ES2554231T3 - Detección de complejos de ADAMTS13-anticuerpo en circulación - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar o determinar complejos inmunitarios de anticuerpo anti- ADAMTS13/ADAMTS13 en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti- ADAMTS13, poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-anticuerpo y detectar los complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 unidos a dicho anticuerpo anti-ADAMTS13 y dicho anticuerpo anti-anticuerpo.

Description

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DESCRIPCION

Deteccion de complejos de ADAMTS13-anticuerpo en circulacion CAMPO DE LA INVENClON

La invencion se refiere a procedimientos para la determinacion de anticuerpos anti-proteasa de escision del factor de von Willebrand (anti-ADAMTS13) que estan unidos en complejos inmunitarios en circulacion (CIC) con ADAMTS13, y a los usos clmicos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

La proteasa de escision del factor de von Willebrand (una desintegrina y metaloproteinasa con un motivo de trombospondina de tipo 1, miembro 13, "ADAMTS13") se ha aislado, purificado y caracterizado anteriormente, tal como en los documentos WO 1997/041206 y WO 02/42441. La ADAMTS13 degrada multimeros de VWF grandes en la corriente sangumea, disminuyendo su actividad de agregacion de plaquetas.

La disfuncion de ADAMTS13 puede conducir a la acumulacion de grandes cantidades de multfmeros de alto peso molecular de factor de von Willebrand en la sangre, que a su vez puede conducir a eventos microtromboticos y dano de vasos sangumeos. La deficiencia de ADAMTS13 esta ligada al smdrome de Upshaw-Schulman y a la forma hereditaria de la purpura trombocitopenica trombotica (PTT). Ademas, la disfuncion de ADAMTS13 puede estar causada por respuestas inmunitarias aberrantes orientadas a ADAMTS13. Es un ejemplo de enfermedades con causas inmunologicas caracterizadas por la formacion de inhibidores inmunitarios de ADAMTW13 la PTT adquirida. En la PTT adquirida, los anticuerpos de IgM e IgG contra proteasa de escision del factor de von Willebrand pueden ser no neutralizantes (Scheiflinger 2003; Levy 2005). Pueden acumularse tambien complejos inmunitarios persistentes en el plasma y causar reacciones activadoras del complemento adversas que danen los vasos sangumeos. Los autoanticuerpos neutralizantes de ADAMTS13 son la causa principal de PTT adquirida. Se han investigado los subtipos de IgG de anticuerpos anti-ADAMTS13 con diferentes funciones efectoras (Ferrari; 2009).

La PTT adquirida (PTTa) es una enfermedad remitente (Sadler, 2008) caracterizada por plaquetas bajas, LDH elevado, recuento de eritrocitos bajo (causado por una degradacion prematura de las celulas), eritrocitos fragmentados (esquistocitos) y anormalidades neurologicas. La cafda brusca del numero de eritrocitos y plaquetas en la sangre esta asociada a problemas graves que afectan a rinones y cerebro, junto con fiebre y hemorragia. La purpura hace referencia a la hemorragia caractenstica que aparece bajo la piel, o en membranas mucosas, que produce moratones o una apariencia de tipo erupcion roja. Los smtomas neurologicos asociados a esta enfermedad incluyen migranas, confusion, cambios del habla y alteraciones de la consciencia, que vanan de letargo a coma; otros smtomas incluyen el desarrollo de anormalidades renales. Si no se trata, la pTt aguda puede conducir a la muerte en pocos dfas (aproximadamente un 90 % de los pacientes que la presentaban monan antes de los regfmenes de tratamiento actuales), de modo que es esencial una deteccion rapida de la causa y el tipo de la enfermedad. El tratamiento actual consiste en la infusion de plasma congelado reciente con o sin intercambio de plasma o plasmaferesis. Ademas, se esta explorando el tratamiento con ADAMTS13 recombinante. La carga de complejo inmunitario de ADMTS13 puede fluctuar durante la progresion de la enfermedad. Para adaptar una terapia eficaz para la PTTa, existe la necesidad de identificar, calificar y cuantificar las reacciones inmunitarias contra ADAMTS13 y CIC. Sin embargo, muy pocos laboratorios pueden efectuar ensayos de ADAMTS13 suficientemente rapido, y el profesional medico debe hacer un diagnostico e iniciar la terapia sin esta informacion (Sadler, 2008).

Se ha desarrollado un ensayo basado en celulas para detectar complejos inmunitarios en muestras de suero (Theofilopoulos, 1976). Sin embargo, dichos ensayos consumen tiempo, son engorrosos y soportan una baja reproducibilidad.

Existen ensayos mas sencillos para determinar la actividad de ADAMTS13 o la presencia de la concentracion de ADAMTS13 total en plasma (Rieger, 2006). Otros ensayos estan dirigidos a detectar anticuerpos anti-ADAMTS13 en muestras de plasma (Rieger, 2005; WO 2004/095027). Sin embargo, estos ensayos soportan un uso limitado en el diagnostico de enfermedades espedficas asociadas a la disfuncion de ADAMTS13 como APTT adquirida (Rieger, 2006).

Es un objetivo de la presente invencion mejorar la sensibilidad y exactitud de los ensayos para la deteccion y determinacion de CIC de anticuerpos contra ADAMTS13 en muestras biologicas, asf como el uso de estos ensayos mejorados en el cuidado de pacientes.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona un procedimiento para detectar o determinar las cantidades de anticuerpos anti- ADAMTS13 en complejo con ADAMTS13 como se define en las reivindicaciones. Este procedimiento puede combinarse con la determinacion de los anticuerpos anti-ADAMTS13 libres y/o la determinacion de ADAMTS13 libre o la actividad de ADAMTS13. Los anticuerpos anti-ADAMTS13 diana se unen a ADAMTS13 o, si ya estan

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complejados con ADAMTS13, a una unidad de union a ADAMTS13, que es un anticuerpo anti-ADAMTS13. Esta etapa permite la seleccion espedfica de los anticuerpos con especificidad por ADAMTS13 de un fondo de muestras. Los anticuerpos se unen ademas a un resto que reconoce los anticuerpos y/o sus subclases espedficas denominado la unidad de union a anticuerpo, a saber un anticuerpo anti-anticuerpo. Los complejos inmunitarios de ADAMTS13 comprenden ADAMTS13 y anticuerpos anti-ADAMTS13. El procedimiento de la invencion esta basado en un mecanismo de union de dos componentes: la parte de ADAMTS13 del complejo se une a dicha unidad de union a ADAMTS13 y la parte de anticuerpo anti-ADAMTS13 del complejo se une a dicha unidad de union a anticuerpo. Ambas reacciones de union aseguran la deteccion espedfica de complejos inmunitarios de ADAMTS13.

En un aspecto particular, la presente invencion proporciona un procedimiento para detectar complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTSl3/ADAMTS13 en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con una unidad de union a ADAMTS13 que es un anticuerpo anti-ADAMTS13, poner en contacto dicha muestra con una unidad de union a anticuerpo, a saber un anticuerpo anti-anticuerpo, y detectar los complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 unidos a dicha unidad de union a ADAMTS13 y dicha unidad de union a anticuerpo.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un procedimiento de combinacion para detectar a) complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con una unidad de union a ADAMTS13 que es un anticuerpo anti-ADAMTS13, poner en contacto dicha muestra con una unidad de union a anticuerpo , a saber un anticuerpo anti-anticuerpo, y detectar los complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 unidos a dicha unidad de union a ADAMTS13 y dicha unidad de union a anticuerpo y b) anticuerpos anti-ADAMTS13 en una muestra, que comprende unir dichos anticuerpos anti-ADAMTS13 a ADAMTS13 o un fragmento del mismo y detectar dichos anticuerpos anti-ADAMTS13 unidos a ADAMTS13 o dicho fragmento con unidades de union a anticuerpo espedficas de dichos anticuerpos anti- ADAMTS13; en el que pueden determinarse las cantidades relativas y tipos de anticuerpos anti-ADAMTsi3 no complejados y complejados. Dichas unidades de union a anticuerpo de las etapas a) y/o b) pueden ser espedficas de clase de anticuerpo o subtipo de anticuerpo.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una combinacion del procedimiento de deteccion de a) complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTsi3/ADAMTS13 en una muestra y de deteccion de b) ADAMTS13 libre o de determinacion de la actividad de ADAMTS13 en la muestra, en la que pueden determinarse las cantidades relativas de ADAMTS13 no complejada y complejada o la relacion de actividad de ADAMTS13 a complejos inmunitarios de ADAMTS13.

En otro aspecto, la memoria descriptiva se refiere a un kit que comprende una unidad de union a ADAMTS13 y al menos una unidad de union a anticuerpo.

Puesto que la presencia de anticuerpos anti-ADAMTS13 complejados y/o libres en una muestra biologica puede indicar una afeccion patologica, la presente invencion se refiere tambien a un procedimiento de diagnostico de una enfermedad asociada a la disfuncion de ADAMTS13 (p.ej., PTT) en un paciente, que comprende obtener una muestra de un paciente y detectar los complejos inmunitarios de ADAMTS13 y anticuerpos anti-ADAMTS13 libres o complejos inmunitarios de ADAMTS13 solo en dicha muestra. Es un aspecto adicional de esta invencion la monitorizacion de los complejos inmunitarios de ADAMTS13 y los anticuerpos anti-ADAMTS13 libres, ADAMTS13 libre y/o complejos inmunitarios de ADAMTS13 en un paciente para ajustar el tratamiento del paciente con un medicamento que contiene ADAMTS13 (tal como plasma congelado reciente o una composicion de ADAMTS13 recombinante).

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 muestra una representacion esquematica del procedimiento de la invencion para detectar complejos inmunitarios. Los anticuerpos (1) orientados a una parte del complejo de inmunoglobulina-antigeno (2) de la muestra, aqrn el antfgeno, estan recubiertos sobre una superficie solida. Los anticuerpos secundarios (3) se orientan a la otra parte del complejo inmunitario, aqrn la inmunoglobulina. Un marcaje en los anticuerpos secundarios da como resultado una senal detectable (4), tal como el sistema de peroxidasa de rabano picante (HRP).

La Fig. 2 muestra la determinacion de complejos inmunitarios en muestras positivas diluidas (PTT) y muestras negativas (NHP) en una configuracion que usa anticuerpos policlonales anti-ADAMTS13 (fig. 2a: anticuerpo abcam comercial, fig. 2b: anticuerpo policlonal de conejo K1-4) como anticuerpos de recubrimiento y anticuerpos secundarios espedficos de subtipo de IgG.

La Fig. 3 muestra los resultados de un inmunoensayo anti-IgG4 que usa diferentes anticuerpos anti-ADAMTS13 inmovilizados: a: anticuerpo policlonal Abcam; b: anticuerpo policlonal K1-4; c: anticuerpo policlonal K6; anticuerpo monoclonal 5.1 y e: anticuerpo monoclonal 12.1.

La Fig. 4 muestra los resultados de un inmunoensayo anti-IgG para determinar la reactividad cruzada de diferentes anticuerpos secundarios; la fig. 4a muestra la reactividad por el subtipo IgG1-4 e IgA e IgM de un anticuerpo anti-

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IgG1; la fig. 4b lo mismo para un anticuerpo anti-IgG2; la fig. 4C lo mismo para un anticuerpo anti-IgG3; la fig. 4d lo mismo para un anticuerpo anti-IgG4; la fig. 4e lo mismo para un anticuerpo anti-IgA y la fig. 4g lo mismo para un anticuerpo anti-IgM.

La Fig. 5 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con diferentes anticuerpos monoclonales anti-ADAMTS13 como anticuerpos anti-ADAMTS13 y diferentes anticuerpos secundarios espedficos de clase de Ig y subtipo (fig. 5a: anti-IgG1, fig. 5b: anti-IgG2, fig. 5C: anti-lgG3, fig. 5d: anti-IgG4, fig. 5e: anti-lgA, fig. 5f: anti-IgM, anticuerpos secundarios).

La Fig. 6 muestra los resultados de la comparacion de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 de un anticuerpo policlonal y monoclonal anti-ADAMTS13 como anticuerpos inmovilizados y diferentes anticuerpos secundarios espedficos de clase de Ig y subtipo (fig. 6a: Ac policlonal K1-4, 6b: Ac monoclonal 5C11) y en la fig. 6c los resultados de un inmunoensayo anti-IgG4 usando el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-4.

La Fig. 7 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos anti- IgG no espedficos de subtipo y espedficos de clase IgG en diferentes muestras (fig. 7a: muestra de PTT enriquecida con ADAMTS13rfrente a plasma de NHP; fig. 7b: plasma de PTT frente a plasma de NHP).

La Fig. 8 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos policlonales purificados por afinidad como anticuerpos anti-ADAMTsl3 y diferentes anticuerpos espedficos de clase de Ig y subtipo como anticuerpos secundarios (fig. 8a: anti-IgG1, fig. 8b: anti-IgG2, fig. 8c: anti-IgG3, fig. 8d: anti- IgG4, fig. 8e: anti-IgA, fig. 8f: anti-IgM, anticuerpos secundarios).

La Fig. 9 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpo policlonal purificado y una mezcla de anticuerpos monoclonales como anticuerpos anti-ADAMTS13 y diferentes anticuerpos espedficos de clase de Ig y subtipo como anticuerpos secundarios (fig. 9a: anti-IgG1, fig. 9b: anti-IgG2, fig. 9c: anti-IgG3, fig. 9d: anti-IgG4, fig. 9e: anti-IgA, fig. 9f: anti-IgM, anticuerpos secundarios).

La Fig. 10 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con diferentes anticuerpos policlonales purificados por afinidad como anticuerpos anti-ADAMTS13 (fig. 10a: anticuerpo K1-4, fig. 10b: anticuerpo K1-10 purificado por afinidad, fig. 10c: anticuerpo K1-10 no purificado por afinidad).

La Fig. 11 muestra los resultados de un inmunoensayo anti-IgG4 que usa diferentes anticuerpos anti-ADAMTS13 no purificados por afinidad (a) y purificados por afinidad (b).

La Fig. 12 muestra los resultados de un inmunoensayo de anticuerpo anti-IgA contra inmunoglobulinas de subtipo IgG1-4, IgA e IgM.

La Fig. 13 muestra los resultados de un inmunoensayo que ilustra la especificidad por subtipo de inmunoglobulina de anticuerpos secundarios no espedficos de subtipo y espedficos anti-IgG.

La Fig. 14 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos secundarios anti-IgG humana no espedficos de subtipo usando diferentes muestras (fig. 14a: plasma de PTT enriquecido con ADAMTS13 recombinante; fig. 14b: plasma de PTT).

La Fig. 15 muestra los resultados de inmunoensayos que ilustran la especificidad de subtipo de inmunoglobulina de anticuerpos secundarios de raton no espedficos de subtipo y espedficos anti-IgG humana.

La Fig. 16 muestra los resultados de un inmunoensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos secundarios no espedficos de subtipo anti-IgG humana usando diferentes muestras (fig. 16a: plasma de PTT enriquecido con ADAMTS13r; fig. 16b: plasma de PTT).

La Fig. 17 muestra los resultados de un inmunoensayo para la determinacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 en muestras de PTT y una muestra de control sana combinada (NHP) a diferentes concentraciones salinas para anticuerpos espedficos de clase y subtipo seleccionados (a: IgG1, b: IgG2, c: IgG3, d: IgG4, e: IgA, f: IgM).

La Fig. 18 muestra los resultados de inmunoensayos de complejo inmunitario de ADAMTS13 de muestras de plasma individuales de pacientes de PTT usando anticuerpos espedficos de clase de Ig y subtipo (a: IgG1, b: IgG2, c: IgG3, d: IgG4, e: IgA, f: IgM).

La Fig. 19 muestra los resultados de un inmunoensayo para la determinacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 en una muestra de PTT y una muestra de control sana combinada a diferentes concentraciones salinas usando un anticuerpo secundario anti-IgG1 humana (Fitzgerald). (a: dilucion 1:32.000, b: dilucion 1:64.000).

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La Fig. 20 muestra los resultados de un inmunoensayo para la determinacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 en una muestra de PTT y una muestra de control sana combinada a diferentes concentraciones salinas para dos anticuerpos secundarios anti-IgG4 humana. (a: dilucion 1:32.000, anticuerpo de Invitrogen; b: dilucion 1:2.000, anticuerpo de AbD Serotech).

La Fig. 21 muestra los resultados de ensayos de reactividad cruzada para un anticuerpo secundario anti-IgG1 humana (Fitzgerald). (a: dilucion 1:16.000; b:dilucion 1:32.000; c: dilucion 1:64.000).

La Fig. 22 muestra los resultados de ensayos de reactividad cruzada para dos anticuerpos secundarios anti-IgG4 humana (a: placa 1, b: placa 2).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona un procedimiento de deteccion de anticuerpos con especificidad por ADAMTS13, una proteasa de escision del factor de von Willebrand (VWF), en complejos inmunitarios con ADAMTS13. Ademas, se contempla la deteccion de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres en una muestra sin ADAMTS13 complejada. La deteccion de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres puede combinarse con la deteccion de complejos inmunitarios de ADAMTS13, en particular para determinar la relacion de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres y complejados en una muestra, lo que tiene importancia de diagnostico. En una realizacion adicional, se contempla la deteccion de ADAMTS13 libre o la determinacion de la actividad de ADAMTS13 en una muestra. La deteccion de ADAMTS13 libre y/o la determinacion de la actividad de ADAMTS13 pueden combinarse con la deteccion de complejos inmunitarios de ADAMTS13, en particular para determinar la relacion de ADAMTS13 libre y complejada o la relacion entre la actividad de ADAMTS13 y la ADAMTS13 complejada en una muestra.

Se dan a conocer proteasas de escision de VWF (VWF-cp, EC 3.4.24.87) en los documentos WO 1997/041206, WO 2002/042441 y wO 2004/095027. Se hace especial referencia a las secuencias de la proteasa de escision de VWF ADAMTS13 o fragmentos de la misma como se dan a conocer en el documento WO 02/42441. Con fines de la invencion, pueden adquirirse comercialmente ADAMTS13 derivada de plasma o recombinante, o fragmentos de la misma, u obtenerse como se da a conocer en estas referencias. Las secuencias de ADAMTS13 se dan a conocer adicionalmente en la entrada Q76LX8 de la base de datos UniProt y en la entrada AAL11095.1 de la base de datos NCBI GenBank. "ADAMTS13", como se usa en la presente memoria, hace referencia a VWF-cp y polipeptidos de las secuencias anteriormente mencionadas, asf como a isoformas, polimorfismos, fragmentos, variantes y otras formas mutantes de las mismas que sean inmunologicamente indistinguibles de la ADAMTS13 de tipo silvestre. En particular, las isoformas de ADAMTS13, polimorfismos, fragmentos, variantes y otras formas mutantes de los mismos comprenden un epftopo de ADAMTS13 reconocido por el anticuerpo anti-ADAMTS13 o la unidad de union a ADAMTS13.

El termino “epftopo” define cualquier region de una molecula que pueda reconocerse por un anticuerpo espedfico o que provoque la formacion de esos anticuerpos espedficos. Los epftopos pueden ser epftopos conformacionales (compuestos por porciones no secuenciales de una molecula polimerica o compleja) o pueden ser epftopos lineales.

Las unidades de union a ADAMTS13 o unidades de union a anticuerpo son anticuerpos que comprenden un dominio de union a una diana dada (ADAMTS13 o un anticuerpo).

El termino “dominio de union” caracteriza con respecto a la presente invencion un dominio de una unidad de union que se une espedficamente a/interacciona con una estructura/epftopo diana dado. Por tanto, el dominio de union es un “sitio de interaccion con diana”. El termino “sitio de interaccion con diana” define, de acuerdo con la presente invencion, un motivo que es capaz de interaccionar espedficamente con una diana espedfica o con un grupo espedfico de dianas. Dicha union/interaccion se entiende tambien que define un “reconocimiento espedfico”. El termino “reconocer espedficamente” significa de acuerdo con esta invencion que la unidad de union es capaz de interaccionar espedficamente con y/o unirse a al menos 2, 3, 4, 5, 6 o mas aminoacidos de una diana. Dicha union puede ejemplificarse por la especificidad de un “principio de cerradura y llave”. Por tanto, los motivos espedficos en la secuencia aminoaddica del dominio de union y la diana se unen entre sf como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria, asf como como resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. La interaccion espedfica de un sitio de interaccion con diana con su diana espedfica puede dar como resultado tambien una union sencilla de dicho sitio a la diana.

La unidad de union de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo anti- inmunoglobulina o un anticuerpo anti-ADAMTS13. La unidad de union puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal o derivar de un anticuerpo monoclonal o policlonal. El termino “anticuerpo” comprende derivados o fragmentos funcionales del mismo que sigan reteniendo la especificidad de union. La definicion del termino “anticuerpo” incluye tambien realizaciones tales como anticuerpos quimericos, monocatenarios y humanizados, asf como fragmentos de anticuerpos tales como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados de los mismos comprenden ademas fragmentos F(ab')2, Fv, scFv o anticuerpos de un unico dominio, anticuerpos de un unico dominio variable o un unico dominio variable de inmunoglobulina que comprende simplemente un dominio variable, que podna ser VH o VL, que se une espedficamente a una diana o epftopo independientemente de las

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demas regiones o dominios V. Dicho dominio variable unico de inmunoglobulina engloba no solo un polipeptido de dominio variable unico de anticuerpo aislado, sino tambien polipeptidos mayores que comprenden uno o mas monomeros de una secuencia polipeptfdica de dominio variable unico de anticuerpo.

En realizaciones preferidas, la unidad de union tiene una alta afinidad de union por la diana (en particular ADAMTS13 o el anticuerpo). Una alta afinidad de union distingue la union espedfica de cualquier forma de union no espedfica. En particular, la alta afinidad de union se caracteriza por una alta constante de disociacion en equilibrio (KD), especialmente a 22 °C, por debajo de 10"3 M, por debajo de 10"4 M, por debajo de 10"5 M, por debajo de 10"6 M, por debajo de 10"7 M, por debajo de 10"8 M o incluso por debajo de 10"9 M.

La presente invencion proporciona un procedimiento de deteccion o determinacion de los complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 (a los que se hace tambien referencia en la presente memoria como complejos inmunitarios de ADAMTS13) en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con una unidad de union a ADAMTS13, que es un anticuerpo anti-ADAMTS13, poner en contacto dicha muestra con una unidad de union a anticuerpo, a saber un anticuerpo anti-anticuerpo, y detectar dichos complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 unidos a dicha unidad de union a ADAMTS13 y a dicha unidad de union a ADAMTS13. “Determinar” puede incluir cuantificar.

La presente invencion describe tambien un procedimiento de deteccion o determinacion de anticuerpos anti- ADAMTS13 en una muestra, que comprende preferiblemente unir dichos anticuerpos anti-ADAMTS13 a ADAMTS13 o un fragmento del mismo y detectar dichos anticuerpos anti-ADAMTS13 unidos a ADAMTS13 o a dicho fragmento con unidades de union a anticuerpo espedficas de dichos anticuerpos anti-ADAMTS13. Este procedimiento se combina con el procedimiento de deteccion o determinacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13, en particular para determinar la relacion de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres y conjugados en la muestra. Por tanto, la presente invencion proporciona ademas un procedimiento para detectar o determinar, junto con complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTsi3, los anticuerpos anti-ADAMTS13 contra ADAMTSl3 o un fragmento del mismo y detectar dichos anticuerpos anti-ADAMTS13 unidos a ADAMTS13 o dicho fragmento con unidades de union a anticuerpo espedficas de dichos anticuerpos anti-ADAMTS13.

Se contemplan tambien procedimientos de deteccion o determinacion de ADAMTS13 en una muestra. Dicho procedimiento puede comprender las etapas de unir dicha ADAMTS13 de la muestra a una unidad de union a ADAMTS13, que es un anticuerpo anti-ADAMTS13, y detectar dicha ADAMTS13 unida. Para la etapa de deteccion, es posible usar una segunda unidad de union a ADAMTS13 que este marcada. Este procedimiento puede combinarse con el procedimiento de la invencion de deteccion o determinacion de los complejos inmunitarios de ADAMTS13 para determinar la relacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 a ADAMTS13 libre.

Se contemplan tambien procedimientos de deteccion de la actividad de ADAMTS13 en una muestra. Dichos procedimientos pueden comprender las etapas de poner en contacto la ADAMTS13 en dicha muestra con un sustrato de ADAMTS13 y detectar los productos de escision de VWF o un sustrato peptfdico menor, p.ej., mediante deteccion del marcaje fluorescente tras la escision de un apagador en el sustrato. La puesta en contacto puede efectuarse en condiciones en que la ADAMTS13 sea activa para la escision del sustrato. Dichas condiciones pueden seleccionarse por un especialista en la materia, tales como condiciones fisiologicas. ADAMTS13 escinde el enlace peptfdico entre Tyr1605 y Met1606 de VWF (Plaimauer et aI., 2002) o entre Tyr842 y Met843 en el dominio A2 de VWF maduro (documento WO 97/041206). Es un sustrato adecuado de ADaMtS13 el VWF o un polipeptido que comprende un fragmento de VWF que comprende un enlace peptfdico escindible por ADAMTS13, tal como un polipeptido que comprende Asp1596-Arg1668 de VWF (Wu, 2005). El sustrato puede modificarse, p.ej., para facilitar la inmovilizacion y/o marcaje del sustrato o los productos de escision como es conocido en la materia. Este procedimiento puede combinarse con el procedimiento de la invencion de deteccion o determinacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 para determinar la relacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 a actividad de ADAMTS13.

Los procedimientos de la invencion son para la deteccion o determinacion de complejos de ADAMTS13, anticuerpos anti-ADAMTS13 libres y/o ADAMTSl3 libre (o actividad de ADAMTS13) en una muestra que comprende potencialmente estos analitos. Los anticuerpos anti-ADAMTS13 “libres” haran referencia en la presente memoria a anticuerpos anti-ADAMTS13 que no estan unidos a ni complejados con su ligando antigenico, ADAMTS13. Igualmente, se entendera que ADAMTS13 “libre” hace referencia a ADAMTS13 no complejada con un anticuerpo anti-ADAMTS13.

En realizaciones favorables de los procedimientos de la invencion, las unidades de union a anticuerpo son espedficas de subtipo de anticuerpo o clase de anticuerpo. “Subtipo de anticuerpo” significa que las unidades de union al anticuerpo tienen una preferencia distintiva por unirse a anticuerpos de un subtipo particular, con poca o ninguna union con anticuerpos de otros subtipos (reactividad cruzada de subtipo). Igualmente, “espedfico de clase de anticuerpo” significa que las unidades de union a anticuerpo tienen una preferencia distintiva por unirse a anticuerpos de una clase particular, con poca o ninguna union a anticuerpos de otras clases (reactividad cruzada de clase). En realizaciones preferidas particulares, se usan unidades de union a anticuerpo con menos de un 25 %, menos de un 20 %, menos de un 15 %, menos de un 13 %, menos de un 10 %, menos de un 9 %, menos de un

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Las clases de anticuerpo ejemplares se seleccionan de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Las clases de anticuerpo pueden dividirse ademas en subtipos, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (subtipos humanos). En realizaciones preferidas particulares, la especificidad de subtipo de los anticuerpos usados segun la presente invencion es por IgG1, IgG3 o IgG4, en realizaciones especiales tambien por IgG2; cada una con las bajas reactividades cruzadas mencionadas anteriormente con los otros subtipos respectivos. Los anticuerpos espedficos de subtipo son tambien habitualmente anticuerpos espedficos de clase. Por otro lado, los anticuerpo espedficos de clase pueden ser o no espedficos de subtipo. En realizaciones preferidas, los anticuerpos espedficos de clase se seleccionan de anticuerpos espedficos de IgG o IgM, en realizaciones adicionales tambien de IgA, IgD, IgE; cada uno con la baja reactividad cruzada mencionada anteriormente con las otras clases respectivas.

La unidad de union a anticuerpo puede ser espedfica de ciertos dominios del anticuerpo diana, tal como la parte Fc del anticuerpo diana. Habitualmente, este dominio es distintivo de la clase o subtipo de anticuerpo, como las cadenas gamma o mu de los anticuerpos.

Las unidades de union a ADAMTS13 pueden ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En ambos casos, pero especialmente para anticuerpos policlonales, es favorable usar anticuerpos purificados por inmunidad o afinidad. La purificacion por inmunidad o afinidad puede conseguirse poniendo en contacto la unidad de union a ADAMTS13, o generalmente cualquier unidad de union, con su diana, tal como ADAMTS13, y seleccionando las unidades de union a ADAMTS13 que se unan a dicha diana. La purificacion por inmunidad o afinidad se efectua preferiblemente mediante inmovilizacion selectiva de las unidades de union, tal como en fase solida como una perla o una columna, y aislando las unidades de union unidas, tal como por elucion de la columna despues del lavado. Las unidades de union pueden inmovilizarse selectivamente inmovilizando en primer lugar la diana y uniendo entonces la unidad de union a dicha diana inmovilizada. La purificacion por inmunidad o afinidad puede dar como resultado unidades de union con menos especificidad por cualquier otra diana, rebajando las reactividades cruzadas. Como se demuestra en los ejemplos, el uso de anticuerpos policlonales no purificados por afinidad da como resultados ensayos con menos especificidad y sensibilidad que los materiales purificados por afinidad cuando se usan en la deteccion de un complejo de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13. Los anticuerpos policlonales estan habitualmente disponibles como mezclas de anticuerpos. Dichas mezclas de anticuerpos policlonales pueden contener solo hasta un 10 % o ligeramente mas anticuerpos espedficos de una diana dada, p.ej. ADAMTS13. En realizaciones preferidas, las unidades de union a ADAMTS13, especialmente en el caso de anticuerpos, se proporcionan en forma purificada en la que al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o incluso un 100 % de las unidades de union o anticuerpos (especialmente anticuerpos policlonales) se unen a ADAMTS13 o son espedficos de ADAMTS13.

Los procedimientos de la invencion estan basados en un mecanismo de union de dos componentes, los anticuerpos anti-ADAMTS13 de la diana se unen a 1) ADAMTS13 o, si estan ya unidos a ADAMTS13, a una unidad de union a ADAMTS13 que es un anticuerpo anti-ADAMTS13 y 2) a una unidad de union a anticuerpo, a saber un anticuerpo anti-anticuerpo. Las etapas 1) y 2) pueden efectuarse en cualquier orden, primero 1) y luego 2) o primero 2) y luego 1), o simultaneamente. En realizaciones preferidas, los agentes de la etapa 1), concretamente ADAMTS13 o la unidad de union a ADAMTS13, pueden inmovilizarse en una fase solida o el agente de la etapa 2), la unidad de union a anticuerpo, puede inmovilizarse en una fase solida. Poner en contacto la muestra con los agentes inmovilizados conduce a la inmovilizacion de los anticuerpos anti-ADAMTS13 o complejos inmunitarios de la muestra. Los anticuerpos anti-ADAMTS13 o complejos inmunitarios inmovilizados pueden manejarse facilmente y purificarse por etapas de lavado.

El termino “fase solida” no implica ninguna limitacion espedfica y se refiere, por ejemplo, a un material polimerico insoluble que puede ser un polfmero organico, tal como una poliamida o un polfmero vimlico (p.ej., poli(met)acrilato, poliestireno y polivinilalcohol o derivados de los mismos), un polfmero natural tal como celulosa, dextrano, agarosa, quitina y poliaminoacidos, o un polfmero inorganico tal como vidrio o hidroxido metalico. La fase solida puede estar en forma de un microportador, partfculas, membranas, tiras, papel, pelfcula, perlas o placas tales como placas de microvaloracion. Los agentes inmovilizados pueden inmovilizarse en la fase solida directamente por acoplamiento covalente o a traves de un portador, tal como una molecula ligadora o un anticuerpo inmovilizado en la fase solida.

En realizaciones adicionales, pueden marcarse los agentes de la etapa 1), concretamente ADAMTS13 o la unidad de union a ADAMTS13, o el agente de la etapa 2), la unidad de union a anticuerpo. Poner en contacto la muestra con los agentes marcados permite la generacion de una senal dependiente de los anticuerpos anti-ADAMTS13 originalmente presentes en la muestra. La combinacion de etapas 1) y 2) con un agente que se inmoviliza y otro que se marca significa que la senal creada por sustancias inmovilizadas depende unicamente de la presencia de anticuerpos anti-ADAMTS13. En realizaciones preferidas particulares, se marca la unidad de union a anticuerpo y se

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inmoviliza la unidad de union a ADAMTS13 o ADAMTS13. El marcaje puede ser un marcaje fluorogenico, cromogenico, radiactivo o enzimatico.

El complejo de ADAMTS13/unidades de union a ADAMTS13 con anticuerpos anti-ADAMTS13/complejos inmunitarios y unidades de union a anticuerpo puede detectarse mediante procedimientos bien conocidos en la materia, p.ej. mediante deteccion de un marcaje. El procedimiento de deteccion puede seleccionarse del grupo consistente en un ensayo enzimatico, un ensayo cromogenico, un ensayo luminogenico, un ensayo fluorogenico y un radioinmunoensayo. Las condiciones de reaccion para efectuar la deteccion de la formacion del complejo anticuerpo/antigeno dependen del procedimiento de deteccion seleccionado. Esta dentro del conocimiento del especialista en la materia elegir los parametros optimos, tales como sistema de tampon, temperatura y pH, para usar en el sistema de deteccion respectivo.

Es tambien posible un mecanismo de union de dos componentes para procedimientos de deteccion de ADAMTS13 libre. La ADAMTS13 puede unirse a 1) una primera unidad de union a ADAMTS13, que puede inmovilizarse en un soporte solido y 2) a una segunda unidad de union a ADAMTS13, que puede marcarse.

En realizaciones preferidas, la muestra se obtiene de un mairnfero, especialmente de un ser humano. La unidad de union a anticuerpo debena reconocer anticuerpos del mismo organismo, tales como anticuerpos humanos. La deteccion o determinacion de complejo inmunitario de ADAMTS13, opcionalmente tambien de anticuerpos anti- ADAMTS13 libres y/o de ADAMTS13 libre o actividad de ADAMTS13, pueden efectuarse con dilucion, incluyendo una dilucion gradual, de la muestra con un diluyente, p.ej. 1:1, 1:2, 2:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:75, 1:100, 1:150, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:1.000 o mas, incluyendo cualquier intervalo dentro de estas diluciones. Las muestras pueden diluirse con cualquier diluyente inerte, incluyendo agua, tampones o muestras sericas negativas de analito (complejo inmunitario de ADAMTS13, anticuerpos anti- ADAMTS13 libres, ADAMTS13 libre). La dilucion gradual puede efectuarse con 2, 3, 4, 5, 6 o mas diluciones diferentes.

El termino “muestra” como se usa en la presente memoria pretende incluir un fluido biologico tal como sangre, plasma o tejido de un paciente. El paciente puede ser un paciente humano. La muestra puede obtenerse en particular de pacientes sospechosos de tener un trastorno asociado a la aparicion de anticuerpos anti-ADAMTS13. En particular, la muestra puede obtenerse a partir de un paciente que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad asociada a disfuncion o deficiencia de ADAMTS13, tal como PTT. En realizaciones adicionales, el paciente puede recibir una terapia de sustitucion de ADAMTS13, tal como por administracion de ADAMTS13 derivada de plasma o recombinante o infusion de plasma o terapia de plasmaferesis.

Puede usarse como control negativo una muestra conocida por no comprender un anticuerpo anti-ADAMTS13, p.ej. plasma humano normal. Puede usarse un control negativo como comparacion con una muestra de interes. Dicha comparacion puede incluirse para cuantificar los anticuerpos anti-ADAMTS13 en una muestra de interes, para ajustar o correlacionar los valores de senal de un procedimiento de deteccion para determinar los valores de blanco. En ciertas realizaciones, se usa la relacion de senal de una muestra de interes a un control negativo.

En realizaciones preferidas, la reaccion de union de los complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13 de la muestra a unidades de union a ADAMTS13 y/o la etapa de union de los anticuerpos anti-ADAMTS13 o de los complejos inmunitarios de la muestra a las unidades de union a anticuerpo y/o la etapa de deteccion estan en condiciones de fuerza ionica de al menos 0,1 M, al menos 0,2 M, al menos 0,3 M, al menos 0,4 M, al menos 0,5 M, al menos 0,6 M, al menos 0,7 M, al menos 0,8 M, al menos 0,9 M, al menos 1,0 M o mas. La fuerza ionica de una solucion es funcion de la concentracion de todos los iones presentes en esa solucion:

en que ci es la concentracion molar del ion i, zi es el numero de cargas de ese ion y se hace la suma de todos los iones en la solucion. En realizaciones preferidas, I representa la fuerza ionica de solo los iones salinos de dicha solucion, especialmente los iones seleccionados de Li , Na , K , Mg , Ca , NH4 y Cl', I', PO4', SO4', CO3', en particular iones salinos monovalentes o divalentes. En realizaciones especialmente preferidas, la concentracion salina de NaCl es de al menos 0,1 M, al menos 0,2 M, al menos 0,3 M, al menos 0,4 M, al menos 0,5 M, al menos 0,6 M, al menos 0,7 M, al menos 0,8 M, al menos 0,9 M, al menos 1,0 M o mas. Dicha alta fuerza ionica de las condiciones de alta salinidad es especialmente preferible para usar los anticuerpos espedficos de subtipo IgG4, IgG3, IgA o IgM o de clase como restos de union a anticuerpo. La alta fuerza ionica o concentracion salina es tambien aceptable para anticuerpos espedficos de IgG1 como restos de union a anticuerpo. Como alternativa, o ademas de ello, la fuerza ionica o concentracion salina (NaCl) en todas las reacciones anteriores puede ser menor o igual a 0,1 M, menor o igual a 0,2 M, menor o igual a 0,3 M, menor o igual a 0,4 M, menor o igual a 0,5 M, menor o igual a 0,6 M, menor o igual a 0,7 M, menor o igual a 0,8 M, menor o igual a 0,9 Mo menor o igual a 1,0 M. Se encontro que, en condiciones de baja fuerza ionica, pueden observarse senales mayores, sin embargo tambien el valor de blanco de muestras negativas de anticuerpo anti-ADAMTS13 era mayor, lo que podfa reducir la eficacia. No obstante, para situaciones cuando, p.ej., se usan anticuerpos espedficos de IgG1 como restos de union a anticuerpo o en muestras de baja senal, puede ser beneficiosa una baja fuerza ionica o condiciones de baja salinidad. Dicha

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baja fuerza ionica o concentracion salina puede ser tambien aceptable para anticuerpos espedficos de subtipo IgG4, IgG3, IgA o IgM o de clase como restos de union a anticuerpo.

En un aspecto adicional, la presente memoria descriptiva proporciona un kit que comprende una unidad de union a ADAMTS13 y/o una unidad de union a anticuerpo y/o tampones de una fuerza ionica mayor y/o menor a como se describe anteriormente. Ademas, se proporciona un kit que comprende ADAMTS13 o un fragmento de la misma y al menos una unidad de union a anticuerpo. Un kit puede comprender ademas uno o mas del grupo de ADAMTS13 o un fragmento de la misma y un sustrato de ADAMTS13. La unidad de union a anticuerpo puede ser espedfica del subtipo de anticuerpo como se describe anteriormente. Los kits pueden usarse en los procedimientos anteriormente descritos. Puede inmovilizarse cualquier componente de los kits en una fase solida tal como pocillos de placa de microvaloracion. La unidad de union a ADAMTS13/ADAMTS13 o la unidad de union a anticuerpo pueden inmovilizarse en la fase solida separadamente en puntos diferentes, p.ej., en pocillos diferentes de una placa de microvaloracion, en la que esta contenido tfpicamente en un punto un agente definido tal como ADAMTS13/unidades de union a ADAMTS13.

La unidad de union a anticuerpo y/o ADAMTS13/unidades de union a ADAMTS13 como se especifican anteriormente pueden marcarse. El marcaje puede ser un marcaje fluorogenico, cromogenico, radiactivo o enzimatico. Los kits pueden comprender ademas aditivos, diluyentes, reactivos de deteccion, soluciones de lavado y/o tampones (tampones PBS, PBS-T, Tris, acetato o fosfato) que tienen diversos valores de pH y fuerzas ionicas, solubilizantes tales como Tween o polisorbato, portadores tales como seroalbumina humana o gelatina, conservantes tales como timerosal o alcohol bendlico y antioxidantes tales como acido ascorbico o metabisulfito de sodio, y/o muestras sericas de control negativo. La seleccion de una composicion de kit particular dependera de una serie de factores, incluyendo la muestra que se este usando.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento de diagnostico de una enfermedad, o predisposicion a una enfermedad, asociada a disfuncion o deficiencia de ADAMTS13 en un paciente, que comprende obtener una muestra de un paciente y detectar los anticuerpos anti-ADAMTS13 o complejos inmunitarios en dicha muestra segun el procedimiento de la invencion descrito en la presente memoria. La enfermedad puede ser PTT, especialmente PTT adquirida. “Disfuncion de ADAMTS13” o “deficiencia de ADAMTS13” se refieren en particular a la perdida de la funcion de ADAMTS13 debido a la presencia de anticuerpos orientados a ADAMTS13 y la formacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 en el paciente. Dichos anticuerpos orientados a ADAMTS13 pueden ser anticuerpos inhibidores o anticuerpos no neutralizantes. Como consecuencia, la actividad y/o concentracion de ADAMTS13 puede reducirse en dicho paciente. El resultado directo de la disfuncion de ADAMTS13 puede ser la causa de ciertas clases de enfermedades asociadas a ADAMTS13, tales como PTT asociada a deficiencia de ADAMTS13, y puede ser el parametro de diagnostico para diagnosticar o predecir dichas enfermedades. “Predecir una enfermedad” o “diagnosticar una predisposicion”, como se usan en la presente memoria, no se entendera en un sentido absoluto en el que en todos los casos se desarrollara una enfermedad, sino como un riesgo relativo aumentado de que el paciente desarrolle una enfermedad. Los procedimientos de la invencion pueden usarse tambien para detectar la formacion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 durante la terapia de un paciente que padece una disfuncion o deficiencia de aDaMtS13, especialmente durante una terapia de sustitucion enzimatica con ADAMTS13.

El procedimiento de la invencion de deteccion de complejos inmunitarios de ADAMTS13 en una muestra de un paciente puede combinarse con procedimientos de deteccion de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres o procedimientos de deteccion de ADAMTS13 libre o de determinacion de la actividad de ADAMTS13. La determinacion de la relacion o correlacion entre las cantidades de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres y complejos inmunitarios de ADAMTS13, o la relacion o correlacion entre las cantidades de ADAMTS13 libre/actividad de ADAMTS13 y complejos inmunitarios de ADAMTS13, puede ser de valor de diagnostico particular en el diagnostico o prediccion de ciertas enfermedades o en la monitorizacion de una terapia.

Las enfermedades asociadas a ADAMTS13 ejemplares incluyen PTT (purpura trombocitopenica trombotica) en particular PTT adquirida, y smdrome de Upshaw-Schulman (PTT hereditaria). En la PTT adquirida, los pacientes tienen una baja actividad de ADAMTS13 debido al desarrollo de anticuerpos autoinmunitarios dirigidos a ADAMTS13. La ADAMTS13 inmunocomplejada se inactiva, neutraliza y/o elimina de la corriente sangumea y el plasma del paciente. Una actividad de ADAMTS13 reducida conduce a la acumulacion de grandes multfmeros de VWF no escindidos que pueden adherirse espontaneamente a las plaquetas y conducir a trombos ricos en plaquetas-VWF en la microcirculacion. La presencia de anticuerpos anti-ADAMTS13 es el marcador de diagnostico principal para diagnosticar PTT adquirida. Este marcador puede usarse para distinguir a PTT adquirida de la PTT hereditaria, que es una falta congenita de protema ADAMTS13 funcional. La relacion de complejos inmunitarios a anticuerpos anti-ADAMTS13 libres proporciona informacion adicional de la gravedad de la enfermedad y del posible resultado de tratamiento. Puede observarse una relacion inversa entre anticuerpos libres y complejos inmunitarios. En la forma leve de la enfermedad, o incluso en pacientes sanos con predisposicion hacia la enfermedad, pueden detectarse algunos complejos inmunitarios, pero se observara poca o ninguna cantidad de anticuerpos anti- ADAMTS13 libres. La ADAMTS13 libre o actividad de ADAMTS13 pueden seguir observandose en muestras de sangre de dichos pacientes. A medida que progresa la enfermedad, se volvera detectable una cantidad de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres y puede aumentar ademas con relacion a la cantidad de complejos inmunitarios.

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Dicho exceso de anticuerpos anti-ADAMTS13 libres puede indicar formas graves de la enfermedad. El conocimiento de los anticuerpos anti-ADAMTS13 libres puede ser ademas de importancia para adaptar una terapia de sustitucion, ya que un exceso de anticuerpos libres puede reducir o disminuir el efecto de la ADAMTS13 administrada. Por lo tanto, pueden requerirse dosis mayores.

Los pacientes con smdrome de Upshaw-Schulman (PTT hereditaria) padecen una mutacion en el gen de ADAMTS13 y no expresan ADAMTS13 activa. La formacion de aloanticuerpos anti-ADAMTS13 y complejos inmunitarios de ADAMTS13 puede ser el resultado consecuencia de la administracion de ADAMTS13, una sustancia extrana para estos pacientes sin tolerancia a ADAMTS13. El procedimiento de la invencion es de particular importancia para monitorizar una terapia en estos pacientes, de forma similar a como se describe anteriormente para PTT.

La informacion sobre la cantidad de complejos inmunitarios, especialmente con relacion a los anticuerpos anti- ADAMTS13 libres o ADAMTS13 libre/actividad de ADAMTS13, puede proporcionar informacion adicional sobre smtomas secundarios en un paciente. Los pacientes de PTT pueden padecer insuficiencia renal. La insuficiencia renal a su vez puede reducir la eliminacion de los complejos inmunitarios de ADAMTS13 en circulacion, dando como resultado una acumulacion aumentada de complejo en muestras de sangre o plasma. Las cantidades aumentadas de complejo inmunitario, especialmente con relacion a los anticuerpos anti-ADMTS13 libres o ADAMTS13 libre/actividad de ADAMTS13, indican una reaccion inflamatoria aumentada en el paciente, que puede incluso dar como resultado un choque inflamatorio. Para dichos pacientes, puede requerirse terapia antiinflamatoria.

Las enfermedades asociadas a disfuncion o deficiencia de ADAMTS13 como PTT adquirida pueden ser enfermedades remitentes con una carga de complejo inmunitario de ADAMTS13 fluctuante durante la progresion de la enfermedad. Por lo tanto, el procedimiento de la invencion puede usarse para monitorizar rutinariamente en un paciente la presencia de complejos inmunitarios y anticuerpos anti-ADAMTS13 libres o complejos inmunitarios solos. Las determinaciones repetidas pueden ser diarias o cada 2 dfas, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses o mas o intervalos mas cortos. El procedimiento de la invencion puede usarse tambien para monitorizar la presencia de anticuerpos anti-ADAMTS13 o complejos inmunitarios durante el tratamiento para reconocer la progresion o reacciones adversas. Un tratamiento puede incluir una terapia de sustitucion de ADAMTS13, especialmente la administracion de ADAMTS13 a dicho paciente. Puede administrarse ADAMTS13 en forma de una infusion de plasma (p.ej., de plasma reciente o congelado), plasmaferesis o tratamiento con un medicamento que contiene ADAMTS13 recombinante o derivado de plasma. En dichos procedimientos de diagnostico o monitorizacion, puede determinarse la relacion de anti-ADAMTsl3 libre a anti-ADAMTS13 en CIC.

Ejemplos

La presente invencion se ilustra ademas por los siguientes ejemplos, sin embargo sin estar limitada a estas realizaciones. Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en la presente memoria son solo con fines ilustrativos.

Ejemplo 1: ADAMTS13 recombinante (ADAMTS13r)

Se expreso ADAMTS13 humana recombinante con y sin marcaje de His en celulas de rinon embrionario humano (HEK293) o en celulas de ovario de hamster chino (CHO), p.ej. el clon 938, como se describe en (Plaimauer, 2002; WO2004/095027; WO02/42442). Se construyo una ADAMTS13 marcada con His C-terminal mediante la fusion en fase de 6 residuos de histidina y 3 de glicina como ligador con el residuo de residuo de treonina C-terminal (Thr- 1427) de ADAMTS13 completa.

Ejemplo 2: Anticuerpos anti-ADAMTS13

Se adquirieron anticuerpos policlonales anti-ADAMTS13 (Abcam, ab28273) o se produjeron por inmunizacion de conejos: se inmunizaron de 1 a 10 conejos blancos de Nueva Zelanda con ADAMTS13r segun el ejemplo 1. La solucion de inyeccion de 200 pl consistfa en 100 pl de solucion tampon (860 |jg de ADAMTS13r en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, 0,05 % de Tween 80, 2 % de sacarosa, CaCh 2 mM, pH 7,0) y 100 pl de coadyuvante (coadyuvante completo de Freund, CFA, para inmunizacion de sensibilizacion; coadyuvante incompleto de Freund, IFA, para inmunizaciones de refuerzo). A intervalos de 3 semanas, se administraron por via subcutanea una inmunizacion de sensibilizacion y dos de refuerzo en 2-4 puntos sobre los muslos. Se extrajo sangre 3 semanas despues del primer refuerzo y 2 y 3 semanas despues del segundo refuerzo.

Se produjeron tres lotes diferentes, lote “K1-4” originario de sueros combinados de 4 conejos inmunizados con ADAMTS13r marcada con His, lote “K6” originario del suero de un conejo inmunizado con ADAMTS13r marcada con His y lote “K1-10” originario de sueros combinados de 10 conejos inmunizados con ADAMT13r.

Se adquirieron los anticuerpos monoclonales anti-ADAMTS13 en American Diagnostica (clones de anticuerpo 5.1 y 12.1) o de Hycultbiotechnology (anticuerpo 5C11).

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Se purificaron ademas los anticuerpos en una columna de protema G-Sepharose: se centrifugaron los sueros inmunitarios durante 10 min a 13.000 rpm y se diluyeron cada 10 ml de sobrenadante con 20 ml de PBS. Se almaceno el suero en estas condiciones a 4 °C. Se purificaron todos los sueros de anticuerpo anti-ADAMTS13 por elucion en una columna de protema G. Se realizaron todas las etapas de purificacion en un sistema cromatografico AktaExplorer 100. Se relleno con protema G-Sepharose una columna y se equilibro con PBS, pH 7,1. Se cargaron los sueros en la columna y se lavaron con tampon PBS. Se efectuo la elucion con tampon de elucion (glicina 100 mM, pH 2,8). Se recogieron las fracciones de anticuerpos eluidas y se almacenaron a -20 °C para uso posterior.

Ejemplo 3: Purificacion por afinidad de anticuerpos anti-ADAMTS13

Se acoplo ADAMTS13r segun el ejemplo 1 con Sepharose activada con NHS (Sepharose 4FF de GE Healthcare). Con este fin, se lavaron 25 ml de Sepharose activada con NHS y se activaron con Hcl 1 mM, pH 3,3. Despues de la centrifugacion, se anadieron 25 ml de ADAMTS13r en tampon de acoplamiento (NaHCO3 100 mM, NaCl 500 mM, pH 8,3) y e incubo durante una noche a 4 °C. Se centrifugo la Sepharose, se lavo y se incubo durante 2 h con tampon de bloqueo (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5) a temperatura ambiente. Se pasa posteriormente el gel de Sepharose a una columna, que se relleno y se lavo entonces con tampon de acoplamiento. Las etapas de lavado adicionales de la columna inclman 3 ciclos de lavado con tampon de bloqueo y tampon acetato (acetato, pH 4,5).

Despues de la purificacion en una columna de protema G, se cargaron anticuerpos anti-ADAMTS13 segun el ejemplo 2 en la columna de Sepharose activada con ADAMTS13r-NHS y se lavaron con tampon de equilibrado en presencia de Zn2+ y Ca2+ (TBS, pH 8,4). Se eluyeron los anticuerpos purificados con tampon de elucion 1 (glicina 100 mM, pH 2,8) y tampon de elucion 2 (NaCl 2 M, glicina 100 mM, 50 % de etilenglicol, pH 5) y se recogieron. Se recuperaron 11 mg de anticuerpo purificado por afinidad a partir de 40 mg de anticuerpo purificado por Sepharose despues de purificacion por afinidad.

Ejemplo 4: Anticuerpos anti-Ig

Se adquirieron los anticuerpos anti-inmunoglobulina (Ig) con especificidad de clase o subtipo de Ig.

Se adquirieron los anticuerpos de raton anti-IgG1 humana en Zymed; se adquirieron los anticuerpos de raton anti- IgG2 humana en Southern Biotech; se adquirieron los anticuerpos de raton anti-IgG3 humana en Zymed; se adquirieron los anticuerpos de raton anti-IgG4 humana en Zymed (Invitrogen); se adquirieron los anticuerpos anti- IgG humana en AbD Serotec; se adquirieron los anticuerpos de cabra anti-IgM humana en SIGMA y se adquirieron los anticuerpos de raton anti-IgA humana en SIGMA.

Se adquirieron ademas los anticuerpos de raton anti-IgG4-HRP humana en Alpha Diagnostics, ac 10124.

Para uso como anticuerpos secundarios, se adquirieron anticuerpos anti-Ig con marcaje de fosfatasa alcalina o marcaje de peroxidasa de rabano picante (HRP).

Ejemplo 5: Muestras de plasma

Se obtuvieron muestras de plasma de personas sanas como controles negativos (NHP, plasma humano normal combinado pobre en plaquetas de 35 donantes sanos diferentes, George King Bio-Medical, Inc.) y de pacientes diagnosticados con pTt adquirida. Se proporciono el plasma de PTT por el Vienna General Hospital. Se sometieron los pacientes de PTT en parte a terapia de plasmaferesis. El plasma puede obtenerse de muestras de sangre o de bolsas de plasmaferesis para monitorizar la reduccion del complejo inmunitario de ADAMTS13 durante la terapia. Como muestras de control positivas, se usaron muestras de sangre de pacientes de PTT.

Ejemplo 6: Deteccion de anticuerpo anti-ADAMTS13

Se recubrio ADAMTS13 recombinante segun el ejemplo 1 sobre placas ELISA (Maxisorp; Nunc, Rochester, NY) a una concentracion de 2 pg/ml mediante aplicacion de 100 pl por pocillo en tampon de recubrimiento (tampon de carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, Sigma). Se incubaron las placas a 4 °C durante una noche o durante 6 h a temperatura ambiente, seguido de lavado 4 veces con tampon de lavado (PBS) en volumenes de 300 pl por pocillo en un lavador de tiras y placas automatico. Se bloquearon los sitios de union libres con 250 pl por pocillo de tampon de bloqueo (T20 exento de protema (PBS), Pierce) e incubacion durante 2 h a temperatura ambiente. El bloqueo es seguido por lavado 4 veces con tampon de lavado (PBS) en volumenes de 300 pl por pocillo en un lavador de tiras y placas automatico. Se diluyeron en serie tanto las muestras de plasma como los controles de 1:25 a 1:6.400 en tampon de muestra (T20 exento de protema, Pierce, + NaCl 0,5 M), se aplicaron en cantidades de 100 pl/pocillo y se incubaron durante una noche a 4 °C o durante 3 horas a temperatura ambiente. La incubacion de muestras es seguida por lavado 4 veces con tampon de lavado (PBS) en volumenes de 300 pl por pocillo en un lavador de tiras y placas automatico. Se aplicaron los anticuerpos anti-inmunoglobulina marcados con HRP segun el ejemplo 4 a diluciones (anti-IgG1 1:2.000, anti-IgG2 1:500, anti-IgG3 1:3.000, anti-IgG4 1:3.000, anti-IgG 1:30.000, anti-IgM 1:30.000, anti-IgA 1:30.000) en tampon de muestra, aplicados en cantidades de 100 pl por pocillo, y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. La incubacion de anticuerpos es seguida por lavado 4 veces con tampon de

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lavado (PBS) en volumenes de 300 pl por pocillo en un lavador de tiras y placas automatico. Para la reaccion de HRP, se anadieron volumenes iguales de cada una de solucion de TMB y solucion de peroxido (kit Immuno Pure TMB Substrate, Pierce) a un volumen de sustrato total de 100 pl/pocillo y se incubaron durante 5-30 minutos a temperature ambiente. Son tiempos de desarrollo normales para diferentes anticuerpos secundarios: anti-IgG, 5-6 min, anti-IgM: 5-10 min, anti-IgA: 15-30 min, anti-IgG1 10-15 min, anti-IgG2 10-15 min, anti-IgG3 10-15 min, anti- IgG4 5-10min. Los cambios de color son de transparente a azul brillante, mientras que la reaccion debena detenerse antes de que ningun pocillo exhiba un color verde. Se detuvo la reaccion mediante la adicion de 100 pl de H2SO4 1,9. Se midio la reaccion de color a 450 nm frente a 620 nm en un lector de ELISA Tecan. Se calculan los resultados como la relacion entre la DO de la muestra y la DO del control.

Ejemplo7: Deteccion del complejo inmunitario de ADAMTS13

Se diluyeron anticuerpos anti-ADAMTS13 segun el ejemplo 2 o 3 a una concentracion de 1-2 pg/ml con tampon de recubrimiento (tampon carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, 25 °C) y se recubrieron sobre la superficie de placas ELISA (Maxisorp; Nunc. Rochester, NY) a un volumen de 100 pl/pocillo durante una noche a 4 °C o durante 5-6 horas a temperatura ambiente. Despues de lavar (4 veces con tampon de lavado: PBS (PBS, Invitrogen, 300 pl/pocillo)), se bloquearon los sitios de union libres durante 2 horas a temperatura ambiente con 250 pl/pocillo de tampon de bloqueo (PBS-T: PBS con 0,01 % de Tween 20, Biorad, con 0,5 % de leche desnatada desecada, pH 7,47,5, BioRad).

Se diluyeron las muestras en tampon de dilucion (PBS-T con 0,5 % de leche desnatada desecada, opcionalmente con NaCl 0,1 a 1 M) en serie de 1:25 a 1:400. Se anadieron las muestras diluidas (100 pl/pocillo) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos 4 veces con 300 pl/pocillo de tampon de lavado. Se anadieron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-Ig segun el ejemplo 4 (diluidos en tampon de dilucion; anti-IgG1 1:2.000, anti-IgG2 1:2.000, anti-IgG3 1:1.000, anti-IgG4 1:4.000, anti-IgM 1:80.000, anti-IgA 1:25.000) a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos 4 veces con 300 pl/pocillo de tampon de lavado. Se anadieron volumenes iguales de cada una de solucion de TMB y solucion de peroxido (Immuno Pure TMB Substrate, Pierce) a un volumen de sustrato total de 100 pI/pocillo y se incubaron durante 5-30 min. Son tiempos de desarrollo normales para diferentes anticuerpos secundarios: anti-IgG1, IgG2, IgG3, IgA e IgM: 20 min, anti-IgG4: 10-20 min. Los cambios de color son de transparente a azul brillante, mientras que la reaccion debena detenerse antes de que ningun pocillo exhiba color verde. Se detuvo la reaccion mediante la adicion de 100 pl de H2SO4 1,9 o 2 M. Se midio la reaccion de color a 450 nm frente a 620 nm en un lector de ELISA Tecan. Se calculan los resultados como la relacion entre la DO de muestra y la DO de control. Se muestra en la Fig. 1 una representacion esquematica de este procedimiento.

Ejemplo 8: ELISA del complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos policlonales

Se adquirieron los anticuerpos policlonales anti-ADAMTS13 "abcam'" y "K1-4" o se obtuvieron como se describe en el ejemplo 2 y se recubrieron sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se usaron los anticuerpos abcam y K1-4 como anticuerpos de recubrimiento a concentraciones de 1 mg/ml y 3,356 pg/ml, respectivamente, en cantidades de 10 pI o 3 pI de solucion de anticuerpo, respectivamente, con 5 ml de tampon de recubrimiento. La incubacion fue de una noche a 4 °C. Se uso tampon de dilucion sin NaCl (siendo por tanto identico al tampon de bloqueo). Se usaron plasma de PTT y plasma de NHP como muestras positivas y negativas de ADAMTS13:ic. Se diluyeron las muestras a 1:50, 1:100 y 1:200 con tampon de bloqueo y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Se usaron como anticuerpos de deteccion secundarios IgG1-HRP (Zymed), IgG2-HRP (SouthernBiotech), IgG3-HRP (Zymed) e IgG4- HRP (Zymed) a diluciones 1:2.000 junto con tampon de bloqueo (1,5 pl de dilucion de anticuerpo con 3 ml de tampon de bloqueo) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion por incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 15-30 min a temperatura ambiente.

Se dan los resultados en la tabla 1 siguiente y se muestran en la Figura 2 (fig. 2a: anticuerpo policlonal abcam; fig. 2b anticuerpo policlonal K1-4). En particular, en el caso de IgG4, se mostraron senales de fondo muy altas para las muestras de NHP negativas. Este efecto podna ser debido a la union inespedfica de IgG4 a IgG (Ito, 2010).

Tabla 1:

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Ejemplo 9: ELISA de IgG4 con diferentes anticuerpos

Se adquirieron los anticuerpos policlonales anti-ADAMTS13 "abcam", "K1-4" y "K-6" y los clones de anticuerpo monoclonal 5.1 y 12.1 o se obtuvieron como se describe en el ejemplo 2, y se recubrieron sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se usaron los anticuerpos como anticuerpos de recubrimiento a las siguientes concentraciones: abcam: 1 mg/ml, K1-4: 3.356 |jg/ml, K6: 13.148 jg/ml, clon 5.1: 0,2 mg/ml, clon 12.1: 0,2 mg/ml. Se usaron soluciones de anticuerpo en cantidades de: abcam: 10 jl, K1-4: 3 jl, K6: 0,8 jl, clon 5.1: 50 jl, clon 12.1 50 jl, con 10 ml de tampon de recubrimiento. La incubacion fue de una noche a 4 °C. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se investigaron tres compuestos de muestra a diferentes diluciones: 1) Una combinacion de anticuerpos de IgG4 (1:1; kappa de IgG4 humana, Sigma, 1 mg/ml; lambda de IgG4 humana, Sigma, 1 mg/ml), 2) albumina humana (Sigma) y 3) ADAMTS3 producida en celulas CHO segun el ejemplo 1. Se diluyeron las muestras a concentraciones de 20 jg/ml a 0,625 jg/ml con tampon de dilucion y se incubaron durante 5 h a temperatura ambiente. Como anticuerpo de deteccion secundario, se uso anticuerpo de raton anti-IgG4-HRP humana (Alpha Diagnostics) a dilucion 1:1.000 junto con tampon de dilucion (50 jI de solucion de anticuerpo con 50 ml de tampon de bloqueo) y se incubo durante 2 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 15 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Figura 3 (fig. 3a: anticuerpo policlonal abcam; fig. 3b: anticuerpo policlonal K1-4; fig. 3c anticuerpo policlonal K6; fig. 3d anticuerpo monoclonal 5.1; fig. 3e anticuerpo monoclonal 12.1). Los resultados ilustran que, para todos los anticuerpos policlonales, se detectaron altas senales anti-IgG4, incluso en ausencia de ADAMTS13 en la muestra. Los efectos fueron menores para el anticuerpo comercial abcam. En el caso de recubrimiento con anticuerpos monoclonales, no se detecto adsorcion de IgG4. Pudo concluirse que las senales de fondo de IgG4 eran debidas a la naturaleza de la especificidad multiepitopica de los anticuerpos policlonales.

Ejemplo 10: ELISA de IgG, reactividad cruzada de anticuerpos secundarios

Se ensayaron las reactividades cruzadas de anticuerpos espedficos de subtipo mediante el recubrimiento de Ig de distintas clases y subtipos sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7. No se usaron muestras. Inmediatamente despues del recubrimiento e incubacion (durante una noche a 4 °C), siguieron la incubacion y generacion de senal con anticuerpos secundarios marcados con HRP. Se usaron los siguientes anticuerpos de recubrimiento: IgG1: kappa de IgG1 humana (Sigma, 1,2 mg/ml) y lambda de IgG1 humana (Sigma, 1,0 mg/ml); IgG2: kappa de IgG2 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG2 humana (Sigma, 1,06 mg/ml); IgG3: kappa de IgG3 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG3 humana (Sigma, 1,04 mg/ml); IgG4: kappa de IgG4 humana (Sigma, 1,0 mg/ml) y lambda de IgG4 humana (Sigma 1,0 mg/ml); IgA: IgA humana (Sigma, 1,0 mg/ml) e IgM: IgM humana (Sigma, 1,01 mg/ml). Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de clase Ig o subtipo segun el ejemplo 4.

Se muestran los resultados en la Figura 4. Los graficos muestran senales de las concentraciones indicadas de anticuerpo de recubrimiento (fig. 4a: anti-IgG1-HRP humana, diluido 1:2.000; fig. 4b: anti-IgG2-HRP humana, diluido 1:1.000; fig. 4c: anti-IgG3-HRP humana, diluido 1:1.000; fig. 4d: anti-IgG4-HRP humana, diluido 1:2000; fig. 4e: anti- IgA-HRP humana; diluido 1:1.000; fig. 4f: anti-IgM-HRP humana, diluido 1:80.000). Se observo una reactividad cruzada distintiva para anticuerpos anti-IgA humana contra IgM recubierta, pero no contra espedficos de subtipo.

Eiemplo 11: ELISA de compleio inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos monoclonales como Ac de recubrimiento

Se recubrieron una mezcla de anticuerpos monoclonales anti-ADAMTS13 5C11, 5.1 y 12.1 del ejemplo 2 sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se usaron soluciones de anticuerpos monoclonales como anticuerpos de recubrimiento a las siguientes concentraciones: clones 5.1 y 12.1 (1:1): 0,2 mg/ml. 5C11: 0,1 mg/ml. Para el recubrimiento, se diluyeron las soluciones de anticuerpo con tampon de recubrimiento a concentraciones de 1 jg/ml, 1,5 jg/ml y 2 jg/ml (cada una con 15 ml de tampon de recubrimiento). Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se investigaron tres muestras: 1) plasma de PTT, 2) plasma de NHP y 3) plasma de PTT enriquecido con ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (273,5 jg/ml). Se diluyeron las muestras con tampon de dilucion como sigue: PTT: 400 jl de plasma con 9.600 jl de tampon de dilucion; NHP: 600 jl de plasma con 4800 jl de tampon de dilucion y 37,1 jI de ADAMTS13r con 200 jl de plasma de PTT y 4800 jl de tampon de dilucion y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de clase o subtipo de Ig segun el ejemplo 4. Se diluyeron los anticuerpos secundarios con tampon de dilucion a 1:1.000 a 1:8.000 como se muestra en la Fig. 5 y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 30 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Figura 5 (fig. 5a: anti-IgG1, fig. 5b: anti-IgG2, fig. 5c: anti-IgG3, fig. 5d: anti-IgG4, fig. 5e: anti-IgA, fig. 5f: anti-IgM, anticuerpos secundarios). Se determino la relacion de senal a ruido por comparacion de las senales obtenidas para muestras de PTT (usada para la deteccion de IgG1-4) o plasma de PTT enriquecido con ADAMTS13r (usada para la deteccion de IgA e IgM) como muestras positivas y plasma de NHP

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como control negativo. Se observaron relaciones de s/n excepcionales para IgG1, IgG3 e IgG4. A continuacion, IgM pareda superior a IgA e IgG2.

Ejemplo 12: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos policlonales purificados por afinidad como Ac de recubrimiento

Se adquirieron anticuerpo monoclonal 5C11 y anticuerpo policlonal anti-ADAMTS12 K1-4 o se obtuvieron como se describe en el ejemplo 3 y se recubrieron sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: para el recubrimiento, se diluyeron soluciones de anticuerpo policlonal K1-4 a 1:1.000 y solucion de anticuerpo monoclonal 5C11 a 1:100 con tampon de recubrimiento. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Como muestra positiva, se uso plasma de PTT enriquecido con 500 ng/pl de ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 y como muestra negativa plasma de NHP. Se diluyeron las muestras con tampon de dilucion a 1:25, 1:50 y 1:100 y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de clase o subtipo de Ig segun el ejemplo 4. Se diluyeron los anticuerpos secundarios con tampon de dilucion a 1:2.000 (IgG1, IgG3, IgG4 e IgA), 1:1.000 (IgG2 e IgG3) o 1:80.000 (IgM) y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 15 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la figura 6 (fig. 6a: Ac policlonal K1-4, 6b: Ac monoclonal 5C11). Sorprendentemente, despues de la purificacion por afinidad del ApC K1-4, se consiguieron los mejores resultados con anticuerpos anti- IgG4 como anticuerpos de deteccion secundarios con baja relacion de s/n y maximas senales. Pudieron mostrarse muy buenos resultados para los anticuerpos IgG1, IgG3 e IgM que son superiores a IgA e IgG2. Para el anticuerpo monoclonal 5C11, se muestran resultados similarmente buenos para IgG4, IgG1 e IgG3, con resultados aceptables para IgM que son superiores a IgG2 e IgA (tambien vease el ejemplo 11).

Se repitio el ensayo ELISA de IgG4 segun el ejemplo 9 para el anticuerpo purificado por afinidad K1-4. Se muestran los resultados en la fig. 6c (vease la fig. 3b). La reactividad inespedfica pudo reducirse significativamente mediante la purificacion por afinidad.

Ejemplo 13: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos secundarios anti-IgG-HRP humana (no especificos de subtipo)

Se obtuvo y purifico el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-10 como se describe en el ejemplo 3 y se recubrio sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se diluyo la solucion de anticuerpo inicial a una concentracion de 3,135 mg/ml con 10 ml de tampon de recubrimiento a concentraciones de 1 o 2 pg/ml. La incubacion fue durante 6 horas a temperatura ambiente. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se usaron como muestras positivas plasma de PTT y plasma de PTT enriquecido con 300 ng/pl de ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (concentracion inicial 273,5 pg/ml) y como muestra negativa plasma de NHP o tampon. Se diluyeron las muestras a 1:25 y 1:50 con tampon de dilucion y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se uso como anticuerpo de deteccion secundario anticuerpo de raton anti-IgG-HRP humana (Southern Biotech.) a diluciones 1:32.000, 1:64.000 y 1:128.000 con 5 ml de tampon de dilucion. Se incubaron las muestras durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 20 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Fig. 7 (fig. 7a: plasma de PTT con ADAMTS13r frente a plasma de NHP; fig. 7b: plasma de PTT frente a plasma de NHP). Este ejemplo muestra que los anticuerpos especificos de clase IgG soportan altas senales de fondo para muestras de NHP negativas de ADAMTS13.

Ejemplo 14: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos policlonales purificados por afinidad como Ac de recubrimiento

Se recubrio anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-4 purificado por afinidad del ejemplo 3 sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se usaron soluciones de anticuerpo policlonal como anticuerpos de recubrimiento a las siguientes concentraciones: para recubrimiento, se diluyeron las soluciones iniciales de anticuerpo (180 pg/ml) a 1:50 y 1:100 con tampon de recubrimiento. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se examinaron tres muestras: 1) plasma de PTT, 2) plasma de NHP y 3) plasma de PTT enriquecido con ADAMTS3r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (273,5 pg/ml). Se diluyeron las muestras con tampon de dilucion como sigue: PTT: 100 pl de plasma con 2400 pI de tampon de dilucion; NHP: 600 pl de plasma con 11.900 pl de tampon de dilucion y 220 pl de ADAMTS13r con 500 pI de plasma de PTT y 12 ml de tampon de dilucion, y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de clase o subtipo de Ig segun el ejemplo 4. Se diluyeron los anticuerpos secundarios con tampon de dilucion a 1:1.000 a 1:8.000 como se muestra en la Fig. 8 y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo una reaccion de

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coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 30 min a temperature ambiente.

Se muestran los resultados en la Figura 8 (fig. 5a: anti-IgG1, fig. 5b: anti-IgG2, fig. 5c: anti-IgG3, fig. 5d: anti-IgG4, fig. 5e: anti-IgA, fig. 5f: anti-IgM, anticuerpos secundarios). Se determino la relacion de senal a ruido mediante comparacion de las senales obtenidas para muestras de PTT (usada para deteccion de IgG1-4) o ADAMTS13r (usada para deteccion de IgA e IgM) como muestras positivas y plasma de NHP como control negativo.

Ejemplo 15: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos policlonales y monoclonales purificados por afinidad como Ac de recubrimiento

Se recubrieron el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-4 purificado por afinidad del ejemplo 3 y una mezcla de los anticuerpos monoclonales 5C11, 5.1 y 12.1 sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se usaron soluciones de anticuerpo policlonal como anticuerpos de recubrimiento a las siguientes concentraciones: para recubrimiento, soluciones iniciales de anticuerpo K1-4 (180 pg/ml), y se diluyeron a 1:50, 100 pl de solucion en 10 ml de tampon de recubrimiento, para ensayo de IgG1-3, lgA e IgM y 10 pl en 2 ml de tampon de recubrimiento para ensayo de IgG4. Se mezclaron 50 pl de anticuerpo monoclonal 5C11 (0,1 mg/ml) y 25 pl de ambos AcM 5.1 y 12.1 (0,1 mg/ml cada uno) en 10 ml de tampon de recubrimiento. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se examinaron tres muestras: 1) plasma de PTT enriquecido con 100 ng/100 pl de ADAMTS13r, 2) plasma de NHP y 3) ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (273,5 pg/ml). Se diluyeron las muestras con tampon de dilucion a 1:25 (20 pl de plasma y 480 pl de tampon de dilucion) a 1:100 y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de clase o subtipo de Ig segun el ejemplo 4. Se diluyeron los anticuerpos secundarios con tampon de dilucion (IgG1, IgG4 e IgA: 2,5 pl de solucion de anticuerpo en 5 ml de tampon de dilucion (DB); IgG2 e IgG3: 5 pl de solucion de anticuerpo en 5 ml de DB; IgM: 6,3 pl de solucion de anticuerpo en 5 ml de DB) y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues del lavado, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 15 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Figura 9 (fig. 9a: anti-IgG1, fig. 9b, anti-IgG2, fig. 9c, anti-IgG3, fig. 9d, anti-IgG4, fig. 9e, anti-IgA, fig. 9f, anti-IgM; anticuerpos secundarios). Para la mayona de subtipos de anticuerpo, el uso de anticuerpos policlonales (purificados por afinidad) como anticuerpos de recubrimiento daba como resultado mayores senales en comparacion con anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 16. ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con diferentes anticuerpos policlonales purificados por afinidad

Se recubrieron el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 purificado por afinidad K1-4 y el anticuerpo no purificado por afinidad y purificado por afinidad K1-10 de los ejemplos 2 y 3 sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se usaron soluciones de anticuerpo policlonal como anticuerpos de recubrimiento a concentraciones de 2 pg/ml, 4 pg/ml y 6 pg/ml en diluciones de tampon de recubrimiento. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se examinaron dos muestras: 1) plasma de PTT enriquecido con 500 ng/100 pl de ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (273,5 pg/ml), 2) plasma de NHP: se diluyeron las muestras a 1:25 con tampon de dilucion y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de clase o subtipo de Ig segun el ejemplo 4. Se diluyeron los anticuerpos secundarios con tampon de dilucion (IgG4: 2 pI de solucion de anticuerpo en 8 ml de tampon de dilucion (DB), IgG1, IgG2 e IgA: 4 pl de solucion de anticuerpo en 8 ml de DB, IgG3: 8 pl de solucion de anticuerpo en 8 ml de DB, IgM: 10 pl de solucion de anticuerpo a 1:100 en 8 ml de DB) y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de tMb y solucion de peroxido durante 15 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Figura 10 (fig. 10a: anticuerpo K1-4, fig. 10b: anticuerpo K1-10, purificado por afinidad, fig. 10c: anticuerpo K1-10, no purificado por afinidad). No se midieron senales significativas para el anticuerpo no purificado por afinidad K1-10, ilustrando la importancia de una purificacion adicional.

Ejemplo 17: ELISA de IgG4 con anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13

Se recubrieron el anticuerpo K1-10 no purificado por afinidad (eluido de columna de protema G) y purificado por afinidad de los ejemplos 2 y 3 sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se uso como anticuerpo de recubrimiento una solucion de anticuerpo policlonal no purificado por afinidad de una concentracion de 0,95 mg/ml a una dilucion de 10,5 pl de solucion de anticuerpo en 10 ml de tampon de recubrimiento. Se uso como anticuerpo de recubrimiento una solucion de anticuerpo policlonal purificado por afinidad de una concentracion de 0,32 mg/ml a una dilucion de 33 pl de solucion de anticuerpo en 10 ml de tampon de recubrimiento. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Las muestras examinadas incluyen: 1) mezcla 1:1 de kappa de IgG4 (Sigma, 1,2 mg/ml) y lambda de IgG4 (Sigma, 1,0 mg/ml); 2) albumina humana (Sigma, 30 %); ADAMTS13 producida en celulas CHO segun el ejemplo 1, 273,5 pg/ml (no

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diluida). Se incubaron las muestras durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpos anti-inmunoglobulina con especificidad de subtipo IgG4 (IgG4-HRP, Lymed Laboratories 1:4.000). Se diluyeron 5 pl de solucion de anticuerpo secundario con 20 ml de tampon de dilucion y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 15 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Figura 11 (fig. 11a: anticuerpo no purificado por afinidad, fig. 11b: anticuerpo purificado por afinidad). La purificacion por afinidad conduce a una reduccion marcada de la union no espedfica.

Ejemplo 18: ELISA de IgA con inmunoglobulina humana como anticuerpos de recubrimiento

Se ensayaron las reactividades cruzadas de anticuerpos espedficos de subtipo mediante el recubrimiento de Ig de distintas clases y subtipos sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7. No se usaron muestras. Inmediatamente despues del recubrimiento e incubacion (durante una noche a 4 °C), siguio una incubacion y generacion de senal con anticuerpos secundarios marcados con HRP. Se usaron los siguientes anticuerpos de recubrimiento: IgG1: kappa de IgG1 humana (Sigma, 1,2 mg/ml) y lambda de IgG1 humana (Sigma, 1,0 mg/ml); IgG2: kappa de IgG2 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG2 humana (Sigma, 1,08 mg/ml); IgG3: kappa de IgG3 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG3 humana (Sigma, 1,04 mg/ml); IgG4: kappa de IgG4 humana (Sigma, 1,0 mg/ml) y lambda de IgG4 humana (Sigma, 1,0 mg/ml); IgA: IgA humana (Sigma, 1,0 mg/ml) e IgM: IgM humana (Sigma, 1,01 mg/ml); con 1 pl de solucion de Ig con 500 pl de tampon de recubrimiento para recubrimiento durante la incubacion durante una noche a 4 °C. El tampon de dilucion contema NaCl 0,6 M. Se usaron como anticuerpos secundarios anticuerpo de raton anti-IgA-HRP humana (Pierce 1:32.000) y anticuerpo de cabra anti-IgA-peroxidasa humana (espedfica de cadena alfa) (Sigma; 1:25.000) (Ac Pierce: 0,63 pI en 20 ml de tampon de dilucion; Ac Sigma: 0,8 pl en 20 ml de tampon de dilucion). Se incubaron los anticuerpos secundarios durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 20 min a temperatura ambiente. Se muestran los resultados en la Figura 12. Para ambos anticuerpos secundarios, se observaron reactividades cruzadas con IgM solo a las concentraciones de anticuerpo de recubrimiento mayores.

Ejemplo 19: Especificidad de subtipo de inmunoglobulina de anticuerpos especificos de IgG

Se ensayaron las reactividades de subtipo de anticuerpos especificos de clase IgG mediante recubrimiento de Ig de distintos subtipos de Ig sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7. No se usaron muestras. Inmediatamente despues del recubrimiento e incubacion (durante una noche a 4 °C), siguio la incubacion y generacion de senal con anticuerpos secundarios marcados con HRP. Se usaron los siguientes anticuerpos de recubrimiento: IgG1: kappa de IgG1 humana (Sigma, 1,2 mg/ml) y lambda de IgG1 humana (Sigma, 1,0 mg/ml); IgG2: kappa de IgG2 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG2 humana (Sigma, 1,08 mg/ml); IgG3: kappa de IgG3 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG3 humana (Sigma, 1,04 mg/ml); IgG4: kappa de IgG4 humana (Sigma, 1,19 mg/ml) y lambda de IgG4 humana (Sigma, 1,15 mg/ml); diluidos a una concentracion de 4 pg/ml a 0,25 pg/ml con tampon de recubrimiento. Se usaron como controles negativos seroalbumina bovina (BSA) y seroalbumina humana (HAS). Se incubaron los anticuerpos de recubrimiento durante una noche a 4 °C. El tampon de dilucion contema NaCl 0,6 M. Se uso como anticuerpo secundario anticuerpo de raton anti-IgG-HRP humana (Southern Biotech). Se diluyeron los anticuerpos secundarios a 1:10 y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 10 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Fig. 13. Para anticuerpos especificos de clase IgG, se encontraron las reactividades mas altas contra los subtipos IgG1 e IgG2, con menor reactividad contra las subclases IgG3 e IgG4. A alta concentracion de anticuerpos de recubrimiento (4 pg/ml), las reactividades eran similares para la especificidad de cadena kappa y lambda.

Ejemplo 20: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos secundarios anti-IgG-HRP humana (no especificos de subtipo)

Se obtuvo y se purifico el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-10 como se describe en el ejemplo 3 y se recubrio sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se diluyo la solucion inicial de anticuerpo a una concentracion de 3,135 mg/ml con 20 ml de tampon de recubrimiento a concentraciones de 2 pg/ml. La incubacion fue durante 5 horas a temperatura ambiente. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se usaron como muestras positivas plasma de PTT y plasma de PTT enriquecido con 300 ng/pl de ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (concentracion inicial 273,5 pg/ml) y como muestra negativa plasma de NHP o tampon. Se diluyeron las muestras a 1:25 y 1:50 con tampon de dilucion y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se ensayaron como anticuerpos de deteccion secundarios diluciones de tres anticuerpos de raton anti-IgG-HRP humana diferentes (Zymed Laboratories, Jackson ImmunoResearch, Southern Biotech.) con 3 ml de tampon de dilucion: Se diluyeron los anticuerpos de Zymed y Jackson I. a 1:1.000 (1a dilucion) o 1:5.000 (2a dilucion); se diluyo el anticuerpo de Southern B. a 1:1.000 (1a dilucion) y 1:2.000 (2a dilucion). Se incubaron las muestras durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo

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la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxidasa durante 20 min a temperature ambiente.

Se muestran los resultados en la Fig. 14 (fig. 14a: plasma de PTT enriquecido con ADAMTS13r; fig. 14b: plasma de PTT). Aunque el plasma de PTT podfa distinguirse del plasma de NHP para todos los anticuerpos, todos los anticuerpos espedficos de clase de IgG soportan altas senales de fondo para muestras de NHP negativas de ADAMTS13.

Ejemplo 21: Especificidad de subtipo de inmunoglobulina de anticuerpo de raton espedfico anti-IgG humana

Se ensayaron las reactividades de subtipo de anticuerpo de raton espedfico de clase de IgG (pero no espedfico de subtipo) recubriendo Ig de distintos subtipos de IgG sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7. No se usaron muestras. Inmediatamente despues del recubrimiento e incubacion (durante una noche a 4 °C), siguio la incubacion y generacion de senal con anticuerpo secundario marcado con HRP. Se usaron los siguientes anticuerpos de recubrimiento: IgG1-IgG4 como en el ejemplo 19; IgA: IgA humana (Sigma I1010, lote: 057K6070, 5 mg de liofilizado diluidos en 5 ml de PBS); IgM: IgM humana (Sigma, 1,01 mg/ml); diluidos a una concentracion de 4 pg/ml a 0,0039 pg/ml con tampon de recubrimiento. Se usaron como controles negativos seroalbumina bovina (BSA) y seroalbumina humana (HAS). Se incubaron los anticuerpos de recubrimiento durante una noche a 4 °C. El tampon de dilucion contema NaCl 0,6 M. Se uso como anticuerpo secundario anticuerpo de raton anti-IgG-HRP (Southern Biotech). Se diluyeron los anticuerpos secundarios a 1:10 y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 10 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Fig. 15. Para anticuerpos espedficos de clase IgG, a altas concentraciones (4 pg/ml) se encontraron reactividades contra todos los subtipos IgG1-IgG4.

Ejemplo 22: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13 con anticuerpos secundarios anti-IgG-HRP humana (no espedficos de subtipo)

Se obtuvo el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-10, se purifico como se describe en el ejemplo 3 y se recubrio sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se diluyo la solucion inicial de anticuerpo a una concentracion de 3,135 mg/ml con 10 ml de tampon de recubrimiento a concentraciones de 1 o 2 pg/ml. La incubacion fue de 6 horas a temperatura ambiente. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se usaron como muestras positivas plasma de PTT y plasma de PTT enriquecido con 300 ng/pl de ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 y como muestra negativa plasma de NHP o tampon. Se diluyeron las muestras a 1:25 y 1:50 con tampon de dilucion y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se uso como anticuerpo de deteccion secundario anticuerpo de raton anti-IgG-HRP humana (Southern Biotech.) a diluciones 1:16.000, 1:32.000 y 1:64.000 con 10 ml de tampon de dilucion. Se incubaron los anticuerpos durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 20 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Fig. 16 (fig. 16a: plasma de PTT enriquecido con ADAMT813r; fig. 16b: plasma de PTT). Aunque el plasma de PTT pudo distinguirse del plasma de NHP para todas las diluciones de anticuerpo, los anticuerpos espedficos de clase IgG soportan senales de fondo para muestras de NHP negativas de ADAMTS13.

Ejemplo 23: Condiciones ionicas

Se examino el efecto de la concentracion salina y la fuerza ionica en un ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13. Se obtuvo y purifico el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-10 como se describe en el ejemplo 3 y se recubrio sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se diluyo la solucion inicial de anticuerpo con una concentracion de 3,135 mg/ml con 10 ml de tampon de recubrimiento a concentraciones de 1 pg/ml (para ensayo de IgG4) o 2 pg/ml (para ensayo de IgGl-3, IgA e IgM). La incubacion fue de 6 horas a temperatura ambiente.

Se anadio al tampon de dilucion NaCl a concentraciones de NaCl 0,25 M, 0,5 M y 1 M, junto con tampon PBS-T, dando como resultado concentraciones de NaCl 0,1 M, 0,4 M, 0,6 M y 1,1 M.

Se usaron como muestras positivas plasma de PTT (para ensayo de IgG4) y plasma de PTT enriquecido con 300 ng/pl de ADAMTS13r producida en celulas CHO segun el ejemplo 1 (para ensayo de IgG1-3, IgA e IgM) y como muestra negativa plasma de NHP o tampon. Se diluyeron las muestras con tampon de dilucion que comprendfa NaCl adicional a las concentraciones dadas (PTT, 104 pI de suero + 2496 pl de los tampones de dilucion, PTT+A13r, 24 pI de suero + 596 pl de los tampones de dilucion, NHP: 120 pI de suero + 2880 pl de los tampones de dilucion) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpo de deteccion secundario anticuerpos espedficos de subtipo segun el ejemplo 4 a diluciones 1:1.000 (anti-IgG3), 1:2.000 (anti-IgG1, anti-IgG2), 1:4.000 (anti-IgG4), 1:25.000 (anti-IgA) o 1:80.000 (anti-IgM). Se diluyeron los anticuerpos secundarios con tampon de dilucion sin adicion de NaCl o con tampon de dilucion con las adiciones de NaCl indicadas. Se incubaron las

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soluciones de anticuerpo durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 15 min a temperatura ambiente.

Se muestran los resultados en la Fig. 17 (fig. 17a, anti-IgG1, fig. 17b, anti-IgG2, fig. 17c: anti-IgG3, fig. 17d: anti- IgG4, fig. 17e, anti-IgA, fig. 17f: anti-IgM, anticuerpos secundarios). Las concentraciones salinas mayores son favorables para la mayona de anticuerpos secundarios. Aunque pueden observarse senales mayores para las condiciones de baja salinidad, la relacion de senal a ruido era generalmente mejor para condiciones de alta salinidad. Se observaron muy buenas relaciones de senal (PTT) a ruido (NHP) para IgG3 e IgG4. Se observa el efecto beneficioso de la alta salinidad para IgA e IgM, pero no es tan pronunciado como el visto para IgG4 e IgG3. Para IgG1, los resultados sin sal adicional son mejores, sin embargo la relacion con alta salinidad sigue estando en un intervalo aceptable.

Ejemplo 24: ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13, ensayo de muestras de PTT individuales

Se ensayaron muestras de plasma de PTT de pacientes individuales segun el ejemplo 5 en un ensayo de complejo inmunitario de ADAMTS13. Se obtuvo y se purifico el anticuerpo policlonal anti-ADAMTS13 K1-10 como se describe en el ejemplo 3 y se recubrio sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp como se describe en el ejemplo 7 con las siguientes modificaciones del procedimiento: se diluyo la solucion inicial de anticuerpo con una concentracion de 3,135 mg/ml a 2 pg/ml con 80 ml de tampon de recubrimiento o a 1 pg/ml con 20 ml de tampon de recubrimiento; para ensayo de IgA e IgM, se diluyo el anticuerpo de recubrimiento a 2 pg/ml en 160 ml de tampon de recubrimiento. La incubacion fue durante 6 horas (para ensayo de IgG) o 5 horas (para ensayo de IgA e IgM) a temperatura ambiente. Se uso tampon de dilucion con NaCl 0,6 M. Se diluyeron muestras de plasma combinado de PTT de control positivo (como se describe en el ejemplo 23), plasma combinado de NHP de control negativo (plasma de referencia) y plasma de paciente de PTT individual con tampon de dilucion a 1:25 (72 pl de plasma en 1800 pl de tampon de dilucion o 36 pl de plasma en 864 pl de tampon de dilucion) y se diluyeron ademas por etapas a 1:400 para ensayos adicionales. Se incubaron las muestras de plasma durante una noche a 4 °C. Se usaron como anticuerpos de deteccion secundarios anticuerpos espedficos de subtipo IgG1-4 segun el ejemplo 4 (anticuerpo de raton anti-IgG1-HRP humana, Zymed, usado a dilucion 1:2.000; anticuerpo de raton anti-IgG2-HRP humana, Southern BioTech, usado a dilucion 1:2.000; anticuerpo de raton anti-IgG3-HRP humana, Zymed, usado a dilucion 1:1.000; anticuerpo de raton anti-IgG4-HRP humana, Zymed, usado a dilucion 1:4.000; anticuerpo de cabra anti-IgA- HRP humana, Sigma, usado a dilucion 1:25.000; anticuerpo de cabra anti-IgM-HRP humana (espedfico de cadena alfa, Sigma, usado a dilucion 1:80.000). Se incubaron los anticuerpos secundarios durante 3 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se efectuo la reaccion de coloracion mediante incubacion con solucion de TMB y solucion de peroxido durante 20 min a temperatura ambiente.

Se muestran las muestras de pacientes seleccionadas en la Figura 18 (fig. 18a: anti-IgG1, fig., 18b: anti-IgG2, fig. 18c: anti-IgG3, fig. 18d: anti-IgG4, fig. 18e; anti-IgA, fig. 18f: anti-IgM). Los resultados del control positivo estaban habitualmente por encima de los intervalos de senal representados: Para IgG1, las relaciones de DO de muestra/DO de referencia eran: para una dilucion de 1:25 de 15,0, para una dilucion de 1:50 de 12,1, para una dilucion de 1:100 de 8,4, para una dilucion de 1:200 de 4,1 y para una dilucion de 1:400 de 2,7; para IgG2, las relaciones de DO de muestra/DO de referencia eran: para una dilucion de 1:25 de 3,40, para una dilucion 1:50 de 1,48, para una dilucion de 1:100 de 0,84, para una dilucion de 1:200 de 1,23 y para una dilucion de 1:400 de 1,19; para IgG3, las relaciones de DO de muestra/DO de referencia eran: para una dilucion de 1:25 de 15,6, para una dilucion de 1:50 de 15,3, para una dilucion de 1:100 de 11:6, para una dilucion de 1:200 de 8,0 y para una dilucion de 1:400 de 4,4; para IgG4, las relaciones de DO de muestra/DO de referencia eran: para una dilucion de 1:25 de 17,3, para una dilucion de 1:50 de 14,9, para una dilucion de 1:100 de 10,1, para una dilucion de 1:200 de 7,6 y para una dilucion de 1:400 de 5,4; para IgA, las relaciones de DO de muestra/DO de referencia eran: para una dilucion de 1:25 de 8,4, para una dilucion de 1:50 de 10,8, para una dilucion de 1:100 de 10.3, para una dilucion de 1:200 de 7,9 y para una dilucion de 1:400 de 4,4; para IgM, las relaciones de DO de muestra/DO de referencia eran: para una dilucion de 1:25 de 5,1, para una dilucion de 1:50 de 4,6, para una dilucion de 1:100 de 3,6, para una dilucion de 1:200 de 2,3 y para una dilucion de 1:400 de 1,6. Se determinaron estadfsticamente los puntos de corte y se encuentran en el intervalo de 1,0-1,4 de DO de muestra/DO de referencia. Pudieron detectarse complejos inmunitarios de IgG1 de ADAMTS13 detectables de pacientes de PTT adquirida confirmada para todos los pacientes con el nuevo ensayo de ADAMTS13. Una muestra de paciente, el paciente 40, estaba solo ligeramente por encima del valor de corte. Es probable que con procedimientos menos sensibles este paciente pudiera haber sido diagnosticado erroneamente. Sorprendentemente, este paciente mostraba los mayores tttulos de IgG2. Las senales de IgG2 estan normalmente muy cercanas al valor de corte. Se resumen en la tabla 2 los ensayos de sueros de pacientes positivos y negativos.

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Tabla 2: Se dan los ensayos de suero de pacientes de PTT negativos y positivos con la mayor dilucion posible:

Muestra

Titulo de lgG1 Titulo de lgG2 Titulo de lgG3 Titulo de lgG4

3

n.d. n.d. n.d. >400

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200 n.d. 25 n.d.

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n.d. n.d. n.d. >400

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50 n.d. n.d 100

4

200 25 25 25

50

>400 n.d. 25 >400

40

50 50 n.d. >400

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>400 100 200 >400

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>400 25 >400 >400

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200 n.d. 25 n.d.

(n.d.: no detectado; todos estos pacientes seleccionados dieron negativo en el ensayo de tftulos de IgA e IgM anti- ADAMTS13, veanse las fig. 18e y f)

Ejemplo 25: Condiciones ionicas. anticuerpo secundario de subtipo IgG1

Se ensayo el efecto de la concentracion salina y la fuerza ionica en un ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13. Se diluyo el anticuerpo policlonal de conejo anti-ADAMTS13 humana K1-10 a una concentracion de 2 pg/ml con tampon de recubrimiento (tampon carbonato-bicarbonato 0.05 M. pH 9.6. 25 °C) y se recubrio sobre la superficie de placas ELISA (Maxisorp; Nunc. Rochester. NY). Despues de lavar 4 veces con 250 pl/pocillo de tampon de lavado (PBS-T: PBS con 0.01 % de Tween 20). se bloquearon los sitios de union libres durante 2 horas a temperature ambiente con 200 pl/pocillo de tampon de bloqueo (PBS-T: PBS con 0.1 % de Tween 20 con 0.5 % de leche desecada desnatada).

Se diluyeron muestras de plasma de PTT enriquecido con ADAMTS13r o plasma de NHP con tampon de dilucion (PBS-T con 0.5 % de leche desecada desnatada. opcionalmente con NaCl 1.1 M. 0.6 M. 0.4 Mo 0.1 M) a 1:25. Se anadieron muestras diluidas (100 pl/pocillo) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos 4 veces con 250 pl/pocillo de tampon de lavado. Se anadio anticuerpo anti-IgG1 (anticuerpo de raton anti-IgG1-HRP humana n° de cat. de Fitzgerald: 61R-I1110aHRP) como anticuerpo secundario (diluido en tampon de dilucion a 1:32.000 y 1:64.000) a 100 pI/pocillo y se incubo durante 3 h a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos 4 veces con 250 pl/pocillo de tampon de lavado. Se anadieron iguales volumenes de cada una de solucion de TMB y solucion de peroxido (Immuno Pure TMB Substrate. Pierce) a un volumen de sustrato total de 100 pI/pocillo. Se detuvieron las reacciones mediante la adicion de 100 pl de H2SO4 2 M. Se midio la reaccion de coloracion a 450 nm frente a 620 nm en un lector de ELISA Tecan. Se calculan los resultados como la relacion entre la DO de la muestra y la DO del control. Se muestran los resultados en la Figura 19.

Ejemplo 26: Condiciones ionicas. anticuerpo secundario de subtipo IgG4

Se ensayo el efecto de la concentracion salina y la fuerza ionica en un ELISA de complejo inmunitario de ADAMTS13. Se diluyo el anticuerpo policlonal de conejo anti-ADAMTS13 humana K1-10 a una concentracion de 2 pg/ml con tampon de recubrimiento (tampon carbonato-bicarbonato 0.05 M. pH 9.6. 25 °C) y se recubrio sobre la superficie de placas ELISA (Maxisorp; Nunc. Rochester. NY). Despues de lavar 4 veces con 250 pl/pocillo de tampon de lavado (PBS-T: PBS con 0.01 % de Tween 20). se bloquearon los sitios de union libres durante 2 horas a temperatura ambiente con 200 pl/pocillo de tampon de bloqueo (PBS-T: PBS con 0.01 % de Tween 20 con 0.5 % de leche desecada desnatada).

Se diluyeron las muestras en tampon de dilucion (PBS-T con 0.5 % de leche desecada desnatada. opcionalmente con NaCl 1.1 M. 0.6 M. 0.4 M o 0.1 M) a 1:25. Se anadieron las muestras diluidas (100 pI/pocillo) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos 4 veces con 250 pl/pocillo de tampon de lavado. Se anadieron anticuerpo anti-IgG4 (anticuerpo de raton anti-IgG4-HRP humana (Invitrogen. n° de cat. A10654 o AbD Serotec. n° de cat. MCA20980) como anticuerpo secundario (diluido en tampon de dilucion a 1:32.000. anticuerpo de Invitrogen y 1:2.000. anticuerpo AbD de Serotec) a 100 pl/pocillo y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos 4 veces con 250 pl/pocillo de tampon de lavado. Se anadieron volumenes iguales de cada una de solucion de TMB y solucion de peroxido (Immuno Pure TMB Substrate. Pierce) a un volumen de sustrato total de 100 pl/pocillo. Se detuvo la reaccion mediante la adicion de 100 pl de H2SO4 2 M. Se midio la reaccion de coloracion a 450 nm frente a 620 nm en un lector de ELISA Tecan. Se calculan los resultados como la relacion entre la DO de la muestra y la DO del control. Se muestran los resultados en la Figura 20.

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Ejemplo 27: Reactividad cruzada por ELISA de IgG de anticuerpos secundarios

Se ensayaron las reactividades cruzadas del anticuerpo de IgG1 del Ejemplo 25 y de los anticuerpos de IgG4 del Ejemplo 26 recubriendo Ig de distintas clases y subtipos sobre placas ELISA de Nunc Maxisorp. No se usaron muestras. Inmediatamente despues del recubrimiento e incubacion (durante una noche a 4 °C), se lavaron las placas y se anadieron 250 pl/pocillo de tampon de bloqueo. Se anadio el anticuerpo secundario (IgG1, ejemplo 26 o IgG4, ejemplo 27) y se midio la generacion de senal. Se usaron los siguientes anticuerpos de recubrimiento: IgG1: kappa de IgG1 humana (Sigma, 1,2 mg/ml) y lambda de IgG1 humana (Sigma, 1,0 mg/ml); IgG2: kappa de IgG2 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG2 humana (Sigma, 1,08 mg/ml); IgG3: kappa de IgG3 humana (Sigma, 1,1 mg/ml) y lambda de IgG3 humana (Sigma, 1,04 mg/ml); IgG4: kappa de IgG4 humana (Sigma, 1,2 mg/ml) y lambda de IgG4 humana (Sigma, 1,1 mg/ml); IgA: IgA humana (Sigma, 1,0 mg/ml); IgM: IgM humana (Sigma, 1,0 mg/ml) e IgG de suero humano (Sigma, 6,4 mg/ml).

Se muestran los resultados en las Figuras 21 y 22. Las graficas muestran senales de las concentraciones indicadas de anticuerpo.

REFERENCIAS

Las siguientes referencias se refieren a los temas y la materia en cuestion discutidos en la presente memoria.

WO 1997/041206 A2 WO 02/42441 Al WO 2004/095027 A1

Theofilopoulos et al., J. Clin. Invest. 1976; 57:169-182 Plaimauer et al., Blood 2002; 100: 3626-3632 Scheiflinger et al., Blood 2003; 102 (9): 3241-3243 Levy et al., Blood 2005; 106: 11-17 Rieger et al., Blood 2005; 106: 1262-1267

Wu. et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005; 4: 129-136 Rieger et al., Thromb. Haemost. 2006; 95: 212-220 Sadler, Blood 2008; 112: 11-18

Ferrari et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009; 7: 1703-1710 Ito et al., Scandinavian J. of Immunology 2010, vol 71(2): 109-114.

Claims (21)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para detectar o determinar complejos inmunitarios de anticuerpo anti- ADAMTS13/ADAMTS13 en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti- ADAMTS13, poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-anticuerpo y detectar los complejos inmunitarios de anticuerpo anti-ADAMTS13/ADAMTS13 unidos a dicho anticuerpo anti-ADAMTS13 y dicho anticuerpo anti-anticuerpo.
2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas detectar los anticuerpos anti- ADAMTS13 libres en la muestra.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el procedimiento de deteccion o determinacion de los anticuerpos anti-ADAMTS13 libres comprende unir dichos anticuerpos anti-ADAMTS13 libres a ADAMTS13 o un fragmento de la misma y detectar dichos anticuerpos anti-ADAMTSl3 unidos a ADAMTS13 o dicho fragmento con un anticuerpo anti-anticuerpo espedfico de dichos anticuerpos anti-ADAMTS13.
4. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas detectar o determinar la ADAMTS13 libre o determinar la actividad de ADAMTS13 en la muestra.
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que detectar o determinar la ADAMTS13 libre comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo anti-ADAMTS13 y detectar la ADAMTS13 unida a dicho anticuerpo anti-ADAMTS13.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que la determinacion de la actividad de ADAMTS13 comprende poner en contacto la muestra con un sustrato de ADAMTS13 en condiciones en que la ADAMTS13 sea activa para escindir el sustrato y determinar los productos de escision de dicho sustrato.
7. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichos anticuerpos anti- anticuerpo son espedficos de subtipo de anticuerpo o clase de anticuerpo.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que dicha clase de anticuerpo se selecciona de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que dicho subtipo de anticuerpo se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
10. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo anti-anticuerpo reconoce la parte Fc de un anticuerpo.
11. 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo anti- ADAMTS13 es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal o una mezcla de dos o mas anticuerpos monoclonales.
12. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo anti- ADAMTS13 es un anticuerpo policlonal, que ademas se purifica por inmunidad o afinidad mediante contacto con ADAMTS13.
13. 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho anticuerpo anti- ADAMTS13, dicha ADAMTS13 o fragmento de la misma esta marcado y/o dicho anticuerpo anti-anticuerpo esta marcado.
14. 14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho anticuerpo anti- ADAMTS13 o dicha ADAMTS13 o fragmento de la misma esta inmovilizado y/o dicho anticuerpo anti-anticuerpo esta inmovilizado.
15. 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha muestra es una muestra humana.
16. 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho anticuerpo anti- anticuerpo reconoce anticuerpos humanos.
17. 17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que, en dicha reaccion de union o en dicha etapa de deteccion, la fuerza ionica es de al menos 0,4 N.
18. 18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que, en dicha reaccion de union o etapa de deteccion, la concentracion salina es de al menos NaCl 0,4 M.
19. 19. Un procedimiento de diagnostico de una enfermedad asociada a la disfuncion de ADAMTS13 en un paciente, que comprende detectar complejos inmunitarios de ADAMTS13 en una muestra obtenida de un paciente segun un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

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20. 20. Uso de un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para monitorizar una terapia de sustitucion de ADAMTS13.
21. 21. El procedimiento de la reivindicacion 19 o el uso de la reivindicacion 20, en el que la enfermedad es PTT 10 (purpura trombocitopenica trombotica), especialmente PTT adquirida.