ES2555994T3 - Uso de perfiles de expresión génica para predecir la supervivencia en un paciente con cáncer - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el pronóstico de un paciente con mieloma múltiple, que comprende determinar el nivel de expresión génica de GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EVI5, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489, LTBP1, TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, OPN3, ASPM, CCT2, UBE2I, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKS1B, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IF116, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENO1, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, ROBO1, TCOF1, YWHAZ y MPHOSPH1 en células plasmáticas aisladas del sujeto, y comparar los niveles de expresión con uno o varios controles adecuados y determinar si el paciente tiene un pronóstico malo basándose en la comparación, en donde una expresión reducida de GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EVI5, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489 o LTBP1, respecto a un control con un pronóstico favorable; y una hiperexpresión de al menos uno entre OPN3, ASPM o CKS1B opcionalmente con hiperexpresión de TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, CCT2, UBE2I, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IF116, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENO1, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, ROBO1, TCOF1, YWHAZ o MPHOSPH1, respecto a un control con un pronóstico favorable, se asocia con un pronóstico malo.

Description

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DESCRIPCIÓN

Uso de perfiles de expresión génica para predecir la supervivencia en un paciente con cáncer Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la investigación del cáncer. Más específicamente, la presente Invención se refiere a la creación de perfiles de expresión génica en pacientes con cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

Un aspecto frustrante de la quimioterapia del cáncer es la variabilidad de la inducción o la duración de la respuesta y la supervivencia a largo plazo ¡mpredeclbles. Una cantidad significativa de pacientes (aproximadamente el 20%) no obtiene ningún beneficio tangible de la terapia, pero se les sigue sometiendo a la toxicidad de los fármacos, a un riesgo secundarlo, a una reducción de la calidad de vida y a una demora en un tratamiento que podría haber sido

eficaz.

El mieloma múltiple es una neoplasla maligna de los linfocitos B que es mortal de forma invariable, que se manifiesta en la etapa de diferenciación de una célula plasmática. Aunque el mieloma múltiple reside inicialmente en la médula ósea, se puede transformar en una enfermedad agresiva con un aumento de la proliferación (que da como resultado una mayor frecuencia de carlotlpos anormales en metafase), LDH elevada y manifestaciones extramedulares (Barlogie B. et al., 2001). Además, el curso clínico del mieloma múltiple y su respuesta a una terapia, se ven influenciados por lesiones genéticas moleculares especiales y una interacción entre la célula tumoral-microambiente (Kuehl et al., 2002; Shaughnessy et al., 2003; Hideshlma, et al., 2004; Fonseca et al., 2004). Aunque se puede obtener una respuesta completa en más del 40% de los pacientes con terapia de dosis elevada, la supervivencia puede variar desde unos pocos meses a más de quince años (Attal et al., 2003; Barlogie et al., 2004). Por otra parte, una enfermedad de alto riesgo se reconoce mejor mediante una cltogenética anormal en metafase, presente en el 30% y el 50% (DeWald et al., 1985; Smadja et al., 2001; Shaughnessy et al., 2003) de los pacientes recién diagnosticados y que refleja una mayor capacidad proliferativa y una independencia de las células estromales del clon maligno. Sin embargo, los carlotlpos de mieloma múltiple son notoriamente complejos y tienen hasta la fecha una resistencia a la clasificación cltogenética. Sin embargo, un análisis correlativo Integral de múltiples carlotlpos de mieloma con la supervivencia del paciente, procedentes de múltiples laboratorios, revela ahora que las formas de la enfermedad hiperdiploides, no hiperdiploides, positivas para la deleción del cromosoma 13, t(4;14)(p16;q32) y t(11; 14)(q13;q32), probablemente representan subclases únicas con una evolución clínica divergente.

Aunque la presencia de un carlotipo anormal se ha convertido en la variable aislada más importante para el pronóstico en la predicción de la evolución en pacientes que reciben dosis altas de quimioterapia y trasplantes de células madre en tándem, esta variable, en combinación con otros parámetros clínicos históricamente relevantes, por ejemplo, seroalbúmlna, b2M y lactato deshidrogenasa, representan no más del 30% de la variabilidad en la evolución en esta enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad de algoritmos de estratificación del riesgo más potentes para esta enfermedad.

El mieloma múltiple se caracteriza por cariotipos complejos e inestabilidad del cromosoma 1 a nivel citogenético. La Inestabilidad del cromosoma 1 Implica generalmente duplicaciones parciales, translocaciones de todo el brazo o translocaclones por salto de 1q identificadas por bandas G. Esta Inestabilidad se ha caracterizado además recientemente usando una combinación de cariotipado espectral e hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas para satll/lll (1 q12), BCL9 (1q21) e IL6R (1 q21) en los cariotipos de 44 pacientes con aberraciones 1q conocidas (Sawyer et al., 2004). En ocho pacientes se produjo una duplicación segmentaria de 1 q 12-21 y de bandas adyacentes en cromosomas no homólogos. En cinco casos, 1q primero saltó a un cromosoma no homólogo, después de lo cual el segmento 1 q12-21 se duplicó de nuevo posteriormente de una a tres veces. En tres casos adicionales, se produjeron duplicaciones segmentarias después de que el primer 1q saltara a un cromosoma no homólogo y se duplicara después el segmento del cromosoma no homólogo proxlmal adyacente, antes de saltar o insertarse en una nueva posición. Estos casos demuestran que las secuencias de ADN de satll/lll no solo están asociadas con la duplicación de segmentos cromosómicos distales adyacentes después de la translocación, sino que también están asociadas con la duplicación y el salto/inserción de segmentos cromosómicos no homólogos proxlmales (Sawyer et al., 2004).

En la leucemia llnfoblástlca aguda de linfocitos B y muchas otras neoplasias avanzadas, copias adicionales de 1q pueden conferir una ventaja proliferativa a las células tumorales. En la actualidad, no se conoce la(s) diana(s) molecular(es) prlnclpal(es) de la amplificación y el salto de 1q21 en 1q en el mieloma y en muchos otros tipos de cáncer. La técnica anterior por tanto no puede proporcionar un(os) marcador(es) del cromosoma 1 o un(os) marcador(es) del cromosoma 13, útil para la estadificación inicial, así como para un seguimiento de la enfermedad mieloma múltiple y otros tipos de cáncer. La presente invención satisface esta necesidad y deseo persistentes en la técnica.

Compendio de la invención

La creación de perfiles de expresión génica globales ha surgido como una herramienta poderosa para la

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clasificación de subtipos de enfermedades y el desarrollo de modelos de pronóstico potentes en la leucemia y el linfoma (Shlpp et al., 2002; Yeoh et al., 2002; Rosenwald et al., 2002; Bulllnger et al., 2004; Valk et al., 2004). Estudios con micromatrices en mieloma también han proporcionado una información clave sobre su biología y comportamiento clínico (Zhan et al., 2002; De Vos et al., 2002; Claudio et al., 2003; Han et al., 2003).

En la presente Invención, se examinaron perfiles de expresión génica de células plasmáticas malignas en un esfuerzo para identificar las firmas moleculares del fracaso temprano de un tratamiento, después de una quimioterapia de dosis elevada y un trasplante de células madre autólogas de la sangre periférica. Los resultados descritos en este documento revelan una firma clara de expresión génica que presagia una forma muy agresiva de mieloma múltiple. Los marcadores identificados en el presente documento son útiles para la estadificación inicial y el seguimiento de la enfermedad para predecir una recaída del mieloma múltiple y de otros tipos de cáncer. Además, estos genes predictivos, sus productos proteicos y las vías biológicas en las que actúan representan posibles puntos para una intervención terapéutica contra el mieloma múltiple y otros tipos de cáncer.

La presente invención proporciona un método para determinar el pronóstico de un paciente con mieloma múltiple, que comprende determinar el nivel de expresión génica de GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EVI5, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489, LTBP1, TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, OPN3, ASPM, CCT2, UBE21, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKS1B, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IF116, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENOI, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, R0B01, TCOF1, YWHAZ y MPHOSPH1 en células plasmáticas aisladas a partir del sujeto, y comparar los niveles de expresión con uno o varios controles adecuados y determinar si el paciente tiene un pronóstico malo basándose en la comparación, en donde una expresión reducida de GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EVI5, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489 o LTBP1, respecto a un control con un pronóstico favorable; y la hiperexpresión de al menos uno entre OPN3, ASPM o CKS1B opcionalmente con hiperexpresión de TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, CCT2, UBE21, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IF116, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENOI, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, R0B01, TCOF1, YWFIAZ o MPHOSPH1, respecto a un control con un pronóstico favorable, se asocia con un pronóstico malo.

Otros aspectos y aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones actualmente preferidas de la invención. Estas realizaciones se proporcionan con el fin de describir.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-B muestran un análisis de la curva de supervivencia de Kaplan Meier de la supervivencia exenta de eventos (Figura 1B) y de la supervivencia global (Figura 1A) en relación con los niveles de expresión de CSK1B. Las muestras de los pacientes se agruparon en cuartiles basados en los niveles de expresión génica. Q1 era el cuartil más bajo y Q4 era el más alto. Hay que tener en cuenta la relación significativa entre Q4 y pronóstico malo.

La Figura 2 muestra el análisis de la supervivencia global en pacientes con más de 1,5 años de seguimiento. Las muestras de los pacientes se agruparon en cuartiles basados en los niveles de expresión génica. Q1 era el cuartil más bajo y Q4 era el más alto. Hay que tener en cuenta la relación significativa entre un pronóstico malo y una expresión elevada de ASPM, OPN3 y CSK1B (panel superior). El poder de predicción de la supervivencia se incrementó agrupando dos o más de los tres genes en el análisis (panel inferior).

La Figura 3A muestra que ASPM, OPN3 y CSK1B también pueden predecir una supervivencia exenta de eventos. La Figura 3B muestra que la agrupación de dos o más de los genes ASPM, OPN3 y CSK1B aumenta el poder de predicción de una supervivencia exenta de eventos.

La Figura 4 muestra que un incremento de la expresión de CSK1B y del número de copias estaba asociado con una recaída.

Las Figuras 5A-B muestran que la expresión de CSK1B en células plasmáticas de mieloma varía y que niveles de expresión elevados de CSK1B definen una entidad de mieloma de alto riesgo. La Figura 5A muestra diagramas de cajas de la señal de Affymetrix transformada en logaritmo en base 2 (eje y) entre 351 casos, de acuerdo con los niveles de expresión del cuartil (eje x). La Figura 5B muestra que los gráficos de Kaplan-Meier de la supervivencia global revelan una evolución peor entre los 88 pacientes con niveles de expresión de CSK1B en el 4o cuartil, en comparación con los 263 pacientes restantes con niveles de expresión en los cuartiles 1-3.

Las Figuras 6A-D muestran que el aumento de la expresión de CSK1B se relaciona con el aumento del número de coplas del ADN de CSK1B y el grado de amplificación del ADN está ligado a una mala supervivencia. La Figura 6A muestra un análisis de hibridación in situ fluorescente en metafase de CSK1B en 1q21 (señal roja) y ASPM en 1q31 (señal verde), realizado en células plasmáticas de un paciente con mieloma. Ténganse en cuenta las flechas que apuntan a las duplicaciones en tándem de CSK1B y su mayor prevalencia en relación con 1q31. La Figura 6B muestra el gráfico de cajas de la señal de Affymetrix transformada en logaritmo en base 2 (eje y) mediante

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amplificación de CSK1B (N = 197). En los diagramas de cajas, las líneas de arriba, abajo y medias se correspondían a los percentiles 75°, 25° y 50°, respectivamente, y los bigotes se extendían hasta el punto más cercano no más allá de 1,5 veces el rango intercuartil, en donde las observaciones más allá de éstos se indicaban con líneas individuales. Se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar la Señal a través de categorías de números de copias. La Figura 6C muestra que un gráfico de Kaplan-Meler de la supervivencia global en la cohorte de validación describe evoluciones peores entre los 89 pacientes con amplificación de CSK1B, en comparación con los restantes 135, según lo determinado mediante hibridación in situ fluorescente de la interfase. La Figura 6D muestra el gráfico de Kaplan-Meier, como en 6C, para la muestra combinada de 421 pacientes.

La Figura 7 muestra que la expresión de CSK1B aumenta en un mieloma con recaída. Señal de CSK1B para 32 matrices emparejadas de diagnóstico y recaída. La línea de referencia del cuartil 4 fue tomada a partir de la muestra completa (n = 351) de matrices en el momento del diagnóstico. Téngase en cuenta que una mayoría de las muestras mostraba una mayor expresión en la recaída; los cambios más dramáticos se observaron en pacientes con niveles de expresión en el cuartil 1-3 en el momento del diagnóstico. Se utilizó una, prueba t pareada modificada por Welch para comparar la Señal a escala logarítmica en el momento del diagnóstico y la recaída.

Las Figuras 8A-E muestran que el ARNm de CSK1B se correlaciona con los niveles de proteína nuclear y se correlaciona inversamente con CDKN1B, y el ARNsi de CKS1B puede aumentar los niveles de p27 y reducir la proliferación celular. La Figura 8A muestra la señal de la expresión génlca de CSK1B y la Figura 8B muestra la de CDKN1B (CDKN1B) en incrementos de 1000 unidades que se representa en el eje y. Los mielomas primarios con expresión de CSK1B en cuartil 1 (n = 13) y el cuartil 4 (n = 14) y las líneas celulares de mieloma (n = 7) se agruparon y se representaron de izquierda a derecha a lo largo del eje x. Cada barra representaba una muestra y la altura indicaba el nivel de expresión génica en la muestra. Se empleó un análisis con transferencia Western de extractos de proteínas nucleares para CSK1B (figura 8C), fosfo-thr-187-CDKN1B (figura 8D) e histona 1A (carga de control; figura 8E) procedentes de partes alícuotas de las mismas células plasmáticas utilizadas en 8A y 8B. Las muestras se ordenaron de izquierda a derecha directamente con el mismo orden en todos los paneles.

Descripción detallada de la invención

La variabilidad en la supervivencia entre los pacientes con mieloma puede oscilar desde un mes a más de 15 años. Los pacientes con mayor riesgo se identifican mejor por la presencia o ausencia de un cariotipo anormal. Sin embargo, esta prueba solo representa el ~15% de la variabilidad en la evolución. Por lo tanto, muchos pacientes que no presentan anomalías citogenéticas, experimentan recaídas rápidas y/o una muerte temprana. Para definir mejor una enfermedad de alto riesgo e identificar potencialmente mecanismos genéticos que dan lugar a esta mala supervivencia, se analizaron patrones de expresión génica en células plasmáticas recién aisladas de 40 pacientes recién diagnosticados con mieloma, los cuales fueron tratados a continuación con trasplantes de células madre en tándem. Los pacientes se separaron en dos grupos de 20 cada uno. Los del grupo de "supervivencia corta" murieron todos en un plazo de 900 días a partir del inicio de la terapia. Los pacientes del grupo de "supervivencia larga" sobrevivieron más de 1.453 días. El ARN procedente de las células plasmáticas se marcó y se híbrido con mlcromatrlces U133Plus2.0. El valor de la expresión se transformó en logaritmo en base 2 y cada muestra se normalizó para proporcionar una media de 0 y una varianza de 1. Los análisis de Chi-cuadrado y las pruebas t se utilizaron para identificar genes cuyos patrones de expresión eran exclusivos de cada grupo.

Un total de 1770 grupos de sondas se expresaban significativamente de forma diferencial entre los dos grupos (P <0,05). Un total de 1.025 (58%) de los grupos de sondas eran elevados en el grupo de supervivencia corta. Una abrumadora mayoría, 290 de los 1.770 genes (19%), se cartografiaron en el cromosoma 1. De los 1.770 grupos de sondas, 84 que mostraban una diferencia más de 2 veces superior en la expresión, se analizaron adicionalmente con análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. En esta prueba, 17 genes eran altamente significativos (P <0,0001) (Tabla 1). De los 17 genes identificados, 10 (59%) se cartografiaron en el cromosoma 1. De estos 10 genes, los 4 genes del brazo p estaban infrarregulados, mientras que los 6 genes del brazo q estaban hiperregulados en el grupo de supervivencia corta.

Se ha demostrado previamente que el salto de 1q y la amplificación de los genes de 1q21 representan lesiones genéticas comunes en el mieloma. El análisis con hibridación in situ fluorescente de BCL9 e IL-6R ha mostrado que estos genes pueden definir un amplicón 1q21. Sin embargo, BCL9 e IL-6R no estaban relacionados con la evolución de la enfermedad. La presente Invención ha descubierto que CKS1B, que se encuentra muy cerca del amplicón 1q21, se hiperexpresa en los mielomas y está altamente correlacionado con la supervivencia global (Figura 1 A) y la supervivencia exenta de eventos (Figura 1B). CKS1B es una proteína conservada evolutivamente que interacclona genética y físicamente con clnasas dependientes de ciclina y promueve la mltosls. Se empleó una RT-PCR cuantitativa para confirmar los resultados para este gen de las micromatrlces. Dado el papel importante de CKS1B en el control de la mitosls, la hlperexpresión de CKS1B, posiblemente como resultado de una amplificación génica, puede conferir un fenotipo altamente agresivo a las células plasmáticas malignas.

Utilizando estudios correlativos de micromatrices con 350 casos recién diagnosticados con una supervivencia global mayor o menor de 2 años desde el inicio de la terapia, se encontró que la expresión elevada de genes del cromosoma 1q era una característica evidente de muerte temprana. Con el uso de modelos estadísticos, en el presente documento se da a conocer un modelo de tres genes que podría reconocer >80% de todas las muertes

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tempranas. Estos tres genes están todos ellos cartografiados en el cromosoma 1. Los genes de 1q desde los telómeros hasta el centrómero son: OPN3 (1q43), ASPM (1 q31.3) y CKS1B (1q21). La posición en el mapa cromosómico de CKS1B, telomérlca en solamente 200 Kb de IL6R, sugiere que este gen es la diana de la amplificación de 1q21 en el mleloma. Además, dada la amplificación frecuente de 1q en muchos cánceres, es posible que CKS1B, solo o junto con los otros dos genes identificados anteriormente, pueda ser un marcador/diana ubicuo para el cáncer en general.

CKS1B y control del ciclo celular

CKS1B se definió originalmente por su capacidad para unirse a complejos CDK/ciclina. CKS1B es una proteína altamente conservada de 79 aminoácidos que tiene dos homólogos en eucariotas superiores. Los ortólogos humanos se pueden sustituir funclonalmente por CKS1 en la levadura. La mayor información genética y bioquímica de un papel mltótlco de las proteínas CKS. La pérdida de la función de CKS1 da como resultado una detención de la fase M con cromosomas condensados pero no segregados, un huso extendido y niveles elevados de actividad clnasa Cdc2/clcllna B. CKS1 también tiene una función G1. El ¡nmunoagotamiento del ortólogo de CKS1, Xep9, procedente de extractos de óvulos en interfase, impedía la entrada en mltosls, mientras que el agotamiento de extractos mitótlcos conducía a una detención de la fase M con niveles elevados de ciclina B y actividad cinasa CDKI/ciclina B. Estos datos sugieren que las proteínas CKS pueden ser necesarias tanto para la entrada como para la progresión de la mltosls.

La síntesis de ADN está mediada por la acción del complejo ciclina E/CDK2, que a su vez está regulado negativamente por el Inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina CDKN1B (Sherr y Roberts, 1999). La pequeña proteína CKS1 conservada evolutivamente es necesaria para la ubicuitinación mediada por SCFSkp2 y la degradación proteasómica del Inhibidor de la clnasa dependiente de ciclina, CDKN1B (Ganoth et al., 2001; Spruck et al., 2001). La degradación de CDKN1B no solo permite la replicación del ADN, sino que también asegura la progresión correcta de las células a través de la fase S en la mitosis (Nakayama et al., 2004) y las proteínas Cks interaccionan con el proteasoma para controlar la proteóllsis de las ciclinas mltótlcas, por medio de una regulación de la actividad transcripcional de CDC20 (Morris et al., 2003), una subunldad reguladora de la ubicuitina ligasa del complejo que favorece la anafase/clclosoma (Peters, 2002). Por lo tanto, CKS1 y el eje SCFSkp2-CDKN1B-Cdk1/2 parecen ser Importantes tanto para la síntesis de ADN y como para la mltosls (Pagano, 2004). Los bajos niveles de proteína CDKN1B en las células cancerosas, en ausencia de mutaciones génlcas, ha llevado a la especulación de que la hlperactivación de CKS1B y/o SKP2, puede explicar los bajos niveles de CDKN1B (Slingerland y Pagano, 2000). Por otra parte, CKS1B también regula la transición de G2 a M mediante el control de la degradación de la ciclina B por APC.

CKS1B y cáncer

Los resultados descritos a continuación Identifican que CKS1B está ubicado en 1q21 como un gen potente candidato para conferir un pronóstico malo en pacientes que reciben trasplantes de células madre en tándem para su mieloma. El análisis de una hibridación in situ fluorescente confirmó una expresión elevada de CKS1B; por lo tanto, la supervivencia estaba directamente relacionada con la actividad de transcripción del gen CKS1B y el número de coplas en pacientes recién diagnosticados. Fia habido una sugerencia de que la terapia previa y una latencia larga dan como resultado un evento de amplificación. Pacientes jóvenes (<50 años) son más propensos a presentar CKS1B elevado que los pacientes ancianos (>60 años). Los datos de 20 pacientes con muestras del valor inicial y de la recaída mostraron que la amplificación del gen CKS1B y un aumento de la expresión se incrementaban en pacientes que tenían valores ¡nidales normales. Estos datos sugieren que la amplificación de CKS1B puede estar presente en el momento del diagnóstico y estar relacionada con una mala supervivencia y se puede amplificar durante el curso de una recaída fulminante.

Aberraciones cromosómicas numéricas primarlas observadas en múltiples cariotipos de mieloma, evolucionan aparentemente durante un período prolongado de tiempo, ya que la enfermedad permanece como un fenómeno subclínico (MGUS). En estadios posteriores de mieloma múltiple progresivo, se lleva a cabo la evolución citogenética, lo que da como resultado la adquisición de anomalías adicionales que, por lo general, implican al cromosoma 1. La trisomía del cromosoma 1 se observa en el 40% de los cariotipos de mieloma, y la trisomía del brazo largo del cromosoma 1q es común en muchos tipos de cáncer, como la leucemia y los linfomas. El 1q duplicado podría ser una mutación secundarla asociada con la progresión de la enfermedad. La trisomía de 1q también se ha relacionado con un potencial metastáslco de carcinomas de colon y de células renales.

Este es el primer Informe que indica que el gen CKS1B puede ser un oncogén, y que este oncogén tiene un papel en la adquisición de resistencia a los fármacos y la muerte rápida en el mieloma. La frecuencia de este defecto genético en el mieloma y en otros tipos de cáncer, como la leucemia, los linfomas, el cáncer de mama, el cáncer de colon y el cáncer de próstata, sugiere que la amplificación de CKS1B es un mecanismo frecuente por el que se desarrollan tumores altamente prollferativos y una enfermedad resistente a múltiples fármacos. El desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de CKS1B puede ser una estrategia terapéutica futura y CKS1B podría ser un marcador de gran alcance para el estadio inicial y el seguimiento de la enfermedad, para predecir una recaída inminente mediante la detección de una amplificación de CKS1B con técnicas tales como la creación de perfiles de expresión génica, la hibridación in situ fluorescente o la inmunohistoquímlca. Además de la hiperexpresión de un gen, la reducción de la

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expresión del gen RFP2 en el cromosoma 13q14 ya sea sola o en combinación con la hiperexpresión del gen CKS1B, puede tener un papel significativo en el diagnóstico del mieloma múltiple.

En una realización de la presente invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de un paciente con mieloma múltiple, que comprende las etapas de: obtener células plasmáticas de dicho paciente, determinar la expresión génica de uno o varios genes del grupo que consiste en GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EV15, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489, LTBP1, TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, OPN3, ASPM, CCT2, UBE2I, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKS1B, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IFI16, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENOI, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, ROBOI, TCOF1, YWHAZ, MPHOSPH1 en la célula plasmática, y comparar el nivel de expresión del (de los) gen(es) con el nivel de expresión del gen en un individuo de control, en donde una expresión reducida, una hiperexpresión de un gen o una combinación de ambas, en comparación con los niveles de expresión génica en células plasmáticas de un individuo de control, indica que el paciente tendrá un pronóstico malo.

Un paciente que tiene un pronóstico malo es el que tiene riesgo de desarrollar una forma agresiva de la enfermedad, padecer una recaída o tener una esperanza de vida más corta. En concreto, la reducción de la expresión de un gen, la hiperexpresión de un gen o una combinación de ambas en un paciente después del tratamiento, predice el riesgo de recaída en el paciente después del tratamiento. Ejemplos de un tratamiento que un paciente de este tipo habría padecido es la quimioterapia en dosis elevada y el trasplante de células madre autólogas de la sangre periférica. Ejemplos de los genes con una expresión reducida, aunque no limitados a los mismos, incluyen GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EV15, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489 o LTBP1. Además, ejemplos de los genes que se hiperexpresan, aunque no se limitan a los mismos, incluyen TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, OPN3, ASPM, CCT2, UBE21, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKS1B, CKAP1, MGC57827, DKPZp7790175, PFN1, ILF3, IFI16, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENOI, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, ROBOI, TCOF1, YWHAZ o MPHOSPH1. Específicamente, el gen que se hiperexpresa es el gen CKS1B y el gen con una expresión reducida es el gen RFP2. Adicionalmente, el individuo de control es un individuo sano, normal o un individuo diagnosticado con mieloma múltiple que carece de una hiperexpresión del gen, una reducción de la expresión del gen o una combinación de las mismas. Además, la expresión génica se puede determinar mediante micromatrices de ADN o RT-PCR.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de un paciente con mieloma múltiple, que comprende las etapas de: obtener células plasmáticas a partir del paciente y determinar el número de copias de uno o varios genes descritos anteriormente, en donde una disminución del número de copias, un aumento del número de copias o una combinación de los mismos en comparación con el número de copias en una célula plasmática de un individuo de control, indica que el paciente tendría un pronóstico malo. Como se ha descrito anteriormente, una disminución del número de copias, un aumento del número de copias del gen o una combinación de los mismos en un paciente después del tratamiento, predice el riesgo de recaída después del tratamiento. El tipo de tratamiento es el mismo que se ha descrito anteriormente.

Además, ejemplos de los genes con una disminución del número de copias son iguales que los genes con una expresión reducida, mientras que los ejemplos del gen con un mayor número de copias son iguales que los genes con hiperexpresión. Además, un gen preferido con un número de copias incrementado es el gen CKS1B y un gen preferido con un número de copias reducido es el gen RFP2. El individuo de control en este método es un individuo sano normal o un individuo diagnosticado con mieloma múltiple que carece de una disminución del número de copias, de un aumento del número de copias del gen o de una combinación de los mismos. Además, el número de copias del gen se determina mediante hibridación in situ fluorescente. En una realización adicional relacionada de la presente invención, es un kit que comprende; sonda(s) específica(s) para uno o varios de los genes que se han descrito anteriormente.

En todavía otra realización de la presente invención, se proporciona un método para determinar el riesgo de desarrollar un evento relacionado con una enfermedad, para un paciente con cáncer. Un método de este tipo comprende las etapas de: obtener muestras biológicas a partir del paciente y determinar los niveles de expresión génica, el número de copias o la combinación de uno o varios genes que pertenecen al grupo descrito anteriormente por tener hiperexpresión, en donde la hiperexpresión, el aumento del número de copias del gen o una combinación de los mismos, en comparación con los niveles de expresión génica, el número de copias de la combinación en un individuo normal, indica que el paciente tendría un mayor riesgo de desarrollar un evento relacionado con una enfermedad. Ejemplos representativos del gen que se hiperexpresa o que tiene un número de copias incrementado son el gen OPN3, CKS1B o ASPM.

Generalmente, el evento relacionado con una enfermedad consiste en la muerte, la progresión a una forma agresiva de la enfermedad y la recaída. Además, el paciente con cáncer puede ser un individuo con una amplificación de 1q21. Un individuo de este tipo puede ser un paciente con mieloma múltiple, cáncer de mama, cáncer de colon o cáncer de próstata. Por otra parte, el individuo de control es el mismo que el que se ha descrito anteriormente en los métodos. Además, el nivel de expresión génica o el número de copias se determina antes o después del tratamiento del paciente. El tipo de tratamiento, el método utilizado para determinar el nivel de expresión génica y el número de

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copias es el mismo que se ha descrito anteriormente. Además, el nivel de expresión génica se determina a nivel de proteína. Ejemplos de tales métodos, aunque sin estar limitados a los mismos, incluyen citometría de flujo, ¡nmunohistoquímica y matriz tisular.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento para un paciente con cáncer que tiene hiperexpresión del gen CKS1B o del producto génico de CKS1B, que comprende la etapa de administrar al paciente un agente que regula a la baja la expresión del gen CKS1B o del producto génico de CKS1B. Un paciente de este tipo puede ser un individuo con una amplificación de 1q21. Además, un individuo tal puede ser un paciente con mieloma múltiple, cáncer de mama, cáncer de colon o cáncer de próstata. Ejemplos de agentes que regulan a la baja la expresión del gen CKS1B no se limitan a los mismos, pero incluyen la interferencia mediada con ARN o un ácido nucleico peptídico (PNA). Ejemplos de agentes que regulan a la baja la expresión del gen CKS1B no se limitan a los mismos, pero incluyen un oligonucleótido anti-sentido, un anticuerpo o un inhibidor de molécula pequeña que son bien conocidos por un experto en la técnica.

En aún otra realización de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un individuo que tiene mieloma múltiple de alto riesgo, que comprende administrar al individuo cantidades farmacéuticamente eficaces de un compuesto que regula a la baja la expresión del gen CKS1B o el producto génico de CKS1B y un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el gen RFP2. Los ejemplos de compuestos que regulan a la baja la expresión del gen CKS1B o de su producto génico, son los mismos que se han descrito anteriormente.

En aún otra realización de la presente invención, se proporciona un kit, que comprende; (a) una sonda específica para el gen CKS1B, (b) una sonda específica para el gen RFP2, o combinaciones de las mismas.

Los presentes ejemplos, junto con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos en esta memoria, son actualmente representativos de las realizaciones preferidas y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los objetivos, fines y ventajas inherentes al presente documento. Cambios en la misma y otros usos que se engloban dentro del espíritu de la invención, tal como se definen por el alcance de las reivindicaciones, se les ocurrirán a los expertos en la técnica.

EJEMPLO 1

Supervivencia global relacionada con las ganancias de genes en el cromosoma 1

Este ejemplo revela datos de la creación de perfiles de expresión génica que identifican los genes cuya expresión en células plasmáticas malignas de pacientes recién diagnosticados con mieloma, se correlaciona significativamente con una muerte prematura en pacientes tratados con trasplantes de células madre en tándem.

La Figura 2 muestra un análisis de la supervivencia global en pacientes con más de 1,5 años de seguimiento. Las muestras de los pacientes se agruparon en cuartiles basándose en los niveles de expresión génica. Q1 es el cuartil más bajo y Q4 es el más alto. Había una relación significativa entre el pronóstico malo y una expresión elevada de ASPM, OPN3 o CSK1B (Figura 2, panel superior). El poder de predicción de la supervivencia se incrementó mediante la agrupación de dos o más de estos tres genes en el análisis (Figura 2, panel inferior).

Estos tres genes capaces de predecir la supervivencia global también se pueden utilizar para predecir la supervivencia exenta de eventos (Figura 3A), y el poder de predicción se incrementó mediante la agrupación de dos o más de los tres genes en el análisis (Figura 3B). La Figura 4 muestra que un incremento de la expresión de CSK1B y del número de copias se asociaba con una recaída.

TABLA 1

Diecisiete genes cuyos niveles de expresión predicen una muerte temprana con mieloma múltiple

Grupo de sondas

Símbolo del gen Cromosoma

1565951_s_at

OPN3 1q43

200850_s_at

AHCYL1 1 p12

201897_s_at

CKS1B 1 q21.2

201921_at

GNG10 9q32

202345_s_at

FABP5 8q21.13

202729_s_at

LTBP1 2p22-p21

5

10

15

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Grupo de sondas

Símbolo del gen Cromosoma

206513_at

AIM2 1q22

208540_x_at

S100A11 1q21

209717_at

EV15 1 p22

210427_x_at

ANXA2 15q21-q22

213704_at

RABGGTB 1 p31

219918_s_at

ASPM 1q31

222495_at

AD-020 1 p13.3

224847_at

CDK6 7q21

227525_at

GLCCI1 7p22.1

230100_x_at

PAK1 11q13-q14

242488_at

1q43

EJEMPLO 2

Creación de perfiles de expresión génica para identificar genes candidatos para el diagnóstico, el pronóstico y posibles dianas de fenotipos de alto riesgo

Como se ha descrito anteriormente, el perfil de expresión génica global identificaba genes cuya hiperexpresión o falta de expresión podría ser útil para la estadificación y la realización de un seguimiento de la enfermedad mieloma múltiple y otros cánceres. Esta creación de perfiles génicos también se utilizó para identificar genes cuya expresión anormal podría causar un fenotipo de alto riesgo de mieloma.

(a) Sujetos:

En el estudio participaron 668 pacientes recién diagnosticados con mieloma múltiple sintomático o progresivo, el cual incluía 2 ciclos de melfalán de dosis alta (200 mg/m2) apoyados con células madre sanguíneas (Shaughnessy et al., 2003). Un subgrupo de 575 pacientes con mediciones genéticas disponibles, tal como se describe a continuación, constituían la muestra para este análisis. La mediana del seguimiento fue de 30 meses. Había 185 eventos de progresión o de muerte y 128 muertes. Las características de los pacientes eran las siguientes: el 20% tenían 65 años o más, el 31% tenía niveles de beta-2-mlcroglobulina >= 4 mg/L, el 55% tenían niveles de proteína C reactiva >= 4 mg/L; el 22% presentaba valores de hemoglobina <=10 g/dL, el 10% tenía valores de creatlnlna >= 2 mg/dL; LDH era elevada (>= 190 Ul/L) en el 30%, la albúmina disminuía (<3,5 g/dL) en el 15%; se detectaron anomalías citogenéticas en el 33%. La mediana del seguimiento en este subgrupo era de 22 meses y hubo 98 eventos y 64 muertes.

(b) Creación de perfiles de expresión génica:

La creación de perfiles de expresión génica, utilizando la micromatriz de Affymetrix U133Plus2.0, se realizó en células plasmáticas enriquecidas con CD138, aisladas a partir de 351 pacientes consecutivos, como se ha descrito previamente (Zhan et al., 2002).

(c) Hibridación in situ fluorescente (FISH):

Los cromosomas artificiales bacterianos que incluían CKS1B en 1q21 (RP11-307C12) y ASPM (RP11-32D17) en 1q31 se adquirieron de BAC/PAC Resources (Oakland, CA) y se marcaron directamente con Spectrum-Verde o Spectrum-Rojo (Vysis Inc, Downers Grove, IL). La hibridación in situ fluorescente en metafase se realizó como se ha descrito previamente (Sawyer et al., 2005). Se confirmó que las sondas cartografiaban las bandas de 1q21 y 1q31 utilizando extensiones en metafase procedentes de linfocitos humanos normales. Los análisis de hibridación in situ fluorescente en interfase con tres colores, del número de copias de los cromosomas 13 (D13S31) y 1q21 (CKS1B) se realizaron como se ha descrito (Shaughnessy et al., 2000) en un subgrupo de 421 pacientes (145 eventos y 100 muertes, seguimiento de 31 meses); la deleción 13q se puntuó como positiva cuando >= el 80% de las células clónicas mostraba una pérdida de señal en 13q14 como se ha descrito (McCoy et al., 2003). De estos 421 pacientes, 197 estaban entre los que tenían micromatrices y 224 no.

(d) Transferencia Western:

La proteína nuclear se aisló a partir de una parte alícuota de células plasmáticas enriquecidas con CD138 que también se analizaron mediante una micromatriz. La transferencia Western se realizó empleando el protocolo de inmunodetecclón qulmlolumlnlscente WesternBreeze®, como se ha descrito (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los anticuerpos para CKS1B y fosfo-thr-187-CDKN1B se adquirieron en Zymed Laboratories Inc, (South San Francisco, 5 CA) y la anti-histona 1A se adquirió en Upstate Biotechnology (Charlottesville, VA).

(e) Análisis estadístico:

La muestra de 351 micromatrices de Affymetrix U133Plus2.0 se procesó previamente utilizando el programa informático MAS5.01 y se normalizó utilizando la escala MAS5.01 convencional, como se detalla en los Métodos Complementarios. Las pruebas de rango logarítmico para la asociación univariada con la supervivencia relacionada 10 con enfermedad, se realizaron para cada uno de los 54.675 resúmenes de "Señal". En concreto, se realizaron pruebas de rango logarítmico para el cuartil 1 frente a los cuartiles 2-4 y el cuartil 4 frente a los cuartiles 1-3, con el fin de identificar los genes subexpresados e hiperexpresados, respectivamente. Se aplicó un umbral de tasa de descubrimiento falso del 2,5% a cada lista de valores P del rango logarítmico (Storey et al., 2003), dando como resultado 19 grupos de sondas subexpresadas y 51 grupos de sondas hiperexpresadas. Para los 70 grupos, la 15 pertenencia al cuartil extremo (Q1 o Q4) se asoció con un mayor riesgo de muerte relacionada con la enfermedad. Todos los demás EFS y la evolución de la supervivencia en este análisis fueron generales (es decir, no relacionados con la enfermedad). El método de Kaplan-Meler se utilizó para estimar las distribuciones de la supervivencia exenta de eventos y la supervivencia global y las pruebas de rango logarítmico se utilizaron para analizar su igualdad entre los grupos. Las pruebas de Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher se utilizaron para la prueba de independencia 20 de las categorías. La regresión de riesgos proporcionales multivariados se utilizó para ajustar los efectos de la expresión de CKS1B y la amplificación para otros indicadores, y se calcularon las proporciones de la heterogeneidad observada interpretadas por los indicadores combinados (es decir, R2) (O'Quigley y Xu et al., 2001). El paquete estadístico R versión 2.0 (R Development Core Team, 2004) se utilizó para este análisis.

Los datos de las micromatrices de los 351 pacientes se han depositado en el “Gene Expression Omnibus” del NIH 25 con el número de orden GSE2658. Téngase en cuenta que un análisis de las muestras del valor inicial para 174 de los mismos pacientes se había indicado anteriormente (De Vos et al., 2002) utilizando micromatrices U95Av2 de Affymetrix. Estas muestras se hibridaron de nuevo con micromatrices U133Plus2.0 para los análisis actuales.

(f) índice de la amplificación de CKS1B basado en FISH:

Un punto de corte convencional, definido en laboratorio del 20% para la proporción de células plasmáticas clónicas 30 con 3 señales o >= 4 señales, se utilizó para pruebas de asociación entre la expresión y la amplificación (Figura 6B y Tabla 5) y para la validación de la asociación entre la amplificación y la supervivencia global (Figuras 6C-D). Con la hipótesis de que 2 o más copias adicionales podrían conferir un riesgo adicional, en comparación con 1 copia adicional, el análisis multivariado de la supervivencia global (Tabla 4A) estimaba el tamaño del efecto independiente para la proporción de 3 señales y la proporción de >= 4 señales. Estos tamaños del efecto se utilizaron para definir 35 el índice de amplificación como una suma ponderada: (0,34 * % de 3 copias + 0,66 * % de >= 4 copias)/0,66. El índice se adapta de manera que se incrementa en uno para cada incremento de unidad en la proporción con >= 4 señales. El índice es 0 para los pacientes con <= 2 señales en el 100% de las células clónicas, 51,5% para los pacientes con 3 señales en el 100%, y 100 para los pacientes con >= 4 señales en el 100%. Se observó el intervalo completo en estos pacientes. Un punto de corte para el índice de >= 46 minimizaba el valor P del rango logarítmico 40 no ajustado para la supervivencia en el subgrupo de 421 pacientes (es decir, un corte óptimo). Téngase en cuenta que todos los puntos de corte para el índice de entre 3 y 88 tenían una P <0,003.

(g) Subgrupos genéticos:

Casi el 50% de los mielomas recién diagnosticados contiene una de las cinco translocaciones cromosómicas recurrentes que dan como resultado la hiperactivaclón de MAF, MAFB, FGFR3/MMSET, CCND3, CCND1 (Kuehl et 45 2002) con pronósticos divergentes (Fonseca et al., 2004), detectable como una expresión "enriquecida" mediante el

análisis con micromatrices (Valk et al., 2004). Los subgrupos genéticos se clasificaron basándose en la presencia o ausencia de estos picos de translocación. Los pacientes también se clasificaron dentro del contexto de la citogenética en metafase por tener cariotipos normales (originados en células hematopoyéticas normales en el caso de mleloma hipoproliferativo) o por tener anormalidades hiperdiploides, hipodiploides u "otras" anomalías 50 cltogenétlcas. "Otras" se define como un cariotlpo anormal en metafase, es decir, cambios estructurales y/o numéricos, con un número de cromosomas modal diploide. Por lo tanto, a diferencia del seminario de París (Fonseca et al., 2004), las entidades sin translocación se definieron por la citogenética en metafase en lugar de por la citogenética en ¡nterfase.

(I) Análisis de micromatrices

55 Los resúmenes de la “Señal” procesada previamente con Affymetrix MAS5.01 se utilizaron exclusivamente para este análisis, con una normalización de la matriz MAS5.01 realizada mediante una escala de la media recortada al 2% de señales de cada conjunto de sondas de la matriz para ser Igual a 500. Para seleccionar los genes del foco, se utilizó un solo criterio para el filtrado del grupo de sondas y el análisis de significancia como una consecuencia del diseño

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experimental particular. En lugar de comparar los niveles de expresión continua a través de categorías predefinidas, como suele ser el caso, el diseño requería comparar la distribución de la muerte relacionada con enfermedad temprana (mediana del seguimiento <2 años) a través de los cuartiles de la distribución de la expresión. El diseño estaba influido por la hipótesis biológica de que los genes de pronóstico malo que se "conectan" o desconectan, pueden estar asociados con una expresión en el cuartil inferior o superior de la muestra, respectivamente. Las pruebas de rango logarítmico para las diferencias de la supervivencia relacionada con la enfermedad a través de Q1 frente a otros, y Q4 frente a otros, se realizaron para todas las 54.675 señales de grupos de sondas, con la única restricción que la muestra contenía suficientes valores de señales únicos para el grupo de sondas, una condición que cumplían todos (es decir, un mínimo de 79 valores únicos). Entre los 70 grupos de sondas declarados significativos para la subexpresión o hiperexpresión, el número mínimo de valores únicos era 323 (percentil 30° de los 54675) y la mediana era 346 (percentil 83°). La varianza de la muestra mínima de las señales en logaritmo de base 2 era de 0,13 (percentil 0,6°) y la media era 0,52 (percentil 29°). La tasa de cambio mínimo sobre el intervalo de la señal era 2,13 (percentil 0,4°) y la mediana era 5,26 (percentil 40°). El examen de las distribuciones de la expresión de los grupos de sondas declarados significativos, no sugiere ninguna razón para que cualquiera de ellos deba ser "filtrado" por filtros de varianza mínima o de tasa de cambio, en particular ya que el valor de P mayor del rango logarítmico era 0,00003. El análisis de la significancia se realizó mediante el cálculo de las estimaciones de las tasas de falso descubrimiento que corresponden a puntos de corte con valores P especificados, como describen Storey y Tibshirani (Shaughnessy et al., 2003). La lista de 70 genes se basa en los puntos de corte del valor P con tasas de falso descubrimiento estimado de 2,5% para las listas del valor P subexpresado e hiperexpresado.

EJEMPLO 3

Resultados de la creación de perfiles de expresión génica global:

Sobre una base molecular para identificar genes que podrían contribuir a un mieloma de alto riesgo, los perfiles de expresión génica de células plasmáticas purificadas se correlacionaron con la supervivencia relacionada con la enfermedad y la global en 351 pacientes con diagnóstico reciente, tratados con 2 ciclos de dosis elevadas de melfalán.

Empleando las pruebas de rango logarítmico, se identificaron 70 genes para los que pertenecer al cuarto o al primer cuartil se correlacionaba con una alta incidencia de muerte relacionada con enfermedad (Tabla 2). Aunque el 10% de los genes en la micromatriz se había obtenido a partir del cromosoma 1, el 30% de los genes obtenidos se obtuvo a partir de ese cromosoma (P <0,0001); 9 de 51 genes del cuartil 4 se cartografiaron en el brazo 1q del cromosoma y 2 en el brazo 1 p, mientras que 9 de 19 genes del cuartil 1 se cartografiaron en el brazo 1p del cromosoma y ninguno en el brazo 1q (Tabla 3). La hiperrepresentación de genes 1q en la lista de 70, y la observación de que la amplificación de 1q21 se asociaba con la progresión y un pronóstico malo en el mieloma (Smadja et al., 2001; Sawyer et al., 2005; Philip et al., 1980) justificó centrarse en esta región en busca de una base molecular para el mieloma de alto riesgo: 2 genes (PSMD4 y CKS1B) se cartografiaron en 1q21, entre los cuales la pertenencia al cuartil 4 de CKS1B estaba asociada más fuertemente con la supervivencia en las pruebas de rango logarítmico no ajustado (Tabla 2).

TABLA 2A

Correlaciones de rangos - grupos de sondas con FDR del 2,5% del cuartil 4 con índice de amplificación de 1q21, el índice de marcado de CKS1B y PC y valores de P ajustados para asociaciones con la supervivencia global

Rango (Q4)

Cromosoma Grupo de sondas Símbolo índice de amplificación de CKS1B r* CKS1B r' PCLI r* Valor P ajustado de la supervivencia

1

8q21.13 202345_s_at NA 0,20 0,22 0,001

2

Xp22.2-p22.1 1555864_s_at NA 0,34 0,47 0,007

3

5p15.33 204033_at TRIP/3 0,19 0,45 0,20 0,001

4

1q22 206513_at AIM2 0,15 0,13 0,089

5

2p24.1 1555274—a_ SELI 0,28 0,31 0,001

6

21 q22.3 211576_s_at SLC19A1 0,17 0,23 0,007

7

3p21.3 204016_at LARS2 -0,18 0,002

8

1q43 1565951 _s_ OPN3 0,36 0,36 0,007

9

1q31 21991 B_s_at ASPM 0,36 0,64 0,17 0,010

10

12q15 201947_s_at CCT2 0,23 0,43 0,13 0,004

Rango (Q4)

Cromosoma Grupo de sondas Símbolo Índice de amplificación de CKS1B rt CKS1B rt PCLI r* Valor P ajustado de la supervivencia

11

16p13.3 213535_s_at UBE21 0,38 0,022

12

20q13.2 -q13.3 204092_s_at STK6 0,31 0,51 0,19 0,044

13

1p36.33 - p36.21 213607_x_at FLJ13052 0,150

14

Xq12-q13 208117_s_at FLJ12525 0,34 0,006

15

17q25 210334_x_at BIRC5 0,20 0,36 0,14 0,110

16

3q27 204023_at NA 0,29 0,62 0,16 0,072

17

1q21.2 201897_s_at CKS18 0,50 1,00 0,15 0,007

18

19q13.1 1-q13.12 216194_s_at CKAP1 0,24 0,38 0,001

19

1q21 225834_at MGC57827 0,39 0,66 0,23 0,140

20

19q13.1 2 238952_x_at DKFZp779 0175 0,11 0,009

21

17p13.3 200634_at PFN1 0,30 0,41 0,002

22

19p13.2 20893 1—s— ILF3 0,22 0,22 0,220

23

lq22 206332_s_at IF/16 0,30 0,32 0,13 0,003

24

7p14-p13 220789_s_at TBRG4 0,13 0,17 0,009

25

10p11.2 3 218947_s_at PAPD1 0,31 0,30 0,150

26

8q24 213310_at EIF2C2 0,28 0,37 0,031

27

3q12.1 224523_s_at MGC4308 0,17 0,24 0,14 0,038

28

1p36.3-p36.2 201231_s_at EN01 0,23 < 0,001

29

18q12.1 217901_at DSG2 0,15 0,005

30

6q22 226936_at NA 0,15 0,52 0,17 0,027

31

8q24.3 58696_at EXOSC4 0,20 0,330

32

1q21-q25 200916_at TAGLN2 0,47 0,52 0,120

33

3q21 201614_s_at RUVBL1 0,16 0,14 0,023

34

16q22-q24 200966_x_at ALDOA 0,21 0,28 0,001

35

2p25.1 225082_at CPSF3 0,39 0,073

36

1q43 242488_at NA 0,18 0,27 0,14 0,090

37

3q12.3 243011_at MGC15606 0,27 0,004

38

22q13.1 201105_at LGALS1 0,31 0,051

39

3p25-p24 224200_s_at RAD18 0,17 0,41 0,14 0,040

40

20p11 222417_s_at SNX5 0,085

41

1q21.2 210450_s_at PSMD4 0,58 0,59 0,13 0,067

42

12q24.3 200750_s_at RAN 0,22 0,40 0,056

43

1pter-q31.3 206364_at KIF14 0,41 0,57 0,25 0,019

44

7p15.2 201091_s_at CBX3 0,14 0,20 0,16 0,150

45

12q22 203432_at TMPO 0,32 0,59 0,18 0,007

Rango (Q4)

Cromosoma Grupo de sondas Símbolo Índice de amplificación de CKS1B rt CKS1B rt PCLI r* Valor P ajustado de la supervivencia

46

17q24.2 221970_s_at DKFZP586 L0724 0,27 0,47 0,081

47

11p15.3 -p15.1 212533_at WEE1 0,20 0,54 0,13 0,056

48

3p12 213194_at ROB01 0,150

49

5q32-q33.1 244686_at TCOF1 0,120

50

8q23.1 200638_s_at YWHAZ 0,26 0,23 0,012

51

10q23.31 205235_s_at MPHOSPH1 0,40 0,16 0,050

TABLA 2B

Grupos de sondas génicas del cuartil 1 cumplen el punto de corte con FDR del 2,5%

Rango (Q1)

Cromosoma Grupo de sondas Símbolo Índice de amplificación de CKS1B rt CKS1B rt PCLI r* Valor P ajustado de la supervivencia3

1

9q31.3 201921_at GNG10 -0,20 -0,30 0,600

2

1p13 227278_at NA -0,12 0,900

3

Xp22.3 209740_s_at PNPLA4 0,029

4

20q11.21 227547_at NA -0,29 -0,28 -0,15 0,630

5

10q25.1 225582_at KIAA1754 -0,21 -0,32 0,003

6

1p13.2 200850_s_at AHCYL1 -0,13 0,019

7

1p13.3 213628_at MCLC -0,30 -0,28 -0,15 0,440

8

1p22 209717_at EV15 -0,33 -0,29 -0,16 0,870

9

1p13.3 222495_at AD-020 -0,30 -0,24 -0,20 0,920

10

6p21.31 1557277_a_at NA -0,11 0,460

11

1p22.1 1554736_at PARG1 -0,20 -0,11 0,280

12

1p22 218924_s_at CTBS -0,16 -0,11 -0,13 0,460

13

9p13.2 226954_at NA -0,22 -0,40 0,090

14

1p34 202838_at FucA1 -0,17 -0,23 0,066

15

13q14 230192_at RFP2 -0,28 -0,18 0,880

16

12q13.11 48106_at FLJ20489 -0,23 -0,23 -0,11 0,300

Rango (Q1)

Cromosoma Grupo de sondas Símbolo índice de amplificación de CKS1B r* CKS1B r* PCLI r* Valor P ajustado de la supervivencia3

17

11 q13.1 237964_at NA -0,16 -0,20 0,044

18

2p22-p21 202729_s_at LTBP1 -0,24 -0,21 0,097

19

1 p13.1 212435_at NA -0,21 -0,21 -0,11 0,034

T Correlación entre la expresión a escala logarítmica de cada gen y el indice de amplificación de CKS1B (N = 197 todos los pacientes con GEP y FISH de 1q21). Las celdas en blanco se corresponden a correlaciones con P> 0,05. * Correlación entre la expresión a escala logarítmica de cada gen y la expresión de CKS1B a escala logarítmica (N = 351, todos los pacientes con GEP). Las filas con CKS1B |r| >= 0,4 tienen el formato en negrita. La correlación entre la expresión de cada gen a escala logarítmica y el PCLI (N = 305, 46 pacientes no tienen PCLI). a Regresión de riesgos proporcionales multivariados de la supervivencia global sobre la expresión del cuartil extremo (Q1 o Q4) para cada gen, ajustada por FISH 13 80%, anomalías cltogenéticas, B2M>4, CRP>4, ALBO,5 y PCLI (N = 277, 74 pacientes han perdido al menos una medición).

Tabla 3. Distribución cromosómica de grupos de sondas génicas con FDR del 2,5%

U133Plus2.0 Q1 Q4 Combinado

Cromosoma

Número de Genes % Número de Genes % Número de Genes % Número de Genes % Valor de P *

1

3.659 9,9 9 47,4 12 23,5 21 30,0 <0,0001

2

2.522 6,9 1 5,3 2 3,9 3 4,3

3

2.116 5,8 0 0,0 7 13,7 7 10,0

4

1.456 4,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0

5

1.718 4,7 0 0,0 2 3,9 2 2,9

6

2.005 5,4 5,3 1 2,0 2 2,9

7

1.798 4,9 0 0,0 2 3,9 2 2,9

8

1.311 3,6 0 0,0 4 7,8 4 5,7

9

1.463 4,0 2 10,5 0 0,0 2 2,9

10

1.444 3,9 1 5,3 2 3,9 3 4,3

11

2.069 5,6 1 5,3 1 2,0 2 2,9

12

1.927 5,2 1 5,3 3 5,9 4 5,7

13

730 2,0 1 5,3 0 0,0 1 1,4

14

1.195 3,2 0 0,0 0 0,0 0 0,0

U133Plus2.0 Q1 Q4 Combinado

Cromosoma

Número de Genes % Número de Genes % Número de Genes % Número de Genes % Valor de P *

15

1.152 3,1 0 0,0 0 0,0 0 0,0

16

1.507 4,1 0 0,0 2 3,9 2 2,9

17

2.115 5,7 0 0,0 3 5,9 3 4,3

18

582 1,6 0 0,0 1 2,0 1 1,4

19

2.222 6,0 0 0,0 3 5,9 3 4,3

20

1.072 2,9 1 5,3 2 3,9 3 4,3

21

468 1,3 0 0,0 1 2,0 1 1,4

22

906 2,5 0 0,0 1 2,0 1 1,4

X

1.273 3,5 1 5,3 2 3,9 3 4,3

Y

80 0,2 0 0,0 0 0,0 0 0,0

m

5 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0

36.795 19 51 70

Desconocido

17.880

54.675

* Se ha realizado una prueba exacta para las proporciones binomiales para comparar la proporción de grupos de sondas obtenidas que se cartografiaban en el cromosoma 1 con la proporción para toda la matriz.

Los niveles de expresión a escala logarítmica de genes asociados con la proliferación tendían a tener correlaciones elevadas con CKS1B (Tabla 2). Además, 25 de 29 genes (86%), correlacionados significativamente con el índice de 5 marcado de células plasmáticas, estaban fuertemente correlacionados con CKS1B, lo que sugiere que este gen participaba en una red de señalización de la proliferación en pacientes con enfermedad de alto riesgo. CKS1B era un Indicador Independiente de la supervivencia global después del ajuste de la deleción del cromosoma 13 mediante FISH en ¡nterfase, anomalías citogenéticas en metafase, factores de pronóstico clínico e índice de marcado (P = 0,007, Tabla 2, última columna, fila 17). Los valores de P ajustados se proporcionan para los otros 69 genes para 10 comparar, y era evidente que algunos otros genes del cromosoma 1 eran fuertes indicadores Independientes de la supervivencia, la proliferación y la amplificación del gen CKS1B.

Aunque la mediana de la edad de la actual cohorte era 57, más joven que la mediana de la edad en el momento del diagnóstico, el 25% entre 64 y 76 eran suficientes para considerar si la edad modificaba el efecto de la hiperexpresión o amplificación de CKS1B en el análisis multivariado en las Tablas 2 y 4b, respectivamente. Como 15 una variable continua, la edad no era un modificador significativo del efecto de CKS1B sobre la supervivencia, en el análisis (P = 0,37, HR 1,03, para la expresión de CKS1B y P = 0,81, HR 0,99, para la amplificación), correspondiendo el efecto más fuerte a un riesgo más alto estimado del 3% para un 1 año más en la edad (los resultados son similares para EFS). Además, había una prevalencia algo mayor de la amplificación de CKS1B entre los pacientes mayores de 65 años (P = 0,2). Se especuló que genes asociados con la vía de la proliferación mediada 20 por 1q21 dominaban como indicadores univariados de la supervivencia relacionada con la enfermedad en el seguimiento temprano. Los genes relacionados con otras lesiones genéticas, como FGFR3/MMSET, MAF y MAFB se clasificaban por debajo de 70, pero pueden aparecer con tasas elevadas de falso descubrimiento.

TABLA 4A

Análisis multivariado de riesgos proporcionales f (n = 369)

Supervivencia exenta de eventos Supervivencia

% HR P r2 acumulado HR P r2 acumulado

índice de amplificación de CKS1B (0-100)

1,009 0,002 0,160 1,011 0,002 0,219

Deleción del cromosoma 13 FISH

25,5 1,786 0,006 0,224 1,879 0,014 0,308

Cariotipo anormal

35,0 1,875 0,001 0,272 2,298 <0,001 0,393

Beta-2-microglobulina >= 4 mg/L

35,8 1,478 0,046 0,305 1,396 0,170 0,422

Proteína C reactiva >= 4 mg/L

63,.4 1533 0,028 0,320 1,586 0,055 0,448

Albúmina < 3,5 g/dL

16,5 1,660 0,019 0,336 1,698 0,044 0,461

Eventos/Muertes

127 84

TABLA 4B

Supervivencia exenta de eventos Supervivencia

% HR P ^acumulado HR P ^acumulado

índice de amplificación de CKS1B (0-100)

32,5 1,68 0,008 0,132 2,12 0,001 0,207

Deleción del cromosoma 13 FISH

25,5 1,74 0,010 0,204 1,83 0,020 0,293

Cariotipo anormal

35,0 1,94 <0,001 0,257 2,33 <0,001 0,383

Beta-2-microglobulina >= 4 mg/L

35,8 1,52 0,033 0,293 1,43 0,140 0,417

Proteína C reactiva >= 4 mg/L

63,4 1,49 0,038 0,312 1,56 0,060 0,443

Albúmina < 3,5 g/dL

16,5 1,69 0,016 0,331 1,73 0,035 0455

Eventos/Muertes

127 84

T 369 de los 421 pacientes con mediciones de la amplificación de CKS1B tenían mediciones completas para este análisis), a) Análisis multivariado de riesgos proporcionales con el índice de amplificación de CKS1B continuo. Un grupo de pacientes con un índice una unidad mayor que otro tiene un riesgo de progresión mayor estimado del 0,9% y un riesgo de muerte mayor del 1,1% (es decir, un aumento de aproximadamente 1% del riesgo con cada aumento de 1 en el índice). El índice de marcado no era significativo en ninguno de los análisis (P> 0,35, HR <1,11, N = 325, eventos EFS = 116, muertes = 77, con 44 sujetos adicionales en los que faltaba el índice de marcado), b) El análisis multivariado de riesgos proporcionales con un corte >= 46 para el índice de amplificación de CKS1B. El

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10

15

20

25

30

Supervivencia exenta de eventos Supervivencia

% HR P r2 acumulado HR P ^acumulado

índice de marcado no era significativo en ninguno de los análisis (P> 0,32, HR <1,12

N = 325).

Los niveles de CKS1B estaban fuertemente correlacionados con la evolución clínica (Figura 5): 25 muertes tuvieron lugar entre 88 pacientes con niveles de expresión en el cuartil 4, en comparación con solo 39 entre los 263 pacientes con niveles en el cuartil 1-3 (tasa de falsos descubrimientos (FDR), 2,5%); esto también era cierto para la supervivencia exenta de eventos (EFS) (34 de 88 en la cohorte del cuartil 4 habían experimentado un evento en comparación con 64 de 263 en el resto). Los niveles de SKP2, el gen asociado de CKS1B, eran uniformemente altos y no se asociaron significativamente con la supervivencia. Además, el análisis FISH en interfase reveló 3 o más coplas de CKS1B en el 46% entre los 197 casos con datos de expresión simultánea de genes. Los niveles de expresión estaban relacionados significativamente con el número de coplas de CKS1B (Figura 6B). A la Inversa, la amplificación aumentaba la frecuencia a medida que los niveles de expresión de CKS1B se incrementaron desde el cuartil 1 al cuartil 4 (Tabla 5). Un examen de la amplificación génica de CKS1B en el contexto de los niveles de expresión de los 70 genes (Tabla 2) reveló, como era de esperar, correlaciones con genes en la banda 1q21 del cromosoma pero lo más importante era que también con genes relacionados con la proliferación celular que no se cartografiaban en 1q21.

Tabla 5.

Tabla 5. Cuartlles de expresión génica de CKS1B y amplificación de CKS1B mediante hibridación in situ fluorescente en interfase en mieloma diagnosticado recientemente.

Expresión de CKS1Bf

AMPLIFICADO N° AMPLIFICADO %

cuartil 1* n = 44

9 20%

cuartil 2 n = 43

12 28%

cuartil 3 n = 51

26 51%

cuartil 4 n = 59

44 75%

Total 197

91 46%

T P <0,0001. La amplificación se define como >= 20% de las células con 3 o >= 4 señales de CKS1B, para la validación junto con la Figura 2c-d. Otras tablas utilizan el índice de amplificación de CKS1B y su punto de corte óptimo. * Asignaciones a cuartiles basadas en 351 pacientes con GEP

Todas las líneas celulares de mieloma expresaban niveles elevados de CKS1B y ASPM, que se cartografiaban en 1q31 y en la lista de 51 genes hiperexpresados relacionados con la evolución en este análisis. El FISH en metafase para CKS1B y ASPM reveló de 3 a 8 copias de CKS1B en 21 líneas celulares, mientras que ASPM se amplificó (de 3 a 6 copias) en solo 16 líneas celulares (datos no mostrados). El FISH en metafase de un mieloma primario (Figura 6A) proporcionó una clara evidencia de la amplificación de CKS1B en ausencia de amplificación de ASPM. Por lo tanto, a pesar de que la hiperexpresión de ambos genes se relacionó con la supervivencia y que ambos genes estaban localizados en la misma banda del cromosoma, CKS1B se amplificó con más frecuencia que ASPM en el mieloma.

A continuación, se examinó la relación entre las anomalías citogenéticas que implicaban al cromosoma 1q y FISH de CKS1B. En 414 casos primarios con ambas anomalías citogenéticas y datos de FISH en interfase para la amplificación CKS1B, se observó una amplificación de CKS1B en 16 de 17 casos (94%) con una ganancia de 1q

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30

35

mediante citogenética, mientras que la amplificación de CKS1B se observó por FISH en interfase en 61 de 112 casos que carecían de una evidencia obvia de anomalías en 1 q, a pesar de la presencia de una citogenética anormal en metafase (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugerían que la amplificación de CKS1B no estaba simplemente reflejando una trisomía en el cromosoma 1.

El clon BAC utilizado para evaluar el número de copias del gen CKS1B también medía el número de copias de PBXIP1 (que se cartografía centromérico a CKS1B) y PB591, LENEP, ZFP67, FLJ32934, ADAM15 y EFNA4 (todos cartografiados teloméricos a CKS1B). Al examinar la relación entre el número de copias génicas y los niveles de expresión de estos genes (Tabla 6), la expresión del ARN estaba correlacionada más fuertemente con el número de copias de ADN en el caso de CKS1B. Es Importante destacar que ninguno de los otros genes que se cartograflaban en este BAC, se encontraba entre los 70 relacionados con la supervivencia corta. Por otra parte, la expresión de los genes candidatos BCL9, MCL1, IL6R y RAB25, que no se cartograflaban en el clon BAC, pero que se cartograflaron en 1q21, no estaba relacionada con la supervivencia en este análisis.

Tabla 6. Relación de la expresión génlca en el cuartll 4 con la amplificación de genes localizados en el cromosoma artificial bacteriano (BAC) usado para medir la amplificación de 1q21

No amplificado Amplificado* (índice de amplificación >= 46). índice de amplificación Rango logarítmico

Símbolo

n/129 (%) n/68 (%) Valor PT r* Valor Pa

PBXIP1

24 (18,6) 28 (41,2) 0,0012 0,29 0,5285

CKS1B

20 (15,5) 39 (57,4) <0,0001 0,50 0,0002

PB591

23 (17,8) 38 (55,9) <0,0001 0,43 0,0873

LENEP

31 (24,0) 18 (26,5) 0,8389 0,03 0,6507

ZFP67

27 (20,9) 29 (42,6) 0,0023 0,34 0,8717

FLJ32934

28 (21,7) 11 (16,2) 0,4606 -0.02 0,6207

ADAM15

23 (17,8) 29 (42,6) 0,0003 0,23 0,2808

EFNA4

26 (20,2) 23 (33,8) 0,0528 0,21 0,3212

* El índice de amplificación de CKS1B a escala 0-100 es una suma ponderada de las proporciones de células clónicas con 3 copias de CKS1B y >= 4 copias de CKS1B, definido por (0,34% * con 3 copias + 0,66% * con >= 4 copias) / 0,66. * Para una prueba de la independencia de la amplificación y la pertenencia al cuarto cuartil (N = 197).

* Correlación entre la expresión de cada gen y el índice de amplificación de CKS1B a escala 0-100. a Prueba de rango logarítmico para la asociación de la pertenencia a Q4 y la supervivencia global (N = 351, 64 muertes).

Por otra parte, la asociación de la amplificación de CKS1B con la supervivencia y la supervivencia exenta de

eventos, fue validada en una cohorte de 224 pacientes que carecían de datos de micromatrices. Los niveles de

amplificación de CKS1B se correlacionaron inversamente con la supervivencia exenta de eventos y la supervivencia global (Figura 6C). También se observaron estos efectos cuando se consideraron los 421 pacientes (supervivencia exenta de eventos, supervivencia global, Fig. 6D).

A continuación, se realizaron análisis multivariados de riesgos proporcionales con los 369 pacientes con datos de la amplificación de CKS1B y todos los datos de los factores de riesgo adicionales (Tabla 4). Los 3 factores de riesgo genético (amplificación de CKS1B, deleción de la banda del cromosoma 13q14 y anomalías del cariotipo en

metafase) conferían todos ellos de forma independiente tanto una supervivencia exenta de eventos como una

supervivencia global, mientras que la hipoalbuminemia era el único de los tres factores de pronóstico convencional que conservaba implicaciones adversas para ambos criterios de valoración examinados. En conjunto, estas 6 variables representaron el 46% y el 33% de la variabilidad en la supervivencia y la supervivencia exenta de eventos, respectivamente, en donde los 3 parámetros convencionales, no genéticos contribuían solamente en un 7,2% y 7,4% adicionales. La amplificación de CKS1B era un indicador independiente de la evolución tanto como un índice de escala de 0 a 100 como con una categoría de dos grupos (Tabla 4A y B) después de ajustar las variables mencionadas anteriormente y el índice de marcado de células plasmáticas.

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Los datos emparejados de la expresión de CKS1B en el momento del diagnóstico y la recaída, disponibles en 32 casos, revelaban una expresión incrementada en el 84% en la recaída (P = 0,0001, Figura 7), que era especialmente importante en pacientes con niveles de expresión en el cuartil 1-3 en el momento del diagnóstico. Los datos del número de copias de CKS1B emparejados en el momento del diagnóstico y en la recaída estaban disponibles para 17 pacientes: de 7 que carecían de amplificación en el momento del diagnóstico, 4 mostraron 3 o más copias en la recaída; de 10 casos con 3 copias en el momento del diagnóstico, 4 habían adquirido 4 copias o más en la recaída; pero 2 casos con 4 o más copias en el momento del diagnóstico no mostraron una amplificación adicional en la recaída.

Además, se examinó la relación entre la expresión de CKS1B, la amplificación de CKS1B y los subgrupos genéticos. La frecuencia de la expresión de CKS1B en el cuartil 4 variaba entre los subgrupos genéticos descritos anteriormente (Fonseca et al., 2004) (Tabla 7A). Con respecto a las translocaciones basadas en la expresión génica, casi dos tercios de los pacientes con activación de MAF o MAFB, un tercio cada uno con activación de FGFR3/MMSET y CCND1, y solo 18% sin estas translocaciones tenían hiperactivación de CKS1B (P <0,0001). Cuando se examinaba en el contexto de cariotipos en metafase, la expresión de CKS1B en el cuartil 4 estaba presente en aproximadamente el 20% de los casos hiperdiploides o normales, es decir, cariotipos poco informativos, mientras que esta característica se observó en casi el 50% de los pacientes hipodiploides y con otras anomalías citogenéticas.

En un análisis multivariado distinto que se ajustaba a los subgrupos genéticos, la expresión de CKS1B en el cuartil 4 siguió siendo un indicador independiente de una evolución adversa (Tabla 7B); la categoría de translocación derivada de la expresión génica en su conjunto, confería una supervivencia exenta de eventos inferior (P = 0,034), pero no una supervivencia global (P = 0,261); lo que era compatible con los datos publicados (Fonseca et al., 2004), la activación de CCND1 afectaba a ambos criterios de valoración favorablemente. Si bien no se ajustaba a las múltiples pruebas de rango logarítmico que identificaban los 70 genes, este análisis sugería que la expresión de CKS1B conservaba un poder explicativo dentro de los subgrupos genéticos pertinentes.

Tabla 7A. Anomalías genéticas y expresión de CKS1B en el cuartil 4

CKS1B

Anomalía

Q4

Categoría T

n/347(%) n (%) Valor P*

Translocación derivada de la expresión

t( 11; 14)

60(17,3) 20 (33,3) <0,0001

t(4; 14)

48(13,8) 17 (35,4)

t( 14; 16) y t(14;20)

14(4,0) 9 (64,3)

Sin pico de translocación

225 (64,8) 41 (18,2)

Cariotipo en metafase

Hiperdiploide

55(15,9) 10 (18,2) 0,0002

No hiperdiploide

48(13,8) 24 (50,0)

Otras anomalías citogenéticas

9 (2,6) 4 (44,4)

Sin anomalías citogenéticas

235 (67,7) 49 (20,9)

Deleción del cromosoma 13

n/334

No

224 (67,1) 47 21,0 0,02

5

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CKS1B

Sí

110 (32,9) 37 33,6

t(4;14)=FGFR3/MMSET, t(14;16)=MAF y t(14;20)=MAFB. La aneuploidía y otras anomalías citogenéticas se determinaron a partir de la citogenética, para las que faltaban 4 observaciones. * Prueba exacta de Fisher, de la Independencia de cada categoría y de pertenencia de CKS1B al cuarto cuartil. Bajo la hipótesis nula, Q4 contiene en promedio 25% de los pacientes dentro de cada nivel, correspondiente a una distribución proporcional a través de Q1-3 y Q4.

Tabla 7B. Análisis multivariado de la expresión de CKS1B en el cuartil 4 y anomalías citogenéticas*

Supervivencia exenta de eventos Supervivencia

HR P* HR P*

CKS1B Q4

1,97 0,003 2,16 0,005

Translocación derivada de la expresión*

t(11; 14)

0,59 0,034 0,82 0,261

t(4; 14)

1,67 1,77

t( 14; 16) y t(14;20)

1,48 1,12

Cariotipo en metafase**

Hiperdiploide

1,75 0,006 1,84 0,013

No hiperdiploide

2,29 2,56

Otras anomalías citogenéticas

2,35 2,71

r2

0,218 0,223

Eventos / Muertes

97 63

* N = 347. De 351 pacientes con datos de expresión, de 4 faltaba la citogenética. T Prueba de proporción de probabilidad parcial para el efecto general de la categoría. * El valor de P para la modificación del efecto de CKS1B sobre EFS mediante subgrupo de translocación es 0,74. ** El valor de P para la modificación del efecto de CKS1B sobre EFS mediante subgrupo de cariotipo es 0,27 y para la supervivencia es 0,17. Para la supervivencia, la proporción de riesgo para CKS1B se estima en 4,2 veces superior en el grupo de no hiperdiploide, en comparación con los que no tienen anomalías, con proporciones de riesgo más o menos iguales para los otros grupos.

Además, el análisis con transferencia Western de proteína nuclear procedente de células plasmáticas de 27 casos de mieloma recién diagnosticado y 7 líneas celulares de mieloma, mostraba una fuerte correlación entre el ARNm de CKS1B y la proteína, pero sin correlación entre la expresión del gen CDKN1B y la expresión del gen CKS1B, niveles de proteína o niveles de proteína CDKN1B. Sin embargo, la proteína CKS1B y los niveles de proteína CDKN1B mostraron una correlación inversa (Figura 8). La causa de discrepancias raras (por ejemplo, proteína CKS1B elevada en ausencia de una expresión génica elevada, no se entendía con claridad. Niveles uniformes de la proteína histona 1A indicaron una carga proteica igual en todas las muestras. Niveles citoplasmáticos y no fosforilado-thr-187- CDKN1B no se alteraron en Usados celulares de mieloma con respecto a la expresión de CKS1B. Los niveles de proteína CDKN1B no se correlacionaron con los niveles de ARNm de SKP2.

Discusión:

Los análisis de la expresión génica global de células plasmáticas muy purificadas procedentes de pacientes recién diagnosticados con mieloma, identificaron 70 genes que se correlacionaban significativamente con una mortalidad relacionada con una enfermedad temprana (mediana de tiempo de seguimiento de 22 meses). Es importante

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destacar que 30% de estos genes se cartografiaron en el cromosoma 1, lo que sugiere un papel importante de este cromosoma en la progresión de la enfermedad mieloma. El aumento de la expresión de los genes 1 q y la reducción de la expresión de los genes 1p eran compatibles con los datos citogenéticos de ganancias de 1q y pérdidas de 1p frecuentes en cariotipos de mieloma. (Nilsson et al., 2003; Gutiérrez et al., 2004). Además, las duplicaciones en tándem y las translocaciones por salto que implicaban a 1q21, causadas por una descondensación de la heterocromatina pericentromérica, son características de la enfermedad en estadio terminal (Sawyer et al., 2005; Sawyeret al., 1998; Le Baccon et al.,2001).

La hiperexpresión/amplificación de CKS1B, cartografiada en 1q21, estaba relacionada con un pronóstico malo en el seguimiento temprano del mieloma recién diagnosticado. El papel de CKS1B en el control de la ubicuitinación mediada por SCFSkp2 y la degradación proteasómica del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina CDKN1B, hacen de él un gen candidato atractivo. Los niveles de proteína CKS1B se correlacionaron con la expresión génica y ambos se correlacionaron inversamente con los niveles de proteína CDKN1B. Investigaciones en S. cerevisiae han demostrado un papel esencial de cks1 para favorecer la mitosis mediante la modulación de una activación transcripcional de CDC20 (Morris et al., 2003). La expresión de CKS1B y CDC20 se correlacionaron fuertemente (r = 0,78; p <0,0001, datos no mostrados), lo que es compatible con que CKS1B favorece la mitosis mediante la regulación de la expresión de CDC20 en células humanas. Por lo tanto, un aumento relacionado con la dosis génica de la expresión de CKS1B podría conducir a una mayor degradación de CDKN1B y también a una activación de CDC20 en el mieloma.

En el contexto de los subgrupos genéticos relevantes para el pronóstico, recientemente reconocidos, la hiperactivaclón de CKS1B era menos frecuente en los casos hiperdiploides y con cariotipos normales; un tercio de los que tenían translocaclones de CCND1 tenían niveles altos de CKS1B\ y hasta dos tercios de las entidades de alto riesgo, MAF, MAFB e hlpodlploldía mostraban hlperactivación de CKS1B (Tabla 7A). Además de conferir un pronóstico malo en los pacientes recién diagnosticados, la hiperexpresión y la amplificación de CKS1B eran comunes en la recaída de pacientes que carecían de estas características en el momento del diagnóstico. Por lo tanto, será Importante determinar si la amplificación de CKS1B surge en todos los subgrupos y, cuando está presente, predice una progresión rápida de la enfermedad y la muerte. Además, dado que la amplificación de 1q21 es una observación frecuente en muchos tumores malignos sólidos y hematológicos avanzados, será importante determinar si la amplificación del gen CKS1B se asocia con una agresividad de la enfermedad en una mayor proporción de cánceres.

Además, la amplificación del gen CKS1B junto con la deleción cromosómica de 13q14 y la citogenética anormal en metafase, representaban casi el 40% de la variabilidad de la supervivencia observada, lo que subraya que el riesgo de mieloma se determina mejor mediante pruebas genéticas moleculares y celulares. Una aplicación rutinaria de estos estudios, realizada sobre una muestra aislada de médula ósea, se recomienda por lo tanto para una estratificación adecuada del paciente en el diseño de un ensayo terapéutico. Además, el impacto sobre la supervivencia de nuevos agentes, tales como bortezomib y talidomida y sus derivados, será profundo si su eficacia clínica también se extiende al mieloma de alto riesgo definido genéticamente, que no ha sido investigado. Puesto que CKS1B parece interaccionar directa o indirectamente con ligasas de ubicuitina y/o el proteasoma para regular puntos de control múltiples del ciclo celular (Pagano y Benmaamar, 2003), nuevas estrategias terapéuticas que se dirigen directamente a CKS1B o a vías relacionadas pueden representar medios nuevos y más específicos para tratar un mieloma de alto riesgo de novo y pueden prevenir su evolución secundaria.

Dado el impacto negativo de la deleción de la banda cromosómica 13q14 sobre la supervivencia, hay que destacar que una expresión reducida de un gen aislado que se cartografía en el cromosoma 13q14, RFP2/LEU5, que se había identificado previamente como un gen supresor tumoral candidato, con homología significativa con BRCA1 (Kapandaze et al., 1998), se asoció significativamente con una supervivencia mala en este análisis, y sugiere que justifica una Investigación a fondo de la función de RFP2 y un análisis de mutaciones en el mieloma.

Además, la desregulación de la ciclina D es un evento común en el cáncer y contribuye a la tumorigénesis favoreciendo la hiperfosforilación de la proteína RB1 y la activación de genes diana E2F importantes para favorecer la transición del punto de control temprano de G1 hasta S del ciclo celular. Un estudio anterior había informado de que una expresión mal regulada de una de las tres ciclinas de tipo D es probable que sea una lesión genética uniflcadora que inicia el mieloma múltiple. Basándose en la información disponible y los resultados presentados en este documento, se contempla un modelo patogénico de múltiples etapas de génesis de mieloma en el que la activación de una ciclina de tipo D es un evento iniciador temprano y la amplificación de CKS1B es un evento de progresión, lo que da como resultado la pérdida de ambos puntos de control temprano y tardío de G1 hasta S del ciclo celular y el establecimiento de una enfermedad agresiva resistente a múltiples fármacos.

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5 Cualquier patente o publicación mencionada en esta memoria descriptiva es indicativa de los niveles de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un método para determinar el pronóstico de un paciente con mieloma múltiple, que comprende determinar el nivel de expresión génica de GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EVI5, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489, LTBP1, TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, OPN3, ASPM, CCT2, UBE2I, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKS1B, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IF116, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENOI, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, R0B01, TCOF1, YWHAZ y MPHOSPH1 en células plasmáticas aisladas del sujeto, y comparar los niveles de expresión con uno o varios controles adecuados y determinar si el paciente tiene un pronóstico malo basándose en la comparación, en donde

   una expresión reducida de GNG10, PNPLA4, KIAA1754, AHCYL1, MCLC, EVI5, AD-020, PARG1, CTBS, FUCA1, RFP2, FLJ20489 o LTBP1, respecto a un control con un pronóstico favorable; y

   una hlperexpreslón de al menos uno entre OPN3, ASPM o CKS1B opcionalmente con hlperexpreslón de TRIP13, AIM2, SELI, SLC19A1, LARS2, CCT2, UBE2I, STK6, FLJ13052, FLJ12525, BIRC5, CKAP1, MGC57827, DKFZp7790175, PFN1, ILF3, IF116, TBRG4, PAPD1, EIF2C2, MGC4308, ENOI, DSG2, EXOSC4, TAGLN2, RUVBL1, ALDOA, CPSF3, MGC15606, LGALS1, RAD18, SNX5, PSMD4, RAN, KIF14, CBX3, TMPO, DKFZP586L0724, WEE1, ROB01, TCOF1, YWHAZ o MPHOSPH1, respecto a un control con un pronóstico favorable, se asocia con un pronóstico malo.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en el que la expresión reducida, la hiperexpreslón o una combinación de las mismas de los genes en el paciente después de un tratamiento del mieloma múltiple predice el riesgo de recaída en el paciente después del tratamiento.
3. 3. El método según la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende una quimioterapia de alta dosis o un trasplante de células madre de la sangre periférica autólogas.
4. 4. El método según la reivindicación 1, en el que el pronóstico es para la supervivencia global.
5. 5. El método según la reivindicación 1, en el que el pronóstico es para la supervivencia exenta de eventos.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en el que la expresión génica se determina mediante una micromatriz de ADN o RT-PCR.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en el que dicha expresión génica se determina a nivel de proteína.
8. 8. El método según la reivindicación 7, en el que la expresión génica se determina mediante un método seleccionado a partir del grupo que consiste en citometría de flujo, inmunohistoquímica y matriz tisular.
9. 9. El método según la reivindicación 1, en el que las células plasmáticas son células plasmáticas enriquecidas con CD138, y los niveles de expresión génica se determinan sobre una micromatriz Affymetrix U133Plus2.0 usando las sondas enumeradas en las Tablas 2A y 2B, en donde se determina el nivel de expresión génica de genes que están hiperexpresados en un sujeto con un pronóstico malo utilizando las sondas de la Tabla 2A y el nivel de expresión génica de los genes que tienen una expresión reducida en un sujeto con un pronóstico malo se determinan usando las sondas de la Tabla 2B.