ES2579477T3 - Moléculas de corte y empalme en trans de pre-ARNm (RTM) mejoradas y sus usos - Google Patents
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-
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Abstract
Una molécula de corte y empalme en trans de pre-ARNm (RTM), que comprende: a) al menos un dominio de unión que dirige la unión de la molécula de ácido nucleico a un pre-ARNm expresado dentro de una célula; en el que dicho dominio de unión consiste en una secuencia que es complementaria a una secuencia de exón de mamífero, b) al menos un dominio de corte y empalme que contiene motivos necesarios para que se produzca la reacción de corte y empalme en trans, y c) al menos un dominio codificante , en el que dicho dominio codificante codifica al menos un exón de un gen de mamífero seleccionado del grupo de CFTR, integrinas, TNF-alfa, interleucinas, la superfamilia de las inmunoglobulinas, calicreínas, metaloproteinasas de matriz, queratinas, colágenos, y lamininas.
Description
(continuación)
Gen Exones ID del gen COL16A1 71 1307 COL17A1 56 1308 COL18A1 42 80781 COL19A1 51 1310 COL20A1 37 57642 COL21A1 29 81578 COL22A1 65 169044 COL23A1 29 91522 COL24A1 60 255631 COL25A1 38 84570 COL26A1 14 136227 COL27A1 61 85301 COL28A1 35 340267 COL29A1 10 256076
Tabla 3: Base para las construcciones derivadas del factor de necrosis tumoral alfa Exones ID del gen ID en GeneBank
TNF–a 4 7124 NM_000594
Tabla 4: Bases para las construcciones derivadas de interleucinas
- Interleucina
- Exones ID del gen ID en GeneBank
- 1-alfa
- 7 3552 NM_000575
- 1-beta
- 7 3553 NM_000576
- 1F5
- 5 26525 NM_173170
- 1F6
- 3 27179 NM_014440
- 1F7
- 5 27178 NM_014439
- 1F8
- 6 27177 NM_014438
- 1F9
- 5 56300 NM_019618
- 1F10
- 5 84639 NM_173161
- 2
- 4 3558 NM_000586
- 3
- 5 3562 NM_000588
- 4
- 4
- 3565 NM_000589
- 5
- 4 3567 NM_000879
- 6
- 5 3569 NM_000600
- 7
- 6 3574 NM_000880
- 8
- 4 3576 NM_000584
- 9
- 5 3578 NM_000590
- 10
- 5 3586 NM_000572
- 11
- 5 3589 NM_000641
- 12a
- 7 3592 NM_000882
- 12b
- 8 3593 NM_002187
- (continuación)
- Interleucina
- Exones ID del gen ID en GeneBank
- 13
- 4 3596 NM_002188
- 15
- 6 3600 NM_000585
- 16
- 21 3603 NM_172217
- 17a
- 3 3605 NM_002190
- 17b
- 3 27190 NM_014443
- 17c
- 3 27189 NM_013278
- 17d
- 3 53342 NM_138284
- 17f
- 3 112744 NM_052872
- 18
- 6 3606 NM_001562
- 19
- 6 29949 NM_153758
- 20
- 5 50604 NM_018724
- 21
- 5 59067 NM_021803
- 22
- 6 50616 NM_020525
- 23A
- 4 51561 NM_016584
- 24
- 7 11009 NM_006850
- 25
- 2 64806 NM_022789
- 26
- 5 55801 NM_018402
- 27 (30)
- 5 246778 NM_145659
- 28a
- 6 282616 NM_172138
- 28b
- 5 282617 NM_172139
- 29
- 5 282618 NM_172140
- 31
- 3 386653 NM_001014336
- 32
- 6 9235 NM_004221
- 33
- 7 90865 NM_033439
- 34
- 6 146433 NM_152456
- Tabla 5: Bases para las construcciones derivadas de ICAM/VCAM
- ICAM
- Exones ID del gen ID en GeneBank
- 1
- 7 3383 NM_000201
- 2
- 4 3384 NM_001099786 Variante del transcrito 1
- NM_001099787
- Variante del transcrito 2
- NM_001099788
- Variante del transcrito 3
- NM_001099789
- Variante del transcrito 4
- NM_000873
- Variante del transcrito 5
- 3
- 7 3385 NM_002162
- 4
- 3 3386 NM_001544 Variante del transcrito 1
- NM_022377
- Variante del transcrito 2
- NM_001039132
- Variante del transcrito 3
- 5
- 11 7087 NM_003259
(continuación)
ID enVCAM Exones ID del gen
GeneBank 1 9 7412 NM_001078 Variante del transcrito 1 8 NM_080682 Variante del transcrito 2
Tabla 6: Bases para las construcciones derivadas de calicreínas Calicreína Exones ID del gen ID en GeneBank
KLK1 5 3816 NM_002257 KLK2 5 3817 NM_005551,3 KLK3 5 354 NM_145864 KLK4 6 9622 NM_004917 KLK5 6 25818 NM_012427 KLK6 5 5653 NM_002774 KLK7 6 5650 NM_005046 KLK8 6 11202 NM_007196 KLK9 5 284366 NM_012315 KLK10 6 5655 NM_002776 KLK12 (variante del transcrito 1) 7 43849 NM_019598 KLK12 (variante del transcrito 2) 6 NM_145894 KLK12 (variante del transcrito 3) 5 NM_145895 KLK11 6 11012 NM_006853 KLK13 5 26085 NM_015596 KLK14 8 43847 NM_022046 KLK15 5 55554 NM_017509
Tabla 7: Bases para las construcciones derivadas de metaloproteinasas de la matriz Metaloproteinasa de la matriz Exones ID del gen ID en GeneBank
MMP1 10 4312 NM_002421 MMP2 13 4313 NM_004530 MMP3 10 4314 NM_002422 MMP7 6 4316 NM_002423 MMP8 10 4317 NM_002424 MMP9 13 4318 NM_004994 MMP10 10 4319 NM_002425 MMP11 8 4320 NM_005940 MMP12 10 4321 NM_002426 MMP13 10 4322 NM_002427 MMP14 10 4323 NM_004995 MMP15 10 4324 NM_002428 MMP16 10 4325 NM_005941 MMP17 10 4326 NM_016155 MMP19 9 4327 NM_002429
(continuación)
- Integrinas
- Exones ID del gen ID en GeneBank
- NM_000210
- Variante del transcrito 2
- a7
- 25 3679 NM_002206
- a8
- 30 8516 NM_003638
- a9
- 28 3680 NM_002207
- a10
- 30 8515 NM_003637
- a11
- 31 22801 NM_012211
- ad
- 30 3681 NM_005353
- ae
- 31 3682 NM_002208
- al
- 31 3683 NM_002209
- (continuación)
- am
- 30 3684 NM_000632
- av
- 30 3685 NM_002210
- aw
- 9 3686 ?
- ax
- 30 3687 NM_000887
- ß1
- 23 3688 NM_002211 Variante del transcrito
- 1A
- NM_033666
- Variante del transcrito
- 1B
- NM_033667
- Variante del transcrito
- 1C–1
- NM_033669
- Variante del transcrito
- 1C-2
- NM_033668
- Variante del transcrito
- 1D
- NM_133376
- Variante del transcrito
- 1E
- ß2
- 16 3689 NM_000211
- ß3
- 15 3690 NM_000212
- ß4
- 42 NM_000213 Variante del transcrito 1
- NM_001005619
- Variante del transcrito 2
- NM_001005731
- Variante del transcrito 3
- ß5
- 17 3693 NM_002213
- ß6
- 15 3694 NM_000888
- ß7
- 16 3695 NM_000889
- ß8
- 14 3696 NM_002214
Tabla 11: Bases para las construcciones derivadas de plectina Plectina Exones ID del gen
33 NM_000445 Isoforma 1 33 NM_201378 Isoforma 2 33 NM_201379 Isoforma 3 33 NM_201380 Isoforma 6 33 NM_201381 Isoforma 7
5
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- (continuación)
- Plectina
- Exones ID del gen
- 33
- NM_201382 Isoforma 8
- 33
- NM_201383 Isoforma 10
- 33
- NM_201384 Isoforma 11
En la presente invención, el término "homólogo" se refiere al grado de identidad entre secuencias de dos secuencias de ácido nucleico. La homología de secuencias homólogas se determina comparando dos secuencias alineadas en condiciones óptimas sobre las secuencias con las que se han de comparar. Las secuencias que se van a comparar en el presente documento pueden tener una adición o deleción (por ejemplo, hueco y similares) en la alineación óptima de las dos secuencias. Tal homología de secuencia se puede calcular mediante la creación de una alineación usando, por ejemplo, el algoritmo ClustalW (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). Se puede usar el software de análisis de secuencias disponible habitualmente, más específicamente, Vector NTI, GENETYX, BLAST o herramientas de análisis proporcionadas por las bases de datos públicas, tales como las que se encuentran en, por ejemplo, http://dragon.bio.purdue.edu/bioinfolinks/.
Por consiguiente, la presente invención abarca generalmente RTM de acuerdo con la presente invención, en la que las RTM comprenden cualquier combinación de dominio codificante que comprende los exones x a y para el gen respectivo, como se indica en las tablas anteriores, en las que x es un número entero seleccionado de 1 o 2 para el número máximo de exones, e y es un número entero seleccionado de 0 y x + 1, en el que x + 1 está limitado por el número máximo de los exones de dicho gen.
Como ejemplos preferidos, una RTM derivada de MMP9 (NM_004994, véase la tabla 7) puede comprender un dominio codificante que comprende los exones 1 a 13, o entre 2 y 13 exones del gen (estando x+1 limitado por los 13 exones de la MMP9); una RTM derivada de la plectina (NM_000445, véase la tabla 11) puede comprender un dominio codificante que comprende uno o más de los exones 1 a 33, o entre 2 y 33 exones del gen (estando x+1 limitado por los 10 exones de plectina, isoforma 1); una RTM derivada de la queratina 14 (NM_000526, véase la tabla 1) puede comprender un dominio codificante que comprende uno o más de los exones 1 a 8, o entre 2 y 8 exones del gen (estando x+1 limitado por los 8 exones de la queratina 14); una RTM derivada del colágeno de tipo 7 (ID del gen 1294, véase la tabla 2) puede comprender un dominio codificante que comprende uno o más de los exones 1 a 118, o entre 2 y 118 exones del gen (estando x+1 limitado por los 118 exones del colágeno de tipo 7); y una RTM derivada de ICAM–1 (NM_000201, véase la tabla 5) puede comprender un dominio codificante que comprende uno o más de los exones 1 a 7, o entre 2 y 7 exones del gen (estando x+1 limitado por los 7 exones de ICAM–1). Como ejemplos adicionales, para el corte y empalme en trans en 5’, la parte frontal del gen se sustituye, por lo que las RTM puede liberar solo el exón 1, los exones 1 y 2, 1 a 3, de 1 a 4, etc. Para la plectina, el exón 1 se deja fuera, por lo que en este caso la construcción es 2, 2 y 3, 2 a 4, etc. En el caso del corte y empalme en trans en 3’, solo el exón terminal y puede reemplazarse, lo que lleva a y + (y–1), y a (y–2), y a (y–3), etc. Las RTM de corte y empalme en trans doble pueden reemplazar cualquier exón interna o combinaciones de exones.
En una realización preferida de las RTM de acuerdo con la presente invención, dicha RTM comprende al menos un exón, derivado de otros genes, con el fin de proporcionar funcionalidades deseadas adicionales. Los ejemplos preferidos son la introducción de un dominio de unión complementario al intrón 1 de ICAM-1 fusionado a la interleucina-10, o una construcción que comprende una RTM para unirse en el gen de la MMP-9, en el que se introduce la HSV-timidina-quinasa. Después de la adición de, por ejemplo, ganciclovir, se fosforilada y se activa. En otras realizaciones preferidas, el exón comprende codones de terminación de origen natural o introducidos de forma artificial con el fin de reducir la expresión génica o contiene otras secuencias que producen un efecto similar al ARNi.
La RTM de acuerdo con la presente invención, en la que dicho gen se selecciona del grupo de plectina, queratina 14, colágeno de tipo 7, queratina 5, queratina 6, colágeno de tipo 17, laminina A3, laminina B3, g2, integrina 134, a6, CFTR e interleucina-10 (IL-10), preferiblemente al menos una de plectina, queratina 14, colágeno 7A1, colágeno 17a1 e IL-10. Las mutaciones en estos genes se han relacionado con enfermedades de células de la piel como se describe en el presente documento y enfermedades relacionadas. La IL-10 es una interleucina inmunosupresora que puede usarse para tratar enfermedades autoinmunitarias.
Se prefiere adicionalmente una RTM de acuerdo con la presente invención, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende además al menos una secuencia de seguridad en dicho dominio de corte y empalme. Dicha "seguridad" se incorpora en el espaciador, el dominio de unión, o en otro lugar en la RTM para evitar el corte y empalme en trans inespecífico. Esta es una región de la RTM que cubre elementos del sitio de corte y empalme en 3' y/o en 5' de la RTM mediante complementariedad relativamente débil, lo que impide el corte y empalme en trans inespecífico. La RTM está diseñada de tal manera que tras la hibridación de la o las porciones de unión/direccionamiento de la RTM, el sitio de corte y empalme en 3’ y/o 5’ se descubre y se vuelve completamente activo. Dichas secuencias de "seguridad" comprenden uno o más tramos complementarios de secuencia cis (o podría ser una segunda hebra distinta de ácido nucleico) que se une a uno o ambos lados del punto de ramificación
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nucleicos que se utilizan, por ejemplo, en las estrategias anti-sentido, como ribozimas o ARNpi para estabilizarlos frente a la degradación y de esta manera prolongar el tiempo durante el cual se mantiene una cantidad eficaz del ácido nucleico dentro de la célula (L. Beigelmann et al. (1995) Nucleic acids Res. 23:3989–94, documentos WO 95/11910, WO 98/37340 y WO 97/29116). Típicamente, dicha estabilización se puede obtener mediante la introducción de uno o más grupos fosfato internucleotídicos y/o mediante la introducción de uno o más internucleótidos sin fósforo.
Los internucleótidos modificados adecuados se resumen en, por ejemplo, Uhlmann y Peimann (1990) Can. Rev.
90:544. Los restos de fosfato internucleotídicos modificados y/o los puentes que no son de fosfato que se pueden usar en un ácido nucleico de la invención comprenden, por ejemplo, metilfosfonato, fosforotioato, fosforamidato, fosforoditionato, éster fosfato, análogos internucleotídicos sin fósforo, que pueden usarse en nucleico ácidos de la invención incluyen, por ejemplo, puentes de siloxano, puentes de carbonato, carboximetiléster, puentes acetamida y/o puentes tioéter.
En una realización preferida de la invención, potenciadores de corte y empalme tales como, por ejemplo, las secuencias denominadas potenciadores del corte y empalme exónico también pueden incluirse en la estructura de las RTM sintéticas. Se ha demostrado que los factores de corte y empalme de transacción, a saber, las proteínas ricas en serina/arginina (SR) que interaccionan con tales potenciadores de corte y empalme exónico y modulan el corte y empalme (véase, Tacke et al., 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11:358–362; Tian et al., 2001, J. Biological Chemistry 276:33833–33839; Fu, 1995, RNA 1:663–680). Por tanto, la RTM incluye, preferentemente, una o más secuencias complementarias a las secuencias del intrón y/o el exón en el pre-ARNm diana. Esto une la RTM al pre-ARNm diana endógeno elegido, de modo que es más probable que el sitio de corte y empalme de la RTM complete una reacción de corte y empalme con un sitio de corte y empalme en el pre-ARNm diana.
Se pueden añadir características adicionales a la molécula de RTM, tales como señales de poliadenilación para modificar la expresión/estabilidad del ARN o secuencias de corte y empalme en 5’ para potenciar el corte y empalme, regiones de unión adicionales, regiones de autocomplementariedad de “seguridad”, sitios de corte y empalme adicionales o grupos protectores para modular la estabilidad de la molécula y prevenir la degradación. Además, se pueden incluir codones de terminación en la estructura de la RTM para evitar la traducción de las RTM no sometidas a corte y empalme. En las RTM se pueden incorporar elementos adicionales, tales como estructura en horquilla en 3', ARN circularizado, modificación de bases nucleotídicas o análogos sintéticos para estimular o facilitar la localización nuclear y la incorporación del espliceosoma y la estabilidad intracelular.
Cuando las RTM específicas se deben sintetizar in vitro (RTM sintéticas), dichas RTM se pueden modificar en el resto de base, resto de azúcar, o estructura de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación con el ARNm diana, transporte a la célula etc. Por ejemplo, la modificación de una RTM para reducir la carga global puede potenciar la captación celular de la molécula. Además se pueden realizar modificaciones para reducir la susceptibilidad a las nucleasas o a la degradación química. Las moléculas de ácido nucleico se pueden sintetizar de una manera tal como que se conjugan a otra molécula, tal como un péptido (por ejemplo, para apuntar a los receptores de las células huésped in vivo), o un agente facilitador del transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553–6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648–652; publicación de PCT n.º WO 88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación de PCT n.º WO 89/10134, publicada el 25 de abril de 1988), agentes de escisión desencadenada por hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958–976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539–549). Para este fin, las moléculas de ácido nucleico se pueden conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de reticulación desencadenada por hibridación, agente de transporte, agente de escisión desencadenado por hibridación, etc.
Varias otras modificaciones bien conocidas de las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir como medio de aumentar la estabilidad intracelular y la semivida (véase también anteriormente para oligonucleótidos). Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula. En algunas circunstancias en las que se desea una mayor estabilidad, pueden ser preferentes los ácidos nucleicos que tienen enlaces internucleosídicos modificados, tales como 2'-O-metilación. Los ácidos nucleicos que contienen enlaces internucleosídicos modificados pueden sintetizarse utilizando reactivos y procedimientos que son bien conocidos en la técnica (véase, Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90: 543–584; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335 y las referencias citadas en el mismo).
Cuando se producen sintéticamente, las RTM sintéticas de la presente invención se modifican preferiblemente de tal manera que aumentan su estabilidad en las células. Dado que las moléculas de ARN son sensibles a la escisión por ribonucleasas celulares, puede ser preferible utilizar como inhibidor competitivo un oligonucleótido (o combinación de oligonucleótidos) modificado químicamente que imita la acción de la secuencia de unión a ARN, pero es menos sensible a la escisión por nucleasas. Además, las RTM sintéticas pueden producirse como moléculas circulares resistentes a nucleasas con estabilidad mejorada para evitar la degradación por las nucleasas (Puttaraju et al., 1995, Nucleic Acids Symposium Series No. 33: 49–51; Puttaraju et al., 1993, Nucleic Acid Research 21: 4253–4258). Otras modificaciones también pueden ser necesarias, por ejemplo para potenciar la unión, para mejorar la captación celular, para mejorar la farmacología o la farmacocinética o para mejorar otras características farmacéuticamente deseables.
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Las modificaciones, que pueden realizarse en la estructura de las RTM sintéticas, incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de la estructura principal, tales como el uso de (i) fosforotioatos (X o Y o W o Z = S o cualquier combinación de dos o más con el resto como O). Por ejemplo, Y = S (Stein, C. A., et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16:3209–3221), X = S (Cosstick, R., et al., 1989, Tetrahedron Letters, 30, 4693–4696), Y y Z = S (Brill, W. K.–D., et al., 1989, J. Amer. Chem. Soc., 111: 2321–2322); (ii) metilfosfonatos (por ejemplo, Z = metilo (Miller, P. S., et al., 1980, J. Biol. Chem., 255: 9659–9665); (iii) fosforamidatos (Z = N–(alquil)2 por ejemplo, metilo alquilo, etilo, butilo) (Z = morfolina o piperazina) (Agrawal, S., et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079–7083) (X o W = NH) (Mag, M., et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16:3525–3543); (iv) fosfotriésteres (Z = O–alquilo, por ejemplo metilo, etilo, etc) (Miller, P. S., et al., 1982, Biochemistry, 21: 5468–5474); y (v) enlaces sin fósforo (por ejemplo, carbamato, acetamidato, acetato) (Gait, M. J., et al., 1974, J. Chem. Soc. Perkin I, 1684–1686; Gait, M. J., et al., 1979, J. Chem. Soc. Perkin I, 1389–1394).
Además, las modificaciones de azúcar se pueden incorporar en las RTM de la invención. Tales modificaciones incluyen el uso de: (i) 2'-ribonucleósidos (R=H); (ii) nucleósidos 2'–O–metilados (R=OMe) (Sproat, B. S., et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17:3373–3386); y (iii) 2'–fluoro–2'–riboxinucleósidos (R=F) (Krug, A., et al., 1989, Nucleosides and Nucleotides, 8: 1473–1483).
Además, las modificaciones de bases que pueden realizarse en las RTM, incluyendo, pero sin limitaciones, el uso de: (i) derivados de pirimidina sustituidos en la posición 5 (por ejemplo, metilo, bromo, flúor, etc.) o sustitución de un grupo carbonilo mediante un grupo amino (Piccirilli, J. A., et al., 1990, Nature, 343:33–37); (ii) derivados de purina que carecen de átomos de nitrógeno específicos (por ejemplo, 7–deaza adenina, hipoxantina) o funcionalizados en la posición 8 (por ejemplo, 8-azido adenina, 8-bromo adenina) (para una revisión véase Jones, A. S., 1979, Int. J. Biolog. Macromolecules, 1: 194–207).
Además, las RTM pueden unirse covalentemente a grupos funcionales reactivos, tales como: (i) psoralenos (Miller,
P. S., et al., 1988, Nucleic Acids Res., Special Pub. No. 20, 113–114), fenantrolinas (Sun, J–S., et al., 1988, Biochemistry, 27: 6039–6045), mostazas (Vlassov, V. V., et al, 1988, Gene, 72:313–322) (agentes de reticulación irreversible con o sin la necesidad de correactivos); (ii) acridina (agentes intercalantes) (Helene, C., et al., 1985, Biochimie, 67: 777–783); (iii) derivados de tiol (formación de disulfuro reversible con proteínas) (Connolly, B. A., y Newman, P. C., 1989, Nucleic Acids Res., 17: 4957–4974); (iv) aldehídos (formación de base de Schiff); (v) grupos azido, bromo (reticulación UV); o (vi) elipticinas (reticulación fotolítica) (Perrouault, L., et al., 1990, Nature, 344: 358– 360).
En una realización de la invención, se pueden usar miméticos de oligonucleótidos en los que el azúcar y el enlace internucleosídico, es decir, la estructura principal de las unidades de nucleótidos, se sustituyen con grupos nuevos. Por ejemplo, uno de tales miméticos de oligonucleótidos que se ha demostrado que se unen con una mayor afinidad al ADN y al ARN que los oligonucleótidos naturales se conoce como ácido nucleico peptídico (PNA) (para una revisión, véase Uhlmann, E. 1998, Biol. Chem. 379: 1045–52). Por lo tanto, el PNA se puede incorporar en RTM sintéticas para aumentar su estabilidad y/o la afinidad de unión por el pre-ARNm diana.
En otra realización de la invención, las RTM sintéticas pueden unirse covalentemente a grupos lipófilos u otros reactivos capaces de mejorar la absorción por las células. Por ejemplo, las moléculas de RTM pueden unirse covalentemente a: (i) colesterol (Letsinger, R. L., et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553–6556); (ii) poliaminas (Lemaitre, M., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84: 648–652); otros polímeros solubles (por ejemplo, polietilenglicol) para mejorar la eficiencia con la que las RTM se liberan en una célula. Además, las combinaciones de las modificaciones identificadas anteriormente se pueden utilizar para aumentar la estabilidad y la liberación de las RTM en la célula diana. Las RTM de la invención se pueden utilizar en los procedimientos diseñados para producir un nuevo ARN quimérico en una célula diana.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante, que comprende una RTM de acuerdo con la presente invención como anteriormente. Un vector en el sentido de la presente invención es un ácido nucleico que es capaz de ser introducido o de introducir ácido nucleico como está comprendido en una célula. Se prefiere que las RTM codificadas por el ácido nucleico introducido se expresen dentro de la célula después de la introducción del vector. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión eucariota, preferiblemente un vector que comprende secuencias derivadas de virus. Más preferido es un vector de la presente invención, en el que dicho vector comprende además células de la piel y, preferentemente, elementos reguladores específicos de queratinocitos con el fin de dirigir la expresión del transgén.
Los vectores de expresión adecuados para la expresión in vitro o in vivo se pueden encontrar en la literatura. El experto en la técnica también puede modificar fácilmente estos vectores con el fin de aplicarlos en los procedimientos de la presente invención. Los vectores de expresión usualmente contienen todos los elementos genéticos que son necesarios para la producción de una molécula de RTM específica. En algunas realizaciones de la presente invención, los vectores de expresión según la presente invención pueden tener la forma de un "transgén", es decir, un elemento de expresión en, por ejemplo, un vector adecuado que está diseñado para una expresión y, particularmente, una expresión inducible y/o controlable in vivo. En consecuencia, el transgén comprende ácidos nucleicos de la presente invención junto con ciertos elementos de control genético para la expresión como se trata en el presente documento.
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También se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica para introducir el ácido nucleico que codifica las RTM en las células de la piel, tales como queratinocitos, fibroblastos o células endoteliales, como ya se ha descrito también anteriormente. Un procedimiento es la microinyección, en la que el ADN se inyecta directamente en el citoplasma de las células a través de agujas de cristal finas. Como alternativa, el ADN se puede incubar con un polímero de hidrato de carbono inerte (dextrano) al que se ha acoplado un grupo químico cargado positivamente (DEAE, para dietilaminoetilo). El ADN se pega al DEAE-dextrano a través de sus grupos fosfato cargados negativamente. Estas partículas grandes que contienen ADN se pegan a su vez a las superficies de las células, que se piensa que las captan mediante un proceso conocido como endocitosis. En otro procedimiento, las células captan con eficiencia ADN en forma de un precipitado con fosfato cálcico. En la electroporación, las células se introducen en una solución que contiene ADN y se someten a un breve pulso eléctrico que hace que se abran orificios transitorios en sus membranas. El ADN entra en el citoplasma a través de los agujeros, sortea las vesículas endocitóticas a través de las cuales pasar en los procedimientos de DEAE-dextrano y de fosfato cálcico. El ADN también se puede incorporar en vesículas lipídicas artificiales, liposomas, que se fusionan con la membrana celular y liberan sus contenidos directamente en el citoplasma. En un abordaje incluso más directo, el ADN se absorbe en la superficie de microproyectiles de tungsteno y son disparados en las células con un dispositivo similar a una pistola.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una preparación farmacéutica, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y la molécula de RTM de acuerdo con la presente invención, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente invención o la célula de la piel recombinante de acuerdo con la presente invención. Por tanto, otro aspecto más de la presente invención se refiere a una molécula de RTM de acuerdo con la presente invención, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente invención, la célula de la piel recombinante de acuerdo con la presente invención o la preparación farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso como medicamento.
En una realización específica, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que está en la lista de la farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “vehículo” refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la sustancia sintética. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.
En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas se administran: (1) en enfermedades o trastornos que implican una ausencia o disminución (respecto a lo normal o deseado) del nivel de una proteína endógena o función, por ejemplo, en huéspedes en los que falta la proteína, es genéticamente defectuosa, biológicamente inactiva o poco activa, o de expresión baja; o (2) en enfermedades o trastornos en los que, in vitro o in vivo, los ensayos indican la utilidad de las RTM sintéticas que inhiben la función de una proteína en particular. La actividad de la proteína codificada por el ARNm quimérico resultante de la reacción de corte y empalme en trans sintética mediada por RTM sintética se puede detectar fácilmente, por ejemplo, mediante la obtención de una muestra de tejido del huésped (por ejemplo, de tejido de biopsia) y analizándola in vitro para determinar los niveles de ARNm o proteicos, la estructura y/o actividad del ARNm quimérico expresado. Por tanto, se pueden usar muchos procedimientos estándar en la técnica, incluyendo, pero sin limitaciones, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína codificada por el ARNm quimérico (por ejemplo, transferencia Western, inmunoprecipitación seguida de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico, inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la formación de expresión de ARNm quimérico detectando y/o visualizando la presencia de ARNm quimérico (por ejemplo, ensayos Northern, transferencias de puntos, hibridación in situ y PCR con transcriptasa inversa, etc.), etc. Como alternativa, se puede llevar a cabo la visualización directa de un gen indicador codificado por la RTM sintética o asociado con una RTM.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una RTM sintética o un ácido nucleico que codifica unA RTM sintética, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en la zona que necesita el tratamiento. Esto se puede conseguir mediante, por ejemplo y sin limitaciones, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, o por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas sialásticas
o fibras. Otros sistemas de administración de fármacos de liberación de control, tales como nanopartículas, matrices tales como polímeros de liberación controlada, hidrogeles La RTM o la RTM sintética se administrarán en cantidades que son eficaces para producir el efecto deseado en la célula diana. Las dosis eficaces de las RTM sintéticas se pueden determinar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica que abordan parámetros tales como la semivida biológica, la biodisponibilidad y la toxicidad. La cantidad de la composición de la invención que será efectiva dependerá de la naturaleza de la enfermedad o trastorno que se está tratando y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse, opcionalmente, para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos.
Se divulga un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención, opcionalmente asociados con dicho o dichos recipientes puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, en el que la nota refleja la aprobación por la agencia de la
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La figura 2 muestra una visión general esquemática de los tres tipos posibles de RTM en un ARN con 24 exones, 1) RTM de corte y empalme en trans en 5’ que incluyen un sitio de corte y empalme en 5’. Después del corte y empalme en trans, la RTM en 5’ habrá cambiado la región 5' del ARNm diana; 2) las RTM en 3’ que incluyen un sitio de corte y empalme en 3’ que se utiliza para el corte y empalme en trans y sustituir la región 3 'del ARNm diana; y 3) las RTM de corte y empalme doble, que llevan uno o 2 dominios de unión junto con un sitio de corte y empalme en 3’ y en 5’. Después del corte y empalme en trans, esta RTM sustituiría uno o más exones internos en el ARNm diana procesado.
La figura 3 muestra la representación esquemática del corte y empalme en trans en 3’. SMaRT crea un ARNm quimérico a través de una reacción de corte y empalme en trans mediada por el espliceosoma entre el sitio de corte y empalme en 5' de un pre-ARNm diana endógeno y el sitio de corte y empalme en 3’ de la molécula de pre-ARN de corte y empalme en trans liberada exógenamente. La molécula de RTM se une a través de apareamiento de bases específico a un intrón del pre-ARNm diana endógeno y sustituye toda la secuencia en 3' del gen endógeno aguas arriba del intrón diana con la secuencia de tipo silvestre de la RTM.
La figura 4 muestra una molécula de RTM para sistema modelo de corte y empalme doble en trans de LacZ tal como se utiliza en los Ejemplos siguientes. Secuencia del dominio de unión:
CCGTCCCCACCCACCTGCACAGCTCTTCCCTTCCTCTCCTCCAG (SEQ ID No. 3); secuencia espaciadora: GAGAACATTATTATAGCGTTGCTCGAG (SEQ ID No. 4); secuencia del punto de ramificación: TACTAAC; tracto de polipirimidina: TCTTCTTTTTTTTCTG (SEQ ID No. 5); sitio aceptor de corte y empalme en 3': CAG.
La figura 5 muestra la construcción de PTM-6 para el corte y empalme en trans endógeno del gen COL7A1 como describe en los ejemplos siguientes. Secuencia del dominio de unión: (secuencia marcada en negrita:
complementaria al exón 65 de COL7A1)
Secuencia espaciadora: AACGAGAACATTATTATAGCGTTGCTCGAG (SEQ ID No. 17); secuencia del punto de ramificación: TACTAAC; tracto de polipirimidina: TCTTCTTTTTTTTCTG (SEQ ID No. 18); sitio aceptor de corte y empalme en 3': CAG
La figura 6 muestra una imagen de microscopia óptica de células HEK 293FT transfectadas teñidas con ß– galactosidasa. Aumento: 100x; A) La transfección de células HEK 293FT con el vector diana solo no produjo ninguna actividad de ß–gal. B) El corte y empalme en trans preciso entre el pre-ARNm diana y el ARN de RTM produjo ß-gal funcional en las células 293FT epiteliales cotransfectadas. El 10 % de las células cotransfectadas mostró restauración de la expresión de ß-gal.
La Figura 7 muestra un análisis de microscopia de células HEK 293FT cotransfectadas. Aumento: 200x. A) El corte y empalme en trans específico entre GFP-diana y GFP-PTM-1 en las células cotransfectadas conduce a un exón de GFP completo y, por lo tanto, las células producen fluorescencia verde. B) El indicador de fluorescencia roja en la RTM sirve como control de la transfección e indica corte y empalme en trans no específico, corte y empalme en cis o expresión directa de RTM no sometida a corte y empalme.
La figura 8 muestra la tinción de inmunofluorescencia de equivalentes de piel organotípicos con un anticuerpo anti-colágeno de tipo VII. El análisis se realizó en un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axioscop. Aumento: 100x, tiempo de exposición: 10 segundos. A) La tinción de inmunofluorescencia de los EP realizada con queratinocitos EADR RO inmortalizados no tratados y fibroblastos EADR muestra que el cultivo organotípico no era casi inmunorreactivo en comparación con el control positivo. B) En los EP hechos con queratinocitos y fibroblastos de tipo silvestre, la unión dermo-epidérmica (UDE) es fuertemente reactiva, lo que indica depósito de colágeno de tipo VII. C) La tinción de colágeno de tipo VII en los EP realizados con células clonogénicas con el n.º 1 de los queratinocitos primarios RO revertidas dio lugar a una señal muy verde, que indica depósito de colágeno de tipo VII en la UDE. La intensidad de la tinción es comparable a la observada en los EP realizados con queratinocitos de tipo silvestre.
La figura 9 muestra el diagrama esquemático de la RTM en 5’ y la molécula diana en el sistema modelo fluorescente tal como se utiliza en los ejemplos. Los acontecimientos de corte y empalme en trans inducidos por RTM conducen a la expresión de una proteína de fusión dsRED–acGFP en la RTM y las células HEK293 transfectadas con la molécula diana.
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