PT1899459T - Obtenção de células tr1 específicas para um auto-antigénio ou antigénio de alimentos a partir de uma população de pbmc ou de leucócitos - Google Patents

Obtenção de células tr1 específicas para um auto-antigénio ou antigénio de alimentos a partir de uma população de pbmc ou de leucócitos Download PDF

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PT1899459T
PT1899459T PT68089739T PT06808973T PT1899459T PT 1899459 T PT1899459 T PT 1899459T PT 68089739 T PT68089739 T PT 68089739T PT 06808973 T PT06808973 T PT 06808973T PT 1899459 T PT1899459 T PT 1899459T
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population
antigen
cell
specific
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PT68089739T
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Foussat Arnaud
Brun Valérie
Groux Hervé
Cottrez Françoise
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Inst Nat De La Santé Et De La Rech Médicale (Inserm)
Txcell S A
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Description

DESCRIÇÃO
"OBTENÇÃO DE CÉLULAS TR1 ESPECÍFICAS PARA UM AUTO-ANTIGÉNIO OU ANTIGÉNIO DE ALIMENTOS A PARTIR DE UMA POPULAÇÃO DE PBMC OU DE LEUCÓCITOS" A invenção refere-se a um método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento de um leucócito ou uma população de PBMC, que compreende estimular a população de PBMC ou leucócitos com o antigénio de alimento ou auto-antigénio, e recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento da população de células estimuladas. De preferência, a população de PBMC ou leucócitos é reestimulada pelo menos uma vez com o mesmo antigénio após o passo (1), na presença de IL-2 e pelo menos uma interleucina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-4 e IL-13. 0 método in vitro pode compreender adicionalmente um terceiro passo de expandir a população de células Trl específicas para antigénio recuperada, contatando-se as mesmas com células de matriz celular com a capacidade de expressar fatores necessários para a dita expansão. De preferência, as células de matriz celular são células de matriz celular de inseto.
Entre as populações de células T, acumulam-se agora evidências para uma nova subpopulação de células T com uma funcionalidade distinta, denominada células reguladoras Trl ou células Trl. Os inventores mostraram que as células T reguladoras 1 (Trl) poderiam ser utilizadas para tratar doenças inflamatórias (ou seja, doenças de Crohn (H. Groux et al. Nature 1997, 389, 737 a 742), inflamação da pele (Foussat et al. 2003 J. Immunol. 171, 5.018 a 5.026), aterosclerose (Mallat et al. Circulation 2003, 108, 1232 a 1237) ou esclerose múltipla (Barrat et al. 2002, 195, 603 a 616). Em todos estes modelos, mostrou-se que as células Trl anti-inflamatórias eram direcionadas de um antigénio especifico e que a administração daquele antigénio, preferencialmente no local da inflamação, foi necessária para estimular as células Trl para induzir as suas funções anti-inflamatórias. Deste modo, de modo a usar células Trl para tratar doenças humanas é necessário conseguir o isolamento de células Trl especificas para um antigénio. No entanto, verifica-se que isto é muito dificil. O pedido de patente internacional WO 02/092793 ensina a preparação de células Trl através da estimulação de células T CD4+ com células L de ratinho transfetadas com HLA-II DR1 e CD58 (LFA3), selecionando células CD4+ CD25+ e expandindo os clones na presença de IL-2 e IL-4. O Pedido de Patente internacional W096/27392 descreve a ativação das células T com o uso de células de matriz celular de inseto modificadas. O Pedido de patente U.S. US2002/090357 ensina a geração de células T CD4+ produtoras de IL-10 ao estimular as células T CD4+ com um péptido de ovalbumina, vitamina D3, dexametasona e esferas anti-CD3/CD28.
Os inventores também mostraram que as células Trl expressam marcadores de superfície específicos e poderiam ser caracterizadas pela coexpressão dos marcadores CD3 e CD4 assim como a expressão de CD4 9b e um elevado nível de expressão de CD18, e, quando apropriado, pela demonstração de uma sobre-expressão de genes que codificam para as proteínas CD4, PSGL-1, PECAM-1 e alfaV/beta3 (ver o pedido de patente internacional publicado com o número WO 2005/000344).
Surpreendentemente, os inventores observaram que as células Trl purificadas isoladas de sangue humano com base na expressão destes marcadores (e consequentemente células Trl presentes numa população de PBMC ou de leucócitos) proliferavam vigorosamente na resposta a antigénios de alimentos ou auto-antigénios e a resposta proliferativa destas células conseguia ser mantida através do estimulo utilizando tanto IL-2 e IL-4 (IL refere-se à interleucina). Este potencial oferece uma vantagem importante relativamente à técnica anterior, uma vez que de acordo com o conhecimento comum de um perito na técnica, foi anteriormente necessário primeiramente isolar células T nativas especificas para um antigénio de uma população de PBMC, segundamente induzir a diferenciação de células Trl especificas para um antigénio, enquanto que e agora possível obter células Trl específicas para um auto-antigénio ou para um antigénio de alimentos diretamente de uma população de PBMC (ou leucócitos) . Na presente invenção, o método in vitro para obter uma população de células Trl específicas para um auto-antigénio ou um antigénio de alimentos e simplificado, e a segurança para os pacientes aos quais estas células são administradas e acrescidas, uma vez que estas células não se alteraram em termos de qualidade.
Consequentemente, a matéria da presente invenção e um método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl específicas para um auto-antigénio ou um antigénio de alimentos a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células sanguíneas mononucleares (PBMC) humanas, sendo que o dito método consiste em: 1) estimular a população de PBMC de ser humano ou de leucócitos com o auto-antigénio ou o antigénio de alimentos, 2) recuperar a população de células Trl especificas para o auto-antigénio ou o antigénio de alimentos da população de células estimuladas, desde que o dito método não compreenda estimular linfócitos sanguíneos periféricos de ser humano com ovalbumina.
Leucócitos abrangem vários tipos de células que se caracterizam pela sua importância, a sua distribuição, o seu número, a sua duração de vida e a sua potencialidade. Estes tipos são os seguintes: os leucócitos polinucleares ou granulares, entre os quais se contam os leucócitos eosinofílicos, neutrofílcios e basofilicos, e as células mononucleares, ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), que são grandes glóbulos brancos e consistem nos tipos de células do sistema imunitário (linfócitos e monócitos). Os leucócitos ou as PBMCs podem ser separados do sangue periférico por qualquer método conhecido pelos peritos na técnica. Com vantagem, para a separação das PBMCs, pode-se utilizar centrifugação, preferentemente centrifugação com gradiente de densidade, preferentemente centrifugação com gradiente de densidade descontinuo. Uma alternativa e a utilização de anticorpos monoclonais específicos. Em certas realizações, as PBMC são tipicamente isoladas a partir de produto sanguíneo completo por intermédio de Ficoll-Hypaque, utilizando procedimentos convencionais. Noutras realizações, as PBMCs são recuperadas por intermédio de leucaferese. 0 termo "antigénio" na expressão "população de células Trl específicas para o antigénio" refere-se a um péptido imunogénico. Os péptidos imunogénicos são péptidos gue se podem ligar a moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC) de um indivíduo e que são reconhecidas pelos recetores das células T do referido indivíduo.
Os termos proteína, polipéptido, péptido utilizados no presente pedido referem-se indiferentemente a uma molécula formada pela união de uma longa cadeia de elementos mais pequenos, os aminoácidos. 0 termo "antigénio de alimentos" refere-se a um péptido imunogénico que vêm de alimentos, tais como antigénios de alimentos da seguinte lista não limitativa: antigénios bovinos tais como lipocalina, S100 de ligação a Ca, alfa-lactalbumina, beta-lactoglobulina, albumina de soro bovina, imunoglobulina ou caseínas. Antigénios de alimentos podem ser também antigénios do salmão atlântico, tais como a parvalbumina, antigénios de galinha tais como ovomucóie, ovalbumina, Ag22, conalbumina, lisozima ou albumina de soro de galinha, antigénios de camarão, tais como tropomiosina, antigénios do trigo tais como aglutinina ou ómega-5 gliadina, antigénios do aipo, tais como profilina do aipo, antigénios da cenoura tais como a profilina da cenoura, antigénios da maçã, tais como taumatina, proteína de transferência de lípidos da maçã, profilina da maçã, antigénios da pera tais como profilina de pera, isoflavona redutase, antigénios do abacate, tais como a endoquitinase, antigénios do alperce, tais como a proteína de transferência de lípidos do alperce, antigénios do pêssego, tais como proteína de transferência de lípidos do pêssego ou a profilina do pêssego, antigénios da soja, tais como HPS, profilina da soja ou (SAM22) PR-10 prot. 0 termo "auto-antigénio" refere-se a um péptido imunogénico derivado de uma proteina do referido individuo. Pode ser, por via de exemplo, um auto-antigénio da seguinte lista não limitativa: recetor acetilcolina, actina, translocador nucleotidico da adenina, (B-adrenoreceptor, descarboxilase de L-aminoácidos aromáticos, recetor asioaloglicoproteina, proteina de aumento do efeito bactericida/permeabilidade (BPi), recetor sensivel ao cálcio, enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol, cadeia ay do colagénio de tipo N, citocromo P450 2D6, desmina, desmogleina-1, desmogleina-3, F-actina, GM-gangliósidos, glutamato descarboxilase, recetor glutamato, ATPase H/K, 17-a-hidroxilase, 21-hidroxilase, IA-2 (ICAS12), insulina, recetor da insulina, fator intrinseco do tipo 1, antigénio 1 associado à função leucocitária, glicoproteina associada à mielina, proteina básica da mielina, proteina oligodendrocitica da mielina, miosina, P80-colina, complexo E2 da piruvato desidrogenase (PDC-E2), simporte do iodeto de sódio, SOX-10, proteina partilhada da tiroide e do músculo ocular, tiroglobulina, peroxidase da tiroide, recetor da tirotropina, transglutaminase tecidular, coativador da transcrição p75, triptofano hidroxilase, tirosinase, tirosina hidroxilase, ACTH, aminoacil-tARN-histidil sintetase, cardiolipina, anidrase carbónica II, proteínas associadas ao centrómero, ATPase estimulada pelo nucleossoma dependente do ADN, fibrilarina, fibronectina, glucose 6 fosfato isomerase, beta 2-glico-proteina I, golgina (95, 97, 160, 180), proteínas de choque térmico, proteína hemidesmossomal 180, histona H2A, H2B, queratina, recetor IgE, proteína cinase Ku-ADN, núcleo-proteína-Ku, fosfoproteina La, mieloperoxidase, proteinase 3, ARN polimerase I-III, proteína de reconhecimento de sinal, topoisomerase I, tubulina, vimenscina, proteína básica oligodendrocitica associada à mielina (MOBP), proteína proteolipidica, proteína especifica oligodendro-citica (OSP/Claudina 11) 3'-fosfodiesterase de nucleótido cíclico (CNPase), antigénio BP 1 (BPAGl-e), transaldolase (TAL), auto-antigénios da mitocôndria humana PDC-E2 (Novo 1 e 2) , 0GDC-E2 (Novo 3), e BC0ADC-E2 (Novo 4), penfigoide bolhoso (BO) 180, laminina 5 (LN5), proteína "DEAD-box" 48 (DDX48) ou antigénio-2 associado à insulinoma.
Antigénios tais como antigénios bacterianos ou virais são excluídos da expressão "auto-antigénio ou antigénio de alimentos". O auto-antigénio ou antigénio de alimentos, que é principalmente composto por uma sequência de aminoácidos, pode ser sintetizado pelas técnicas convencionais, tais como o método Fmoc, se a sequência de aminoácidos for conhecida, ou por tecnologias de ADN recombinante conhecidas (ver Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2“ Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) . Alguns auto-antigénios ou antigénios de alimentos são também comercialmente disponíveis (Sigma, L'Isle d'Abeau, França). O auto-antigénio ou antigénio de alimentos pode também ser extraído.
De preferência, a população de células Trl específicas para o auto-antigénio ou antigénio de alimentos e obtido de uma população de PBMC de ser humano.
Com mais preferência, a população de PBMC ou de leucócitos e reestimulada pelo menos uma vez com o mesmo antigénio após o passo (1), na presença de interleucina-2 (IL-2) e pelo menos uma interleucina selecionada do grupo que consiste em interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13) . A frequência da estimulação do auto-antigénio ou antigénio de alimentos pode ser pelo menos uma vez, preferentemente uma vez por semana, ao longo de algumas semanas (geralmente cerca de três), ou varias vezes em intervalos de cinco a doze dias. Podem ser realizadas estimulações múltiplas através da permuta de uma porção do sobrenadante da cultura com a mesma quantidade de meio de cultura de PBMC ou leucócitos frescos contendo o antigénio.
As IL-2 e IL-4 utilizadas para reestimular a população de PBMC ou de leucócitos podem ser sintetizadas ou ser interleucinas recombinantes e o perito na técnica tem larga experiência nos métodos para a obtenção de tais interleucinas (ver, por exemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). IL-2 e IL-4 podem ser adquiridas de diferentes fontes, tais como R&D Systems e Peprotech.
De preferência, o auto-antigénio ou antigénio de alimentos é um antigénio recombinante ou sintetizado.
Com mais preferência, o antigénio de alimentos é selecionado do grupo que compreende caseína, proteína de soja, fragmentos, variantes e misturas daqueles. 0 termo "variante" do auto-antigénio ou antigénio de alimentos refere-se aqui a um antigénio que é quase idêntico ao antigénio natural e que partilha a mesma atividade biológica. A diferença minima entre o antigénio natural e a sua variante pode consistir, por exemplo, numa substituição, deleção e/ou adição de aminoácido. Tais variantes podem conter, por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos nas quais os residuos de aminoácidos são substituídos por residuos de aminoácidos com uma cadeia lateral similar. Foram identificadas na técnica famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Com máxima preferência, o antigénio de alimentos é selecionado do grupo que compreende caseína alfa SI bovina de sequência SEQ ID N°24, beta-caseína bovina de sequência SEQ ID N°25 e sequências com pelo menos 70%, preferentemente 75, 77, 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 96, 97, 98, 99 % de identidade com uma das sequências SEQ ID 24 e SEQ ID N°25 .
Noutra modalidade preferida, o auto-antigénio é selecionado do grupo que compreende insulina, proteína básica da mielina, seus fragmentos, variantes e misturas dos mesmos. A expressão "estimular a população de PBMC de ser humano ou leucócitos com o auto-antigénio ou antigénio de alimento" tal como aqui utilizado significa adicionar o antigénio à população de PBMC de ser humano ou de leucócitos e proceder à cultura para reagir com as células T da referida população de PBMC de ser humano ou de leucócitos. Para produzir uma população de células Trl especificas para o auto-antigénio ou antigénio de alimentos, a população de PBMC de ser humano ou de leucócitos e contactada com um antigénio de acordo com a presente invenção numa forma adequada para desencadear um sinal de ativação primária nas células T da referida população de PBMC de ser humano ou de leucócitos, ou seja, o antigénio e apresentado à população de PBMC de ser humano ou de leucócitos de tal modo que é desencadeado um sinal das células T através do complexo CD3/TCR. Por exemplo, o antigénio pode ser apresentado às PBMCs ou aos leucócitos numa forma solúvel (seja diretamente para formar complexos com as moléculas MHC expressas pelas PBMCs ou pelos leucócitos ou o antigénio pode ser acoplado seja a uma forma solúvel, uma forma polimérica ou uma formal ligada a uma superfície (plástico, ...) das moléculas MHC) ou por uma célula apresentadora de antigénio (APC) em conjunto com uma molécula MHC. Uma célula apresentadora de antigénios (APC), tal como uma célula B, um macrófago, um monócito, uma célula dendrítica, uma célula de Langerhans, ou outra célula que apresente o antigénio às células T da referida população de PBMC de ser humano ou de leucócitos, pode ser incubada com as PBMCs ou com os leucócitos na presença do antigénio (por exemplo, um antigénio solúvel) de tal modo como as células apresentadoras de antigénios apresentam o antigénio às PBMCs ou aos leucócitos. Alternativamente, uma as APCs podem ser pré-incubadas com o antigénio antes de serem adicionadas aos PBMCs ou leucócitos. Alternativamente, uma célula que expressa o auto-antigénio ou o antigénio de alimentos pode ser incubado com a população de PBMC de ser humano ou de leucócitos.
De preferência, o estimulo da população de PBMC de ser humano ou de leucócitos e levado a cabo nos poços de uma microplaca, um frasco de cultura celular ou um saco de cultura celular. Os meios de cultura de PBMCs ou de leucócitos que podem ser utilizados são muito bem conhecidos por um perito na técnica: por exemplo, as PBMCs ou os leucócitos podem ser estimulados num meio RPMI suplementado com soro humano ou com X-vivo 15 (Cambrex).
Com vantagem, a população de PBMC de ser humano estimulada no passo (1) contem de 0,01x10s a 100x10s células/mL, preferentemente de 0,2x10s a 5x10s células/mL, mais preferentemente de 0,1x10s a 3x10s células/mL, ainda mais preferentemente de 0,5x10s a 2,5x10s células/mL, e preferivelmente de 10s a 2x10s células/mL.
Mais vantajosamente, o auto-antigénio ou antigénio de alimento utilizado para estimular a população de PBMC de ser humano no passo (1) está numa forma solúvel de 0,1 yg/mL a 5 mg/mL, preferentemente de 1 a 200 yg/mL.
No entanto, o perito na técnica sabe que a quantidade especifica do auto-antigénio ou antigénio de alimento utilizado para estimular uma população de PBMC de ser humano ou de leucócitos depende do auto-antigénio ou antigénio de alimento que é utilizado.
Noutra modalidade particular, a população de PBMC de ser humano ou de leucócitos e incubada, antes da estimulação no passo (1), com um marcador fluorescente da divisão celular de modo a determinar, por citofluorimetria, que quando a intensidade de fluorescência da população celular estimulada e pelo menos duas vezes inferior a. intensidade de fluorescência da população de PBMC de ser humano ou de leucócitos, a divisão celular ocorreu na referida população celular, e que a referida população celular que é recuperada no passo (2) e a população celular Trl específica para o antigénio.
Tal método, que permite monitorizar a divisão celular utilizando marcadores de fluorescência, é bem conhecido pelo perito na técnica e é muito bem apropriado para utilização no passo (2) de recuperação da população de células Trl específicas para o antigénio, uma vez que a população celular estimulada cuja intensidade de fluorescência e pelo menos duas vezes inferior a. intensidade de fluorescência da população de PBMC ou de leucócitos, compreende a população de células Trl específicas para ao auto-antigénio ou para o antigénio de alimento. Com vantagem, a população celular estimulada cuja intensidade de fluorescência e pelo menos duas vezes inferior a. intensidade de fluorescência da população de PBMC ou de leucócitos e a população de células Trl específicas para ao auto-antigénio ou para o antigénio de alimento.
De preferência, o marcador de fluorescência da divisão celular e o marcador éster carboxifluoresceína diacetato de succinimidilo (CFSE), o marcador diacetato do ácido carboxílico verde oregon 488 (Carboxi-DFFDA SE) ou o marcador PKH26 (derivado do descobridor, Paul Karl, Horan, PKH), estando todos, entre outros, comercialmente disponíveis através da Invitrogen. 0 passo (2) da recuperação da população celular Trl específica para o auto-antigénio ou o antigénio contra alimentos, pode ser conduzido por vários métodos bem conhecidos por um perito na técnica. Por exemplo, as células Trl podem ser identificadas e/ou purificadas por Elisa, citometria de fluxo, cromatografia de imunoafinidade com anticorpos marcados dirigidos contra os referidos marcadores de células Trl, por exemplo, com: anti-CD4 conjugado com APC (RPA-T4) - Becton Dickinson (APC para aloficocianina) anti-CD3 conjugado com PC5 (UCHT-1) - Catalag (PC5 para ficoeritrina-cianina 5)
anti-CD18 conjugado com PE (6.7) - Becton Dickinson (PE para ficoeritrina) anti-CD49b conjugado com FITC (AK-7) - Becton Dickinson ou anti-CD49b humano de murganho marcado com PE (12F1-H6) (FITC para floresceína-isotiocianato).
São agora bem conhecidos marcadores específicos para células Trl pelo perito na técnica, e são suficientemente descritos no pedido de patente internacional WO 2005/000344. Assim, numa modalidade preferida, a população de células Trl específicas para o antigénio é recuperada no passo (2) por citofluorometria utilizando anticorpos com marcação de fluorescência dirigidos contra proteínas presentes na superfície das células da referida população de células Trl específicas para o antigénio.
Também podem ser utilizados testes ELISA e coloração intracelular para medir a expressão de IL-4, IL-10 e IFN-γ e para identificar as células Trl através do seu perfil de expressão de citocinas. Tais métodos são geralmente utilizados pelo perito na técnica. Por exemplo, o sobrenadante obtido após o passo (1) da estimulação pode ser contactado com os anticorpos marcados com NIP dirigidos contra a expressão de IL-4, IL-10 e IFN-γ (NIP para acetil de (4-hidroxi-5-iodo-3-nitrofenilo) (NIP)), seguido do anticorpo anti-NIP marcado com peroxidase e adição de ABTS (ABTS para 2,2'-azino-de(3-etil-benztiazolina-6-sulfonato) (da R&D Systems, Minneapolis, MN, e Chiron Corp. Emmeryville, CA).
De preferência, a população de células Trl específicas para o antigénio e recuperada no passo (2) através de uma técnica de clonagem, tal como com vantagem por diluição limite. Tais métodos são bem conhecidos pelo perito na técnica e não serão mais apresentados na presente descrição.
Deve-se considerar que estes métodos de recuperação da população de células Trl específicas para o antigénio podem ser utilizados isoladamente ou em combinação. Por exemplo, o "método CFSE" pode ser utilizado em combinação com a citofluorometria ou com técnicas de clonagem por diluição limite. Também é possível utilizar a citofluorometria seguida de uma técnica de clonagem. A presente invenção também se refere a um método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl específica de auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de ser humano, sendo que o método é caracterizado por compreender: a) recuperar a população de células Trl específicas para auto-antigénio ou antigénio de alimento do passo (2) do método como descrito acima no presente documento, e b) expandir a população de células Trl específicas para antigénio recuperado no passo (2) num meio de cultura Mp. 0 meio de cultura Mp pode ser de qualquer tipo, desde que seja apropriado para a referida população de células Trl específicas para o antigénio, e será facilmente selecionado por um perito na técnica (meio de Schneider, meio sem soro, . . .) .
No presente pedido, os termos "expansão", "proliferação", "crescimento" podem ser utilizados intermutavelmente e referem-se ao número crescente de células numa população celular. De preferência, a população de células Trl específicas para o antigénio e expandida exponencialmente.
Com vantagem, o passo (b) de expansão da população de células Trl específicas para o antigénio consiste no contacto da referida população de células Trl específicas para antigénio com esferas CD3+CD28 (por exemplo adquiridas da Dynal, Oslo, Noruega) na presença de IL-2 e IL-4. A presente invenção também se refere, portanto, a um método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl específica de auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas de ser humano (PBMC), sendo que o dito método compreende: a) recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento do passo 2 do método como descrito acima no presente documento, e b) expandir a população de célula Trl especifica de antigénio recuperada no passo (2) ao contatar a dita população de célula Trl especifica de antigénio com esferas CD3+CD28 na presença de IL-2 e IL-4.
Numa modalidade particularmente vantajosa, o passo (b) de expandir a população de células Trl especificas para antigénio requer a presença de um grupo de fatores recombinantes no meio de cultura Mp, sendo que o dito passo de expansão compreende: a) cultivar, numa temperatura TI num meio de cultura Mf, células de matriz celular capazes de expressar um grupo de fatores recombinantes que interagem com as seguintes proteínas de superfície celular da população de células Trl especificas para antigénio a ser expandida:
- o complexo proteico CD3/TCR - a proteina CD28, - a proteina CD2, - o recetor de interleucina-2 (IL-2), e - o recetor de interleucina-4 (IL-4), tal TI permite a proliferação das ditas células de matriz celular, b) contatar as células de matriz celular obtidas no passo (a) separadas ou não do seu meio de cultura Mf, com a população de células Trl específicas para antigénio contida no meio de cultura Mp, em que o dito meio de cultura Mp não contém inicialmente o grupo de fatores, a fim de obter uma mistura que contém a população de células Trl específicas para antigénio, as células de matriz celular e o meio de cultura Mp, c) cultivar a mistura obtida no passo (b) que contém os fatores do grupo que são expressos pelas células de matriz celular no meio de cultura Mp, em que o dito passo (c) de cultivação é executado a uma temperatura T2 que é pelo menos cerca de 35°C, de modo que: - a população de células Trl específicas para antigénio prolifere, e - as células de matriz celular não proliferem, e em que a população de células Trl específicas para antigénio é expandida, d) recuperar a população de células Trl específicas para antigénio assim expandida. A razão [células da matriz celular: população de células Trl específicas para o antigénio] e indiferente quando se adicionam as células da matriz celular a. população de células Trl específicas para o antigénio (passo (b) ) . Com vantagem, esta razão pode ser [1:1] .
As células de matriz celular podem ser de qualquer tipo, desde que não proliferem a. temperatura de cultura da população de células Trl específicas para o antigénio T2, que é pelo menos cerca de 35°C. A expressão "pelo menos cerca de 35°C" significa que a temperatura pode variar de 0,1°C abaixo de 35°C (de 34,9°C a 35°C) . 0 perito na técnica está de qualquer modo ciente de tais variações mínimas de temperatura. 0 perito na técnica que tem vasta experiência em cultura celular, conhece condições específicas a serem usadas, em particular as temperaturas de cultura ótimas Ti e T2 de cada população de matriz celular e população de células Trl específicas para o antigénio. 0 meio de cultura Mf pode ser de qualquer tipo, desde que seja apropriado para o referido tipo de célula de matriz celular, e será facilmente selecionado pelo perito na técnica (meio de Schneider, . . .) .
Deve ser considerado que o passo (b) colocando as células de matriz celular em contacto com a população de células Trl específicas para o antigénio, e o passo (c) de cultura da mistura a uma temperatura T2, são em geral passos simultâneos: antes do contacto, as células de matriz celular e a população de células Trl específicas para o antigénio são cultivadas separadamente, respetivamente uma à temperatura Ti no meio de cultura Mf e a outra à temperatura T2 no meio de cultura Mp. Depois, as células de matriz celular "isoladamente" ou o meio de cultura Mf contendo as células de matriz celular são/e colocado em contacto com a população de células Trl específicas para o antigénio que está presente no seu meio de cultura Mp e que está a ser cultivada à temperatura T2. Consequentemente, as células de matriz celular passam imediatamente da temperatura Ti para a temperatura T2 e cessam a proliferação, ao invés da população de células Trl específicas para o antigénio, que é expandida graças ao grupo de fatores que são expressos pelas células de matriz celular. É possível manter durante um período de tempo prolongado o crescimento exponencial in vitro da população de células Trl específicas para o antigénio, tal como pelo menos dois ou três meses, através de se voltar a contactar as células de matriz celular regularmente, por exemplo, todas as semanas, com a referida população de células Trl específicas para o antigénio.
Mais vantajosamente, as células de matriz celular morrem durante o passo (c) devido à temperatura T2 que já não e apropriada para a cultura de células de matriz celular. Mais vantajosamente, os fragmentos da membrana celular das células de matriz celular que resultam da morte destas células são eliminados no passo (d).
Após um período suficiente de cultura da população de células Trl específicas para o antigénio no passo (c) tal como preferentemente várias horas, o meio de cultura Mp obtido e composto por uma mistura da população de células Trl específicas para o antigénio, células de matriz celular viáveis e opcionalmente fragmentos da membrana celular das células de matriz celular, e a população de células Trl específicas para o antigénio expandida tem de ser recuperada no passo (d). Tal recuperação pode ser realizada através da separação da população de células Trl específicas para o antigénio das células de matriz celular viáveis e opcionalmente dos referidos fragmentos da membrana celular utilizando qualquer método de separação apropriado bem conhecido pelo perito na técnica, tal como por exemplo citometria de fluxo utilizando um ligando marcado específico capaz de se ligar à superfície das células de matriz celular ou uma proteína de superfície celular da população de células Trl específicas para o antigénio. Podem também ser utilizados outros métodos, tais como métodos de lavagem e/ou centrifugação tais como centrifugação com gradiente de densidade utilizando meio de separação como Ficoll®, sendo tal centrifugação um meio apropriado para eliminar fragmentos da membrana celular.
Deve notar-se que a eliminação dos fragmentos da membrana celular das células de matriz celular não e obrigatória, mas recomendada, especialmente quando se pretende administrar a população de células Trl específicas para o antigénio expandida a mamíferos. De outro modo, existe um risco que a referida população de células Trl específicas para o antigénio expandida esteja contaminada.
Com vantagem, o grupo de fatores compreende fatores ancorados à membrana celular das células de matriz celular e fatores secretados pelas referidas células de matriz celular.
Quando as células de matriz celular são cultivadas no passo (a), expressam alguns fatores do grupo na superfície da sua membrana celular e alguns outros fatores no meio de cultura Mf. No passo (b) de contacto, os "fatores de membrana" já estão ancorados à membrana das células de matriz celular, mas os "fatores secretados" podem ser eliminados se as células de matriz celular forem previamente removidas do seu meio de cultura Mf. De qualquer modo, ambos os "fatores de membrana" e os "fatores secretados" são expressos pelas células de matriz celular no passo (c), mesmo se as células de matriz celular já não proliferam, e ate à morte das referidas células de matriz celular. E mesmo possível que os "fatores de membrana" ancorados aos fragmentos de membrana celular das células de matriz celular mortas ainda desempenhem um papel na produção da população de células Trl específicas para o antigénio. A população de células Trl específicas para o antigénio que é expandida tem proteínas de superfície celular que estão implicadas nos sinais celulares que permitem a sua expansão. Tais proteínas de superfície celular são ativadas graças a ligandos específicos, ou fatores, que são proporcionados na presente invenção pelas células de matriz celular: as células de matriz celular expressam o grupo de fatores que permitem a expansão da população de células Trl específicas para o antigénio. 0 perito na técnica conhece quais os fatores específicos que têm de ser expressos pelas células de matriz celular de tal modo que estes fatores interagem com uma proteína de superfície celular da população de células Trl específicas para o antigénio.
Ainda mais preferentemente, as células de matriz celular são células recombinantes e contêm ácidos nucleicos heterólogos que codificam para os fatores do referido grupo.
As expressões "célula recombinante" ou "célula de matriz celular recombinante" referem-se à introdução nas referidas células de ácidos nucleicos heterólogos que codificam para os fatores do grupo. Tal introdução engloba uma variedade de técnicas úteis para a introdução de ácidos nucleicos em células de matriz celular incluindo eletroporação, precipitação por fosfato de cálcio, tratamento com DEAE-dextrano, lipofeção, microinjeção e infeção com vetores virais. Tais métodos adequados são muito bem conhecidos pelo perito, e podem ser encontrados por exemplo em Sambrook et ai. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
Os ácidos nucleicos a serem introduzidos podem ser, por exemplo, ADN englobando os genes que codificam para os fatores suscetíveis de interagir com as proteínas de superfície celular da população de células Trl específicas para o antigénio a ser expandida, fragmentos de ADN genómico, cadeia de ARN no sentido direto ou vetores de expressão recombinantes contendo ADNc contendo tais genes. Os ácidos nucleicos heterólogos podem codificar para o comprimento total dos fatores ou alternativamente podem codificar para seus fragmentos peptídicos que são suficientes para permitir a produção da população de células Trl específicas para o antigénio de acordo com a presente invenção, quando introduzidos nas células de matriz celular. Os ácidos nucleicos podem codificar para os ligandos naturais (proteínas co-estimuladores) das proteínas de superfície celular da população de células Trl específicas para o antigénio, ou seus fragmentos, ou formas modificadas dos ligandos ou de seus fragmentos. A invenção pretende incluir a utilização de fragmentos, mutantes ou variantes (por exemplo, formas modificadas) dos fatores que retêm a capacidade de aumentar a expansão da população de células Trl específicas para o antigénio. Uma "variante" de um fator significa uma proteína que partilha uma homologia significativa com o ligando natural e que está implicada na expansão da população de células Trl específicas para o antigénio. Os termos biologicamente ativa ou forma biologicamente ativa de uma proteina incluem formas de fatores que são capazes de resultar na expansão da população de células Trl especificas para o antigénio. Um perito na técnica pode selecionar tais variantes de fatores com base na sua capacidade de aumentar a expansão celular através da introdução de ácidos nucleicos que codificam para os fatores nas células de matriz celular. A capacidade de uma variante ou fator especifico em aumentar a expansão de uma população de células Trl especificas para o antigénio pode ser facilmente determinada, por exemplo, através da comparação das células de matriz celular recombinantes com as células de matriz celular não recombinantes através de qualquer teste ou método conhecido. Alem disso, será apreciado pelos peritos na técnica que alterações na sequência primária de aminoácidos dos fatores irão provavelmente ser toleradas sem diminuir de forma significativa a capacidade das proteínas em permitir a expansão da população de células Trl especificas para o antigénio. Deste modo, variantes dos fatores que têm substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos em comparação com as sequências de aminoácidos que ocorrem naturalmente de fatores nativos comparáveis, que ainda retenham a atividade funcional das formas naturais dos fatores tais como aqui descritos são também abrangidos pela invenção. Tais variantes podem conter por exemplo substituições de aminoácidos conservativas (ver acima).
Os ácidos nucleicos estão numa forma adequada para a expressão de fatores contendo a referida forma a totalidade das sequências codificantes e de regulação necessárias para a transcrição e a tradução de um gene, que pode incluir um promotor, um "enhancer" e um sinal de poliadenilaçao, e opcionalmente uma sequência necessária para o transporte do fator para a superfície das células de matriz celular, incluindo uma sequência sinal na extremidade N. As sequências de regulação podem também ser selecionadas para proporcionar transcrição constitutiva ou indutivel. A expressão do fator à superfície da célula de matriz celular pode ser confirmada por coloração das células por imunofluorescência. Por exemplo, as células podem ser coradas com um anticorpo monoclonal com marcação fluorescente reativo contra a molécula co-estimuladora ou com um recetor solúvel com marcação fluorescente que se liga ao fator. 0 perito na técnica, que conhece muito bem os fatores a serem expressos pelas células de matriz celular, também conhece anticorpos monoclonais apropriados que reconhecem fatores expressos pelas células de matriz celular. Alternativamente, proteínas ligando solúveis marcadas que se ligam aos fatores podem ser utilizadas para detetar a sua expressão à superfície da célula de matriz celular. As técnicas e dispositivos utilizados para a deteção de células coradas por imunofluorescência são bem conhecidas pelo perito na técnica; preferentemente utiliza-se para deteção um seletor de células ativado por fluorescência (FACS).
Quando o ácido nucleico que codifica para um fator está funcionalmente ligado a elementos de regulação, e tipicamente transportado num vetor, incluindo por exemplo plasmideos e virus. Assim, um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica para um fator da presente invenção ligado funcionalmente a elementos de controlo de regulação, e também aqui referido como um "vetor de expressão". Serão escolhidos vetores de expressão em relação ao tipo de célula de matriz celular a ser transformada. Por exemplo, quando as células de matriz celular são células de matriz celular de inseto de drosófila, vetores constitutivos de drosófila disponíveis para a expressão de proteínas nas células de inseto cultivadas incluem a serie pAc (Smith et al. , (1983) Mol.
Cell Biol. 3: 2156 a 2165) a serie pVL (Lucklow, V.A., e
Summers, M.D., (1989) Virology 170:31 a 39).
Alem disso, é preferido que as células de matriz celular que não tenham qualquer molécula do complexo major de histocompatibilidade (MHC) de classe intrínseca I e/ou II a. sua superfície. Significa que estas células não expressam naturalmente moléculas MHC, a não ser que tenham sido geneticamente transformadas. A ausência destas moléculas MHC de classe intrínseca I e/ou II a. superfície das células de matriz celular e crucial para evitar uma resposta alogénica entre as células de matriz celular e a população de células Trl específicas para o antigénio. Como resultado, as células de matriz celular da presente invenção podem ser utilizadas para expandir uma população de células Trl específicas para o antigénio de qualquer dador num curto período de tempo.
Numa modalidade mais particular, as células de matriz celular são limpas do seu meio de cultura Mf no passo (b).
De preferência, as células de matriz celular são células de matriz celular de inseto, com Ti inferior a T2. Pode-se utilizar qualquer célula de matriz celular de inseto apropriada na presente invenção, desde que cumpra com as condições acima mencionadas. Podem ser, por exemplo, células de matriz celular da linha Sf9 (entre outros, depositada na ATCC com o número CRL 1711 ou na DSMZ com o número ACC 125, e comercializada pela BD Biosciences Pharmingen, EUA), Sf21 (entre outros, depositada na DSMZ com o número ACC 119, e também comercializada pela BD Biosciences Pharmingen, EUA) ou S2. De preferência, as células de matriz celular de inseto são da linha celular S2 de drosófila. A linha celular S2 de drosófila e bem conhecida pelo perito na técnica, e foi revelada de forma abrangente na técnica anterior. A linha celular S2 de drosófila está disponível comercialmente (Invitrogen, França, etc...), e foi depositada em particular na coleção Alemã de microrganismos e culturas celulares DSMZ ("Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen") com o número ACC 130, e revelada em Schneider, J Embryol Exp Morphol, 27:1972, 353; foi também depositada na coleção de culturas tipo Americana ATCC com o número CRL 1963. De preferência, as células de matriz celular são da linha S2 de células de drosófila depositadas a 25 de março de 2005 na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM, Instituto Pasteur, Paris) sob o número 1-3407.
Uma grande vantagem proporcionada pela utilização de células de matriz celular de inseto quando se pretende expandir uma população de células de mamifero, e aqui uma população de células Trl especificas para um antigénio, e que (1) as células de matriz celular e as células de mamifero não proliferam à mesma temperatura (Ti é inferior a Ϊ2 e Ϊ2 é pelo menos cerca de 35°C) , e (2) os virus de mamifero não proliferam em células de matriz celular de inseto, evitando deste modo possiveis contaminações da população de células Trl especificas para um antigénio a partir das células de matriz celular.
Com máxima preferência, o meio de cultura Mp é um meio de cultura sem soro. Preferem-se meios isentos de qualquer contaminante biológico, tais como meios de cultura sem soro comercialmente disponíveis (XVIVO-15 da BioWhittaker, Walkersville, MD; meio AIM V da Invitrogen, etc...).
Com máxima preferência, o meio de cultura Mf é um meio de cultura sem soro. Preferem-se meios isentos de qualquer contaminante biológico, tais como, por exemplo, meios de cultura sem soro comercialmente disponíveis (meio de Schneider sem soro comercializado por BioWhittaker, Walkersville, MD GIBCO® meio de cultura para células de inseto sem soro tal como SFM comercializado por Invitrogen, ou Insectagro® meio sem soro comercializado por Krackeler Scientific Inc., EUA, etc ...) de modo a evitar a contaminação subsequente da população de células P.
Para a expansão da população de células Trl específica ao antigénio, é necessário o estímulo do complexo TCR/CD3 (TCR para recetor de célula T e CD para antigénio de diferenciação celular) para fornecer um sinal de ativação primário numa célula T. Um anticorpo monoclonal anti-CD3 pode ser utilizado para ativar uma população de células T através do complexo TCR/CD3, com vantagem um anticorpo anti-CD3, em que a modificação do anticorpo anti-CD3 consiste na substituição do domínio intracitoplasmático com um domínio transmembranar, de tal modo que o referido anticorpo anti-CD3 modificado vai ancorar à membrana celular das células de matriz celular e interatua com o complexo proteico CD3/TCR das células T.
Alem disso, algumas proteínas na superfície das células T, indiferentemente denominadas "moléculas de co-estimulação" ou "co-estimuladores", foram implicadas na regulação da transição de uma célula T quiescente para transformação blástica, e subsequente proliferação e diferenciação. Assim, alem do sinal de ativação primário proporcionado através do complexo TCR/CD3, a indução de respostas de células T requer um segundo sinal de co-estimulação. Crê-se que uma molécula de co-estimulação ou acessória, CD28, inicia ou regula uma via de transdução de sinal que é distinta daquelas estimuladas pelo complexo TCR. 0 fator que interatua com a proteina CD28 presente á superfície das células Trl especificas para o antigénio e que é expresso pelas células de matriz celular, pode ser um anticorpo monoclonal anti-CD28 ou um seu fragmento capaz de ligação cruzada com a molécula CD28; em tal caso, a modificação do anticorpo monoclonal anti-CD28 pode ser considerada através da adição de um domínio transmembranar de modo que vai ancorar à superfície celular das células de matriz celular. De preferência, o ligando natural para CD28 e utilizado em vez do anticorpo monoclonal anti-CD28, o que equivale a dizer por exemplo um membro da família B7 de proteínas, tais como proteínas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86).
Outra molécula co-estimuladora, CD2, está implicada nos sinais que permitem a expansão da população de células Trl especifica para um antigénio. Do mesmo modo, o fator expresso pelas células de matriz celular que interage com CD2 pode ser um anticorpo monoclonal anti-CD2 ou um seu fragmento capaz de ligação cruzada com as moléculas CD2; a modificação do anticorpo monoclonal anti-CD2 pode ser considerada através da adição de um domínio transmembranar para ancorar à superfície celular das células de matriz celular. De preferência, o ligando natural para CD2 e utilizado em vez do anticorpo monoclonal anti-CD2, ou seja, a proteína CD58.
Alem dos fatores que são ancorados à membrana celular das células de matriz celular, são também necessários fatores que são secretados, tais como interleucinas, para a expansão da população de células Trl especifica para um antigénio. Entre estas interleucinas estão IL-2, que interage com o recetor IL-2 presente à superfície das células Trl especificas para um antigénio, e quer IL-4 ou IL-13, que interagem com o recetor IL-4 das células Trl especificas para um antigénio.
Mais vantajosamente, o grupo dos fatores recombinantes compreende: - o anticorpo anti-CD3 modificado, em que a modificação do anticorpo anti-CD3 consiste na substituição do domínio intracitoplasmático anti-CD3 da cadeia pesada de anti-CD3 por um domínio transmembranar, sendo o referido anticorpo anti-CD3 ancorado à membrana celular das células de matriz celular e sendo suscetível de interagir com o complexo proteico CD3/TCR das células T, ou uma sua variante. - a proteína CD80 ou CD86, preferentemente a proteína CD80, ancorada à membrana celular das células de matriz celular, que é suscetível de interagir com a proteína CD28 das células T, ou uma sua variante, e - a proteína CD58 ancorada à membrana celular das células de matriz celular, que é suscetível de interagir com a proteína CD2 das células Trl, ou uma sua variante, - IL-2 secretada pelas células de matriz celular, que é suscetível de interagir com o recetor IL-2 das células Trl, ou uma sua variante, e - uma interleucina selecionada do grupo que compreende IL-4 e interleucina 13 (IL-13), preferentemente IL-4, sendo a referida interleucina secretada pelas células de matriz celular e sendo suscetível de interagir com o recetor IL-4 das células Trl, ou uma sua variante.
De preferência, o domínio transmembranar que substitui o domínio intracitoplasmático da cadeia pesada do anticorpo anti-CD3 é o domínio transmembranar do recetor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF).
Os fatores que são expressos pelas células de matriz celular podem ser de qualquer origem. De preferência, são da mesma origem que aqueles da população de PBMC de ser humano ou de leucócitos da qual se obtém a população de células Trl especifica para um antigénio. Portanto, de preferência, os fatores do referido grupo são de origem humana.
De preferência, a cadeia leve do anticorpo anti-CD3 modificado é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°l, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°l, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-CD3 modificado é codificada pelo ácido nucleico de sequência SEQ ID N°2, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°2.
Com mais preferência, a proteína CD80 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°3, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°3 .
Vantajosamente, a proteína CD86 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°4, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°4 .
Ainda mais preferentemente, a proteína CD58 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°6, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°6.
Numa modalidade preferida, a IL-2 pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°5, ou é codificada qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°5 .
Vantajosamente, a IL-4 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°7, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°7.
Mais vantajosamente, a IL-13 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°8, ou qualquer ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°8 . A expressão "molécula de ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID No. X" refere-se a qualquer sequência que tem pelo menos 70, 75, 80, 85, 90,95 ou 99% de identidade com a referida sequência SEQ ID No. X.
Geralmente, após várias horas de cultura a população de células Trl específicas para o antigénio a ser expandida tal como 12 horas, preferentemente após 24 horas de cultura, mais preferentemente 48 horas, não existem quaisquer células de matriz celular viáveis no meio de cultura Mp. Com vantagem, a população de células Trl específicas para o antigénio é recuperada quando todas as células de matriz celular estão mortas, o que permite primeiramente obter uma população de células Trl específicas para o antigénio expandida maior, e segundamente recuperar rapidamente e facilmente a população de células Trl específicas para o antigénio através da eliminação dos fragmentos de membrana celular das células de matriz celular, por exemplo, por métodos de lavagem e/ou por centrifugação por gradiente de densidade, tal como apresentado acima.
Assim, numa modalidade preferida, a população de células Trl específicas para o antigénio assim expandida é recuperada no passo (d) após se ter cultivado a população de células Trl específicas para o antigénio no passo (c) durante pelo menos 12 horas, preferentemente 24 horas.
Por percentagem de identidade entre dois ácidos nucleicos (ou sequências de ácido nucleico) ou duas sequências proteicas na presente invenção, significa uma percentagem de nucleótidos ou aminoácidos idênticos entre duas sequências a comparar, obtidas após o melhor alinhamento; esta percentagem é puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências são distribuídas aleatoriamente e ao longo da totalidade do seu comprimento. 0 melhor alinhamento ou alinhamento ótimo é o alinhamento correspondente à percentagem mais elevada de identidade entre duas sequências a comparar, a qual é calculada tal como aqui de seguida. As comparações de sequências entre dois ácidos nucleicos ou duas sequências proteicas são geralmente levadas a cabo através da comparação destas sequências após o seu alinhamento ótimo, sendo a referida comparação realizada para um segmento ou para uma "janela de comparação", para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. 0 alinhamento ótimo de sequências para a comparação pode ser realizado manualmente ou por intermédio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2: 482), por intermédio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48: 443), por intermédio do método de investigação de similaridade de Pearson e Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85: 2444), por intermédio de programas de computador utilizando estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) . A percentagem de identidade entre duas sequências de ácidos nucleicos ou duas sequências proteicas é determinada através da comparação destas duas sequências alinhadas de um modo ótimo com uma "janela de comparação" em cuja região da sequência de ácido nucleico ou sequência proteica para comparar pode compreender adições ou deleções relativamente à sequência de referência para um alinhamento ótimo entre estas duas sequências. A percentagem de identidade é calculada através da determinação do número de posições para as quais o nucleótido ou o aminoácido é idêntica entre as duas sequências, dividindo este número de posições idênticas pelo número total de posições na "janela de comparação" e multiplicando o resultado obtido por 100, para obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências. O passo (b) de expansão da população de células Trl específicas para o antigénio de acordo com a presente invenção utilizando células de matriz celular, oferece as seguintes vantagens: - 0 sistema de expansão de células de matriz celular e capaz de manter o crescimento exponencial da população de células Trl específicas para o antigénio durante pelo menos dois ou três meses in vitro, - As células de matriz celular não têm moléculas MHC de classe I e II para evitar resposta alogénica, - As células de matriz celular são isentas de micoplasma, - As células de matriz celular são capazes de crescer bem utilizando meio de sem soro, - As células de matriz celular não precisam ser irradiadas, - As células de matriz celular não permitem a expansão de vírus animais, e - A população de células Trl específicas para o antigénio expandida é muito bem caracterizada para efeitos de inj eção.
Outro objetivo da invenção é um método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl específicas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas de ser humano (PBMC), sendo que o método consiste em: 1) estimular a PBMC de ser humano ou população de leucócitos com o auto-antigénio ou antigénio de alimento, 2) recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir da população de células estimuladas, e 3) expandir uma população de células Trl especificas para antigénio ao contatar a dita população de células Trl especificas para antigénio com esferas CD3+CD28 na presença de IL-2 e IL-4.
Numa modalidade, a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento é obtida a partir de uma população de PBMC.
Numa modalidade, a população de PBMC ou leucócitos é reestimulada pelo menos uma vez com o mesmo antigénio após o passo (1), na presença de interleucina-2 (IL-2) e pelo menos uma interleucina selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13) .
Numa modalidade, o auto-antigénio ou antigénio de alimento é um antigénio recombinante ou sintetizado.
Numa modalidade, o antigénio de alimento é selecionado a partir do grupo que compreende ovalbumina, caseina, proteina de soja, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos. numa modalidade, o antigénio de alimento é selecionado a partir do grupo que compreende ovalbumina de ovo de galinha da sequência SEQ ID N°23, alfa Sl-caseína bovina de sequência SEQ ID N°24, beta-caseina bovina de sequência SEQ ID N°25, e sequências que têm pelo menos 70% de identidade com uma das sequências SEQ ID N° 23, SEQ ID N°24 e SEQ ID N°25.
Noutra modalidade, o auto-antigénio é selecionado a partir do grupo que compreende insulina, proteina básica da mielina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.
Numa modalidade, a população de PBMC estimulada no passo (1) contém de 0,01.106 a 100.106 células/mL, de preferência de 106 a 2.106 células/mL.
Numa modalidade, o auto-antigénio ou antigénio de alimento usado para a estimulação da população de PBMC no passo (1) está numa forma solúvel de 0,1 mg/mL a 5 mg/mL, de preferência de 1 a 2.000 mg/mL. A presente invenção é descrita adicionalmente nas figuras e exemplos a seguir. Essas figuras e exemplos são fornecidos somente para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações anexas. Os vários cenários são relevantes para muitas situações práticas, e destinam-se a ser meramente exemplificativos para aqueles peritos na técnica. Portanto, a invenção deve ser interpretada como abrangendo qualquer e todas as variações que se tornam evidentes como um resultado do ensinamento fornecido no presente documento.
LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1: Células Trl CD4+CD18brilhanteCD49b+ proliferam em resposta aos antigénios de alimentos e não têm memória para os antigénios. A) Células T purificadas CD4+ (barras cinzentas), células Trl CD4+CD18brilbanteCD4 9b+ (barras brancas) e células T de memória CD4+CD45RO+CD49b- foram estimuladas com o toxoide tetânico (10 yg/ML), PPD (20 yg/mL) ou anti-CD3+antiCD28 mAb (10 yg/mL) na presença de monócitos purificados autólogos. A proliferação foi analisada por incorporação de timidina ao dia 5. B) A mesma população que em A foi estimulada com ovalbumina (OVA, 20 yg/mL), Caseína (20 yg/mL) ou uma mistura de proteínas de soja (Soja) a 50 yg/mL). Os resultados representam a resposta proliferativa média de 10 pacientes diferentes.
Figura 2: Células T CD4+CD18brilhanteCD49b+ proliferam com antigénios de alimentos e não com antigénios de vacina. Células T CD4+ ou CD4+CD45RO+CD4 9b“ purificadas ou CD4+CD18+CD49b+ foram marcadas com CFSE e estimuladas com o antigénio diferente tal como indicado, seja um antigénio de vacina (PPD, derivado proteico purificado: tuberculina, TT: toxoide tetânico) ou antigénio de alimento (OVA: ovalbumina, Caseína ou proteína de Soja) . Após 8 dias, as células foram analisadas por citofluorometria, e a percentagem de células divididas foi analisada pela expressão decrescente de CFSE. A percentagem de células CFSEbaix0 é indicada em cada quadrante.
Figura 3: Células T proliferativas CD4+ especificas para um antigénio de alimento têm um fenótipo de perfil de citocina Trl
Marcaram-se células T CD4+ com CFSE e estimularam-se com a vacina indicada (PPD, TT) ou antigénio de alimento (OVA,
Soja, Caseína) . Purificaram-se células T CD4+ CFSEbaix0 e foram reestimuladas com um mAb anti-CD3 e anti-CD28, e após 48 horas os sobrenadantes foram analisados por ELISA para medir as quantidades das citocinas indicadas. As células T CD4+ proliferativas específicas para o antigénio de alimento apresentaram um fenótipo Trl com um nível de secreção IL-10alto IL-4~ IFN-g+/-, IL-5+/_, IL-2~, enquanto que células T específicas para o antigénio com memória apresentaram um fenótipo Thl com elevada secreção de IFN-γ.
Figura 4: Células T CD4+CD18brilhanteCD49b+ proliferam para auto-antigénio e as células especificas para o auto-antigénio apresentaram um fenótipo de citocina Trl Células T CD4+ ou CD4+CD45RO+CD4 9b“ purificadas ou CD4+CD18+CD49b+ foram marcadas com CFSE e estimuladas com um auto-antigénio (MBP: proteína básica da mielina) ou insulina conforme indicado. Após 8 dias, as células foram analisadas por citofluorometria, e a percentagem de células divididas foi analisada pela expressão decrescente de CFSE. A percentagem de células CFSEbalx0 é indicada em cada quadrante. As células T CFSEbaix0 foram purificadas e reestimuladas com mAb anti-CD3 e anti-CD28, e após 48 horas os sobrenadantes foram analisados por ELISA para medir as quantidades das citocinas indicadas. células T CD4+ proliferativas específicas para o auto-antigénio apresentaram um fenótipo Trl com níveis de secreção IL10alto IL-4- IFN-y+/-, IL-5+/“, IL-2“.
Figura 5: Células Trl podem ser observadas em pacientes que sofrem de doenças autoimunes ou alérgicas para o antigénio testado Células T CD4+ ou CD4+CD45RO+CD4 9b“ purificadas ou CD4+CD18+CD49b+ foram isoladas de um paciente que sofre de esclerose múltipla (MS) ou alergia à caseína, conforme indicado, marcadas com CFSE e estimuladas com um auto-antigénio (MBP: proteína básica da mielina) ou caseína ou derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosos (PPD) como controlo positivo conforme indicado. Após 8 dias, as células foram analisadas por citofluorometria, e a percentagem de células divididas foi analisada pela expressão decrescente de CFSE. A percentagem de células CFSEbaix0 é indicada em cada quadrante. As células T CFSEbaix0 foram purificadas e reestimuladas com mAb anti-CD3 e anti-CD28, e após 48 horas os sobrenadantes foram analisados por ELISA para medir as quantidades das citocinas indicadas.
Figura 6: Células Trl especificas para iam antigénio de alimentos não proliferaram em resposta exclusiva a IL-2 mas proliferaram vigorosamente em resposta a IL-2 e IL-4.
As células CD4+ foram marcadas com CFSE, estimuladas com os antigénios indicados e purificadas tal como na Figura 3. As células purificadas foram então expandidas na presença de apenas IL-2 (1 yg/mL) ou IL-2 e IL-4 (1 yg/mL e 500 ng/mL, respetivamente). O número de células sob as diferentes condições foi então medido e representado em relação ao número de dias após iniciação. Células T com memória para o antigénio proliferaram em resposta a IL-2 e à combinação de IL-2 e IL-4, enquanto que as células Trl específicas para o antigénio de alimento proliferaram apenas contra a combinação das citocinas IL-2 e IL-4.
Figura 7: Células Trl especificas para o antigénio expandidas com IL-2 e IL-4 mantêm o seu perfil de citocinas após a expansão
As diferentes populações de células T especificas para o antigénio tais como obtidas na Figura 5 foram estimuladas com mAb CD3 e CD28 e o seu perfil de citocinas foi determinado por ELISA nos sobrenadantes recolhidos 48 horas após estimulação. As células T especificas para PPD e TT mantiveram o seu perfil de citocinas Thl após expansão apenas com IL-2, enquanto que a adição de IL4- induziu a secreção de IL-4 nestas células tal como esperado. Pelo contrário, células Trl especificas para antigénios de alimentos mantiveram o seu perfil de citocinas mesmo após expansão na presença de IL-2 e IL-4.
Figura 8: Análise da expressão de proteina humana na linha celular S2.
Análise de citometria de fluxo a duas cores das cadeias pesada e leve de 0KT3 e expressão CD80 e CD58 em células parentais (S2) ou de fábrica celular (CF) .
Figura 9: Esquema de CF modificada em interação com uma célula Trl CD4+
As células S2 foram transfetadas com um mAb anti-CD3 ligado à membrana para envolver o complexo TCR/CD3, CD80 e CD58 na adição de alguns sinais co-estimuladores através da interação com as moléculas CD28 e CD2, respetivamente, e IL-2 e IL-4 para induzir o crescimento celular.
Figura 10: Proliferação de células T induzidas pela linha celular CF. A proliferação de PBLs policlonais, células T CD4+, linhas celulares Trl (LI e L2) ou clones Trl (Cl e C2) estimulados com a fábrica celular foi medida por incorporação de [3H]timidina entre os dias 3 e 4 de cultura. As células T foram estimuladas com células CF tal como indicado, na ausência de citocinas exógenas. Às 72 h, as células foram pulsadas com [3H]timidina e incubadas durante mais 18 h antes da recolha. Os valores de contagens por minuto são apresentados como média e erro padrão da média de culturas em triplicado.
Figura 11: Crescimento prolongado de células Trl humanas policlonais primárias estimuladas com fábrica celular.
As células Trl foram estimuladas com esferas CD3/28 mais IL-2 e IL-4 exógenas, células CF' que expressam 0KT3, CD80 e CD58 mas não IL-2 e IL-4 na presença de IL-2 e IL-4, ou com o sistema de fábrica celular completo sem qualquer adição exógena. As células T foram estimuladas com células CF nos dias 0, 10, e 20 de cultura.
Figura 12: Pureza das células T após co-cultura com a linha celular CF.
Avaliou-se a pureza das células T e após estimulação com a linha celular CF através da coloração para a expressão de CD3, CD4 durante os primeiros sete dias de cultura. A seleção da análise com base no tamanho das células/detritos não foi utilizada nesta experiência de modo a representar todas as células na cultura. As células viáveis são indicadas através da restrição da análise com base em iodeto de propídio de modo a excluir células mortas. Os resultados são representativos de >10 experiências diferentes, cada uma com um dador diferente.
Figura 13: Destino da linha celular CF após co-cultura com células T 0 destino das células estimuladoras CF foi avaliado através da coloração para a expressão de CD4 e 0KT3H durante os primeiros sete dias de cultura. A seleção da análise com base no tamanho das células/detritos não foi utilizada nesta experiência de modo a representar todas as células na cultura. As células viáveis são indicadas através da restrição da analise com base em iodeto de propidio de modo a excluir células mortas. Os resultados são representativos de >10 experiências diferentes, cada uma com um dador diferente.
Figura 14: Representação esquemática do protocolo experimental utilizado.
Figura 15: Isolamento de clones Trl específicos para OVA.
Estimulou-se PBL corado com CFSE com OVA, e corados com CD4 CD49b e CD18. Selecionaram-se para analise células CD4+CD4 9b+CDl 8brilho e foram selecionadas células CFSE. As células selecionadas foram clonadas para gerar o clone 1 e o clone 2, a população em bruto foi estimulada com OVA e corada com IL-1 e IFN-y revelando um fenótipo Trl.
Figura 16: Análise de proliferação prolongada de clones Trl
Foram então estimulados dois clones com a fábrica celular irradiada. Os números de células totais são apresentados numa representação semi-logaritmica do número de células vs. dias em cultura.
Figura 17: Perfil de citocinas de clones T 1 e 2 específicos para OVA após expansão da fábrica celular durante 7 0 dias.
Mediram-se citocinas nos sobrenadantes dos clones estimulados com OVA e monócitos irradiados autólogos. A supressão especifica para antigénio foi também examinada através de um teste de migração nos poços. Estimularam-se PBLs autólogos com mAb anti-CD3 no fundo do poço, e adicionaram-se no topo do cesto nenhumas células, células T CD4 controlo e os dois clones e estimulou-se com anti-CD3 e monócitos irradiados autólogos para células CD4 ou OVA e monócitos autólogos irradiados para os dois clones Trl. A totalidade do protocolo é representativo de dez experiências, cada uma de diferentes dadores.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: OBTENÇÃO IN VITRO DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS TR1 ESPECÍFICA PARA O AUTO-ANTIGÉNIO OU ANTIGÉNIO DE ALIMENTOS A PARTIR DE UMA POPULAÇÃO DE PBMC POR ESTIMULAÇÃO COM O AUTO-ANTIGÉNIO OU O ANTIGÉNIO DE ALIMENTO 1.1 Materiais e métodos
Purificação celular e citometria de fluxo
Recuperaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir da camada leuco-plaguetária de dadores saudáveis após centrifugação num gradiente de Ficoll. Purificaram-se linfócitos T CD4+ a partir de PBMC após remoção de células CDllb+ (OKM1-95), CD20+ (1F5C9), e CD8+
(G42-8) por seleção negativa utilizando esferas Dynabeads revestidas com anticorpos de cabra anti-ratinho (Dynal, Oslo, Noruega). Os monócitos foram purificados por aderência após cultura de PBMC durante 1 hora a 37°C em meio RPMI suplementado com 20% de FCS. Mais de 90% das células aderentes recuperadas eram monócitos CD14+. Os linfócitos T CD4+ foram separados em células T CD4 9b+CDl 8brilho ou CD4 9b+CD4 5RO+ após coloração das células com anticorpos fluorescentes e separadas num equipamento FACS vantage SE, Beckton Dickinson, Le Pont de Claix, França). Utilizaram-se os seguintes anticorpos para citometria de fluxo: FITC, CD4 de ratinho anti-humano marcado com APC ou PC5 (RPA-T4), CD3 de ratinho anti-humano marcado com PC5 (UCHT1), CD49b de ratinho anti-humano marcado com PE (12F1-H6), CD14 de ratinho anti-humano marcado com FITC (M5-E2), CD18 de ratinho anti-humano marcado com PE ou PC5 (6.7), CD25 de ratinho anti-humano marcado com PE (M-A251), HLA-DR de ratinho anti-humano marcado com PE (G46-6), CD69 de ratinho anti-humano marcado com PE (FN50), CD45RO anti-humano FITC (UCHL-1). Todos os anticorpos foram adquiridos junto da BD-Pharmingen (Le Pont de Claix, França).
Cultura celular
Para a deteção de linfócitos T específicos para o antigénio CD4+, coraram-se PBMCs (10 milhões de células/mL) ou com 0, 2 μΜ de CFSE ou com 2,5 μΜ de PKH26 (Molecular Probes, Leiden, Holanda) durante 5 minutos a 37°C em PBS lx. Após duas lavagens em PBS lx, as populações celulares foram incubadas a 2 milhões/mL em meio RPMI suplementado com 5% de soro humano AB na presença ou ausência de 200 yg/mL de
Ovalbumina de galinha, 200 yg/mL de Caseína bovina, 200 yg/mL de Insulina humana (Sigma, L'Isle d'Abeau, França), 50 yg/mL de toxoide Tetânico (Lederie, Pearl River, Nova Iorque) e 2 yg/mL de Derivado Proteico Purificado (PPD) de Mycobacterium tuberculosis (Staten serum Institute, Dinamarca) ou 50 yg/mL de MBP (Sigma, L'Isle d'Abeau, França) . Após 9 dias de cultura, as células foram coradas com CD4 de ratinho anti-humano marcado com PC5 e analisadas por citometria de fluxo. Foram também selecionadas células T CD49b+CDl8brllho ou CD49b+CD4 5RO+, coradas com 0, 2 yM de CFSE ou 2,5 yM de PKH26 e cultivada a 2 milhões/mL na presença de 4xl05 monócitos autólogos e na presença de antigénios.
Seleção e expansão de células especificas para antigénio
Após 10 dias de cultura, selecionaram-se células T específicas para o antigénio CD4+CFSE10 ou CD4+PKH26 10 num equipamento FACS vantage SE (Beckton Dickinson) e foram expandidas com PBMCs autólogas irradiadas na presença de antigénios, em meio X-vivo 15 (Biowittaker, Emerainville, França) suplementado com 10 ng/mL de IL4 e 5 ng/mL de IL2.
Deteção de citocinas A produção de citocinas foi detetada por ELISA que foram realizados em sobrenadantes de populações de células humanas (2 milhões/mL) cultivadas durante 48 horas em meio RPMI suplementado com 10% de FCS (Life Technologies, Cergy Pontoise, França) e estimuladas com 10 yg/mL de anti-CD3 revestido (UCHT1) e 1 yg/mL de anti-CD28 solúvel (CD28.2). Os anticorpos utilizados foram anticorpos de captura anti-IL10 (JES3-9D7), anti-IL4 (8D4), anti-IL2 (17H12), anti-IL5 (39D10) e anti-IFNy (A35) e anticorpos de deteção marcados com NIP anti-IL10 (JES3-12D8), anti-IL4 (MP4-25D2), anti-IL2 (B33-2), anti-IL5 (5A10) e anti-IFNy (B27) seguidos pela adição de anticorpo anti-NIP marcado com peroxidase e de ABTS. IL10, IL4 e IFNy foram da R&D systems (Minneapolis, MN) , IL2 foi da Chiron corp (Emmeryville, CA). Todos os anticorpos foram da BD pharmingen.
Medição da proliferação
Para avaliar a proliferação, as populações de células T (1 milhão de células/mL) foram estimuladas in vitro com PBMCs autólogas irradiadas e antigénios específicos em RPMI suplementado com 10% de FCS a 37°C na presença das citocinas indicadas. A proliferação de células T foi avaliada pela enumeração das células vivas. Métodos para isolar células Trl especificas para um antigénio
Os inventores desenharam métodos para isolar populações e clones de células Trl especificas para um antigénio. O primeiro método assenta na incorporação de CFSE ou qualquer corante similar (PHK). As células são marcadas com CFSE e estimuladas com um antigénio de alimento (na gama de 0,1 yg/mL a 5 mg/mL) , após 9 a 10 dias, as células são selecionadas por citofluorometria e mantidas com esferas CD3+CD28 e IL-2+IL-4. De modo a remover quaisquer outras células que poderiam não ter proliferado significativamente sob estas condições de cultura, as células poderiam também ser clonadas a uma célula por poço e os diferentes clones analisados para especificidade e secreção de citocina. 0 segundo método assenta na expressão à superfície celular de marcadores de ativação ou proliferação. As PBMCs são estimuladas com auto-antigénios ou antigénios de alimento e as células estimuladas com o antigénio são purificadas por anticorpos dirigidos contra anti-CD69, anti-CD25 ou quaisquer marcadores de ativação ou de proliferação. As células purificadas são então mantidas com estímulos CD3+CD28 e IL-2+ IL-4. Alternativamente as células podem ser mantidas com células de matriz celular e estímulo CD3/CD28, na presença de IL-2 e IL-4. As células purificadas poderiam também ser clonadas a uma célula por poço por seleção por FACS ou diluição limite. 0 terceiro método baseia-se no enriquecimento da população proliferativa após estimulação com auto-antigénios ou antigénios de alimento. As PBMCs são estimuladas com ovalbumina (ou qualquer outro antigénio de alimento) e após uma semana as células são de novo estimuladas com o mesmo antigénio na presença de IL-2 e IL-4. A combinação foi ótima, mas pode ser utilizada qualquer combinação ou período de tempo. A população enriquecida foi então clonada por diluição limite (mas poderia ser utilizada qualquer outra técnica de clonagem). Os clones foram então multiplicados por estimulação com células de matriz celular anti-CD3, CD28 e IL-2 e IL-4. Os clones em proliferação foram então analisados para especificidade e secreção de citocinas utilizando ovalbumina apresentadas por PBMCs irradiadas autólogas. 1.2 Resultados
As células Trl CD4+CD3+CD49b+CD18brilho proliferam em resposta a antigénios de alimentos e não a antigénios de vacina
Quando os inventores purificaram células Trl CD4+CD3+CD4 9b+CDl 8brllho, observaram que estas células não proliferam em resposta a antigénios de memória tal como o toxoide tetânico de PPD, ao contrário da população reciproca (Figura IA) . Também testaram a capacidade das células Trl CD4+CD3+CD4 9b+CDl 8brilh0 proliferarem com antigénios de alimentos. Tal como apresentado anteriormente, foi apenas observada uma resposta proliferativa muito minima relativamente à linha de base quando a população total de células T CD3+CD4+ foi estimulada com antigénios de alimentos (Ovalbumina, caserna, proteina de soja ou imunoglobulinas bovinas). No entanto, observaram uma resposta proliferativa vigorosa nas populações de células Trl CD4+CD3+CD4 9b+CDl 8brilh0 purificadas, enquanto que não se observou qualquer proliferação na população de memória reciproca (Figura 1B).
Deste modo, utilizaram uma técnica mais sensivel com incorporação de CFSE, e observaram que as células Trl não proliferavam com antigénios de memória, mas apresentavam uma resposta proliferativa significativa a antigénios de alimentos, tais como ovalbumina, caserna ou proteínas de soja. Pelo contrário, a população reciproca de células T CD4+ não apresentou qualquer resposta proliferativa aos antigénios de alimentos, mas proliferou vigorosamente com os antigénios de memória (TT e PPD) (Figura 2).
As células T CD4+CD3+CD49b+CD18brilho especificas para iam antigénio de alimento têm um perfil de citocina Trl.
Utilizando a técnica de incorporação CFSE (Figura 3) , os inventores isolaram por FACS as células proliferativas CFSEbaix0 e analisaram o seu perfil de citocina através de um estímulo policlonal (mAbs antiCD3+CD28). Estas experiências mostraram que células específicas para OVA, Caseína, e soja têm um perfil de citocinas Trl secretando em níveis elevados IL-10, algum IFN-γ, alguma IL-5 e nenhuma IL-2 e IL-4 como previamente descrito (Groux et al. Nature 1997). Pelo contrario, as células específicas para TT ou PPD apresentavam um fenótipo Thl que secretava principalmente IFN-γ, como esperado.
As células Trl são também especificas para auto-antigénios
Utilizando a técnica de CFSE, os inventores também analisaram a resposta proliferativa das diferentes populações de células T CD4+ aos auto-antigénios tais como MBP (proteína básica da mielina) ou insulina. De modo similar aos antigénios de alimentos, não se observou qualquer ou nenhuma resposta proliferativa na globalidade da população CD4+ (como referido) ou na população de memória CD49b+ (CD45RCU) . Surpreendentemente, observou-se uma resposta de proliferação vigorosa quando se estimularam células Trl CD4+CD3+CD49b+CDl8brilh0 purificadas com insulina ou MBP. Além disso, estas células específicas para MBP ou insulina apresentavam um perfil de citocinas trl com elevada secreção de IL-10 (Figura 4).
Podem ser isoladas células trl em pacientes que sofram de autoimunidade ou alergia ao antigénio testado
Uma vez que auto-antigénios e antigénios de alimentos foram associados a doenças, respetivamente, autoimunes ou alérgicas, os inventores analisaram a presença de células T proliferativas na população de células T CD4+CD3+CD4 9b+CDl 8brilbo purificada de pacientes que sofrem de MS (com uma doença autoimune direcionada contra um componente da mielina tal como MBP) ou pacientes com alergia a caserna. Tal como ilustrado na Figura 5, observaram que, como esperado, a estimulação com MBP ou com Caserna induz a proliferação em CD4+CD3+CD45R0+CD4 9b~ num paciente que sofra, respetivamente, de esclerose múltipla ou alergia a. caserna. A reestimulação das células proliferativas mostrou que como esperado estas células apresentavam um perfil de citocinas Thl no caso de células de um paciente que sofre de MS estimulado com MBO, e um perfil de citocinas Th2 em resposta a. Caserna no caso do paciente alérgico. No entanto, inesperadamente, também observaram uma proliferação na população de células Trl CD4+CD3+CD4 9b+CDl 8brilbo tal como num controlo normal mostrando que células Trl especificas para um auto-antigénio ou antigénio de alimentos também poderia ser observadas em pacientes que sofrem de autoimunidade ou alergia ao antigénio testado (Figura 5). A combinação de IL-2 e IL-4 é necessária para manter a proliferação de células Trl especifica para o Ag.
Apesar das células Trl (células CD4+CD3+CD4 9b+CDl 8brilho) proliferarem em resposta a auto-antigénios ou antigénios de alimentos, aquela proliferação não conseguiu ser mantida através da adição de apenas IL-2 (Figura 6) em contraste com a proliferação de células T especificas para TT e PPD (Figura 6) . Surpreendentemente, os inventores descobriram que a adição combinada de IL-2 e IL-4 permitiu a manutenção da resposta proliferativa das células Trl especificas para o auto-antigénio ou para antigénios de alimentos (Figura 7) .
EXEMPLO 2: EXPANSÃO DA POPULAÇÃO DE CÉLULAS TR1 ESPECÍFICA PARA ANTIGÉNIOS OBTIDA UTILIZANDO CÉLULAS DE MATRIZ CELULAR 2.1 Protocolo experimental
Anticorpos marcados
Para seleção de esferas:
Esferas utilizadas: "MagCellect Ferrofluid, Streptavidin" (R&D) - "Sheep anti-Rat beads" (Dako)
Para CD80: CD80 de ratinho-anti-humano biotinilado (B7-1), clone L307.4 (BD Biosciences Pharmingen)
Para 0KT3: Cadeia leve de IgK de rato anti-ratinho purificado, clone 187.1 (BD Biosciences Pharmingen)
Para seleção por FACS e marcadores de seleção usuais
Para CD80: CD80-PE (ficoeritrina) ou FITC (fluoresceina isotiocianato) de ratinho-anti-humano, clone L307.4 (BD Biosciences Pharmingen)
Para CD58: CD58-PE ou PECy5 (ficoeritrina-cianina 5) de ratinho anti-humano (LFA-3) Clone 1C3 (BD Biosciences Pharmingen)
Para 0KT3: - Cadeia pesada: IgG2a anti-ratinho biotinilado, clone R19- 15 + Estreptavidina-FITC ou Estreptavidina-PE ou Estrepta-vidina-PECy5 (BD Biosciences Pharmingen)
Cadeia leve: cadeia leve de IgK de rato-anti-ratinho purificada, clone 187.1 (BD Biosciences Pharmingen) + Coelho-anti-Rato-FITC (Dako)
Iniciadores de amplificações 0KT3-L FWD: 5'-ATGCGGATCCATGGATTTTCAAGTGCAG-3' (SEQ ID N° 9) 0KT3-L REV: 5'-ATGCGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTG-3' (SEQ ID N° 10) iniciador OKT3H1 cadeia pesada variável (571 pb): HSPAT1 FWD: 5'- ATG CCC GCG GGG TAC CCA CTG AAA ACT CTG ACT CAA C - 3' (SEQ ID N° 11) OKT3 H2/3 REV: 5'- ACT GGA CAG GGA TCC AGA GTT C - 3' (SEQ ID N° 12) iniciador OKT3H2 cadeia pesada CH1-CH3 (850 pb). OKT3 H3/5 FWD: 5'- GAA CTC TGG ATC CCT GTC CAG TG -3' (SEQ ID N° 13) OKT3 H3/3 REV: 5'- ATG CGA ATT CTT TAC CCG GAG TCC GGG AGA AGC TC -3' (SEQ ID N° 14) iniciador pdgf recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas, beta (151pb) PDGFR 5 FWD: 5'- ATG CGA ATT CGC TGT GGG CCA GGA CAC GCA G - 3' (SEQ ID N° 15) PDGFR 3 REV: 5'- ATG CGG GCC CAA GCT TCT AAC GTG GCT TCT GCC AAA G-3' (SEQ ID N° 16) IL-2 FWD: 5'- ATGCGGATCCATGTACAGGATGCAACTCCT - 3' (SEQ ID N° 17) IL-2 REV: 5 ATGCGAATTCTCAAGTCAGTGTTGAGATGA - 3' (SEQ ID N° 18) LFA3 FWD: 5'- ATGCTGGATCCATGGTTGCTGGGAGCGACGC - 3' (SEQ ID N° 19) LFA3 REV: 5'- ATGCTAAGCTTTCAATTGGAGTTGGTTCTGT - 3' (SEQ ID N° 20) IL-4 FWD: 5'- ATGCGGATCCATGGGTCTCACCTCCCAACT - 3' (SEQ ID N° 21) IL-4 REV: 5'- ATGCAAGCTTTCAGCTCGAACACTTTGAAT - 3' (SEQ ID N° 22) Clonagem e construção da fábrica celular
Clonaram-se CD80, IL-2, IL-4 e CD58 humanos de linfócitos T de sangue periférico (PBLs) obtidos de um dador saudável no vetor pAC (Invitrogen) utilizando o promotor da actina de inseto (Chung e Keller, Mol Cell Biol. 1990 Dez; 10(12): 6172-80; Chung e Keller, Mol Cell Biol. 1990 Jan; 10(1): 206-16) e transfretou-se por eletroporação (eletroporador Biorad, EUA) em células S2 da linha celular S2 depositada a 25 de março de 2005 na CNCM sob o número 1-3407. De modo similar, as cadeias pesada e leve de OKT3 (Kung et al, Science. 1979 Out 19; 206(4416) : 347) foram clonadas a partir das células de hibridoma OKT3 (ATCC CRL 8001;
Manassas, Virginia, EUA) no vetor pAC e transfetadas para as células S2 antes de FACS. De modo a obter mAb anti-CD3 ligado à membrana, removeu-se a extremidade 3' da cadeia pesada e substituiu-se pela parte transmembranar do gene do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) de células CF', ou seja, células que expressam hCD80, hCD58 e o anticorpo monoclonal (mAb) anti-CD3 e CF, ou seja células que expressam hCD80, hCD58, hIL-2 hIL-4 e o anticorpo monoclonal (mAb) anti-CD3, foram isoladas por seleção celular ativada por fluorescência FACS utilizando anticorpos tal como descrito acima. Não se utilizou qualquer marcador de seleção e selecionaram-se células que foram transfetadas de forma estável por cloração FACS. As células selecionadas foram clonadas e para cada ciclo de transfeção e seleção, foi selecionado o clone mars eficiente para a estimulação das células Trl.
Preparação de linfócitos T CD4+ e cultura de células S2
Obtiveram-se linfócitos de sangue periférico fresco por centrifugação em Ficoll hypaque é as células T CD4+ foram purificadas por seleção negativa utilizando o anticorpo anti-CD8 (Beckton Dickinson). Todas as culturas foram mantidas em X-vivo sem adição de soro (BioWhittaker,
Wlersville, MD). Adicionou-se IL-2 humana (Chiron Therapeutics, Emeryville, CA) a 20 UI/mL onde indicado, utilizou-se hIL-4 a 1 yg/mL (para comparação da vantagem biológica obtida quando as células de matriz celular expressam as interleucinas com os resultados obtidos quando se adicionam interleucinas recombinantes no meio de cultura). As células S2 foram mantidas em meio SFM sem soro (Gibco).
Citometria de fluxo e seleção por FACS
As células foram coradas com anticorpos a 4°C, e analisadas num equipamento FACSCalibur (BD BioSciences, Mountain View, CA) e selecionadas com o sistema FACStar. 2.2 Resultados
Construção de aAPCs
Para testar a hipótese de que as células Trl têm requisitos de co-estimulação distintos para o crescimento de longo prazo, os inventores desenharam um sistema baseado em células que poderia ser manipulado geneticamente para expressar diferentes moléculas e citocinas co-estimuladoras alem dos estímulos clássicos CD3/CD28. Escolheram células S2 dado que não expressam proteínas HLA humanas que iriam promover respostas alogénicas, e não poderiam ser contaminadas por virus humanos (Figura. 8). Além disso, a eventual introdução de células de matriz celular irradiadas na prática clinica pode ser evitada uma vez que estas células que crescem a 27°C são facilmente mortas a 37°C e são propagadas num meio sem soro. Os inventores transfetaram e depois clonaram as células S2 que expressam o CD80 humano, ο CD58 humano e as duas cadeias de um mAb anti-hCD3 para permitir o estimulo de células Trl humanas (CF') (Figura. 8) . De modo similar, geraram a linha CF (Figuras 8, 9) através da transfeção das células CF' com cADN de IL-4 humano e IL2. As culturas foram iniciadas através da adição de células CF a células T CD4+ frescas preparadas através de seleção negativa (ver Protocolo Experimental). A linha celular CF ativa eficientemente as células T CD4+ policlonais e as células Trl A fábrica celular foi testada relativamente à sua capacidade de estimular a ativação inicial e proliferação de células T CD4+ primárias assim como linhas de células Trl ou clones de células trl. As diferentes células T purificadas foram estimuladas com a fábrica celular numa razão 1/1. Os inventores descobriram que a velocidade inicial de crescimento das células T estimuladas com a fábrica celular era equivalente, tal como avaliado pela incorporação de [3H]timidina (Figura. 10) com um ligeiro aumento de resposta proliferativa das células Trl em relação a outras células T CD4+. Os inventores confirmaram esta observação através da marcação de células T frescas com éster carboxifluoresceina diacetato de succinimidilo (CFSE) e monitorizando a divisão celular durante os primeiros cinco dias de cultura (dados não apresentados). Também descobriram que o sistema baseado em células era mais eficiente do que as esferas CD3/28 para a indução da proliferação e da divisão celular das células T CD4+ (dados não apresentados). Não se observou proliferação quando a fábrica celular, ou as células T CD4+ eram incubadas separadamente (Figura. 10 e dados não apresentados). Assim, os requisitos para os ciclos iniciais de proliferação de células T CD4+ foram ainda mais satisfatórios com a fábrica celular em comparação com a estimulação CD3/CD28 proporcionada no contexto de esferas de poliestireno. A linha celular CF permite a expansão prolongada de células Trl humanas
De seguida, os inventores determinaram se a fábrica celular era suficiente para manter a propagação prolongada de células Trl (Figura. 11). As células Trl foram estimuladas com CF que secreta hIL-2 e IL-4, com CF' que não secreta citocinas, mas com a adição de citocinas exógenas e esferas CD3/28 com citocinas exógenas. As células estimuladas com esferas CD3/28 não proliferaram após a segunda estimulação, em concordância com estudos anteriores. Similarmente, as células Trl estimuladas com CF' no contexto de IL-2 e IL-4 adicionadas exogenamente entraram numa fase de patamar da curva de crescimento ao fim de duas ou três semanas de cultura, e não ocorreu qualquer crescimento liquido de células após a reestimulação. Pelo contrário, quando as culturas de células Trl foram estimuladas com a fábrica celular, permaneceram em crescimento exponencial mesmo após uma terceira estimulação. Este aumento da proliferação de longo prazo foi reprodutível, uma vez que o aumento médio no número total de células T foi 810 vezes superior em culturas estimuladas com a fábrica celular do que em culturas estimuladas com esferas CD3/28 em seis experiências independentes. A análise fenotipica das culturas mostrou um enriquecimento progressivo para células T CD3+CD+ após estimulação com a fábrica celular (Figura. 12) . As células S2 desapareceram rapidamente da cultura celular, tal como evidenciado por uma incapacidade em detetar as células que expressam o mAb anti-CD3 por citometria de fluxo após sete dias (Figura. 13) ; esta descoberta foi confirmada em experiências em larga escala e também por RT-PCR para genes de drosófila (dados não apresentados). Assim, a cultura mista de células T e fábrica de células origina uma população pura de células T no período de uma semana.
Propagação eficiente de células Trl especificas para um antigénio pela fábrica de células A imunoterapia com células Trl ira. provavelmente necessitar de células com funções reguladoras especificas para o antigénio. Para determinar se a fábrica celular poderia ser usada para expandir Trl especificas para o antigénio, os inventores usaram-nas para cultivar clones Trl específicos para OVA durante 10 semanas (Figura. 14)
Um exemplo de dois clones diferentes e ilustrado pela experiência que foi realizada com centenas de diferentes clones de células especificas para auto-antigénios ou antigénios de alimentos. PBLs de um indivíduo normal foram marcados com CFSE para seguir a divisão celular e as células foram estimuladas com ovalbumina (20 yg/mL) durante 7 dias. As células foram então coradas com CD4, CD18 e CD49b para selecionar células Trl que sobre-expressam estes marcadores e selecionaram-se células especificas para OVA de acordo com a diminuição na marcação CFSE devido à divisão da célula especifica para o antigénio (Figura. 15). Para controlar o seu fenótipo, a globalidade de uma população selecionada foi estimulada com OVA e a produção de citocinas foi analisada por intermédio de coloração intracitoplasmática que revelou uma população Trl tipica (Figura. 15). Após a clonagem, as células foram estimuladas com a fábrica celular (Figura. 16). Todas as células foram reestimuladas com a fábrica celular a intervalos de 10 dias. Não se proporcionou estimulação OVA especifica durante a cultura. Obtiveram-se curvas de crescimento exponenciais para ambos os clones durante vários meses. A célula Trl especifica para um antigénio resultou em l,5xl09 células após um mês e meio de cultura, um número de células suficiente para imunoterapia. A capacidade proliferativa substancial das células Trl que subsiste após 30 dias de cultura sugere que estas Trl poderiam ter um potencial de enxerto de longo prazo após transferência adotiva.
Para determinar se a especificidade ao antigénio das populações expandidas foi mantida durante a cultura, as células foram estimuladas com OVA (Figura. 17). Após um mês e meio de cultura, as células foram estimuladas com OVA e APCs autólogos e analisou-se a secreção de citocina. Observou-se um perfil tipico trl para os dois diferentes clones analisados.
Para examinar a função efetora das células Trl cultivadas, a função supressora especifica para o antigénio foi testada num teste tipico de migração em poços (Figura. 17 e dados não apresentados). Ambos os clones apresentavam um efeito supressor Trl tipico nas outras células presentes. A supressão foi devida à secreção de IL-10 e TGF-(3 tal como ilustrado pela utilização de anticorpos de bloqueio (não apresentado). Não se obteve supressão na ausência da estimulação com OVA (dados não apresentados). Obtiveram-se resultados semelhantes com diferentes dadores e diferentes clones Trl (dados não apresentados).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) GROUX, Hervé COTTREZ, Françoise <120> Obtenção de células Trl especificas para um auto-antigénio ou antigénio de alimentos a partir de uma população de PBMC ou de leucócitos <130> D23177 <150> EP 05291429.8 <151> 2005-07-01 <160> 25 <170> Patentln versão 3.3
<210> 1 <211> 708 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica OKT3-L <4 0 0> 1 atggattttc aagtgcagat ttrcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60 agaggacasa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag 180 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 240 gctcacttca ggggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cggcatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc 360 tcggggacaa agfctggaaat aaaccgggct gatactgcac caactgtatc catcttccca 420 ccatccagtg agcagtfcaac atctggaggt gcctcagtog tgtgcttctt gaacaacttc 480 taccceaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540 etgaacagtfc ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600 acgttgaçca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708
<210> 2 <211> 1560 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica 0KT3-H <400> 2 atggaaaggc actggatett. fcctacteet:g fctgfceagtaa ctgcaggtgt cc&amp;ctccCag 60 gtççagetgc agcagtctgg ggctgaaccg geaagacctg gggcctcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggett ctggctacac ctttactagg tacacgatgc actgggtaaa acag&amp;ggcct 180 ggacagggtc tggaatggat tggatseafct aafcectagee gtggttatae teattacaat 240 cagaagttca sggacaaggc esesttgact acragaeaast cctccagcac agectaeatg 300 caactgagca gcccgacatc tgaggaetcfc gcagtcfcatt actgtgcaag atattatgat 360 gatcattgct geettgacta ctggggceaa ggçaeeaetc tcacagtcfcc ctcagccaaa 420 acascagoec catcggtets tccactggcK cetgfgtgtg gagatacsac tggçtuxtcg 480 gtgactctag gatgcctggt caagggttat tt.ccctgagc eagtgacct:t gacetggaae S40 tctggatccc cgtceagtgg tgtgeaaagc ttcccagctg tcctgcagtc tgaeetctac 600 acectcagca gctcagtgas tgtaaectçg agcacctggc ccagccagtc eaieaectgc 660 aatgtggccc acccggcaag cagcacca.ag gtggacaaga aaettgagcc cag&amp;gggccc 320 acaatcaage cctgtcctcc atgcsaatgc ceageaccta acctcttggg tggaccatcc 780 gtcttcatct tocctccasá gatcaaggat gtaetcatga tciccctgag ccccatagtc 840 acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat g&amp;cccagatg tccagafccag ctggtttgtg 960 aacaacgtgg aagtacaeac agctcagaca caaaeccata gagaggatta caacagtact 960 ctccgggtgg tcagtgccct ccccstecag cacçaggact ggatgagtgg caaggagttc 1020 aaatgcaagg tcsaeaeeaa agacctccca gcgcecatcg agagaaccat ctcaasaccc 1080 aaaggqtcag taagagctec acaggtãfc-at gtcttgqetc esee&amp;g&amp;&amp;§3 agag&amp;tgact 1140 sagaascagg tcaetctgac etgcatggfe seagsettes tgcctgaâga catttacgtg 1200 gagtggacca acascgggsa aacagageta asctâcsaga aeacfgaacc agtcctggac 1260 tctgatggtt cttacttcat gtscagcaag ctgagagtgg aaaagsagaa ctgggtggaa 1320 agaaatagot actcctgtfcc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1360 agcttctccc ggaetccggg taaagaatte gctgtgggcc aggacacgca ggaggtcatc 1440 gtggtgccae aetccttgec ctttaaggtg gtggtgatct cagccatcct ggccctggtg 1500 gtgctcacca tcatctccct tatcatáctc atcatgcttt ggc&amp;gaagaa gacacgttag 1560
<210> 3 <211> 867 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica CD80 <400> 3 atgggcesea. eaeggaggea gggaaeatcs ccatccaagt gtccatacct câstttcttt 60 cagctettgg tgctggctgg tcittctcac tfcetgtteag gtgfcfcafceca egtgaccaag 120
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atagtaccaa tttetaatat aacagaaaat gtgtacataa atttgacctg ctcatctata 4SO cacggttacc eagaacctaa gaagâtgagt gttfctgcfcaa gaaccaagaa tteaactatc &amp;4Ô gagtatgatg giattatgca gaaatcfccaa gataatgtea cagaactgta cgacgttfcce 600 stcagcttgt ctgfcttcatt ccctgatgtt acgaçcaata tgsccatcfcfe cigtattctg 660 gaaactgaca agacgcggct: tttatettcs cotttctcta tagagcttga ggaecetcag 7 20 cet.ceeccag aecaeaitee ttggattaea gcfcgtacttc caacagttat fcatatgtgfeg 700 atggttttet gtctaafctet atggaaatgg aagaagaaga agcggccteg caactc-ttat 840 asatgtggaa ccaacacaat ggagagggaa gagagtigaac agaccaagaa aagagaaaaa 900 âtGcatâtac ctgaaagste tgatgaagcs eagegfcgttfc ttaaaagfctc gaagacatef 960 tcâtgcgaca aaagfcgâtâC atgtttttaâ 990
<210> 5 <211> 462 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica IL2 <400> 5 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctectggâ ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462
<210> 6 <211> 753 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica CD58 (LFA3) <400> 6 atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60 cactgctttg gttfceateag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat 120 gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag 180 gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaaiagg 240 gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc 3ctatctaca acttaacate atcagatgaa 300 gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtg 360 cttgagtcte ttccatctcc cacactaact tgtgcattga ctaatggaag cattgaagtc 420 caatgcatga taccagagca ttacaacagc catcgaggac ttataatgta ctcatgggat 480 tgtcctatgg agcaatgtaa acgtaactca accagtatat attttaagat ggaaaatgat 540 cttccacaaa aaatacagtg tactcttagc aatecattat ttaatacaac atcatcaatc 600 attttgacaa cctgtatccc aagcagcggt .cattcaagac acagatatgc acttataccc 660 ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatggtat tctgaaatgt 720 gacagaaaac cagacagaac caactccaat tga 753
<210> 7 <211> 462 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica IL4 <400> 7 atgggtctca cctcccaact gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg tgccggcaac 60 tttgtccacg gacacaagtg cgatatcacc ttacaggaga tcatcaaaac tttgaacagc 120 ctcacagagc agaagactct gtgcaccgag ttgaccgtaa cagacatctt tgctgcctcc 180 aagaacacaa etgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 240 agccaccatg agaaggacae tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac 300 aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gaeaggaacc tctggggcct ggcgggcttg 360 aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta 420 aagacgatca tgagagagaa atattcaaag tgttcgagct ga 462
<210> 8 <211> 441 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de ácido nucleico que codifica IL13 <400> 8 atgcatccgc tcotcaatcc tctcctgttg gcactgggcc tcatggcgct tttgttgacc 60 acggtcattg ctctcacttg ccttggoggc tttgcctcco caggccctgt gcctccctct 120 acagccctca gggagctcat tgaggagctg gtcaacatca cccagaacca gaaggctccg 180 ctctgcaatg gcagcatggt atggagcatc aacctgacag ctggcatgta ctgtgcagcc 240 ctggaatccc tgatcaacgt gtcaggctgc agtgccatcg agaagaccca gaggatgctg 300 agcggattct gcccgcacaa ggtctcagct gggcagtttt ocagcttgca tgtccgagac 360 accaaaatcg aggtggccca gtttgtaaag gacctgctct tacatttaaa gaaacttttt 420 cgcgagggac agttcaactg a 441
<210> 9 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <400> 9 atgcggatcc atggattttc aagtgcag 28
<210> 10 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 10 atgcgaattc ctaacactca ttcctgttg 29
<210> 11 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 11 atgcccgcgg ggtacccact gaaaactctg actcaac 37
<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 12 actggacagg gatccagagt tc 22
<210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador sintético <4 0 0> 13 gaactctgga tccctgtcca gtg 23
<210> 14 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 13 gaactctgga tccctgtcca gtg 23
<210> 14 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 14 atgcgaattc tttacccgga gtccgggaga agctc 35
<210> 15 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 15 atgcgaattc gctgtgggcc aggacacgca g 31
<210> 16 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 16 atgcgggccc aagcttctaa cgtggcttct tctgccaaag 40
<210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 17 atgcggatcc atgtacagga tgcaactcct 30
<210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 18 atgcgaattc tcaagtcagt gttgagatga 30
<210> 19 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <4 0 0> 19 atgctggatc catggttgct gggagcgacg c 31
<210> 20 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <400> 20 atgctaagct ttcaattgga gttggttctg t 31
<210> 21 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <400> 21 atgcggatcc atgggtctca cctcccaact 30
<210> 22 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Sintético <400> 22 atgcaagctt tcagctcgaa cactttgaat 30 <210> 23 <211> 386 <212> PRT <213> Gallus sp. <22 0> <223> Ovalbumina de ovo de Galinha <400> 23
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Asp Thr Gin Ala Met Fro Fhe Arg Val Tbr Glu Gin Glu Ser lys Fro 195 200 205
Val Sin Met Met Tyr Gin lie Sly Leu Fhe ftrg Val Ala Ser Met Ala 210 215 220
Ser Glu Lys Met Lye lie Leu Glu Leu Fro Fhe Ala Ser Gly Thr Met 225 230 235 240
Ser Met Leu Val Leu Leu Fro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gin Leu 245 250 255
Glu Ser lie lie Asn She Glu Ly$: Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn 260 265 2?0
Val Met Gin Glu Arg Lys lie Lys Val Tyr Leu Fro Arg Met Lys Met 275 280 285
Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ale Met Gly lie Thr 230 295 300
Asp Val Fhe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ik Ser Ser Ala Glu 305 310 315 320
Ser Leu Lys He Ser Gin Ala Val Hie Ala Ala His Ala Glu lie Asn
325 330 33S
Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala 340 345 350
Ala Ser Val Ser Glu Gin She Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys 355 360 365
Ila Lys His lie .Ala Thr Asn Ala Val Leu Fhe Fbe Gly Arg Cys Val 370 375 380
SerFro 385 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> alfa Sl-Caseina Bovina <400> 24
Met Lys Leu Leu He Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg
1 5 10 IS
Pro Lys His Pro He Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu Asn 20 25 30
Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Fhe Gly 35 40 45
Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp He Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60
Glu Asp Gin Ala Met Glu Asp He Lys Girt Met Glu Ala Glu Ser lie €5 70 75 @0
Ser Ser Ser Glu Glu He Val Pro Asn Ser Val Glu Gin Lys His lie 85 90 35
Gin Lys Glu. Asp Val pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gin 100 105 110
Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gin Leu Glu lie Val Fro US ' 120 125
Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly He His Ala 130 135 140
Gin Gin Lys Glu Pro Met He Gly Val Asn Gin Glu Leu Ala Tyr Phe 45 150 155 ' 160
Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gin Phe Tyr Gin Leu Asp Ala Tyr Pro Ser 165 170 175
Giy Ala Trp Tyr' Tyr Vai Fro Leu Gly Thr Girt Tyr Thr Asp Ala Fro 180 185 ISO
Ser Phe Ser Asp lie Pro Asn Pro lie Giy Ser Glu Asn Ser Glu Lys 195 200 205
Thr Thr Met Fro Leu. Trp 210 <210> 25 <211> 224 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> Beta-caseína bovina <400> 25
Met Lys Val Leu lie Leu Ale Cys Leu Val Ale Lee Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15
Glut Lee Glu GXu Leo Asn Val Pro Gly Glu He Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30
Ser Ser Glu Glu Ser Ik Thr Arg He A$n Lys Lys lie Glu Lys Phe 35 40 45
Gin Ser Glu Gits Gin Gin Gin Thr Glu Asp Glu Leu Girs Asp Lys He 50 55 60 fils Pro Phe Ala Gin Thr Gin Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro 65 70 IS 80 lie Bis Asn Ser Leu Pro Gin Asn He Pro Pro Leu Thr Gin Thr Pro 85 90 95
Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gin Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys 100 105 110
Val Lys Glu Ala Mat Ala Pro Lys His Lys 61u Met Pro Phe Pro Lys 115 120 125
Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gin Ser Leu Thr Leu Thr Asp 130 135 140
Val Glu Asn Leu Hi-S Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gin Ser Trp Met His 145 150 155 160
Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gin Series 170 175
Val Leu Ser Leu Ser Gin Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gin Lys Ala 180 185 190
Vai Fsro Tyr Pro Cio Arg Asp Hat Pro lia Gin Ma Phe Leu Leu Tyr
195 200 20S
Gin Gin Pro Vai Lao Giy Pro Vai &amp;rg Gly Pro Phe Pro lie lie Vai 210 215 ‘ 220
Lisboa,

Claims (39)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas de ser humano (PBMC), sendo que o método é caracterizado por consistir em: 1) estimular a PBMC de ser humano ou população de leucócitos com o auto-antigénio ou antigénio de alimento, 2) recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir da população de células estimuladas, desde que o dito método não compreenda estimular linfócitos sanguíneos periféricos de ser humano com ovalbumina.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento ser obtida a partir de uma população de PBMC.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a população de PBMC ou leucócitos ser reestimulada pelo menos uma vez com o mesmo antigénio após o passo (1), na presença de interleucina-2 (IL-2) e pelo menos uma interleucina selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13) .
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o auto-antigénio ou antigénio de alimento ser um antigénio recombinante ou sintetizado.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o antigénio de alimento ser selecionado a partir do grupo que compreende caseína, proteína de soja, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o antigénio de alimento ser selecionado a partir do grupo que compreende alfa Sl-caseína bovina de sequência SEQ ID N°24, beta-caseína bovina de sequência SEQ ID N°25, e sequências que têm pelo menos 70% de identidade com uma das sequências SEQ ID N°24 e SEQ ID N°25.
  7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o auto-antigénio ser selecionado a partir do grupo que compreende insulina, proteína básica da mielina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado por a população PBMC estimulada no passo (1) conter de 0,01x10s a 100x10s células/mL, de preferência de 106 a 2xl06 células/mL.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o auto-antigénio ou antigénio de alimento utilizado para estimulação da população de PBMC no passo (1) estar numa forma solúvel de 0,1 pg/mL a 5 mg/mL, de preferência de 1 a 2.000 pg/mL.
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a população de PBMC ou de leucócitos ser incubada, antes da estimulação no passo (1), com um marcador fluorescente da divisão celular que permite determinar, por citofluorometria, que quando a intensidade de fluorescência da população de células estimulada é pelo menos duas vezes inferior à intensidade de fluorescência da população PBMC ou de leucócitos, que ocorreu divisão celular na referida população de células estimuladas, e que a referida população de células estimuladas que é recuperada no passo (2) compreende a população de células Trl específica para o antigénio.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o marcador fluorescente da divisão celular ser o marcador éster carboxifluoresceína diacetato de succinimidilo (CFSE), o marcador diacetato do ácido carboxílico verde oregon 488 (Carboxi-DFFDA SE) ou o marcador PKH26.
  12. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por a população de células Trl específicas para o antigénio ser recuperada no passo (2) por citofluorometria utilizando anticorpos marcados com fluorescência direcionados contra proteínas presentes à superfície das células da referida população de células Trl específicas para o antigénio.
  13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por a população de células Trl específicas para o antigénio ser recuperada no passo (2) por uma técnica de clonagem, tal como vantajosamente pela diluição limite.
  14. 14. Método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas de ser humano (PBMC), sendo que o método é caracterizado por compreender: a) recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento do passo 2, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e, b) expandir a dita população de células Trl especificas para antigénio ao contatar a dita população de células Trl especificas para antigénio com esferas CD3+CD28 na presença de IL-2 e IL-4.
  15. 15. Método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas de ser humano (PBMC), sendo que o método é caracterizado por compreender: a) recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento do passo 2, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e, b) expandir a dita população de células Trl especificas para antigénio num meio de cultura Mp, em que o dito passo de expansão compreende: i. cultivar numa temperatura TI num meio de cultura Mf, células de matriz celular capazes de expressar um grupo de fatores recombinantes que interagem com as seguintes proteínas de superfície celular da população de células Trl específicas para antigénio a ser expandida: - o complexo de proteína CD3/TCR, - a proteína CD28, - a proteína CD2, - o recetor de interleucina-2 (IL-2), e - o recetor de interleucina-4 (IL-4), tal Tl permite a proliferação das ditas células de matriz celular, ii. contatar as células de matriz celular no passo (a) separadas ou não do seu meio de cultura Mf, com a população de células Trl específicas para antigénio contida no meio de cultura Mp, em que o dito meio de cultura Mp não contém inicialmente o grupo de fatores, a fim de obter uma mistura que contém a população de células Trl específicas para antigénio, as células de matriz celular e o meio de cultura Mp, iii. cultivar a mistura obtida no passo (b) que contém os fatores do grupo que são expressos pelas células de matriz celular no meio de cultura Mp, em que o dito passo (c) de cultivação é executado a uma temperatura T2 que é pelo menos cerca de 35°C, de modo que: - a população de células Trl específicas para antigénio prolifere, e - as células de matriz celular não proliferem, e em que a população de células Trl específicas para antigénio é expandida, iv. recuperar a população de células Trl específicas para antigénio assim expandida.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por as células de matriz celular morrerem durante o passo (ill) .
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por no passo (iv) os fragmentos de membrana celular das células de matriz celular que resultam da morte das ditas células serem eliminados.
  18. 18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado por o grupo de fatores compreender fatores ancorados à membrana celular das células de matriz celular e fatores secretados pelas ditas células de matriz celular.
  19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado por as células de matriz celular serem células recombinantes e conterem ácidos nucleicos heterólogos que codificam os fatores do dito grupo.
  20. 20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado por as células de matriz celular não terem qualquer molécula de complexo major de histocompatibilidade (MHC) de classe intrínseca I e/ou II em sua superfície.
  21. 21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado por no passo (ii) as células de matriz celular serem separadas de seu meio de cultura Mf.
  22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado por as células de matriz celular serem células de matriz celular de inseto, sendo que TI é inferior a T2.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as células de matriz celular de inseto serem da linha celular S2 de drosófila depositada em 25 de março de 2005 na National Collection of Microorganisms Cultures (CNCM) sob a designação 1-3407.
  24. 24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado por o meio de cultura Mp ser um meio de cultura sem soro.
  25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 24, caracterizado por o meio de cultura Mf ser um meio de cultura sem soro.
  26. 26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, caracterizado por o grupo de fatores recombinantes compreender: - o anticorpo anti-CD3 modificado, em que a modificação do anticorpo anti-CD3 consiste na substituição do domínio intracitoplasmático anti-CD3 da cadeia pesada de anti-CD3 com um domínio transmembranar, sendo que o dito anticorpo anti-CD3 modificado é ancorado à membrana celular das células de matriz celular e é suscetível à interação com o complexo proteico CD3/TCR das células T, ou uma variante dos mesmos, - a proteína CD80 ou CD86, de preferência a proteína CD80, ancorada à membrana celular das células de matriz celular, que é suscetível à interação com a proteína CD28 das células T, ou uma variante da mesma, e - a proteína CD58, ancorada à membrana celular das células de matriz celular, que é suscetível à interação com a proteína CD2 das células Trl, ou uma variante da mesma, - a proteína secretada pelas células de matriz celular, que é suscetível à interação com o recetor de IL-2 das células Trl, ou uma variante da mesma, e uma interleucina selecionada a partir do grupo que compreende IL-4 e interleucina 13 (IL-13), de preferência IL-4, sendo que a dita interleucina é secretada pelas células de matriz celular e é suscetível à interação com o recetor de IL-4 das células Trl, ou uma variante do mesmo.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o domínio transmembranar que substitui o domínio intracitoplasmático da cadeia pesada de anticorpo anti-CD3 de domínio transmembranar do recetor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF).
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado por os fatores do dito grupo serem de origem humana.
  29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por: a cadeia leve do anticorpo anti-CD3 modificado ser codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°l, ou qualquer ácido nucleico que tem pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°l, e em que a cadeia pesada do anticorpo anti-CD3 modificado é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°2, ou qualquer ácido nucleico que tem pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°2; e/ou - o método, conforme definido na reivindicação 30 ou 31, em que a proteina CD80 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°3, ou qualquer ácido nucleico que tem pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°3, e/ou - o método, conforme definido na reivindicação 30 ou 31, em que a proteina CD86 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°4, ou qualquer ácido nucleico que tem pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°4, e/ou o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33, em que a proteina CD58 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°6, ou qualquer ácido nucleico que tem pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°6, e/ou o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 34, em que a IL-2 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°5, ou qualquer ácido nucleico que têm pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°5, e/ou o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que a IL-4 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°7, ou qualquer ácido nucleico que têm pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°7, e/ou o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 36, em que a IL-13 é codificada pelo ácido nucleico heterólogo de sequência SEQ ID N°8, ou qualquer ácido nucleico que têm pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°8, e/ou
  30. 30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 2 9, caracterizado por a população de células Trl especificas para antigénio assim expandida ser recuperada no passo (iv) após ter cultivado a população de células Trl especificas para antigénio no passo (iii) durante pelo menos 12 horas, vantajosamente 24 horas.
  31. 31. Método in vitro para a obtenção de uma população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir de uma população de leucócitos de ser humano ou uma população de células mononucleares sanguíneas periféricas de ser humano (PBMC), sendo que o método é caracterizado por consistir em: 1) estimular a PBMC de ser humano ou população de leucócitos com o auto-antigénio ou antigénio de alimento, 2) recuperar a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento a partir da população de células estimuladas, e 3) expandir uma população de células Trl especificas para antigénio ao contatar a dita população de células Trl especificas para antigénio com esferas CD3+CD28 na presença de IL-2 e IL-4.
  32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a população de células Trl especificas para auto-antigénio ou antigénio de alimento ser obtida a partir de uma população de PBMC.
  33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado por a população de PBMC ou leucócitos ser reestimulada pelo menos uma vez com o mesmo antigénio após o passo (1), na presença de interleucina-2 (IL-2) e pelo menos uma interleucina selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13) .
  34. 34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado por o auto-antigénio ou antigénio de alimento ser um antigénio recombinante ou sintetizado.
  35. 35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado por o antigénio de alimento ser selecionado a partir do grupo que compreende ovalbumina, caseína, proteína de soja, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.
  36. 36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o antigénio de alimento ser selecionado a partir do grupo que compreende ovalbumina de ovo de galinha da sequência SEQ ID N°23, alfa Sl-caseína bovina de sequência SEQ ID N°24, beta-caseína bovina de sequência SEQ ID N°25, e sequências que têm pelo menos 70% de identidade com uma das sequências SEQ ID N° 23, SEQ ID N°24 e SEQ ID N°25.
  37. 37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizado por o auto-antigénio ser selecionado a partir do grupo que compreende insulina, proteína básica da mielina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.
  38. 38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 37, caracterizado por a população PBMC estimulada no passo (1) conter de 0,01x10s a 100x10s células/mL, de preferência de 106 a 2xl06 células/mL.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o auto-antigénio ou antigénio de alimento utilizado para estimulação da população de PBMC no passo (1) estar numa forma solúvel de 0,1 pg/mL a 5 mg/mL, de preferência de 1 a 2.000 pg/mL. Lisboa,
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