ES2581784T3

ES2581784T3 - Análisis integrado de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2581784T3
Application number: ES05761305.1T
Authority: ES
Inventors: Pia Ollikka; Alice Ylikoski
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2005-06-28
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2025-06-28
Also published as: WO2006000648A1; EP1778863A4; EP1778863B1; DK1778863T3; EP1778863A1; FI20045248A; FI20045248A0

Abstract

Un método para analizar un ácido nucleico diana en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas de i) transferir una matriz absorbente a un vial de reacción; ii) proporcionar una muestra biológica que contiene dichos ácidos nucleicos diana a dicha matriz absorbente, o aplicarla a la misma; iii) proporcionar en dicho vial de reacción una mezcla de reactivos para amplificar dichos ácidos nucleicos; iv) proporcionar en dicho vial de reacción una mezcla de reactivos de detección; v) sellar dicho vial de reacción; vi) realizar una reacción de amplificación; y vii) detectar los ácidos nucleicos amplificados usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, en donde dicha muestra biológica se proporciona sin previa extracción, lavado o elución de los ácidos nucleicos, y las etapas vi) y vii) se llevan a cabo en dicho vial sin eliminar dicha matriz del vial y en donde la etapa de detección se realiza en tubos cerrados, sin abrir los sellos.

Description

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Technologies). Como control, se analizaron 20 ng/reacción de muestra de ADN genómico purificado procedente de sangre entera de un voluntario.

El programa de PCR fue como sigue: Pre-calentamiento 95 °C 1 min; 35 ciclos de siguientes + 95 °C 30 s, + 56 °C, 1 min + 66 °C 1 min, extensión final de 7 min y última desnaturalización 8 min. Después de la amplificación, la reacción se incubó a + 40 °C durante 20 min y a + 22 °C durante 15 min, tras lo cual la fluorescencia resuelta en el tiempo se midió con un contador Victor2 1420 Multilabel Counter (Wallac) directamente desde el vial sin abrir.

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 2 por la media y la desviación estándar de la fluorescencia Eu resuelta en el tiempo de cada reacción por triplicado. Los controles de PCR negativos y positivos son representados por las barras A y B, respectivamente. C -D representan los resultados de la sangre y EF a partir de muestras de saliva obtenidas a partir de 2 voluntarios. Cuando la liberación integrada en el vial de reacción sin la retirada de la matriz en cualquier punto (barras rayadas) se compara con la liberación en un vial separado (barras grises), se ve claramente que todo el análisis puede realizarse con discos de sangre y saliva sin eliminación del disco. El resultado indica que la liberación de la matriz se puede realizar a temperatura ambiente en el vial de reacción y después de la amplificación la detección se puede realizar sin la eliminación de la matriz permitiendo la automatización sencilla de análisis conjunto.

Ejemplo 3.

Análisis integrado de ADN de sangre entera y saliva.

Este ejemplo muestra cómo la liberación de ácidos nucleicos de la matriz se puede simplificar aún más para permitir la automatización simple. La muestra se recoge sobre la matriz de desnaturalización de proteína, y la liberación de ácidos nucleicos, amplificación y detección se llevan todas a cabo en un único vial de reacción, incluso en presencia de reactivos de amplificación y detección. Se añade la matriz que comprende la muestra, junto con los reactivos de amplificación/detección a un vial de reacción, el vial se sella y después de la amplificación y una corta incubación analítica, se mide la fluorescencia sin abrir el vial de reacción, es decir, sin eliminar la matriz.

En primer lugar, se recogió sangre entera y saliva de dos voluntarios. Las muestras se aplicaron sobre papel de recogida IsoCode® (Schleicher y Schuell) y se dejaron secar.

Para el análisis, fueron perforados un disco de sangre de 1,2 mm o dos discos de saliva de 1,2 mm en viales de PCR. La reacción de amplificación de PCR y detección en tubo cerrado se realizó en un volumen total de 50 µl en la siguiente mezcla de reacción de PCR/detección: 1 x tampón HotStarTaq® (Qiagen), dNTP´s 0,2 mM, MgCl2 2,5 mM, 0,05% de BSA, cebador directo exón 10 de CFTR 0,2 µM (5' AAG CAC AGT GGA AGA ATT TC 3'), cebador inverso exón 10 de CFTR 0,05 µM (5 ' CTC TTC TAG TTG ACG TGC T 3'), 0,02 U/µl de enzima DyNAzyme™ (Finnzymes), 17 nM sonda de oligonucleótido específico del analito (5 'ACC AAA GAT GAT ATT TAA A 3') marcada en su extremo 5' con un quelato Eu W8184 fluorescente estable (Wallac) y sonda de desactivación 33 nM complemento a la sonda Eu (5' TCA TTG GTG TTT 3 ') marcada en su extremo 3' con BHQ1 (Biosearch Technologies). Como control, se analizaron 20 ng/reacción de muestra de ADN genómico de un voluntario en el disco. Como referencia, se realizó la liberación de ácidos nucleicos a temperatura ambiente durante 30 min en 40 µl de agua destilada, y se analizó en PCR/detección en tubo cerrado después de la adición de una porción de 10 µl de mezcla de reacción como 5 × concentrado.

El programa de PCR fue como sigue: Precalentamiento +95 °C 15 min; 35 ciclos de lo siguiente +95ºC 30 s, +56 °C, 1 min, +66 °C 1 min, extensión final 7 min y desnaturalización final 8 min. Después de la amplificación, la reacción se incubó a +40 °C durante 20 min y a + 22 °C durante 15 min, después de lo cual la fluorescencia resuelta en el tiempo se midió con un contador Victor2 1420 Multilabel Counter (Wallac).

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 3 mediante la media y la desviación estándar de la fluorescencia Eu resuelta en el tiempo de cada reacción por triplicado. Los controles de PCR negativos y positivos son representados por las barras A y B, respectivamente. C -D representan los resultados de las muestras de sangre y E -F de las muestras de saliva obtenidas de 2 voluntarios. Cuando la liberación en los reactivos de amplificación/detección (barras grises) se compara con la liberación en agua destilada (barras blancas), el resultado es casi igual con ambos métodos. El resultado indica que la liberación de la matriz se puede realizar incluso en la mezcla de amplificación /detección, y todo el proceso se puede realizar en un solo vial en un formato de tubo cerrado que permite la automatización simple de todo el análisis.

Ejemplo 4.

Pretratamiento de la muestra y análisis de ADN de sangre entera integrados.

Este ejemplo muestra cómo la matriz que comprende la muestra puede ser usada en el análisis inmediatamente después de la aplicación de la muestra que permite el desarrollo de dispositivos de amplificación/detección que comprenden la matriz en el vial de reacción. La muestra se aplica sobre la matriz absorbente desnaturalizante de

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rayadas) se compara con la liberación en un vial separado (barras grises), se observa claramente que el análisis completo puede realizarse usando reactivos secos, incluso sin eliminar el disco. Además, E indica que la matriz se puede integrar en el vial de reacción que comprende los reactivos secos, y la muestra se puede aplicar justo antes del análisis. El resultado indica que todo el proceso de pretratamiento de la muestra hasta la detección se puede realizar en un solo vial de reacción que comprende todos los reactivos secos permitiendo una automatización extraordinariamente simple.

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Claims

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