ES2578259T3

ES2578259T3 - Obtención de células Tr1 específicas de antígenos de los alimentos o de autoantígenos a partir de una población de leucocitos o PBMC

Info

Publication number: ES2578259T3
Application number: ES06808973.9T
Authority: ES
Inventors: Françoise Cottrez; Hervé GROUX; Valérie BRUN; Arnaud Foussat
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; TxCell SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sangamo Therapeutics SA
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2006-07-03
Publication date: 2016-07-22
Anticipated expiration: 2026-07-03
Also published as: AU2006271320B2; ES2368152T3; SI1739166T1; JP2008544760A; EP1739166A1; US20090075372A1; US7977093B2; PL1739166T3; DK1899459T3; JP2013240334A; PT1899459T; WO2007010406A3; PL1899459T3; PT1739166E; EP1899459B1; SI1899459T1; HUE029143T2; AU2006271320A1; DK1739166T3; CY1112351T1

Abstract

Un método in vitro para la obtención de una población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos de una población de leucocitos humanos o de una población de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), consistiendo dicho método de: 1) estimular la población de PBMC o leucocitos humanos con el antígeno de alimentos o el autoantígeno, 2) recuperar la población de células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos de la población de células estimuladas, siempre que dicho método no comprenda estimular linfocitos de sangre periférica humana con ovalbúmina.

Description

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El experto en la técnica con amplia experiencia en cultivo celular conoce las condiciones específicas que se han de utilizar, en particular las temperaturas de cultivo óptimas T1 y T2 de cada población de células alimentadoras y de la población de células Tr1 específicas de antígenos. El medio de cultivo Mf puede ser de cualquier clase, siempre que sea apropiado para dicho tipo de célula alimentadora, y el experto en la técnica lo seleccionará fácilmente (medio de Schneider,...).

Se debe considerar que la etapa (b) de poner en contacto las células alimentadoras con la población de células Tr1 específicas de antígenos, y la etapa (c) de cultivar la mezcla a la temperatura T2, usualmente son etapas simultáneas: antes de ponerse en contacto, las células alimentadoras con la población de células Tr1 específicas de antígenos se cultivan por separado, respectivamente una a temperatura T1 en el medio de cultivo Mf y la otra a temperatura T2 en el medio de cultivo Mp. Luego, las células alimentadoras “solas”, o el medio de cultivo Mf que contiene las células alimentadoras, se pone/ponen en contacto con la población de células Tr1 específicas de antígenos que está presente en su medio de cultivo Mp y que está siendo cultivada a temperatura T2. Por consiguiente, las células alimentadoras pasan inmediatamente de la temperatura T1 a la temperatura T2 y dejan de proliferar, a diferencia de la población de células Tr1 específicas de antígenos, que se expande gracias al grupo de factores que son expresados por las células alimentadoras.

Es posible mantener durante un largo tiempo el crecimiento exponencial in vitro de la población de células Tr1 específicas de antígenos, como por lo menos dos o tres meses, volviendo a contactar las células alimentadoras regularmente, por ejemplo cada semana, con dicha población de células Tr1 específicas de antígenos.

Más ventajosamente, las células alimentadoras mueren durante la etapa (c) dado que la temperatura T2 ya no es apropiada para el cultivo de células alimentadoras. Más ventajosamente, los fragmentos de membrana celular de las células alimentadoras que resultan de la muerte de dichas células se eliminan en la etapa (d).

Después de un periodo de tiempo suficiente de cultivar las células Tr1 específicas de antígenos en la etapa (c), preferiblemente varias horas, el medio de cultivo obtenido se compone de una mezcla de la población de células Tr1 específicas de antígenos, células alimentadoras viables y opcionalmente fragmentos de membrana celular de las células alimentadoras, y la población expandida de células Tr1 específicas de antígenos debe recuperarse en la etapa (d). Dicha recuperación puede realizarse separando la población de células Tr1 específicas de antígenos de las células alimentadoras viables y opcionalmente dichos fragmentos de membrana celular, usando cualquier métodos de separación apropiado conocido por el experto en la técnica, como por ejemplo citometría de flujo, empleando un ligando marcado específico capaz de unirse en la superficie de las células alimentadoras o una proteína de superficie celular de la población de células Tr1 específicas de antígenos. Se pueden emplear también otros métodos, como métodos de lavado y/o centrifugación tales como centrifugación en gradiente de densidad, usando medios de separación como Ficoll®, siendo dicha centrifugación un método apropiado para eliminar fragmentos de membrana celular.

Se ha de destacar que la eliminación de los fragmentos de membrana celular de las células alimentadoras no es obligatoria pero se recomienda, más aun cuando la población expandida de células Tr1 específicas de antígenos tiene como fin administrarse a mamíferos. De lo contrario, existe el riesgo de que se contamine dicha población expandida de células Tr1 específicas de antígenos.

Ventajosamente, el grupo de factores comprende factores anclados a la membrana celular de las células alimentadoras y factores segregados por dichas células alimentadoras.

Cuando las células alimentadoras se cultivan en la etapa (a), expresan algunos factores del grupo en su superficie de membrana celular y algunos otros factores en el medio de cultivo Mf. En la etapa (b) de contactar, los “factores de membrana” están ya anclados a la membrana de la célula alimentadora, pero los “factores segregados” pueden eliminarse si las células alimentadoras son previamente depuradas de su medio de cultivo Mf. De todas maneras, tanto los “factores de membrana” como los “factores segregados” se expresan mediante las células alimentadoras en la etapa (c), incluso si las células alimentadoras no proliferan más, y hasta la muerte de dichas células alimentadoras. Incluso es posible que los “factores de membrana” anclados a los fragmentos de membrana celular de las células alimentadoras muertas cumplan incluso una función en la producción de la población de células Tr1 específicas de antígenos.

La población de células Tr1 específicas de antígenos que se expande tiene proteínas de superficie celular implicadas en las señales celulares permitiendo su expansión. Dichas proteínas de superficie celular se activan gracias a ligandos específicos, o factores, que se proveen en la presente invención por las células alimentadoras: las células alimentadoras expresan el grupo de factores que permiten la expansión de la población de células Tr1 específicas de antígenos. La persona experta en la técnica conoce qué factores específicos deben ser expresados por las células alimentadoras, de modo tal que estos factores interactúan con una proteína de superficie celular de la población de células Tr1 específicas de antígenos.

Incluso más preferiblemente, las células alimentadoras son células recombinantes y contienen ácidos nucleicos heterólogos que codifican los factores de dicho grupo.

Las expresiones “células recombinante” o “célula alimentadora recombinante” se refieren a la introducción en dichas

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membrana celular de las células alimentadoras, por ejemplo por métodos de lavado y/o centrifugación en gradiente de densidad, como se describió anteriormente.

Por lo tanto, en una realización preferida, la población de células Tr1 específicas de antígenos así expandida se recupera en la etapa (d) después de haber cultivado la población de células Tr1 específicas de antígenos en la etapa

(c) durante por lo menos 12 horas, ventajosamente 24 horas.

Por porcentaje de identidad entre dos ácidos nucleicos (o secuencias de ácidos nucleicos) o dos secuencias proteicas en la presente invención, se entiende un porcentaje de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después de la mejor alineación; este porcentaje es puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente y en toda su longitud. La mejor alineación o alineación óptima es la alineación correspondiente al porcentaje más alto de identidad entre las dos secuencias a comparar, que se calcula como se define a continuación. Las comparaciones de secuencias entre dos ácidos nucleicos o dos secuencias proteicas usualmente se realizan comparando estas secuencias después de su alineación óptima, siendo dicha comparación realizada para un segmento o para una “ventana de comparación”, para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencias. Las alineaciones óptimas de secuencias para la comparación se pueden llevar a cabo manualmente o mediante el algoritmo de homología local de

Smith y Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2:482), mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48:443), mediante el método de investigación de similitud de Pearson y Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85:2444), mediante programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias proteicas se determina comparando estas dos secuencias alineadas en un modo óptimo con una “ventana de comparación” en la que la región de la secuencia de ácido nucleico o la secuencia proteica a comparar puede comprender adiciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones para las cuales el nucleótido o el aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la “ventana de comparación” y multiplicando el resultado obtenido por 100, para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

La etapa (b) de expandir la población de células Tr1 específicas de antígenos de acuerdo con la presente invención, usando células alimentadoras, ofrece las siguientes ventajas:

–: el sistema de expansión de células alimentadoras es capaz de mantener el crecimiento exponencial de la población de células Tr1 específicas de antígenos durante por lo menos dos o tres meses in vitro,

–: las células alimentadoras carecen de moléculas MHC de clase I y II para evitar una respuesta alogénica,

–: las células alimentadoras están libres de micoplasma,

–: las células alimentadoras son capaces de crecer bien usando medio libre de suero,

–: no se requiere que las células alimentadoras sean irradiadas,

–: las células alimentadoras no permiten la expansión de virus mamíferos, y

–: la población de células Tr1 específicas de antígenos expandida está muy bien caracterizada para propósitos de inyección.

Otro objeto de la invención es un método in vitro para la obtención de una población de células Tr1 específicas de antígenos de los alimentos o de autoantígenos de una población de leucocitos humanos o una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), dicho método consiste de:

1) estimular la población de leucocitos o PBMC humana con el antígeno de alimentos o auto–antígeno,

2) recuperar la población de células Tr1 específicas de antígenos de los alimentos o de autoantígenos a partir de la población de células estimuladas, y

3) expandir dicha población de células Tr1 específicas de antígenos al poner en contacto dicha población de células Tr1 específicas de antígenos con microesferas CD3+CD28 en la presencia de IL–2 y IL–4.

En una realización, la población de células Tr1 específicas de antígenos de los alimentos o de autoantígenos se obtiene de una población de PBMC. En una realización, la población de leucocitos o PBMC se vuelve a estimular por lo menos una vez con el mismo antígeno después de la etapa (1), en la presencia de interleucina–2 (IL–2) y por lo menos una interleucina seleccionada del grupo que consiste de interleucina– 4 (IL–4) e interleucina–13 (IL–13).

En una realización, el antígeno de alimentos o auto–antígeno es un antígeno recombinante o sintetizado.

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micobacteriana (PPD) como control positivo según se indica. Después de 8 días, las células se analizaron por citofluorometría, y el porcentaje de células divididas se analizó por disminución de la expresión de CFSE. El porcentaje de células CFSEbajo se indica en cada cuadrante. Las células T CFSEbajo se purificaron y re–estimularon con anti–CD3 y anti–CD28 mAb, y después de 48 horas, los sobrenadantes se analizaron por ELISA para medir las cantidades de las citocinas indicadas.

Figura 6: Las células Tr1 específicas de antígenos de alimentos no proliferaron en respuesta a solo IL–2, pero proliferaron vigorosamente en respuesta a IL–2 e IL–4.

Se marcaron células T CD4+ con CFSE, se estimularon con los antígenos indicados y se purificaron como en la Figura 3. Las células purificadas luego se expandieron en presencia de IL–2 sola (1 µg/mL) o IL–2 e IL–4 (1 µ/mL y 500 ng/mL respectivamente). El número de células bajo condiciones diferentes se midió luego y se trazó contra el número de días después del inicio. Las células T de antígeno de memoria proliferaron en respuesta a IL–2 y la combinación de IL–2 e IL–4, mientras que las células Tr1 específicas de antígenos de alimentos proliferaron solamente contra la combinación de las citocinas IL–2 e IL–4.

Figura 7: las células Tr1 específicas de antígenos de alimentos IL–2 e IL–4 expandidas mantienen su perfil de citocinas después de la expansión

La población de células T específicas de antígenos diferente según lo obtenido en la Figura 5 se estimuló con CD3 y CD28 mAb, y se determinó su perfil de citocina por ELISA en sobrenadantes recogidos 48 horas después de la estimulación. Las células T específicas de PPD y TT mantuvieron su perfil de citocina Th1 después de la expansión con IL–2 sola, mientras que la adición de IL–4 indujo la secreción de IL–4 en estas células, según lo esperado. En contraste, las células Tr1 específicas de antígenos de alimentos mantuvieron su perfil de citocinas incluso después de la expansión en presencia de IL–2 e IL–4.

Figura 8: Análisis de expresión de la proteína humana en la estirpe celular S2.

Análisis citométrico de flujo de dos colores de cadenas pesada y ligera de OKT3 y expresión de CD80 y CD58 en células parentales (S2) o células de la fábrica de células (cell factory o CF).

Figura 9: Dibujo de CF modificada que interactúa con una célula CD4 +Tr1

Se transfectaron células S2 con anti–CD3 mAb unido a membrana para unir el complejo TCR/CD3, CD80 y CD58 con el fin de añadir algunas señales co–estimuladoras a través de la interacción con moléculas CD28 y CD2 respectivamente, e IL–2 y IL–4 para inducir el crecimiento celular.

Figura 10: Proliferación de células T inducida por la estirpe celular CF.

La proliferación de PBL policlonales, estirpes celulares Tr1 y células T CD4+ (LI y L2), o clones Tr1 (C1 y C2) estimulados con la fábrica de células se midió con incorporación de [3H]timidina entre 3 y 4 cultivos. Se estimularon células T con células CF según se indica, en ausencia de citocinas exógenas. A las 72 horas, las células se pulsaron con [3H] timidina y se incubaron durante 18 horas más, antes de cosecharse. Los valores de los recuentos por minuto se muestran como el error estándar de la media de cultivos triplicados.

Figura 11: Crecimiento a largo plazo de células Tr1 humanas policlonales, primarias estimuladas con fábrica de células.

Se estimularon células Tr1 con microesferas CD3/28 más IL–2 e IL–4 exógenas, células CF' que expresaban OKT3, CD80 y CD58 pero no IL–2 e IL–4 en presencia de IL–2 e IL–4 exógenas, o con el sistema de fábrica de células completo, sin ninguna adición exógena. Las células T se estimularon con células CF en los días 0, 10 y 20 de cultivo.

Figura 12: Pureza de células T después del co–cultivo con la estirpe celular CF.

La pureza de las células T y después de la estimulación con la estirpe celular CF se evalúo con tinción para expresión de CD3, CD4 durante los primeros siete días de cultivo. No se usó selección del tamaño/sedimento celular en este experimento, como para representar todas las células del cultivo. Las células viables se indican por selección de yoduro de propidio para excluir las células muertas. Los resultados son representativos de >10 experimentos diferentes, cada uno con un donante distinto.

Figura 13: Destino de la estirpe celular CF después del co–cultivo con células T

El destino de las células estimuladoras CF se evalúo tiñendo para expresión de CD4 y OKT3H durante los primeros siete días de cultivo. No se usó selección del tamaño/sedimento celular en este experimento como para representar todas las células del cultivo. Las células viables se indican por selección de yoduro de propidio para excluir las células muertas. Los resultados son representativos de >10 experimentos diferentes, cada uno con un donante distinto.

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Figura 14: Representación esquemática del protocolo experimental utilizado.

Figura 15: Aislamiento de clones Tr1 específicos de OVA.

Se estimularon PBL teñidos con CFSE con OVA, y se tiñeron con CD4 CD49b y CD18. Se seleccionar células CD4+CD49b+CD18brillante, y las células CFSE se clasificaron. Las células clasificadas se clonaron para generar los clones 1 y 2, la población en volumen se estimuló con OVA y se tiñó con IL–10 y IFN–γ, revelando un fenotipo Tr1.

Figura 16: Análisis de proliferación a largo plazo de clones Tr1

Se estimularon luego dos clones con la fábrica de células irradiadas. Los números de células totales se representan en un trazado semi–logarítmico del número de células frente a los días en cultivo.

Figura 17: Perfil de citocina de los clones T 1 y 2 específicos de OVA después de la expansión en la fábrica de células durante 70 días.

Se midieron las citocinas en los sobrenadantes de los clones estimulados con OVA y monocitos irradiados autólogos. La supresión específica de antígenos también se examinó por un ensayo trans–pozos. Los PBL autólogos se estimularon con anti–CD3 mAb en el pozo inferior, ninguna célula, las células T CD4 control y los dos clones se añadieron a la cesta superior y se estimularon con anti–CD3 y monocitos irradiados autólogos para células CD4 u OVA y monocitos irradiados autólogos para los dos clones diferentes Tr1. Todo el protocolo es representativo de diez experimentos, cada uno de distintos donantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Obtención in vitro de una población de células tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos de una población de PBMC por estimulación con el antígeno de alimentos o el autoantígeno

1.1 Material y métodos

Purificación celular y citometría de flujo

Se recuperaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana de capas leucocitarias de donantes sanos después de la centrifugación en gradiente de ficoll. Los linfocitos T CD4+ se purificaron de la PBMC después de la eliminación de células CD11b+ (OKM1–95), CD20+ (1F5C9) y CD8+ (G42–8) por selección negativa usando Dynabeads recubiertas con anti–ratón de cabra (Dynal, Oslo, Noruega). Los monocitos se purificaron después del cultivo de PBMC 1 hora a 37°C en RPMI enriquecido con 20% FCS. Más de 90% de las células adherentes recuperadas fueron monocitos CD14+. Se separaron los linfocitos T CD4+ en células T CD49b+CD18brillante o CD49b+CD45RO+ después de teñir las células con anticuerpos fluorescentes y clasificar en FACS vantage SE, Beckton Dickinson, Le pont de Claix, Francia). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la citometría de flujo: FITC, APC o CD4 antihumano de ratón marcado con PC5 (RPA–T4), CD3 antihumano de ratón marcado con PC5 (UCHT1), CD49b antihumano de ratón marcado con PE (12F1–H6), CD14 antihumano de ratón marcado con FITC (M5–E2), CD18 antihumano de ratón marcado con PE o PC5 (6.7), CD25 antihumano de ratón marcado con PE (M– A251), HLA–DR antihumano de ratón marcado con PE (G46–6), CD69 antihumano de ratón marcado con PE (FN50), CD45RO antihumano marcado con FITC (UCHL–1). Todos los anticuerpos se adquirieron de BD– Pharmingen (Le Pont de Claix, Francia).

Cultivo celular

Para detección de linfocitos T específicos de antígeno CD4+, las PBMC (10 millones de células por ml) se tiñeron con CFSE 0.2 µM o PKH26 2.5 µM (Molecular Probes, Leiden, Holanda) durante 5 minutos a 37°C en PBS 1X. Después de dos lavados en PBS 1X, las poblaciones celulares se incubaron a 2 millones/mL en RPMI enriquecido con suero humano al 5% AB en presencia o ausencia de 200 µg/mL de ovalbúmina de pollo, 200 µg/mL de caseína bovina, 200 µg/mL de insulina humana (Sigma, L'Isle d'Abeau, Francia), 50 µg/mL de toxoide tetánico (Lederie, Pearl River, Nueva York) y 2µg/mL de derivado de proteína purificado (PPD) de tuberculosis micobacteriana (Staten serum Institute, Dinamarca) o 50 µg/mL de MBP (Sigma, L'Isle d'Abeau, Francia). Después de 9 días de cultivo, las células se tiñeron con CD4 antihumano de ratón marcado con PC5 y se analizaron por citometría de flujo. Las células T CD49b+CD18brillante o CD49b+CD45RO+ también se clasificaron, se tiñeron con CFSE 0,2 µM o PKH26 2,5 µM y se cultivaron a 2 millones/mL en presencia de 4,105 monocitos autólogos y en presencia de antígenos.

Clasificación y expansión de células específicas de antígenos

Después de 10 días de cultivo, las células T específicas de antígenos CD4+CFSElo o CD4+PKH26lo se clasificaron en un FACS vantage SE (Beckton Dickinson) y se expandieron con PBMC irradiadas autólogas en presencia de antígenos, en medio X–vivo 15 (Biowhittaker, Emerainville, Francia) enriquecido con 10 ng/mL de IL4 y 5 ng/mL de IL2.

Detección de citocinas

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La producción de citocinas se detectó por ELISA, que se realizó en sobrenadantes de poblaciones celulares humanas (2 millones/mL) cultivadas 48 horas en RPMI enriquecido con 10% FCS (Life Technologies, Cergy Pontoise, Francia), y se estimuló con 10 µg/mL de anti–CD3 recubierto (UCHT1) y 1 µg/mL de anti–CD28 soluble (CD28.2). Los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos de captura anti–IL10 (JES3–9D7), anti–IL4 (8D4), anti–IL2 (17H12), anti–IL5 (39D10) y anti–IFNγ (A35), y anticuerpos de detección anti –IL10 (JES3–12D8), anti–IL4 (MP4– 25D2), anti–IL2 (B33–2), anti–IL5 (5A10) y anti–IFNγ (B27) marcados con NEP seguidos de adición de anticuerpo anti–NIP marcado con peroxidasa y ABTS. IL10, IL4 y IFNγ fueron de R&D systems (Minneapolis, MN), IL2 fue de Chiron corp (Emmeryville,CA). Todos los anticuerpos fueron de BD pharmingen.

Medición de proliferación

Para evaluar la proliferación, las poblaciones de células T (1 millón de células por ml) se estimularon in vitro con PBMC irradiadas autólogas y antígenos específicos en RPMI enriquecido con 10% FCS a 37°C en presencia de citocinas indicadas. La proliferación de células T se evaluó por la numeración de células vivas.

Métodos para aislar células Tr1 específicas de antígenos

Los inventores diseñaron métodos para aislar poblaciones y clones de células Tr1 específicas de antígenos.

El primer método depende de la incorporación de CFSE o cualquier tinte similar (PHK). Las células se marcan con CFSE y se estimulan con antígeno de alimento (intervalo de 0,1 µg/mL a 5 mg/mL), después de 9 o 10 días, las células se clasifican por citofluorometría y se mantienen con microesferas CD3+CD28 e IL–2+IL–4. Con el fin de eliminar cualquier otra célula que podría no haber proliferado significativamente bajo estas condiciones de cultivo, las células podrían también clonarse a una célula por pozo, y los diferentes clones analizarse para especificidad y secreción de citocinas.

El segundo método depende de la expresión de superficie celular de los marcadores de activación o proliferación. Las PBMC se estimulan con antígenos de alimentos o autoantígenos, y las células estimuladas con antígenos se purifican con anticuerpos dirigidos contra anti–CD69, anti–CD25 o cualquier marcador de activación o proliferación. Las células purificadas se mantienen luego con estímulos CD3+CD28 e IL–2+ IL–4. Alternativamente, las células pueden mantenerse con células alimentadoras y estímulos CD3/CD28, en presencia de IL–2 e IL–4. Las células purificadas podrían también clonarse a una célula por pozo, por clasificación FACS o dilución limitante.

El tercer método se basa en el enriquecimiento de la población proliferativa después de la estimulación con antígenos de alimentos o autoantígenos. Las PBMC se estimulan con ovalbúmina (o cualquier otro antígeno de alimento o autoantígeno) y después de una semana, las células se vuelven a estimular con el mismo antígeno en presencia de IL–2 e IL–4. Esa combinación fue óptima, pero podría utilizarse cualquier combinación o periodo de tiempo. La población enriquecida luego se clonó por dilución limitante (pero podría utilizarse cualquier otra técnica de clonación). Los clones luego se multiplicaron por estimulación con células estimuladoras anti–CD3, CD28, e IL–2 e IL–4. Los clones proliferativos se analizaron luego para especificidad y secreción de citocinas, usando ovalbúmina presentada por PBMC irradiadas autólogas.

1.2 Resultados

Las células Tr1 CD4+CD3+CD49b+CD18brllante proliferan en respuesta a antígenos de alimentos y no antígenos de vacunas.

Cuando los inventores purificaron células Tr1 CD4+CD3+CD49b+CD18brillante, observaron que estas células no proliferaban en respuesta a antígenos de memoria como toxoide tetánico de PPD, en contraste con la población recíproca (Fig 1A). También ensayaron la capacidad de las células Tr1 CD4+CD3+CD49b+CD18brillante de proliferar en respuesta a antígenos de alimentos. Como se indicó previamente, se observó solamente una respuesta proliferativa muy mínima sobre el fondo cuando la población de células T CD3+CD4+ total se estimuló con antígenos de alimentos (Ovalbúmina, caseína, proteína de soja o inmunoglobulinas bovinas). No obstante, observaron una

CD4+CD3+CD49b+CD18brillante

respuesta proliferativa vigorosa en las poblaciones de células Tr1 purificadas, mientras que no se observó proliferación en la población de memoria recíproca (Fig 1B).

Por lo tanto, utilizaron una técnica más sensible con incorporación de CFSE, y observaron que las células Tr1 no proliferaban en respuesta a antígenos de memoria, pero exhibían una respuesta proliferativa significativa a antígenos de alimentos, como ovalbúmina, caseína o proteínas de soja. En cambio, la población recíproca de células T CD4+ no demostró ninguna respuesta proliferativa a antígenos de alimentos, sino que proliferó vigorosamente en respuesta a antígenos de memoria (TT y PPD) (Fig 2).

Las células T CD4+CD3+CD49b+CD18brllante específicas de antígenos de alimentos tienen un perfil de citocina Tr1.

Usando la técnica de incorporación de CFSE (Figura 3), los inventores aislaron por FACS, las células proliferativas CFSEbajo y analizaron su perfil de citocina por estímulo policlonal (anti–CD3+CD28 mAbs). Estos experimentos demostraron que las células específicas OVA, Caseína y soja poseen un perfil de citocina Tr1 que segrega altos niveles de IL–10, cierto IFN–γ, cierta IL–5 y ninguna IL–2 e IL–4 como se describió previamente (Groux et al. Nature

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1997). En contraste, las células específicas de TT o PPD exhibieron un fenotipo Tr1 que segrega principalmente IFN–γ, según lo esperado.

Las células Tr1 son también específicas para autoantígenos

Usando la técnica CFSE, los inventores también analizaron la respuesta proliferativa de las diferentes poblaciones de células T CD4+ a autoantígenos como MBP (proteína básica de mielina) o insulina. De modo similar a los antígenos de los alimentos, se observó una respuesta proliferativa mínima o no se observó ninguna respuesta proliferativa en la población CD4+ en volumen (según se reportó) o en la población de memoria CD49b+ (CD45RO+). Sorprendentemente, se observó una respuesta de proliferación vigorosa cuando las células Tr1 CD4+CD3+CD49b+CDl8brillante purificadas se estimularon con insulina o MBP. Asimismo, estas células específicas de insulina o MBP exhibieron un perfil de citocina Tr1 con alta secreción de IL–10 (Fig 4).

Se pueden aislar células Tr1 en pacientes que padecen autoinmunidad o alergia al antígeno ensayado.

Ya que el antígeno de alimentos y el autoantígeno han estado implicados en enfermedades alérgicas o

autoinmunitarias respectivamente, los inventores analizaron la presencia de células T proliferativas en la población CD4+CD3+CD49b+CD18brillante

de células T purificadas de pacientes que padecen MS (con enfermedad autoinmunitaria dirigida contra el componente de mielina como MBP) o pacientes con alergia alimentaria a caseína. Como se muestra en la Figura 5, se observó que, como se esperaba, la estimulación con MBP o caseína induce la proliferación celular en la CD4+CD3+CD45RO+CD49b– purificada, en un paciente que padece esclerosis múltiple o alergia a la caseína, respectivamente. La re–estimulación de las células proliferativas demostró que estas células exhibieron un perfil de citocina Th1 en el caso de las células de un paciente que padece MS estimulada con MBP, y un perfil de citocina Th2 en respuesta a caseína en el caso del paciente alérgico. No obstante, inesperadamente, también observaron una proliferación en la población de células Tr1 CD4+CD3+CD49b+CD18brillante como en un control normal que demostró que las células Tr1 específicas de autoantígenos también podían observarse en pacientes que padecen autoinmunidad o alergia al antígeno ensayado (Fig 5).

Se requiere la combinación de IL–2 e IL–4 para mantener la proliferación de células Tr1 específicas de Ag

Si bien las células Tr1 (células CD4+CD3+CD49b+CD18brillante) proliferaron en respuesta a antígenos de alimentos o autoantígenos, esa proliferación no pudo mantenerse por la adición de IL–2 sola (Fig 6) en contraste con la proliferación de células T específicas de TT o PPD (Fig 6). Sorprendentemente, los inventores hallaron que la adición combinada de IL–2 e IL–4 fue capaz de mantener la respuesta proliferativa de las células Tr1 específicas de antígenos de alimentos o autoantígenos (Fig 7).

Ejemplo 2: expansión de la población obtenida de células TR1 específicas de antígenos usando células alimentadoras

2.1 Protocolo experimental

Anticuerpos marcados

Para clasificación de microesferas:

Microesferas utilizadas:

– « MagCellect Ferrofluid, Estreptavidina » (R&D) « Microesferas anti–rata de oveja » (Dako) Para CD80: CD80 antihumano de ratón biotinilado (B7–1), clon L307.4 (BD Biosciences Pharmingen)

Para OKT3: cadena ligera Ig Kappa anti–ratón de rata purificado, clon 187.1 (BD Biosciences Pharmingen)

Para clasificación FACS y marcadores de control usuales

Para CD80: CD80–PE antihumano de ratón (ficoeritrina) o FITC (isotiocianato de fluoresceína), clon L307.4 (BD Biosciences Pharmingen)

Para CD58: CD58–PE antihumano de ratón o PECy5 (ficoeritrina–cianina 5)

(LFA–3) Clon 1C3 (BD Biosciences Pharmingen)

Para OKT3:

Cadena pesada: IgG2a anti–ratón biotinilado, clon R19–15 + Estreptavidina–FITC o Estreptavidina–PE o Estreptavidina–PECγ5 (BD Biosciences Pharmingen)

Cadena ligera: cadena ligera Ig Kappa anti–ratón de rata, clon 187.1 (BD Biosciences Pharmingen) + FITC–anti–rata de conejo (Dako)

Cebadores de ampliación

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anticuerpo monoclonal hCD80, hCD58 y anti–CD3 (mAb) y CF, es decir, células que expresan anticuerpo monoclonal hCD80, hCD58, hIL–2 hIL–4 y anti–CD3 (mAb) se aislaron por clasificación celular activada por fluorescencia, FACS, usando los anticuerpos anteriormente descritos.. No se usó ningún marcador de selección, y las células establemente transfectadas se seleccionaron por tinción FACS. Las células clasificadas se clonaron, y para cada tanda de transfección y selección, se seleccionó el clon más eficiente para la estimulación de células Tr1.

Preparación de linfocitos T CD4+ y cultivo de células S2

Se obtuvieron linfocitos de sangre periférica nueva por centrifugación de Ficoll hypaque, y se purificaron las células T CD4+ por selección negativa, usando anticuerpo anti–CD8 (Becton Dickinson). Todos los cultivos se mantuvieron en X–vivo sin adición de suero (BioWhittaker, Walkersville, MD). Se añadió IL–2 humana (Chiron Therapeutics, Emeryville, CA) a 20 IU/mL donde correspondía, se usó hIL–4 a 1 µg/mL (para comparar la ventaja biológica obtenida cuando las células alimentadoras expresan las interleucinas con los resultados obtenidos cuando se añaden interleucinas recombinantes al medio de cultivo). Las células S2 se mantuvieron en medio SFM sin suero (Gibco).

Citometría de flujo y clasificación FACS

Las células se tiñeron con anticuerpos a 4°C y se analizaron en un FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA) o se clasificaron con el sistema FACStar.

2.2 Resultados

Construcción de aAPC

Para ensayar la hipótesis de que las células Tr1 tienen requerimientos de co–estimulación diferentes para crecimiento a largo plazo, los inventores diseñaron un sistema basado en células que podrían manipularse genéticamente para expresar diferentes moléculas co–estimuladoras y citocinas además de los estímulos clásicos de CD3/CD28. Eligieron células S2 porque no expresan proteínas HLA humanas que promoverían respuestas alogénicas, y que no podrían contaminarse con virus humanos (Fig. 8). Además, la introducción eventual de células alimentadoras irradiadas en el escenario clínico puede evitarse, ya que estas células que crecen a 27°C se destruyen fácilmente a 37°C y se propagan en medio libre de suero. Los inventores transfectaron y luego clonaron células S2 que expresan CD80 humano, CD58 humano y las dos cadenas de un anti–hCD3 mAb para permitir la estimulación de células Tr1 humanas (CF') (Fig. 8). De modo similar, generaron la estirpe CF (Fig. 8, 9) transfectando células CF' con cADN de IL–4 e IL–2 humanas. Los cultivos se iniciaron añadiendo células CF a células T CD4+ humanas recién preparadas por selección negativa (véase Protocolo experimental).

La estirpe celular CF activa eficientemente las células T CD4+ policlonales humanas y las células Tr1

Se ensayó la capacidad de la fábrica celular para estimular la activación inicial y proliferación de células T CD4+ primarias como también estirpes celulares Tr1 o clones de células Tr1. Las distintas células T purificadas se estimularon con la fábrica de células en una relación 1/1. Los inventores hallaron que el índice inicial de crecimiento de las células T estimuladas con la fábrica de células fue equivalente, según lo juzgado por la incorporación de [3H]timidina (Fig. 10) con una ligera potenciación de respuesta proliferativa de las células Tr1 frente a las otras células T CD4+. Los inventores confirmaron esta observación marcando células T nuevas con carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) y rastreando la división celular durante los primeros cinco días de cultivo (no se muestran los datos). También descubrieron que el sistema basado en células fue más eficiente que las microesferas CD3/28 para la inducción de proliferación y división celular de células T CD4+ (no se muestran los datos). No se observó proliferación cuando la fábrica de células, o las células T CD4+ se incubaron por separado (Fig. 10 y datos no mostrados). Por lo tanto, los requerimientos para las tandas iniciales de proliferación de células T CD4+ fueron incluso más satisfactorios con la fábrica de células, en comparación con la estimulación de CD3/CD28 provista en el contexto de microesferas de poliestireno.

La estirpe celular CF permite la expansión a largo plazo de células Tr1 humanas

Luego, los inventores determinaron si la fábrica de células fue suficiente para mantener la propagación a largo plazo de las células Tr1 (Fig. 11). Las células Tr1 se estimularon con CF que segregan hIL–2 y IL–4, con CF' que no segregan citocina pero con la adición de citocinas exógenas y microesferas CD3/28 con citocinas exógenas. Las células estimuladas con microesferas CD3/28 no pudieron proliferar después de la segunda estimulación, en concordancia con los estudios previos. De modo similar, las células Tr1 estimuladas con CF' en el contexto de IL–2 e IL–4 añadidas exógenamente ingresaron en una fase de meseta de la curva del crecimiento al cabo de dos o tres semanas de cultivo, y no ocurrió ningún crecimiento neto de células adicional después de la re–estimulación. En contraste, cuando los cultivos de células Tr1 se estimularon con la fábrica de células, permanecieron en crecimiento exponencial incluso después de una tercera estimulación. Este aumento de proliferación a largo plazo fue reproducible, ya que el incremento promedio en el número total de células T fue 810 veces más alto en cultivos estimulados con la fábrica de células que en cultivos estimulados con microesferas CD3/28 en seis experimentos independientes.

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Claims

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