PL238336B1 - Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych - Google Patents
Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych Download PDFInfo
- Publication number
- PL238336B1 PL238336B1 PL430932A PL43093219A PL238336B1 PL 238336 B1 PL238336 B1 PL 238336B1 PL 430932 A PL430932 A PL 430932A PL 43093219 A PL43093219 A PL 43093219A PL 238336 B1 PL238336 B1 PL 238336B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- antigen
- specific
- treg
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 104
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 104
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 104
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 title claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 125
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 107
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 54
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 25
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 24
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 26
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 23
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 23
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 23
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 22
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 16
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 12
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 8
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 8
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 6
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 6
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 6
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 6
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 6
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 6
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 3
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 3
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 102100035472 DNA polymerase iota Human genes 0.000 description 2
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 2
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001094672 Homo sapiens DNA polymerase iota Proteins 0.000 description 2
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 2
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101500027988 Mus musculus ADGRV1 subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100025470 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Human genes 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000914320 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000025237 Polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- YDONNITUKPKTIG-UHFFFAOYSA-N [Nitrilotris(methylene)]trisphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CN(CP(O)(O)=O)CP(O)(O)=O YDONNITUKPKTIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 229940046731 calcineurin inhibitors Drugs 0.000 description 1
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008938 immune dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000002602 induced regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002501 natural regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania in vitro antygenowo specyficznych limfocytów T regulatorowych (CellTrAg) pozwalająca na kliniczne zastosowanie tych komórek w terapii chorób o podłożu autoimmunologicznym takich jak np. stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca typu 1, a także do hamowania niepożądanych reakcji immunologicznych w tym między innymi odrzucania przeszczepu, reakcji alergicznych i choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (ang. graft versus host disease GVHD).
limfocyty T regulatorowe stosowane do tej pory w terapii mają charakter poliklonalny (rozpoznają wiele różnych antygenów) i dlatego ich skuteczność może być ograniczona (Marek-Trzonkowska N 2014) (Trzonkowski P 2013) (Marek-Trzonkowska N 2013) (Marek-Trzonkowska N 2012) (Hoffmann P 2009) (Trzonkowski P 2009) (Di lanni M 2011) (Bluestone JA 2015) (Stelmaszczyk-Emmel A 2015) (Vignali DA 2008) (Geem D 2015).
Niniejszy sposób (metoda) pozwala na kierowanie limfocytów Treg do tkanek wykazujących ekspresję konkretnych antygenów oraz przeciw konkretnym limfocytom autoreaktywnym odpowiedzialnym za reakcję zapalną przeciw konkretnym antygenom. Zastosowanie imfocytów Treg specyficznych antygenowo pozwoli na precyzyjniejsze leczenie i zmniejszenie dawki limfocytów Treg, a w konsekwencji zwiększy efektywność leczenia i zredukuje możliwe efekty uboczne.
Podstawy wynalazku
Limfocyty Treg stanowią około 1% wszystkich limfocytów krwi obwodowej, lecz mają istotne znaczenie dla utrzymania tolerancji własnych tkanek (Trzonkowski P 2009)(Vignali DA 2008) (Yi S 2012). Brak komórek regulatorowych prowadzi do wystąpienia szeregu chorób autoimmunizacyjnych oraz nadwrażliwości, co widać na przykładzie pacjentów ze sprzężonym z chromosomem X zespołem dysregulacji immunologicznej, poliendokrynopatii i enteropatii (ang. immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked; IPEX) (Gambineri E 2003). Limfocyty Treg można nazwać „inteligentnymi sterydami”, ponieważ podobnie do sterydów hamują reakcje zapalne i działają immunosupresyjnie, ale w przeciwieństwie do nich fizjologiczne działanie supresorowe komórek Treg dotyczy tylko reakcji patologicznych (np. skierowanych przeciwko własnym tkankom). Wyniki badań klinicznych, w których zastosowano komórki Treg- w tym również obserwacje twórców wskazują, że terapia limfocytami Treg jest bezpieczna i nie upośledza odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcym oraz niebezpiecznym antygenom (wirusy, bakterie, komórki nowotworowe) (Marek-Trzonkowska N 2012) (Marek-Trzonkowska N 2014) (Martelli MF 2014) (Bluestone JA 2015).
Zespół badawczy twórców niniejszego wynalazku od ponad 10 lat prowadzi badania nad biologią i klinicznym zastosowaniem limfocytów Treg. Jako pierwsi użyli namnożonych in vitro komórek Treg najpierw w terapii choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD) u osób dorosłych (NKEBN/458310/2008) (Trzonkowski P 2009), a następnie w cukrzycy typu 1 (DM1) u dzieci (TregVAC
ISRCTN06128462; TregVAC2.0EudraCT:2014-004319-35) (Marek-Trzonkowska N 2012) (MarekTrzonkowska N 2014) i w stwardnieniu rozsianym (TregSM EudraCT:2014-004320-22) (Trzonkowski P 2015). Obecnie badania kliniczne z zastosowaniem komórek Treg prowadzone są również przez inne ośrodki na świecie i dotyczą terapii/prewencji GVHD (Di Ianni M 2011), leczenia DM1 u osób dorosłych (NCT01210664), a także indukcji tolerancji w przeszczepie nerki (m.in. NCT02091232 i NCT02129881) oraz wątroby (ThRIL NCT02166177 i NCT01624077). W ostatnich latach rozpoczął się więc dynamiczny rozwój terapii komórkowych wykorzystujących limfocyty Treg jako narzędzie terapeutyczne. Obecnie prowadzonych jest około 40 badań klinicznych z tymi komórkami na świecie Wszystkim tym projektom przyświeca jeden cel, a mianowicie inteligentna immunosupresja, która pozwoliłaby na zahamowanie niepożądanych reakcji immunologicznych bez upośledzenia fizjologicznej odpowiedzi odpornościowej (Trzonkowski P 2015, Gliwiński M 2017).
W zasadniczej większości tych badań limfocyty Treg są pozyskiwane z krwi obwodowej chorego lub z jednostek krwi pępowinowej. Najlepszą metodą izolacji jest użycie sortera komórkowego, dzięki któremu uzyskuje się bardzo czystą (97-100%) populację tych komórek. Zwykle izolowane są limfocyty o fenotypie CD3+CD4+CD25high albo CD3+CD4+CD25highCD127-albo CD3+CD4+CD25highCD127low (zgłoszenie P. 399447) (Trzonkowski P 2009) (Marek-Trzonkowska N 2012) (Marek-Trzonkowska N 2014) (Trzonkowska P 2015). Następnie wyizolowane komórki sa aktywowane do intensywnej proliferacji przez 10-14 dni do uzyskania ilości wystarczającej do podania pacjentowi. Efektywna ekspansja musi być prowadzona w warunkach z jednoczesnym utrzymaniem pełnego fenotypu, w tym zwłaszcza
PL 238 336 B1 wysokiej ekspresji czynnika FoxP3, czemu służą określone działania laboratoryjne (Marek N 2011, Gołąb K 2013, Marek-Trzonkowska N 2017). Dodatkowo, hodowla w takim schemacie do zastosowań klinicznych musi być prowadzona zgodnie ze standardami dobrej praktyki produkcyjnej (ang. good manufacturing practice; GMP) ponieważ preparat limfocytów Treg jest klasyfikowany jako produkt terapii zaawansowanej (Advanced Therapy Medicinal Product ATMP) i podlega prawu farmaceutycznemu i rozporządzeniu nr 1394/2007 Parlamentu Europejskiego „w sprawie produktów leczniczych terapii zaawansowanej”.
Użycie komórek wytworzonych według powyższego schematu implikuje ich polispecyficzność jest to zbiór limfocytów o swoistości przeciw wielu różnym antygenom, a co za tym idzie ich skuteczność po podaniu jest ograniczona. Oczywiście to, że wszystkie limfocyty Treg mają tropizm do miejsc zapalenia, zdolność do regulacji typu „bystander” oraz możliwości konwertowania innych komórek do fenotypu regulatorowego na zasadzie infekcyjnej tolerancji wpływają na wysoką skuteczność preparatów polispecyficznych (poliklonalnych). Niemniej jednak skuteczność takiego preparatu można zwiększyć poprzez ukierunkowanie komórek na konkretne antygeny. W ten sposób takie antygenowo specyficzne limfocyty Tregs mogłyby migrować jedynie do miejsc, w których występuje ekspresja takich antygenów i wybiórczo hamować aktywność patologicznych limfocytów efektorowych rozpoznających takie antygeny jedynie w miejscu reakcji zapalnej wywołanej stymulacją takim antygenem. W przypadku chorób autoimmunologicznych możliwe byłoby zahamowanie niszczenia zaatakowanych narządów (np. wysp trzustkowych produkujących insulinę w cukrzycy typu 1 czy osłonek mielinowych nerwów w stwardnieniu rozsianym). Jednocześnie ograniczałoby to ogólnoustrojowe działania uboczne limfocytów Tregs, które zamiast krążyć po całym układzie chłonnym wykazywałyby tropizm jedynie do miejsc z ekspresją swoistego antygenu, na który są uczulone.
Użyteczność takich antygenowo specyficznych limfocytów Treg została opisana w modelach zwierzęcych, a kilka lat temu pojawiły się pierwsze próby pozyskania takich komórek u ludzi. Początkowo dotyczyło to raczej indukowanych limfocytów Treg i komórek Tri, a następnie naturalnych limfocytów Treg. W przypadku tych ostatnich stosowane metody opierają się o użycie naturalnie występujących komórek prezentujących antygen lub odpowiednio przygotowanych komórek z linii komórkowych, które prezentują określone antygeny. W ostatnim czasie próbuje się także modyfikacji genowych polegających na wszczepieniu limfocytom regulatorowych sztucznego receptora o specyficzności przeciw konkretnemu antygenowi (tzw. limfocyty Treg CAR).
Opracowanie bezpiecznej, prostej do zastosowania i jednocześnie ekonomicznie opłacalnej metody namnażania stabilnych limfocytów Treg o określonej specyficzności antygenowej oraz wysokim potencjałem supresorowym ma kluczowe znaczenia dla rozwoju i sukcesu badań klinicznych wykorzystujących komórki Treg jako narzędzie terapeutyczne.
Możliwość antygenowo specyficznej regulacji odpowiedzi immunologicznej ma istotne znaczenie z terapeutycznego punktu widzenia. Fizjologicznie układ odpornościowy rozpoznaje i niszczy obce oraz niebezpieczne antygeny, jednocześnie tolerując własne tkani. Niemniej jednak w przypadku chorób autoimmunologicznych takich, jak np. stwardnienie rozsiane (ang. multiple sclerosis; MS), cukrzyca typu 1 (ang. diabetes mellitus type 1; DM1), łuszczyca, toczeń rumieniowaty układowy (ang. systemie lupus erythematosus; SLE) czy reumatoidalne zapalenie stawów (ang. rheumatoid arthritis; RA) dochodzi do upośledzenia tego mechanizmu (Senecal V 2015) (Trzonkowski P 2015) (Marek-Trzonkowska N 2012) (Pujol-Autonell 1 2013) (Lima XT 2015) (Mu Q 2015) (Orent W 2015). Limfocyty efektorowe zaczynają niszczyć własne narządy chorego traktując autoantygeny budujące własne tkanki jako obce. Proces ten prowadzi do nieodwracalnych zmian. Obecnie leczenie chorób autoimmunologicznych sprowadza się najczęściej do immunosupresji farmakologicznej oraz hamowania odpowiedzi zapalnej. Taka terapia okazuje się jednak nieskuteczna na przestrzeni czasu. Mimo początkowej poprawy, nie udaje się całkowicie zahamować postępu choroby, a jej przerwanie zwykle wiąże się z zaostrzeniem choroby. Leczenie to jest ponadto związane z głębokim obniżeniem odporności (Gupta S 2012). W związku z tym pacjent staje się podatny na infekcje, które u chorych przyjmujących leki immunosupresyjne mają znacznie poważniejszy przebieg niż o osób zdrowych. Niespecyficzna immunosupresja to ponadto wzrost ryzyka rozwoju nowotworów (wyższy odsetek zachorowań wśród chorych przyjmujących leki immunosupresyjne) (Andras A 2005) (Rama I 2010).
Antygenowo specyficzna regulacja odpowiedzi immunologicznej to również istotne zagadnienie z punktu widzenia transplantologii. Przeszczep narządowy jest zwykle procedurą ratującą życie, wiąże się jednak z koniecznością stałego przyjmowania silnych leków immunosupresyjnych. Przerwanie terapii wiąże się z nasileniem odpowiedzi immunologicznej przeciw tkankom przeszczepionego narządu, co
PL 238 336 B1 w krótkim czasie prowadzi do jego zniszczenia. Stosowanie leków immunosupresyjnych, podobnie jak w przypadku terapii chorób autoimmunologicznych, jest obarczone występowaniem poważnych niepożądanych skutków ubocznych. Ponadto, niektóre z tej grupy leków mimo, że chronią przeszczepiony narząd przed niszczącym wpływem układu immunologicznego pacjenta, równocześnie działają toksycznie na przeszczep lub inne tkanki. Przykład stanowią tu nefrotoksyczne inhibitory kalcyneuryny (cyklosporyna i takrolimus) stosowane w przeszczepie nerki (Prókai A1 2015) lub stosowana u biorców wysp trzustkowych rapamycyna, która upośledza działanie przeszczepionych komórek (Zhang N1 2006) (Berney T 2009). Problem immunosupresji i regulacji odpowiedzi immunologicznej związany jest również ściśle z przeszczepami szpiku. Zasadnicza różnica pomiędzy przeszczepem narządowym, a przeszczepem szpiku polega na tym, że w przypadku pierwszego medycyna próbuje ochronić przeszczepiony organ przed niszczącym działaniem układu immunologicznego biorcy, natomiast w przypadku drugiego nie ma ryzyka odrzucenia przeszczepu, lecz to przeszczepiony szpik jest źródłem komórek, które atakują organizm biorcy i mogą doprowadzić do jego śmierci (Di lanni M 2011) (Zhao K 2015).
Bez względu jednak na pochodzenie komórek układu odpornościowego atakujących organizm pacjenta, walka z nadmierną odpowiedzią immunologiczną sprowadza się tu również do stosowania niespecyficznej immunosupresji. W obu przypadkach, tj. alogenicznych przeszczepów narządów litych i komórek hematopoetycznych szpiku, są ściśle zdefiniowane aloantygeny, które stymulują odpowiedź układu odpornościowego i których działanie może być regulowane przez specyficzne antygenowo limfocyty Treg.
Pozornie innym zagadnieniem jest nadmierna odpowiedź immunologiczna zwana także nadwrażliwością na alergeny. Większość z tych zaburzeń udaje się z powodzeniem leczyć objawowo stosując dostępne leki. Niemniej jednak niektóre postacie nadwrażliwości mogą doprowadzić do ciężkiego kalectwa, a nawet powikłań prowadzących do zgonu. Proces chorobowy często postępuje z czasem, stan zapalny nasila się, prowadząc do trwałych zmian strukturalnych w drogach oddechowych, a stosowane leki przestają być skuteczne (Panettieri RA Jr 2008) (Barbaro MP 2014). W tej sytuacji także antygenowo specyficzne limfocyty Treg mogłyby stać się nowoczesnym lekiem przeciwalergicznym.
Podsumowując, skuteczne i bezpieczne leki stosowane zarówno w terapii chorób autoimmunologicznych, alergicznych, jak i u biorców przeszczepów to takie, które działają maksymalnie wybiórczo regulując odpowiedź układu odpornościowego na ściśle zdefiniowane antygeny odpowiedzialne za niepożądaną reakcję układu odpornościowego (np. rzut choroby autoimmunologicznej lub alergii, odrzucanie narządu, chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi) i jednocześnie nie upośledzają fizjologicznej odpowiedzi immunologicznej na obce i niebezpieczne antygeny. Szansą na taką inteligentną immunosupresję są właśnie antygenowo specyficzne limfocyty Treg. Warunkiem sukcesu terapii klinicznej z zastosowaniem komórek Treg jest jednak opracowanie bezpiecznego dla pacjenta protokołu ekspansji tych limfocytów, który gwarantowałby otrzymanie wysokiej liczby antygenowo specyficznych komórek z jednoczesnym utrzymaniem ich stabilności i aktywności supresorowej przez cały czas trwania hodowli (Tang Q 2013). Opisana w niniejszym zgłoszeniu patentowym metoda spełnia wyżej opisane wymagania.
Istota wynalazku
Selekcja in vitro limfocytów Treg antygenowo specyficznych z poliklonalnej puli tych komórek przy pomocy wyładowanych antygenem monocytów jako komórek prezentujących antygen. Schemat całości prezentowanych doświadczeń pokazuje Figura 1.
Poliklonalne limfocyty Treg o fenotypie CD3+CD4+CD25highCD127- hodowane z autologicznymi naświetlonymi promieniowaniem gamma monocytami prezentującymi specyficzny antygen (w przykładzie insulinę lub peptyd 9-23 łańcucha beta insuliny) zaczynają proliferować tylko gdy wykazują specyficzność w stosunku do antygenu prezentowanego przez monocyty.
Wiele z antygenów nie ma powinowactwa do limfocytów Treg (są to komórki z definicji anergiczne) lub podczas stymulacji może dochodzić do zmiany fenotypu i utraty ich właściwości regulatorowych. Stąd, ważne są warunki w jakich prowadzona jest kohodowla, aby z jednej strony doprowadzić do proliferacji limfocytów Treg specyficznych, a z drugiej utrzymać ich właściwości regulacyjne i supresorowe. Oba warunki zostały spełnione po dodaniu do kohodowli przeciwciał antyCD28 oraz antyCD154, które dostarczyły komórkom Treg brakującego drugiego sygnału. Limfocyty Treg specyficzne wobec prezentowanego antygenu w obecności przeciwciał antyCD28 oraz antyCD154 zaczynały proliferować bez utraty stabilności definiowanej jako ekspresja czynnika FoxP3 (dochodziło wręcz do wzrostu ekspresji tego czynnika) oraz aktywność w funkcjonalnych testach supresyjnych (Fig. 2 i 3).
Sortowanie czystej populacji limfocytów Treg antygenowo specyficznych odbywało się przy pomocy sortera komórek FACS. Sortowanie prowadzono w warunkach laboratoryjnych (sorter Aria II,
PL 238 336 B1
BDBiosciences) lub w warunkach laboratorium czystego z dopuszczeniem do produkcji produktów terapii zaawansowanej (sorter Influx BDBiosciences kwalifikowany do warunków dobrej praktyki wytwarzania - GMP). Sortowanie było możliwe dzięki uprzedniemu wybarwieniu poliklonalnych limfocytów Treg barwnikiem fluorescencyjnym (CFSE lub Violet). Limfocyty Treg, które proliferują w odpowiedzi na prezentowany antygen czyli Treg antygenowo specyficzne zaczynają rozcieńczać/tracić intensywność fluorescencji, która zmniejsza się o około połowę z każdym kolejnym podziałem komórek. Na podstawie takiej zmiany fluorescencji można wyodrębnić i wysortować komórki proliferujące o niskiej fluorescencji (limfocyty Treg antygenowo specyficzne) i komórki nieproliferujące o wysokiej fluorescencji (limfocyty Treg niespecyficzne) (Fig. 2 i 3).
Tak wysortowane komórki można dalej hodować i użyć w testach funkcjonalnych.
Zaprezentowana metoda pozwala na uzyskanie limfocytów Treg antygenowo specyficznych, które mają zachowany fenotyp komórki regulatorowej potwierdzony ekspresją czynnika transkiypcyjnego FoxP3, a ich aktywność w testach funkcjonalnych (testy hamowania proliferacji i hamowania produkcji interferonu γ) jest wyższa od aktywności wyjściowej populacji limfocytów Treg poliklonalnych.
Należy podkreślić, że uzyskane wyniki nie wskazują na dużą klonalność uzyskanych komórek specyficznych. Przeprowadzona analiza repertuaru TCR nie wykazała bowiem istotnego przyrostu odsetka limfocytów Treg z ekspresją konkretnej klasy receptorów TCR (Fig. 4).
Wysoka ekspresja FoxP3 (FoxP3High) może tłumaczyć lepsze właściwości supresorowe limfocytów Treg specyficznych antygenowo w porównaniu z limfocytami Treg poliklonalnymi. Powszechnie wiadomo, że komórki FoxP3High stanowią najbardziej aktywną supresorowo frakcję limfocytów Treg, ponieważ aktywność immunoregulacyjna komórek Treg koreluje pozytywnie z intensywnością ekspresji czynnika FoxP3 (Marek N 2011) (Ryba M 2011). Fakt, iż specyficzność antygenowa powoduje indukcję wysokiego odsetka komórek FoxP3High tłumaczy wyższą skuteczność terapii, w której stosowane są takie komórki Treg. Wydaje się, że komórki są uruchamiane wyłącznie konkretnym antygenem, a ich działanie ogranicza się właśnie do tkanek, w których dochodzi do ekspresji tego antygenu. W przeprowadzonych przez twórców testach funkcjonalnych analizowano wpływ komórek Treg na proliferację oraz na produkcję interferonu γ(lFN-γ) przez limfocyty T CD4+ efektorowych (Teff). Otrzymane wyniki wskazują, że limfocyty Treg antygenowo specyficzne wykazują tendencję do silniejszego hamowania proliferacji limfocytów Teff oraz produkcji IFN-γ przez te komórki w porównaniu z limfocytami Treg poliklonalnymi (Fig.5-7). Hamowanie to dotyczy zarówno poliklonalnych limfocytów Teff (Fig.5a,6a,7), jak i limfocytów Teff specyficznych (Fig.5b,6b,7) w stosunku do tych samych antygenów, co użyte limfocyty Tregs. Szczególnie ten ostatni układ jest istotny, ponieważ jest najbliższy sytuacji in vivo w trakcie choroby, gdzie limfocytów Teff specyficzne antygenowo (limfocyty autoreaktywne) są głównie odpowiedzialne za zniszczenie tkanek w procesie autoimmunologicznym czy podczas odrzucania narządów. Stworzone przez twórców niniejszego wynalazku antygenowo specyficzne limfocyty Tregs są w stanie hamować specyficzne limfocyty Teff co powinno znacznie wpłynąć na efektywność terapii.
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T namnażanych, znakowanych przeciwciałami monoklonalnymi, sortowanych, gdzie:
a) stosuje się autologiczne monocyty wyładowane antygenem;
b) limfocyty T regulatorowe lub limfocyty T efektorowe zawiesza się w PBS i barwi się wewnątrzkomórkowo, barwnikiem fluorescencyjnym,
c) komórki inkubuje się w ciemności,
d) następnie intensywnie kilkukrotnie płucze się pożywką,
e) limfocyty T regulatorowe lub limfocyty T efektorowe zawiesza się w pożywce i dodaje się autologiczne monocyty CD14+ wyładowane antygenem i naświetlone promieniami gamma
f) do tak przygotowanej kohodowli dodaje się przeciwciała anty-CD154 i anty-CD28, g) kohodowlę inkubuje się w pożywce;
h) limfocyty antygenowo specyficzne są następnie sortowane na podstawie utraty fluorescencji użytego barwnika, gdzie niska fluorescencja komórki świadczy o specyficzności antygenowej limfocytu.
Sposób, gdzie limfocyty T regulatorowe lub limfocyty T efektorowe zawiesza się w 1x106 komórek/ml PBS.
Sposób, gdzie limfocyty barwi się barwnikiem wybranym spośród: CFSE lub Violet w końcowym stężeniu między 1-5pM.
Sposób, gdzie komórki inkubuje się przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37°C,
Sposób, gdzie stosuje się pożywkę wybraną spośród: XV1VO20, CellGRO.
PL 238 336 B1
Sposób, gdzie dodaje się naświetlone monocyty CD 14+ maksymalnie 1:1
Sposób, gdzie monocyty CD 14+ naświetla się promieniami gamma.
Sposób, gdzie przeciwciała anty-CD154 dodaje się do stężenia końcowego 5 μg/ml i anty-CD28 do stężenia końcowego 5 μg/ml.
Sposób, gdzie inkubuje się w temperaturze 37°C w 5% CO2
Sposób, gdzie specyficzność antygenowa oceniana jest w testach funkcjonalnych, w których limfocyty antygenowo-specyficzne, wysortowane na podstawie niskiej fluorescencji są bardziej aktywne od limfocytów niespecyficznych, o wysokiej fluorescencji podczas sortowania; przy czym aktywność jest definiowana w przypadku limfocytów T regulatorowych jako hamowanie funkcji limfocytów efektorowych, a w przypadku limfocytów T efektorowych oznacza nasilenie cech tych komórek takich jak proliferacja, produkcja cytokin i czynników cytotoksycznych.
Zaletami niniejszego wynalazku są:
1) możliwość otrzymywania limfocytów Treg o specyficzności wobec konkretnych antygenów
2) wykorzystanie do otrzymywania specyficznych antygenowo limfocytów Treg autologicznych monocytów wyładowanych pożądanym antygenem
3) użycie kombinacji przeciwciał anty-CD28 i anty-CD154 do aktywacji proliferacji specyficznych antygenowo limfocytów Treg stymulowanych autologicznymi monocytami wyładowanymi antygenem
4) wykorzystanie cechy rozcieńczania barwnika fluorescencyjnego w komórce do separacji specyficznych antygenowo limfocytów Treg z populacji poliklonalnej; do rozcieńczania dochodzi podczas proliferacji tych komórek indukowanej autologicznymi monocytami wyładowanymi pożądanym antygenem
5) wykorzystanie sortera komórek do separacji specyficznych antygenowo limfocytów Treg z obniżonym sygnałem barwnika fluorescencyjnego będącego markerem proliferacji
6) uzyskanie bardzo wysokiej stabilności uzyskanej specyficznej antygenowo populacji limfocytów Treg w czasie hodowli, w której odsetek komórek o wysokiej ekspresji czynnika FoxP3 jest wyższy po stymulacji przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD154, co pozytywnie wpłynie na skuteczność terapii komórkowej wykorzystującej komórki Treg
7) w porównaniu z poliklonalnymi limfocytami Treg. wykazano, iż uzyskane antygenowo spcyficzne nielimfocyty Treg silniej i hamują proliferację i produkcję IFN-γ limfocytów Teff (zarówno poliklonalnych jak i antygenowo specyficznych limfocytów Teff) - zjawisko to ma znaczenie dla skuteczności terapii komórkowych wykorzystujących komórki Treg Opis figur:
Fig. 1 - przedstawia_schemat doświadczeń. Kożuch leukocytarno-płytkowy rozdzielany był do monocytów i limfocytów. Limfocyty sortowane były do limfocytów T regulatorowych (Treg) oraz limfocytów CD4+ T efektorowych (Eff), znakowane CFSE i stymulowane naświetlonymi w irradiatorze monocytami wyładowanymi uprzednio pożądanym antygenem (insuliną lub peptydem 9-23). W celu uzyskania populacji poliklonalnej stosowano beadsy antyCD3/antyCD28 zamiast monocytów. Po 7 dniach kohodowle sortowano na podstawie wywołanego proliferacją rozcieńczenia CFSE (jak na Fig.2) do komórek antygenowo-specyficznych i niespecyficznych. Uzyskane limfocyty Treg (populacje: poliklonalną Tregpoli, antygenowo-specyficzną Tregspec i niespecyficzną Tregniespec) testowano następnie w testach funkcjonalnych wobec barwionych fioletem limfocytów efektorowych poliklonalnych (Effpoli) lub specyficznych wobec pożądanego antygenu (Effspec) stymulowanych naświetlonymi monocytami wyładowanymi uprzednio pożądanym antygenem (insuliną lub peptydem 9-23). Wyniki tych testów przedstawiono na Figurach 5-7. Przed pierwszym sortem i po drugim sorcie przeprowadzano badanie klonalności jak na Figurze 4.
Fig. 2 - przedstawia sposób sortowania limfocytów T regulatorowych antygenowo-specyficznych. W celu odróżnienia Tregs od innych komórek, (A), w szczególności od monocytów prezentujących antygen używanych podczas stymulacji, wykonuje się ich barwienie barwnikiem fluorescencyjnym (B). Po zakończeniu kohodowli, limfocyty Tregs, które rozpoznały antygen układają się w polu zmniejszonej fluorescencji (P1 na rysunku C) i są na tej podstawie sortowane jako oddzielna populacja specyficzna antygenowo.
Fig. 3 - przedstawia_odsetki limfocytów Treg w kohodowlach z monocytami oraz ekspresja czynnika transkrypcyjnego FoxP3 w poszczególnych kohodowlach. Analizie poddano limfocyty Tregs w ko
PL 238 336 B1 hodowlach z monocytami prezentującymi testowane antygeny: insulinę lub peptyd 9-23 („tylko monocyty”). Do części takich kohodowli dodawano także przeciwciała antyCD28 i antyCD152 („monocyty i przeciwciała”). Oceniano odsetek limfocytów Tregs proliferujących (antygenowo-specyficznych) w takich warunkach (A) oraz odsetek limfocytów Tregs, które proliferując zwiększały też ekspresję czynnika FoxP3 (B). Podobną analizę ekspresji FoxP3 wykonano dla limfocytów nieproliferujących (C). Wyniki jako średnie +/- odchylenie standardowe. Przykładowe wyniki proliferacji i odczyty ekspresji FoxP3 z populacji proliferującej (antygenowo-specyficznej) i nieproliferującej (niespecyficznej) po stymulacji insulina (D) i peptydem 9-23(E) . W plotach CD4 vs. Violet lewa bramka to komórki proliferujące a prawa to nieproliferujące. Strzałkami połączono wygenerowane z tych bramek ploty z wartościami ekspresji FoxP3. Wartości uznawane za wysokie (oceniane w B i D) znajdują się w górnych bramkach płotów FoxP3 vs. CD4.
Fig. 4 - przedstawia_klonalność limfocytów Tregs mierzona ekspresją poszczególnych klas receptorów TCR (łańcuchy Vbeta). Przykładowe analizy klonalności limfocytów Tregs przed hodowlą („Treg Poliklonalne”) oraz po kohodowli z monocytami prezentującymi antygen sortowane na podstawie proliferacji jako proliferujące („Treg SPECYFICZNE”) i nieproliferujące („Treg NIEspecyficzne”). Na strzałkach klony zidentyfikowane jako preferencyjnie stymulowane do proliferacji podczas kohodowli (odsetek istotnie wzrastał po kohodowli w stosunku do „Treg poliklonalne”). W każdej z prowadzonych hodowli były to klony o ekspresji innego Vbeta, w każdej hodowli preferencyjnemu wzrostowi odsetka ulegało nie więcej niż jeden-dwa klony, a wzrost nie przekraczał kilku procent.
Fig. 5 - przedstawia test funkcjonalny hamowania proliferacji. Limfocyty Treg namnażane jako poliklonalne (Tregs POLI) lub po kohodowli z przeciwciałami antyCD28 i antyCD152 oraz monocytami prezentującymi insulinę lub peptyd9-23 jako komórki antygenowo-specyficzne (Tregs SPEC) lub niespecyficzne (Tregs NIESPEC) były mieszane w różnych proporcjach(na dole rysunku) z autologicznymi limfocytami T efektorowymi traktowanymi jako responderzy. Test stymulowany był następnie monocytami prezentującymi adekwatny antygen, a po inkubacji mierzono proliferację limfocytów efektorowych. Użyto limfocytów efektorowych T poliklonalnych (A) lub specyficznych uprzednio koinkubowanych z autologicznymi monocytami prezentującymi adekwatny antygen (B). Wyniki prezentowane jako zindeksowane do hodowli samych stymulowanych efektorów, których proliferację uznawano za 100%. Wyniki pokazano jako średnią +/- min.-maks, istotne różnice oznaczono kreską/* i podano istotność różnicy.
Fig. 6 - przedstawia_test funkcjonalny hamowania wydzielania IFNgamma. Limfocyty Treg namnażane jako poliklonalne (Tregs POLI] lub po kohodowli z przeciwciałami antyCD28 i antyCD152 oraz monocytami prezentującymi insulinę lub peptyd9-23 jako komórki antygenowo-specyficzne (Tregs SPEC) lub niespecyficzne (Tregs NIESPEC) były mieszane w różnych proporcjach(na dole rysunku) z autologicznymi limfocytami T efektorowymi traktowanymi jako responderzy. Test stymulowany był następnie monocytami prezentującymi adekwatny antygen, a po inkubacji w nadsączu mierzono stężenie IFNgamma. Użyto limfocytów efektorowych T poliklonalnych (A) lub specyficznych uprzednio koinkubowanych z autologicznymi monocytami prezentującymi adekwatny antygen (B). Wyniki prezentowane jako zindeksowane do hodowli samych stymulowanych efektorów, których proliferację uznawano za 100%. Wyniki pokazano jako średnią +/- min.-maks, istotne różnice oznaczono kreską/* i podano istotność różnicy.
Fig. 7 - przedstawia_test funkcjonalny hamowania wydzielania IFNgamma - odczyt metodą ELISPOT. Limfocyty Treg namnażane jako poliklonalne (Tregs POLIKLONALNE] lub po kohodowli z przeciwciałami antyCD28 i antyCD152 oraz monocytami prezentującymi insulinę lub peptyd9-23 jako komórki antygenowo-specyficzne (Tregs SPECYFICZNE] lub niespecyficzne (Tregs NIESPECYFICZNE] były mieszane w różnych proporcjach (na górze rysunku] z autologicznymi limfocytami T efektorowymi traktowanymi jako responderzy. Test stymulowany był następnie monocytami prezentującymi adekwatny antygen, a po inkubacji na membranach dołków hodowlanych płytki ELISPOT mierzono wydzielanie IFNgamma. Użyto limfocytów efektorowych T poliklonalnych (A) lub specyficznych uprzednio koinkubowanych z autologicznymi monocytami prezentującymi adekwatny antygen (B). Wyniki prezentowane jako ilość spotów w hodowli oraz zdjęcie hodowli.
Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia OTRZYMYWANIE ANTYGENOWO SPECYFICZNYCH LIMFOCYTÓW TREGs Izolacja limfocytów Treg, limfocytów T CD4+ efektorowych i monocytów CD14+
PL 238 336 B1
Limfocyty Treg, T CD4+ efektorowe (Teff) i monocyty CD14+ krwi obwodowej pozyskiwano z kożuszków płytkowo-leukocytarnych honorowych dawców krwi obu płci. Z otrzymanego materiału izolowano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (ang. peripheral blood mononuclear cells; PBMC) poprzez wirowanie w gradiencie stężeń Ficoll/Uropolina.
Limfocyty T CD4+ izolowano następnie metodą negatywnej selekcji immunomagnetycznej (czystość izolacji 90-99%). W tym celu używano zestawu „EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit” (Stemcell Technologies), który umożliwia eliminację komórek wykazujących ekspresję następujących antygenów: CD8, CD14, CD16, CD19, CD20, CD36, CD56, CD66b, CD123, TCRy/δ oraz glikoforyna A. Alternatywnie stosowano selekcję pozytywną przy pomocy zestawu „EasySep Human CD4+ T Positive Selection Kit II” (Stemcell Technologies), który umożliwia separację komórek wykazujących wysoką ekspresję antygenu CD4, tj. limfocytów T CD4+.
Wyizolowane limfocyty T CD4+ znakowano następnie przeciwciałami monoklonalnymi (ang. monoclonal antibodies; mAb; 501 mAb/106 komórek) rozpoznającymi następujące antygeny: CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, CD25 oraz CD127 (BD Biosciences). Spośród wymienionych przeciwciał, przeciwciała rozpoznające antygeny: CD14, CD16, CD19 i CD8 były skoniugowane z tym samym fluorochromem. Celem takiego sposobu barwienia jest eliminacja komórek pozytywnych dla wymienionych antygenów (odpowiednio: monocyty, komórki NK, limfocyty B i T cytotoksyczne, oznaczone wspólnie w algorytmie izolacji jako lineage) bez konieczności wprowadzania dodatkowych barwników, zmniejszając tym samym niepożądane zjawisko nakładania się widm fluorescencji.
Następnie komórki były sortowane przy użyciu cytometru sortującego do limfocytów Treg o następującym fenotypie CD3+CD4+CD25highCD127-doublet-lineage-dead-oraz limfocytów Teff, które charakteryzował następujący wzór antygenów CD3+CD4+CD25-doublet-lineage-dead-.
Czystość wyizolowanych komórek Treg wynosiła ~100% [mediana(min-max): 98%(97-99)]. W tym miejscu należy nadmienić, że zastosowany sorter komórkowy Influx (BD Biosciences) został zaadaptowany do wymogów dobrej praktyki produkcyjnej (ang. good manufacturing practice; GMP). Jego dużą zaletą z punktu widzenia terapii klinicznej jest wymienna linia przepływu próbki, co eliminuje ryzyko kontaminacji komórek patogenami pochodzącymi z wcześniej przetwarzanego materiału innych pacjentów. Niemniej jednak, w zależności od aplikacji (badania naukowe/terapia kliniczna) komórki Treg można pozyskiwać także z zastosowaniem innych typów sorterów komórkowych. Opisany algorytm izolacji, a następnie sposób namnażania będący przedmiotem niniejszego zgłoszenia pozwala na otrzymanie identycznych wyników ekspansji komórek Treg także w przypadku użycia innego modelu maszyny sortującej. Zastosowany w przykładzie sorter komórkowy nie stanowi więc ograniczenia niniejszego wynalazku.
Wyizolowane limfocyty Treg oraz komórki Teff były następnie wysiewane na oddzielne płytki hodowlane i inkubowane w temperaturze 37°C w pożywce hodowlanej XV1VO-20 (Lonza) lub CellGro, która spełnia standardy GMP. Pożywka była suplementowana ludzką inaktywowaną surowicą AB (10%) oraz interleukiną 2 (1L-2; 2000 U/ml; Proleukin; Chiron, San Diego, CA).
Autologiczne monocyty krwi obwodowej (komórki CD14+) izolowano z PBMC pochodzących z tego samego kożuszka, z którego uzyskiwano limfocyty T CD4+. Stosowano metodę pozytywnej selekcji immunomagnetycznej (czystość izolacji 90-99%) przy użyciu zestawu „EasySep™ Human CD 14 Positive Selection Kit 11 (StemCell Technologies), który umożliwia separację komórek wykazujących ekspresję antygenu CD 14, tj. monocytów CD14+.
Wyizolowane monocyty były następnie wysiewane w ilości 106komórek/dołek płytki hodowlanej i inkubowane w temperaturze 37°C w pożywce hodowlanej XV1VO-20 (Lonza) lub CellGro , która spełnia standardy GMP. Do dołków dodawano uprzednio przygotowany roztwór peptydu (25pg/dołek) i pozostawiano hodowlę na 24 h.
Przygotowanie peptydu (w obecnej procedurze peptyd 9-23 łańcucha beta insuliny, insulina): Wyjściową ilość peptydu rozpuszczano w dejonizowanej, autoklawowanej wodzie do stężenia 0,5pg/pl. W probówkach Eppendorf 1,5 ml umieszczano po 50 pl roztworu peptydu i podpisywano stężeniem i nazwą. Przechowywano nie dłużej niż 30 dni w temp. -20 st. Celsjusza.
Kohodowle limfocytów Treg i monocytów CD14+ w celu uzyskania antygenowo-specyficznych limfocytów Treg Po 24h inkubacji monocyty zbierano z dołków i naświetlano promieniami gamma w irradiatorze (w warunkach standardowych jak przy naświetlaniu preparatów krwi).
Limfocyty T regulatorowe 24 h po sorcie zbierano z dołków, zawieszano 1x106 komórek na ml PBS i barwiono wewnątrzkomórkowo barwnikiem CFSE (Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit, Life
PL 238 336 B1
Technologies) w końcowym stężeniu CFSE między 1 a 5μΜ. Komórki inkubowano 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37°C w ciemności, a następnie intensywnie kilkukrotnie płukano pożywką XV1V020. Kontrolę barwienia przeprowadzano w cytometrze przepływowym Fortessa (BDBioscience). W podobny sposób barwiono także limfocyty T efektorowe.
Alternatywnie, obie populacje limfocytów barwiono wewnątrzkomórkowo barwnikiem Violet (Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit, Life Technologies) w powyższy sposób w końcowym stężeniu Violet między 1 a 5μΜ.
Limfocyty Treg zawieszano w pożywce XV1VO20 lub CellGRO i dodawano przygotowane (wyładowane antygenem) i naświetlone monocyty CD 14+ (optymalnie w proporcji 1:1, ale możliwa jest także mniejsza proporcja monocytów). Następnie do tak przygotowanych kohodowli dodawano sterylne przeciwciała anty-CD154 i anty-CD28 (Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD154 (BD Biosciences) do stężenia końcowego 5μg/ml oraz Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 (BD Biosciences) do stężenia końcowego 5μg/ml). Tak przygotowaną kohodowlę inkubowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 w pożywce hodowlanej XV1VO-20 (Lonza) lub CellGro. Po osiągnięciu przez hodowlę 80% konfluencji w powiększeniu obiektywu 10x mikroskopu odwróconego wykonywano pasaż komórek do kolejnych dołków mikropłytki. Pożywkę uzupełniano do pierwotnej objętości i stężenia przeciwciał anty-CD154 i anty-CD28. Podobną procedurę kohodowli wykonywano dla limfocytów T efektorowych z monocytami. Jako kontrole przygotowano hodowle limfocytów wybarwionych bez stymulacji monocytami (kontrola negatywna - komórki nieproliferujące) oraz limfocyty stymulowane mikrosferami magnetycznymi opłaszczonymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 (Treg Expansion Kit, Miltenyi Biotech) w stosunku 4:1 (komórki mikrosfery; kontrola pozytywna - komórki nieproliferujące).
Hodowle zbierano po 7 dniach i sortowane z dot-plotu SSC-A (side scatter) versus kanał 488 nm dla barwnika proliferacyjnego Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit (Life Technologies) bądź SSC-A versus kanał 450 nm dla barwnika proliferacyjnego Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit (Life Technologies). Komórki proliferujące w odpowiedzi na antygen prezentowany przez monocyty identyfikowane były jako te, które wykazywały fluorescencję niższą od komórek z kontroli negatywnej [odcięcie dla bramki do sortowania zakładane dla intensywności fluorescencji poniżej piku kontroli negatywnej, bramka zawierająca nie więcej niż 5% zdarzeń (events) piku kontroli negatywnej o najniższej fluorescencji), a komórki nieproliferujące jako te, których fluorescencja była porównywalna z fluorescencją komórek z kontroli negatywnej (bramki do sortowania zakładana dla intensywności fluorescencji piku kontroli negatywnej, bramka zawierająca nie mniej niż 80% zdarzeń (events) piku kontroli negatywnej].
Tak wyizolowane limfocyty poddawano testom jakości (kontrola fenotypu i testy funkcjonalne hamowania proliferacji i produkcji interferonu γ) lub dalej prowadzono hodowlę z dodatkiem mikrosfer magnetycznych opłaszczonych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 (Miltenyi Biotec) w stosunku 1:1 z hodowanymi limfocytami Treg w celu uzyskania jak największej ilości limfocytów Treg antygenowo-specyficznych.
Po zakończeniu hodowli zbierano wszystkie hodowane limfocyty Treg, płukano buforem PBS, oczyszczano z mikrosfer stymulujących, liczono i przeprowadzano kontrolę jakości, tj. badania fenotypu i aktywności supresyjnej w testach funkcjonalnych.
Kontrola jakości
Kontrola fenotypu
Próbkę limfocytów Treg i Efektorów z każdej hodowlanej kondycji znakowano następującymi przeciwciałami monoklonalnymi: anty-CD3, anty-CD4, anty-CD25 andty-CD127, anty-CD62L, antyCD45RA oraz anty-FoxP3 z zastosowaniem zestawu Foxp3 Staining Buffer Set (eBiosciences). Następnie komórki analizowano z zastosowaniem cytometru przepływowego (BD Fortessa, BD Biosciences).
Test funkcjonalne hamowania produkcji interferonu-r (IFN-r) w limfocytach efektorowych Teff przez komórki Treg
Komórki przeznaczone do testu (Treg oraz Teff) płukano buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS), oczyszczano z mikrosfer używanych do stymulacji oraz liczono. Następnie komórki zawieszano w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej antybiotyki oraz ludzką inaktywowaną surowicę AB (10%). Przez kolejne 2 dni komórki z poszczególnych kondycji nadal hodowano osobno i nie dodawano przez ten czas IL-2 oraz aktywujących mikrosfer. Dzięki temu komórki Treg oraz Teff wchodziły w stan spoczynku. Zabieg ten miał na celu doprowadzenie wszystkich badanych komórek do porównywalnego poziomu aktywacji, dzięki czemu możliwe było obiektywne porównanie zdolności supresorowych badanych populacji komórek Treg.
PL 238 336 B1
Po upływie 48h limfocyty T efektorowe (Teff) przeznaczone do testu płukano buforem (PBS) oraz ponownie liczono. Następnie komórki Teff barwiono roztworem sukcynimidylowego estru dioctanu karboksyfluoresceiny CFSE (Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit, Life Technologies, 1 μM; 15 min., 37°C) lub Violet (Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit, Life Technologies, 1 μM; 15 min., 37°C) w celu przeprowadzenia analizy ich proliferacji w obecności limfocytów Treg. O wyborze barwnika decydowało wcześniejsze barwienie limfocytów Tregs - jeśli Treg były barwione CFSE to Teff barwiono Violet i odwrotnie.
Znakowane autologiczne limfocyty Teff (responderzy) mieszano w następujących proporcjach z komórkami Treg: 1:1, 1:½ i 1:¼ 1:1/8. Liczba komórek Teff była za każdym razem stała, a liczba limfocytów Treg zmienna. Komórki te były zawieszane w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej ludzką inaktywowaną surowicę AB (10%) oraz interleukinę 2 (IL-2; 100 U/ml). Jako stymulatory dodawano napromienione autologiczne monocyty wyładowane peptydem w proporcji 1:1 z Teff. Jako kontrola pozytywna służyły limfocyty Teff bez Treg stymulowane napromienionymi autologicznymi monocytami wyładowanymi peptydem lub mikrosferami opłaszczonymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Za każdym razem przygotowywano również kontrolę negatywną zawierającą jedynie niestymulowane komórki Teff hodowane bez limfocytów Treg (referencja do odczytu w cytometrze). Dodatkową kontrolę stanowiły również niebarwione komórki Treg, które hodowano bez limfocytów Teff.
Wysiane w ten sposób komórki hodowano przez następne 6 dni w 37°C. Po upływie tego czasu zbierano komórki, a następnie analizowano przy użyciu cytometru przepływowego (Canto II, BD Biosciences). Wynik dla komórek Teff niestymulowanych i hodowanych bez dodatku limfocytów Treg (K) interpretowany był jako tło, które odejmowano za każdym razem od wszystkich analizowanych wyników, stąd przyjmował on zawsze wartość 100% co oznaczało, że 100% komórek Teff nie uległo nawet 1 podziałowi. Wynik dla komórek Teff stymulowanych i hodowanych bez dodatku limfocytów Treg (1:0) przyjmował zawsze wartość 0% (całkowity brak hamowania).
Test funkcjonalne hamowania produkcji interferonu-r (IFN-r) w limfocytach efektorowych Teff przez komórki Treg
Próbkę limfocytów Treg z każdej hodowlanej kondycji pobierano do testu funkcjonalnego w celu potwierdzenie hamującego wpływu komórek Treg na wydzielanie IFN-γ przez autologiczne limfocyty Teff CD4+. Równolegle pobierano próbkę limfocytów Teff, które wcześniej hodowano w warunkach jak badane limfocyty Treg, jako responderzy w teście hamowania proliferacji. W ten sposób można było przeprowadzić dwie serie testów - z responderami-limfocytami Teff CD4+ poliklonalnymi oraz z responderami-limfocytami Teff CD4+ specyficznymi antygenowo.
Komórki przeznaczone do testu (Treg oraz Teff) płukano buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS), oczyszczano z mikrosfer używanych do stymulacji oraz liczono. Następnie komórki zawieszano w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej antybiotyki oraz ludzką inaktywowaną surowicę AB (10%). Przez kolejne 2 dni komórki z poszczególnych kondycji nadal hodowano osobno i nie dodawano przez ten czas IL-2 oraz aktywujących mikrosfer. Dzięki temu komórki Treg oraz Teff wchodziły w stan spoczynku. Zabieg ten miał na celu doprowadzenie wszystkich badanych komórek do porównywalnego poziomu aktywacji, dzięki czemu możliwe było obiektywne porównanie zdolności supresorowych badanych populacji komórek Treg.
Znakowane autologiczne limfocyty Teff (responderzy) mieszano w następujących proporcjach z komórkami Treg: 1:1, 1:½ i 1:¼ 1:1/8 Liczba komórek Teff była za każdym razem stała, a liczba limfocytów Treg zmienna. Komórki te były zawieszane w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej ludzką inaktywowaną surowicę AB (10%) oraz interleukinę 2 (IL-2; 100 U/ml). Jako stymulatory dodawano napromienione autologiczne monocyty wyładowane peptydem, jak opisano wyżej. Jako kontrola pozytywna służyły limfocyty Teff bez Treg stymulowane napromienionymi autologicznymi monocytami wyładowanymi peptydem lub mikrosferami opłaszczonymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Za każdym razem przygotowywano również kontrolę negatywną zawierającą jedynie niestymulowane komórki Teff hodowane bez limfocytów Treg (referencja do odczytu w cytometrze). Dodatkową kontrolę stanowiły również niebarwione komórki Treg, które hodowano bez limfocytów Teff.
Wysiane w ten sposób komórki hodowano przez następne 6 dni w 37°C. Po upływie tego czasu zbierano supernatant znad kohodowli i oznaczano w nim poziom IFNγ metodą ELISA zgodnie ze wskazówkami producenta (BDBioscience).
IFNγ - ELISPOT
Odmianą tego testu był test ELISPOT pozwalający na ocenę produkcji IFNγ przez pojedyncze komórki. Test polegał na tym, iż kohodowle limfocytów Teff (responderów) z limfocytami Treg hodowano
PL 238 336 B1
48h na specjalnych płytkach do ELISPOT pozwalających na zidentyfikowanie ile dokładnie komórek produkowało cytokinę. Po inkubacji płytki były płukane z komórek i wybarwiano wydzielony na membranę płytki IFNy zgodnie ze wskazówkami producenta testu (MABtech). Odczytu dokonywano w czytniku płytek ELISPOT (Immunospot 5, CTL).
WYNIKI
Efektywność pozyskiwania limfocytów T regulatorowych antygenowo specyficznych stymulowanych monocytami prezentującymi antygen i przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD154
Analiza odsetka limfocytów Treg generowanych przez autologiczne monocyty prezentujące antygen, tj. limfocytów Treg antygenowo specyficznych, wykazała, że proliferacja tych komórek jest wyższa po dodaniu do kohodowli przeciwciał antyCD28 oraz antyCD154, szczególnie w przypadku kohodowli z insuliną (t-test różnica bez przeciwciał / z dodatkiem przeciwciał: insulina p=0.041, peptyd 923 p=0.044) (Fig. 3A).
Porównując efekt użytych peptydów na proliferację limfocytów Treg generowanych przez autologiczne monocyty prezentujące antygen wykazano, że prezentowany peptyd 9-23 istotnie silniej w porównaniu do insuliny zwiększał odsetek tych komórek w kohodowlach bez przeciwciał antyCD28 oraz antyCD154 (t-test p=0.032). Użycie w kohodowli przeciwciał antyCD28 oraz antyCD154 powodowało, że odsetek proliferujących limfocytów Treg był podobny w obu kohodowlach (t-test p=0.54).
Ekspresja czynnika transkrypcyjnego FoxP3 przez limfocyty T regulatorowych antygenowo specyficznych stymulowane monocytami prezentującymi antygen i przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD154 We wszystkich hodowlach podczas całego eksperymentu odsetek limfocytów z ekspresją FoxP3 nie spadał poniżej 90%.
Odsetek limfocytów Treg wykazujących wysoką ekspresję czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (tj. fenotypu CD3+CD4+CD25highCD127-FoxP3high) stymulowanych przez autologiczne monocyty prezentujące antygen był istotnie wyższy w przypadku populacji specyficznych antygenowo/ proliferujących w porównaniu do odpowiadających im populacji limfocytów Treg niespecyficznych/ nieproliferujących (wszystkie t-testy p<0.05) (Fig. 3B i 3C).
Odsetek limfocytów Treg wykazujących wysoką ekspresję czynnika transkrypcyjnego FoxP3 zwiększał się istotnie po dodaniu do kohodowli przeciwciał antyCD28 oraz antyCD154 zarówno w przypadku limfocytów Treg antygenowo-specyficznych/ proliferujących (t-testy różnica bez przeciwciał / z dodatkiem przeciwciał: insulina p=0.002, peptyd 923 p=0.042), jak i w przypadku limfocytów Treg niespecyficznych/ nieproliferujących (t-testy różnica bez przeciwciał / z dodatkiem przeciwciał: insulina p=0.034 i jedynie trend dla peptydu 923 p=0.063).
Analiza klonalności na podstawie repertuaru receptorów TCR limfocytów Tregs
Analiza zmian klonalności receptorów TCR w populacji limfocytów Tregs antygenowo-specyficznych/ proliferujących wykazała, iż w każdej hodowli dochodzi do wzrostu odsetka jednego-dwóch klonów, każdorazowo o innej specyficzności TCRbeta. Niemniej jednak wzrosty te nie sa większe niż kilkakilkanaście procent wszystkich proliferujących komórek (Fig. 4).
Test funkcjonalny - Hamowanie proliferacji limfocytów T efektorowych
Analiza supresji odpowiedzi immunologicznej w testach hamowania wydzielania interferonu gamma potwierdziła supresyjne działanie wszystkich badanych subpopulacji limfocytów Tregs (wszystkie ANOVA, p<0.05). (Fig. 5)
Skuteczność peptydów
Analiza porównawcza wykazała statystycznie istotną wyższą skuteczność Tregs specyficznych dla peptydu 9-23 w porównaniu do Tregs specyficznych dla pełnej insuliny, zarówno gdy responderami hamowanymi w doświadczeniu były poliklonalne limfocyty T efektorowe (ANOVA F=8.03 p=0.047) (Fig. 5A), jaki i limfocyty T efektorowe specyficzne dla testowanego antygenu (ANOVA F=20.40 p=0.045) (Fig. 5B).
Poliklonalne versus specyficzne
Efektywność hamowania proliferacji była wyższa w testach z Tregs specyficznymi w porównaniu do Tregs poliklonalnych, ale nie osiągnęła istotności statystycznej w żadnym z testów (wszystkie ANOVA, p<0.05).
Niemniej jednak, wykazano, że to głównie komponenta Tregs specyficznych jest odpowiedzialna za efekt supresyjny w testach. Po oddzieleniu Tregs specyficznych (proliferujących) on Tregs niespecyficznych (nieproliferujących), Tregs specyficzne hamowały istotnie bardziej odpowiedź limfocytów T efektorowych w porównaniu do Tregs niespecyficznych. Istotność ta dotyczyła zarówno testów, w których responderami były poliklonalne limfocyty T efektorowe (istotne tylko dla peptydu 923: ANOVA
PL 238 336 B1
F=8.21 p=0.028, dla insuliny: ANOVA F=1.31 p=0.33), jak i limfocyty T efektorowe specyficzne (dla peptydu 9-23: ANOVA F=186.32 p=0.005, dla insuliny: ANOVA F=22.47 p=0.041).
Test funkcjonalny - Hamowanie wydzielania interferonu
Analiza supresji odpowiedzi immunologicznej w testach hamowania wydzielania interferonu gamma potwierdziła supresyjne działanie wszystkich badanych subpopulacji limfocytów Tregs (wszystkie ANOVA, p<0.05) (Fig. 6 i 7).
Skuteczność peptydów
Analiza porównawcza wykazała wyższą skuteczność Tregs specyficznych dla peptydu 9-23 w porównaniu do Tregs specyficznych dla pełnej insuliny gdy responderami hamowanymi w doświadczeniu były poliklonalne limfocyty T efektorowe (ANOVA F=5.78 p=0.025) (Fig. 6A i 7). Podobną różnicę zaobserwowano gdy responderami hamowanymi w doświadczeniu były limfocyty T efektorowe specyficzne dla testowanego antygenu, niemniej jednak różnica nie osiągnęła istotności statystycznej (ANOVA F=1.86 p=0.22) (Fig. 6B i 7).
Poliklonalne versus specyficzne
Efektywność hamowania odpowiedzi była wyższa w testach z Tregs specyficznymi w porównaniu do Tregs poliklonalnych, ale nie osiągnęła istotności statystycznej w żadnym z testów (wszystkie ANOVA, p<0.05).
Niemniej jednak, przynajmniej w przypadku stymulacji peptydem 9-23 wykazano, że to głównie komponenta Tregs specyficznych dla peptydu 9-23 jest odpowiedzialna za efekt supresyjny w testach. Po oddzieleniu Tregs specyficznych (proliferujących) on Tregs niespecyficznych (nieproliferujących) wykazano, iż Tregs specyficzne dla peptydu 9-23 hamowały statystycznie istotnie bardziej odpowiedź limfocytów T efektorowych w porównaniu do Tregs niespecyficznych. Istotność ta dotyczyła zarówno testów, w których responderami były poliklonalne limfocyty T efektorowe (ANOVA F=5.3 p=0.031), jak i limfocyty T efektorowe specyficzne dla peptydu 9-23 (ANOVA F=111.84 p=0.0004).
Silniejsze hamowanie zaobserwowano także w przypadku Tregs specyficznych dla Insuliny w porównaniu do Tregs niespecyficznych gdy responderami były limfocyty T efektorowe specyficzne dla insuliny, ale istotność statystyczna efektu obserwowana była tylko w niektórych eksperymentach oraz analizie post hoc, a w analizie całościowej okazała się nieistotna statystycznie (ANOVA F=0.31 p=0.56). Nie wykazano takich różnic między limfocytami Tregs specyficznymi dla insuliny i Tregs niespecyficznymi dla responderów poliklonalnych (ANOVA: F=0.0004 p=0.94).
Literatura:
Andres A (2005). „Cancer incidence after immunosuppressive treatment following kidney transplantation.” Crit Rev Oncol Hematol 56(1): 71-85.
Barbaro MP, Spanevello A, Palladino GP, Salerno FG, Lacedonia D, Carpagnano GE, (2014). „Exhaled matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in different biological phenotypes of asthma.” Eur J Intern Med 25(1): 92-96.
Berney T, Secchi A (2009). „Rapamycin in islet transplantation: friend or foe?” Transpl Int 22(2): 153-161.
Bluestone JA, Buckner JH, Fitch M, Gitelman SE, Gupta S, Hellerstein MK, Herold KC, Lares A, Lee MR, Li K, Liu W, Long SA, Masiello LM, Nguyen V, Putnam AL, Rieck
M, Sayre PH, Tang Q, (2015). „Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.” Sci Transl Med 7(315): 315ra189.
Bluestone JA, Trotta E, Xu D, (2015). „The therapeutic potential of regulatory T cells for the treatment of autoimmune disease.” Expert Opin Ther Targets 19(8): 1091-1103.
Di lanni M, Falzetti F, Carotti A, Terenzi A, Castellino F, Bonifacio E, Del Papa B, Zei T, Ostini RI, Cecchini D, Aloisi T, Perruccio K, Ruggeri L, Balucani C, Pierini A, Sportoletti P, Aristei C, Falini B, Reisner Y, Velardi A, Aversa F, Martelli MF, (2011). „Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA- haploidentical transplantation.” Blood 117(14): 3921-398.
Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY, (2003). „Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.” Nat Immunol 4(4): 330-336.
Gambineri E, Torgerson TR, Ochs HD, (2003). „Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, and X-linked inheritance (IPEX), a syndrome of systemic autoimmunity caused by mutations of FOXP3, a critical regulator of T-cell homeostasis. „Curr Opin Rheumatol 15: 430-435.
Geem D, Harusato A, Flannigan K, Denning TL, (2015). „Harnessing regulatory T cells for the treatment of inflammatory bowel disease. „Inflamm Bowel Dis 21(6): 1409-1418.
PL 238 336 B1
Gupta S, (2012). „Immunotherapies in diabetes mellitus type 1.” „Med Clin North Am 96(3): 621-634.
Hoffmann P, Boeld TJ, Eder R, Huehn J, Floess S, Wieczorek G, Olek S, Dietmaier W, Andreesen R, Edinger M, (2009). „Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. „Eur J Immunol 39(4): 1088-1097.
Krzystyniak A, Gołąb K, Witkowski P, Trzonkowski P, (2014). „Islet cell transplant and the incorporation of Tregs. „Curr Opin Organ Transplant 19(6): 610-615.
Lima XT, Cintra ML, Piaza AC, Mamoni RL, Oliveira RT, Magalhaes RF, Blotta MH, (2015). „Frequency and characteristics of circulating CD4(+) CD28(null) T cells in patients with psoriasis.” Br J Dermatol 173(4): 998-1005.
Malek TR (2003). „The main function of IL-2 is to promote the development of T regulatory cells.” J Leukoc Biol 74(6): 961-965.
Malek TR, Castro 1 (2010). „lnterleukin-2 receptor signaling: at the interface between tolerance and immunity.” Immunity 33(2): 153-165.
Marek-Trzonkowska N, Myśliwiec M, Dobyszuk A, Grabowska M, Techmanska I, Juscinska J, Wujtewicz MA, Witkowski P, Młynarski W, Balcerska A, Myśliwska J, Trzonkowski P, (2012). „Administration of CD4+CD25highCD127- regulatory T cells preserves β-cell function in type 1 diabetes in children.” Diabetes Care 35(9): 1817-1820.
Marek-Trzonkowska N, Myśliwec M, Siebert J, Trzonkowski P, (2013). „Clinical application of regulatory T cells in type 1 diabetes.” Pediatr Diabetes 14(5): 322-332.
Marek-Trzonkowska N, Myśliwiec M, Dobyszuk A, Grabowska M, Derkowska I, Juścińska J, Owczuk R, Szadkowska A, Witkowski P, Młynarski W, Jarosz-Chobot P, Bossowski A, Siebert J, Trzonkowski P, (2014). „Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up.” Clin Immunol 153(1): 23-30.
Marek N, Bieniaszewska M, Krzystyniak A, Juścińska J, Myśliwska J, Witkowski P, Hellmann A, Trzonkowski P, (2011). „The time is crucial for ex vivo expansion of T regulatory cells for therapy.” Cell Transplant 20(11-12): 1747-1758.
Martelli MF, Di Ianni M, Ruggeri L, Falzetti F, Carotti A, Terenzi A, Pierini A, Massei MS, Amico L, Urbani E, Del Papa B, Zei T, Iacucci Ostini R, Cecchini D, Tognellini R, Reisner Y, Aversa F, Falini B, Velardi A, (2014). „HLAhaploidentical transplantation with regulatory and conventional T-cell adoptive immunotherapy prevents acute leukemia relapse.” Blood 124(4): 638-644.
Mu Q, Zhang H, Luo XM, (2015). „SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet?” Front Immunol 6(artykul 608): 1-10.
Nishimura E, Sakihama T, Setoguchi R, Tanaka K, Sakaguchi S, (2004). „Induction of antigenspecific immunologic tolerance by in vivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells.” Int Immunol 16(8): 1189-1201.
Orent W, McHenry AR, Rao DA, White C, Klein HU, Bassil R, Srivastava G, Replogle JM, Raj T, Frangieh M, Cimpean M, Cuerdon N, Chibnik L,Khoury SJ, Karlson EW, Brenner MB, De Jager P, Bradshaw EM, Elyaman W, (2015). „Rheumatoid arthritis-associated RBPJ polymorphism alters memory CD4+ T cells.” Hum Mol Genet DOI: 10.1093/hmg/ddv474 (w druku).
Panettieri RA, Jr Covar R, Grant E, Hillyer EV, Bacharier L, (2008). „Natural history of asthma: persistence versus progression-does the beginning predict the end?” J. Allergy Clin Immunol 121(3): 607-613.
Prókai A, Csohaany R, Sziksz E, Pap D, Balicza-Himer L, Boros S, Magda B, Vannay A, KisPetikK, Fekete A, Peti-Peterdi J, Szabo AJ, (2015). „Calcineurin-inhibition results in upregulation of local renin and subsequent vascular endothelial growth factor production in renal collecting ducts. Transplantation DOI: 10.1097/TP.0000000000000961(w druku).
Pujol-Autonell 1, Ampudia RM, Monge P, Lucas AM, Carrascal J, Verdaguer J, Vives-Pi M, (2013). „Immunotherapy with Tolerogenic Dendritic Cells Alone or in Combination with Rapamycin Does Not Reverse Diabetes in NOD Mice. „ISRN Endocrinol 2013 (ID 346987): 1-5.
Rama 1, Grinyó JM (2010). „Malignancy after renal transplantation: the role of immunosuppression.” Nat Rev Nephrol 6(9): 511-519.
Ryba M, Marek N, Hak Ł, Rybarczyk-Kapturska K, Myśliwiec M, Trzonkowski P, Myśliwska J, (2011). „Anti-TNF rescue CD4+Foxp3+ regulatory T cells in patients with type 1 diabetes from effects mediated by TNF.” Cytokine 55(3): 353-361.
PL 238 336 B1
SenecalV, Deblois G, Beauseigle D, Schneider R, Brandenburg), NewcombeJ, Moore CS, Prat A, Antel J, Arbour N, (2015). „Production of IL-27 in multiple sclerosis lesions by astrocytes and myeloid cells: Modulation of local immune responses.” Glia DOI: 10.1002/glia.22948(w druku).
Stelmaszczyk-Emmel A (2015). „Regulatory T cells in children with allergy and asthma: it is time to act.” Respir Physiol Neurobiol 209: 59-63.
Tang Q, Bluestone JA (2013). „Regulatory T-cell therapy in transplantation-moving to the clinic. Cold Spring Harb Perspect Med 3(11): pii: a015552.
Trzonkowski P, Bacchetta R, Battaglia M, Berglund D, Bohnenkamp HR, ten Brinke A, Bushell A, Cools N, Geissler EK, Gregori S, Marieke van Ham S, Hilkens C, Hutchinson JA, Lombardi G, Madrigal JA, Marek-Trzonkowska N, Martinez-Caceres EM, Roncarolo MG, Sanchez-Ramon S, Saudemont A, Sawitzki B, (2015). „Hurdles in therapy with regulatory T cells.” Sci Transi Med 7(304): 304ps18.
Trzonkowski P, Bieniaszewska M, Juścińska J, Dobyszuk A, Krzystyniak A, Marek N, Myśliwska J, Hellmann A, (2009). „First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+CD127- T regulatory cells.” Clin Immunol 133(1): 22-26.
Trzonkowski P, Dukat-Mazurek A, Bieniaszewska M, Marek-Trzonkowska N, Dobyszuk A, Juścińska J, Dutka M, Myśliwska J, Hellmann A, (2013). „Treatment of graft- versus-host disease with naturally occurring T regulatory cells.” BioDrugs 27(6): 605-614.
Trzonkowski P, Szaryńska M, Myśliwska J, Myśliwski A, (2009). „Ex vivo expansion of
CD4(+)CD25(+) T regulatory cells for immunosuppressive therapy.” Cytometry A 75(3): 175-188.
Vignali DA, Collison LW, Workman CJ, (2008). „How regulatory T cells work.” Nat Rev Immunol 8(7) 523-532.
Wang YM, Zhang GY, Wang Y, Hu M, Wu H, Watson D, Hori S, Alexander IE, Harris DC, Alexander SI, (2006). „Foxp3-transduced polyclonal regulatory T cells protect against chronic renal injury from adriamycin.” J Am Soc Nephrol 17(3) 697-706.
Xiao F, Ma L, Zhao M, Huang G, Mirenda V, Dorling A, Lechler R, Lombardi G, (2014). „Ex vivo expanded human regulatory T cells delay islet allograft rejection via inhibiting islet-derived monocyte chemoattractant protein-1 production in CD34+ stem cells-reconstituted NOD-scid lL2rynull mice.” PLoS One. 2014 Mar 3;9(3):e90387,9(3): :e9038.
Yi S, Ji M, Wu J, Ma X, Phillips P, Hawthorne WJ, O'Connell PJ, (2012). „Adoptive transfer with in vitro expanded human regulatory T cells protects against porcine islet xenograft rejection via interleukin-10 in humanized mice.” Diabetes 61 (5): 1180-1191.
Zhang N, Su D, Qu S, Tse T, Bottino R, Balamurugan AN, Xu J, Bromberg JS, Dong HH, (2006). „Sirolimus is associated with reduced islet engraftment and impaired beta-cell function.” Diabetes 55(9): 2429-2436.
Zhao K, Ruan S, Yin L, Zhao D, Chen C, Pan B, Zeng L, Li Z, Xu K, (2015).” Dynamic regulation of effector IFN-y-producing and IL-17-producing T cell subsets in the development of acute graft-versushost disease.” Mol Med Rep 2016 Feb; 13(2): 1395-403.
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T namnażanych, znakowanych przeciwciałami monoklonalnymi, sortowanych znamienny tym, że:a) stosuje się autologiczne monocyty wyładowane antygenem;b) limfocyty T regulatorowe lub limfocyty T efektorowe zawiesza się w PBS i barwi się wewnątrzkomórkowo, barwnikiem fluorescencyjnym,c) komórki inkubuje się w ciemności,d) następnie intensywnie kilkukrotnie płucze się pożywką,e) limfocyty T regulatorowe lub limfocyty T efektorowe zawiesza się w pożywce i dodaje się autologiczne monocyty CD14+ wyładowane antygenem i naświetlone promieniami gamma,f) do tak przygotowanej kohodowli dodaje się przeciwciała anty-CD154 i anty-CD28,g) kohodowlę inkubuje się w pożywce;PL 238 336 B1h) limfocyty antygenowo specyficzne są następnie sortowane na podstawie utraty fluorescencji użytego barwnika, gdzie niska fluorescencja komórki świadczy o specyficzności antygenowej limfocytu.
- 2. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że limfocyty T regulatorowe lub limfocyty Tefektorowe zawiesza s w 1x106 komórek/ ml PBS.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że limfocyty barwi się barwnikiem wybranym spośród: CFSE lub Violet w końcowym stężeniu między 1-5μGM.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki inkubuje się przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37°C,
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pożywkę wybraną spośród: XVIVO20, CellGRO.
- 6. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że dodaje się naświetlone monocyty CD 14+ maksymalnie 1:1.
- 7. Sposób według zastrz.1, znamienny tym, że monocyty CD 14+ naświetla się promieniami gamma.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała anty-CD154 dodaje się do stężenia końcowego 5μg/ml i anty-CD28 do stężenia końcowego 5μ/ml.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubuje się w temperaturze 37°C w 5% CO2.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że specyficzność antygenowa oceniana jest w testach funkcjonalnych, w których limfocyty antygenowo-specyficzne, wysortowane na podstawie niskiej fluorescencji są bardziej aktywne od limfocytów niespecyficznych, o wysokiej fluorescencji podczas sortowania; przy czym aktywność jest definiowana w przypadku limfocytów T regulatorowych jako hamowanie funkcji limfocytów efektorowych, a w przypadku limfocytów T efektorowych oznacza nasilenie cech tych komórek takich jak proliferacja, produkcja cytokin i czynników cytotoksycznych.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL430932A PL238336B1 (pl) | 2019-08-22 | 2019-08-22 | Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych |
| PCT/PL2020/000073 WO2021034208A1 (en) | 2019-08-22 | 2020-08-24 | The process for manufacturing of antigen-specific t lymphocytes |
| JP2022510078A JP7569544B2 (ja) | 2019-08-22 | 2020-08-24 | 抗原特異的ｔリンパ球の製造方法 |
| KR1020227009573A KR20220049591A (ko) | 2019-08-22 | 2020-08-24 | 항원-특이적 t 림프구의 제조방법 |
| CN202080059223.9A CN114269905A (zh) | 2019-08-22 | 2020-08-24 | 制造抗原特异性t淋巴细胞的方法 |
| US17/635,755 US20220333072A1 (en) | 2019-08-22 | 2020-08-24 | The process for manufacturing of antigen-specific t lymphocytes |
| EP20780376.8A EP4017970A1 (en) | 2019-08-22 | 2020-08-24 | The process for manufacturing of antigen-specific t lymphocytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL430932A PL238336B1 (pl) | 2019-08-22 | 2019-08-22 | Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL430932A1 PL430932A1 (pl) | 2021-03-08 |
| PL238336B1 true PL238336B1 (pl) | 2021-08-09 |
Family
ID=72644853
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL430932A PL238336B1 (pl) | 2019-08-22 | 2019-08-22 | Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220333072A1 (pl) |
| EP (1) | EP4017970A1 (pl) |
| JP (1) | JP7569544B2 (pl) |
| KR (1) | KR20220049591A (pl) |
| CN (1) | CN114269905A (pl) |
| PL (1) | PL238336B1 (pl) |
| WO (1) | WO2021034208A1 (pl) |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020151690A1 (en) * | 1997-08-12 | 2002-10-17 | Luxemburg Alain T | Purification of antigen-specific t cells |
| JP4117031B2 (ja) * | 1996-09-06 | 2008-07-09 | オーソ―マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド | 抗原特異的ｔ細胞の精製 |
| SI1739166T1 (sl) | 2005-07-01 | 2011-11-30 | Txcell S A | PRIDOBIVANJE CELIC Tr1 SPECIFIČNIH ZA ALIMENTARNI ANTIGEN ALI AVTOGEN IZ LEVKOCITNE ALI PBMC POPULACIJE |
| WO2013050413A1 (en) * | 2011-10-03 | 2013-04-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for obtaining a population of regulatory t cells |
| US9801911B2 (en) * | 2012-03-02 | 2017-10-31 | The Regents Of The University Of California | Expansion of alloantigen-reactive regulatory T cells |
| MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
| JP6987338B2 (ja) * | 2016-08-05 | 2021-12-22 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | ＭＨＣＩＩ拘束性ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ生成及びその治療的使用 |
| WO2018106885A1 (en) * | 2016-12-07 | 2018-06-14 | East Carolina University | Compositions and methods for in vitro cultivation and/or expansion of regulatory t cells |
| CN108004208A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-08 | 南京爱瑞生物科技有限公司 | 一种体外诱导抗原特异性t细胞的方法 |
-
2019
- 2019-08-22 PL PL430932A patent/PL238336B1/pl unknown
-
2020
- 2020-08-24 CN CN202080059223.9A patent/CN114269905A/zh active Pending
- 2020-08-24 US US17/635,755 patent/US20220333072A1/en active Pending
- 2020-08-24 KR KR1020227009573A patent/KR20220049591A/ko unknown
- 2020-08-24 JP JP2022510078A patent/JP7569544B2/ja active Active
- 2020-08-24 WO PCT/PL2020/000073 patent/WO2021034208A1/en unknown
- 2020-08-24 EP EP20780376.8A patent/EP4017970A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4017970A1 (en) | 2022-06-29 |
| JP2022553482A (ja) | 2022-12-23 |
| PL430932A1 (pl) | 2021-03-08 |
| US20220333072A1 (en) | 2022-10-20 |
| KR20220049591A (ko) | 2022-04-21 |
| JP7569544B2 (ja) | 2024-10-18 |
| CN114269905A (zh) | 2022-04-01 |
| WO2021034208A1 (en) | 2021-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dijke et al. | Discarded human thymus is a novel source of stable and long-lived therapeutic regulatory T cells | |
| Abomaray et al. | Human chorionic villous mesenchymal stem cells modify the functions of human dendritic cells, and induce an anti-inflammatory phenotype in CD1+ dendritic cells | |
| US20150210982A1 (en) | Isolation and Use of Human Regulatory T Cells | |
| EP4417210A1 (en) | Compositions and methods for hematopoietic stem cell transplants | |
| Guo et al. | Generation, cryopreservation, function and in vivo persistence of ex vivo expanded cynomolgus monkey regulatory T cells | |
| JP2016192970A (ja) | Ｔｒ１細胞を単離する新規な方法 | |
| Popescu et al. | EBV-specific CD8+ T cell reactivation in transplant patients results in expansion of CD8+ type-1 regulatory T cells | |
| Litjens et al. | Natural regulatory T cells from patients with end-stage renal disease can be used for large-scale generation of highly suppressive alloantigen-specific Tregs | |
| PL236046B1 (pl) | Sposób namnażania in vitro limfocytów T regulatorowych CD4+ FoxP3+ | |
| US20130101568A1 (en) | Il-13 producing tr1-like cells and use thereof | |
| Zhang et al. | Evaluation of immunosuppressive function of regulatory T cells using a novel in vitro cytotoxicity assay | |
| US20210348126A1 (en) | Method for ex vivo expansion of regulatory t cells | |
| Jin et al. | Large-scale in vitro expansion of human regulatory T cells with potent xenoantigen-specific suppression | |
| WO2012018930A1 (en) | Methods of isolating and expanding human t regulatory cells and uses thereof for cellular therapy | |
| PL238336B1 (pl) | Sposób otrzymywania in vitro antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych | |
| Noël et al. | Patients suffering from acute graft-versus-host disease after bone-marrow transplantation have functional CD4+ CD25hiFoxp3+ regulatory T cells | |
| Mazzitelli | Modulating regulatory T cells towards effective cancer immunotherapy | |
| Nasser et al. | The role of T regulatory lymphocytes in lymphoma | |
| Romano | In vitro characterisation and expansion of human regulatory T cells for their in vivo application in the induction of tolerance in haematopoietic stem cell and solid organ transplantation | |
| He et al. | TNfR2-agonist facilitates high purity expansion of human Treg starting from low purity isolated Treg | |
| Erkers | Immunoregulatory effects of placenta-derived decidual stromal cells | |
| ÇEN | Concanavalin A and phytohaemagglutinin stimulated lymphoproliferative responses in cord blood mononuclear cells | |
| Hameetman et al. | Cutting Edge: TNFR-Shedding by | |
| PETERS et al. | 5CHAPTER 5 EX VIVO GENERATION OF HUMAN ALLOANTIGEN-SPECIFIC REGULATORY T-CELLS FROM CD4POSCD25HIGH T-CELLS FOR IMMUNOTHERAPY |