ES2555628T3 - Electrodos de medición y referencia recubiertos de aptámeros y métodos que los utilizan para la detección de biomarcadores - Google Patents

Abstract

Un dispositivo para identificar la presencia de una molécula o biomarcador objetivo específica mediante la detección de un cambio en una propiedad eléctrica, el dispositivo incluye un sensor (8) de medición que comprende: una estructura (12) de sensor conductora o semiconductora capaz de conjugarse con el biomarcador, dando lugar así a dicho cambio en la propiedad eléctrica, incluyendo el sensor un recubrimiento de aptámero o un recubrimiento de anticuerpo; y un sistema (3) de electrodos para la realización de una señal desde el dispositivo; en el que el dispositivo incluye un tal sensor (9) adicional, de forma sustancialmente idéntica, pero que tiene su estructura (14) de sensor cubierta de tal manera que no conjuga con el biomarcador, con el fin de actuar como una referencia interna.

Description

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DESCRIPCION

Electrodos de medicion y referenda recubiertos de aptameros y metodos que los utilizan para la detection de biomarcadores.

Introduction

Esta invention se relaciona con la deteccion de analitos quimicos, organicos y biologicos. Mas especificamente, la invention se relaciona con la deteccion de biomarcadores y se relaciona con un dispositivo para detectar de forma fiable la presencia de bajas concentraciones de biomarcadores moleculares en muestras de fluido.

Un prometedor campo de aplicacion para tal deteccion es en la identification de enfermedades por medio de moleculas de Biomarcadores. Metodologias existentes para el diagnostico de enfermedades cronicas (por ejemplo la tuberculosis) frecuentemente se basan en pruebas intrincadas de laboratorio en muestras de sangre, orina o tejido tomadas de un paciente. En el caso de ejemplo de la tuberculosis (TB), el uso de una prueba de “frotis esputo” es comun, basandose en la identificacion del bacilo Mycobacterium tuberculosis utilizando un microscopio, o, alternativamente, una prueba de la tuberculina.

Se apreciara que no suele ser posible llevar a cabo este tipo de pruebas intrincadas en las proximidades del paciente, y por lo tanto se requiere una red de laboratorios, equipados con equipos de prueba costosos y personal altamente capacitado. Se requiere una compleja red logistica para el transporte de muestras desde los centros de pruebas para pacientes hasta el lugar de la prueba, y suministrar los resultados a los pacientes despues de un retraso.

Se sabe que las enfermedades cronicas como la tuberculosis son prevalentes en los paises en desarrollo, donde son dificiles de proveer las condiciones descritas previamente para pruebas exitosas. Los equipos de prueba podrian ser demasiado costosos para que sea una red efectiva de laboratorios para el tamano de la poblacion o podria ser la falta de personal calificado para trabajar en los laboratorios. El transporte de las muestras entre los laboratorios y el punto de atencion podria ser dificil, e incluso durante la entrega de un resultado de la prueba de vuelta al punto de atencion, podria resultar dificil encontrar pacientes infectados despues de intervalos de hasta varias semanas, particularmente en una poblacion transitoria.

El acceso insuficiente a las pruebas mas avanzadas significa que los programas de deteccion de la tuberculosis en los paises con enfermedades endemicas son dependientes de metodos anticuados e inexactos como la microscopia de frotis, cultivo solido, radiografia de torax y pruebas cutaneas. En el caso del legado de las pruebas de tuberculosis mencionadas anteriormente, se sabe que la prueba cutanea de la tuberculina tiene la desventaja de ser incapaz de distinguir entre las etapas latentes y activas de tuberculosis. La prueba de frotis de esputo solamente es exacta en la mitad medio a tres cuartos de los casos, lo que requiere un gran numero de organismos en la muestra y un operador experto de microscopio capaz de distinguir entre M. tuberculosis y otras micobacterias.

Los biomarcadores moleculares ofrecen un nuevo metodo atractivo de deteccion de la enfermedad, en comparacion con las tecnicas conocidas que involucran pruebas de laboratorio centralizado. El campo en rapido avance de la proteomica demuestra que muchas enfermedades se pueden diferenciar por las pruebas de la presencia de biomarcadores moleculares en fluidos corporales tales como plasma sanguineo, orina o saliva.

Un biomarcador relevante para la deteccion de la tuberculosis es la neopterina, un producto catabolico sintetizado por los macrofagos (celulas blancas de la sangre) tras la estimulacion por la molecula de serialization gamma- interferon. La presencia de neopterina es conocida para indicar una respuesta inmune inflamatoria, y una enfermedad que causa la production de neopterina es la tuberculosis. Otros marcadores de activation de macrofagos son conocidos, tales como la procalcitonina, proteina C reactiva, molecula 1 de adhesion intercelular soluble, receptor del activador de plasminogeno uroquinasa soluble, y Monocito CDIIc66.

Otro biomarcador relevante para la deteccion de la tuberculosis es la trombina, un factor de coagulation que actua sobre el fibrinogeno para producir fibrina, una proteina fibrosa involucrada en la coagulacion de la sangre, que tambien aparece en niveles aumentados en pacientes que sufren de tuberculosis. Se apreciara que existe un amplio y creciente rango de biomarcadores moleculares utiles para el diagnostico de enfermedades, y que los dos biomarcadores mencionados anteriormente son ejemplos. Otros ejemplos son la Lisozima y la dinucleotido Nicotinamida adenina (NAD).

Tambien se apreciara que la expresion de diferentes biomarcadores puede variar en funcion de la etapa de la enfermedad. Por ejemplo, los niveles de neopterina se incrementan en el diagnostico con base en la extension de la enfermedad, y disminuyen durante y despues del tratamiento. Un incremento subsecuente en los niveles de neopterina esta asociado con recaidas. Las mediciones longitudinales cuantitativas consistentes son, por lo tanto, de gran uso diagnostico.

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Otros biomarcadores pueden ser identificados en los marcadores microbianos en el esputo, marcadores microbianos en la orina funcion de celulas T especlficas en tuberculosis, y otros marcadores de activacion de macrofagos. Las indicaciones de riesgo de reactivacion, y la erradicacion de la infeccion latente de la tuberculosis, tambien se pueden predecir utilizando por ejemplo el interferon gamma, o neopterina. Los biomarcadores se pueden usar para juzgar la eficacia de la vacuna, por ejemplo monitorizando las celulas T polifuncionales.

La especificidad de la prueba incrementada y el valor predictivo se pueden lograr mediante la combinacion de un conjunto de biomarcadores no especlficos relacionados con la tuberculosis mediante la medicion de multiples parametros resultantes de la proteomica (el estudio a gran escala de las protelnas), la metabolomica (el estudio de huellas qulmicas que los procesos celulares especlficos dejan atras) y transcriptomica (el estudio de los ARNm utilizado en la transcripcion de genes).

Una forma de la identificacion de biomarcadores es mediante el uso de moleculas similares al ADN, como se muestra por ejemplo en la WO 2007/001401 (Dupont/Boussard et al.), donde se utilizan oligonucleotidos sobre nanotubos de carbono. Los aptameros son oligonucleotidos sinteticos (un pollmero corto de acidos nucleicos), ligandos o peptidos que se pueden aislar o creados usando por ejemplo el proceso SELEX contra objetivos tan diversos como pequenas moleculas organicas, toxinas, protelnas bacterianas y virales, celulas infectadas por virus, celulas de cancer y organismos patogenicos. Se han definido las formas, y sitios funcionales de enlace en sus respectivos objetivos con afinidades y especificidades que frecuentemente superan los de los reactivos de anticuerpos mucho mas ampliamente desarrollados. Los aptameros de acido nucleico son facilmente aislados por un proceso totalmente in vitro semiautomatizado, eliminando la necesidad de experimentos con animales. Ademas la caracterizacion les permite que se minimicen de tal manera que se pueden hacer en la escala de gramo por rutas sinteticas qulmicas. Se concatenan facilmente con otras secuencias de acidos nucleicos que permiten crear especies bifuncionales. La funcionalizacion qulmica de los aptameros para permitir inmovilizacion y deteccion directa tambien es trivial. Es posible sintetizar un aptamero funcionalizado para conjugar con uno de los biomarcadores que indican enfermedad mencionados anteriormente, tales como trombina o neopterina.

Con el fin de exponer los aptameros a una solucion que contenga posiblemente moleculas objetivo, necesitan estar enlazados a o "montados en" un sustrato adecuado. Para detectar un evento de enlazamiento, es ventajoso si el sustrato es conductor o semiconductor, y si tiene una gran area de superficie especlfica. Un sustrato prometedor es nanotubos de carbono.

Los nanotubos de carbono son bien conocidos alotropos de carbono con una estructura cillndrica. El aptamero puede estar unido a los nanotubos utilizando ya sea metodologlas covalentes o no covalentes. Por ejemplo, es posible unir una estructura qulmica en forma de "pie" hasta el extremo del biomarcador no especlfico de la molecula de aptamero usando un compuesto tal como antraceno, que luego hara contacto con la superficie de un nanotubo de carbono, recubriendolo con una capa de aptamero de biomarcador especlfico. En particular, cuando los nanotubos de carbono tienen propiedades semiconductoras, cuando un nanotubo de carbono es recubierto con un aptamero y luego expuesto al analito al que el aptamero revestido se enlaza, sera detectable por medios electronicos el gran numero de eventos de enlazamiento y el cambio en la conductividad del nanoalambre o nanotubo de carbono recubierto con aptamero, por ejemplo mediante la deteccion de un cambio en la conductividad, capacitancia, impedancia, o la inductancia, potencialmente bajo corriente alterna de alta frecuencia. Tales eventos de enlazamiento de aptameros tambien pueden afectar la conductividad de los nanotubos metalicos.

Tales nanotubos de carbono recubiertos con aptamero tal como se describe en el parrafo anterior se pueden aplicar a traves de la compuerta de un Transistor de Efecto de Campo, en efecto, que forma el canal. Un FET de nanotubo de carbono (CNT-FET) con la fuente, drenaje y contacto de compuerta posterior, con el dominio de canal hecho de cadenas de nanotubos de carbono recubiertos con aptameros, se discute en la Patente de Estados Unidos N° 7.854.826 (So et al./ Korea Research Institute of Chemical Technology).

Aunque tales detectores son prometedores, son propensos a la variacion en su precision y sensibilidad. Esto es debido a la variacion individual, la variacion en la concentracion de electrolitos, oscilacion de temperatura, geometrla y otros factores.

Se apreciara que las caracterlsticas qulmicas de los fluidos corporales que contienen biomarcadores de interes variaran; entre individuos diferentes, se encontraron diferentes concentraciones de electrolitos y otras moleculas tales como protelnas y enzimas en fluidos corporales. Sin un metodo de control para estos efectos espurios, que distinguen la presencia de biomarcadores es probable que sean poco fiables.

Es deseable aumentar la fiabilidad de los sensores de este tipo, y en particular proveer un detector biomarcador que pueda ser utilizado en el diflcil contexto descrito previamente para proveer una deteccion rapida y fiable de la enfermedad de una manera no costosa, y de una manera que no requiera la presencia de personal de laboratorio experimentado.

Resumen de la invencion

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De acuerdo con la invencion, se provee un dispositivo como se reivindica en la reivindicacion 1 y un metodo como se reivindica en la reivindicacion 15.

La invencion utiliza un sistema de referencia para reducir la probabilidad de eventos de deteccion falsa de biomarcadores. Las realizaciones de la invencion usan una base o soporte conductor o semiconductor recubierto con aptamero, tal como un conjunto o deposito de nanotubos de carbono, o una estructura similar a una lamina tal como grafeno, o ADN semiconductor u otros "nanocables" para formar una estructura de sensor, y una segunda estructura de sensor que es esencialmente identica sino que es "cubierta", es decir, se le impide al aptamero el reconocimiento de las moleculas objetivo, por ejemplo, por estar prerecubierto con o conjugado o enlazado a las moleculas objetivo, o por estar conjugado con una cadena de ADN complementaria, o por ser una version mutante que difiere en unas pocas bases. Ejemplos de conjugacion pueden, entre otros, incluyen el uso de foto- entrecruzamiento estandar de la secuencia de aptamero a su objetivo, o la retencion de un oligo complementario de proteccion en la cadena de aptamero; tambien se puede utilizar una variante de secuencia de aptamero que impide el enlazamiento. En presencia de moleculas objetivo o biomarcadores de diagnostico que se enlazan al aptamero, los electrones se transfieren y se presenta un cambio en la conductividad del soporte. Se puede decir que la base semiconductora actua como el canal de un Transistor de Efecto de Campo o del CNT-FET. Este cambio puede ser detectado por un circuito electronico adecuado, que puede estar integrado en el dispositivo, conectado al sistema de electrodos. La lectura se toma luego comparando el sensor "en vivo" con el sensor preconjugado (referencia) del sensor. Puesto que los dos sensores de la pareja estan en entornos moleculares identicos, esto es, habitan el mismo espacio de medicion, otras variaciones, por ejemplo, que resultan de electrolitos en las muestras de fluido se cancelan.

Los aptameros son una opcion preferida como una forma especlfica y razonablemente barata de detectar moleculas objetivo, pero se preven otras moleculas o estructuras receptivas a biomarcadores, incluso anticuerpos o aptameros de peptidos, por ejemplo, siempre que una senal electrica suficiente resulte del proceso de enlazamiento.

Frecuentemente se desea medir simultaneamente varios biomarcadores, puesto que tal conjunto de biomarcadores puede indicar con mas precision la presencia de una condition cronica tal como la tuberculosis; en algunas realizaciones, por lo tanto, el detector tiene varios de tales pares de sensores y puede ser facilmente utilizado para detectar biomarcadores multiples simultaneamente y de forma fiable.

Mas especlficamente, cada uno de los detectores receptivos a biomarcadores tambien se colocaran junto a, por ejemplo, un detector saturado de biomarcador. Tales detectores de referencia seran identicos a los detectores de biomarcadores, con la importante diferencia de que los electrodos de referencia usaran aptameros que ya se han enlazado a su objetivo, por ejemplo por foto-entrecruzamiento, el uso de una variante de secuencia no enlazante o por la retencion de una cadena complementaria de base emparejada, de tal manera que esten “cubiertos” para asegurarse de que no reaccionan durante una prueba de diagnostico. Es decir, el aptamero esta preenlazado con la molecula objetivo o especies biologicas. Aparte de esta diferencia, el detector de referencia es analizado para un cambio en la conductividad, capacitancia, etc., de la misma manera como para el detector biomarcador activo. El proposito de esto es que los multiples detectores de biomarcadores, por ejemplo en numero de cinco, cada uno tiene ahora una referencia interna de un evento positivo de deteccion del analito, sometido a los mismos efectos espurios que afectan a todo el detector. De este modo, se provee una comparacion de "control" con el fin de permitir efectos espurios de primer orden debido a la variabilidad entre individuos o condiciones de muestreo a ser eliminadas y por lo tanto calibran la deteccion de cada biomarcador.

Existen diversos metodos para soportes de recubrimiento con aptameros. Como una alternativa al caso con un nanotubo de carbono (o grafeno) recubierto con aptamero especlfico de biomarcador, es posible, primero, para funcionalizar una cadena de ADN - usada puramente como soporte - con aptamero y, luego, para enrollar la cadena de ADN funcionalizada alrededor de un sustrato de nanotubos de carbono (o la cadena pueden enrollarse primero y luego funcionalizarse). El aptamero especlfico de biomarcador y el aptamero cubierto se pueden unir a los grupos de ADN utilizando la qulmica clic. Otra posibilidad es unir el aptamero a los nanotubos a traves de un enlace de estreptavidinbiotina, donde uno de estos elementos esta funcionalizado en el aptamero y el otro elemento esta unido a los nanotubos a traves de un enlace covalente o no covalente. Alternativamente, un nano alambre de ADN metalizado podrla estar recubierto directamente con aptamero y aptamero cubierto. Otra alternativa podrla utilizar pollmero conductor recubierto con el aptamero o aptamero cubierto.

Como se menciono anteriormente, el enlazamiento de los biomarcadores objetivo a sus aptameros especlficos causara un cambio pequeno pero detectable en las caracterlsticas electricas a traves de los electrodos. Si es necesario, esta senal puede ser amplificada haciendo de los electrodos terminales de fuente-drenaje de un CNT- FET, por ejemplo. Despues de una muestra se ha aplicado a los multiples detectores especlficos de biomarcadores y sus referencias de acompanamiento, los CNT-FET son interrogados para determinar el cambio en sus caracterlsticas electricas. Tales mediciones podrlan tomar la forma de una prueba de conductividad simple con una fuente DC, o mas complicado la determination de la impedancia en ciertas frecuencias o sobre un rango de frecuencias. La misma prueba se aplicarla a los multiples detectores de referencia, permitiendo que los efectos de fondo espurios presentes en el detector "vivo" sean retirados de la medicion de concentration de biomarcador genuino.

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En un tipo de construccion, la fuente de oro y contactos de drenaje de un CNT-FET estan dispuestos como un patron de grabado al aguafuerte interdigitado sobre un sustrato de silicio, con los nanotubos de carbono recubiertos con aptamero establecidos sobre la parte superior para formar una especie de canal o puente semiconductor. Cuando se utilizan nanotubos de carbono que tienen una mezcla de realizacion de naturalezas, es preferible que la separacion del patron interdigitado sea mayor que la longitud de un nanotubo individual para prevenir que los electrodos sean puestos en cortocircuito por un nanotubo metalico que actue como una impureza.

Una disposicion de deteccion alternativa utiliza un sustrato de pollmero, con pares de electrodos de oro dispuestos en un patron de parrilla y los nanotubos de carbono recubiertos con aptamero establecidos sobre el patron interdigitado. Muchas variaciones son posibles, como es conocido; en cada caso, se utilizan pares de estructuras de sensor, con circuitos apropiados, para dar un resultado referenciado.

Para realizar el proceso de medicion y obtener las mediciones discutidas anteriormente de forma automatica, se proveen los circuitos a interfaz con el conjunto de CNT-FET, incluyendo, por ejemplo interruptores, fuentes de senal, amplificadores, convertidores de analogo a digital y microprocesadores.

Para asegurar de que hay suficiente fluido biologico de prueba, por ejemplo esputo, orina, sangre, etc., presentes en la cabeza del sensor antes de una medicion, se provee un circuito logico para proveer una capacidad incorporada de auto-prueba. Tras la activacion inicial, se registra el cambio de conductividad del electrodo de referencia de cada detector y se compara con un rango conocido, para asegurar que se ha aplicado fluido suficiente al detector, y que las mediciones subsecuentes seran validas. El circuito realiza una medicion de la conductividad en seco en todas las pistas para verificar la integridad del sistema. Despues de la aplicacion de, por ejemplo, saliva u otro fluido biologico al detector, se verifica el cambio en la conductividad para asegurar que esta por encima de un nivel predefinido. La amplificacion de los circuitos se utilizara para asegurar que los rangos dinamicos de las senales electricas son apropiados, para cada elemento sensor. Para algunos fluidos, el pretratamiento en un regulador adecuado serla seguido por la filtracion selectiva, por ejemplo, para eliminar los contaminantes celulares.

Con el fin de satisfacer la necesidad declarada de un sensor de diagnostico en el punto de atencion, no costoso, rapido, que pueda ser operado por personal mlnimamente entrenado, toda la disposicion de sustrato de deteccion y los circuitos discutidos previamente, puede ser montada dentro de un cuerpo moldeado que se parece, por ejemplo, a tarjetas de memoria de camara digital conocidas. El conjunto de sensores esta contenido dentro de una depresion poco profunda para permitir que muestras de fluido corporal se pongan en contacto con el conjunto de cNT-FET revestido con aptamero. Una pellcula de sellado desmontable cubre el area activa del detector para evitar el ingreso de contaminantes. Se preve que un lado o extremo del moldeado de cuerpo conectara los circuitos de deteccion a un dispositivo de mano movil, como un telefono inteligente, usando uno de los muchos conectores de datos y protocolos disponibles. En otra realizacion el sensor de moldeo es insertado en una solucion como una “barra de inmersion" para medir otros fluidos corporales tales como la orina. Debido al pequeno tamano del detector, el soporte mecanico provisto por el receptaculo, debe sostener la tarjeta de deteccion de una manera estable.

Se apreciara que los resultados generados por el detector se pueden descargar en un telefono inteligente u otro dispositivo de mano, para la recoleccion, visualizacion o analisis. Adicionalmente, los datos pueden ser enviados a traves de cualquier equipo de transmision de radio de productos accesibles y la pila de TCP/IP contenida dentro del telefono inteligente a un servidor centralizado.

Breve resumen de los dibujos

Para una mejor comprension de la invention, y para mostrar como puede ser puesta en efecto, se hara ahora referencia, a manera de ejemplo, a los dibujos acompanantes en los cuales:

La Figura 1 es una vista lateral de una realizacion que tiene un cuerpo moldeado que contiene el sustrato, los sensores y la pellcula sellable;

La Figura 2 es una vista plana de la disposicion de una disposicion de electrodos de referencia y del sensor;

La Figura 3 es una vista plana de una realizacion con cinco pares de electrodos de sensores de referencia que extienden sobre un sustrato;

La Figura 4 provee vistas esquematicas de extremo y planas de la manera en que un aptamero de ejemplo se une a un esqueleto de nanotubos de carbono;

La figura 5 muestra tres realizaciones diferentes de disposicion de aptamero-biomarcador en un esqueleto del ADN;

La Figura 6 muestra las diferentes disposiciones de biomarcador cubierto y descubierto como se aplica en el esqueleto del ADN de los electrodos de referencia y del sensor;

La Figura 7 muestra una secuencia de pasos que utilizan qulmica clic para formar los CNT funcionalizados;

Figura 8 muestra un sistema de control conectado a los sensores, para procesar adicionalmente los resultados y trasmitir la informacion hacia y desde los medios de procesamiento;

La Figura 9 muestra microscopia de fuerza atomica de nanotubos de carbono de pared sencilla que han sido dispersados usando esperma de arenque de una sola cadena y luego secados sobre un sustrato.

5 La Figura 10a muestra un esquema de los electrodos interdigitados utilizados para medir las propiedades electricas de las redes de nanotubos, incluyendo aquellos adecuadamente funcionalizados para detectar el analito objetivo.

La Figura 11 muestra la corriente del electrodo como funcion del voltaje de la compuerta para redes de nanotubos formados por la deposicion de nanotubos envueltos en ADN de esperma de arenque.

La Figura 12 muestra las caracteristicas electricas de un dispositivo de nanotubo hecho por la deposicion del 10 complejo nanotubo-(GT)10.

La Figura 13 muestra la corriente del dispositivo (eje derecho, linea oscura) y la corriente absoluta del dispositivo (eje izquierdo, linea clara) como una funcion del voltaje de la compuerta para dispositivos "protegidos" y "sin proteccion", donde el aptamero es contra la lisozima;

La Figura 14 muestra las caracteristicas del dispositivo una realizacion con aptamero de trombina (GT)10 15 desprotegido;

La Figura 15 muestra una caracteristica para una instalacion como en la Figura 14 pero con el grupo protector dejado en su lugar;

La Figura 16A muestra los resultados del electrodo de referencia como fue hecho (nanotubos funcionalizados por aptamero de trombina (GT)10 protegida), mientras que la Figura 16b muestra el resultado desprotegido;

20 Figura 17a muestra los resultados para el electrodo de referencia como se hicieron (nanotubos funcionalizados mediante aptamero de trombina (GT)10 protegida) y

La Figura 17b muestra el equivalente desprotegido.

Description detallada

Un dispositivo 50 de detection de biomarcadores que incorpora la invention esta montado dentro de un moldeado 1 25 de cuerpo como se ilustra esquematicamente en la Figura 1. Un sustrato 2 esta unido al interior del moldeado 1 de cuerpo, y una pluralidad de contactos o electrodos 3, 4 planares, se aplica al lado superior del sustrato para formar sensores 8, 9. Un canal 6 poco profundo puede estar formado para rodear las areas de contacto del sustrato, para dirigir fluidos a las areas de contacto en el inicio de una prueba, y para permitir que los fluidos sean retenidos en las areas de contacto durante el proceso de deteccion, en circunstancias donde la cantidad de Kquido es pequena. Una 30 tira 7 de sellado extraible de polimero se une a la superficie superior del moldeado de cuerpo con un adhesivo debil, para proveer un sello de barrera contra el aire y la humedad con el fin de evitar que las areas de contacto del sustrato sean expuestas prematuramente a contaminantes o sean degradados por oxidation o hidrolisis.

La disposition de los electrodos sobre el sustrato 2 se muestra con mas detalle en la vista plana de la Figura 2. El substrato 2 puede consistir de silicio, preferiblemente con 300 nm de espesor de revestimiento de dioxido de silicio. 35 Para cada sensor 8, 9, los electrodos 3, 4 son formados depositando y grabando alternativamente para dejar contactos interdigitados paralelos formados a partir de una capa de adhesion de cromo de 20 nm de espesor debajo de una capa de oro de 100 nm de espesor. Tipicamente, las pistas lineales estan espaciadas 10-50 pm entre si y estan conectadas de forma alternativa a los contactos 30, 31 de electrodos. Estos contactos podrian ser etiquetados como "fuente" y "drenaje", aunque, estrictamente, en la mayoria de las realizaciones, el dispositivo no es realmente 40 un FET. Los electrodos interdigitados se alternan en tal vez veinte o treinta pares (el dibujo es esquematico y muestra solamente unos pocos pares), dando un ancho total de tal vez 300 pm, y una altura comparable (en el dibujo). Los terminales 10, 11 recolectan la corriente de los electrodos 3, 4 interdigitados, respectivamente. Los pares de electrodos de cada sensor pueden ser colocados en estrecha proximidad entre si, por ejemplo 500-1000 pm.

45 Una estructura 12 de sensor conductor o semiconductor capaz de conjugarse con un biomarcador objetivo de interes esta recubierto sobre el primero del par de contactos 3, 4 interdigitados, formando lo que se conoce como el sensor de "medicion". La estructura 14 del sensor adicional de naturaleza sustancialmente identica, pero ya conjugado con el biomarcador dirigido por el sensor de medicion se aplica al segundo del par de contactos 9 interdigitados, formando lo que se conoce como el sensor de referencia. Cuando estan en interfaz con el circuito electronico 50 apropiado que se describira subsecuentemente, juntos el par de sensores de medicion y de referencia forman un par 16 de deteccion para un biomarcador de interes.

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La estructura 12 del sensor capaz de conjugarse con el biomarcador objetivo comprende nanotubos de carbono funcionalizados con un aptamero especlfico creado recubriendo el sustrato 2 y por lo tanto los contactos 3, 4 interdigitados con una capa de nanotubos de carbono. El aptamero puede ser una longitud corta (digamos aproximadamente 40 nucleotidos) de ADN o ARN, o un fragmento peptldico, por ejemplo. En el caso en el que el sustrato 2 sea silicio, se aplica una capa aislante delgada a los electrodos y se forma un "FET" de nanotubos de carbono con cierre posterior que tiene terminales que se pueden marcar fuente y drenaje, un canal formado por los nanotubos de carbono, y una compuerta formada por una capa dopada en el silicio. Si la amplificacion por cierre posterior no es necesaria, no tiene que estar presente la compuerta.

En realizaciones donde se utiliza una red de nanotubos semiconductores como la estructura de sensor, el espaciado de los electrodos deberla estar disenado para asegurar que, incluso si una muestra de nanotubos semiconductores contiene impurezas de nanotubos conductores, estadlsticamente es poco probable que haya un camino de nanotubos conductores puenteando el electrodo, causando un cortocircuito en el sensor. Los cNt pueden ser del orden de 1-10 pm de largo si las pistas estan separadas 10-50 pm. Su estructura y funcion se describen mas adelante con mas detalle.

Los espacios definidos por los electrodos intercalados en efecto forman un canal muy amplio entre dos electrodos. Las senales recolectadas de los electrodos de cada par intercalado alimentan a los circuitos adecuados (no mostrados). Aqul la senal desde el sensor 9 cubierto se compara con el sensor 8 expuesto o de "medicion". Considerando que se puede esperar que el nivel absoluto de la senal se desplace o varle con las condiciones, la diferencia (o relacion, u otra comparacion) da una lectura fiable. Puesto que los dos sensores estan muy juntos, se ven afectados por igual por su entorno.

Para ciertas aplicaciones, frecuentemente es necesario detectar al mismo tiempo un conjunto de biomarcadores, frecuentemente denominados como una biofirma o "huella digital", por ejemplo de una enfermedad, para mejorar la probabilidad de un evento de deteccion correcta. La Figura 3 ilustra una vista plana de un detector biomarcador similar al de la Figura 2 pero que tiene una disposicion lineal de cinco pares de deteccion de cada uno con su sensor 8 de medicion y 9 de referencia sobre un sustrato 2 comun 2, con sus electrodos intercalados que se muestran muy esquematicamente; se apreciara que un numero mayor o menor de pares de deteccion podrla ser desplegado de acuerdo con el conjunto preciso de los biomarcadores de interes, el cual variara con la aplicacion deseada del dispositivo. El conjunto lineal de pares de deteccion aqul coincide con una depresion 6a poco profunda extendida, para asegurar que las muestras de fluido pueden estar contenidas correctamente sobre la disposicion de pares de deteccion.

En general, los biomarcadores son indicativos de, pero no 100% especlficos para, por ejemplo, una enfermedad. Sin embargo, mediante la obtencion de lecturas cuantitativas de un conjunto adecuado de biomarcadores se puede lograr un buen grado de confianza. Por ejemplo, la TB se pueden identificar usando cuatro biomarcadores: Neopterina, que indica los procesos inflamatorios y de estres oxidativo en las celulas; La Procalcitonina, que distingue las enfermedades bacterianas en comparacion con las enfermedades virales; Lipoarabinomanano (LAM), que tiende a distinguir la TB latente vs. activa, y la protelna C reactiva (CRP), que tiende de nuevo a estar asociada con procesos inflamatorios y estres oxidativo. Vease Tuberculosis 4, Biomarkers and diagnostics for tuberculosis: progress, needs, and translation into practice; Robert S Wallis, Madhukar Pai, Dick Menzies, T Mark Doherty, Gerhard Walzl, Mark D Perkins, Alimuddin Zumlat. Published Online May 19, 2010; DOI:10.1016/S0140- 6736(10)60359-5: http://
www.mossmanassociates.com/ TB%20Biomarker%20report%20Lancet_ 2010.pdf

Un dispositivo tal como el mostrado en la Figura 3 puede presentar un resultado en una sola lectura.

Como alternativa a este sistema de medicion individual y referencia multiple, sistemas de referencia multiples pueden ser tomados como plantilla en un patron regular para una medida sencilla y el resultado de referencia.

Se pueden utilizar disposiciones de pistas alternativas para el area de deteccion cuando se fabrica sobre un sustrato de plastico, con el area de contacto formado a partir de un numero de pares de pistas paralelas dispuestas en un patron de rejilla. En tal realizacion, los contactos pueden formarse a partir de oro depositado, plata o carbono aplicado por un proceso de impresion de chorro de tinta. Las pistas intercaladas pueden ser rectas o enroscada o enrollada.

Para la manufactura del FET con cierre posterior o cerrado en la parte superior que forma la estructura 12 de sensor semiconductor, el dominio del canal entre los contactos de fuente y drenaje (espaciados aproximadamente 10 pm de separacion) debe estar revestido con un material de canal funcionalizado, preferiblemente los CNT, en particular, los CNT SW (de pared sencilla), y preferiblemente predominantemente semiconductores, aunque estos son mas costosos. Una manera sencilla de lograr este fin es recubrir los electrodos con una suspension solvente de los SWCNT.

En una tecnica de ejemplo los SWCNT se modifican con p-ciclodextrina (p-CD) que no requiere calentamiento prolongado, filtracion, y lavado de los CNT, que pueden causar danos. Los SWCNT se dispersan en una solucion DE p-CD con sonicacion, tlpicamente dando como resultado una suspension de 2 mg/mL. Una allcuota de la

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suspension se aplica entonces al area de contacto en la depresion 6 del sustrato 2. Para asegurarse de que la alineacion de los SWCNT 12, 14 funcionalizados a traves de los contactos 3, 4 intercalados sea lo mas uniforme posible, es posible aplicar un campo electrico a traves del area de contacto del sustrato 2 a medida que evapora allcuotas, pero el requerimiento principal es que los nanotubos se distribuyan de manera uniforme.

Otra tecnica de ejemplo para depositar con precision los nanotubos de carbono entre los electrodos basados en dielectroforesis se da en Suhiro et al. ("Fabrication of a carbon-nanotube-based gas sensor using dielectrophoresis and its application for ammonia detection by impedance spectroscopy", J. Phys D: Appl. Phys. 36 (2003) L109-L114). En este metodo, los CNT de pared multiple en suspension en etanol son sometidos a sonicacion. Un conjunto de electrodos de cromo intercalados fabricados sobre un sustrato de vidrio esta rodeado por un espaciador de goma de silicona para formar una camara sellada. La suspension de nanotubos de carbono se hace circular continuamente sobre los electrodos, los cuales son excitados simultaneamente por un voltaje de 100 kHz, 10 V pk-pk AC, lo que da como resultado los nanotubos de carbono de pared multiple puentenando las brechas entre los dedos de los electrodos. Se apreciara que se podrlan emplear otros metodos de deposicion de nanotubos de carbono entre los electrodos.

Tras la aplicacion de los nanotubos 12, 14 de carbono funcionalizados al area de contacto, se les somete a un tratamiento de "pegilacion". La pegilacion es conocida por los expertos en la tecnica como el proceso por el cual las cadenas de polietilen glicol (PEG) estan unidas a las protelnas, aumentando as! la masa molecular de las protelnas. Sin embargo, en esta solicitud, el polietilen glicol se deposita directamente sobre la superficie de los nanotubos de carbono, recubriendo las areas del nanotubo que no se han funcionalizado con un aptamero o una cadena de ADN. La intencion de este tratamiento es asegurar que las protelnas no especlficas para el aptamero funcionalizado no se pueden enlazar a cualquier parte no funcionalizada del sensor, introduciendo as! efectos espurios adicionales en la medicion. Esto tiene el efecto de mejorar la sensibilidad de un nanotubo funcionalizado cuando se expone a una muestra de fluido que contiene una diversidad de especies de protelnas. El sustrato 1 y/ o la depresion 6 tambien pueden ser tratados para pegilar sus superficies para evitar la absorcion de especies que puedan interferir con el proceso de medicion. Un tratamiento tlpico de PEG deja una capa entre 2 y 3 nm de espesor sobre la superficie del sensor. El proceso puede llevarse a cabo ya sea en la superficie del sustrato despues de la deposicion de nanotubos, o en solucion antes de que los nanotubos esten recubiertos sobre los contactos.

Se apreciara que los detalles de la fabricacion de los electrodos de medicion 19 y de referencia 20 de un par 16 de deteccion son identicos, con la excepcion del recubrimiento de SWCNT aplicado a los contactos. Por lo tanto la fabricacion de los electrodos de medicion y de referencia podrla tener lugar simultaneamente hasta la ultima etapa de recubrimiento de SWCNT. En este punto, se aplican dos soluciones separadas de los SWCNT, la primera solucion a los electrodos del sensor 19 de medicion, con el sensor de referencia enmascarado, y la segunda solucion al sensor 20 de referencia, con el sensor de medicion enmascarado. Las soluciones se diferencian en que los nanotubos de carbono en suspension en la primera solucion aplicada al electrodo 19 de medicion son aptameros funcionalizados capaces de enlazarse a un biomarcador objetivo. Los nanotubos de carbono contenidos en la segunda solucion aplicada al electrodo de referencia son funcionalizado con un aptamero que ya esta saturado (pre- enlazado, conjugado o cubierto) con el biomarcador objetivo.

En funcionamiento, un dispositivo se prepara con una estructura 14 de sensor cubierto en un area del sustrato con electrodos 4 y una estructura 12 de sensor descubierta o desnuda en la otra area de sustrato, con electrodos 3. El dispositivo esta expuesto a una solucion que va a ser medida, por inmersion o aplicacion de una gota de analito, tal como un fluido. Electrolitos y otros contenidos pueden causar un cambio de conductividad de las estructuras 12, 14 de los sensores, pero esto es el mismo para ambas. Solamente los eventos de enlazamiento causan un cambio diferencial. La serial resultante es analizada por la circuiterla adecuada del dispositivo. Se puede ejecutar una prueba durante un tiempo determinado, tal como 30 segundos, tomando una lectura automaticamente al final, con el fin de dar una medida de concentracion en el electrolito.

Tambien se podrla detectar el analito objetivo (molecula causante) en sistemas de aire o no biologicos si el analito es VX o similar.

Un evento de deteccion tlpica consistira en medir el dopaje tales como agujero o transferencia de electrones que se produce en el evento de enlazamiento entre el aptamero inmovilizado sobre la superficie del nanotubo de carbono, y el biomarcador objetivo. Un gran numero de tales eventos de dopaje (por ejemplo, transferencias de electrones) causado por los eventos de enlazamiento modulara el flujo de corriente de la fuente-drenaje en el "CNT-FET", un efecto que puede ser influenciado ademas por el voltaje aplicado a la compuerta.

El dispositivo tambien puede actuar como un sensor de promedio de tiempo en la forma de un monitor de radiacion; es decir, que permanece en su lugar y mantiene la conjugacion a los objetivos disponibles, y solamente despliega una serial si la conjugacion promedio de tiempo, que puede estar relacionada con la concentracion, esta por encima de un cierto valor, o se integra en el tiempo para medir una exposicion mayor que un umbral.

Como se menciono en relacion con la Figura 3 y previamente en la descripcion, un dispositivo con un conjunto de pares de sensores detectara un conjunto de biomarcadores, con cada biomarcador correspondiente a un par de

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deteccion. Por ejemplo, un detector capaz de detectar cinco biomarcadores consistira de un sustrato 2 con una fila

26 de cinco pares de deteccion. Para un dispositivo dirigido cinco biomarcadores, se aplicarlan diez recubrimientos de SWCNT separados, la primera serie de cinco recubrimientos que representa los SWCNT “vivos” recubiertos aplicadas a los electrodos de medicion, y el segundo conjunto de recubrimientos relacionados con los SWCNT recubiertos de aptameros cubiertos aplicados al electrodo de referencia.

Como se menciono anteriormente, con el fin de detectar moleculas especlficas de las bases de nanotubos de carbono, primero necesitan ser "funcionalizado". Una forma de hacer esto es para los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) que van a ser funcionalizados directamente mediante la union no covalente de aptameros especlficos de biomarcadores a la pared exterior de los nanotubos.

Preferiblemente, los aptameros son inmovilizados sobre la superficie del nanotubo de carbono usando una sustancia con una alta afinidad por el nanotubo de carbono, por ejemplo antraceno o una cadena de soporte de ADN monocatenario (que actua como un "pie"). Se dice entonces que el nanotubo de carbono esta funcionalizado para el biomarcador dirigido por el aptamero. La muy esquematica Figura 4 provee vistas axiales y planas de un nanotubo

27 de carbono con un aptamero 28 generico funcionalizado inmovilizado en la pared externa de un nanotubo de carbono usando antraceno 29. Sin embargo, se apreciara que muchos metodos son conocidos en la tecnica para la funcionalizacion de nanotubos, por ejemplo la carboxilacion seguida por esterificacion, o qulmica clic como se describe mas adelante. Cabe senalar que el dibujo es esquematico, y en realidad, un CNT serla mucho mas largo de lo que esta impllcito, mientras que en particular es poco probable que los aptameros sean esfericos.

Un nanotubo de carbono tlpico podrla ser 1000 nm de largo con un diametro de 1.25 nm, y que los respectivos diametros efectivos del aptamero y el antraceno sean 3 nm y 0.4 nm. Bajo estos supuestos, cuatro aptameros funcionalizados se puede unir a una circunferencia de un SWCNt, y 330 a lo largo de la longitud, lo que conduce a una estimacion de un total de 1320 aptameros funcionalizados por SWCNT.

En un segundo tipo de metodo de funcionalizacion de nanotubos de carbono, un ADN monocatenario se modifica por qulmica "clic" para apoyar aptameros, como se muestra en la Figura 5. Esta cadena se enrolla entonces alrededor de un nanotubo de carbono de pared simple.

La "qulmica clic describe las reacciones entre los grupos funcionales que dan lugar a un enlazamiento estable, presentan una minima reactividad cruzada termica con otros grupos funcionales, reacciona a la terminacion, estan libres de cantidades apreciables de productos secundarios, y proceden bajo condiciones de reaccion benignas.

El paradigma de la quimica clic se puede aplicar a la modificacion de acidos nucleicos, y se sabe que se puede utilizar para oligonucleotidos marcadores con colorantes fluorescentes, azucares o peptidos; para ciclar ADN; y unir oligonucleotidos al ADN.

En una realization preferida, la union se compone de un pie de polinucleotidos, preferiblemente alternando secuencias GT de (GT)n, donde el numero de GT se repite, n, es de 5 a 50, mas preferiblemente n = 10. La secuencia GT incluye un grupo funcional alquino colgante sobre el cual un aptamero modificado por azida puede estar unido a traves de la quimica "clic". Mas preferiblemente, el aptamero esta unido al medio de la estructura en forma de pie formando una union en T para asegurar un buen contacto con el nanotubo.

Alternativamente, el nanotubo de carbono puede ser funcionalizado directamente con el aptamero mediante quimica "clic", en ausencia del ADN intermediario enrollado alrededor del nanotubo de carbono.

Preferiblemente, tanto en los casos en que el aptamero se une al “pie” polinucleotido o directamente sobre el CNT, el aptamero es protegido durante la conjugation qulmica mediante una molecula complementaria, tal como una cadena de ADN. Una vez que la conjugacion esta completa, se retira la molecula protectora. Tal metodologla reduce la funcionalizacion no deseada de la parte de reconocimiento del aptamero durante la qulmica y reduce la probabilidad de adsorcion no deseada del aptamero sobre los nanotubos. La secuencia protectora es suficientemente complementaria al aptamero para asegurar enlazamiento suficiente durante la funcionalizacion de tal manera que el aptamero esta protegido pero puede contener secciones no coincidentes con el fin de reducir el punto de fusion del complejo para permitir la extraction facil. La urea o cambios de pH tambien pueden ser utilizados durante el proceso de elimination para reducir la temperatura requerida.

Con el fin de saturar las superficies de los nanotubos para evitar el enlazamiento no especifico del objetivo se puede introducir exceso de aptameros (GT)n.

La Figura 5 muestra una cadena de ADN enrollado alrededor de un SWCNT o MWCNT, u otro medio conductor. Se ilustran tres arreglos alternativos de aptameros unidos a un esqueleto de ADN con la quimica "clic". En (a), un aptamero especifico de biomarcador se conjuga a cada una de las bases de Adenina, Citosina, Guanina o Timina de una cadena de ADN. En (b) un aptamero se conjuga solamente con la base de Adenina, por ejemplo, dando lugar a una menor densidad de aptameros en comparacion con el esqueleto en (a). En (c) hasta cuatro aptameros dirigidos a diferentes biomarcadores se han conjugado con el ADN. Se apreciara que los aptameros conjugados con el

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esqueleto pueden ser de la variedad activa (no conjugados con sus biomarcadores objetivo), o puede ya estar conjugados con sus biomarcadores objetivo (cubiertos). De esta manera, se pueden preparar cadenas de ADN adecuadas para enrollar alrededor de los nanotubos de carbono que forman sensores ya sea de medicion o de referencia se pueden.

Un hlbrido de los ADN y nanotubos de carbono funcionalizados se forma enrollando las cadenas de ADN funcionalizadas alrededor de los nanotubos. Se apreciara que, o bien en la realizacion que concierne a la union directa de aptameros a un nanotubo de carbono, por ejemplo a traves de carboxilacion, o en la realizacion que describe el enrollado de una cadena de ADN alrededor de un nanotubo de carbono, los aptameros unidos bien sea directamente al nanotubo o a la cadena de ADN se encuentran en el sensor de medicion no conjugado y en el sensor de referencia conjugado con su biomarcador objetivo o de otra forma cubiertos (“descubierto” o “cubierto”, respectivamente).

La Figura 6 es un diagrama correspondiente a la figura 5(b) y que muestra un par de estructuras de sensor, de medicion y de referencia, con la estructura de referencia preenlazada con biomarcador y la estructura de medicion que tiene algun biomarcador enlazado a la misma durante el proceso de medicion.

Los diagramas muestran aptameros enlazados a las bases, pero en realidad es probable que sea las bases hidrofobas que se enlazan al CNT con el esqueleto orientado hacia el exterior, de tal manera que los aptameros se pueden unir al esqueleto.

La Figura 7 muestra una manera de preparar los recubrimientos de ADN de los aptameros para los CNT. Se provee por un lado, una cadena de ADN (vertical) compuesta principalmente de una secuencia alternante GT, que incluye un alquino-T individual adyacente a una secuencia unica corta, y por otro lado el ADN de aptamero deseado (horizontal) con modificacion azida en 3', protegida por una cadena de ADN totalmente complementaria con la region apareamiento de bases anadida para alinear en la cadena de ADN de soporte (pie) y una modificacion de biotina en 5'. La conjugacion clic (segundo panel de la Figura 7) se lleva a cabo en el lugar azida de alquino con la adicion de Cu+. El aDn se dispersa entonces con los CNT y adecuadamente tratado, por ejemplo, por agitacion, haciendo que los CNT se dispersen uniformemente. Luego, la suspension se incuba con estreptavidina recubierta sobre perlas magneticas y se calienta brevemente. La estreptavidina se enlaza a la biotina (panel 3) y las perlas pueden entonces ser removidas (panel 4), halando el complemento protector de los aptameros y haciendo los CNT activos listos para su uso.

Mientras tanto, la otra parte del lote, para los sensores de referencia, mantiene la protection del aptamero. Las soluciones se dispersan entonces sobre los electrodos intercalados. Es preferible llevar a cabo el ultimo paso despues del enlazamiento de aptameros, de tal manera que todos los sitios posibles son accesibles para el enlazamiento. Como se muestra en el diagrama final, el efecto del enlazamiento objetivo (izquierda) puede entonces ser comparado con la referencia o el sensor inactivo (derecha) en condiciones qulmicas identicas.

En otra realizacion, se puede formar el sensor usando las tecnicas comunmente asociados con el area de la electronica impresa. En este caso, un sustrato puede estar formado de un pollmero plastico, por ejemplo tereftalato de polietileno (PET), naftalato de polietileno (PEN), poli-4-vinilfenol (PVP), o PEG. Pistas, de metal o de carbono, se depositan sobre el sustrato de plastico, y los nanotubos de carbono se depositan entre ellas usando el metodo descrito subsecuentemente.

Haciendo referencia nuevamente a la Figura 2, se entendera que deben proveerse medios para medir las caracterlsticas electricas entre los contactos de la fuente 30 y drenaje 31 intercalados de los electrodos de referencia y de medicion. Como se describio anteriormente, el sensor 8 de medicion tiene principales terminales 30 y 31 de electrodos y un compuerta, un tanto analogo a un FET, pero el recubrimiento de nanotubos de carbono recubiertos por aptamero se aplica entre los terminales de "fuente" y del "drenaje" para preparar el area de la compuerta del FET. Los terminales del dispositivo se pueden conectar a los medios de estimulacion 37 electronica y de medicion 38 para medir las caracterlsticas electricas entre los electrodos de la fuente y del drenaje.

Por ejemplo, los medios 37 de estimulacion podrlan asumir la forma de una fuente de voltaje, y los medios 38 de medicion podrlan asumir la forma de un amperlmetro, lo que permite un establecimiento de la variation de la conductividad entre los electrodos 30, 31 de la fuente y de drenaje.

Se apreciara que otros circuitos electronicos tales como amplificadores de instrumentation y las fuentes de corriente o de voltaje variable podrlan ser utilizados durante el proceso de medicion. Tambien se apreciara que los medios de estimulacion 37 y medicion 38 podrlan ser fabricados sobre el mismo sustrato 2 que forma el sustrato para el area de contacto, si se trata de silicio, o alternativamente podrla residir en una tarjeta separada en estrecha proximidad con el sustrato de silicio, con los contactos de la fuente 30 y drenaje 31 que estan conectados por cable de enlace.

Al cambiar los medios de estimulacion y de medicion, la variacion de otros parametros pudo ser medida a traves de los electrodos de la fuente 30 y de drenaje 31. Por ejemplo, los medios de estimulacion podrlan asumir la forma de una fuente de alta frecuencia que, o bien podrla estimular los contactos del SWCNT con una frecuencia unica, o

barrer a traves de un amplio rango de frecuencias. Esto permitirla un establecimiento de la impedancia a traves de los electrodos de la fuente 30 y de drenaje 31. Del mismo modo, se podrlan proveer medios para medir la resistencia, la capacitancia o la inductancia.

Al considerar la provision de circuitos de deteccion, se entendera que los circuitos identicos al utilizado para los 5 electrodos 34 de medicion tambien pueden ser provistos para medir las caracterlsticas del electrodo de referencia simultaneamente.

Como se muestra en la Figura 8, las senales que representan la variacion en la conductividad, la impedancia, resistencia, capacitancia, o inductancia, por ejemplo, de un par 100 de deteccion que comprende unos electrodos 101 de medicion y electrodos 102 de referencia pueden ser transmitidas a medios 105 de calibracion. En el caso 10 donde las senales son analogicas, los medios de toma de decisiones podrlan ser una sustraccion analogica. Sin embargo, serla posible digitalizar las senales de los sensores de medicion y de referencia utilizando un convertidor analogico a digital y realizar la sustraccion entre ellos digitalmente. La senal 111 corregida es entonces la salida. Como se menciono anteriormente, se provee una pluralidad de pares de deteccion para permitir la deteccion de un conjunto de biomarcadores. Por lo tanto, sera evidente que se necesitara proveer un numero proporcional de medios 15 de calibracion.

Se proveen unos medios 107 de toma de decisiones en los cuales las senales calibradas son entrada. Los medios de toma de decisiones establecen el conjunto de senales calibradas a partir de la pluralidad de pares de deteccion, y detecta para una condicion. Si la condition se cumple, los medios de toma de decisiones indican esto mediante la emision de una senal logica. Sera evidente que otra information relevante para el proceso de deteccion podrla ser 20 generada, por ejemplo, mediciones brutas de conductividad para cada nanotubo.

Se apreciara que los circuitos descritos anteriormente se puede fabricar en una tarjeta de circuito impreso (PCB), y conectado al sustrato sensor usando alambre de enlace o algunos otros medios. En la realization preferida, el sustrato sensor es desechable de un solo uso y facilmente conectado a, y retirado de, una unidad de medida multiusos que contiene los dispositivos de circuitos de medicion y de salida. Esta realizacion permite a los sustratos 25 de sensores mantenerse en condiciones optimas de almacenamiento, por ejemplo, ambiente esteril y control de temperatura. Alternativamente, se apreciara que una proportion de los circuitos podrla fabricarse directamente sobre el sustrato sensor, y el resto que ocupa una PCB conectada al sustrato. Ademas, la PCB podrla estar conectado mecanica y electricamente a un conector, el cual por ejemplo podrla incluir un conector USB, o un conector micro USB, aunque se apreciara que podrlan ser utilizados muchos otros tipos de conector de datos, incluyendo los 30 conectores inalambricos.

Los experimentos se llevaron a cabo para probar la viabilidad del sistema, y se hicieron mediciones, como se describira ahora.

Paso 1: Production del aptamero de ADN-

i) slntesis de ADN

35 utilizando qulmica de protection con DMTr para 5'-OH y un 3'fosfito protegido con p-cianoetilo.

El ADN fue sintetizado utilizando slntesis en fase solida por etapas en un Sintetizador de ADN/ARN ABI 394 utilizando proteccion qulmica de DMTr para 5'-OH y un 3'fosfito protegido por p-cianoetilo.

La funcionalidad azida se introdujo usando 3'amino CPG que luego se convirtio en 3'azida usando qulmica de azidobutirato NHS ester. Se utilizo una fosforamidita "T" funcionalizada con alquino para incorporar el grupo alquino 40 dentro de la secuencia de ADN

ii) Purification de oligonucleotidos despues de la Escision y Desproteccion usando HPLC.

Los oligonucleotidos se purificaron usando ya sea:

• RPLC usando un gradiente de 100% de acetato de amonio 50 mM pH 6.8 a 100% de acetato de amonio 50 mM en 50% de acetonitrilo, a 55°C.

45 • Cromatografla de intercambio ionico utilizando agua a 100% de NaCl 1.2M a 60°C.

iii) Conversion del grupo 3'-amino a -3'azida:

Se disolvio azidobutirato NHS ester en MeCN. 3'-amino-ADN disuelto en carbonato/bicarbonato 0.1 M pH 9. Azidobutirato NHS ester se agrego a oligonucleotido disuelto y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Para concentrar se agregaron 2 volumenes de etanol frlo, se incubo a -80°C durante 20 minutos y se 50 granularon (4000 g, 30 minutos). El ADN redisuelto fue desalinizado en agua de 18.2mC y fue liofilizado

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iv) Qulmica clic (refierase a la Figura 7.)

El ADN marcado con alquino (en agua) se anadio al ADN marcado con azida para disolverse. La solucion de CuBr que contenla TBTA 0.1 M en DMSO/t-butanol 3:1 (v/v) se incubo a 45°C durante 2 horas [1, 2]. La reaccion se diluyo con agua, se desalinizo en agua a 18.2mQ y se liofilizo.

v) Verificacion de la slntesis de ADN y Productos Clic

Los ADN sintetizados fueron sometidos a espectrometrla de masas de ionizacion por aspersion en modo negativo para verificar masas correctas.

Los productos clic de reaccion se marcaron en el fosfato 5' usando y- [32P]-ATP [3]. Estos fueron analizados en gel de poliacrilamida SDS al 10% desnaturalizante para mostrar la conjugacion "clic" exitosa.

Protocolos y Reactivos

www.glenresearch.com

www.linktechnologies.co.uk

Paso 2: Proteccion de oligomero, eliminacion.

Las cadenas de andamio o protectoras se sintetizaron con un grupo biotina 5' permitiendo su eliminacion postinmovilizacion del CNT de la pieza en T a traves del fragmento en forma de “pie” de ssADN GT mediante breve (2 min) incubacion sobre de la respectiva Tm en presencia de perlas magneticas recubiertas con estreptavidina. Despues de la exposition a un iman el sobrenadante que contenla las cadenas de aptamero libre unido a los CNT a traves de los "pies" se utilizo para el recubrimiento de los elementos de electrodo.

Paso 3: Construction del electrodo de referencia.

Se crearon ejemplos de electrodos de referencia por la retention de las cadenas complementarias o andamio unidas por hidrogeno al aptamero, bloqueando as! la formation de la conformation activa del soporte aptamero. Alternativamente, las cadenas de aptamero se sintetizaron con un grupo de entrecruzamiento fotoactivo y enlazadas covalentemente a su objetivo en presencia de objetivo en exceso mediante iluminacion UV.

Se llevo a cabo un experimento inicial con el fin de demostrar la dispersion uniforme de los nanotubos recubiertos de ADN, utilizando la solucion de ADN de esperma de arenque congelado. La Figura 9 es una micrografla en fuerza atomica de tal dispersion de nanotubos seca sobre un sustrato de sllice que muestra los nanotubos recubiertos de ADN dispersados y la formacion de una red percolada. Las imagenes y los barridos de llnea confirman que los nanotubos estan bien dispersos y se pueden secar para formar las redes conductoras requeridas para el sensor.

Paso 4: Dispersion de nanotubos en (GT)10 en solucion reguladora de fosfato (PBS).

Para hacer los nanotubos presentes en aptameros, se utilizo un ADN sintetico, a saber (GT)10, conjugado con una cadena de aptamero cubierta, La solucion (GT)10 congelada a una concentration de 3.25 mg/ml se descongelo a temperatura ambiente. 115 microlitros de la solucion de ADN se sometieron a sonicacion durante 15 minutos.

0.19 mg de polvo de nanotubos como se recibio (Nanointegresis, semiconductor) se agregaron a 1 ml de PBS y se sometio a sonicacion durante 80 min en total usando sonda ultrasonica usando 40 min a 15W con 0.5 ml adicionales de PBS. La dispersion de nanotubos se diluyo a 0.19 mg en 1.5 ml de PBS y se sometio a sonicacion en un bano ultrasonico durante 2 h antes de la mezcla con el ADN.

La solucion de ADN (115 microlitros) agregada a la dispersion de los CNT y se sometio a sonicacion en un bano ultrasonico. Luego se agrego PBS a la dispersion (285 pl) hasta que la dispersion alcanzo la concentracion de nanotubos requerida. En general, una relation de 2:1 (ADN:SWNT p/p) se logro con DNAv:0.2 mg/ml y cCNTs:0.1 mg/ml. Las dispersiones se sometieron a sonicacion vigorosamente en agua con hielo causando que la muestra se volviera de color rojo oscuro. Las dispersiones se sometieron a sonicacion durante un total de 2 h, con hielo que se agrego al bano sonico cada 20-30 min para evitar que la temperatura se elevara por encima de 8°C. Finalmente, las dispersiones se centrifugaron suavemente a 3300 rpm durante 1 h y luego se filtraron usando un filtro de jeringa de 1 micron.

Paso 5: Deposition de la dispersion de nanotubos sobre los electrodos.

Los electrodos fueron producidos usando tecnicas litograficas. Los electrodos comprenden de electrodos interdigitados como se muestra en la Figura 10a. En este dibujo, el diagrama de la parte superior es una section

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transversal de la parte del diseno de electrodos interdigitados, el medio es una disposicion plana del par de referenda y del sensor. La vista desde arriba es una seccion transversal de uno de los electrodos, mientras que el diagrama inferior es una vista plana de un par de electrodos, uno de los cuales se utilizaria como un electrodo de "referenda" y el otro como el electrodo de "medicion". Las almohadillas rectangulares marcadas G, S y D se utilizan para conectar los electrodos a los circuitos de medicion. Notese que el etiquetado indicado aqui es para una configuracion de transistor con contactos de una fuente, de drenaje y de compuerta. Sin embargo, el mismo diseno de electrodo puede ser usado en una situacion sin transistor donde la corriente entre los dos electrodos interdigitados se mide, con o sin una polarizacion de compuerta.

La Figura 10b es una micrografia optica de los electrodos del sensor interdigitados. Las pistas de oro son de 10 micrones de ancho y separadas por 10 micrones.

Los electrodos desnudos se enjuagaron con metanol, acetona y el IPA fue soplado con N2 y limpiado en UV-O3 durante 30 min. Los electrodos fueron aislados en sustratos utilizando lapiz hidrofobo. A continuacion, una gota de 2 pm de la dispersion de CNT-ADN se deposita sobre los electrodos.

Resultados 1: Medidas electricas del complejo nanotubos-ADN sobre los electrodos

Se dispersaron nanotubos semiconductores (NanoIntegresis) con ADN de cadena sencilla utilizando el protocolo descrito con referencia a la Figura 9. Dispersiones de nanotubos de 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.007 mg/ml y 0.001 mg/ml se prepararon y se depositan sobre el electrodos. Se aplico un voltaje de 2 V a traves de los electrodos y el voltaje de la compuerta vario a medida que se media la corriente del electrodo.

Los resultados se muestran en la Figura 11, que tiene la corriente del dispositivo (eje izquierdo) y la corriente absoluta del dispositivo (eje derecho) como una funcion del voltaje de la compuerta para diversas concentraciones iniciales de dispersion. El valor absoluto de la corriente es en forma de V debido a la naturaleza bipolar de la red de CNT. Las concentraciones iniciales en terminos de nanotubos son como indican en el titulo de los graficos. Se encontro que una concentracion de aproximadamente 0.007 mg/ml de nanotubos dio una cobertura fiable sin un riesgo excesivo de cortocircuitos. Los cortocircuitos surgen de nanotubos metalicos; es dificil y costoso asegurar nanotubos semiconductores puros, por lo que la muestra utilizada contenia aproximadamente 10% de formas metalicas. El cortocircuito tambien fue impedido teniendo una diferencia suficiente en la separacion de los electrodos en comparacion con la longitud de los nanotubos utilizados - como se describio anteriormente.

Resultados 2: Medidas electricas de complejos (GT)10 de nanotubes en los electrodos.

Se dispersaron nanotubos semiconductores (NanoIntegresis) con ADN de cadena sencilla utilizando el protocolo discutido en el Paso 4. Dispersiones de nanotubos de 0.1 mg/ml fueron preparadas y depositadas en los electrodos como se explica en el Ejemplo 4. Se aplico un voltaje de 2 V a traves de los electrodos y el voltaje de la compuerta vario a medida que se media la corriente del electrodo.

La figura 12 muestra la corriente del dispositivo (eje derecho, linea oscura) y la corriente absoluta del dispositivo (eje izquierdo, linea clara) en funcion del voltaje de la compuerta.

Resultados 3: Medidas electricas de complejos de (GT)10 de nanotubes en los electrodos.

En este experimento, Se dispersaron nanotubos semiconductores (NanaIntegresis) con la pieza en T de apatamero de lisozima de (GT)10 de cadena sencilla en el uso del protocolo discutido en el Ejemplo 2. Estas muestras son designadas "protegidas" y todavia tienen la cadena protectora conjugada unida al aptamero. Un segundo conjunto de muestras, designadas "sin proteccion", fueron producidas por el calentamiento de la pieza en T de aptamero de lisozima de (GT)10 de cadena sencilla a 70°C durante 15 minutos antes de su introduccion a la dispersion del nanotubo. Las dispersiones se prepararon a una concentracion de 0.007 mg/ml y se depositaron 2 microlitros en los electrodos como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 13 muestra la corriente del dispositivo (eje derecho, linea oscura) y la corriente absoluta del dispositivo (eje izquierdo, linea clara) en funcion del voltaje de la compuerta para: IZQUIERDA - el dispositivo "protegido" en el que el aptamero todavia se conjuga con su cadena de proteccion y DERECHA - el dispositivo "sin proteccion", donde el aptamero ha tenido eliminada la cadena conjugada. El aptamero utilizado en este caso estaba contra la lisozima.

Se describiran ahora algunos ejemplos de sensores espedficos de la trombina.

Ejemplo 1: CNTs/aptamero de trombina (GT)10 desprotegido.

Trombina (GT)10 protegida congelada se descongelo a temperatura ambiente. 100 microlitros de esta solucion se diluyeron en 900 microlitros de PBS para dar una concentracion aproximada de trombina (GT)10 de 1.2 mg/ml. La

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solucion se incubo a 90°C durante 2 min y se enfrio lentamente a temperatura ambiente para asegurar que todos los oligomeros fueran apareados en bases antes de la dispersion.

0Se colocaron 0.6 mg de polvo de nanotubos de Nanointegris en 2 ml de PBS y se sometieron a sonicacion utilizando sonda ultrasonica durante 80 minutos a 15W. La dispersion de los CNT se sometio a sonicacion en bano ultrasonico durante 30 min antes de la mezcla con el ADN. Se anadio 1 ml de la solucion de trombina (GT)i0 a la dispersion de nanotubos y se sometieron a sonicacion en bano ultrasonico. Se agrego entonces PBS a la dispersion (3 ml) hasta que la dispersion alcanzo la concentracion requerida de nanotubos. Este proceso dio como resultado ADN:SWNT p/p de DNAc: 0.2 mg/ml, cCNTs: 0.1 mg/ml.

Las dispersiones se sometieron a sonicacion vigorosamente en agua con hielo provocando que la muestra se tornara negra. El vial se suspendio centralmente en el bano, a una profundidad de 20-40 mm, con hielo alrededor de los bordes de la banera que previene el calentamiento de la muestra.

Las dispersiones se sometieron a sonicacion durante un total de 2 horas, agregando el hielo al bano sonico cada 2030 min para evitar que la temperatura se elevara por encima de 5°C. Una vez que los nanotubos hablan sido funcionalizados por el aptamero de trombina (GT)i0, el grupo protector se elimino mediante calentamiento rapido a 70°C y recolectando el grupo protector usando perlas magneticas de estreptavidina.

Las dispersiones fueron entonces centrifugadas suavemente a 3300 rpm durante 1 h y luego se filtraron usando un filtro de jeringa Whatman. Las dispersiones se diluyeron entonces a la concentracion requerida usando PBS. En este ejemplo se diluyo la dispersion para dar una concentracion de 0.007 mg/ml de nanotubos.

Los electrodos se limpiaron y aislaron utilizando un lapiz hidrofobo. Se coloco una gota de 2 microlitros de la dispersion sobre el electrodo y se dejo secar. Los dispositivos finales consistieron de una red de nanotubos cubiertos en el aptamero de trombina desprotegido. Este electrodo es el electrodo de "medicion".

La corriente (ID) entre los electrodos de la fuente y de drenaje, o mas bien los electrodos principales, se midieron entonces como una funcion del voltaje de la compuerta (VD) como se muestra en la Figura 14. El dispositivo muestra un comportamiento semiconductor. El dispositivo es un sensor hecho por los CNT funcionalizados por aptamero de trombina (GT)10 desprotegido. Las mediciones se realizaron despues del secado.

La corriente entre los electrodos (l, eje de la izquierda, llnea oscura) como una funcion del voltaje de la compuerta (V). (El eje a mano derecha y la llnea clara denotan la corriente absoluta (ABS(I)).)

Ejemplo 2: CNTs/aptamero de trombina (GT)10 protegido

El electrodo se hizo como se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, el grupo protector se dejo en su lugar de tal manera que los dispositivos finales consistieron de una red de nanotubos cubiertos en el aptamero de trombina protegido. Este electrodo es el electrodo de "referenda".

La Figura 15 muestra la corriente entre los electrodos principales (ID) como una funcion de del voltaje de la compuerta (VD). Al igual que con el electrodo desprotegido, se observo un comportamiento semiconductor. En este dispositivo, un electrodo hecho por los CNT esta funcionalizado por aptamero de trombina (GT)10 protegido. Las mediciones se realizaron despues del secado. La corriente entre los electrodos (l, eje de la izquierda, llnea oscura) como una funcion del voltaje de la compuerta (V). (El eje a mano derecha y la llnea clara denotan la corriente absoluta (ABS(I)).)

Ejemplo 3: Comparacion de la respuesta de los electrodos de referencia y de medicion

Los electrodos de medicion se produjeron como se describe en el Ejemplo 1 y los electrodos de referencia se produjeron como se describe en el Ejemplo 2. Se midieron las caracterlsticas electricas de los electrodos (Figura 16). Se introdujo entonces trombina 100 nM a los electrodos, se dejo secar y las propiedades electricas se midieron de nuevo (Figura 17). No se observo ningun cambio significativo en el electrodo de referencia despues de la introduccion de la trombina, mientras que en el electrodo de "medicion", la corriente se incremento por un factor de ~4 a 2 V voltios de drenaje.

La figura 16a muestra el electrodo de referencia como fue hecho (nanotubos funcionalizados mediante aptamero de trombina (GT)1o protegido) y la Figura 16b muestra el electrodo de medicion como fue hecho (nanotubos funcionalizados por aptamero de trombina (GT)10 desprotegido). Las mediciones se realizaron despues del secado. La corriente entre los electrodos (eje mano izquierda, "I", llnea oscura) se traza como una funcion del voltaje de compuerta (V). (El eje a mano derecha y la llnea clara denotan la corriente absoluta, ABS (I).)

La Figura 17A muestra el electrodo de referencia como fue hecho (nanotubos funcionalizados mediante aptamero de trombina (GT)10 protegido) y la Figura 17b muestra el electrodo de medicion (nanotubos funcionalizados mediante aptamero de trombina (GT)10 desprotegido) despues de la deposicion de la trombina 100 nM y secado subsecuente.

5

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La corriente entre la fuente y el drenaje del electrodo (ID - llnea oscura) se traza como una funcion del voltaje de compuerta (VD). (El eje al lado derecho y la llnea clara denotan la corriente absoluta.)

Aunque se preve que la invencion sea util para la deteccion de la tuberculosis, se apreciara que podrla ser adaptada para detectar indicativos de biomarcadores de muchas otras condiciones tambien. Adicionalmente, la tecnica se puede utilizar para detectar especies moleculares de origen no biologico, como ejemplificado por, pero no limitado a, agentes de guerra qulmica, narcoticos y explosivos.

Los posibles campos de interes son:

Medicina humana/veterinaria, en particular las enfermedades infecciosas como la tuberculosis humana/bovina;

La seguridad nacional, incluyendo riesgos biologicos como el antrax, el tetanos, gases nerviosos, y explosivos tales como TNT, 2,4-DNT, 2-6-DNT, etc.;

Aplicacion de la ley, en particular farmacos que incluyen cannabinoides, benzoilecgonina;

Salud y seguridad - deteccion de gases/vapores nocivos, nafta, hidrocarburos;

Control de Procesos y de Calidad;

Productos con valor muy alto, tal como fragancias por ejemplo almizcle (galaxolide);

Mediciones Generales, instantaneas o continuas o acumulativos:

Gas, vapor, llquido, aliento, saliva, huellas dactilares;

Entorno general o personal;

Mediciones individuales o multiples.

Otras aplicaciones posibles son:

Configuraciones especlficas de diagnostico para la deteccion de la TB bovina;

Configuraciones especlficas de diagnostico para la deteccion de la TB humana en puertos de entrada;

El uso de una serie de sensores de aptamero en paralelo para detectar una "biofirma" para TB cuantitativamente;

Biomarcador especlfico - configuraciones de diagnostico para la deteccion de otras enfermedades (por ejemplo, Hepatitis B y C);

Configuraciones especlficas de diagnostico para la deteccion de agentes de guerra biologica;

Configuraciones especlficas de diagnostico para la deteccion de explosivos;

Configuraciones especlficas de diagnostico para la deteccion de farmacos;

Configuraciones especlficas de diagnostico para la deteccion de gases nocivos Referencias:

1. Kocalka, P., A.H. El-Sagheer, and T. Brown, Rapid and efficient DNA strand cross-linking by click chemistry. Chembiochem., 2008. 9(8): p. 1280-5;

2. El-Sagheer, A.H. and T. Brown, Click chemistry with DNA. Chem. Soc. Rev., 2010. 39: p. 1388-1405;

3. Sambrook, J., Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 2nd ed 1989, Cold Spring Harbour: Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un dispositivo para identificar la presencia de una molecula o biomarcador objetivo especlfica mediante la deteccion de un cambio en una propiedad electrica, el dispositivo incluye un sensor (8) de medicion que comprende:

   una estructura (12) de sensor conductora o semiconductora capaz de conjugarse con el biomarcador, dando lugar as! a dicho cambio en la propiedad electrica, incluyendo el sensor un recubrimiento de aptamero o un recubrimiento de anticuerpo;

   y un sistema (3) de electrodos para la realizacion de una senal desde el dispositivo;

   en el que el dispositivo incluye un tal sensor (9) adicional, de forma sustancialmente identica, pero que tiene su estructura (14) de sensor cubierta de tal manera que no conjuga con el biomarcador, con el fin de actuar como una referencia interna.
2. 2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el cubrimiento se efectua por presaturacion de la estructura del sensor con la molecula o biomarcador objetivo, o en el que la estructura del sensor contiene un aptamero de oligonucleotido y el cubrimiento se efectua por la estructura de sensor que esta unida a un oligonucleotido de complemento, o en el que el cubrimiento se lleva a cabo mediante el uso de una version mutante de la estructura del sensor con variaciones de la secuencia, de tal manera que el biomarcador ya no se reconoce.
3. 3. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que la estructura (12) de sensor se hace sobre una base de semiconductor recubierta con aptameros capaz de conjugarse con el biomarcador.
4. 4. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que los aptameros son aptameros de oligonucleotidos y son preferiblemente estereoespeclficos.
5. 5. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, en el que en el que la base semiconductora incluye un esqueleto de nanotubos de carbono (CNT), y una cadena de ADN esta unida al esqueleto del CNT, con moleculas de conjugacion unidas al ADN.
6. 6. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la base semiconductora es un esqueleto de ADN recubierto por, por ejemplo, PVP, Al o Si para formar un "nanocable" para dar mediciones potenciadas de efectos electricos.
7. 7. Un dispositivo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el sistema de electrodos incluye un par de electrodos (3) interdigitados entre los que se extiende la estructura de sensor.
8. 8. Un dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 7, en el que los electrodos (3) incluyen oro u otras tiras conductoras con una separacion mayor que la longitud promedio de los CNT y que estan espaciados aproximadamente 10-50 pm.
9. 9. Un dispositivo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que incluye ademas un sustrato (2) sobre el que se forman los sensores y electrodos, siendo el sustrato preferiblemente silicio o un pollmero tal como PET, PEN, PVP o PEG.
10. 10. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 9 y que tiene dos o mas de tales sensores de medicion, cada uno para un biomarcador especlfico diferente, donde se utiliza la relacion de las propiedades electricas medidas a partir de los electrodos de biomarcadores para identificar un compuesto.
11. 11. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 9 y que tiene una o mas referencias y una pluralidad de estructuras de sensor de medicion para la medicion multiple del mismo biomarcador.
12. 12. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que las moleculas de conjugacion se asocian con biomarcadores generados por una enfermedad, tal como la Tuberculosis, Hepatitis B o Hepatitis C o surgen de otros procesos biologicos alterados generados como un ejemplo por la exposicion a materiales biologicos peligrosos, tales como el gas sarin, VX o Ricina.
13. 13. Un dispositivo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, y que se incorpora en un moldeado (1) de cuerpo con conexiones electricas apropiadas y sellado antes de su uso de una manera hermetica con una pellcula de barrera de pollmero; que incluye ademas una interfaz para ser conectado a un dispositivo lector que mide la respuesta del conjunto y da un juicio o diagnostico, y los circuitos (100-110) conectados al sistema (3, 4) de electrodos y adaptado para comparar las senales de la dos estructuras de sensores para dar una medicion de la concentracion de las moleculas objetivo en la muestra.
14. 14. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que el dispositivo en el punto de uso comprueba la suficiencia del volumen de muestra objetivo a traves de la medicion del electrolito contenido antes de que la conjugacion (evento de enlazamiento) sea medida.
15. 15. Un metodo de analisis de un fluido de muestra por la presencia de una molecula o biomarcador objetivo, en el 5 que se hace pasar el fluido de muestra sobre un detector que incluye un par de dos estructuras de sensores

    sustancialmente identicos adaptado para enlazarse al objetivo, cada estructura de sensor que comprende un sistema de electrodos y un recubrimiento aptamero o un recubrimiento de anticuerpo, en donde una de las estructuras de sensor esta protegida para no unirse al objetivo y se utiliza como una referencia para una medicion tomada desde el otro; y detectar un cambio en las caracterlsticas electricas a traves de los electrodos basados en el 10 enlazamiento de la molecula o biomarcador objetivo; en donde se utilizan opcionalmente varios pares de electrodos de medicion (no conjugado) y de referencia (conjugados), con cada par funcionalizado con un objetivo diferente, de tal manera que varios identificadores diferentes pueden ser examinados para garantizar la identificacion de la molecula objetivo; y en el que las moleculas objetivo pueden ser biomarcadores de la enfermedad o pueden emanar de explosivos, narcoticos u otras moleculas indeseables por ejemplo, agentes de guerra qulmica tales como Sarin.