muy temprano durante la fertilizacion in vitro. De esta manera, por ejemplo se puede ofrecer a los futuros padres ya antes de la implantacion una base para la decision sobre el siguiente procedimiento, sin poner en peligro al embrion. Preferentemente el ADN/ARN fetal, exento de celulas, se analiza el dfa 3 a 5 del cultivo in vitro, porque en este momento existe ya suficiente ADN/ARN fetal del embrion en el sobrenadante de cultivo celular del cultivo celular in vitro para obtener de forma segura un resultado del analisis y, ademas, el resultado esta disponible a tiempo antes de la transferencia del embrion al utero de la madre.
Preferentemente, el lfquido que sobrenada en el cultivo celular se extrae de una zona que rodea el ovulo fertilizado y que tiene al menos 2 veces el diametro del ovulo fertilizado cultivado, porque en esta zona existe la maxima concentracion de ADN/ARN y por tanto la maxima probabilidad de obtener un resultado del analisis.
Tambien es posible abrir de forma mecanica, qmmica o por laser la zona pelucida del embrion o del ovulo fertilizado en los dfas de cultivo 1 a 6 del cultivo celular antes de la extraccion del lfquido que sobrenada en el cultivo celular, para aumentar la concentracion de ADN/ARN fetal, ya que la zona pelucida constituye un obstaculo natural para la salida de ADN/ARN al medio de cultivo.
Segun el procedimiento (sin o despues de abrir la zona pelucida) se analizan al menos 2 |il del sobrenadante de cultivo celular, porque de esta manera se puede suministrar suficiente ADN/ARN fetal al analisis.
El aislamiento, especialmente el enriquecimiento, de los acidos nucleicos fetales se realiza mediante un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende la centrifugacion, la filtracion, la union a granulos, la amplificacion, especialmente la reaccion en cadena de la polimerasa, porque de esta manera se usan procedimientos estandarizados para la obtencion del resultado y por tanto se puede mantener lo mas baja posible la cuota de errores.
El analisis de los acidos nucleicos fetales puede comprender un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende la secuenciacion, la amplificacion, la hibridizacion in situ, especialmente la hibridizacion in situ con fluorescencia, con lo que existe rapidamente un resultado con valor informativo y se puede decidir sobre el siguiente destino del embrion a tiempo antes de la transferencia del embrion.
Resulta ventajoso que se pueden detectar enfermedades, especialmente enfermedades monogeneticas, grupos sangumeos, el sexo, aneuploidias, tipos de HLA, y por tanto existe ya antes de comenzar el embarazo en sf la certeza sobre la cuestion inicial y no se consigue un resultado solo en el transcurso del embarazo despues de una larga espera o mediante la puesta en peligro del embrion.
En un procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica, que comprende los pasos: a) extraccion del lfquido exento de celulas, que contiene acido nucleico fetal, a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto, b) enriquecimiento de los acidos nucleicos fetales contenidos en el lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, en el blastocele o la cavidad blastodstica y c) realizacion de un analisis de los acidos nucleicos presentes en el sobrenadante exento de celulas, se extrae una cantidad de lfquido seleccionada de entre un intervalo con un lfmite inferior de 0,004 pl y un lfmite superior de 0,1 nl, especialmente 0,04 nl, del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del lfquido contenido en el blastocele o la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto, y se transfiere a un volumen de lfquido que preferentemente se compone del o contiene el medio de cultivo, de al menos 2 |il, y a continuacion se analiza, para por una parte no poner en peligro al embrion, a la blastula o al blastocisto, pero por otra parte, disponer de suficiente material para el analisis adicional.
El aislamiento y el enriquecimiento del acido nucleico se realizan mediante amplificacion, especialmente mediante
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la reaccion en cadena de la polimerasa, porque de esta manera se dispone rapidamente de una cantidad suficiente de acido nucleico fetal para someterlo a un analisis adicional.
Las ventajas del aislamiento y del analisis de los acidos nucleicos mediante procedimientos estandarizados corresponden tambien en esta forma de realizacion alternativa del procedimiento en el que los acidos nucleicos exentos de celulas se obtienen a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica, a las que se han descrito anteriormente. Ademas, con el procedimiento alternativo segun la invencion se pueden comprobar y determinar los mismos parametros como se ha descrito anteriormente.
Para una mejor compresion de la invencion, esta se describe en detalle con la ayuda de la siguiente figura.
Muestra en una representacion fuertemente simplificada esquematicamente:
la figura 1, un recipiente de cultivo con un ovulo fertilizado y la zona circundante.
Introduciendo, cabe mencionar que en las distintas formas de realizacion descritas, las partes identicas se proveen de signos de referencia identicos, siendo validas las especificaciones contenidas en la descripcion completa de forma analoga para partes identicas con signos de referencia identicos. Ademas, las indicaciones de posicion elegidas en la descripcion como por ejemplo arriba, abajo, lateralmente etc. se refieren a la figura descrita y representada en concreto y en caso de un cambio de posicion son validas de forma analoga para la nueva posicion. Ademas, tambien caractensticas individuales o combinaciones de caractensticas de los diferentes ejemplos de realizacion representados y descritos pueden constituir soluciones autonomas de la invencion o segun la invencion.
Todas las indicaciones relativas a intervalos de valores en la presente descripcion se entenderan de tal forma que comprenden cualquier intervalo parcial y todos los intervalos parciales de los mismos, por ejemplo, la indicacion 1 a 10 se entendera de tal forma que estan comprendidos todos los intervalos parciales partiendo del lfmite inferior 1 y del lfmite superior 10, es decir, que todos los intervalos parciales comienzan con un lfmite inferior de 1 o superior y terminan en un lfmite superior de 10 o inferior, por ejemplo, 1 a 1,7 o 3,2 a 8,1 o 5,5 a 10.
La presente invencion describe un procedimiento con el que se puede realizar un diagnostico preimplantacional sin usar material celular.
Por embrion se entiende en el sentido de la invencion aquella parte celular del cultivo in vitro, a partir de la que se desarrolla el embrion en sf, incluidos los estadios de desarrollo tempranos como la morula, la blastula, la gastrula o el blastocisto.
El ovulo fertilizado corresponde en el sentido de la invencion a los diferentes estadios de desarrollo tempranos de la genesis embrionaria, como la morula, la blastula, la gastrula o el blastocisto.
Para la realizacion del procedimiento segun la invencion para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos celulares fetales de un cultivo de celulas de fertilizacion in vitro, en primer lugar, se extrae del recipiente de cultivo empleado para cultivar el ovulo fertilizado una alfcuota del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo o el sobrenadante total del medio de cultivo, que esta exento de celulas y contiene acidos nucleicos fetales. A continuacion, el medio de cultivo con el acido nucleico contenido en el mismo se sigue procesando y se afslan los acidos nucleicos fetales contenidos en el sobrenadante. Ahora, este acido nucleico aislado del sobrenadante exento de celulas se somete a un analisis adicional.
Como medio de cultivo para el ovulo fertilizado o el embrion se usan medios estandarizados tales como medios HSA o rHSA, por lo que no se introduce ADN ajeno en los cultivos celulares.
Sin embargo, antes de poder cultivar el ovulo fertilizado, se realiza primero la extraccion del ovulo (puncion folicular) con la fertilizacion subsiguiente del ovulo con el espermatozoide mediante IVF, ICSI, IMSI. Los ovulos fertilizados de esta manera se introducen en un medio de cultivo, tambien llamado medio nutritivo. Ahora, estos se incuban en un armario encubador. Al cabo de 16 a 18 horas se realiza un primer control bajo microscopio para detectar cuantos ovulos se pudieron fertilizar con los espermatozoides. Entretanto es posible mantener los ovulos fertilizados o embriones durante mas tiempo en el cultivo para, a continuacion, en el dfa 5 (poco frecuentemente en el dfa 6) despues de la puncion folicular, transferir uno o dos embriones en el estadio de blastocisto, preferentemente en el estadio de blastocisto expandido.
Esto significa que de la totalidad de todos los embriones cultivados durante 3 a 6 dfas se seleccionan y se
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transfieren los mas desarrollados y los menos llamativos tanto bajo el aspecto morfologico como bajo el aspecto genetico molecular conforme al procedimiento segun la invencion.
Sorprendentemente, tanto en el lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, en el blastocele o en la cavidad blastodstica, como en el lfquido que sobrenada en el medio de cultivo existe ya una cantidad suficiente de acidos nucleicos fetales para poder someterlos a un analisis adicional. Se supone que el ADN proviene de celulas apoptoticas dentro del embrion. El ADN de estas celulas se libera y puede pasar a traves de la zona pelucida. Para realizar un analisis genetico molecular del embrion previsto para la transferencia, por lo tanto, por el procedimiento segun la invencion es obsoleta la extraccion de material celular. Por lo tanto, no se es necesario extraer celulas de ningun tipo, es decir, ni del embrion posterior ni de las celulas que lo rodean ni del estadio de morula, de blastula, de gastrula o de blastocisto. Dado que el embrion a desarrollar se encuentra en un estadio muy activo al contrario del ovulo material y del espermatozoide paternal, la parte de acidos nucleicos fetales en el medio de cultivo exento de celulas es notablemente mayor que la de los padres.
Mediante la obtencion de acidos nucleicos exentos de celulas a partir del sobrenadante se facilita notablemente el siguiente procesamiento de los mismos para poder realizar un analisis, porque no es necesario separar componentes celulares, en cuyo caso se podnan perder acidos nucleicos fetales, y no existen impurificaciones celulares que pudiesen perturbar un analisis.
El acido nucleico fetal puede ser tanto ADN como ARN, existiendo generalmente fragmentos de acido nucleico. Asf, se pueden analizar fragmentos de ADN circulantes libres de reducido tamano molecular. Pero tambien se puede aislar y analizar ARN, como por ejemplo miARN, siARN o mARN, que por ejemplo se transcribe inicialmente de forma reversa par el siguiente analisis.
El lfquido del medio de cultivo que va a ser sometido a analisis se puede analizar a partir de medios de cultivo unicos o que forman una secuencia. En caso de emplear medios de cultivo secuenciales, en el transcurso del cultivo del ovulo fertilizado, el medio de cultivo eventualmente se cambia varias veces, y durante cada cambio de medio de cultivo, del medio de cultivo retirado pueden aislarse y analizarse los acidos nucleicos fetales. Sin embargo, un cambio multiple del medio de cultivo tambien es posible en medios de cultivo unicos.
El sobrenadante exento de celulas que contiene el acido nucleico se extrae del cultivo in vitro en al menos uno de los dfas 1 a 6 y se analiza. Preferentemente, el sobrenadante se extrae del cultivo in vitro entre los dfas 3 y 5 (sin o despues de la apertura mecanica, qmmica o por laser de la zona pelucida), porque en este penodo esta contenido suficiente acido nucleico fetal en el sobrenadante y, no obstante, el resultado del diagnostico preimplantacional esta disponible a tiempo antes de la transferencia del embrion al utero de la madre. La apertura de la zona pelucida se puede realizar directamente antes de la extraccion del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo o ya hasta 3 dfas antes.
Si el medio de cultivo no se cambia o si se analiza acido nucleico fetal antes de un cambio de medio de cultivo, el sobrenadante de cultivo celular se extrae de una zona que rodea al ovulo fertilizado y que tiene al menos 2 veces el diametro del ovulo fertilizado cultivado. En la figura 1, la zona de la que se puede extraer el medio de cultivo no esta representada a escala. La figura 1 muestra un medio de cultivo 1 en el que el ovulo 2 fertilizado se cultiva en el medio de cultivo 3. Una posible zona 4 que rodea al ovulo 2 fertilizado limita con el ovulo 2 fertilizado y se extiende en el borde superior de este. Otra posibilidad de la zona 5 tambien esta representada en la figura 1, extendiendose la misma radialmente alrededor del ovulo 2. Para obtener una cantidad suficiente de acido nucleico fetal, preferentemente, se extrae el volumen de la distancia del doble diametro maximo del ovulo 2 fertilizado.
Se extraen al menos 2 |i del sobrenadante de cultivo celular para garantizar que esten contenidos al menos algunas moleculas de acido nucleico fetal que generalmente se amplifican de todas formas antes de someterse al analisis adicional.
Sin embargo, en caso de un cambio de medio de cultivo o en el momento de la transferencia del embrion al utero tambien se puede someter el medio de cultivo completo al analisis adicional.
El aislamiento de los acidos nucleicos fetales del sobrenadante de cultivo celular exento de celulas se realiza mediante procedimientos conocidos por el estado de la tecnica que sirvan para el enriquecimiento de acidos nucleicos. Se trata especialmente de procedimientos seleccionados de entre un grupo que comprende la centrifugacion, la filtracion, la union a granulos, la amplificacion, especialmente la reaccion en cadena de la polimerasa.
Sin embargo, tambien es posible comprobar la presencia y la cantidad de DNA fetal sin enriquecimiento o
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aislamiento, por ejemplo mediante procedimiento espectrofotometricos. De esta manera, por ejemplo, a partir de una pequena cantidad de muestra (1 |il) y del espectro obtenido a partir de ello se puede calcular la cantidad de los acidos nucleicos presentes en la muestra (como ADN o ARN). A partir de ello se pueden obtener indicios para el siguiente desarrollo del ovulo fertilizado o del embrion.
El analisis de los acidos nucleicos fetales igualmente se realiza con procedimientos conocidos por el estado de la tecnica, realizandose preferentemente un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende una secuenciacion, una amplificacion, una hibridizacion in situ, especialmente una hibridizacion in situ con fluorescencia. El examen de los acidos nucleicos sin embargo se realiza mediante diferentes procedimientos de analisis segun el objetivo y habitualmente tarda entre dos y 24 horas. Por ejemplo, la amplificacion y, dado el caso, el aislamiento del acido nucleico pueden realizarse mediante procedimientos de amplificacion, con los que cantidades de un equivalente de celula ADN se pueden comprobar mediante la amplificacion del genoma completo. El test FisH (hibridizacion in situ con fluorescencia) por ejemplo comprueba si existen aberraciones cromosomicas, unas alteraciones muy graves del genoma. Genes individuales se examinan si en los padres existe una disposicion a un defecto genetico, es decir, si una determinada enfermedad hereditaria aparece de forma repetida en la familia. Ademas de los procedimientos de uso mas frecuente de la amplificacion por PCR y la hibridizacion in situ con fluorescencia, tambien estan disponibles para el diagnostico preimplantacional los procedimientos de la amplificacion del genoma completo conocidos por el estado de la tecnica. Tambien el cariomapping puede realizarse como posible procedimiento de analisis para los acidos nucleicos obtenidos con el procedimiento segun la invencion.
Mediante el analisis de ADN genomico o mitocondrial exento de celulas de un embrion en cultivo se pueden obtener parametros importantes para las expectativas de exito de la implantacion, la viabilidad y la predisposicion genetica del ser vivo desarrollado a partir del mismo. Se pueden detectar enfermedades, especialmente enfermedades monogeneticas, grupos sangumeos, el sexo, aneuploidias, tipos de HLA, etc. Pero evidentemente, tambien se pueden determinar otros parametros sobre la base de la genetica molecular. Con el procedimiento segun la invencion se pueden detectar tambien marcadores biologicos relacionados con aneuploidias cromosomicas y basados en causas de genetica molecular.
En una variante de realizacion alternativa de la invencion tambien se puede usar un procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica para realizar un diagnostico preimplantacional sin usar material celular. En un primer paso se extrae lfquido que contiene acido nucleico fetal, exento de celulas, del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto. A continuacion, se enriquece o se afsla el acido nucleico fetal contenido en el lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, en el blastocele o en la cavidad blastodstica. Por ultimo, se realiza un analisis biomolecular de los acidos nucleicos presentes en el sobrenadante exento de celulas.
Por ejemplo, la zona pelucida se puede abrir el dfa 3 y el medio de cultivo se puede recoger los dfas 3 a 5. Alternativamente, el dfa 3 tambien se puede lavar la parte interior y recoger el medio.
A partir del blastocele o de la cavidad blastodstica se pueden obtener muestras el dfa 5.
A partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica se extraen al menos 0,004 pl, especialmente 0,004 nl a 0,04 nl, de lfquido. Preferentemente, a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida se extraen al menos 0,004 nl y a partir del blastocele o de la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto se extraen al menos 0,04 pl a 0,04 nl del lfquido y se transfieren a un volumen de lfquido de al menos 2 |il, que en el caso ideal se compone de o contiene el medio de cultivo, y a continuacion se analiza para haber obtenido en todo caso moleculas de acidos nucleicos fetales en el lfquido extrafdo del blastocele o de la cavidad blastodstica o de la zona de lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida.
El acido nucleico contenido en el lfquido del blastocele o de la cavidad blastodstica se enriquece preferentemente mediante amplificacion, especialmente mediante la reaccion en cadena de la polimerasa.
Se pueden usar los procedimientos de aislamiento y de analisis descritos anteriormente y se pueden determinar los mismos parametros.
Las variantes de realizacion del procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos celulares fetales de una fertilizacion in vitro no esta limitadas a las variantes de realizacion del mismo representados especialmente, sino que mas bien tambien son posibles diversas
combinaciones de las distintas variantes de realizacion entre sf y esta posibilidad de variacion por la teona para la actuacion tecnica de la presente invencion esta sujeta al saber del experto activo en este campo tecnico. Por lo tanto, tambien esta incluida en el alcance de proteccion cualquier variante de realizacion imaginable que sea posible mediante combinaciones de detalles individuales de la variante de realizacion representada y descrita.
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Finalmente, cabe mencionar que para una mejor comprension los componentes de la figura 1 se han representado en parte no a escala y/o de forma aumentada y/o reducida.
El objetivo en el que se basan las soluciones autonomas de la invencion se halla en la descripcion.
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Lista de signos de referencia
1 Recipiente de cultivo
2 Ovulo
15 3 Medio de cultivo
4 Zona
5 Zona

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. - Procedimiento para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del Ifquido que sobrenada en el medio de cultivo de cultivos celulares fetales de una fertilizacion in vitro, que comprende los pasos: a) extraccion del Uquido que sobrenada exento de celulas, que contiene acido nucleico fetal, del medio de cultivo de fertilizacion in vitro del recipiente de cultivo empleado para cultivar el ovulo fertilizado, b) aislamiento de los acidos nucleicos fetales contenidos en el lfquido que sobrenada y c) realizacion de un analisis de los acidos nucleicos presentes en el lfquido que sobrenada exento de celulas.
  2. 2. - Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque como acido nucleico fetal se analiza ADN y/o ARN.
  3. 3. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se analiza el lfquido que sobrenada en el cultivo celular de medios de cultivo unicos y/o secuenciales.
  4. 4. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el lfquido que sobrenadaexento de celulas que contiene acido nucleico se analiza en al menos uno de los dfas 1 a 6 del cultivo in vitro.
  5. 5. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el lfquido que sobrenada en el medio de cultivo (3) del recipiente de cultivo (1) se extrae de una zona (4, 5) que rodea al ovulo (2) fertilizado y que tiene al menos 2 veces el diametro del ovulo (2) fertilizado cultivado.
  6. 6. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se analizan al menos 2 |il del sobrenadante de cultivo celular.
  7. 7. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la zona pelucida del ovulo fertilizado se abre de forma mecanica, qmmica o por laser en los dfas de cultivo 1 a 6 antes de la extraccion del lfquido que sobrenada en el cultivo celular.
  8. 8. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el aislamiento de los acidos nucleicos fetales se realiza mediante enriquecimiento, especialmente mediante un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende la centrifugacion, la filtracion, la union a granulos, la amplificacion, especialmente la reaccion en cadena de la polimerasa.
  9. 9. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el analisis de los acidos nucleicos fetales comprende un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende una secuenciacion, una amplificacion, una hibridizacion in situ, especialmente una hibridizacion in situ con fluorescencia.
  10. 10. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se detectan enfermedades, especialmente enfermedades monogeneticas, grupos sangumeos, el sexo, aneuploidias, tipos de HLA del embrion.
  11. 11. - Procedimiento in vitro para la comprobacion de acidos nucleicos fetales a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica, que comprende los pasos: a) extraccion del lfquido exento de celulas, que contiene acido nucleico fetal, a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, del blastocele o de la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto, b) enriquecimiento de los acidos nucleicos fetales contenidos en dicho lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, en el blastocele o la cavidad blastodstica y c) realizacion de un analisis de los acidos nucleicos presentes en el sobrenadante exento de celulas.
  12. 12. - Procedimiento segun la reivindicacion 11, caracterizado porque se extrae una cantidad de lfquido seleccionada de entre un intervalo con un lfmite inferior de 0,004 pl, especialmente de 0,004 nl, y con un lfmite superior de 0,1 nl, a partir del lfquido que rodea al embrion dentro de la zona pelucida, a partir del lfquido contenido en el blastocele o la cavidad blastodstica de la blastula o del blastocisto, y se transfiere a un volumen de lfquido que preferentemente se compone del o contiene el medio de cultivo, de al menos 2 |il, y a continuacion se analiza.
  13. 13. - Procedimiento segun la reivindicacion 11 o 12, caracterizado porque el enriquecimiento del acido nucleico se realiza mediante amplificacion, especialmente mediante la reaccion en cadena de la polimerasa.
  14. 14. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el aislamiento de los acidos nucleicos fetales se realiza mediante enriquecimiento, especialmente mediante un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende la centrifugacion, la filtracion, la union a granulos, la amplificacion, especialmente
    la reaccion en cadena de la polimerasa.
  15. 15. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque el analisis de los acidos nucleicos fetales comprende un procedimiento seleccionado de entre un grupo que comprende una secuenciacion, una amplificacion, una hibridizacion in situ, especialmente una hibridizacion in situ con fluorescencia.
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  16. 16. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque se detectan enfermedades, especialmente enfermedades monogeneticas, grupos sangumeos, el sexo, aneuploidias, tipos de HLA del embrion.
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