ES2564416T3 - Método in vitro para la detección de Candida glabrata, kit de diagnóstico y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención describe y reclama un método in vitro parala identificación de Candida Glabrata, las secuencias asociadas adicha identificación, así como kits de diagnostico para identificar a C. glabrata y el uso de los mismos.

Description

DESCRIPCION

METODO IN VITRO PARA LA DETECCION DE CANDIDA GLABRATA, KIT DE DIAGNOSTICO Y USOS DE LOS MISMOS.

5 CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion pertenece al campo de la biotecnologia, en especial a metodos de diagnostico molecular realizados in vitro.

10 ANTECEDENTES

Historicamente se ha considerado a Candida glabrata como un saprofito relativamente no patogenico en la flora normal de individuos sanos. Es decir, que rara vez causa infecciones serias en humanos. Sin embargo, en virtud del incremento en el uso de terapias inmunosupresoras junto con terapias con antimicoticos de amplio espectro, la frecuencia de infecciones 15 causadas por C. glabrata en mucosas o en vias sistemicas se ha incrementado de manera significativa. De hecho, dependiendo del sitio de infeccion, C. glabrata es generalmente la segunda o tercera causa de infeccion mas comun despues de C albicans, representando un 17 a 23% de los casos de candidiasis en el torrente sanguineo en pacientes de 16 a 65 afios <M. A. Pfaller, et. al, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 2002, p. 852-856 Vol. 40, No. 3). Asimismo, las infecciones por C. glabrata son comunes en huespedes anormales, por ejemplo, personas 20 inmunocomprometidas, pacientes con diabetes mellitus, pacientes con cancer o, por otro lado, en neonatos o personas de la tercera edad. Es tambien comun en ambientes hospitalarios y en pacientes que han sido sometidos a cirugia, han sido manipulados por el personal del hospital (cateterismos) o han estado internados por periodos prolongados y la mortalidad en dichos pacientes es igual a la de infecciones causadas por C. albicans.

25 Ademas, en el campo de la medicina veterinaria se ha reportado infecciones por levaduras en vacas, en donde un porcentaje importante corresponde a C. glabrata. (Costa, G.M. et al., Cienc. Rural, 2008, Vol 38, No. 7, pp.1938-1942). Por lo que se considera que un diagnostico rapido y preciso en mamiferos es necesario para abatir la incidencia de C. glabrata.

Las infecciones de C. glabrata son dificiles de tratar y generalmente son resistentes a muchos agentes antifungicos del tipo 30 de los azoles, especialmente fluconazol, que es el antimicotico mas recetado para casos de candidiasis. Por lo tanto, al ser resistentes a los antifungicos comunes y por falta de un diagnostico rapido y preciso, las infecciones de C. glabrata tienen una alta mortalidad en pacientes hospitalarios.

Metodos de diagnostico para C. glabrata 35

Existen tres grupos de metodos de diagnostico para candidiasis reportados en la literatura: por seleccion en medio de cultivo, pruebas bioquimicas y pruebas moleculares.

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Entre los metodos de seleccidn por medio de cultivo estan reportados, a manera de ejemplo, el Mycosis IC/F, el Plus Aerobic/F standard y ChroM-agar, entre otros. La caracterlstica principal de estos medios de cultivo es que permiten diferenciar distintas especies de Candida por tipo y color de colonia Sin embargo, los tiempos de incubacion van de entre 24 a 43 haras, o hasta 7 dias y ademas la especificidad y sensibilidad no alcanzan porcentajes optimos (van desde un 37.5% hasta un maximo de 96%). (J. Clin. Microbiol. Feb. 2004, pp 773-777, Vol. 42 No. 2; J. Clin. Microbiol., Ene. 2004, pp 115-118, Vol. 42, No. 1; J. Clin. Microbiol. Oct. 2003, pp. 4714-4717, Vol. 41, No. 10). Por lo tanto, aun cuando son metodos economicos para el diagnostico, los resultados obtenidos son poco especlficos y muy tardados, por lo que para el caso de C. glabrata, implican poner en riesgo la vida del paciente.

En cuanto a los metodos bioquimicos, se incluyen los siguientes: los sistemas API 20 6 API 20C (Bio-Merieux Vitex Inc.) estan basados en pruebas de asimilacion de carbohidratos para la identificacion de las levaduras clinicamente relevantes, su tiempo de incubacion es de aproximadamente 72 horas, pero siempre se recomienda hacer una correlacion con morfologia en cultivos o metodos similares, por lo que no es 100% especifica la identificacion de hongos. Existen pruebas mejoradas como la Vitex Yeast Biochemical Card, el cual es un sistema automatizado en donde se hacen 26 pruebas bioquimicas convencionales y 4 controles negativos, con una precision mayor o igual al 85%, pero en caso de que la precision sea menor hay que hacer pruebas morfologicas adicionales (J. Clin. Microbiol. May 1994, pp. 1184-1187, Vol. 32, No. 5; J. Clin. Microbiol., jun 1999, pp. 1967-1970, Vol. 37, No. 6; J. Clin. Microbiol., abril, 1998, pp. 883-886, Vol. 36 No. 4; J. Clin. Microbiol. Mayo 1998, pp. 1443-1445, Vol. 36, No. 5).

Otros metodos estan basados en la asimilacion de trehalosa de C. glabrata, y en la falta de asimilacion de sacarosa. Sin embargo, en estos casos hay falsos positivos con Candida tropicalis, se necesita una gran cantidad de inoculo y los resultados suelen depender del medio de cultivo. En ciertos casos la densidad del inoculo dificulta la lectura de colores en las placas y el laboratorista debe ser muy experimentado para estandarizar la tecnica (J. Clin. Microbiol., Mar 2001, pp 1172-1174, Vol. 39 No. 3). Dentro de estos metodos se encuentran las Rosco

Diagnostic Plates, Glabrata RTT y Dipstick Test, etc.

De los reportes anteriores se deriva que aun cuando las pruebas bioquimicas sean relativamente rapidas, siempre se recomienda hacer analisis complementarios que aumentan el tiempo de obtencion de resultados, dependen de la destreza del laboratorista y/o del tipo de medio de cultivo, por lo que se requiere un sistema que identifique C. glabrata sin la necesidad de hacer pruebas suplementarias, mejorando la eficiencia y que provea informacion clinica relevante de manera rapida y a bajo costo.

Dentro de los metodos moleculares se describe en la literatura (J. Clin. Microbiol., Die 2005, pp. 5912-5915, Vol. 43 No. 12) un metodo para identificar 7 especies de Candida por medio de HPLC desnaturalizante, el cual permite un analisis de alta resolucion de productos de PCR a partir de cultivos de sangre, en donde las amplificaciones son de las regiones variables ITS2 con un analisis subsecuente con el sistema de analisis microbiano WAVE. El HPLC desnaturalizante separa los productos de PCR los cuales son tenidos con tincion intercalable y se visualizan con un detector de fluorescencia. Este metodo es de alto costo y requiere un dia de trabajo.

Asirnismo, se ha reportado el uso de hibridacion por fluorescencia in situ (FISH) con sondas de PNA para C.albicans (J. Clin. Microbiol. Jun 2002, pp. 2182-2186, Vol. 40, No. 6; J. Clin. Microbiol., Nov. 2007, pp. 3802-3803, Vol. 45, No. 11; J. Clin. Microbiol., Jun 2005, pp. 2909-2912, Vol. 43 No. 6; J. Clin Microbiol., Sep 2006, pp. 3381-3383, Vol. 44, No. 9), en donde se reportan datos variables en cuanto a la especificidad y sensibilidad del metodo, ya que en ciertos reportes hay inconsistencias con cepas clinicas que no dieron un resultado positivo, pero que al hacer las pruebas bioquimicas detectaron especies diferentes de Candida, en algunos casos no detecta especies de Candida diferentes en mezclas, y la fiabilidad de la prueba depende del diseno de las sondas de oligonucleotidos. En uno de dichos reportes destaca la necesidad de sondas especificas para C. glabrata.

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Otros ejemplos de metodos moleculares para la detection de Candida glabrata basados en la identification de regiones internas del espaciador de transcrito (regiones de espaciador transcritas internas ITS) de ADN ribosomal como aquellas reportadas en la Patente Norteamericana 5,631,132, US 5,688,644, US 5,426,027, US 6,858,387 (equivalente a WO 00/73499 A2), US 7,427,472 y W098/11257. Tambien, ha habido metodos para detectar una region hipen/ariable dentro de la region ribosomal 28S como se reporta en US 5,707,802, US 5,763,169 y US 6,180,339. Sin embargo, la confiabilidad de los metodos de diagnostico a traves de la detection de regiones de ADN ribosomal es menor en una mezcla de organismos filogeneticamente cercanos.

Mas aun, hay metodos para la identification de Candida glabrata para detectar regiones de ciertas proteinas. La US Patent 6,497,880 reporta un metodo detectando las secuencias geneticas que codifican para proteinas en respuesta a calor (proteinas de cheque termico, HSPS). Por otro lado la US Patent 6,017,699 reporta un metodo para identificar Candidas detectando secuencias del gen de la quitina sintasa 1 CHS1 (quitina sintasa). Los metodos para identificar Candida por secuencias especificas en genes conservados pueden reducir su confiabilidad en una mezcla de organismos filogeneticamente cercanos.

Adhesinas en C. glabrata

Las adhesinas son proteinas tipo lectina que se han descrito en diversas especies de patogenos, entre ellas, C. albicans y C. glabrata. Dichas especies se adhieren a las celulas epiteliales del hospedero por medio del reconocimiento de los carbohidratos de la pared celular del mismo.

En C. glabrata se identified una proteina de pared celular llamada Epa1 que es la principal adhesina responsable de la adherencia que presentan las celulas de C. glabrata a las celulas epiteliales in vitro. Epa1 es una lectina que reconoce glicoconjugados de N-acetil-lactosamina presentes en la superficie de las celulas epiteliales de mamiferos (Cormack et al., 1999).

El gen EPA1 se identified inicialmente al buscar mutantes de C. glabrata que fueran incapaces de adherirse a celulas epiteliales in vitro, y se demostro que una delecion del gen EPA1 reducia la adherencia de C. glabrata a niveles no detectables. Asimismo, EPA6 y EPA7 son genes que codifican para otras adhesinas (confieren adherencia a cerevisiae cuando se expresan ectopicamente), y estan localizados en regiones subtelomericas (Secuencias Gene Bank AY646926 y AY646925, respectivamente). Esta localizacion tiene como consecuencia que EPA6 y EPA7 (y las demas adhesinas subtelomericas) no se expresen in vitro. Durante infecciones de vias urinarias sin embargo, al menos Epa6 se induce (Domergue et al., 2005).

El genoma de C. glabrata contiene una familia de proteinas de pared celular de al menos 23 miembros. EPA1 esta agrupado con otros dos genes relacionados, EPA2 y EPA3, en una region adyacente al telomero del lado derecho del cromosoma E (Secuencia Gene Bank AY344226). En la region subtelomerica del lado derecho del cromosoma I, tambien encontramos los genes EPA4 y EPA5 (De Las Penas et al., 2003) (Secuencia Gene Bank AY344225). En total, de los 23 miembros de la familia Epa, al menos 17 se localizan en regiones adyacentes a los telomeros, y durante el crecimiento in vitro son transcripcionalmente inactivos (Brown et. al. 2005; De Las Penas et al., 2003). Esta regulacion negativa depende de la estructura represiva de la cromatina en regiones cercanas a los telomeros (silenciamiento subtelomerico).

Por analisis bioinformatico, se ha deducido que EPA1, EPA6 y EPA7 son los mas homologos entre si en el extremo amino terminal.

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Con el objelo de superar los retos tecnicos de la identificacion especifica y sensible de C. glabrata, la presente invencion surge de una estrategia de analisis de las regiones intergenicas de las adhesinas, en especial de las variantes de las regiones que contienen las secuencias de los elementos negativos (EN) para identificar Candida glabrata.y a parti de la evidencia de su utilidad en la identificacion de este organismo, cabe mencionar que esta estrategia no ha sido abordada en ningun reporte de arte previo, por lo que es novedosa, no obvia y sujeta a aplicacion industrial.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Diagrama de localizacion de los oligonucleotidos generados a lo largo de las SEQ. ID. Nos 1 a 5. Los numeros corresponden a las SEQ. ID. Nos. 6 a 52 y su posicion y orientacion sobre las secuencias SEQ. ID. Nos. 1 a 5.

Figura 2. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generates a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C1+ a C4+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C1- a C4-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M1+ a M4 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C tropicalis y C. guillermondii. Los carriles M1- a M4- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C parapsilosis, C. tropicalis y C guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 2205pb (muestras con C1 + y M1+), 289pb (muestras con C2+ y M2+), 196pb (muestras con C3+ y M3+) y 410 pb (muestras con C4+ y M4+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 3. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C5+ a C8+, son aquellos con ADN de C glabrata. Los carriles marcados C5- a C8-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M 5+ a M8 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Los carriles M 5- a M8- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 301 pb (muestras con C5+ y M5+), 267pb (muestras con C6+ y M6+), 130pb (muestras con C7+ y M7+) y 428 pb (muestras con C8+ y M8+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 4. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C9+ a C12+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C9- a C12-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae Los carriles M9+ a M12 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Los carriles M9- a M12- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 200pb (muestras con C9+ y M9+), 559pb (muestras con C10+ y M10+), 331pb (muestras con C11+ y M11+) y 306 pb (muestras con C12+ y M12+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 5. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C1+ a C4+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C1- a C4-, son aquellos con

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ADN de S. cerevisiae Los carriles M1+ a M4 + contienen ADN de C glabrata, C. albicans, C. kmzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii Los carriles M1- a M4- contienen ADN de C. albicans, C kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 2080pb (muestras con C1+ y M1+), 332pb (muestras con C2+ y M2+), 177pb (muestras con C3+ y M3+) y 673 pb (muestras con C4+ y M4+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 6. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identifcacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular Los carriles marcados C5+ a C8+, son aquellos con ADN de C. glabrata Los carriles marcados C5- a C8-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae Los carriles M 5+ a M8 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Los carriles M5-a M8- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 339pb (muestras con C5+ y M5+), 600pb (muestras con C6+ y M6+), 162pb (muestras con C7+ y M7+) y 1004 pb (muestras con C8+ y M8+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 7 Gel de agarosa al 2%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C9+ a C10+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C9- a C10-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M9+ a M10 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C kmzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C guilleimondii. Los carriles M9- a M10- contienen ADN de C. albicans, C kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 740pb (muestras con C9+ y M9+) y 741pb (muestras con C10+ y M10+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 8. Gel de agarosa al 0.6%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C1+ a C3+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C1- a C3-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M1+ a M3 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C guillermondii. Los carriles M1- a M3- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 8209pb (muestras con C1+ y M1+), 4531pb (muestras con C2+ y M2+) y 4596pb (muestras con C3+ y M3+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 9. Gel de agarosa al 1.5%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular Los carriles marcados C4+ a C6+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C4- a C6-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M 4+ a M6 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C parapsilosis, C. tropicalis y C. guillenvondii. Los carriles M 4- a M6- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 593pb (muestras con C4+ y M4+), 274pb (muestras con C5+ y M5+) y 859 pb (muestras con C6+ y M6+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 10 Gel de agarosa al 1.5%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C glabrata. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular Los carriles marcados C7+ a C10+, son aquellos con ADN de C. glabrata Los carriles marcados C7- a C10-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M 8+ a M10 + contienen ADN de C glabrata, C. albicans, C. kmzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Los carriles M7- a M10- contienen ADN de C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 918pb (muestras con C7+ y M7+), 2271pb (muestras con C8+ y M8+), 689pb (muestras con C9+ y M9+) y 1306 pb (muestras con C10+ y M10+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

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Figura 11. Gel de agarosa al 1.5%, en donde se muestran diversos pares de oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos: 1 a 5, utiles para la identificacion de C. glabrata En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular. Los carriles marcados C1+ a C3+, son aquellos con ADN de C. glabrata. Los carriles marcados C1- a C3-, son aquellos con ADN de S. cerevisiae. Los carriles M 1+ a M3 + contienen ADN de C. glabrata, C. albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Los carriles M 1- a M3- contienen ADN de C albicans, C. kruzei, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. guillermondii. Las bandas de amplificacion positivas para C. glabrata son de 2412pb y 1940pb (muestras con C1+ y M1+), 556pb (muestras con C2+ y M2+) y 427pb (muestras con C3+ y M3+). El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 12 Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la optimizacion del gradiente de temperatura para la reaccion de PCR con los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 7 y 8, las bandas identificadas son de 136 y 140 pb. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular y en los carriles 2 a 13 se muestran los productos de PCR a temperaturas de 54.0, 54.9, 56.3, 57.6, 59.0, 60.3, 61.4, 62.9, 64 4, 65.8, 67.1 y 67.6°C respectivamente, correspondientes a ADN de C. glabrata, lo que se comprobo con resecuenciacion de los productos de PCR. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 13. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la optimizacion del gradiente de temperatura para la reaccion de PCR con los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 6 y 8, las bandas identificadas son de 327, 348 y 364 pb. En los carriles 1 y 14 se muestra el marcador de peso molecular y en los carriles 2 a 13 se muestran los productos de PCR a temperaturas de 54.0, 54.9, 56.3, 57.6, 59.0, 60.3, 61.4, 62.9, 64.4, 65.8, 67.1 y 67.6°C respectivamente. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 14. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la optimizacion del gradiente de temperatura para la reaccion de PCR con los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 9 y 10, las bandas identificadas son de 601 y 664 pb. En los carriles 1 y 14 se muestra el marcador de peso molecular y en los carriles 2 a 13 se muestran los productos de PCR a temperaturas de 54.0, 54.9, 56.3, 57.6, 59.0, 60.3, 61.4, 62.9, 64.4, 65.8, 67.1 y 67.6°C respectivamente. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 15. Gel de agarosa al 2% en donde se optimiza la concentracion de primers para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 7 y 8, a una temperatura de 59°C, en donde en los carriles 1 y 8 se presentan los marcadores de peso molecular y en los carriles 2 a 7 las concentraciones de primers son de 100, 200, 400, 500, 600 y 800 nM. Los productos de PCR obtenidos son de 136 y 140 pb, lo cual se comprobo por resecuenciacion de los productos de PCR. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 16. Gel de agarosa al 2% en donde se optimiza la concentracion de primers para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos 6 y 8, a una temperatura de 67.1°C, en donde en el carril 1 se presenta el marcador de peso molecular y en los carriles 2 a 7 las concentraciones de primers son de 100, 200, 400, 500, 600 y 800 nM. Los productos de PCR obtenidos son de 327, 348 y 364 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 17. Gel de agarosa al 2% en donde se optimiza la concentracion de primers para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 9 y 10, a una temperatura de 61.4°C, en donde en el carril 1 se presenta el marcador de peso molecular y en los carriles 2 a 9 las concentraciones de primers son de 100, 200, 400, 500, 600, 800, 1000 y 1200 nM. Los productos de PCR obtenidos son de 601 y 664 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

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Figura 18. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la optimizacion de la concentracion de dNTPs para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 6 y 8, a una temperatura de 59°C y una concentracion de primers de 500 nM. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular, y en los carriles 2 a 8 se muestran las concentraciones de 5, 10, 15, 20, 30, 40 y 50 pM de dNTPs. Los productos de PCR obtenidos son de 136 y 140 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 19. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la optimizacion de la concentracion de dNTPs para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 7 y 8, a una temperatura de 67.1°C y una concentracion de primers de 200 nM. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular, y en los carriles 2 a 8 se muestran las concentraciones de 5, 10, 15, 20, 30, 40 y 50 pM de dNTPs. Los productos de PCR obtenidos son de 327, 348 y 364 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 20. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la optimizacion de la concentracion de dNTPs para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 9 y 10, a una temperatura de 61 4°C y una concentracion de primers de 400 nM. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular, y en los carriles 2 a 8 se muestran las concentraciones de 5, 10, 15, 20, 30, 40 y 50 pM de dNTPs. Los productos de PCR obtenidos son de 601 y 664 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 21. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la sensibilidad de la reaccion de PCR al variar la cantidad de ADN genomico de la muestra para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 6 y 8, a una temperatura de 59°C, una concentracion de primers de 500nM, una concentracion de dNTPs de 30pM. En los carriles 1 y 15 se muestran los marcadores de peso molecular, y en los carriles 2 a 14 se muestran las concentraciones de 345, 200, 20, 12.5, 2.5, 0.5, 0.1,0 02, 0.004, 0.0008, 0.00016, 0.000032 y 0 ng de ADN genomico. Los productos de PCR obtenidos son de 136 y 140 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 22. Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la sensibilidad de la reaccion de PCR al variar la cantidad de ADN genomico de la muestra para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 7 y 8, a una temperatura de 67.1°C, una concentracion de primers de 200nM, una concentracion de dNTPs de 30pM. En el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular, y en los carriles 2 a 14 se muestran las concentraciones de 345, 200, 20, 12.5, 2.5, 0.5, 0.1, 0.02, 0.004, 0.0008, 0,00016, 0.000032 y 0 ng de ADN genomico. Los productos de PCR obtenidos son de 327, 348 y 364 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)

Figura 23 Gel de agarosa al 2% en donde se muestra la sensibilidad de la reaccion de PCR al variar la cantidad de ADN genomico de la muestra para los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 9 y 10, a una temperatura de 61 4°C, una concentracion de primers de 400nM, una concentracion de dNTPs de 30pM En los carriles 1 y 15 se muestran los marcadores de peso molecular, y en los carriles 2 a 14 se muestran las concentraciones de 345, 200, 20, 12.5, 2.5, 0.5, 0.1, 0 02, 0.004, 0.0008, 0.00016, 0.000032 y 0 ng de ADN genomico. Los productos de PCR obtenidos son de 601 y 664 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 24. Gel de poliacrilamida nativo al 6%. Gel A: En el carril PM se muestra el marcador de peso molecular ADN pBR322/Msp I (Biogenica), en los carriles 2 a 5 se muestran los productos de reaccion de PCR obtenidos a 59° C, 500 nM de primers y 30pM de dNTP's con los oligonucleotidos de las SEQ. ID. Nos. 7 y 8, en donde las bandas obtenidas son de 136 y 140 pares de bases. Gel B: acercamiento del gel A: carril PM: bandas de 147 y 123 pares de bases del marcador de peso molecular pBR322/Msp I (Biogenica); los carriles 2 a 5 corresponden a las bandas de 136 y 140 pares de bases de los productos de PCR obtenidos utilizando los oligonucleotidos de las SEQ. ID. Nos. 7 y 8.

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Figura 25. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestra la sensibilidad y especificidad de la reaccion de PCR al utilizar muestras clinicas. Se utilizaron los oligonucledtidos de las SEQ ID Nos. 6 y 8. En el carril 1 se encuentra el marcador de peso molecular, en el carril 2, una muestra de ADN genomico de una cepa silvestre de C. glabrata, en el carril 3, una muestra de ADN genomico de C.albicans, en los carriles 4 a 15 muestras clinicas de orina. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 26. Gel de agarosa al 2%, en donde se muestra la sensibilidad y especificidad de la reaccion de PCR en muestras clinicas de sangre. En el carril 1 se encuentra el marcador de peso molecular, en el carril 2, el ADN genomico de una cepa silvestre de C. glabrata, en el carril 3, ADN genomico de una cepa silvestre de C.albicans, en el carril 4, una muestra de sangre negativa para C. glabrata, en los carriles 5 y 6, dos muestras de ADN genomico positivas para C. glabrata. Los productos de PCR son de 327, 348 y 364 pb. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 27. Geles de agarosa al 2%, en donde se demuestra que el elemento negativo unicamente se encuentra en C. glabrata y no en otras especies filogeneticamente relacionadas. Se utilizaron varias sondas, los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 9 y 10 para identificar el elemento negativo de C. glabrata en los carriles 2 a 17 y oligonucleotidos especificos de rRNA 26 S en los carriles 3 a 7, oligonucleotidos especificos de rRNA 18 S en los carriles 8 a 17. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 28 Geles de agarosa al 2% en donde se demuestra la especificidad de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5 en mezclas de C. glabrata con especies filogeneticamente cercanas. En el gel A, carril 2 se utilizan los oligonucleotidos con las SEQ ID Nos. 7 y 8, en los carriles 3 a 13 se utilizan oligonucleotidos de rRNA; en el gel B, en los carriles 2 a 13 se utilizan los oligonucleotidos de las SEQ. ID Nos 7 y 8, y en los carriles 3 a 13 se utilizan ademas oligonucleotidos de rRNA. En los carriles 1 a 13 de cada gel se corrieron en orden las siguientes muestras: carril 1, marcador de peso molecular; carril 2, elemento negativo de C. glabrata; carril 3, C. glabrata, carril 4, C. parapsilosis, carril 5, C. tropicalis\ carril 6, C. parapsilosis; carril 7, C. albicans', carriles 8 a 13, mezcla de C. albicans (100 ng) con C. glabrata en concentraciones de 345, 20, 10, 5, 2.5 y 0 ng de C. glabrata. Se observan bandas de amplificacion para los rRNA en los carriles 3 a 13 y unicamente en los carriles 2, 3 y 8 a 13 de 136 y 140 pb correspondientes a C. glabrata. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 29. Geles de agarosa al 2% en donde se identifica C. glabrata proveniente de diversos aislados clinicos. En los carriles M, se muestran los marcadores de peso molecular. En el carril C, se muestra el control positivo de C. glabrata. En los carriles 1 a 46 se muestran diversos aislados clinicos. Los carriles 14, 17 y 33 no muestran banda de amplificacion, mismo que sera explicado en la seccion de ejemplos. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 30. Geles de agarosa al 2% en donde se identifica C. glabrata proveniente de diversos aislados clinicos. En los carriles M, se muestran los marcadores de peso molecular. En el carril C, se muestra el control positivo de C. glabrata En los carriles 1 a 46 se muestran diversos aislados clinicos. Los carriles 14, 17 y 33 no muestran banda de amplificacion, mismo que sera explicado en la seccion de ejemplos. El marcador de peso molecular utilizado es 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 31 Uso de una molecula de ADN como sonda de hibridacion para la identificacion especifica de C. glabrata. En esta figura se muestra un analisis por Dot-blot, en donde en la fila 1 se muestra un producto de PCR como control interno, variando las cantidades de ADN de 50, 40, 30, 20 y 10 ng en los carriles A a E respectivamente. En la fila 2 se muestra el ADN de una muestra clinica de C. glabrata en cantidades de 10, 5, 2.5, 1 y 0.5 pg en los carriles A a E, respectivamente En la fila 3 se muestra el ADN de una muestra clinica de C. glabrata en cantidades de 5, 2.5, 1, 0.5 y 0.25 pg en los carriles A a E, respectivamente. En la fila 4 se muestra el ADN de una cepa silvestre de C. glabrata en cantidades de 10, 5, 2.5, 1 y 0.5

pg en los carriles A a E, respectivamente. En la fila 5 se muestra el ADN de una cepa silvestre de C. albicans en cantidades de 10, 5, 2.5, 1 y 0.5 pg en los carriles A a E, respectivamente. En la fila 6 se muestra el ADN de una cepa silvestre de Saccharomyces cerevisiae en cantidades de 10, 5, 2 5, 1 y 0.5 pg en los carriles A a E, respectivamente La sonda de C. glabrata utilizada es de 140 pb y se encuentra en la region intergenica de las SEQ. ID. Nos. 1 a 3.

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BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCI6N

En la presente invencion se describe y reclama una molecula de ADN, caracterizada porque es una region intergenica de adhesinas de C. glabrata y se selecciona a partir del grupo que consiste de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, 10 SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 5

En una modalidad adicional, dicha molecula de ADN de esta comprendida por las siguientes regiones intergenicas: EPA1 a EPA 2 para la SEQ ID No. 1(2225 pb), EPA-H a Telomero para la SEQ. ID No. 2(2438 pb), EPAK a EPA22 para la SEQ. ID. No. 3(8309 pb), EPA6 a Telomero para la SEQ. ID. No 4 (2432 pb) y EPA7 a Telomero para la SEQ. ID. No. 5 (2498 pb).

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Asimismo, se describe y reclama un oligonucleotido para la identificacion especifica de C. glabrata, caracterizado porque consiste de una secuencia continua de 15 a 35 nucleotidos de las secuencias de ADN que se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No 4 y SEQ ID No. 5. En donde dicho oligonucleotido esta caracterizado ademas porque consiste de las secuencias como se muestran en las SEQ ID Nos. 6 a 52. 20 Dicho oligonucleotido esta caracterizado ademas porque tiene una homologia de entre 90 y 100% con respecto a las SEQ ID Nos. 1 a 5.

En un aspecto adicional de la presente invencion, se describe y reclama un metodo in vitro para la identificacion especifica de C. glabrata, caracterizado porque comprende los pasos de: a) amplificar fragmentos de ADN a partir de una muestra 25 biologica mediante PCR con los oligonucleotidos descritos anteriormente y b) identificar los fragmentos de ADN amplificados. En dicho metodo la muestra biologica es derivada de un sujeto a estudio. En donde dicho sujeto a estudio es un animal mamifero, que en una modalidad preferida es, pero no se limita a un humano. En una modalidad preferida adicional, dicha muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de cualquier tipo de muestra que contenga ADN, fluidos, tejido, desecho o celula, orina chorro medio, cultivo de orina por sonda, cultivo por nefrostomla (rinon derecho e 30 izquierdo), agua de hemodialisis, liquido pleural, cultivo piogenos, mielocultivo, medula osea, hemocultivo por lisis (sangre periferica), cultivo de sangre (hemocultivo), concentrado leucocitario, concentrado eritrocitario, exudado faringeo, exudado nasal, exudado vaginal, exudado prostatico, expectoracion, cateter, biopsias de diferentes tejidos, tales como: ganglio, tejido subcutaneo, cornea, pulmon, nodulo pulmonar, pancreas, maxilar, piel, piel cuantitativa (celulitis, mama, escroto, brazo, mano), pelo, unas, tibia, musculo, hueso, mama, sinovial, escara, muslo, capsula articular, rodilla, epiplon; lavado 35 bronquioalveolar (lingula, lobulo superior e inferior (izquierdo y derecho), LBA derecho e izquierdo (vias aereas)); postmortem (higado, pulmon, bazo); herida; hisopado (perianal, vaginal, ulcera (pie, mano)); absceso (muslo, rifton, perianal); 6 peripancreatico.

En una modalidad adicional de dicho metodo, la amplificacion de fragmentos de ADN se lleva a cabo con al menos un 40 oligonucleotido como se definio anteriormente. Asimismo, en modalidades preferidas del metodo aqui descrito y reclamado, la temperatura de amplificacion de la reaccion de PCR es de entre 54° C y 67.6°C; la concentracion de ADN genomico es igual o mayor a 0.0008ng, preferentemente la concentracion de ADN genomico es de entre 0.0008ng a 345ng; ademas, la concentracion de oligonucleotidos es de entre 100nM y 1200nM y la concentracion de dNTPs es de entre 5 a 50 pM.

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Oentro de una modalidad adicional de la presente invencion se describe y reclama un kit para la identificacion especifica de Candida glabrata, caracterizado porque comprende los oligonucleotidos como se definieron anteriormente. En una modalidad preferida, dicho kit comprende al menos una muestra de ADN genomico de C. glabrata (control positivo) y al menos una muestra de ADN genomico de al menos una especie filogeneticamente relacionada con C. glabrata (control negativo)

En una modalidad preferida, se describe y reclama el uso de una molecula de ADN que es una region intergenica de adhesinas de C. glabrata y se selecciona a partir del grupo que consiste de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 5, como la descrita anteriormente, para generar oligonucleotidos utiles para la identificacion especifica de C. glabrata

Adicionalmente, se reclama y describe el uso de al menos dos oligonucleotidos caracterizados porque consisten de una secuencia continua de 15 a 35 nucleotidos de las secuencias de ADN que se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 y SEQ ID No. 5. En donde dichos oligonucleotidos estan caracterizados ademas porque consisten de las secuencias como se muestran en las SEQ ID Nos 6 a 52. Dichos oligonucleotidos estan caracterizados ademas porque tienen una homologia de entre 90 y 100% con respecto a las SEQ ID Nos. 1 a 5, para identificar C. glabrata.

Una modalidad preferida de la presente invencion comprende una molecula de ADN util para la identificacion especifica de C. glabrata, caracterizada porque consiste de una secuencia continua de 36 o mas nucleotidos comprendidos dentro de las secuencias de ADN que se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 5, en donde dicha molecula tiene una homologia de entre 90 y 100% con respecto a las SEQ ID Nos. 1 a 5, asi como su uso.

Dentro del alcance de la presente invencion se describe y reclama un metodo in vitro para la identificacion especifica de C. glabrata, caracterizado porque comprende los pasos de: a) hibridizar fragmentos de ADN a partir de una muestra biologica con las moleculas de ADN como se definieron en el parrafo anterior; b) identificar los fragmentos de ADN hibridizados, en donde los pasos a) y b) se llevan a cabo por medio de una tecnica seleccionada del grupo que comprende: Dot-Blot, Southern Blot, Northern Blot, hibridizacion in situ o microarreglos, en donde la muestra biologica es derivada de un sujeto a estudio, en donde el sujeto a estudio es un animal mamifero, en donde dicho animal mamifero es un humano. Dicha muestra biologica se selecciona del grupo que consiste de cualquier tipo de muestra que contenga ADN, fluidos, tejido, desecho o celula, orina chorro medio, cultivo de orina por sonda, cultivo por nefrostomia (rinon derecho e izquierdo), agua de hemodialisis, liquido pleural, cultivo piogenos, mielocultivo, medula osea, hemocultivo por lisis (sangre periferica), cultivo de sangre (hemocultivo), concentrado leucocitario, concentrado eritrocitario, exudado faringeo, exudado nasal, exudado vaginal, exudado prostatico, expectoracion, cateter, biopsias de diferentes tejidos, tales como: ganglio, tejido subcutaneo, cornea, pulmon, nodulo pulmonar, pancreas, maxilar, piel, piel cuantitativa (celulitis, mama, escroto, brazo, mano), pelo, uhas, tibia, musculo, hueso, mama, sinovial, escara, muslo, capsula articular, rodilla, epiplon; lavado bronquioalveolar (lingula, lobulo superior e inferior (izquierdo y derecho), LBA derecho e izquierdo (vias aereas); post-mortem (higado, pulmon, bazo); herida; hisopado (perianal, vaginal, ulcera (pie, mano)); absceso (muslo, rinon, perianal); 6 peripancreatico. Asimismo, el paso a) se lleva a cabo con al menos una molecula de ADN como se defmio anteriormente.

Por ultimo, dentro del alcance de la presente solicitud se encuentra un kit para la identificacion especifica de Candida glabrata, caracterizado porque comprende al menos una molecula de ADN como se definio anteriormente, en donde dicho kit comprende al menos una muestra de ADN genomico de C. glabrata (control positivo) y al menos una muestra de ADN genomico de al menos una especie filogeneticamente relacionada con C. glabrata (control negativo).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

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Obtencion de las secuencias v sondas de diagnostico.

Las secuencias descritas y reclamadas en la presente invencion se encuentran incluidas dentro de la secuencia de ADN genomico de C. glabrata (
http://cbi.labri.fr/Genolevures/elt/CAGL/), y en las secuencias de GeneBank Nos.: AY344225, AY344226, AY646926, AY646925. Sin embargo, y sin menoscabo para la patentabilidad de la presente invencion, su caracterizacion como secuencias regulatorias en cis de las adhesinas asociadas a las mismas y su uso como secuencias utiles para la identificacion de C. glabrata no ha sido descrita en ningun reporte cientifico o de bases de dates de patente.

Sin embargo, las secuencias regulatorias de los genes de adhesinas, objeto de la presente solicitud estan relacionadas con la regulacion de la expresion de, por ejemplo, la adhesina EPA1 Se ha observado que la regulacion de dicha adhesina in vitro es compleja: el gen esta reprimido en cultivos de celulas en fase estacionaria, y se induce fuertemente al diluirlas en medio fresco. A lo largo de la fase exponencial la expresion se reprime por la accion de un elemento negative (EN). El EN es un elemento en cis, y se mapeo inicialmente de manera funcional al extreme 3’ del TAA de EPA1. Por analisis bioinformatico se ha encontrado que el elemento mapeado funcionalmente, se encuentra solamente en C glabrata y por bloques, mismos que pueden variar dependiendo del serotipo analizado. El genoma de C. glabrata tiene 5 copias del EN (incluyendo el original al 3' de EPA1), asociadas con alguno de los genes de la familia EPA. La deteccion de los EN por medio de oligonuclebtidos generables a lo largo de la secuencia de dichas regiones es esencial para la identificacion de C. glabrata. En virtud de lo anterior, las secuencias identificadas como SEQ ID Nos. 1 a 5 comprenden las regiones intergenicas con los bloques de Elementos Negativos, y por lo tanto, cualquier oligonucleotido generable a partir de dichas secuencias es util para la identificacion de C. glabrata. En este tenor, la SEQ ID No. 1 (2225 pb), corresponde a la region intergenica entre los genes EPA1 y EPA2; la SEQ ID No. 2 (2438 pb), corresponde a la region intergenica entre el gen EPA- H y el Telomero; la SEQ ID No. 3 (8309 pb), corresponde a la region intergenica entre los genes EPA-K y EPA-22; la SEQ ID No 4 (2432 pb), corresponde a la region intergenica entre el gen EPA6 y el Telomero; y la SEQ ID No. 5 (2498 pb), corresponde a la region intergenica entre el gen EPA7 y el Telomero. A manera de ejemplo, y sin ser limitantes para el alcance de la presente invencion, se presentan las SEQ. ID Nos. 6 a 52, derivadas de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5, las cuales permiten la identificacion 100% especifica y sensible de aislados clinicos de C. glabrata de diferentes origenes. La alineacion relativa de las SEQ. ID. Nos. 6 a 52, sobre las SEQ ID. Nos. 1 a 5 se encuentra representada en la Figura 1. Dentro del alcance de la presente invencion quedaran asimismo comprendidas las secuencias complementarias en al menos 90% con las SEQ. ID. Nos 1 a 5.

A fin de comprobar que cualquier porcion de las secuencias descritas en las SEQ. ID Nos. 1 a 5 son utiles para la identificacion de C. glabrata, se generaron oligonucleotidos como los descritos en las SEQ. ID. Nos. 6 a 52, mismos que abarcan todas las regiones intergenicas de las adhesinas EPA1, EPA22, EPAH, EPA6 y EPA7. La posicion de dichos oligonucleotidos esta representada en la Figura 1, en donde se puede apreciar que dichos oligonucleotidos fueron generados desde los extremos hasta las regiones centrales. Asimismo, se comprobo su utilidad para la identificacion de C. glabrata sola o en mezcla con otras especies filogeneticamente relacionadas. En las figuras 2 a 11 se muestran las diferentes combinatorias obtenibles a partir de los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos 6 a 52 y los tamanos de producto de PCR esperados. Los resultados demuestran que la totalidad de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5 sirve como base para la generacion de oligonucleotidos especificos para C. glabrata, se mantiene la sensibilidad y la especificidad de la prueba, y que es posible detectar el hongo en mezcla con otras levaduras. Por lo tanto, cualquier oligonucleotido generable a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5 entra dentro del alcance de la presente solicitud.

Obtencion de muestras bioloqicas.

Las muestras biologicas provienen de un sujeto de estudio, el cual es un animal, mamifero, y en una modalidad preferida, dicho mamifero es un humano. Dichas muestras biologicas pueden provenir de cualquier fluido, tejido, desecho o celula que

contenga ADN en buenas condiciones para llevar a cabo el PCR. Tales muestras se pueden seleccionar, pero no estan limitadas a: orina chorro medio, cultivo de orina por sonda, cultivo por nefrostomia (rinon derecho e izquierdo), agua de hemodialisis, liquido pleural, cultivo piogenos, mielocultivo, medula osea, hemocultivo por lisis (sangre periferica), cultivo de sangre (hemocultivo), concentrado leucocitario, concentrado eritrocitario, exudado faringeo, exudado nasal, exudado 5 vaginal, exudado prostatico, expectoracion, cateter, biopsias de diferentes tejidos, tales como: ganglio, tejido subcutaneo, cornea, pulmon, nodulo pulmonar, pancreas, maxilar, piel, piel cuantitativa (celulitis, mama, escroto, brazo, mano), pelo, unas, tibia, musculo, hueso, mama, sinovial, escara, muslo, capsula articular, rodilla, epiplon; lavado bronquioalveolar (lingula, lobulo superior e inferior (izquierdo y derecho), LBA derecho e izquierdo (vias aereas)); post-mortem (higado, pulmon, bazo); herida; hisopado (perianal, vaginal, ulcera (pie, mano)); absceso (muslo, rinon, perianal); 6 peripancreatico.

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Metodo de diaanostico in vitro de Candida glabrata por PCR

De manera general, el metodo de la presente invencion consta de los siguientes pasos:

- Aislar el ADN proveniente de una muestra biologica,

15 - Realizar una reaccion de PCR utilizando los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ ID

Nos. 1 a 5, incluyendo, pero no limitados a los oligonucleotidos de las SEQ ID. Nos. 6 a 52.

Corroborar la presencia de Candida glabrata por medio de algun metodo convencional.

Dichos metodos convencionales son como se describen, pero no limitados a: Ausubel FM et al. (1999) Short protocols in 20 molecular biology: a compendium of methods from Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons; Fasmann GD (1989) Practical handbook of biochemistry and molecular biology. Florida CRC Press, 1989, Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Innis MA et al. (1990); PCR protocols : a guide to methods and applications Academic Press; Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ (1999) PCR applications : protocols for functional genomics. Academic Press; McClelland M, Honeycutt R, Mathieu-Daude F, Vogt T, 25 Welsh J (1997) Fingerprinting by arbitrarily primed PCR Methods Mol Biol. 85:13-24; McClelland M, Welsh J (1994) DNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR. PCR Methods Appl. 4:S59-65; McPherson MJ, Hames BD, Taylor GR (1995) PCR 2 : a practical approach. IRL Press; McPherson MJ, Quirke P, Taylor GR (1994) PCR : a practical approach. Oxford University Press; Evans IH (1996) Yeast protocols: methods in cell and molecular biology. New Jersey Humana Press.

30 La identificacion de C. glabrata se Neva a cabo con un 100% de especificidad y un 100% de sensibilidad, debido a que las secuencias SEQ ID Nos. 1 a 5 son exclusivas para el hongo y no se encuentran presentes en ningun otro organismo y este es el primer reporte de su utilidad para la identificacion de C. glabrata.

Para comprobar la eficiencia y especificidad del metodo de identificacion de la presente invencion, a continuacion se 35 muestran los siguientes experimentos:

Con el objeto de demostrar la estandarizacion de las condiciones experimentales para la identificacion especifica de C. glabrata, se eligieron los oligonucleotidos descritos en las SEQ ID Nos. 6 a 10, para ser probados en las siguientes condiciones:

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a) Optimizacion de gradiente de temperatura: los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 6 a 10 fueron probados en un rango de temperaturas de entre 54°C y 67.6°C. Como puede apreciarse en las Figures 12 a 14, dichos oligonucleotidos produjeron los fragmentos de PCR esperados de 136, 140, 327, 348, 364, 601 y 664 pb. Esto significa que la temperatura de reaccion puede variar de entre 54°C y 67.6°C sin que cambie el producto reaccion, su especificidad y sensibilidad.

b) Optimizacion de cantidad de primers: en las figures 15 a 17, se muestran los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 6 a 10, que fueron probados en concentraciones de entre 100 a 1200 nM, y a temperaturas de entre 59°C a 67.1°C, produciendo los fragmentos del tamano esperado en todos los casos.

c) Gradiente de concentracion dNTPs: en las figures 18 a 20 se muestra la optimizacion de la concentracion de dNTPs a diferentes temperatures de entre 59 y 67.1 °C y a una concentracion de primers de entre 200nM a 500nM. La concentracion de dNTPs es de entre 5 y 50 pM y en todos los casos se obtienen los productos de PCR del tamano esperado.

d) Concentracion de ADN genomico: en las figures 21 a 23 se muestra las concentraciones minimas necesarias para la amplificacibn del ADN genomico proveniente de muestras clinicas. Se utilizaron los diferentes pares de oligonucleotidos descritos en las SEQ ID Nos. 6 a 10, en temperaturas de entre 59°C a 67.1°C, a una concentracion de primers de entre 200nM a 500nM y una concentracion de dNTPs de 30pM. Las concentraciones de ADN genomico que producen productos de PCR van de entre 0.0008ng a 345 ng.

e) Resolucion de los productos de PCR de 136 y 140 pb correspondientes a los oligos SEQ ID Nos: 7 y 8. Dado que en los geles de agarosa al 2% utilizados cotidianamente para la identificacion de productos de PCR no es posible distinguir diferencias de unas pares de bases entre bandas de tamarios muy similares, en el caso de los productos de PCR obtenidos para la pareja de oligonucleotidos SEQ ID Nos. 7 y 8 se verified la presencia de los dos productos tanto por resecuenciacion como por gel de acrilamida nativo. Asi, para comprobar que efectivamente se obtienen unicamente dos bandas de 136 y 140 correspondientes a los productos de PCR de los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos.: 7 y 8, se hizo un gel de poliacrilamida nativo al 6% y tefiido con bromuro de etidio. Como se aprecia en la figure 24, a diferentes concentraciones de ADN (partiendo de una concentracion de ADN de 345 ng en

30 microlitros de reaccion final y cargando en los carriles M1 6 microlitros, M2 3 microlitros, M3 5 microlitros y M4 4 microlitros de dicho volumen de 30 microlitros), se ve la presencia de las dos bandas de 136 y 140 pares de bases esperadas.

De la estandarizacion de condiciones experimentales para el diagnostico de C. glabrata se desprende que se pueden utilizar una amplia variedad de parejas de oligonucleotidos disefiados a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5, y que adecuando las condiciones de concentracion de ADN genomico, oligonucleotidos, dNTP's y temperature de reaccion de PCR, por ejemplo, se obtiene una excelente resolucion de los productos de PCR de los tamanos esperados para cada secuencia, y, como se comprueba en las figures 2 a 11 y mas adelante en las figuras 13 a 18 dicha identificacion es especifica y sensible para diversos aislados de C. glabrata provenientes de aislados clinicos ya sea sola o en combinacion con otras especies de hongos.

Analisis comoarativo del metodo de diaanostico tradicional vs el metodo de deteccion de la presente invencion.

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Con el objeto de probar cabalmente la ventaja competitiva de los metodos de la presente invention contra los metodos de diagnostico tradicionales, a continuacion se hace un comparative de los tiempos de ambas pruebas:

Metodo tradicional de identificacion de Candida glabrata en muestra de orina: las muestras de orina son analizadas en un analizador de orina automatico tipo URISYS acoplado a UF-100i. El analisis se realiza mediante citometria de flujo con laser de argon. El UF-100i mide las propiedades de luz dispersa y fluorescencia para contar y determinar las particulas presentes en la orina. El volumen de las particulas se determina a partir de las senales de impedancia. De esta forma, de acuerdo a los diagramas de dispersidn, el resultado final indica cuales muestras de orina son las que probablemente contengan celulas levaduriformes. Estas muestras son marcadas como muestras de orina YLC(celulas levaduriformes). De las muestras de orina marcadas como YLC se toma 1pl y se siembra en placas de medio Sabourand/Dextrosa (SDA) y medio Sabourand/Dextrosa con cefoperazona (CFP). Dichas placas se incuban a 30°C por 72 horas. Los urocultivos con crecimiento menor a 10,000 UFC/ml, al igual que las placas sin crecimiento, se reportan como No Desarrollo Hongo (negativo); los urocultivos con desarrollo igual o mayor a 10,000 UFC/ml pasan a la prueba de tubo germinal, con una incubacion de 2 horas a 35°C, en donde se reportan como positivo para C.albicans y C. dubliniensis En el caso de los tubos germinales negativos se reporta como Candida sp Para identificar a la especie a partir del reporte de Candida sp. se utilizan las tarjetas Vitek, que permiten la identificacion por medio de la asimilacion de carbohidratos. Dichas tarjetas se incuban por un periodo de 24 a 48 horas, momento en el que se leen las tarjetas. El tiempo total minimo para identificar C. glabrata es de 6 dias, con una sensibilidad de alrededor del 85%.

Metodo de identificacion de C. glabrata de la presente invencion: las muestras de orina son analizadas en un analizador de orina automatico tipo URISYS acoplado a UF-100i. El analisis se realiza mediante citometria de flujo con laser de argon. El UF-10Oi mide las propiedades de luz dispersa y fluorescencia para contar y determinar las particulas presentes en la orina. El volumen de las particulas se determina a partir de las sehales de impedancia. De esta forma, de acuerdo a los diagramas de dispersion, el resultado final indica cuales muestras de orina son las que probablemente contengan celulas levaduriformes. Estas muestras son marcadas como muestras de orina YLC (celulas levaduriformes). El tiempo de esta primera etapa es de 2 horas. A continuacion, de las muestras de orina marcadas como YLC se toma 1 ml, se centrifuga, se descarta el sobrenadante, se resuspende y se hierve la pastilla. El ADN genomico obtenido es el templado del PCR donde se utilizan los primers generables a partir de las SEQ ID Nos. 1 a 5, como por ejemplo, pero no limitado a los descritos en las SEQ ID Nos. 6 a 52, en condiciones optimas de reaccion. Los productos de PCR son separados mediante electroforesis en gel de agarosa y dlchos productos son analizados para la correcta identificacion de C. glabrata. El tiempo total de la prueba es de 6 horas.

Metodo tradicional de identificacion de Candida glabrata en muestras sanguineas: Las muestras de sangre se incuban durante 72 horas en el equipo automatizado BACTEC9240. Cuando hay crecimiento de los microorganismos, estos metabolizan los nutrientes contenidos en el medio de cultivo liberando CO2. La liberacion de CO2 es detectada por el equipo y automaticamente el hemocultivo se marca como positivo para levaduras. Los hemocultivos positivos para levaduras son sembrados en placas de Sabourand/Dextrosa (SDA) y Sabourand/Dextrosa con cefoperazona (CFP) y se incuban a 30°C por 72 horas. Los hemoculfivos con un crecimiento menor a 10,000 UFC/ml al igual que aquellos sin crecimiento, se reportan como No desarrollo hongo (negativo); los hemocultivos con un crecimiento igual o mayor a 10,000 UFC/ml se realiza la prueba de tubo germinal durante 2 horas a 35°C y se reporta como positivo para C.albicans y C. dubiniensis En el caso de los tubos germinales negativos se reporta como Candida sp. Para identificar a la especie a partir del reporte de Candida sp. se utilizan las tarjetas Vitek, que permiten la identificacion por medio de la asimilacion de carbohidratos. Estas tarjetas se incuban durante 24 a 48 horas y son leidas para identificar C. glabrata. El tiempo total minimo para la identificacion es de 9 dias.

Metodo para detectar C. glabrata de la presente invencion en muestras sanguineas: Las muestras de sangre se incuban durante 72 horas en el equipo automatizado BACTEC9240. Cuando hay crecimiento de los microorganismos, estos metabolizan los nutrientes contenidos en el medio de cultivo liberando CO2. La liberacion de CO2 es detectada por el equipo y automaticamente el hemocultivo se marca como positivo para levaduras. De las muestras de sangre marcadas como positivas para levaduras se toman 100pl, se centrifugan, se descarta el sobrenadante, se resuspende y se hierve la pastilla

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El AON genomico obtenido es el templado del PCR donde se utilizan cualesquiera de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ ID Nos 1 a 5, como por ejemplo, pero no limitado a los descritos en las SEQ ID Nos 6 a 52, en condiciones optimas de reaccion. Los productos de PCR son separados mediante electroforesis en gel de agarosa y dichos productos son analizados para la correcta identificacion de C. glabrata. El tiempo total de la prueba es de 3 dias

Un metodo alternative es tomar como muestra sangre del paciente sin ser preclasificada por hemocultivo. En este caso, se sigue el procedimiento anterior y el tiempo total de la prueba es de 4 horas.

De tal manera, el paso crltico es obtener ADN genomico suficiente de cualquiera de los tipos de muestras descritos anteriormente (ver seccion de obtencion de muestras clinicas), y a partir de las mismas, se utiliza el ADN genomico obtenido como el templado del PCR donde se utilizan cualesquiera de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ ID Nos. 1 a 5, como por ejemplo, pero no limitado a los descritos en las SEQ ID Nos. 6 a 52, en condiciones optimas de reaccion. Los productos de PCR son obtenidos y analizados por cualquier metodo convencional, como por ejemplo, pero no limitado a electroforesis en gel de agarosa, hibridizaciones tipo Dot-Blot, Southern Blot, Northern Blot y similares; RT-PCR, PCR ELISA, y los demas conocidos en el campo de la tecnica (por ejemplo, pero no limitado a Molecular Diagnostic PCR handbook. (2005), Gerrit J. Viljoen, Louis H Nel and John R. Crowther. Springer Publishers), para la correcta identificacion de C. glabrata Cabe seiialar que dichos oligonucleotidos pueden estar conformados por nucleotidos sin marcar o marcados, como por ejemplo, pero no limitado a, marca radioactiva, marca quiomiluminiscente, luminiscente, fluorescente, biotinilada.

A fin de comprobar la utilidad del metodo de diagnostico de la presente invencion, se realizaron pruebas con muestras clinicas de diferentes origenes, utilizando combinatorias distintas de los oligos generados a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5. Dichos experimentos se describee a continuacion:

a) Identificacion de C. glabrata en muestras clinicas de diferentes origenes: en las figuras 25 y 26 se ejemplifica la deteccion de C. glabrata, en este caso en muestras de orina y sangre. En el 100% de las muestras se detecto a C. glabrata, no produciendose producto de PCR en el control negativo y en muestras con C.albicans Esto indica que el metodo de la presente invencion es 100% especifico y 100% sensible para C glabrata y no hay reaccion cruzada con otras especies. La presencia o ausencia de ciertas bandas sugiere una posible variacion en los serotipos de las muestras clinicas, aunque se requiere investigacion adicional a este respecto. Un reporte reciente que apoya esta hipotesis se encuentra en Polakova, S. et al. PNAS, Vol. 106, No. 8, pags. 2688-2693, 24 feb 2009; en donde se sugiere que existen rearreglos cromosomales en C. glabrata como un mecanismo de virulencia en aislados clinicos. Por lo tanto, no es inconsistente con el objeto y materia de la presente invencion la presencia o ausencia de bandas en muestras clinicas, siempre y cuando las presentes coincidan en secuencia y tamafio con las previstas en la presente solicitud. Asimismo, y para comprobar lo anterior, por medio de resecuenciacion de las bandas obtenidas, se afirma que corresponden tanto al tamano como a las secuencias esperadas para los productos de PCR de C. glabrata

b) Deteccion de especies flogeneticamente relacionadas a C. glabrata: con el objeto de comprobar que las regiones del elemento negativo (EN) y por ende las sondas descritas y reclamadas en la presente solicitud son exclusivas de C. glabrata, se probaron tres pares de oligonucleotidos con las siguientes especies: Candida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida kruzei, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces parodoxus, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces waltii, Ashbya gossypii, Klluyveromyces lactis y Yarrowia lipolytica Como se puede apreciar en la figura 27, los oligonucleotidos de las SEQ. ID. Nos. 9 y 10 de la presente invencidn unicamente amplificaron la region del EN de los controles correspondientes a C. glabrata, por lo que se comprueba que las regiones EN y sondas asociadas son unicas de dicha especie y son utiles para la deteccion de C. glabrata, con una sensibilidad y especificidad del 100%. Las bandas de los carriles 3 a 17 corresponden al control interno con sondas de rRNA26S (carriles 3 a 7) y rRNA 18S (carriles 8 a 17) de las especies flogeneticamente relacionadas enlistadas anteriormente.

c) Deteccion de C. glabrata en mezcla con otras especies flogeneticamente cercanas: en la fgura 28 se muestra la deteccion de C glabrata en distintas muestras biologicas y combinada con diferentes

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especies filogeneticamente cercanas. Como se puede apreciar a partir de esta figura, no hay productos de PCR en el carril con muestras de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, mismas que se encuentran en una cantidad constante de 100ng de ADN por especie probada; en cambio, en las muestras con mezcla de C. albicans y C. glabrata, en donde C. glabrata esta presente en cantidades que van desde 345 ng hasta 2.5 ng, se detecta dicho microorganismo con los productos de PCR del tamano esperado, no asi en el ultimo carril, en donde la mezcla de microorganismos no incluye ADN de C. glabrata, Esto tambien es una prueba fehaciente de la especificidad y sensibilidad de la prueba al 100%.

Una modalidad adicional de la presente invencion comprende un kit de diagnostico para C. glabrata, el cual estara conformado por al menos un oligonucleotido generable a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5, de entre 15 a 35 pares de bases, ya sea liofilizado o resuspendido en un vehiculo aceptable, una muestra de ADN genomico de C. glabrata como control positive y una muestra de ADN genomico de alguna especie filogeneticamente cercana a C. glabrata como control negativo. Variantes en dichos elementos seran facilmente deducibles por un tecnico en la materia y quedan comprendidas dentro del alcance de la presente solicitud.

Metodo de deteccion de C. glabrata por Hibridizacion de acidos nucleicos.

Fragmentos de las SEQ. ID Nos. 1 a 5 son utiles para la deteccion de C. glabrata por metodos de hibridacion de acidos nucleicos convencionales. Para tal efecto, los pasos a seguir son:

a) Obtener acidos nucleicos de una muestra biologica,

b) Hibridar dicho acido nucleico proveniente de una muestra biologica con una sonda que provenga de cualquier fragmento continuo de mas de 36 pares de bases contenido en las SEQ ID Nos. 1 a 5.

c) Detectar la hibridacion por algun metodo convencional.

La sonda derivada de las SEQ ID Nos. 1 a 5 puede ser obtenida a partir de corte con enzimas de restriccion o puede ser un producto de PCR. Asimismo, dicha sonda puede estar marcada radioactivamente, por fluorescencia, biotinilacion, luminiscencia, quimioluminiscencia o similares.

Los metodos para detectar la hibridacion de la sonda con la muestra biologica son aquellos conocidos como metodos de hibridacion de acidos nucleicos, y pueden seleccionarse, por ejemplo pero no limitado a: Dot-Blot, Southern Blot, Northern Blot, microarreglos, hibridizacion in situ o similares. Como referenda, mas no para limitar el alcance de la invencion, se cita: MOLECULAR BIOMETHODS HANDBOOK 2008 JOHN M. WALKER RALPH RAPLEY; Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 2nd ed. L Cseke, et al., ed., CRC Press, 2004, 600 pp; Ausubel FM et al. (1999) Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons; Fasmann GD (1989) Practical handbook of biochemistry and molecular biology. Florida CRC Press, 1989, Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Una modalidad adicional de la presente invencion comprende un kit de diagnostico para C. glabrata, el cual estara conformado por al menos una molecula de ADN de al menos 36 pares de bases contenida dentro de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5, ya sea liofilizada o resuspendida en un vehiculo aceptable, una muestra de ADN genomico de C. glabrata como control positive y una muestra de ADN genomico de alguna especie filogeneticamente cercana a C. glabrata como control negativo. Variantes en dichos elementos seran facilmente deducibles por un tecnico en la materia y quedan comprendidas dentro del alcance de la presente solicitud.

Ejemplo 1. Analisis de muestras cl micas de orina.

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Se tomaron 234 muestras clinicas de orina y se clasificaron por el metodo tradicional descrito anteriormente, en donde 200 muestras se clasificaron como No Desarrollo hongos, 9 como C.albicans y 25 como Candida sp De estas 25 muestras, 6 (24%) fueron clasificadas como C. glabrata. Con el metodo de deteccion de la presente invencion se identificaron 12 (48%) muestras positivas para C glabrata.

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Ejemplo 2. Comparative entre varias especies de levaduras y C. glabrata con el metodo de deteccion de la presente invencion.

En la figura 28 se demuestra la especificidad de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5 en 15 mezclas de C. glabrata con especies filogeneticamente cercanas, como C. albicans, C. parapsilosis, y C. tropicalis. En cada uno de los geles mostrados se utilizaron los oligonucleotidos de las secuencias SEQ. ID. Nos 7 y 8 Como se puede apreciar, unicamente en aquellos carriles en donde esta presente el ADN de C. glabrata, aun en mezcla con otros microorganismos, se logra la amplificacion de los fragmentos de los tamafios esperados. Por lo tanto, los oligonucleotidos de la presente invencion son capaces de detectar especificamente la presencia de C. glabrata en muestras complejas, aun 20 en cantidades minimas de ADN de C. glabrata de entre 2 5 y 345 ng.

Ejemplo 3. Sensibilidad de la prueba de diagnostico de la presente invencion en aislados clinicos.

Con el objeto de probar la sensibilidad de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos. 1 a 5 para la 25 identification de C glabrata en muestras clinicas, se probaron los oligonucleotidos con SEQ. ID. Nos 6 a 10. En las figuras 29 y 30 se observan los resultados de las distintas amplificaciones, con los tamafios de producto de PCR esperados. Cabe hacer mention que en las figuras 29 y 30, en los carriles 14, 17 y 33 no se obtuvo producto de amplificacion. En estos casos, se corroboro la identification de C. glabrata con pruebas bioquimicas y se obtuvieron los resultados mostrados en la Tabla 1.

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Tabla 1 Analisis con prueba API-20 de los aislados clinicos 14, 17 y 33 de las Figuras 29 y 30.

Aislado clinico

Especie identificada Codigo API-20 Descripcion

14

Candida paratropicalis 2552170 Muy buena identification

17

Candida paratropicalis 2552170 Muy buena identification

33

Candida albicans 2546170 Aceptable identification de C. albicans

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Asimismo, los productos de PCR amplificados provenientes de aislados clinicos fueron re-secuenciados para verificar que dichas bandas corresponden a la secuencia esperada de C. glabrata y no de alguna otra especie, incluyendo humanos. De dicha secuenciacion, se comprobo que efectivamente las bandas de amplificacion en todos los casos correspondian a la secuencia especifica de C. glabrata esperada.

Por lo tanto, por medio de esta serie de experimentos se comprueba fehacientemente la sensibilidad y especificidad de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ. ID. Nos 1 a 5

Ejemplo 4. Deteccion de C. glabrata utilizando diferentes combinatorias de los oligonucleotidos generables a partir de las SEQ ID Nos. 1-5.

A fin de comprobar que cualquier porcion de las secuencias descritas en las SEQ ID. Nos 1 a 5 son utiles para la identificacion de C. glabrata, se generaron oligonucleotidos adicionales (SEQ ID Nos. 11 a 52), mismos que abarcan todas las regiones intergenicas de las adhesinas EPA1, EPA22, EPAH, EPA6 y EPA7. Asimismo, se comprobo su utilidad tanto para C. glabrata sola o en mezcla con otras especies filogeneticamente relacionadas. En las figuras 2 a 11 se muestran las diferentes combinatorias obtenibles a partir de los oligonucleotidos de las SEQ ID Nos. 11 a 52 y los tamanos de producto de PCR esperados. Los resultados demuestran que la totalidad de las SEQ. ID. Nos 1 a 5 sirve como base para la generacion de oligonucleotidos especlficos para C. glabrata, se mantiene la sensibilidad y la especificidad de la prueba, y que es posible detectar el hongo en mezcla con otras levaduras. Por lo tanto, cualquier oligonucleotido generable a partir de las SEQ. ID. Nos 1 a 5 entra dentro del alcance de la presente solicitud.

Ejemplo 5. Deteccion de C. glabrata por medio de hibridizacion de acidos nucleicos.

Para comprobar la eficiencia y sensibilidad del metodo de deteccion por hibridizacion de acidos nucleicos, se realizo un Dot- Blot utilizando como sonda una secuencia de acidos nucleicos de 140 pb marcada con luminiscencia comun para las SEQ ID No. 1, 2 y 3 para ser hibridizada contra diversos templados de ADN. Como se puede observar en la figura 31, dicha sonda hibrido unicamente contra el control interno, el ADN de C. glabrata proveniente de dos muestras biologicas de aislados clinicos y el ADN de una cepa silvestre de C glabrata. No se obtuvo hibridacion contra el ADN de C. albicans ni S cerevisiae Por lo tanto, se comprueba la sensibilidad y especificidad de las sondas derivadas de las SEQ ID Nos. 1 a 5 para la identificacion especifica de C. glabrata al 100% en metodos de hibridizacion de acidos nucleicos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Instituto Potosino de Investigacion Cientifica y Tecnologica A C.

<120> “METODO IN VITRO PARA LA DETECCION DE CANDIDA GLABRATA, KIT DE DIAGNOSTICO V USOS DE LOS MISMOS.”

<130> P7593EPPC

<140> EP10753741.7

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<141 > 2010-03-17

<150> MX/a/2009,/002935 <151 > 2009-03-18

<160> 52

<170> Patentln version 3 5

<210>1

<211> 2225 pb <212> ADN

<213> Candida glabrata <220>

<221 > EPA1 inter EPA2

<222> (1)..(2225)

<400> 1

taaaaccaga aaatataata acttctatag tttagcattg taaaagctgt ggtggctgtt 60 ttgtttcact gcaatctttc ttgcaggcgg atcacatcac catccgtttt taacagtgta 120 tattgcctag gtagcatcca tcatcaatac cctttatatc agagctttat acaaataata 180 ttcctggtca cacttgaaat gagagatatt ataaaaaact tcgggtggta tcataagttt 240 cagggttttt ggtttacata cgaagcctaa tttgcctttt ctattctccc agagaattca 300 acttttgagc agggaccatt gttttcgcga ttttcaaaag caagagaaag ttagagcaaa 360 tcacgaaaat ccagaagata taagaaatct cgaattaaac ttccataata ggtcaattgt 420 caaaaaaaac tcgaaacaac ttattattct aaacgaatat gatcatatga acataccgtt 480 ccacgaatat gagagtttat acgactatgg tgcaaggctt aacatgccgc tcatacaggc 540 acagaagtat ataaacgaag gagaagagaa gataagatat aactaggtag gtaacggact 600 attgtaatct ttcaggtgaa aagaaaccga gttgggctta ttagaaccag tttatctgcc 660 acagataaaa ggtataaagg agccctcatt gataatagtc catgaagtta gaccaaagtt 720 ctagtatctt attctgtata ataaaagagg ataaccagta taatttctat aatataccca 780 tagaattttg aattaatatc ttatcatcat gtcttctaag tataactgga cacaagaact 840 aactactcca caaaatcgtt cttagactat cgcaaaacag ggtgatagat actggaacac 900 cgaatagtag tgatgggcct atcttcactt aaacattagt gtaaagcata ttcaatttta 960 ttgaccaaaa caataaaagt aattaaaact gtaattaccg aaatttacat gataagtcag 1020 attattgcac ccgatatgtt tctttcaaga agataatctc atggccgtat agcatatata 1080 acagtttagg gcagtcccaa ttgtaagcag ttacatagat tgctaacagg aagctttatg 1140 atctatgtaa aatccagtgt tctaatcgcc tctaaaactt tttttagcta atgttagatl 1200 aattctaata ctacattcct gataatctgt aaatgatcac aagagagtcl tgttgctcga 1260 acaactgtcc tcgataacat ctcaaagttg aaaaccaaat tctgttggtt aaaaatattg 1320 tgatattaag tttagactta tcaatgtctt caaaatcata cactaaaata tccaaatgta 1380 tagaggtagt gtattcgcaa gaaacacggc ctaagacaag taaattttca gaataaattt 1440 tttagtatag attatagttt tgatatcaag caagatgtta ttggtaatga acataactat 1500 tataattaag tccaagtaaa agaatctctt ttaatacaat aaattgatca gaatcgtaac 1560 tggattgata ttcagtaaag cagtatatat caaagtgccc caaccaagat taaatggaat 1620 accaccccct taacataagg ttccattgca ttcaaaaagg tttccgaaaa atttgtagaa 1680 tagtgtccaa catattgtta tatctaaaaa atagtttatc atcatataga gggccacatt 1740 gtttatatag tgcataactt tcgttttttt tagatgtccc atttagggag tctgacttgc 1800 aacaaaacac tgctcgaaaa tttcgaataa tacaacttaa aatctggtag agtttattga 1860 attttaggta ctgataaaat ttttataata tgttgaaaaa tggtataact gctcattgtc 1920

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5 agate 2225

<210>2

<211 >2438 pb 10 <212> ADN

<213>Candida glabrata

<220>

<221 > EPAChrH inter TEL

15 <223> Cromosoma H(1047924. . . 1050361)

<400> 2

agtgtatttg ttctgtgaat gcccaacatg tacagtaata caaacgttcg tccagccatg 60 atttttagat aggctgtttc tttcaatatg aacattgata ataaaagact 20 gattatagtc 120 caacaaaaaa caaaaaaaac tgaaaaaaca ctaaagtaaa aaaaaaaact gaagctcccc 180 gtttatattt attgttcgla atttggggct attatttttg ttccacglaa tgttttctat 240 atctcatatt aataatgtga gcagtattat tctgaagagt ttttgtatat attatttatt 300 attagttaac aatttaagta cttttctctt ccaaaaaatt ttatgttgtt ttatgtcttt 360 attattgtat tgtgtgcgtc ttcctgttgt cgatgtttct tataatatet tggctaacca 420 tggatttgaa cctgtggtct gaaattgaac ttcaaatgct gcgaaaaacg cgagatgtga 480 taatgeaegg tagtagteat ctgataagtt aagttaccct gttcaacaat ctgctttagt 540 tgtttgacga aaaatatcgt gaccaatcga agttacccag cccccatttc tgttgagata 600 aactcaaaac taettattat tctaaacgaa 25 gatgatcata tgatcatact gtgccacgaa 660 tatggcacaa ggctgtagcg caccgctcat actggtacag agatagccta tcaaagacaa 720 gataaataag ataaaatata actaggctga taactgacta tgatcatatt acaggtgaaa 780 agaatgttca cctgaaacac tactgatcag aaaagaaatc gagttagggc ttattagaac 840 aactttgtct attaaagata aaaggtataa aaggagtcct tatctccatt agtctatgaa 900 gttaaaccta agttctagta tettattetg tataatgaaa aaggataacc agtataattt 960 tgtataatat acccgttaga gttttgaatt aatatettat cattatgtct tetaagtate 1020 actggacaca agaactaact aatccacaag atcgttttag attatatcaa caatttccac 1080 aacagtacag gataegatat atgttcacal gtcctttgtt atatccatga 30 acgagtaccg 1140 acttttttac taacatctag ggaaggtttc cctgggttgg caatttggtt gaagggaggt 1200 ggtggaagag ttttcttaga gtgcgcactt cagcacccaa acatgaattt caaattttgt 1260 gattttacaa ttgtttaaaa cagatatgag tgeeggaata gaaatagtaa atattagtta 1320 cagtacatgg ttttaccagt caaaacttat tggtgagttt ttactgatga tattgctttt 1380 tatgtgcgla atagcttgta ttgtaaatcc atatttggag ctgttgcgta aactaaactg 1440 aaatgattta aaattttgtt ataaataett gagagagtat agtgttggac attataagat 1500 lacagttctt aaatgataaa aaaatataca caaattgaac acagaaatgt acactatcta 1560 caataaataa acaacaaggg ttgtttattc ttatttacaa gcaacataat caaatatgta 1620 tetaatatgt gcctcataca 35 tgcagctagt ctcttttatt taccattttc tcctacaaaa 1680 acagccttgt ctgagaaggt ggaatcacag tageatgtet ctgttctgaa atgetattgt 1740

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5

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<2103

<211>8309 pb <212> ADN

<213>Candida glabrata <220>

<221 > CrK inter EPA22

<223> Cromosoma K(5831...14139)

<400>3

ttcttgaaaa agcaactatg gaatttgttt ggttccgatg tcaaaaaata aaatactgat 60 aaggcgataa gttitgacaa tctctcgtta atatttcttt tgtaatgctt cattgataca 120 tcgactatca agaaaaaaca ttattagtaa attttgaact ttatttaaaa ccatttctga 180 aatgtatact aagtatttat acttgagaaa aaaaaaacat atctttatct agaaaaaact 240 gtgtttctgt gatagagtta gaaacattct gaaaattaac tatcaacttl acttgataca 300 aggggaaaaa ataacacatt tgttgaatal gtttccggaa tttttggtat tacttatttg 360 ctgcattaca tcatctacat cgctaaaata atactactaa agtaactata tgaaaaacat 420 ttaatgaaga aattagacaa taaaatatta caattatttt atggtgtttt tgttagcaat 480 atttgatttt gtgactgagg atttatgggg ttattttaac aaaaaaatga tgtagtctca 540 aattatttta gtacctgatc aatcttttaa tgagttggta aatataaact atacaaagta 600 agtacttaaa agaaagacaa gcctctttct caagftcgag tgtgacaata cttattacta 660 caaagtagac attcgtgtta actaatgttc ttgacttcat tctagccaaa tatgtacata 720 cacggaactc taaccacgta caaatatatc tttttgcttg tttcatatag tatgattatt 780 tgctttattt gttagttaac gtgtgaatat aggaatatca tgtttgatgg tagagattag 840 tlgttcatag cggattggta ttgcattttc cattttctat ttlagttatg tgtgtcttga 900 agcaaataaa tgtatattag aggctatata tlatcacaaa ttcatattgt aattcacaac 960 tatccaactg cttaattccc aagtttgttt ctttcaatat tcctgatttt cttttgttta 1020 ctttactgtg atgctatatt agaaaattaa gtcgccaata tlttacctag aataattaat 1080 ctaaaaagtc atgttaaggt cgtgctctat tactcttgag taatagagcg taatataccc 1140 acttccggaa ttttctatag aatactggta ataggttgta ttaaagaaat tacaaattit 1200 atcggattti agtagatact lagaagcltt taaactattc aataaaatat tagcalagaa 1260 gtcattatat atcactcatt ttgtaatcat cttattaatt gagcacalaa aaatcagagt 1320 atttttcttt cttatatgat aatttccatt atagtgattg agatatclag ttttatgcaa 1380 acatctctta gtagtacaag gttataatag aaatttaalt ttacaaatta tgccacagga 1440 agaaaaacaa gacaaaltta gtatttccta atcaattctt tcataattaa tataatcaaa 1500 tgatgtcatt tgctagtcat tctcgtaaaa aagttttcag attaagtgtt atttttaatt 1560 gacagataac tagtacgata acaaaacaaa aatggagata aaagcacctt tcgcaaaata 1620 cagttttggc tacaaaatat atctaacatt tagttatctg aatttcttag atacatatct 1680 gaattaaata aataaagaca cactaatgtc cggaacaagc aaatactatc ttgtgtttat 1740 tcaagccaaa aagggataaa aatcattact atctggagaa ttagcttggg tagcagtatt 1800 tattcatagt tagatacaac gaagtgtgtc aaaaaaacaa tagctgaaat actggcttct 1860 cgcttaaatt ctgttcatac attgatttta gtgtaccact aagacattat actagataaa 1920 aatgtaaagc aaatggtaga atatatcaaa aatgatggtc ataaaataca ttggcatttg 1980 gagatggtca gataataatg caaatatgaa gaattaacaa agtacctagc atatgttatt 2040 gaaacaatcc ttatcactgg tgctttattt tgtcattcat gaaatcgaaa tagagcttat 2100 attatatctt catttatgaa gcaaatatta cttcattgtg ttccttgaga atataataga 2160 atcaccagca agcaatgaaa ttttgaacta catttttagc gtcacgcggc aacaataatt 2220 tatggatatc aatatcacga aataggatta atagaaaaca taatgaggaa aatattggtt 2280 accaatatta tttacatatg agtaacctct aacctccttc tccaagaaca ctagtagatt 2340 taattacaat tttacaacta cttttcccta ctttacacat cgttgaagac atcgttccaa 2400 aaaaaaatgt aatgtaattt tagtaaaaga atgatattca taaatttcga ctgtgtgctt 2460 atcacacata tcgctgataa atgatttgtt aactgttttg agaagcaaaa atatattgtc 2520 atgcattttc atggcttttt gacatcttat ttcattataa attacattca aagatctaga 2580 ccccaattaa gattcaagct aaatcgtaac tactttaaac acactcaaca aaccttaaca 2640 tgatgaagac agatatttaa cgaccaattt taagtagtat attgtttgag aagattgcga 2700 taactaatct tttagacaag aataagttag tttactattg gtttgcccag catttacaat 2760 ggcattgggt aatattaata gtatttcatt accaagtctt cccttcatca gcaatattca 2820 atcgtagctt ccttattggt tcactgttaa agtaaattca acatttcatt tatttcgtga 2880 cgtcattgta gtgccgtacg aagaattagc aattttttgt tcgtgacatg ttttgtaatt 2940 gtttcctatt ttggctagat tcatgaaact ttttgtcatc aaatattttt ttgtaaattc 3000 aaaatagttt cttcaaaaaa atttggctgg catatttact ttttatgacg tcacttcttc 3060 tccaagaaat aaatgttagg gtagcaccta ctaggtattg tggattatat tttatcaatc 3120 caatcacagt tgttttcaga tattggaaaa ttgtgattct aaagagctgt aacataaata 3180 tttctactta ttctacaagt tgtttcaacc

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<211>2432 pb <212> ADN

<213>Candida glabrata 5 <220

<221 > EPA6 hasta Tel

<223> GenBank Accession No. AY646925 (15567. .. 13136) la cual es homologa a la region intergenica entre EPA6 y el telomero del Cromosoma C publicado en Genolevures.

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<4004

aaagttggag aactagaaaa tatataaaat tgattaacat aaggtaaata tattaattla 60 atttttactt tcatacaatt ttttaaattc tatttcttlt taacgttccc ttatatttat 120 tgataagacg tcatcagtat tttgtgtaat attttttlac tttatttttt tcgattatca 180 tctggtaata ttcgtttctt gtattaaata tttatgcatc cctgtgttat 15 aagtattgat 240 agtttttgtg taacttatca ctggaacttt ttttcaatgg ctattcgcat gatgaatttg 300 gtttcctgct gaattattat attctttacc aagttcaata ctgtttttcc tttcttlcat 360 tattccgatt tttattattt gtatcatatt tggttttaat atatgaaatt tttttacttt 420 aattgaatta atttttgtat tgatgttatc atacttctat atcctaagaa tatgaaggaa 480 gaacaatatt tatttattct ccatatttat caagaaataa acaacaaatc agaatagdc 540 tccttatttg gtatggtaaa ttaaaataaa ttctgtaaaa tagtagtgtt gatatctgta 600 ctgactagtg gtcataatcg acttattgtt atataaaaac ttaatatttt ggttaggaat 660 tttgtattcg tcacttttca attttgatca atttcaagcc aacaatttgt gaaattctag 720 ccttatgtta gacttacgtt tagaattata aatattatca tgtggtgtta aaatgatata 780 20 gacgttggta gtgatctgtc atttctggcg tcgaagtctg taagtaagac taactgataa 840 gatatigttg caadatagt tatgaaatgc ataaaatgat atgagaadt acctttaaca 900 tgatagacta tgatgtataa cggctcttta taccatttat ttttggcaga tatactgttt 960 cttagaagtc ctaadcgct ttctcttcac ctggaaagtg accttagtct gttacctgtc 1020 cattttaatc ttattatcga tgadttgtg aacttattac tgtgcctgta tcagcggtac 1080 tattaagcct ttaatcatta tagtatacca ctcatattcg tgccacaata tattcatatg 1140 actatcttcg tttagaataa taagatgctt cgaatttatt tcaacgtgtt tcaacaaata 1200 tcataatgtg aagtgttacg gtagtagatg cttagattaa ctcgaaacta cttattcatt 1260 tatacgaata tgatcatatg ctaataccgt gacacgaaga agagcgtcgt 25 aaacgacaat 1320 tacgccaggc attataatac cgctcataca gacatagaag tatataaacg aaagagaaga 1380 gaagcttaga taagatataa

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<210> 5

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<212> ADN

<213>Candida glabrata

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<221 > EPA7 hasta Tel

<223> GenBank Accession No. AY646926 (6089 .8586), la cual es homologa a la region intergenica entre EPA7 y el telomero del Cromosoma C publicado en Genolevures.

<400>5

aaatatgtga taccacattt cctaagatag ggttgtgaaa tattatcata cataagattt60 cttcatacag acctaattca aatgtgggct gaglgagttt aagtttttat calttttact 120 gatacatgcc ttaacgatta tcacacatta aaaaaatgaa tgaatactaa gcatagctat 180 cttattcgtt attgagaaaa agtggttttg aaatatactg gglctaacat atgccaagaa 240 tattgtggal atattgtatt taaatttatt tgtcagtgaa tttattgata aacataacat 300 agtggtatca attcttttga aaagctacat atttctacct tatttttttt tccaltctca 360 tltattgaaa gaatttattg tcccttaaac tgttgagctt gaatctacga aagcaagtag 420 atgatatatt ccacgtgata tttatattat ttacgttcta tacatatalt gataggataa 480 tgaatatcit tcgtacagaa agagttgaat ttgcaggaat atagtactgt gaagtaagta 540 ccagattttg gtactagttg tacggaaagg actgttacca aaacattatt atcagtgaca 600 atgaagattt gggttgtatt ttattgagaa gatttccaat agcagattca ctaaaacgaa 660 aatacatgtg atgattttgt gccacaaatg tgaatglccg tttgctgcga taatctaaga 720 cgatcttgtg gagtagttgg tacttgtgtc cagttatact tggaaaacat gatgctaaga 780 tattaattca aaattctaat ggtatattat acaaatlata ctgtttattt ttcttttact 840 atacaaaata agatactaga attaaggttt agctttatag gctaatggag atcagggttc 900 cttttatacc tttcatcttt tggcagataa actggttcta agaagcccta actcggtttc 960 ttttctgatt actaatcttt cagataaaaa ttcatttcac ctgtaagatg ataatagtcc 1020 gtcacaggcc tagttatatc ttatctaagc ttcgcttctc tttcgtttat atacttctat 1080 gtctggatga gcggtattat aatgcctggc gtaattggcg tttacgacgc tcttcttcgt 1140 ggcacggtat cagcatatga tcatattcgt ataaatcaat aagtaglttc gagttaatct 1200 aagcatctac taccgtaaca cttcacatta tgatatttgt tgaaatacgt tgaaataaat 1260 tcgaagcatc tactaccgta acacltcaca ttatgatatt tgttgaaata cgttgaaata 1320 aattcgaagc atcttattat tctaaacgaa gatagtcata tgaatatatt gtggcacgaa 1380 tatgagtggt atactataat gattaaaggc ttaatagtac cgctgataca ggcacagtaa 1440 taaattcaca aagtcatcga taataagatt aaaatggaca ggtaacagac taaggtcact 1500 ttccaggtga agagaaagcg agttaggact tctaaaaaac agtatatctg ccaaaaataa 1560 atggtataaa gagccgttat acatcatagt ctatcatgtt aaaggtaagt tdcatatca 1620 ttttatgcat ttcataacta tagttgcaac aatalcttat cagttagtct tacttacaga 1680 cttcgacgcc agaaatgaca gatcactacc aacgtctata tcattttaac accacatgtt 1740 aatatttata attctaaacg taagtctaac ataaggctag aatttcacaa attgttggct 1800 tgaaattgag caaaattgaa aagtgacgaa tacaaaattc ctaaccaaaa tatlaagltt 1860 ttatataaca ataagtcgat tatgaccact agtcagtaca aatatcaaca ctattatttt 1920 acagaattta ttttaattta ccataccaaa taaggagaga tattctgatt tgttgtttat 1980 ttcttggtaa atatggagaa taaataaata ttgttcttcc ttcataltct taggatatag 2040 aagtatgata acatcaatac aaaaattaat tcaattaaag talaaaaaat ttcatatatt 2100 aaaacctaat atgatacaaa taataaaaat cggaatgatg aaagaaagga aaaacagtat 2160 tgaacttggt aaagaatata ataattcaga aggaaaccac altcatcatg cgaatagcca 2220 tlgaaaaaag gttcaagtga taagttacac aaaaactatc aatacltata acacagagat 2280 gcataaatat tttatacaag aaaagactat taccagatta taatcgaaaa aaataaagta 2340 aaaatatatt acacaaaata ctaatgacgt cttatcaata aatataaggg accgttaaaa 2400 agaaatagaa tttaacatta ttgtaagaaa gtaaaaattg aattaatgta ttlacattat 2460 gataatcaat tttatatatt ttctagtgct ctaacttt 2498

<210> 6 <211>20 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleolido <222> (1)..(20)

cgctcataca ggcacagaag

20

5

<210>7 <211>30 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

10

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(30)

15 <400> 7

ccaaagttct agtatcttat tctgtataat 30

<210>8

20 <211 >26 pb

<212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

25 <221 > oligonucleotido

<222> (1)..(26)

<400> 8

30 gtggagtagt tagttcttgt gtccag 26

5

10

15

20

25

30

<211>22 pb <212>ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(22)

<400> 9

ataccactca tattcgtgcc ac

22

<210> 10 <211>24 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(24)

<400> 10

gtggagtagt tggtacttgt gtcc

24

<210> 11 <211>27 pb <212> ADN

5

10

15

20

25

30

<213=* Candida Glabrata

<220

<221> oligonucleotido <222> (1 )..(27)

<400 11

acagtgtata ttgcctaggt agcatcc

<210 12 <211>23 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1).. (23)

<400> 12

cgggtggtat cataagtttc agg 23

<210> 13 <211>21 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido

27

5

10

15

20

25

30

<400> 13

taagtcagat tattgcaccc g 21

<210> 14 <211>21 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(21)

<400> 14

aaatccagtg ttctaatcgc c

21

<210 15 <211>27 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1). (27)

<400> 15

ccaaatgtat agaggtagtg tattcgc 27

5

10

15

20

25

30

<211>24 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(24)

<400> 16

ccaaccaaga tlaaatggaa tacc 24

<210> 17 <211>20 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1).. (20)

<400> 17

tcacatccac tcaaatgtcg 20

<210> 18 <211>22 pb <212> ADN

5

10

15

20

25

30

<222> (1)..(22)

<400 18

ctcaaaagtt gaattctctg gg 22

<210> 19 <211>22 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(22)

<400> 19

gttaageett gcaccatagt eg 22

<210> 20 <211 >23 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(23)

<400> 20

5

10

15

20

25

30

<210 21 <211>22 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(22)

<400> 21

gcaagtcaga ctccctaaat gg 22

<210 22 <211>21 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1) ..(21)

<400 22

tgagtggatg tgacaatgag c

21

<210> 23 <211>20 pb <212> ADN

5

10

15

20

25

30

<220

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(20)

<400> 23

gacctaattc aaatgtgggc

<210> 24 <211>24 pb <212> AON

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1). .(24)

<400> 24

taacatatgc caagaatatt gtgg 24

<210 25 <211>21 pb <212> AON

<213=* Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(21)

20

5

10

15

20

25

30

tcaagctcaa cagtttaagg g 21

<210> 26 <211>21 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleolido <222> (1)..(21)

<400> 26

tgtacggaaa ggactgttac c 21

<210> 27 <211>19 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(19)

<400> 27

accctgatct ccattagcc 19

34

5

10

15

20

25

30

<211>25 pb <212> ADN

<213> Candida Glabraia <220

<221> oligonucleotido <222> (1)..(25)

<400> 28

tcacctgtaa gatgataata gtccg 25

<210 29 <211>19 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220

<221> oligonucleotido <222> (1)..(19)

<400 29

catatgctga taccgtgcc

19

<210> 30 <211>24 pb <212>ADN

5

10

15

20

25

30

<221 > oligonucleotido <222> (1) .(24)

<400> 30

ggtatcagca tatgatcata ttcg

<210> 31 <211 >24 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1). .(24)

<400> 31

cttaatagta ccgctgatac aggc

<210> 32 <211>22 pb <212>ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1) ..(22)

10

15

20

25

30

<210> 33 <211>20 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonudeotido <222> (1).. (20)

<400> 33

tcctttcttt catcattccg

<210> 34 <211 >23 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonudeotido <222> (1)..(23)

<400> 34

ttctatttct ttttaacggt ccc 23

<210> 35

20

*

5

10

15

20

25

30

<211>32 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(32)

<400 35

taataacttc tatagtttag cattgtaaaa gc

32

<210> 36 <211>26 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(26)

<400> 36

gatctcaata atttcatgta tgatgg 26

<210> 37 <211>21 pb <212> ADN

5

10

15

20

25

30

<221 > oligonucleotide <222> (1)..(21)

<400> 37

aaataaaata ctgataaggc g 21

<210 38 <211>18 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(18)

<400 38

tegaaettga gaaagagg 18

<210> 39 <211>24 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido

5

10

15

20

25

30

<400> 39

caaacatctc ttagtagtac aagg

<210> 40 <211 >25 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..{25)

<400> 40

taaatgttag atatattttg tagcc

<210> 41 <211>18 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(18)

5

10

15

20

25

30

<210 42 <211>21 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220

<221 > oligonuclecitido <222> (1) ..(21)

<400 42

tctttagaat cacaattttc c 21

<210> 43 <211>19 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(19)

<400> 43

aaatatcatt gaaggagee 19

5

10

15

20

25

30

<211>25 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..{25)

<400=- 44

ttgtatcata tatttttatc agtcg

25

<210> 45 <211>23 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(23)

<400> 45

catactaaga ctaatatttg ggg 23

<210> 46 <211>20 pb <212> ADN

5

10

15

20

25

30

<221 > oligonucleotide)

<222> (1)..(20)

<400> 46

caataattat gatgtcaccg 20

<210> 47 <211>18 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221 > oligonucleotido <222> (1)..(18)

<400> 47

ttgtcttttg tgatgggc 18

<210> 48 <211>23 pb <212=* ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(23)

5

10

15

20

25

30

caacatgtac agtaatacaa acg

23

<210> 49 <211>18 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220

<220 oligonucleotido <222> (1).. (18)

<400> 49

ctgggtaact tcgattgg 18

<210> 50 <211>20 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(20)

<400> 50

agacatgcta ctgtgattcc

20

5

10

15

20

25

<211>20 pb <212> ADN

<213> Candida Glabrata

<220>

<221> oligonucleotido <222> (1)..(20)

<400> 51

tgggagttag acatacatgg 20

<210> 52 <211>20 pb <212>ADN

<213> Candida Glabrata <220>

<221 > oligonucleotido <222> (1).. (20)

<400> 52

atactgcaca gatattgtcg 20

Claims (5)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1.- Un oligonucleotido para la identification especifica de C. glabrata, caracterizado porque comprende un acido nucleico que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia para una de las SEQ ID NOS: 1 a 5 o un complemento de las mismas, en donde el oligonucleotido tiene entre 15 y 35 nucleotidos.

   2 - El oligonucleotido de conformidad con la revindication 1, caracterizado porque comprende una secuencia que se selecciona a partir de las SEQ ID NOS: 6 a 52.

   3 - Un metodo in vitro para la identification especifica de C. glabrata, caracterizado porque comprende los pasos de: a) amplificar los fragmentos de ADN a partir de una muestra biologica por PCR con los oligonucleotidos como se definen en las reivindicaciones a 2, b) identificar los fragmentos amplificados.
2. 4.- El metodo de conformidad con la revindication 3, en donde la amplification de los fragmentos de ADN se Neva a cabo con al menos un oligonucleotido como se definieron en las reivindicaciones 1 o 2.
3. 5.- Un kit para la identification especifica de Candida glabrata, caracterizado porque comprende al menos un oligonucleotido como se definen en las reivindicaciones 1 o 2.
4. 6.- Un metodo in vitro para la identification de C. glabrata, caracterizado porque comprende los pasos de: a) hibridar los fragmentos de ADN a partir de una muestra biologica con una secuencia continua de 36 o mas nucleotidos comprendidos dentro de al menos una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID No 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5; y b) identificar los fragmentos hibridizados.
5. 7.- El metodo de conformidad con la revindication 6, en donde los pasos a) y b) son llevados a cabo con una tecnica seleccionada del grupo que comprende: Dot-Blot, Southern Blot, Northern Blot, hibridacion in situ o microarreglos

   8 - El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde la muestra biologica es derivada de un sujeto de estudio

   SEQ. 115 JTO.1 35 u 12 j

   13 14 13 16

   17

   13 19 8

   :o

   :i :: 36

   ■p'

   -~j

   SEQ. ID NO.:

   43

   SEQ ID N0.3

   6

   31

   SEQ.IDN0.5

   4“ 4* 4-

   49 3 fO fi

   57

   39 41

   «♦

   4- 4-

   38 40 42

   13

   14 !J 16 10 21 IS SO 51 32

   •4

   -4 *4 -► 4 -4 -4 ■4 -4

   4- 4-

   19 0 33 34

   13

   14 i# 16 10 17 13 30 31 32

   ■4 «♦ -4 •4 >4 ■4 ■4 «♦

   4- 4-

   19 9 33 34

   43 3

   6 44

   46

   3309

   47

   imagen1

   FIGURA3

   imagen2

   C9 C9 M9 M9 CIO CIO MIO MIO Cll Cll Mil Mil C12 C12 M12 M12 + -+ - ♦- + - + ■ t + - + ■

   FIGURA 5

   imagen3

   imagen4

   FIGURA7

   imagen5

   imagen6

   FIGURA9

   imagen7

   imagen8

   FIGURA 11

   Cl Cl Ml Ml C 2 C2 M2 M2 C3 C3 M3 M3

   imagen9

   FIGURA 13

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

   imagen10

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

   imagen11

   imagen12

   imagen13

   FIGURA 17

   1234567 89

   imagen14

   imagen15

   FIGURA 19

   12 34 56 78 9

   imagen16

   imagen17

   imagen18

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

   imagen19

   FIGURA 23

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

   imagen20

   A.

   PM M1 M2 M3 M4

   imagen21

   B.

   PM M1 M2 M3 M4

   imagen22

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

   imagen23

   FIGURA 26

   FIGURA 27

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

   imagen24

   FIGURA 28

   A B

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

   imagen25

   M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M M 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

   imagen26

   M 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 M

   FIGURA 30

   MC1234 5 S 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M M 18 19 20 21 22 23 24 2S 28 27 28 29 30 31 32 33 34 35 M

   imagen27

   imagen28

   FIGURA 31

   imagen29