ES2575231A1 - Amidas de ácidos grasos para la prevención y/o tratamiento de la esteatohepatitis. - Google Patents

Amidas de ácidos grasos para la prevención y/o tratamiento de la esteatohepatitis. Download PDF

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Abstract

Uso de amidas de ácidos grasos con fenilalquilaminas y de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de estos compuestos en la prevención y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso, alcohólico o no alcohólico y, en particular, para la prevención y/o tratamiento de la esteatohepatitis alcohólica o esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

Description

DESCRIPCIÓN
Amidas de ácidos grasos para la prevención y/o tratamiento de la esteatohepatitis.
imagen1
CAMPO DE LA INVENCIÓN 5
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la farmacia, y se refiere a una nueva serie de amidas de ácidos grasos con fenilalquilaminas y sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, y más concretamente, se refiere al uso del compuesto N-(1-(3,4-dihidroxifenil)propan-2-il)oleamida (OLHHA) en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de la 10 enfermedad por hígado graso, preferiblemente no alcohólica (NAFLD) y, en particular, en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de la esteatohepatitis, preferiblemente esteatohepatitis no alcohólica (NASH). El tratamiento permite reducir la masa grasa hepática, lo que conduce a una mejoría en la salud del paciente. 15
imagen2
imagen3
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La esteatohepatitis es una enfermedad hepática producida por la acumulación de lípidos en los hepatocitos, y es una de las principales causas de morbilidad hepática en todo el mundo. Generalmente, las esteatohepatitis se diferencian etiológicamente 20 en dos grupos, en función de la presencia del principal factor único conocido que la desencadena: el consumo abusivo de alcohol. Por tanto diferenciamos las esteatohepatitis alcohólica y la no alcohólica (non alcoholic steatohepatitis, NASH por sus siglas en inglés). Esta última es una enfermedad común del hígado. A menudo es "silenciosa", es decir, no presenta síntomas. La NASH se parece a las enfermedades 25 del hígado causadas por el consumo de alcohol, pero se presenta en personas que beben poco o nada de alcohol.
La característica principal de la NASH es grasa en el hígado con inflamación y daño. La mayoría de las personas que padece NASH se siente bien. No saben que tienen un problema en el hígado. La NASH puede ser grave y desembocar en cirrosis. Con la 30 cirrosis, el hígado queda dañado para siempre, forma cicatrices y deja de funcionar correctamente.
La NASH afecta entre el 2 y el 5 % de las personas que viven en los Estados Unidos. Otro porcentaje, del 10 al 20 %, de personas, tiene grasa en el hígado sin presentar inflamación ni daño en el mismo. Esta afección médica se llama "hígado graso". No es normal tener grasa en el hígado. Sin embargo, tener grasa en el hígado probablemente no cause mucho daño, ni daño permanente, por sí sola. Con un 5 análisis de sangre, un ultrasonido (ecografía) del hígado o una prueba similar se puede observar la presencia de grasa. Si los resultados del análisis de sangre, la ecografía u otras pruebas muestran la posibilidad de que haya grasa en el hígado, la enfermedad se llama "enfermedad de hígado graso no alcohólica" (non alcoholic fatty liver disease, NAFLD por sus siglas). Una biopsia del hígado detectará si alguien tiene 10 NASH o NAFLD.
La NASH es cada vez más común. Esto puede deberse a la mayor prevalencia de obesidad entre la gente que vive en los Estados Unidos. En los últimos 10 años, se duplicó la cantidad de adultos que se han convertido en obesos y se triplicó en niños. La obesidad también contribuye a la diabetes y a un nivel alto de colesterol en la 15 sangre, lo cual puede complicar la salud de alguien con NASH. En España, las cifras muestran prevalencias superiores al 20%, siendo especialmente prevalente en hombres, en los que se asocia a síndrome metabólico, y en niños con obesidad. En los niños esta prevalencia se ha visto incrementada por la creciente epidemia de sobrepeso en la infancia (Gelpi Méndez et al., 2014. Arch. Prev. Riesgos Labor. 17(2), 20 84-90; Navarro-Jaraboet al., 2013.J. Gastroenterol. Hepatol. 28(9):1532-8; Caballería et al., 2012. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 24(9):1007-11)
Actualmente no hay un tratamiento específico para la NASH. Las recomendaciones más importantes para las personas que padecen esta enfermedad son:
1. bajar de peso (si son obesas o tienen sobrepeso). 25
2. consumir una dieta balanceada y saludable.
3. aumentar la actividad física.
4. evitar el consumo de alcohol.
5. evitar el consumo de medicinas innecesarias.
Seguir estas recomendaciones prevenir el daño hepático inicial o bien revertirlo en los 30 estadios más iniciales. También son útiles para otras afecciones médicas, como enfermedades del corazón, diabetes y colesterol alto. Las personas deben hacer un gran esfuerzo por mantener un peso corporal saludable. La pérdida de peso puede
mejorar los resultados de las pruebas del hígado en personas con NASH. Bajar de peso puede incluso revertir la enfermedad en alguna medida. Los investigadores están tratando de averiguar cuántos kilogramos debe bajar una persona con NASH para mejorar el hígado. También desean saber si bajar de peso tiene efectos a largo plazo.
Las personas con NASH a menudo padecen de otras enfermedades, como diabetes, 5 presión arterial alta o dislipemia (niveles de triglicéridos y/o colesterol superiores a lo normal). Estas afecciones médicas deben tratarse con medicinas y controlarse adecuadamente. Las personas no deben dejar de tratar otras afecciones simplemente porque padecen NASH o tienen niveles altos de enzimas del hígado.
Hay dos tratamientos experimentales para personas con NASH: 10
a) Antioxidantes, como vitamina E, selenio y betaína: Se desconoce si estas sustancias ayudan a tratar la enfermedad, pero los resultados de los estudios estarán disponibles en los próximos años.
b) Nuevos medicamentos para el tratamiento de la diabetes: éstas incluso se utilizan en personas sin diabetes. Ello se debe a que la mayoría de las 15 personas con NASH tiene resistencia a la insulina. Esto significa que la insulina normalmente presente en la sangre no controla la glucosa y los ácidos grasos de manera eficaz. Estos nuevos medicamentos mejoran la sensibilidad del organismo a la insulina.
Es necesario, por tanto, desarrollar un tratamiento específico para el NASH. 20
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) (también referido como el compuesto de la invención):
(I)
donde
X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo; 5
n es un número entero desde 1 a 4;
R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo C1-C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4; 10
R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo C1-C4;
R5 es un compuesto de fórmula general (II):
imagen4
(II)
15
donde:
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4;
R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30;
o cualquiera de sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o un isómero, profármacos, derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, en 5 la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso. Alternativamente, se refiere al compuesto de la invención o cualquiera de sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o un isómero, profármacos, 10 derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, para su uso en la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis. 15
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el compuesto se usa en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD), más preferiblemente esteaotohepatitis no alcohólica (NASH).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, X e Y pueden ser iguales 20 o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y CH3.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, n es un número entero seleccionado entre 1 ó 3, más preferiblemente 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y CH3 o pueden 25 estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C3, y más preferiblemente es H.
En otra realización preferida de este aspecto de invención, R4 se selecciona entre H y 30 CH3, y más preferiblemente es CH3.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, R5 es un compuesto de fórmula (II):
imagen5
(II)
5
donde R6 se selecciona entre H y CH3 y R7 es un grupo alquenilo C15-C25.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, R7 tiene un número de insaturaciones entre 1 y 6, más preferiblemente entre 1 y 4.
En otra realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula general (I) se refiere a un compuesto que se selecciona del siguiente grupo: 10
OHOHNHCH3O
Fórmula (III)
OHOHNCH3OCH2CH3
Fórmula (IV) 15
OHOCH3NHCH3O
Fórmula (V)
5
imagen6
Fórmula (VI)
OHOHNCH3OCH3
Fórmula (VII)
OCH2CH2CH3OHNHOCH3
Fórmula (VIII)
OHOHNHCH3O
Fórmula (IX)

OCH2CH2CH3NHCH2CH3OOH
Fórmula (X)
OHOCH3NHCH3O
Fórmula (XI)
OCH3OHNHCH3O
Fórmula (XII)
OHOHNCH3OCH3
Fórmula (XIII)
5 OCH3OHNHCH3O
Fórmula (XIV)
OONHCH3O
Fórmula (XV)
o cualquiera de sus sales, preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o un isómero, 10 profármacos, derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el compuesto es el N-(1-(3,4-dihidroxifenil) propan-2-il) oleamida (OLHHA).
15
imagen7
Fórmula (III) 5
Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprenden al menos un compuesto de la invención, o un tautómero, una sal farmacéuticamente aceptable, un derivado o un profármaco del mismo, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso. Alternativamente, se refiere una 10 composición farmacéutica que comprenden al menos un compuesto de la invención o cualquiera de sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o un isómero, profármacos, derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, para su uso para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad causada por 15 hígado graso. En una realización preferida de este aspecto, la composición de la invención además comprende un transportador o carrier farmacéuticamente aceptable, un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis. 20
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención se usa la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD), preferiblemente esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
25
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención se usa para la prevención, alivio o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso alcohólico (AFLD; Alcoholic Fatty Liver Disease), preferiblemente esteatohepatitis alcohólica (ASH; alcoholic steatohepatitis).
30
En otra realización preferida, la composición farmacéutica además comprende otro principio activo.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición alimentaria o bien una composición nutracéutica o bien una composición del tipo “medical food”, de ahora en adelante composición alimentaria de la invención, que comprende al menos uno de los 35 compuestos de fórmula (I).
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición alimentaria de la invención para la prevención, alivio o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso, preferiblemente esteatohepatitis en mamíferos, y más preferiblemente en seres humanos. Alternativamente, se refiere al uso de la composición alimentaria de la invención, para 5 la prevención y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso, preferiblemente la esteatohepatitis.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición alimentaria de la invención se usa para la prevención, alivio o tratamiento de una 10 enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD; Non Alcoholic Fatty Liver Disease), preferiblemente esteatohepatitis no alcohólica (NASH; Non-alcoholic steatohepatitis).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición 15 alimentaria de la invención se usa para la prevención, alivio o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso alcohólico (AFLD; Alcoholic Fatty Liver Disease), preferiblemente esteatohepatitis alcohólica (ASH; alcoholic steatohepatitis).
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la prevención, alivio o 20 tratamiento de un sujeto, preferiblemente humano, que padezca una enfermedad causada por hígado graso alcohólico (AFLD; Alcoholic Fatty Liver Disease), preferiblemente esteatohepatitis alcohólica (ASH; alcoholic steatohepatitis), o una enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD; Non Alcoholic Fatty Liver Disease), preferiblemente esteatohepatitis no alcohólica (NASH; Non-alcoholic 25 steatohepatitis), que comprende la administración de la composición alimentaria de la invención o bien de la composición farmacéutica de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la ganancia del peso 30 corporal y la ingesta en ratas Zucker.
Figura 2. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el contenido de grasa en hígado y el nivel de triglicéridos en plasma en ratas Zucker.
Figura 3. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el nivel de transaminasas en ratas obesas. 35
Figura 4. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el nivel de citoquinas pro-inflamatorias en ratas obesas.
Figura 5. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el nivel de proteínas plasmáticas relacionadas con la función renal en ratas obesas.
Figura 6. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la expresión génica de enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos en el hígado de ratas Zucker.
Figura 7.Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la expresión génica de 5 INSIG2 y NAPE-PLD en el hígado de ratas Zucker.
Figura 8. Cardiotoxicidad del OLHHA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los resultados que se presentan en la invención muestran que el compuesto: N-(1-(3,4 dihidroxifenil)propan-2-il)oleamida (OLHHA), aminora el hígado graso en un modelo 10 genético de obesidad tal como las ratas Zucker, lo que sugiere el papel hepato-protector de este compuesto. Las ratas Zucker obesas mostraron niveles altos de triglicéridos en suero e hígado graso, lo que se confirma como una elevación significativa de los triglicéridos circulantes y del contenido total de grasa del hígado en comparación con los animales delgados. Con la administración del compuesto de la 15 presente invención, se generó una reducción tanto de los niveles de triglicéridos en el suero como de la acumulación de lípidos en el hígado de ratas Zucker obesas tratadas con OLHHA. Este efecto se ha asociado con cambios en la expresión de ARNm de los genes relacionados con el metabolismo de lípidos en el hígado. Es decir, OLHHA disminuyó la expresión de genes de enzimas lipogénicos, incluyendo la sintasa de 20 ácidos grasos (FAS) y la reductasa 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-CoAR) y aumentó la expresión de genes de enzimas que promueve la oxidación de ácidos grasos, tales como acil-CoA oxidasa (ACOX). El descenso en el nivel de ARNm de la HMG-CoAR se relacionó con un aumento en la expresión génica del gen 2 inducido por la insulina (INSIG2), que está implicado en la regulación de la biosíntesis del 25 colesterol. Finalmente, OLHHA produjo una disminución en la expresión del gen de la enzima pro-lipogénica relacionada con el sistema endocannabinoide N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipasa D (la NAPE-PLD). También, OLHHA mostró un perfil farmacológico seguro porque no interactúa con el gen humano relacionado ether-à-go-go (hERG) de canales de potasio cardiaco y no tenía o tuvo efectos moderados sobre 30 la actividad de las distintas isoformas del citocromo P450 hepático.
Es decir, la invención se refiere al uso de amidas de ácidos grasos conjugadas con fenilalquilaminas (anfetaminas, dopamina, etc.) en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso, preferiblemente esteatohepatitis. 35
USO MÉDICO DEL COMPUESTO DE LA INVENCIÓN
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) (también referido como el compuesto de la invención):
5
(I)
donde
X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo; 10
n es un número entero desde 1 a 4;
R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo C1-C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4; 15
R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo C1-C4;
R5 es un compuesto de fórmula general (II):
(II)
donde:
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4; 5
R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30;
o cualquiera de sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o un isómero, profármacos, derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado 10 graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el compuesto se usa en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de una 15 enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD), más preferiblemente esteaotohepatitis no alcohólica (NASH)
En la presente invención “enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD)” describe una amplia gama de condiciones causadas por una acumulación excesiva de grasa en forma de triglicéridos (esteatosis) en el hígado (histológicamente 20 > 5% de los hepatocitos). Además del exceso de grasa (esteatohepatitis), un subgrupo de pacientes con NAFLD presenta daño e inflamación de los hepatocitos. Esta última condición es denominada “esteatohepatitis no alcohólica (NASH)”, es virtualmente indistinguible histológicamente de la esteatohepatitis alcohólica (ASH). Mientras que la esteatosis simple que se observa en NAFLD no entraña un aumento de la morbilidad o 25 mortalidad a corto plazo, la progresión de esta condición a NASH aumenta
drásticamente el riesgo de cirrosis, fallo hepático, y carcinoma hepatocelular (HCC). La cirrosis debida a NASH es una razón cada vez más frecuente de trasplante hepático. Si bien la morbilidad y la mortalidad por causa hepática están muy aumentadas en los pacientes con NASH, la correlación es aún mayor con la morbilidad y mortalidad por patología cardiovascular. 5
El término “alquilo” se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Los grupos alquilo pueden tener opcionalmente sustituidos por 10 uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
El término “alquenilo” se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas que contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1,3-butadienilo, etc. Los radicales alquenilos pueden estar 15 opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
El término “halógeno” se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, X e Y pueden ser iguales 20 o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y CH3.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, n es un número entero seleccionado entre 1 ó 3, más preferiblemente 1.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y CH3 o pueden 25 estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C3, y más preferiblemente es H.
En otra realización preferida de este aspecto de invención, R4 se selecciona entre H y 30 CH3, y más preferiblemente es CH3.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, R5 es un compuesto de fórmula (II):
(II)
donde R6 se selecciona entre H y CH3 y R7 es un grupo alquenilo C15-C25.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, R7 tiene un número de insaturaciones entre 1 y 6, más preferiblemente entre 1 y 4. 5
En otra realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula general (I) se refiere a un compuesto que se selecciona del siguiente grupo:
Fórmula (III) 10
Fórmula (IV)
Fórmula (V)
5
Fórmula (VI)
Fórmula (VII)
Fórmula (VIII)
Fórmula (IX)

Fórmula (X)
Fórmula (XI)
Fórmula (XII)
Fórmula (XIII)
5
Fórmula (XIV)
Fórmula (XV)
o cualquiera de sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o un isómero, 10 profármacos, derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el compuesto es el N-(1-(3,4-dihidroxifenil)propan-2-il)oleamida (OLHHA).
15
Fórmula (III) 5
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero 10 también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los 15 compuestos de fórmula (I). El término “prodroga” o “profármaco” tal como aquí se utiliza incluye cualquier derivado de un compuesto de fórmula (I) -por ejemplo y no limitativamente: ésteres (incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc.), carbamatos, amidas, etc.- que al ser administrado a un individuo puede ser 20 transformado directa o indirectamente en dicho compuesto de fórmula (I) en el mencionado individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser 25 administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto a compuestos 30 farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento o composiciones alimentarias, como derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos 35 libres o como solvatos. En este sentido, el término “solvato”, tal como aquí se utiliza,
incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea 5 farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación conocidos por los expertos en la materia.
Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable 10 o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, y todavía más 15 preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% de compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Y FORMA FARMACÉUTICA DE LA INVENCIÓN
Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención, o un tautómero, 20 una sal farmacéuticamente aceptable, un derivado o un profármaco del mismo, junto con un transportador o carrier farmacéuticamente aceptable, un excipiente o un vehículo, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso. 25
En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención se usa la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso no 30 alcohólico (NAFLD), preferiblemente esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención se usa para la prevención, alivio o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso alcohólico (AFLD; Alcoholic Fatty Liver Disease), preferiblemente esteatohepatitis alcohólica (ASH; alcoholic steatohepatitis). 35
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas. 5
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, 10 la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la 15 misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal, profármaco o solvato del mismo.
Por tanto, en otra realización preferida, la composición farmacéutica además 20 comprende otro principio activo. Más preferiblemente, el principio activo se selecciona de la lista que consiste en: vitamina E, vitamina C, betaína, N-acetilcisteína, ácido ursodesoxicólico, y otros antioxidantes.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente 25 activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una 30 forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende el compuesto de la invención o la composición de la invención.
En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más 35
principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.
En otra realización preferida de la presente invención, las composiciones y formas farmacéuticas de la invención son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, 5 siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinil pirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinil pirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril 10 sulfato de sodio. Otras formas farmacéuticas pueden ser los sistemas coloidales, dentro de los cuales se incluyen nanoemulsiones, nanocápsulas y nanopartículas poliméricas.
Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se 15 pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica.
Las composiciones y formas farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes. 20
Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación 25 de enfermedades en el hombre y los animales.
La administración de los compuestos, composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, tópica o parenteral. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las 30 enfermedades a tratar.
La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán
administrados una o más veces al día, por ejemplo 1, 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.
Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados 5 junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
COMPOSICIÓN ALIMENTARIA
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición alimentaria tal y como 10 una composición nutracéutica o una composición del tipo “medical food”, de ahora en adelante composición alimentaria de la invención, que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula (I).
La composición alimentaria de la invención comprende el compuesto de la invención en una cantidad eficaz para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad 15 causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD), y preferiblemente para la prevención, alivio y tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), en mamíferos, incluyendo un ser humano. Las composiciones alimentarias preferidas se seleccionan de la lista que consiste en: una bebida, leche, yogur, queso, leche fermentada , bebida de leche aromatizada, leche de soja, cereales precocinados, pan, 20 pasteles, mantequilla, margarina, salsas, aceites para freír, aceites vegetales, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, condimentos, aderezos para ensaladas, zumos de frutas, jarabes, postres, glaseados y rellenos, productos congelados blandos, dulces, chicles y alimentos intermedios. La composición alimentaria de la invención puede ser un 25 suplemento nutricional o dietético. En otra realización preferida, el suplemento nutricional o dietético comprende una composición estéril que contiene el compuesto de la invención, preferentemente provisto de un revestimiento resistente a los ácidos gástricos, siendo una composición de liberación retardada. En otra realización preferida, la composición alimentaria, incluyendo el compuesto de la invención y/o el 30 suplemento nutricional o dietético comprende "portadores" apropiados tales como diluyentes, adyuvantes, excipientes o vehículos con los que se administra el compuesto de la invención. Excipientes apropiados adecuados incluyen, pero no se limitan a almidón, glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, sulfato de calcio, gel de sílice , estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, 35 cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y
similares. Tales suplementos nutricionales se pueden utilizar para combatir problemas hepáticos, y ayudan a mantener la salud o un estilo de vida saludable al mamífero, preferiblemente un ser humano.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición alimentaria de 5 la invención para la prevención, alivio o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso, preferiblemente esteatohepatitis en mamíferos, preferiblemente seres humanos. Alternativamente, se refiere al uso de la composición alimentaria de la invención, para la prevención y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por 10 hígado graso, preferiblemente la esteatohepatitis.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición alimentaria de la invención se usa para la prevención, alivio o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD), preferiblemente 15 esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición alimentaria de la invención se usa para la prevención, alivio o tratamiento de una enfermedad causada por hígado graso alcohólico (AFLD; Alcoholic Fatty Liver 20 Disease), preferiblemente esteatohepatitis alcohólica (ASH; alcoholic steatohepatitis).
El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto(preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un 25 humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica. 30
El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto(preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica. 35
El procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula (I) podría comprender las siguientes etapas:
a) conjugación entre un compuesto de fórmula general (III) y cloroformiato de bencilo para dar lugar a un nuevo compuesto de fórmula general (IV), que comprende la siguiente reacción: 5
(III) (IV) 10
donde R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30 y R8 se selecciona entre NH3, NH2-CH3, NH2-CH2-CH3, NH-(CH3)2, N-(CH3)3 NH-(CH2-CH3)2 y N-(CH2-CH3)3;
b) reacción del compuesto de fórmula general (IV) con un compuesto de fórmula general (V) para dar lugar al compuesto de fórmula general (I) usando dimetilformamida como disolvente: 15
(IV) (V) (I)
donde
X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre 20 H, halógeno y metilo;
n es un número entero desde 1 a 4;
R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y alquilo C1-C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
R3 se puede seleccionar entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4;
R4 se puede seleccionar entre H, halógeno y alquilo C1-C4; 5
R6 se puede seleccionar entre H y alquilo C1-C4;
R7 se puede seleccionar entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30;
R8 se puede seleccionar entre NH3, NH2-CH3, NH2-CH2-CH3, NH-(CH3)2, N-(CH3)3 NH-(CH2-CH3)2 y N-(CH2-CH3)3;
c) evaporación de la dimetilformamida y extracción con acetato de etilo y agua; 10
d) tratamiento de la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro y evaporación del disolvente;
e) purificación del compuesto de fórmula (I) por cromatografía en columna de gel de sílice FLASH.
Los compuestos de fórmula general (I) fueron sintetizados de acuerdo con la 15 metodología previamente descrita (ChemMedChem.2010,5(10), 1781-1787).
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la 20 invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN 25
Todos los experimentos se llevaron a cabo en ratas macho Zucker obesas (fa/fa) y delgadas (Fa/?) de 8-9 semanas de edad. Los animales se pusieron en jaulas individuales en una habitación con temperatura, humedad e iluminación (ciclos de 12 horas luz / oscuridad) controladas, y con acceso libre a comida y agua (dieta estándar de laboratorio). 30
OLHHA se disolvió en un vehículo conteniendo un 5% de Tween80 en salino y se administró intraperitonealmente (i.p.) a una dosis de 5 mg/kg (volumen de 1 ml/kg peso
corporal) al principio del ciclo de luz (09:00 h-10:00 h) durante 15 días consecutivos. Transcurridas 2h desde la última inyección, los animales fueron eutanizados usando pentobarbital sódico (50mg/kg, i.p.) y se extrajeron muestras de sangre e hígado. La sangre se centrifugó a 2100x g durante 8 min a 4ºC y el plasma obtenido se guardó a -80ºC para los posteriores análisis. Las muestras de hígado también se almacenaron a 5 -80ºC.
Ejemplo 1. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la ganancia del peso corporal y la ingesta en ratas Zucker.
Los animales recibieron diariamente una inyección (i.p.) de vehículo o de OLHHA (5 mg/kg) durante 15 días consecutivos. Para este experimento se usaron 8 ratas por 10 grupo. La ganancia de peso corporal total (g) y la ingesta de alimentos acumulada (g/kg de peso corporal) se evaluaron diariamente.
En las ratas delgadas, el OLHHA produjo una inhibición significativa de la ganancia de peso corporal y una disminución significativa en la ingesta de alimentos acumulada que comenzó en el quinto día de tratamiento en comparación con ratas tratadas con 15 vehículo (Figuras 1A, 1B). En ratas obesas, el tratamiento no produjo ningún efecto sobre la ganancia de peso corporal y la ingesta de alimentos acumulada (Figuras 1C, 1D). Los resultados se expresan como medias ± SEM (n = 8 animales por grupo). Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (genotipo y el tratamiento) y análisis post-hoc de Bonferroni.*p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001 denotan diferencias significativas en 20 comparación con el grupo tratado con vehículo.
Ejemplo 2. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el contenido de grasa en hígado y el nivel de triglicéridos en plasma en ratas Zucker.
El contenido de grasa total en el hígado y el nivel de triglicéridos en plasma se 25 evaluaron en ratas Zucker delgadas y obesas después de un tratamiento de 15 días con OLHHA (5 mg/kg, una vez al día). Las muestras para el análisis de lípidos se obtuvieron 2h después de la última inyección.
Para la cuantificación de la grasa hepática se siguió el método de Bligh & Dyer (Bligh and Dyer, 1959). Los lípidos totales fueron extraídos utilizando una mezcla extractiva 30 compuesta por cloroformo:metanol en una proporción 2:1 (v/v); además, como la mayoría de los lípidos contienen dobles enlaces sensibles a la oxidación, se añadió un 0.025% del antioxidante butilhidroxitolueno. Las muestras de hígado se homogeneizaron y se centrifugaron un par de veces a 2800x g durante 10 min a 4ºC.
Los lípidos, que estaban concentrados en la fase orgánica inferior, fueron extraídos y desecados en corriente de nitrógeno. El contenido de grasa se expresó como % del peso de tejido.
Para la determinación de triglicéridos circulantes se utilizó un kit comercial (Randox Laboratories) que se basa en un método colorimétrico que determina el contenido de 5 triglicéridos tras una hidrólisis enzimática con lipasas.
Las ratas obesas mostraron un aumento de tres veces en el contenido total de grasa en el hígado en comparación con las ratas delgadas (Figura 2A), así como un marcado aumento en los triglicéridos (cinco veces) circulantes (Figura 2B). En ambos casos, el tratamiento con OLHHA previno de estos incrementos. Los resultados se expresan 10 como medias ± SEM (n = 8 animales por grupo). Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (genotipo y el tratamiento) y análisis post-hoc de Bonferroni. *p<0.05 y ***p<0.001 denotan diferencias significativas en comparación con el grupo tratado con vehículo correspondiente. ###p<0.001 denota diferencias significativas en comparación con el grupo delgado tratado con el vehículo. 15
OLHHA reduce los niveles de grasa en el hígado y de triglicéridos plasmáticos en animales obesos con hígado graso.
Ejemplo 3. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el nivel de transaminasas hepáticas en ratas obesas.
Para la determinación de transaminasas hepáticas en suero se utilizaron kits 20 comerciales y se analizaron en un analizador de bioquímica automático Hitachi 737.
La administración de 5 mg/kg (i.p.) de OLHHA durante 15 días produjo una disminución en los niveles de enzimas transaminasas: alaninoaminotransferasa (ALT) (Figura 3A) y la aspartatoaminotransferasa (AST) (Figura 3B) en animales obesos, resultando estadísticamente significativo en el caso de ALT (*p<0.05). Estas enzimas 25 son indicadoras del daño a la célula hepática. Las ALT y AST son enzimas en las células hepáticas que permean hacia la circulación sanguínea cuando existe daño en la célula hepática. Se cree que la ALT es un indicador más específico de la inflamación hepática, mientras que la AST puede aparecer elevada en enfermedades de otros órganos, como el corazón o el músculo. La ALT y la AST son a menudo usadas para 30 valorar el avance de la hepatitis crónica.
Respecto a la enzima gammaglutamiltranspeptidasa (GGt) (Figura 3C) no observamos efecto respecto al grupo tratado con vehículo. GGt es una enzima indicadora de obstrucción del sistema biliar, ya sea en el hígado o en los canales mayores de la bilis
que se encuentran fuera de este órgano. La GGt se incrementa en una gran cantidad de trastornos que afectan el drenaje de la bilis, como cuando existe una enfermedad hepática causada por el alcohol o las drogas, que ocasiona un bloqueo del flujo de la bilis en los canales más pequeños dentro del hígado.
OLHHA mejora el perfil de transaminasas hepáticas en plasma con una caída de ALT 5 y AST.
Ejemplo 4. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el nivel de citoquinas pro-inflamatorias en ratas obesas.
Los niveles circulantes de IL-6 y TNF-α se midieron mediante ELISAs utilizando kits comerciales (Abcam). 10
La administración de 5 mg/kg (i.p.) de OLHHA durante 15 días indujo una caída de citoquinas pro-inflamatorias (Figura 4), concretamente sobre TNF alfa aunque no llegó a alcanzar un grado de significatividad. No obstante no se detectó cambios sobre los niveles plasmáticos de IL6. Numerosas patologías, incluida la obesidad y trastornos relacionados como la esteatosis hepáticas se caracterizan por presentar un perfil pro-15 inflamatorio a través de citoquinas y células inmunitarias.
OLHHA mejora el perfil pro-inflamatorio de animales obesos con una reducción de TNFα en plasma.
Ejemplo 5. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre el nivel de proteínas plasmáticas relacionadas con la función renal en ratas obesas. 20
Para la determinación de creatinina y urea en suero se utilizaron kits comerciales y se analizaron en un analizador de bioquímica automático Hitachi 737.
La administración de 5 mg/kg (i.p.) de OLHHA durante 15 días no afectó a los niveles de creatinina (Figura 5A) pero provocó una importante disminución en los niveles de urea (***p<0.001) respecto a los animales tratados con vehículo (Figura 5B). Esta 25 disminución en la concentración de urea se relaciona con una normalización de la actividad hepática y del catabolismo de proteínas.
La creatinina y la urea son dos sustancias presentes en la sangre que suelen ser determinadas cuando se pretende hacer una evaluación de la función renal.
Medir la creatinina es una prueba simple y es el indicador más común de la función 30 renal, de su capacidad de filtración. En cuanto a la urea, es el resultado final del
metabolismo de las proteínas y se forma en el hígado a partir de la destrucción de las proteínas.
OLHHA mejora la función renal a través de una reducción de los niveles plasmáticos incrementados de urea.
Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la expresión de genes en el hígado 5 de ratas Zucker.
Para el aislamiento del ARN total del hígado, las muestras se homogeneizaron en Trizol y posteriormente se purificaron utilizando el RNeasy Minelute Cleanup Kit de Qiagen (elimina selectivamente la mayoría de las moléculas menores a 200 nucleótidos), que también incluyó un tratamiento con ADNasa. La concentración total 10 de ARNm se cuantificó utilizando un espectrofotómetro. En todos los casos, la ratio A260/280 estaba entre 1.8 y 2. La síntesis del ADN complementario se llevó a cabo por transcripción reversa utilizando el kit Transcriptor Reverse Transcriptase (Transcriptor RT, Roche Diagnostic). Para la PCR a tiempo real (RT-qPCR) se utilizó un ABI PRISM® 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) y sondas 15 TaqMan. La amplificación de un solo producto se confirmó mediante el análisis de las curvas de Melting. Los valores de cada muestra fueron normalizados respecto al gen constitutivo beta-actina. La cuantificación relativa fue calculada mediante el método ΔΔCt y normalizada al grupo control. Las sondas Taqman fueron obtenidas de la base de datos del genoma de la rata de Applied Biosystems 20 (http://bioinfo.appliedbiosystems. com/genome-database/gene-expression.html):
Gen
ID Nº GenBank Longitud amplicon
Beta-actina
Rn00667869_m1 NM_031144.2 91
FAS
Rn01463550_m1 NM_017332.1 148
HMG-CoAR
Rn00565598_m1 NM_013134.2 71
ACOX
Rn01460628_m1 NM_017340.2 63
INSIG2
Rn00710111_m1 NM_178091.4 89
NAPE-PLD
Rn01786262_m1 NM_199381.1 71
Ejemplo 6. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la expresión génica de enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos en el hígado de ratas Zucker.
La expresión del ARNm de las enzimas implicadas en las rutas para la lipogénesis (FAS y de la HMG-CoAR) o la oxidación de ácidos grasos (ACOX) se analizaron por RT-qPCR en el hígado de ratas Zucker tratadas crónicamente con OLHHA (Figura 6). 5 Los niveles de expresión génica de estas enzimas mostraron cambios significativos como resultado del tratamiento. De hecho, OLHHA produjo una disminución significativa de las enzimas implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos (Figura 6A) y en la biosíntesis de colesterol (Figura 6B). Por el contrario, el compuesto indujo un aumento significativo de la ACOX (Figura 6C), la enzima implicada en β-oxidación. Los 10 resultados están expresados como medias ± SEM (n = 8 animales por grupo). Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (genotipo y el tratamiento) y análisis post-hoc de Bonferroni. *p<0.05 y ***p<0.001 denotan diferencias significativas en comparación con el grupo tratado con vehículo correspondiente. ##p<0.01 y ###p<0.001 denotan diferencias significativas en comparación con el grupo delgado tratado con el 15 vehículo.
Ejemplo 7. Efectos del tratamiento crónico con OLHHA sobre la expresión génica de INSIG2 y NAPE-PLD en el hígado de ratas Zucker.
La expresión del ARNm del factor regulador INSIG2 y de la enzima implicada en la biosíntesis de la anandamida, la NAPE-PLD, se analizaron por RT-qPCR en el hígado 20 de ratas Zucker tratados crónicamente con OLHHA (figura 7). La expresión de INSIG2, un factor regulador de la biosíntesis de colesterol, se incrementó significativamente por OLHHA (Figura 7A), mientras que la expresión del gen de la NAPE-PLD, un factor pro-lipogénico relacionada con el sistema endocannabinoide, se redujo significativamente después del tratamiento OLHHA (Figura 7B). Los resultados se expresan como 25 medias ± SEM (n = 8 animales por grupo). Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (genotipo y el tratamiento) y análisis post-hoc de Bonferroni. *p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001 denotan diferencias significativas en comparación con el grupo tratado con vehículo correspondiente. ###p<0.001 denota diferencias significativas en comparación con el grupo delgado tratado con vehículo. 30
Ejemplo 8.Cardiotoxicidad del OLHHA.
El ensayo de canal de hERG se utilizó para identificar si OLHHA puede tener potencial para causar cardiotoxicidad (Figura 8). Para caracterizar mejor el comportamiento del canal de potasio hERG en presencia del compuesto se utilizó un ensayo funcional
basado en la utilización de una sonda fluorescente (FluxORTM, Invitrogen) que emite fluorescencia tras su unión a iones talio (Beacham et al. 2010). El FluxORTM está protegido por grupos AM que impiden la fluorescencia fuera de la célula. Cuando entra en la célula, las esterasas del citosol eliminan los grupos AM, y el FluxORTM pasará a su forma activa en la que es capaz de unir el talio, que pasa al citoplasma a través del 5 canal hERG, resultando en la emisión de fluorescencia. Las células HEK293 expresando el canal hERG se sembraron en placas negras de 96 pocillos tratadas con poli‐D‐lisina y se dejaron incubando durante 24 h. Después de este tiempo, las placas fueron lavadas con tampón de ensayo (NaCl 165 mM, KCl 4.5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1mM, Hepes 10 mM y glucosa 10 mM, pH 7.4). A continuación se añadieron 20 10 μl de FluxORTM disuelto en tampón de ensayo. El fluorocromo se dejó incubando con las células durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las placas con 50μl de tampón de ensayo y se añadió el compuesto OLHHA a una dilución 1:200 (2 μl de OLHHA / 400μl de tampón de ensayo) utilizando una estación EP3. De la mezcla, 20 μl fueron pipeteados a 3 placas de células, siendo ensayado por triplicado 15 en curvas de 12 puntos (diluciones 1:2) a una concentración máxima de 150 μM. Las placas fueron incubadas con OLHHA 30 minutos y a continuación se leyeron en un FLIPRTETRA, el cual añadió 5 μl de tampón de estímulo (Tl2SO4 + K2SO4), y realizó la lectura de la fluorescencia durante 120 s, permitiendo analizar la cinética del canal.
En los estudios con células HEK-293 que expresan hERG, OLHHA no mostró ninguna 20 actividad, encontrándose una IC50 superior a 150 μM en comparación con los inhibidores estándar de control (valores de IC50 para la amiodarona, 1.7 M; bepridil, 2.2 M; haloperidol, 1.9μM; terfenadina, 1.0μM). Por lo tanto, OLHHA es un medicamento con actividad inhibidora de hERG y se puede considerar un fármaco seguro desprovisto de cardiotoxicidad. 25
OLHHA no presenta efectos cardiotóxicos.
Ejemplo 9. Farmacocinética del OLHHA.
Los citocromos P450 (CYP) son una familia de enzimas que juegan un papel importante en el metabolismo de fármacos. La evaluación del potencial de un compuesto para inhibir una enzima específica del CYP es importante a la hora de 30 conocer la co-administración de compuestos, que puede dar lugar a que uno o ambos inhiban el metabolismo del otro. Esto puede afectar los niveles de plasma in vivo y potencialmente dar lugar a reacciones adversas o toxicidad. Los datos de inhibición de citocromo P450 in vitro son útiles en el diseño de estrategias para investigar estudios clínicos de interacción fármaco-fármaco (drug-drug interaction). 35
Para la preparación del OLHHA, éste fue guardado en condiciones óptimas (a 4ºC, protegido de la luz) hasta su utilización. OLHHA en estado sólido (polvo) se disolvió en DMSO a 30 mM. y fue diluido de modo seriado con un factor de dilución de 2 para la obtención de 8 concentraciones. Se sabe que los CYPs son inhibidos por una variedad de solventes orgánicos y los efectos de esta inhibición pueden variar según el tipo y 5 concentración del solvente. Por ello, cuando DMSO se utiliza como solvente la concentración recomendada es 0.35% o menos. Sin embargo, el acetonitrilo es tolerado por la mayoría de CYPs humanos. Teniendo en cuenta esto, las diluciones seriadas de compuesto DMSO se diluyeron con acetonitrilo. De este modo el contenido orgánico final y dosis máxima en el ensayo quedaron establecidos en 0.35% 10 DMSO, 0.65% acetonitrilo y 105 µM respectivamente. OLHHA fue testado por triplicado. La interferencia fluorescente (Quenching) fue determinada con cada dilución de OLHHA. Las incubaciones se realizaron en el intervalo de tiempo lineal y la concentración de sustrato se acercó a la constante de Michaelis-Menten Km
OLHHA no mostró fluorescencia o interferencias en quenching. OLHHA exhibió 15 valores de IC50 mucho más altos que los inhibidores de control de las isoenzimas CYP (CYP3A4, CYP2C9 y CYP2D6).
Los resultados se muestran a continuación:
Tabla 1. Ensayo fluorométrico de inhibición del citocromo P450 usando como inhibidor control el Cetoconazol. 20
Compuesto
CYP3A4 IC50 (μM) Lower Upper 95% CL 95% CL
OLHHA Cetoconazol
14,8 0,05 12,8 17,2 0,04 0,07
CL: nivel de confianza
Tabla 2. Ensayo fluorométrico de inhibición del citocromo P450 usando como inhibidor control el Sulfafenazol.
Compuesto
CYP2C9 IC50 (μM) Lower Upper 95% CL 95% CL
OLHHA Sulfafenazol
6,8 0,2 5,9 7,8 0,2 0,3
CL: nivel de confianza
Tabla 3. Ensayo fluorométrico de inhibición del citocromo P450 usando como inhibidor control la Quinidina.
Compuesto
CYP2D6 IC50 (μM) Lower Upper 95% CL 95% CL
OLHHA Quinidina
23,3 0,02 21,4 25,3 0,01 0,02
CL: nivel de confianza
Inhibidores fuertes IC50<1μM
Inhibidores moderados 1μM <IC50<10μM 5
Inhibidores débiles IC50>10μM
Tabla 4. Grado de inhibición del OLHHA.
Compuesto
CYP3A4 Categoría Inhibidor CYP2C9 Categoría Inhibidor CYP2D6 Categoría Inhibidor
OLHHA
Débil Moderado Débil
OLHHA por lo tanto puede ser considerado como un inhibidor de CYP moderado/débil, 10 indicando un buen perfil farmacocinético de no interacción con otros fármacos y efectos adversos.

Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Uso del compuesto de fórmula general (I):
    (I) 5
    donde
    X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H, halógeno y metilo;
    n es un número entero desde 1 a 4;
    R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se 10 seleccionan entre H y alquilo C1-C6 o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos átomos de oxígeno, formando un nuevo ciclo;
    R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y alquenilo C1-C4;
    R4 se selecciona entre H, halógeno y alquilo C1-C4;
    R5 es un compuesto de fórmula general (II): 15
    (II)
    donde en el compuesto de formula general (II):
    - R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C4; y
    - R7 se selecciona entre alquilo C8-C30 y alquenilo C8-C30 o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente 5 aceptables, o cualquiera de sus combinaciones,
    en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso.
    10
  2. 2. El uso del compuesto según la reivindicación 1, donde la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis.
  3. 3. El uso del compuesto según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad 15 causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD).
  4. 4. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
    20
  5. 5. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde X e Y pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y CH3.
  6. 6. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde n es 25 1.
  7. 7. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes de forma independiente y se seleccionan entre H y metilo o pueden estar unidos por un enlace simple entre los dos 30 átomos de oxígeno formando un nuevo ciclo.
  8. 8. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 donde R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C3.
    35
  9. 9. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 donde R3 es H.
  10. 10. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde R4 se selecciona entre H y CH3.
    5
  11. 11. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde R4 es CH3.
  12. 12. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde R5 es un compuesto de fórmula (II): 10
    (II)
    donde R6 se selecciona entre H y CH3 y R7 es un grupo alquenilo C15-C25.
  13. 13. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde R7 tiene un número de insaturaciones entre 1 y 6.
    15
  14. 14. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde R7 tiene más preferiblemente un número de insaturaciones entre 1 y 4.
  15. 15. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el compuesto se selecciona de entre cualquiera de los compuestos seleccionados 20 de la lista que consiste en:
    Fórmula (III)
    Fórmula (IV)

    Fórmula (V)
    Fórmula (VI)
    Fórmula (VII)
    Fórmula (VIII)

    Fórmula (IX)
    Fórmula (X)
    Fórmula (XI)
    Fórmula (XII)

    Fórmula (XIII)
    Fórmula (XIV)
    Fórmula (XV)
    o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables.
  16. 16. El uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el compuesto es la N-(1-(3,4-dihidroxifenil)propan-2-il)oleamida (OLHHA),
    5
    10
    Fórmula (III)
    o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables.
  17. 17. El uso de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los 15 compuestos de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado 20 graso.
  18. 18. El uso de una composición según la reivindicación 17, donde la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis.
    25
  19. 19. El uso de una composición que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento de 30 una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD).
  20. 20. El uso de una composición según la reivindicación 19, donde la enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la esteatohepatitis no 35 alcohólica (NASH).
  21. 21. El uso de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, donde la composición además comprende otro principio activo.
  22. 22. El uso de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5 17-20, donde la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  23. 23. Una composición alimentaria, nutracéutica o del tipo alimento médico (del inglés “medical food”) que comprende al menos uno de los compuestos de 10 fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
  24. 24. El uso de la composición alimentaria según la reivindicación anterior, para la prevención, alivio y/o tratamiento del hígado graso o de una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso. 15
  25. 25. El uso de la composición alimentaria según la reivindicación 24, donde la enfermedad causada por hígado graso es la esteatohepatitis.
  26. 26. El uso de la composición alimentaria según cualquiera de las reivindicaciones 20 23-24, para la prevención, alivio y/o tratamiento una enfermedad o condición patológica causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD).
  27. 27. El uso de la composición alimentaria según la reivindicación 26, donde la enfermedad causada por hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la 25 esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
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